TWI535844B

TWI535844B - Production of n - Butanol Strain and Its Application

Info

Publication number: TWI535844B
Application number: TW104128016A
Authority: TW
Inventors: yun-peng Zhao; Mukesh Saini; zhong-ren Jiang
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2015-08-26
Publication date: 2016-06-01
Also published as: TW201708534A

Description

可生產正丁醇的菌株及其應用

本發明關於一種利用基因工程技術建構的菌株，且特別關於一種可生產正丁醇的菌株及其應用。

石化產業雖與我們的日常生活息息相關，但石化燃料價格不斷上漲、存量日趨減少與對環境造成的傷害逐日嚴重已侷限這項產業的發展。因此，確實有必要開發更多再生且環保的燃料，利用生物過程製造化學製品便應蘊而生。一般而言，生物所製造的化學製品多為微生物的發酵產物。於微生物發酵過程中，發生了許多以NADH與NAD ^＋為輔因子的氧化還原反應。當NAD ^＋作為電子接受者時，醣類代謝會伴隨NADH產生。之後，於NADH存在下還原醣類代謝中間物而再次產生NAD ^＋。於大腸桿菌內，此種還原反應通常會產生乙醇、乳酸、琥珀酸。故，維持NADH與NAD ^＋間的氧化還原平衡乃是確保微生物發酵持續的關鍵。

梭菌屬（ Clostridium）的正丁醇製造為微生物發酵的典型例（Jones and Woods 1986）。這種發酵製造分成二階段：產酸（acidogenesis）與產溶劑（solventogenesis）（Lee et al. 2008）。產酸時，梭菌屬會發酵葡萄糖而產生乙酸、丁酸。產溶劑時，梭菌屬於再吸收這些有機酸的同時製造丙酮、正丁醇與乙醇為最終產物。依這種合成路徑，自葡萄糖直接合成正丁醇會導致NADH/NAD ^＋氧化還原失衡，主因在於此合成路徑所需的NADH較於醣解途徑所產生的NADH多。正丁醇為一可替代的燃料，且就能量密度、蒸氣壓、吸濕性而言，正丁醇優於乙醇（Mussatto et al. 2008）。以特定比例混合正丁醇與汽油後，此混合物可作為交通運輸的燃料，並直接使用已存在的輸油管運輸。上述性質讓微生物所製造的正丁醇極受業界注目。

目前已有許多於不同菌種內製造正丁醇（Atsumi et al. 2008、Bhandiwad et al. 2014、Berezina et al. 2010、Lan and Liao 2011、Nielsen et al. 2009、Steen et al. 2008、Tong et al. 2014）的方案。這些方案雖然可行，但因其正丁醇的產量低而無法普及。大腸桿菌已廣泛作為生物科技的工具以用來製造高價值的化學製品和生物燃料。於引用梭菌屬的合成途徑至大腸桿菌後，利用大腸桿菌製造正丁醇將大有可為。即使如此，胞內氧化還原狀態仍舊為一難以解決的問題。之後，此問題透過增加大腸桿菌內的NADH量獲致解決（Lim at el. 2013、Shen et al. 2011）。然而，這些先前技術所用的TB培養基（成分為：1.2g/L胰化蛋白（tryptone）、24g/L酵母萃取物、2.31g/L磷酸二氫鉀（KH ₂PO ₄）、12.54g/L磷酸氫二鉀（K ₂HPO ₄）、4mL/L甘油）價格不斐，限制了它們的應用。

調控一種特殊大腸桿菌內NADH含量可提升正丁醇的產生，且引用梭菌屬的CoA依賴合成途徑至此菌株內。這種調控為透過修飾菌株的中心代謝途徑完成的，包含有：（1）將丙酮酸導入乙醯輔酶A；（2）放大五碳糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PP pathway）；（3）將醣解通量引導至五碳糖磷酸途徑；（4）自檸檬酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）轉向乙醯輔酶A。如此一來，此菌株可培養於外加葡萄糖的M9Y培養基（含有M9鹽類與酵母萃取物）並有效地製造正丁醇。

