TWI622648B - 正丁醇表現匣、重組質體及正丁醇生產相關基因的表現方法 - Google Patents

正丁醇表現匣、重組質體及正丁醇生產相關基因的表現方法 Download PDF

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Abstract

一種正丁醇表現匣，包括正丁醇生產相關基因及發酵調控元件。發酵調控元件調控正丁醇生產相關基因的表現且位於正丁醇生產相關基因的上游。發酵調控元件包括發酵反應基因的啟動子、核糖體結合位點以及轉錄因子結合位點。發酵調控元件所參與之發酵反應包括醋酸發酵、酒精發酵、琥珀酸發酵或乳酸發酵，正丁醇生產相關基因不為發酵反應基因或發酵反應基因所參與之發酵反應的上游產物基因。本發明另提供將正丁醇表現匣選殖於表現載體中所製得的重組質體。本發明又提供了正丁醇生產相關基因的表現方法，利用重組質體來表現正丁醇生產相關基因。

Description

正丁醇表現匣、重組質體及正丁醇生產相關基因的表現方法
本發明是有關於一種正丁醇表現匣、重組質體及正丁醇生產相關基因的表現方法，且特別是有關於一種可自我調控的正丁醇表現匣、重組質體及正丁醇生產相關基因的表現方法。
近年來，藉由基因轉殖方式來表現外源基因的技術已廣泛地應用於醫學、農業、畜牧業、食品工業或化學工業等相關領域中。在習知的基因轉殖技術中，是先將外源基因選殖至表現載體並建構重組質體，再將重組質體轉殖至宿主細胞，而後藉由添加誘導物來促使宿主細胞大量表現外源基因。其中，用來表現外源基因的宿主細胞通常為微生物或哺乳動物細胞等。
一般來說，重組質體中通常含有特定基因(諸如抵抗抗生素的基因)，因此可以藉由添加抗生素或誘導物來維持轉殖成功的宿主細胞，並促使宿主細胞將重組質體保留於其體內。然而，添加抗生素或誘導物存在產品製程不便或是成本增加的問題。因此，如何建立不需要添加誘導物或抗生素的生產平台，是有待解決的問題。
本發明提供一種正丁醇表現匣，具有可自我調控的發酵調控元件。
本發明另提供一種重組質體，其用於表現正丁醇生產相關基因。
本發明又提供一種正丁醇生產相關基因的表現方法，可在發酵條件下表現正丁醇生產相關基因。
本發明的一種正丁醇表現匣包括正丁醇生產相關基因以及發酵調控元件。發酵調控元件用以調控正丁醇生產相關基因的表現且位於正丁醇生產相關基因的上游。發酵調控元件包括發酵反應基因的啟動子、核糖體結合位點以及轉錄因子結合位點。其中，發酵調控元件所參與之發酵反應包括醋酸發酵、酒精發酵、琥珀酸發酵或乳酸發酵，正丁醇生產相關基因不為發酵反應基因或發酵反應基因所參與之發酵反應的上游產物基因。
在本發明的一實施例中，上述的發酵反應基因包括ackA基因、adhE基因、frdA基因或ldhA基因。
在本發明的一實施例中，當發酵反應基因為ackA基因時，發酵調控元件具有SEQ ID NO:1的序列。
在本發明的一實施例中，當發酵反應基因為adhE基因時，發酵調控元件具有SEQ ID NO:2的序列。
在本發明的一實施例中，當發酵反應基因為frdA基因時，發酵調控元件具有SEQ ID NO:3的序列。
在本發明的一實施例中，當發酵反應基因為ldhA基因時，發酵調控元件具有SEQ ID NO:4的序列。
在本發明的一實施例中，上述的正丁醇生產相關基因包括atoB基因、adhE2基因、crt基因、hbd基因、ter基因或fdh基因。
本發明另提供一種重組質體，其用於表現正丁醇生產相關基因。重組質體包括表現載體，以及選殖於表現載體中的前述正丁醇表現匣。
在本發明的一實施例中，表現載體包括含有ColE1複製起點的表現載體、含有Cola複製起點的表現載體或含有pSC101複製起點的表現載體。
本發明另提供一種正丁醇生產相關基因的表現方法，包括以下步驟。首先，將前述的重組質體轉化於宿主細胞中，其中所述宿主細胞已剔除發酵反應基因或發酵反應基因所參與之發酵反應的上游產物基因。接著，於發酵條件下培養宿主細胞，並誘導重組質體表現正丁醇生產相關基因。
