KR20220025538A - 일산화탄소로부터 유기산을 고효율로 생산하기 위한 상호공생 미생물 컨소시엄을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

일산화탄소로부터 유기산을 고효율로 생산하기 위한 상호공생 미생물 컨소시엄을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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Abstract

일산화탄소로부터 유기산을 고효율로 생산하기 위한 상호공생 미생물 컨소시엄을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 일산화탄소 대사 이용 균주와 아세트산 대사 이용 균주로 이뤄진 미생물 컨소시엄의 개발은, 미생물의 일산화탄소 대사 안정성뿐만 아니라 일산화탄소로부터의 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP) 및 이타콘산(itaconic acid; ITA)의 생산을 현저하게 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 일산화탄소의 활용성을 제시하고, 이로부터 생산되는 3-HP과 ITA의 경제성을 높일 수 있는바, 해당 생산물들이 활용되는 합성수지, 라텍스 및 식품첨가물 등의 산업 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

일산화탄소로부터 유기산을 고효율로 생산하기 위한 상호공생 미생물 컨소시엄을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법 {Composition comprising mutualistic microbial consortia for high efficiency production of organic acid and method for using thereof}
본 발명은 일산화탄소로부터 유기산을 고효율로 생산하기 위한 상호공생 미생물 컨소시엄을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
미생물을 이용한 특정 물질의 생산방법에 대한 가격경쟁력을 높이기 위해서, 값싸고 풍부한 다양한 탄소원을 사용하려는 연구가 이루어지고 있다. 특히, 일산화탄소는 석유 정제 공정이나 철강 제련 공정에서 발생하는 부생가스에 풍부하게 존재하는 탄소원으로, 부생가스로부터의 수득이 용이하다는 장점 때문에 미생물 발효를 통한 고부가가치 물질 생산에서 매우 잠재력이 높은 탄소원으로 주목을 받고 있다. 특히, 최근 일산화탄소를 자연적으로 대사할 수 있는 일산화탄소 대사균주들이 발견되고 해당 균주들에 관한 연구가 활발히 진행됨에 따라, 미생물 발효를 통한 일산화탄소 유래의 고부가가치 물질 생산기술 개발에 대한 관심이 증가하고 있다.
그럼에도, 현재 미생물 발효를 통해서 일산화탄소로부터 고부가가치 물질을 생산하는데에는 기술적인 한계가 있는데, 미생물을 통한 일산화탄소 대사에서의 불안정성과 일산화탄소 대사균주의 유전자 조작에 관한 기술적인 한계가 주요한 원인으로 여겨진다.
특히, 일산화탄소의 독성에 의해 발생되는 일산화탄소 대사 활성의 급격한 저하는 일산화탄소를 기질로 하는 미생물 발효 공정 개발에 있어 매우 큰 문제로 여겨진다. 일산화탄소는 미생물 내에 존재하는 금속 효소의 활성을 저해함으로써 미생물의 호흡이나 DNA 복제, 에너지 생산 등에 영향을 끼치며, 이로 인해 미생물에 대한 독성을 가질 수 있는 것으로 알려졌다. 이러한 일산화탄소의 독성은 미생물의 대사 활성에 치명적인 영향을 미칠 수 있으며, 결과적으로 미생물의 일산화탄소 대사 활성을 급격하게 저하시키는 원인이 된다. 이처럼, 미생물에 대한 일산화탄소의 독성은 안정적이고 지속적인 일산화탄소의 고부가가치 물질로의 전환을 불가능하게 하기 때문에, 일산화탄소를 기질로 하는 미생물 발효 공정 개발에 있어 매우 큰 문제점으로 여겨진다.
미생물에 대한 일산화탄소의 독성을 저감시키기 위해서는, 일산화탄소 기체로부터 배지로의 물질 전달 제한조건에서 미생물 배양을 수행하는 것이 중요하다. 물질 전달 제한조건이란, 미생물에 의한 일산화탄소 대사 속도가 기체상으로부터 액체상으로의 일산화탄소의 물질 전달 속도보다 빠른 상태를 말하며, 해당 조건에서는 미생물에 의해 빠른 속도로 일산화탄소 대사가 진행되기 때문에 배지 내에 용존 일산화탄소가 거의 존재하지 않아 균주들이 받는 일산화탄소에 의한 독성을 최소화할 수 있다. 따라서, 안정적이고 지속적인 일산화탄소 기반의 미생물 배양을 위해서는, 이러한 일산화탄소의 물질 전달 제한조건의 유지가 중요하다. 하지만, 미생물의 대사 활성은 다양한 원인에 의해 시간이 지남에 따라 점진적으로 저하될 수 있으며, 이는 일산화탄소의 물질 전달 제한조건 유지를 방해하는 요인이 되어왔다.
일산화탄소 대사균주들에 대한 부족한 유전적 정보나 유전자 조작에서의 어려움 또한 일산화탄소를 기질로 하는 미생물 발효 공정을 통한 고부가가치 물질 생산의 한계점으로 여겨진다. 일산화탄소를 대사하여 아세트산을 주요산물로 생산하는 것으로 알려진 아세토젠의 경우 일산화탄소로부터 고부가가치 물질을 생산하기 위해 가장 활발히 활용되어 왔으며, 해당 균주들을 사용하여 일산화탄소로부터 아세트산이나 부틸산, 에탄올, 부탄올 등을 생산하기 위한 연구가 이뤄진 바 있다. 하지만, 아세토젠의 제한된 유전적 정보와 유전자 조작기술의 한계 때문에 생산 가능한 물질이 제한되어 왔으며, 효율적으로 다양한 고부가가치 물질을 생산하기 어렵다는 한계가 있다.
그동안 미생물을 활용한 발효 공정을 위해 공정에서의 불확실성을 최소화하기 위하여 단일 미생물 균주의 배양이 선호되어 왔지만, 최근에는 다종 균주의 공동배양을 통한 미생물 컨소시엄이 가지는 장점들이 주목을 받고 있다. 그동안 선호되어 온 단일 균주 배양을 통한 미생물 발효 공정과는 다르게, 자연계의 미생물은 단일 종의 개체군을 형성하는 것이 아니라 서로 다른 유형의 사회적 상호 작용을 통해 다종 균주의 공동체 네트워크(미생물 컨소시엄)를 형성하여 생존하고 있다. 이러한 미생물들은 지속적으로 변화하는 환경에 대한 적응의 결과로, 다양한 상호관계를 가지는 미생물 컨소시엄을 형성할 수 있는 것으로 알려졌다. 특히, 상호공생 관계는 여러 종이 협력하여 네트워크 전체의 이익을 창출하는 메커니즘이며, 이러한 상호공생 관계는 공동체를 구성하는 종들의 공존을 촉진하기 때문에 생물학적 네트워크의 안정성을 향상시킬 수 있을 것으로 알려졌다. 또한, 최근에는 이러한 미생물 컨소시엄 내에서 형성되는 종간 상호관계를 다양한 목적을 가지는 효율적인 생물학적 공정에 적용하기 위한 연구들이 이루어지고 있다.