依上述概念，本發明提出一種可生產正丁醇的菌株，其屬於大腸桿菌且含有：一丙酮丁醇梭桿菌（ Clostridium acetobutylicum）的 hbd基因、一丙酮丁醇梭桿菌的 crt基因、一丙酮丁醇梭桿菌的 adhE2基因、一鉤蟲貪銅菌（ Cupriavidus necator）的 phaA基因、一齒垢密螺旋體（ Terponema denticola）的 ter基因、一釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的 fdh1基因、一啟動子PλP _L、一操作子 lacO。啟動子PλP _L為鑲嵌於菌株的染色體，以調控染色體上的 zwf基因、 pgl基因、 udhA基因、以及 aceEF基因操縱組-E354K點突變的 lpdA基因，操作子 lacO為鑲嵌於菌株的染色體，以調控色體上的 gltA基因，且菌株缺少 pgi基因、 ldhA基因、 pta基因、 adhE基因、 frdA基因。

於一實施例中，菌株為衍生自大腸桿菌BL21。

於另一實施例中，啟動子PλP _L為鑲嵌於 zwf基因、 pgl基因、 udhA基因、及 aceEF基因操縱組-E354K點突變之 lpdA基因的上游區域。

於又一實施例中，操作子 lacO為鑲嵌於 gltA基因的上游區域。

於再一實施例中， hbd基因、 crt基因、 adhE2基因、 phaA基因、 ter基因、 fdh1基因為受另一啟動子PλP _L調控。

此外，於本發明揭露的範圍內，更提出一種生產正丁醇的方法，其包含：培養上述菌株於一含葡萄糖的M9Y培養基中。

於一實施例中，培養基含有6g/L磷酸氫二鈉（Na ₂HPO ₄）、3g/L磷酸二氫鉀、0.5g/L氯化鈉、1g/L氯化銨、1mM硫酸鎂、0.1mM氯化鈣、10mg/L維他命B1、5g/L酵母萃取物、20g/L葡萄糖。

為讓本發明更明顯易懂，文中使用的基因全名於下： aceEF-lpdA，丙酮酸去氫酶複合體（pyruvate dehydrogenase complex）； adhE，丁醛/丁醇去氫酶（butyraldehyde/butanol dehydrogenase）； adhE2，丁醛/丁酸去氫酶（butyraldehyde/butanol dehydrogenase）； crt，巴豆酸酶（crotonase）； fdh1，甲酸去氫酶（formate dehydrogenase）； frdA，富馬酸還原酶（fumarate reductase）； gltA，檸檬酸合成酶（citrate synthase）； hbd，3-羥基丁基輔酶A去氫酶（3-hydroxybutyryl-CoA dehydorgenase）； ldhA，乳酸去氫酶（lactate dehydrogenase）； pgi，磷酸葡糖異構酶（phosphoglucose isomerase）； pgl，内酯酶（ lactonase）； phaA，β-酮硫解酶（β-ketothiolase）； pta，磷酸乙醯轉移酶（phosphate acetyltransferase）； ter，反烯醯基輔酶A還原酶（trans-enoyl-coA reductase）； udhA，吡啶核苷酸轉氫酶（pyridine nucleotide transhydrogenase）； zwf，葡萄糖-6-磷酸去氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase）。

茲以下述實施例，詳細說明本發明：

製備例1：菌株的培養

接種液為透過將大腸桿菌生長於含2g/L葡萄糖的Luria-Bertani培養液中至隔夜而取得。細胞密度為於光線波長550nm測得。接著，將接種液培養於50mL的M9Y培養液中，其含有：6g/L磷酸氫二鈉、3g/L磷酸二氫鉀）、0.5g/L氯化鈉、1g/L氯化銨、1mM硫酸鎂、0.1mM氯化鈣、10mg/L維他命B1、5g/L酵母萃取物、20g/L葡萄糖。於光線波長550nm下測得的細胞密度達0.1時，提供有限供氧條件給菌株。