在本發明的一實施例中，宿主細胞在厭氧環境下無法生長。
在本發明的一實施例中，將含有正丁醇相關基因之前述的重組質體，轉化於無法生長在厭氧環境下的宿主細胞後，使得轉化後帶有前述的重組質體的宿主細胞，表現正丁醇相關基因，且可於厭氧環境下生長並生產正丁醇。
在本發明的一實施例中，上述的誘導重組質體的方式為微好氧環境或厭氧環境。
在本發明的一實施例中，上述的培養宿主細胞的步驟包括在好氧環境下，培養宿主細胞至生長對數期的早期或生長對數期的晚期，接著轉換至厭氧環境下繼續培養。
在本發明的一實施例中，上述的厭氧環境培養中，每8小時至24小時將pH值調整為6.8至7.2，且將葡萄糖濃度調整為等於或高於20 g/L以上。
在本發明的一實施例中，上述的宿主細胞包括大腸桿菌。
在本發明的一實施例中，上述的宿主細胞中經剔除的基因包括pta基因、adhE基因、frdBC基因、ldhA基因或上述之組合。
基於上述，本發明實施例所提出的正丁醇表現匣、重組質體及正丁醇生產相關基因的表現方法包括宿主細胞本身的發酵調控元件，故可在不需要使用誘導物或抗生素的條件下以自動調控的方式來表現正丁醇生產相關基因。因此，本發明實施例有利於提高正丁醇生產相關基因產量以及降低正丁醇生產相關基因的生產成本。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
以下，將詳細描述本發明的實施例。然而，這些實施例為例示性，且本發明揭露不限於此。
在本發明的一實施例中，提供一種正丁醇表現匣，其包括正丁醇生產相關基因以及發酵調控元件。發酵調控元件用以調控正丁醇生產相關基因的表現且位於正丁醇生產相關基因的上游。發酵調控元件(fermentation regulatory elements, FRE)是參與發酵反應的基因(稱為發酵反應基因)的發酵調控元件，其包括啟動子、核糖體結合位點以及轉錄因子結合位點，如圖1A所示。
在一實施例中，所述發酵反應基因為參與將NADH氧化成NAD +或是產生ATP的基因。具體來說，所述發酵反應基因所參與之發酵反應包括醋酸發酵、酒精發酵、琥珀酸發酵或乳酸發酵。
圖1A是本發明的一實施例之發酵調控元件的示意圖。請參照圖1A，在一實施例中，所述發酵調控元件包括ackA基因的發酵調控元件(簡稱FRE ackA )、adhE基因的發酵調控元件(簡稱FRE adhE )、frdA基因的發酵調控元件(簡稱FRE frdA )或ldhA基因的發酵調控元件(簡稱FRE ldhA )。具體來說，本實施例使用的發酵調控元件包括ackA基因、adhE基因、frdA基因或ldhA基因的啟動子、核糖體結合位點以及轉錄因子結合位點。其中，ackA基因的發酵調控元件(FRE ackA )例如為具有啟動子P ackA 以及300基對(base pairs，bps)的SEQ ID NO:1的序列，adhE基因的發酵調控元件(FRE adhE )例如為具有啟動子P adhE1 、啟動子P adhE2 以及460基對的SEQ ID NO:2的序列，frdA基因的發酵調控元件(FRE frdA )例如為具有啟動子P frdA 以及250基對的SEQ ID NO:3的序列，ldhA基因的發酵調控元件(FRE ldhA )例如為具有啟動子P ldhA 以及180基對的SEQ ID NO:4的序列。
接著，請參照圖1A，為了清楚表示本發明的一實施例之發酵調控元件在染色體上的相對位置，特別標示出ackA基因的相鄰基因為yfbV基因；adhE基因的相鄰基因為ychE基因且相鄰啟動子為P ychE ；frdA基因的相鄰基因為epmA基因且相鄰啟動子為P epmA ；ldhA基因的相鄰基因為ydbH基因且相鄰啟動子為P ydbH 。