한국등록특허 제10-2073308호 (2020.01.29.) 한국등록특허 제10-2089516호 (2020.03.10.)
이에 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하고 일산화탄소로부터 고부가가치의 물질들을 안정적이고 효율적으로 생산하기 위하여, 상호공생 관계의 합성 미생물 컨소시엄을 개발하였으며, 이를 활용한 일산화탄소의 안정적이고 지속적인 대사 및 고부가가치 물질의 생산 가능성을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유기산 고효율 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유기산 고효율 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 일산화탄소 대사 이용 균주 및 아세트산 대사 이용 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 유기산 고효율 생산 방법을 제공한다.
한편, 본 발명은 일산화탄소 대사 이용 균주 및 아세트산 대사 이용 균주를 포함하는 유기산 고효율 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 일산화탄소 대사 이용 균주와 아세트산 대사 이용 균주로 이뤄진 미생물 컨소시엄의 개발은, 미생물의 일산화탄소 대사 안정성뿐만 아니라 일산화탄소로부터의 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP) 및 이타콘산(itaconic acid; ITA)의 생산을 현저하게 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 일산화탄소의 활용성을 제시하고, 이로부터 생산되는 3-HP과 ITA의 경제성을 높일 수 있는바, 해당 생산물들이 활용되는 합성수지, 라텍스 및 식품첨가물 등의 산업 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 아세트산 첨가에 따른 유박테리엄 리모섬 균주의 일산화탄소 대사활성을 확인한 도이다.
도 2는 본 발명 합성 미생물 컨소시엄의 설계 모식도이다. a는 상호공생 관계의 합성 미생물 컨소시엄에서 일산화탄소 소비의 안정화 및 개선된 고부가가치 물질 생산을 위한 개략도이고, b는 본 발명 합성 미생물 컨소시엄에서 일산화탄소로부터 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 이타콘산(ITA)로의 생합성 경로의 개략도이다.
도 3은 야생형 대장균의 호기성 및 혐기성 배양 조건에서 아세트산 대사를 확인한 도이다.
도 4는 산화제 종류가 균주의 대사에 미치는 영향을 확인한 도이다. a는 야생형 대장균의 아세트산 대사를 확인한 결과이고, b는 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사활성을 확인한 결과이다.
도 5는 균주에서 일산화탄소 주입에 의한 독성에 따른 a: 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 소비 저해 및 b: 대장균의 아세트산 소비저해를 확인한 도이다.
도 6은 물질 전달 제한조건 확인을 위해 단일배양에서 유박테리엄 리모섬에 대한 일산화탄소 대사활성을 평가한 도이다.
도 7은 시간에 따른 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사 및 아세트산의 생산을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명 재조합 대장균의 아세트산 대사에 따른 대사 산물 생산능을 확인한 도이다. a는 재조합 CL 대장균의 아세트산 대사에 따른 3-HP의 생산능을 확인한 결과이고, b는 재조합 WCIAG4 대장균의 아세트산 대사에 따른 ITA의 생산능을 확인한 결과이다.
도 9는 유박테리엄 리모섬의 단독 배양 및 재조합 CL 대장균과 유박테리엄 리모섬의 공동배양에 따른 일산화탄소 유래 3-HP 생산을 비교한 도이다. a는 총 일산화탄소 소비를 확인한 결과이고, b는 아세테이트 축적을 확인한 결과이며, c는 3-HP의 생산을 확인한 결과이다.
도 10은 공동배양에서 본 발명의 CL 대장균의 농도 증가에 따른 대사변화를 비교한 도이다. a는 CL 대장균의 농도 및 배양 시간에 따른 일산화탄소의 소비능을 확인한 결과이고, b는 CL 대장균의 농도에 따른 총 일산화탄소 소비량을 확인한 결과이며, c는 CL 대장균의 농도에 따른 아세테이트 축적량을 확인한 결과이고, d는 CL 대장균의 농도에 따른 3-HP 생산량을 확인한 결과이며, e는 배양 시간에 따른 일산화탄소 흡수량, 아세테이트 축적량 및 3-HL 생산량을 확인한 결과이다.
도 11은 공동배양에서 본 발명의 WCIAG4 대장균의 농도 증가에 따른 대사변화를 비교한 도이다. a는 WCIAG4 대장균의 농도 및 배양 시간에 따른 일산화탄소의 흡수능을 확인한 결과이고, b는 WCIAG4 대장균의 농도에 따른 총 일산화탄소 흡수량을 확인한 결과이며, c는 WCIAG4 대장균의 농도에 따른 아세테이트 축적량을 확인한 결과이고, d는 CL 대장균의 농도에 따른 ITA 생산량을 확인한 결과이며, e는 배양 시간에 따른 일산화탄소 흡수량, 아세테이트 축적량 및 ITA 생산량을 확인한 결과이다.
본 발명자는 미생물 배양을 통한 일산화탄소 유래의 고부가가치 물질 생산에서, 일산화탄소의 독성과 일산화탄소 대사 균주의 유전자 조작기술의 부재를 해결하고자 하였다. 일산화탄소 대사 아세토젠은 일산화탄소로부터 독성 대사물질인 아세트산을 고생산하는데, 본 발명자들은 이러한 아세트산의 축적이 아세토젠의 대사활성에 부정적인 영향을 줄 것이라고 가정하였고, 이러한 가정을 기반으로 상호공생 관계의 합성 미생물 컨소시엄을 개발하였으며, 이를 활용한 일산화탄소의 안정적이고 지속적인 대사 및 고부가가치 물질의 생산 가능성을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 일산화탄소 대사 이용 균주 및 아세트산 대사 이용 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 유기산 고효율 생산 방법 및 일산화탄소 대사 이용 균주 및 아세트산 대사 이용 균주를 포함하는 유기산 고효율 생산용 조성물을 제공한다. 이때, 유기산은, 바람직하게는 아세톤산, 아디프산, 아스코르브산, 아크릴산, 시트르산, 2,5-다이케토-D-글루콘산, 포름산, 푸마르산, 글루카르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루타르산, 3-하이드록시프로피온산, 이타콘산, 락트산, 말레산, 말산, 말론산, 옥살산, 옥살로아세트산, 프로피온산, 숙신산 및 자일자일론부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 또는 이타콘산(itaconic acid)인 것이 좋다.
본 발명에 있어서, "3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)"은 화학식 C3H6O3, 분자량 90.08MW, 25℃에서 pKa 4.51인 약산으로, 구조적으로 탄소 3개를 가지는 비카이랄 유기산으로 젖산(2-하이드록시프로피온산)과 이성질체이다. 상기 3-HP는 비결정질이고, 시럽과 같은 연한 노란색을 띠며, 비중은 1.25, 굴절률은 1.45이다.