製備例2：菌株的建構

本實施例的菌株與引子列示於表1。表1 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="_0004"><TBODY><tr><td> </td><td> 主要特徵 </td><td> 參考文獻 </td></tr><tr><td>菌株</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td> BuT-8 </td><td> ΔfrdA φ80attB::PλPL-ter λattB::PλPL-crt ΔadhE::φ80attB::PλPL-pha-hbd ΔldhA::λattB::PλPL-adhE2</td><td> Saini et al. 2015 </td></tr><tr><td> BuT-8-Fdh1 </td><td> 同BuT-8 P21attB::Ptac-fdh1</td><td> － </td></tr><tr><td> BuT-9 </td><td> 同BuT-8-Fdh1 ΔlpdA λattB::PλPL-lpdA* PλPL-aceEF</td><td> － </td></tr><tr><td> BuT-10 </td><td> 同BuT-9 PλPL-zwf PλPL-UdhA</td><td> － </td></tr><tr><td> BuT-12 </td><td> 同BuT-10 ΔatoD::PλPL-pgl</td><td> － </td></tr><tr><td> BuT-13 </td><td> 同BuT-12 Δpgi</td><td> － </td></tr><tr><td> BuT-14 </td><td> 同BuT-13 lacO-gltA</td><td> － </td></tr><tr><td>引子</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td> RC10178 </td><td> 5’-ataaggatccatatctaacaccgtgcgtg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11210 </td><td> 5’-cacaccatatgttagaattcattaccttcg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11403 </td><td> 5’-tttgcggtaccaagccctttgcaaattgc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11404 </td><td> 5’-cagcagagctcgaatggatcgcgttatc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11405 </td><td> 5’-agaatcatatggcggtaacgcaaacag-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11406 </td><td> 5’-cttaaggatcctaacccggtacttaagccag-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11407 </td><td> 5’-cgtaaggtacctgacgcatgcgcgtttg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11408 </td><td> 5’-acttagagctctaaatgcggcttccaccag-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11409 </td><td> 5’-gccctcatatgccacattcctacgattac-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11410 </td><td> 5’-tgttcggatccataaaagcaacagaatggtaac-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11417 </td><td> 5’-ccaagccctttgcaaattgc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11418 </td><td> 5’-ctcgaatggatcgcgttatc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11419 </td><td> 5’-cctgacgcatgcgcgtttg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC11420 </td><td> 5’-ctaaatgcggcttccaccag-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12058 </td><td> 5’-aataacatatgtcagaacgtttcccaaatg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12059 </td><td> 5’-ctatctctagacgttgagttttctggaacc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12060 </td><td> 5’-ccagttcgaggtcttttttcg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12085 </td><td> 5’-tatggggtaccagttcgaggtcttttttcg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12086 </td><td> 5’-caatggagctctgcttcatctgctaagg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12154 </td><td> 5’-gcgatatcgtcggtcaacc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12155 </td><td> 5’-tgagaagcttcagtccgcatcaccagag-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12171 </td><td> 5’-gcaagcttatttcttctgtccataagc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12215 </td><td> 5’-gtccatcgcctataccaaaccagaagttgcatg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12216 </td><td> 5’-catgcaacttctggtttggtataggcgatggac-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12288 </td><td> 5’-aactgctcgagttacttcttcttcgctttcg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12289 </td><td> 5’-aagtggatccatacccgtcgtctttcagg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12290 </td><td> 5’-ccatgagctcggcttttttctggtaatctc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12314 </td><td> 5’-tctggggatccttctgaaatgagctgttgac-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC12331 </td><td> 5’-actctcgaattctggtcgtcctatcgcttc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13001 </td><td> 5’-ttgaattccgcctttaaagatcgccatg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13034 </td><td> 5’-catctcaccagatatcatgc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13035 </td><td> 5’-aatcggagctcgaaagtgaactgtttgg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13195 </td><td> 5’-atcttcccgggcggaattcattaccgttc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13196 </td><td> 5’-gaaattgttatccgctcacaattccgggtacccaattc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13197 </td><td> 5’-cagcaaaataccttcatcacc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13198 </td><td> 5’-ttcaggggaagagaggctg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13199 </td><td> 5’-tcaatgggcccacactgttacataagttaatc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13200 </td><td> 5’-ttaatgtcgacgattgctaagtacttgattcg-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13201 </td><td> 5’-ggtacccagaagccacag-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13292 </td><td> 5’-atcccgggaagcaaacagtttatatcgc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC13293 </td><td> 5’-atctcgagttagtgtgcgttaaccaccac-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC14025 </td><td> 5’-gaggaattctgtaggctggagctgcttc-3’ </td><td> － </td></tr><tr><td> RC14026 </td><td> 5’-aacggtcgacatgggaattagccatgg-3’ </td><td> － </td></tr></TBODY></TABLE>