其中，正丁醇生產相關基因不為發酵反應基因或發酵反應基因所參與之發酵反應的上游產物基因。在一實施例中，所述正丁醇生產相關基因包括需要藉由將NADH氧化成NAD +的反應來生產的產物的基因。也就是說，所述發酵反應基因與所述正丁醇生產相關基因具有一致的特徵，就是兩者都參與需要NADH的反應。具體來說，正丁醇生產相關包括atoB基因、adhE2基因、crt基因、hbd基因、ter基因或fdh基因。
在本發明的一實施例中，藉由將前述的正丁醇表現匣選殖於表現載體中，以建構用於表現正丁醇生產相關基因的重組質體。
在一實施例中，表現載體例如是包括含有ColE1複製起點的表現載體、含有Cola複製起點的表現載體或含有pSC101複製起點的表現載體。
在本發明的一實施例中，正丁醇生產相關基因的表現方法包括以下步驟。首先，將前述的重組質體轉化於宿主細胞中，其中所述宿主細胞已剔除發酵反應基因以及發酵反應基因所參與之發酵反應的上游產物基因。接著，於發酵條件下培養宿主細胞，並誘導重組質體表現正丁醇生產相關基因。
在一實施例中，於所述宿主細胞中，參與將NADH氧化成NAD +的反應或是參與產生ATP的反應的基因已被剔除。在一實施例中，前述經剔除的基因為發酵反應基因或發酵反應基因所參與之發酵反應的上游產物基因。「上游產物基因」是指雖然不是發酵反應基因，但是其是發酵反應基因所參與的發酵反應路徑中產物的基因。在一實施例中，前述經剔除的基因例如是包括pta基因、adhE基因、frdBC基因或ldhA基因。
在本發明的一實施例中，培養宿主細胞的步驟包括在好氧環境下，培養宿主細胞至生長對數期的早期或生長對數期的晚期，接著轉換至厭氧環境下繼續培養。其中，藉由厭氧環境來誘導重組質體表現正丁醇生產相關基因，而不需另外添加誘導物。
接下來，將以實驗例來說明重組質體的建構以及使用重組質體來表現正丁醇生產相關基因的方法，以說明本發明所建立的正丁醇生產相關基因表現平台。
[重組質體的建構]
圖1B是依照本發明的一實驗例之不同重組質體的組合的示意圖。請參照圖1B，在本實驗例中，將上述的發酵調控元件FRE ackA 、FRE adhE 、FRE frdA 或FRE ldhA 分別選殖至含有ColE1複製起點的表現載體、含有Cola複製起點的表現載體或含有pSC101複製起點的表現載體中，使得發酵調控元件位於ColE1複製起點的下游、pSC101複製起點的下游或Cola複製起點的下游。如此一來，含有ColE1複製起點的表現載體可分別包括發酵調控元件FRE ackA 、FRE adhE 、FRE frdA 或FRE ldhA ，因此可以得到4種表現載體。相似地，亦可以藉由含有pSC101複製起點的表現載體建構4種表現載體，以及藉由含有Cola複製起點的表現載體建構4種表現載體。
而後，請參照圖1B，將包括atoB基因、adhE2基因、crt基因及hbd基因(即atoB-adhE2-crt-hbd)的基因片段依序選殖至上述4種含有ColE1複製起點的表現載體中，使得所述基因片段位於發酵調控元件的下游，而獲得如表1中的重組質體pRW13至pRW16。
再者，請參照圖1B，將fdh基因依序選殖至上述4種含有pSC101複製起點的表現載體中，使得fdh基因位於發酵調控元件的下游，而獲得如表1中的重組質體pRW17至pRW20。
此外，請參照圖1B，將ter基因選殖至上述4種含有Cola複製起點的表現載體中，使得ter基因位於發酵調控元件的下游，而獲得如表1中的重組質體pRW21至pRW24。
於重組質體pRW13~pRW24中，發酵調控元件皆位於正丁醇生產相關基因的上游，如此一來，發酵調控元件可控制正丁醇生產相關基因的表現。