상기 3-HP는 여러 화학공정에 사용되는 중요한 합성 중간체로, 1,3-프로판디올 (C3H8O2 - MW 76.09), 아크릴산 (C3H4O2 - MW 72.06), 메틸 아크릴에이트 (C4H6O2 - MW 86.09), 아크릴아미드 (C3H5NO - MW 71.08), 에틸 3-하이드록시프로피온산 (C5H103 - MW 118.13), 말로닉산 (C3H4O4 - MW 104.06), 프로피온락톤 (C3H4O2 - MW 72.06), 아크로니트릴 (C3H4N - MW 53.06) 등을 생산할 수 있는 원료로 사용된다. 상기 3-HP는 에틸렌 사이아노하이드린, 베타-아이도프로피온산, 베타-브로모프로피온산, 베타-클로로프로피온산, 베타-프로피오락톤, 아크릴산 등을 중간체로 하여 화학적 공정을 통해 생산될 수 있고, 글리세롤로부터 생물학적 공정을 통해 생산될 수도 있다.
보다 구체적으로, 생물학적으로 여러 효소가 촉매하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 3-HP를 생산할 수 있으며, 첫 번째 단계는 글리세롤 디하이드라타제(glycerol dehydratase)에 의해 글리세롤을 탈수화시켜 중간물질인 3-하드록시프로피온알데히드 생산 반응을 촉매시키는 반응이며, 두 번째 단계는 알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase)에 의해 3-히드록시프로피온알데히드가 탈수소화되는 반응이다. 3-HP의 생산에 있어서, 두 단계의 대사적 활성도가 균형이 맞지 않아 중간 산물인 3-HPA가 세포 내에 축적될 경우 세포 성장이 저해되고, 3-HP의 생산성이 떨어지게 된다.
본 발명은 3-HP 생합성 회로의 최적화를 달성하기 위하여, 대사 공학적인 접근 방법을 통하여 3-HPA의 축적을 방지하고 3-HP의 생산성을 높이기 위한 새로운 방법을 제공하고자 하였다.
본 발명에 있어, "이타콘산(itaconic acid)"은 탄소 5개로 이루어진 디카르복실산으로, 구조적 특성으로 인하여 플라스틱 및 라텍스 등과 같은 고분자 합성의 전구체로 이용된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명은 일산화탄소 대사균주의 일산화탄소 대사 안정성 향상을 위한 미생물 컨소시엄 배양 방법을 제공하는데, 상기 미생물 컨소시엄은 두 종류 이상의 균주를 공동배양하는 것을 의미한다. 본 발명의 목표는 일산화탄소 대사균주와 재조합 미생물로 구성된 미생물 컨소시엄을 구축함으로써 일산화탄소로부터 효율적으로 고부가가치 물질을 생산하는 데에 있다.
본 발명의 유기산 고효율 생산 방법에 있어, 상기 공동배양은, 바람직하게는 대체전자 수용체가 추가된 혐기성 조건에서 수행되는 것이 좋다. 이때, 상기 대체전자 수용체는, 바람직하게는 질산염 (nitrate) 또는 TMAO (trimethylamine N-oxide)인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 TMAO (trimethylamine N-oxide)인 것이 좋다. 본 발명의 일 실시예에서는 산화제로써, 질산염(nitrate), 아질산염(nitrite), DMSO (dimethyl sulfoxide), TMAO (trimethylamine N-oxide), 푸마르산염(fumarate)을 이용하였을 시, 그 중 질산염 및 TMAO가 재조합 미생물의 빠른 아세트산 대사를 가능하게 하였고, 특히 TMAO 첨가에 의해 일산화탄소 대사 활성에 대한 저감 효과가 낮아졌음을 확인하였다.
본 발명에 있어, 일산화탄소 대사균주란 생물학적으로 일산화탄소를 탄소원으로 사용할 수 있는 미생물을 의미한다. 자연계에 존재하는 대표적인 일산화탄소 대사균주로는 유박테륨 리모숨 (Eubacterium limosum), 무렐라 서모아세티카 (Moorella thermoacetica), 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii), 시트로박터 아말로나티쿠스 (Citrobactor amalonaticus) Y19 등이 있다. 일산화탄소의 생물학적 대사는 주로 일산화탄소 탈수소 효소에 의해 일산화탄소가 이산화탄소로 산화되는 과정으로부터 시작되며, 해당 산화 과정으로부터 얻은 환원력을 사용하여 미생물의 성장 및 생존에 필요한 에너지를 생산하는 것으로 알려졌다. 이때, 환원력을 사용하여 에너지를 얻는 경로에 따라 일산화탄소 대사균주는 황산염 환원균, 수소 생성균, 메탄 생성균, 아세토젠으로 분류된다.
본 발명의 유기산 고효율 생산 방법에 있어, 상기 일산화탄소 대사 이용 균주는, 바람직하게는 아세토젠(acetogen)인 것이 좋다.
본 발명의 구체적 예에 있어서, 상기 일산화탄소 대사균주는 박테리아, 고세균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 유박테리엄 (Eubacterium) 속 또는 클로스트리디움 (Clostridium) 속 미생물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 유박테리엄 리모섬 (Eubacterium limosum) 또는 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei)일 수 있다. 하지만, 본 발명에서 사용되는 일산화탄소 대사균주는 일산화탄소를 생물학적으로 대사 가능한 미생물이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 유기산 고효율 생산 방법에 있어, 상기 아세트산 대사 이용 균주는, 바람직하게는 아세트산으로부터 유기산을 생산하는 대사경로가 도입된 재조합 미생물인 것이 좋다.
특히, 본 발명에 있어서, "일산화탄소 대사균주와 공생 가능한 재조합 미생물"은, 일산화탄소 대사균주가 생산하는 아세트산을 대사물질로 이용하여 목적하는 유용한 유기산을 합성할 수 있는 미생물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 "재조합 미생물"은 재조합 벡터로 형질전환된 것을 말한다. 본 발명에서 "형질전환"은 본 발명에 따른 프로모터, 또는 추가적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입 하는 것을 의미한다. 또한, 형질전환 된 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 에스케리치아 (Escherichia) 속 미생물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 대장균 (Escherichia coli)일 수 있다. 하지만, 본 발명에서 사용되는 재조합 미생물은 아세트산을 대사하여 고부가가치 물질을 생산할 수 있는 미생물이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적 예에 있어, 상기 재조합 미생물은, 바람직하게는 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 생산용 재조합 대장균이며, 대장균 W 균주에서, 클로로플렉서스 아우란티아커스 (Chloroflexus aurantiacus) 유래 mcr 유전자 및 acs 유전자가 과발현된 것이 좋다.