用RC12171引子（SEQ ID NO：22）與RC12314引子（SEQ ID NO：28）對質體pTrc-Fdh1（Chiang et al. 2012）進行PCR以增幅出一受 trc啟動子（Ptrc）調控的釀酒酵母 fdh1。以 BamHI限制酶處理增幅產物後，將產物連接至 BamHI與 NruI等限制酶處理過的質體pP21-Km來取得質體pP21-Fdh1。接著，用質體pP21-Fdh1將含Ptrc- fdh1的DNA片段***至大腸桿菌內，且移除***至菌株內的卡納黴素抗性基因（Chiang et al. 2008）。

用RC12154引子（SEQ ID NO：20）與RC12155引子（SEQ ID NO：21）對菌株BL21進行PCR以增幅出一 lpdA片段，並將增幅產物***至 NdeI與 XhoI等限制酶處理過的質體pMCS-5來取得質體pMSC-lpdA。以RC12215引子（SEQ ID NO：23）與RC12216引子（SEQ ID NO：24）對質體pMSC-lpdA中的 lpdA進行E354K點突變（亦即， lpdA的蛋白質產物中第354位置由谷胺酸變成賴胺酸）。於 NdeI與 XhoI等限制酶處理經點突變後的質體，取得一E354K點突變的 lpdA片段（以 lpdA*表示）。然後，將 lpdA*轉質至夾有LE*- kan-RE*-PλP _L盒匣的質體pLoxKm-PR（Saini et al. 2014），得到的質體pLoxKm-lpdA*含有受LE*- kan-RE*-PλP _L調控的 lpdA*（LE*- kan-RE*-PλP _L- lpdA*）。另以RC12289引子（SEQ ID NO：26）與RC12290引子（SEQ ID NO：27）增幅出 lpdA的上游區域，並接合至 BamHI與 SacI等限制酶處理過的質體pBluescript以得到質體pBlue-ac。以 BamHI與 XhoI等限制酶處理質體pLoxKm-lpdA*，並將得到的LE*- kan-RE*-PλP _L- lpdA*片段***至質體pBlue-ac以獲得質體pBlue-ac/lpdA*。此外，以RC11210引子（SEQ ID NO：2）與RC12331引子（SEQ ID NO：29）對質體pBlue-ac/lpdA*進行PCR。先以 EcoRI切割PCR產物，後自接成質體pBlue-Ac-lpdA，其具有受LE*- kan-RE*阻斷的 lpdA。為剔除 lpdA，以RC12288引子（SEQ ID NO：25）與RC12290引子（SEQ ID NO：27）對質體pBlue-Ac-lpdA進行PCR以取得一截斷（truncated）的lpdA，並電穿孔至大腸桿菌菌株內。最後，以RC10178引子（SEQ ID NO：1）與RC12288引子（SEQ ID NO：25）對質體pBlue-ac/lpdA*進行PCR來取得一含PλP _L- lpdA*的DNA片段，並以 BamHI限制酶處理此片段。透過接合此片段與經 BamHI與 EcoRV等限制酶處理的質體pLam-Crt（Saini et al. 2014）來取得質體pLam-LpdA*。最後，將含有PλP _L- lpdA*的DNA片段***至大腸桿菌內後，移除***的標記（Chiang et al. 2012）。