[表1] <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 重組質體 </td><td> 基因型 </td></tr><tr><td> pRW13 </td><td> FRE<i><sub>ackA</sub></i> :: atoB-adhE2-crt-hbd；ColE1複製起點 </td></tr><tr><td> pRW14 </td><td> FRE<i><sub>adhE </sub></i>:: atoB-adhE2-crt-hbd；ColE1複製起點 </td></tr><tr><td> pRW15 </td><td> FRE<i><sub>frd</sub></i> :: atoB-adhE2-crt-hbd；ColE1複製起點 </td></tr><tr><td> pRW16 </td><td> FRE<i><sub>ldhA</sub></i> :: atoB-adhE2-crt-hbd；ColE1複製起點 </td></tr><tr><td> pRW17 </td><td> FRE<i><sub>ackA</sub></i> :: fdh；pSC101複製起點 </td></tr><tr><td> pRW18 </td><td> FRE<i><sub>adhE</sub></i> :: fdh；pSC101複製起點 </td></tr><tr><td> pRW19 </td><td> FRE<i><sub>frd</sub></i> :: fdh；pSC101複製起點 </td></tr><tr><td> pRW20 </td><td> FRE<i><sub>ldhA</sub></i> :: fdh；pSC101複製起點 </td></tr><tr><td> pRW21 </td><td> FRE<i><sub>ackA</sub></i> :: ter；Cola複製起點 </td></tr><tr><td> pRW22 </td><td> FRE<i><sub>adhE</sub></i> :: ter；Cola複製起點 </td></tr><tr><td> pRW23 </td><td> FRE<i><sub>frd</sub></i> :: ter；Cola複製起點 </td></tr><tr><td> pRW24 </td><td> FRE<i><sub>ldhA</sub></i> :: ter；Cola複製起點 </td></tr></TBODY></TABLE>
[篩選出較佳重組質體組合以生產正丁醇]
為了同時表現atoB基因、adhE2基因、crt基因、hbd基因、ter基因以及fdh基因，從4個含有ColE1複製起點的重組質體pRW13~pRW16中任選一個重組質體，以表現atoB-adhE2-crt-hbd基因；從4個含有pSC101複製起點的重組質體pRW17~pRW20中任選一個重組質體，以表現fdh基因；以及從4個含有Cola複製起點的重組質體pRW21~pRW24中任選一個重組質體，以表現ter基因。因此，會存在4x4x4=64種不同的重組質體組合來表現正丁醇生產相關基因，進而生產正丁醇。
接著，提供宿主細胞，其為已剔除pta基因、adhE基因、frdBC基因及ldhA基因的大腸桿菌突變株。然後，從前述64種不同的重組質體組合中任選出1種組合，且將所選的重組質體組合中轉化於大腸桿菌突變株中。
而後，在發酵條件下培養轉化後的大腸桿菌突變株。具體來說，先在好氧環境下，將轉化後的大腸桿菌突變株培養至生長靜止期(即OD 600約為4)，接著轉換至厭氧環境下繼續培養，且於厭氧環境培養24小時後，測量細胞生長密度及正丁醇生產量，結果如圖2所示。
由圖2可知，具有較佳正丁醇生產量的重組質體組合為FRE ackA:: atoB-adhE2-crt-hbd + FRE adhE:: fdh + FRE adhE:: ter。也就是說，含有FRE ackA:: atoB-adhE2-crt-hbd、FRE adhE:: fdh及FRE adhE:: ter的重組質體的大腸桿菌突變株(以下簡稱重組大腸桿菌突變株)能生產較多的正丁醇。
接下來，分別於以下生長條件下培養轉化有前述重組質體組合（FRE ackA:: atoB-adhE2-crt-hbd + FRE adhE:: fdh + FRE adhE:: ter）的大腸桿菌突變株，以找出正丁醇的最佳生產條件。