본 발명에서 용어 "야생형 대장균"은 대장균 W 균주의 야생형 (wild type) 균주를 의미하고, 용어 "재조합 대장균"은 대장균 W 균주에서 클로로플렉서스 아우란티아커스 (Chloroflexus aurantiacus) 유래 mcr 유전자 및 acs 유전자가 과발현된 균주를 의미하며, 용어 "대장균"은 야생형 대장균과 재조합 대장균을 모두 포함하는 전반적인 의미로 사용되었다.
구체적으로 상기 재조합 대장균은 말로닐-코에이 의존적 대사회로에서, 아세트산은 내생 효소를 통해 아세틸-코에이를 거쳐 말로닐-코에이로 전환되며, 이는 클로로플렉스스 아우란티아커스 유래의 외래 효소인 말로닐-코에이 환원효소를 통해 3-HP로 전환된다. 따라서, 본 발명에서는 대장균 W 균주 내에 말로닐-코에이 환원효소를 암호화하고 있는 외래 유전자인 mcr 유전자를 과발현하였다.
또한, 대장균의 아세트산 대사속도를 향상시키기 위하여 아세틸-코에이 합성효소를 암호화하는 내생 유전자인 acs 유전자를 과발현하였다.
상기 재조합 대장균은, 말로닐-코에이 환원효소의 활성을 향상시키기 위하여 해당 효소에 기존에 알려진 3개의 돌연변이 (N940V, K1106W 및 S1114R)를 추가적으로 가할 수 있으며, 글라이옥실산 회로에 포함된 aceBAK 유전자의 발현 억제인자를 암호화하고 있는 iclR 유전자의 결실을 추가적으로 유도함으로써 글라이옥실산 회로를 활성화할 수도 있다.
또한, 상기 재조합 미생물은, 바람직하게는 이타콘산(itaconic acid) 생산용 재조합 대장균이며, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 합성 5' UTR(untranslated region), cad 유전자, acs 유전자, aceA 유전자 및 gltA 유전자가 과발현되고, icIR 유전자가 결실된 것이 좋다.
더욱 구체적으로, 상기 재조합 미생물은, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 합성 5' UTR(untranslated region) 및 cad 유전자를 포함하는 cad 유전자 발현 카세트를 포함하는 이타콘산(itaconic acid) 생산용 재조합 벡터; acs 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터; 및 aceA 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터; 및 gltA 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터;로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 재조합 벡터;가 도입되고, icIR 유전자가 결실된 것으로, 본 발명자가 한국등록특허 제10-1973001호를 통해 공개한 재조합 균주이다. 따라서, 해당 균주에 대한 자세한 내용은 한국등록특허 제10-1973001호를 참고할 수 있다.
본 발명의 유기산 고효율 생산 방법에 있어, 상기 일산화탄소 대사 이용 균주 및 아세트산 대사 이용 균주는, 바람직하게는 1~5 : 1의 세포 농도로 첨가되는 것이 좋다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기한 조건으로 양 균주를 혼합시, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 이타콘산(itaconic acid)의 고효율 생산이 가능함을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "효소 활성 제한조건"이란, 유박테리엄 리모섬에 의한 일산화탄소 대사 속도가 기체상으로부터 액체상으로의 일산화탄소의 물질 전달 속도보다 느린 상태를 말하며, 해당 조건에서는 기체상의 일산화탄소 분압에 의해 배지 내에 용존 일산화탄소가 존재하기 때문에 균주들이 일산화탄소에 의한 독성 효과를 받게 된다.
본 발명에 있어서 "벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 합성 미생물 컨소시엄의 설계 및 공동배양 조건 설정]
1. 유박테리엄 리모섬과 재조합 대장균으로 구성된 미생물 컨소시엄의 설계
본 발명자는 미생물 배양을 통한 일산화탄소 유래의 고부가가치 물질 생산에서, 일산화탄소의 독성과 일산화탄소 대사 균주의 유전자 조작기술의 부재를 해결하기 위해, 상호공생 관계의 미생물 컨소시엄 전략을 사용하고자 하였다.
일산화탄소 대사 아세토젠은 일산화탄소로부터 독성 대사물질인 아세트산을 고생산하는데, 본 발명자들은 이러한 아세트산의 축적이 아세토젠의 대사활성에 부정적인 영향을 줄 것이라고 가정하였다. 실제로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 대표적인 아세토젠 균주인 유박테리엄 리모섬 균주는, 배지에 아세트산을 첨가함에 따라 균주의 일산화탄소 대사활성이 점진적으로 저해됨을 확인할 수 있었다.
대사산물 축적에 의한 아세토젠의 대사활성 감소는 일산화탄소의 물질 전달 제한조건의 유지를 어렵게 하며, 결과적으로 미생물에 대한 일산화탄소에 의한 독성을 증폭시키는 결과를 야기할 수 있다. 따라서, 아세트산을 탄소원으로 사용하여 고부가가치 물질을 고효율로 생산할 수 있는 타종의 재조합 미생물을 아세토젠과 공동배양한다면, 플랫폼 미생물이 아세트산을 지속적으로 소모함에 따라 아세토젠의 일산화탄소 대사활성을 보다 오래 유지할 수 있을 것이다. 이러한 미생물 컨소시엄에서는 아세토젠과 고부가가치 물질생산 재조합 균주가 서로에게 도움이 되는 상호공생 관계에 있다고 할 수 있다. 또한, 이러한 미생물 컨소시엄 전략은 유전자 조작이 매우 용이한 고부가가치 물질 고생산 균주들을 다양하게 적용할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 일산화탄소로부터 생산되는 고부가가치 물질의 다양성 또한 향상시킬 수 있는 전략이라고 생각하였다.
일산화탄소로부터 고부가가치 물질의 효율적인 생산을 위해서, 도 2에 나타낸 바와 같이, 유박테리엄 리모섬과 재조합 대장균 (하기 실시예 2 참고)으로 구성된 미생물 컨소시엄을 설계하였다. 유박테리엄 리모섬은 일산화탄소를 단일탄소원으로 사용하여 아세트산을 주요 발효산물로 생산하는 우드-융달 대사경로(Wood-Ljungdahl pathway)를 가지고 있다. 대장균은 아세트산을 포함하는 다양한 탄소원으로부터 고부가가치 생산물의 생산을 위해서 가장 널리 이용되는 플랫폼 균주 중 하나이다. 특히 대장균 W 균주는 아세트산에 관한 높은 내성을 가지는 것으로 잘 알려졌기 때문에 본 발명에서 사용할 균주로 선정하였다.
따라서, 본 발명에서는 아세트산으로부터 고부가가치 생산물을 효율적으로 생산하도록 개량된 재조합 대장균 (하기 실시예 2 참고)과 유박테리엄 리모섬을 공동배양함으로써 미생물 컨소시엄을 구축한다면, 일산화탄소로부터 아세트산을 거쳐 원하는 고부가가치 생산물을 효율적으로 생산하는 공정을 개발할 수 있다고 가정하였다.
2. 유박테리엄 리모섬과 대장균의 단일 배양
본 발명에서 설명되는 유박테리엄 리모섬과 대장균을 포함하는 모든 균주의 배양은 산소 분자가 없는 혐기성 조건에서 진행되었다. 균주 배양을 위한 최소배지로는 PBBM 배지(0.9g/L NaCl, 0.3g/L MgSO4·7H2O, 0.2g/L CaCl2·2H2O, 2g/L NH4Cl, 50mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 0.5g/L L-cysteine·HCl, 20mL trace mineral solution, 20mL vitamin solution, 0.02g/L resazurin)가 사용되었으며, 균주 배양을 위한 복합배지로는 RCM 배지 (10g/L peptone, 10g/L beef extract, 3g/L yeast extract, 5g/L dextrose, 5g/L NaCl, 0.5g/L L-cysteine·HCl, 3g/L sodium acetate 및 0.02g/L resazurin)가 사용되었다.
균주 배양은 혐기 조건을 유지하기 위해서 75mL 혹은 500mL의 밀봉된 시럼(serum) 바이알에서 진행되었다. 시럼(serum) 바이알의 기체 부분은 고순도 질소가스 혹은 일산화탄소/질소 혼합가스로 교체되었으며, 질소 혹은 일산화탄소 가스 내에 포함된 미량의 산소분자를 모두 제거하기 위해서 Model 1000 O2 Filter를 사용하였다. 균주 배양은 37℃, 200 rpm 조건에서 수행되었으며, pH 값은 5M HCl 혹은 10M NaOH의 첨가를 통해 7.0 수준으로 유지해 주었다.
유박테리엄 리모섬 균주 배양은, 초기 균주배양을 통해 실험에 필요한 세포의 양을 얻기 위해서 RCM 배지가 사용되었다. 글리세롤 스탁으로부터 시작된 배양을 통해 원하는 양의 세포가 얻어지면 해당 균주를 30배로 농축한 뒤 일산화탄소/질소 혼합가스 (10:90, v/v)를 2시간 간격으로 총 16시간 동안 제공해줌으로써, 유박테리엄 리모섬 균주가 일산화탄소를 대사하기 위해서 필요한 효소 (일산화탄소 탈수소효소)의 발현을 유도하였다. 이렇게 일산화탄소에 적응된 유박테리엄 리모섬 균주는 원심분리를 통해 얻어졌으며, 본 배양에 사용되기에 앞서 남아있는 RCM 배지 내 탄소원들을 제거해주기 위해서 최소배지인 PBBM 배지로 3회 씻어주었다. 해당 균주들은 적절한 농도로 30mL의 PBBM 배지에 재현탁된 뒤에 본 배양에 사용되었다.
유박테리엄 리모섬 균주의 배양은 각각 효소 활성 제한조건과 물질 전달 제한조건에서 수행되었다. 효소 활성 제한조건은 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사 활성 측정 혹은 유박테리엄 리모섬 및 대장균에 대한 일산화탄소의 독성 평가를 위해 사용되었다. 해당 조건에서는 유박테리엄 리모섬에 의한 빠른 속도의 일산화탄소 대사에 의해 배지 내에 용존 일산화탄소가 거의 존재하지 않기 때문에 균주들이 일산화탄소에 의한 독성 효과를 최소한으로 받게 된다. 물질 전달 제한조건은 유박테리엄 리모섬과 대장균의 공동배양을 위해 사용되었다.
대장균 균주 배양은, 초기 균주 배양을 위해서 2g/L의 효소 추출물(yeast extract)이 포함된 PBBM 배지를 사용하였다. 초기 배양은 OD600가 0.05가 되도록 준비하여 시작되었으며, OD600가 1.0이 되었을 때 세포를 원심분리를 통해 얻은 뒤, 본 배양에 사용되기에 앞서 남아있는 배지 내 탄소원들을 제거해주기 위해서 최소배지인 PBBM 배지로 3회 씻어주었다. 해당 균주들은 적절한 농도로 30mL의 PBBM 배지에 재현탁된 뒤에 본 배양에 사용되었다.
배양 중 세포 성장은 UB-1700 분광 광도계 (spectrophotometer)를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 정량되었고, 결과값은 OD600 혹은 OD600 단위 1당 0.31 g DCW/L로 환산하여 계산되었다. 또한, 배지 내 아세트산, 3-하이드록시프로피온산 및 이타콘산은 Aminex HPX-87H 칼럼으로 분당 5mM H2SO4 0.6mL를 이동상으로 이용하여 측정하였으며, 해당 물질들의 검출은 Shodex RI-101 기기를 사용하여 수행하였다. 가스 샘플의 분석을 위해서는 Clarus 680 GC 시스템을 사용하였으며, Carboxen 1010 PLOT 컬럼 (30m x 0.53mm)과 열전도율 검출기 (TCD)를 사용하여 각 물질들을 분리 및 정량하였다.
3. 공동배양 조건 설정
유박테리엄 리모섬과 대장균의 공동배양을 위해서, 혐기적 조건에서 대장균의 아세트산 대사를 가능하게 해주는 대체전자 수용체를 선별하고자 하였다. 유박테리엄 리모섬은 완전 혐기성 균주로써, 산소에 민감한 효소들을 가지고 있고 과산화물에 대한 저항성이 낮기 때문에 미량의 산소에 의해서도 세포의 생존성이 매우 큰 폭으로 저하된다.
한편, 대장균은 도 3에 나타낸 바와 같이, 산소의 유무와 관계없이 성장할 수 있는 통성혐기성 균주이지만, 전자수용체가 없는 조건에서는 아세트산의 대사가 불가능하다. 따라서, 본 발명에서는 해당 두 균주의 공동배양을 위해서 혐기조건에서 대장균이 산소 대신 사용할 수 있는 대체 전자수용체를 선별하여 제공하고자, 대장균이 대체전자수용체로 사용할 수 있다고 알려진 다양한 산화제 [질산염(nitrate), 아질산염(nitrite), DMSO (dimethyl sulfoxide), TMAO (trimethylamine N-oxide), 푸마르산염(fumarate)]를 검사하였다.
이를 위하여 야생형 대장균을 OD600이 1이 되도록 준비하였고, 상기에 명시한 산화제들을 각각 다양한 농도 (0, 100, 200 mM)로 첨가한 뒤 각 조건에서 야생형 대장균의 아세트산 대사량을 비교하였다. 이때, 야생형 대장균의 아세트산 대사량은 배양 0시간과 12시간 후의 배지 내 아세트산 농도를 비교함으로써 계산되었다. 도 4의 a에 나타낸 바와 같이, 여러 산화제 중 질산염(nitrate)과 TMAO가 야생형 대장균의 상대적으로 빠른 아세트산 대사를 가능하게 하였다.