[供氧狀態及培養容器對正丁醇生產量的影響]
實驗例1
在好氧環境下，於含有抗生素的TB (Terrific Broth)培養基中將上述的重組大腸桿菌突變株培養至生長對數期，再轉換至燒瓶(flask)中於好氧環境下繼續培養。培養24小時後，測量細胞生長密度及正丁醇生產量。
實驗例2
使用與實驗例1類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別只在於以試管取代燒瓶作為培養容器，並且以微好氧(micro-aerobic)環境取代好氧環境作為繼續培養的條件。
實驗例3
使用與實驗例1類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別只在於以微好氧環境取代好氧環境作為繼續培養的條件。
實驗例4
使用與實驗例1類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別只在於以厭氧環境以取代好氧環境作為繼續培養的條件。
圖3為實驗例1至實驗例4的供氧狀態及培養容器對細胞生長密度及正丁醇生產量的關係圖。請參照圖3，微好氧環境下(實驗例3)與厭氧環境下(實驗例4，5.4 g/L)的正丁醇生產量(相近，但好氧環境下(實驗例1)的正丁醇生產量卻大幅地降低至0.6 g/L。此外，相較於以燒瓶作為培養容器且在微好氧環境下(實驗例3)的正丁醇生產量，以試管作為培養容器且在微好氧環境下(實驗例2)的正丁醇生產量只有2 g/L。也就是說，在厭氧環境下或是在未完全移除氧氣的微好氧環境下，皆能夠誘導重組質體中的發酵調控元件，以促使正丁醇生產相關基因表現。
[培養基對正丁醇生產量的影響]
實驗例5
在好氧環境下，於含有抗生素的TB培養基中將重組大腸桿菌突變株培養至生長對數期的中期，再轉換至燒瓶中並於厭氧環境下繼續培養。培養24小時後，測量細胞生長密度及正丁醇生產量。
實驗例6
使用與實驗例5類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別只在於以含有0.5%酵母提取物(yeast extract)的M9培養基取代TB培養基。其中，相較於酵母提取物提供細胞生長中所需的豐富營養物質，M9培養基中僅含有提供細胞生長所需的最低營養物質。
實驗例7
使用與實驗例5類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別只在於以M9培養基取代TB培養基。
圖4為實驗例5至實驗例7的培養基對細胞生長密度及正丁醇生產量的關係圖。請參照圖4，相較於使用TB培養基(實驗例5)的正丁醇生產量，使用含有0.5%酵母提取物的M9培養基(實驗例6)的正丁醇生產量減少約50%，而使用M9培養基(實驗例7)的正丁醇生產量更是顯著地減少約95%。換言之，要使得重組大腸桿菌突變株在厭養環境下能有效地生產正丁醇，其培養基中可能必需要包含具有豐富營養的營養物質，例如酵母提取物和/或胰蛋白(tryptone)。
[轉換至厭氧環境的時機對正丁醇生產的影響]
實驗例8
在好氧環境下，於含有抗生素的TB培養基中將重組大腸桿菌突變株培養至生長遲滯期(OD 600~0.03)，再轉換至試管中於厭氧環境下繼續培養，每培養24小時將pH值調整為6.8至7.2，且將葡萄糖濃度調整為20 g/L以上。培養72小時後，測量細胞生長密度及正丁醇生產量。
實驗例9
使用與實驗例8類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別只在於轉換至厭氧環境的時機，以生長對數期(即OD 600約為0.4)取代生長遲滯期(即OD 600約為0.03)。
實驗例10