추가적으로, 상기한 두 종류의 산화제 (nitrate, TMAO)가 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사에 미치는 저해효과를 확인하고자 하였다. 해당 실험을 위해, 효소 활성 제한조건하에서 유박테리엄 리모섬의 단일배양에 질산염과 TMAO를 각각 0, 100, 200mM로 첨가한 뒤 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사 활성을 측정하였다. 이때, 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사 활성은 배양 초기 6시간 동안 측정된 기체상의 일산화탄소 농도 값을 기반으로 계산되었다. 도 4의 b에 나타낸 바와 같이, 질산염에 비해 TMAO를 첨가했을 때 상대적으로 일산화탄소 대사 활성에 대한 저감 효과가 낮아졌음을 확인하였으며, 이러한 결과를 기반으로 TMAO를 공동배양에 사용할 대체 전자수용체로 선정하였다. 실제 공동배양에서는 100mM의 TMAO를 배양 후 0시간과 36시간에 첨가하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 유박테리엄 리모섬과 대장균 모두 일산화탄소의 독성에 의한 영향을 받을 수 있으며, 이로 인해 대사 활성이 저해된다는 특징을 가짐이 확인되었다.
공동배양에 있어 일산화탄소에 의한 독성을 최소화하기 위해서, 본 발명에서는 물질 전달 제한조건을 탐색하였다. 이를 위해 유박테리엄 리모섬을 OD600이 각각 0, 30, 60, 100, 130이 되는 세포밀도로 이들을 101.3kPa의 일산화탄소 분압 조건에서 배양하였고, 이때의 일산화탄소 대사 활성을 측정하였다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 사용한 유박테리엄 리모섬의 농도가 OD600 기준 100 이상일 때, 균주의 농도가 높아지더라도 전체 일산화탄소의 대사 활성이 더 이상 증가하지 않음을 확인하였으며, 이는 상기에 명시한 물질 전달 제한조건을 의미한다. 해당 실험을 통해 물질 전달 제한조건이 성공적으로 탐색되었지만, 도 7에 나타낸 바와 같이, 시간이 지남에 따라 지속적으로 감소하는 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사 활성을 고려하여 본 발명에서는 공동배양을 위해 유박테리엄 리모섬의 세포밀도가 OD600 기준 150, 일산화탄소 분압이 50.65kPa인 조건을 사용하였다.
[ 실시예 2: 합성 미생물 컨소시엄을 통한 일산화탄소로부터 3- 하이드록시프로피온산의 생산]
1. 아세트산 유래 3- 하이드록시프로피온산 생산 대장균의 개량
설정된 공동배양 조건에서 유박테리엄 리모섬과 재조합 대장균을 공동배양하여 일산화탄소로부터 고부가가치 화학물질을 생산하고자 하였다. 생산하고자 하는 첫 번째 목적화합물로는 3-하이드록시프로피온산을 선택하였으며, 이를 위해 아세트산으로부터 3-하이드록시프로피온산을 고생산할 수 있는 대장균을 개발하고자 하였다.
본 발명자는 기존 연구에서 말로닐-코에이(malonyl-CoA) 의존적 대사회로를 통해서 아세트산으로부터 3-하이드록시프로피온산을 고생산하는 대장균을 개발한 바 있으며, 본 발명에서의 3-하이드록시프로피온산 생산 대장균의 개발은 해당 기존 연구를 참고하여 진행되었다.
구체적으로, 말로닐-코에이 의존적 대사회로에서, 아세트산은 내생 효소를 통해 아세틸-코에이를 거쳐 말로닐-코에이로 전환되며, 이는 클로로플렉서스 아우란티아커스 (Chloroflexus aurantiacus) 유래의 외래 효소인 말로닐-코에이 환원효소를 통해 3-하이드록시프로피온산으로 전환된다. 기존 연구를 참고하여, 본 발명에서는 대장균 W 균주 내에 말로닐-코에이 환원효소를 암호화하고 있는 외래 유전자인 mcr 유전자를 과발현하였다. 해당 과발현은 중간 복제수의 플라스미드인 pET-duet1 하에서 강한 인듀서블 프로모터인 tac 프로모터와 합성 5'-UTR을 통해 진행되었다. 말로닐-코에이 환원효소의 활성을 향상시키기 위해서 해당 효소에 기존에 알려진 3개의 돌연변이 (N940V, K1106W, S1114R)를 가해주었다. 재조합 대장균의 아세트산 대사속도를 향상시키기 위해서 아세틸-코에이(acetyl-CoA) 합성효소를 암호화하는 내생 유전자인 acs 유전자를 합성 프로모터인 J23100 프로모터와 합성 5'UTR, 낮은 복제수 플라스미드인 pACYC-duet1 하에서 과발현하였다.
본 실시예에서 사용한 모든 플라스미드 및 미생물 균주는 표 1에 나타내었다.
이름 상세 내용
Strains
Eubacterium limosum An acetogenic microorganism (KCTC3266, ATCC8486)
Escherichia coli W An acid tolerant and fast-growing E. coli strain (ATCC9637)
CL E. coli W ΔiclR/pET-mcr * /pACYC-acs
WCIAG4 E. coli W ΔiclR/pCDF_CAD/pET_ACS/pCOG5
Plasmids
pKD46 Red recombinase expression vector, AmpR
pCP20 FLP expression vector, AmpR,CmR
pRFT3 PCR template vector for the red recombination, pMB1 ori, AmpR, KmR, FRT-KmR-FRT
pET-mcr * ColE1 ori, AmpR, Ptac-SynUTR mcr -mcr N940V, K1106W, S1114R
pACYC-acs p15A ori, CmR, PBBa_J23100-SynUTR acs -acs
pCDF_CAD CloDF13 ori, SmR, Ptac-synUTR cad -cad-TerBBa_B1001
pET_ACS ColE1 ori, AmpR, PBBa_J23100-synUTR acs -acs-TerBBa_B1001
pCOG5 ColA ori, KmR, PBBa_J23100-synUTR gltA -gltA-TerB1001-PBBa_J23100-synUTR aceA -aceA-TerB1001
또한, 글라이옥실산 회로(glyoxylate cycle)에 포함된 aceBAK 유전자의 발현 억제인자를 암호화하고 있는 iclR 유전자를 제거함으로써 글라이옥실산 회로를 활성화시켰다. 상기 iclR 유전자의 제거를 위해서 Lambda-Red 리콤비네이션 시스템을 이용하였다. 상기 Lambda-Red 리콤비네이션 시스템은 벡터 pKD46 및 pcp20와 FRT-KanR_FRT 단편을 이용하는 방법이다. 상기 FRT-KanR-FRT 단편은 iclR 유전자 제거를 위한 것으로, 프라이머 R-iclR-F 및 R-iclR-B를 이용하여 FRT-KanR-FRT를 증폭시킨 것이다. 해당 리콤비네이션의 진행 후에는 프라이머 C-iclR-F 및 C-iclR-B를 사용하여 게놈 유전자의 일부분을 증폭시킨 뒤 프라이머 C-iclR-F를 사용하여 유전자 서열을 확인함으로써 iclR 유전자의 결실을 확인하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 표 2에 나타내었다. 상기의 대장균 개량을 통해서 아세트산 유래 3-하이드록시프로피온산의 고생산 대장균인 CL 균주를 개발하는데 성공하였다.
프라이머명 폴리뉴클레오타이드 서열 (5'→3') 서열번호
R-iclR-F TGCCACTCAGGTATGATGGGCAGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAGGCATGACCGGCGCGATGC 1
R-iclR-B TAACAATAAAAATGAAAATGATTTCCACGATACAGAAAAAGGAGACTGTCGCTCAGCGGATCTCATGCGC 2
C-iclR-F CAACATTAACTCATCGGATCAG 3
C-iclR-B TCTATTGCCACTCAGGTATGATGGGC 4
개량된 CL 균주의 아세트산 유래 3-하이드록시프로피온산의 생산성을 평가하기 위해 혐기성 조건에서 CL 균주를 배양하였다. 4g/L의 아세트산이 유일탄소원으로 포함된 PBBM 배지에 100mM의 TMAO를 첨가한 뒤에 혐기성 조건에서 OD600 기준 1 세포 농도의 CL 균주를 72시간 동안 배양하였다. 도 8의 a에 나타낸 바와 같이 CL 균주는 TMAO가 제공된 혐기성 조건에서 72시간 동안 0.81g/L의 아세트산을 소모하여 14.38mg/L의 3-HP를 생산할 수 있음을 확인하였다.
2. 미생물 컨소시엄을 통한 일산화탄소 유래 3- 하이드록시프로피온산 생산
일산화탄소로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하기 위해서 유박테리엄 리모섬과 대장균 CL 균주를 공동배양하였다. 상기에 명시한 바와 같이, 유박테리엄 리모섬은 일산화탄소의 물질 전달 제한조건을 위해서 OD600 기준 150의 세포 농도를 사용하였으며, 대장균 CL 균주는 상기 실험에서 사용한 OD600 기준 1의 세포 농도를 사용하였다. 배양은 일산화탄소 50.65kPa 조건에서 수행하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 공동배양의 전체 일산화탄소 소모량은 유박테리엄 리모섬의 단일배양에 비해 약 10% 정도 증가하였다. 해당 공동배양은 이러한 일산화탄소 대사의 향상뿐만 아니라, 보다 낮은 수준의 아세트산 축적 (1.06g/L)과 이로부터 12.80mg/L 수준의 3-하이드록시프로피온산의 생산을 보였다.
이러한 연구 결과는 유박테리엄 리모섬과 대장균 CL 균주로 구성된 미생물 컨소시엄이 상기에 명시한 상호공생 관계를 형성하였음을 시사하며, 이를 통해 일산화탄소 대사 수준의 향상과 일산화탄소 유래의 3-하이드록시프로피온산의 생산이 가능함을 보여준다.
[ 실시예 3: 미생물 컨소시엄 내 상호공생 관계의 증폭을 통한 3- 하이드록시프로피온산의 생산성 향상]
상기에 명시한 결과를 기반으로, 본 발명자들은 대장균 CL 균주의 군집 크기를 증가시킴으로써 미생물 컨소시엄 내 상호공생 관계를 보다 증폭시킨다면, 일산화탄소 대사활성의 안정성의 추가적인 향상과 이로부터 비롯되는 3-하이드록시프로피온산 생산의 극대화가 가능할 것이라고 가정하였다. 따라서, 공동배양을 위한 CL 균주의 농도 의존적으로 3-HP의 생산량이 증가하는지를 확인하기 위하여, OD600 기준 1, 5, 10, 25, 50 세포 농도의 CL 균주를 유박테리엄 리모섬과 공동배양하였다. 유박테리엄 리모섬의 세포 농도는 일산화탄소의 물질 전달 제한조건을 위해 OD600 기준 150을 사용하였으며, 50.65kPa 분압의 일산화탄소 조건에서 배양을 진행하였다.
도 10의 a, b에 나타낸 바와 같이, CL 균주의 세포 농도가 증가함에 따라 미생물 컨소시엄의 일산화탄소 대사 안정성이 향상됨을 확인하였다. 유박테리엄 리모섬 단일배양은, 배양 시작 18시간 이후부터 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사량이 급격히 감소함을 확인할 수 있었고, 이는 일산화탄소 물질 전달 제한조건의 붕괴로 인해 발생한 현상으로 추측된다.
반면, 미생물 컨소시엄의 경우, CL 균주의 세포 농도가 증가함에 따라 일산화탄소 대사 수준이 향상되었다. 이러한 일산화탄소 대사의 향상은 배양 후반부에 더욱 극명하게 드러났으며, 이는 배양의 안정성이 향상되었음을 보여준다. 특히, 가장 높은 농도인 OD600 기준 50 수준의 CL 균주를 사용했을 때에는 유박테리엄 리모섬의 단일배양에 비해 배양 시작 후 48시간과 72시간 사이의 일산화탄소 대사량이 약 2.64배 증가하였다. 결과적으로, OD600 기준 50 수준의 CL 균주를 사용했을 때 총 72시간 동안의 배양 동안 전체 일산화탄소 대사량이 유박테리엄 리모섬의 단일배양에 비해 약 1.67배 증가하였다.
본 발명에서는 일산화탄소 대사량뿐만 아니라 중간물질인 아세트산의 축적과 목적화합물인 3-하이드록시프로피온산의 생산을 확인하였다. 도 10의 c에 나타낸 바와 같이, 아세트산의 축적량은 미생물 컨소시엄 내 CL 균주의 세포 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 특히, OD600 기준 50 수준의 CL 균주를 사용했을 때에는 매우 미량의 아세트산만이 배지 내에 남아있었으며 (0.09g/L), 이는 유박테리엄 리모섬의 단일배양과 비교했을 때 약 15.85배 감소한 수준이다.
도 10의 d, e에 나타낸 바와 같이, CL 균주 세포 농도 증가에 따른 유박테리엄 리모섬의 일산화탄소 대사 안정성과 CL 균주의 아세트산 대사 수준 향상은 3-하이드록시프로피온산의 생산성 증진으로 이어졌다. 총 3번의 독립적인 공동배양 실험 결과, OD600 기준 50 수준의 CL 균주를 사용했을 때 평균 6.05mmol의 일산화탄소로부터 45.67mg/L (최대 47.82mg/L)의 3-하이드록시프로피온산이 생산되었음을 확인하였다. 이는 가장 낮은 세포 농도의 CL 균주 (OD600 기준 1)를 사용한 미생물 컨소시엄에 비해 3-하이드록시프로피온산의 생산성이 약 3.57배 증가한 결과이다.