使用與實驗例8類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別只在於轉換至厭氧環境的時機，以生長靜止期的早期(即OD 600約為2)取代生長遲滯期(即OD 600約為0.03)。
實驗例11
使用與實驗例8類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別只在於轉換至厭氧環境的時機，以生長靜止期的晚期(即OD 600約為9)取代生長遲滯期(即OD 600約為0.03)。
實驗例12
在厭氧環境下，於含有抗生素的TB培養基中將重組大腸桿菌突變株培養16~18小時，再將細胞生長密度濃縮至OD 600約為9，再轉換至燒瓶中並於厭氧環境下繼續培養。其中，每培養24小時將pH值調整為6.8至7.2，且將葡萄糖濃度調整為20 g/L以上。培養72小時後，測量細胞生長密度及正丁醇生產量。
也就是說，實驗例12使用與實驗例11類似的方法來培養重組大腸桿菌突變株，其差別在於轉換至燒瓶培養前是以「細胞是在厭氧環境下培養16~18小時後，再將細胞生長密度濃縮至OD 600約為9」取代「在好氧環境下培養至生長靜止期的晚期(OD 600約為9)」。
圖5A至圖5B分別為實驗例8至實驗例12的轉換至厭氧環境的時機對細胞生長密度及正丁醇生產量的關係圖。請參照圖5A，先培養至生長遲滯期(實驗例8)、先培養至生長對數期(實驗例9)或先培養至生長靜止期的早期(實驗例10)，再轉換至厭氧環境下繼續培養，皆可以誘導重組質體表現基因，且得到相似的正丁醇生產量(約為6~8 g/L)。然而，先培養至靜止期的晚期(實驗例11)再轉換至厭氧環境下繼續培養，所得到的正丁醇生產量則顯著地減少。
請參照圖5B，相較於實驗例11是先在好氧環境下培養至生長靜止期的晚期(OD 600約為9)，再轉換至厭氧環境時才開始表現正丁醇生產相關基因，實驗例12則是在開始生長時，就在厭氧環境下開始表現正丁醇生產相關基因。因此，實驗例12可以在濃縮且繼續培養24小時後，達到約10 g/L的正丁醇生產量。
[抗生素對正丁醇生產的影響]
實驗例13
在好氧環境下，於含有抗生素的TB培養基中將重組大腸桿菌突變株培養至生長對數期(OD 600約為0.4)，再轉換至燒瓶中並於厭氧環境下繼續培養，其中所使用的TB培養基不包含抗生素。每培養12小時，測量細胞生長密度及正丁醇生產量，且將pH值調整為6.8至7.2，以及將葡萄糖濃度調整為20 g/L以上。
實驗例14
在厭氧環境下，於不包含抗生素的TB培養基中將重組大腸桿菌突變株培養16~18小時後，再將細胞生長密度濃縮至OD 600約為9。接著，將細胞轉換至燒瓶中並於厭氧環境下繼續培養，其中培養基亦不包含抗生素。每培養24小時，測量細胞生長密度及正丁醇生產量，且將pH值調整為6.8至7.2，以及將葡萄糖濃度調整為20 g/L以上。
圖6A至圖6B分別為實驗例13至實驗例14的抗生素對細胞生長密度及正丁醇生產量的關係圖。請參照圖6A及圖6B，相較於實驗例9在轉換至厭氧環境後繼續使用含有抗生素的TB培養基，實驗例14是在轉換至厭氧環境後改使用不包含抗生素的TB培養基。由結果得知，在厭氧環境下使用不包含抗生素的TB培養基的培養方式，對於細胞生長密度及正丁醇生產量並不會造成顯著的變化。
請參照圖6A及圖6B，相較於實驗例12使用含有抗生素的TB培養基，實驗例14是使用不包含抗生素的TB培養基。由結果得知，在厭氧環境下使用不包含抗生素的TB培養基的培養方式，對於細胞生長密度及正丁醇生產量並不會造成顯著的變化。
換言之，在厭氧環境下，使用不包含抗生素的TB培養基培養重組大腸桿菌突變株時，重組質體不會被重組大腸桿菌突變株排出，而是仍然存在於重組大腸桿菌突變株中，以持續表現基因而生產正丁醇。
綜上所述，本發明所提出的正丁醇表現匣包括發酵調控元件及正丁醇生產相關基因，其中發酵調控元件例如是可在厭氧環境或微好氧環境下誘導正丁醇生產相關基因表現。也就是說，藉由宿主細胞本身對於發酵調控元件的控制，不需要添加誘導物就能表現正丁醇生產相關基因。此外，宿主細胞為了能在厭氧環境下生長，必須將含有發酵調控元件的重組質體留在宿主細胞中。藉由此特性，本發明不需要添加抗生素或誘導物就能避免宿主細胞將重組質體排出，使得宿主細胞能持續表現正丁醇生產相關基因。換言之，使用本發明之含有發酵調控元件的正丁醇表現匣所建構的重組質體，可在不需額外添加誘導物或抗生素的條件下表現正丁醇生產相關基因，因此為可自我調控的生產平台。如此一來，應用此生產平台將能大幅提升產品品質與產量或是降低產品生產成本。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
無。
圖1A是本發明的一實施例之發酵調控元件的示意圖。 圖1B是依照本發明的一實驗例之不同重組質體的組合的示意圖。 圖2是依照本發明的一實驗例之不同重組質體的組合對細胞生長密度及正丁醇生產量的關係圖。 圖3為實驗例1至實驗例4的供氧狀態及培養容器對細胞生長密度及正丁醇生產量的關係圖。 圖4為實驗例5至實驗例7的培養基對細胞生長密度及正丁醇生產量的關係圖。 圖5A為實驗例8至實驗例12的轉換至厭氧環境的時機對細胞生長密度的關係圖。 圖5B為實驗例8至實驗例12的轉換至厭氧環境的時機對正丁醇生產量的關係圖。 圖6A為實驗例13至實驗例14的抗生素對細胞生長密度的關係圖。 圖6B為實施例13至實施例14的抗生素對正丁醇生產量的關係圖。
＜110＞ 國立清華大學 ＜120＞ 正丁醇表現匣、重組質體及正丁醇生產相關基因的表現方法 ＜160＞ 4 ＜210＞ 1 ＜211＞ 300 ＜212＞ DNA ＜213＞ Escherichia coli＜400＞ 1 ackA的FRE序列 tgtgcaaattcacaactcagcgggacaacgttcaaaacattttgtcttccatacccactatcaggtatcctttagcagcctgaaggcctaagtagtacatattcattgagtcgtcaaattcatatacattatgccattggctgaaaattacgcaaaatggcatagactcaagatatttcttccatcatgcaaaaaaaatttgcagtgcatgatgttaatcataaatgtcggtgtcatcatgcgctacgctctatggctccctgacgtttttttagccacgtatcaattataggtacttcc ＜210＞ 2 ＜211＞ 460 ＜212＞ DNA ＜213＞ Escherichia coli＜400＞ 2 adhE的FRE序列 aaagccggataatgttagccataaataaggttgaaaagacgcgctgacaatacgccttttgacagcatttttcacctcctaactacttaaaattgctatcattcgttattgttatctagttgtgcaaaacatgctaatgtagccaccaaatcatactacaatttattaactgttagctataatggcgaaaagcgatgctgaaaggtgtcagctttgcaaaaatttgatttggatcacgtaatcagtacccagaagtgagtaatcttgcttacgccacctggaagtgacgcattagagataataactctaatgtttaaactcttttagtaaatcacagtgagtgtgagcgcgagtaagcttttgattttcataggttaagcaaatcatcaccgcactgactatactctcgtattcgagcagatgatttactaaaaaagtttaacattatcaggagagcatt ＜210＞ 3 ＜211＞ 250 ＜212＞ DNA ＜213＞ Escherichia coli＜400＞ 3 frd的FRE序列 