결론적으로, 이러한 결과는 합성 미생물 컨소시엄의 구축이 일산화탄소로부터의 고부가가치 물질 생산에 있어 효율적인 접근임을 보여주며, 컨소시엄 내에서 형성되는 상호공생 관계는 일산화탄소의 대사 안정성 향상을 통해 전체 탄소 흐름을 높은 수준으로 유지하는데 기여한다는 점에서 매우 큰 의미를 가진다.
[ 실시예 4: 상호공생 합성 미생물 컨소시엄의 이타콘산 생산에의 적용]
1. 아세트산 유래 이타콘산 생산 균주 ( WCIAG4 )의 혐기적 생산성 검토
상호공생 관계의 합성 미생물 컨소시엄의 다양한 고부가가치 목적화합물 생산에의 적용 가능성을 검토하기 위해, 일산화탄소로부터 이타콘산의 생산을 시도하였다. 이타콘산 생산을 위해, 본 발명자가 한국등록특허 제10-1973001호를 통해 공개한 이타콘산 고생산 대장균 균주인 WCIAG4 균주를 사용하였다. 본격적인 유박테리엄 리모섬과의 공동배양에 앞서, WCIAG4의 혐기적 단일 배양을 통한 아세트산 유래 이타콘산 생산성에 대해 우선적으로 검토하였다.
도 8의 b에 나타낸 바와 같이, 4g/L의 아세트산과 100mM의 TMAO가 포함된 PBBM 배지에서 혐기적으로 배양을 수행한 결과, 72시간 동안 0.51g/L의 아세트산으로부터 7.72mg/L의 이타콘산이 생산되었음을 확인하였다.
2. 미생물 컨소시엄을 통한 일산화탄소 유래 이타콘산의 생산
아세트산 유래 이타콘산의 생산성이 검토된 WCIAG4 균주를 유박테리엄 리모섬과 혐기적 조건에서 공동배양함으로써 일산화탄소로부터 이타콘산을 생산하고자 시도하였다. 3-하이드록시프로피온산 생산의 경우와 유사하게, 다양한 세포 농도의 WCIAG4 균주 (OD600 기준 1, 10, 25, 75)를 OD600 기준 150 수준의 유박테리엄 리모섬과 공동배양하였다.
도 11의 a, b에 나타낸 바와 같이, 상기에 명시한 유박테리엄 리모섬과 CL 균주의 미생물 컨소시엄과 유사하게, 미생물 컨소시엄 내 WCIAG4 균주의 세포 농도가 증가함에 따라 일산화탄소의 대사 안정성이 향상됨이 확인되었으며, 일산화탄소 대사 수준의 향상은 배양 후반부에 극명하게 드러났다. 특히, WCIAG4 균주의 세포 농도가 OD600 기준 75 수준이었을 때, 배양 초반의 높은 일산화탄소 대사 수준이 배양 전반에 걸쳐 지속적으로 유지되었으며, 결과적으로 해당 미생물 컨소시엄의 전체 일산화탄소 대사량은 유박테리엄 리모섬의 단일 배양에 비해 약 1.52배 증가하였다.
도 11의 c, d 및 e에 나타낸 바와 같이, 아세트산의 축적량 및 이타콘산의 생산량 또한 WCIAG4 균주의 세포 농도가 증가함에 따라 각각 감소 및 증가하는 추세를 보였으며, 이는 가장 낮은 농도의 WCIAG4 균주 (OD600 기준 1)를 포함하고 있는 미생물 컨소시엄 대비 각각 9.63배 감소 및 12.74배 증가한 결과이다. 총 3번의 독립적인 공동배양 실험 결과, OD600 기준 75 수준의 WCIAG4 균주를 사용했을 때 평균 5.49mmol의 일산화탄소로부터 23.15mg/L (최대 25.84mg/L)의 이타콘산 생산이 가능함을 확인하였다.
결론적으로, 이러한 결과는 상호 공생 관계의 합성 미생물 컨소시엄의 구축이 일산화탄소로부터의 고부가가치 물질 생산에 있어 효율적인 접근임을 보여주며, 컨소시엄의 모듈화된 설계를 통해 목적화합물의 다양화 또한 가능하다는 점을 증명한다.
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Claims (12)

  1. 일산화탄소 대사 이용 균주 및 아세트산 대사 이용 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 유기산 고효율 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유기산은,
    아세톤산, 아디프산, 아스코르브산, 아크릴산, 시트르산, 2,5-다이케토-D-글루콘산, 포름산, 푸마르산, 글루카르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루타르산, 3-하이드록시프로피온산, 이타콘산, 락트산, 말레산, 말산, 말론산, 옥살산, 옥살로아세트산, 프로피온산, 숙신산 및 자일자일론부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유기산 고효율 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 공동배양은,
    대체전자 수용체가 추가된 혐기성 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 유기산 고효율 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 대체전자 수용체는,
    질산염 (nitrate) 또는 TMAO (trimethylamine N-oxide)인 것을 특징으로 하는 유기산 고효율 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 일산화탄소 대사 이용 균주는,
    아세토젠(acetogen)인 것을 특징으로 하는 유기산 고효율 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아세토젠(acetogen)은,
    유박테리엄 리모섬(Eubacterium limosum) 또는 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei)인 것을 특징으로 하는 유기산 고효율 생산 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 아세트산 대사 이용 균주는,
    아세트산으로부터 유기산을 생산하는 대사경로가 도입된 재조합 미생물인 것을 특징으로 하는 유기산 고효율 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 생산용 재조합 대장균이며,
    대장균 W 균주에서, 클로로플렉서스 아우란티아커스 (Chloroflexus aurantiacus) 유래 mcr 유전자 및 acs 유전자가 과발현된 것인 유기산 고효율 생산 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은, 이타콘산(itaconic acid) 생산용 재조합 대장균이며,
    서열번호 5의 염기서열로 표시되는 합성 5' UTR(untranslated region), cad 유전자, acs 유전자, aceA 유전자 및 gltA 유전자가 과발현되고, icIR 유전자가 결실된 것인 유기산 고효율 생산 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 일산화탄소 대사 이용 균주 및 아세트산 대사 이용 균주는,
    1~5 : 1의 세포 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 유기산 고효율 생산 방법.
  11. 일산화탄소 대사 이용 균주 및 아세트산 대사 이용 균주를 포함하는 유기산 고효율 생산용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 유기산은,
    아세톤산, 아디프산, 아스코르브산, 아크릴산, 시트르산, 2,5-다이케토-D-글루콘산, 포름산, 푸마르산, 글루카르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루타르산, 3-하이드록시프로피온산, 이타콘산, 락트산, 말레산, 말산, 말론산, 옥살산, 옥살로아세트산, 프로피온산, 숙신산 및 자일자일론부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유기산 고효율 생산용 조성물.
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