atcaaacagcggtgggcagtgactaaaaaaagcacgatctgatggtttagtaattaaattaatcatcttcagtgataatttagccctcttgcgcactaaaaaaatcgatctcgtcaaatttcagacttatccatcagactatactgttgtacctataaaggagcagtggaatagcgttcgcagaccgtaactttcaggtacttaccctgaagtacgtggctgtgggataaaaacaatctggaggaatgtc ＜210＞ 4 ＜211＞ 180 ＜212＞ DNA ＜213＞ Escherichia coli＜400＞ 4 ldhA的 FRE序列 aaattaagcattcaatacgggtattgtggcatgtttaaccgttcagttgaaggttgcgcctacactaagcatagttgttgatgaatttttcaatatcgccatagctttcaattaaatttgaaattttgtaaaatatttttagtagcttaaatgtgattcaacatcactggagaaagtctt

Claims (8)

  1. 一種正丁醇表現匣，包括：一正丁醇生產相關基因，包括atoB基因、adhE2基因、crt基因、hbd基因、ter基因或fdh基因；以及一發酵調控元件，用以調控所述正丁醇生產相關基因的表現且位於所述正丁醇生產相關基因的上游，所述發酵調控元件包括發酵反應基因的啟動子、核糖體結合位點以及轉錄因子結合位點，其中所述發酵反應基因為ackA基因、adhE基因、frdA基因或ldhA基因，其中當所述發酵反應基因為ackA基因時，所述發酵調控元件具有SEQ ID NO：1的序列，其中當所述發酵反應基因為adhE基因時，所述發酵調控元件具有SEQ ID NO：2的序列，其中當所述發酵反應基因為frdA基因時，所述發酵調控元件具有SEQ ID NO：3的序列，其中當所述發酵反應基因為ldhA基因時，所述發酵調控元件具有SEQ ID NO：4的序列，其中所述發酵調控元件所參與之發酵反應包括醋酸發酵、酒精發酵、琥珀酸發酵或乳酸發酵，所述正丁醇表現匣在不需添加誘導物或抗生素的條件下表現所述正丁醇生產相關基因。
  2. 一種重組質體，用於表現正丁醇生產相關基因，包括：一表現載體；以及一如申請專利範圍第1項所述的正丁醇表現匣，選殖於所述表現載體中。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的重組質體，其中所述表現載體包括含有ColE1複製起點的表現載體、含有Cola複製起點的表現載體或含有pSC101複製起點的表現載體。
  4. 一種正丁醇生產相關基因的表現方法，包括：將如申請專利範圍第2項或第3項所述的重組質體轉化於宿主細胞中，其中所述宿主細胞已剔除pta基因、adhE基因、frdBC基因以及ldhA基因；於發酵條件下培養所述宿主細胞，並誘導所述重組質體表現所述正丁醇生產相關基因。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的正丁醇生產相關基因的表現方法，其中誘導所述重組質體的方式為厭氧環境。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的正丁醇生產相關基因的表現方法，其中培養所述宿主細胞的步驟包括：在好氧環境下，培養所述宿主細胞至生長對數期的早期或生長對數期的晚期；以及轉換至厭氧環境下繼續培養。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的正丁醇生產相關基因的表現方法，其中所述厭氧環境培養中，每8小時至24小時將pH值調整為6.8至7.2，且將葡萄糖濃度調整為等於或高於20g/L以上。
  8. 如申請專利範圍第4項所述的正丁醇生產相關基因的表現方法，其中所述宿主細胞包括大腸桿菌。
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