為提昇內源基因的表現，將啟動子PλP _L置於特定基因的前方以取代原本的啟動子，詳細操作於下。首先，以RC11403引子（SEQ ID NO：3）與RC11404引子（SEQ ID NO：4）對菌株BL21進行PCR以增幅出一含 zwf上游區域與5’-端區域的片段；以RC11407引子（SEQ ID NO：7）與RC11408引子（SEQ ID NO：8）對菌株BL21進行PCR以取得一含 udh上游區域與5’-端區域的片段；以RC12085引子（SEQ ID NO：18）與RC12086引子（SEQ ID NO：19）對菌株BL21進行PCR以取得一含 aceE上游區域與5’-端區域的片段。每一片段經 KpnI與 SacI等限制酶處理後，***至質體pBluescript以分別取得質體pBlue-zwf、pBlue-udhA與pBlue-aceE。之後，以RC11405引子（SEQ ID NO：5）與RC11406引子（SEQ ID NO：6）對質體pBlue-zwf進行PCR以建立 NdeI與 BamHI等限制酶的切點於質體上；以RC11409引子（SEQ ID NO：9）與RC11410引子（SEQ ID NO：10）對質體pBlue-udhA進行PCR以建立 NdeI與 BamHI等限制酶的切點於質體上；以RC12058引子（SEQ ID NO：15）與RC12059引子（SEQ ID NO：16）對質體pBlue-aceE進行PCR以建立 NdeI與 XbaI等限制酶的切點於質體上。以 NdeI與 BamHI（或 NdeI與 XbaI）等限制酶處理質體pLoxKm-PR以取得LE*- kan-RE*-PλP _L盒匣，並***至質體pBlue-zwf、pBlue-udhA與pBlue-aceE來各別取得質體pPR-zwf、pPR-udhA、pPR-aceE。最終，以RC11417引子（SEQ ID NO：11）與RC11418引子（SEQ ID NO：12）對質體pPR-zwf進行PCR以增幅出一客座DNA（passenger DNA）；以RC11419引子（SEQ ID NO：13）與RC11420引子（SEQ ID NO：14）對質體pPR-udhA進行PCR以增幅出另一客座DNA；以RC12060引子（SEQ ID NO：17）與RC12086引子（SEQ ID NO：19）對質體pPR-aceE進行PCR以增幅出又一客座DNA。以電穿孔法將此三客座DNA***至菌株，並移除標記基因（Chiang et al. 2012）。

為取得 pgl，用RC13292引子（SEQ ID NO：40）與RC13293引子（SEQ ID NO：41）對菌株MG1655進行PCR。於PCR產物經 EcoRV與 SacI等限制酶處理後，與質體pBluescript接合成一質體pBlue-pgl。接著，先以 SmaI與 XhoI等限制酶處理質體pBlue-pgl，再將處理後的產物與質體pLoxKm-PL接合。如此，可取得一含與LE*- kan-RE*-PλP _L融合之 pgl的質體pSPL-pgl。然後，利用RC13001引子（SEQ ID NO：30）與RC13293引子（SEQ ID NO：41）對質體pSPL-pgl進行PCR增幅出LE*- kan-RE*-PλP _L- pgl片段。之後，將此增幅片段接合至經 EcoRI與 NruI等限制酶處理過的質體pSPL-ato（Saini et al. 2014）。同樣，以RC13034引子（SEQ ID NO：31）與RC13035引子（SEQ ID NO：32）對接合後的質體pSPL-ato進行PCR以得到一客座DNA，並電穿孔至菌株內。最後，移除***的標記基因。

為調控 gltA的表現，以操作子 lacO取代啟動子P2，取代過程如下。首先，以RC13195引子（SEQ ID NO：33）與RC13196引子（SEQ ID NO：34）對質體pLoxKm-PR進行PCR以增幅出一含操作子 lacO的片段。於此片段經 SmaI限制酶處理後，自黏成質體pLoxCm-LacO，此質體融合有LE*- kan-RE*- lacO。其次，以RC13197引子（SEQ ID NO：35）與RC13198引子（SEQ ID NO：36）對菌株BL21進行PCR以增幅出一含 gltA上游區域與5’-端區域的片段。將增幅得到的片段***至經 KpnI與 SmaI等限制酶處理過的質體pBluescript來得到一質體pBlue-GltA。再者，以RC13199引子（SEQ ID NO：37）與RC13200引子（SEQ ID NO：38）對質體pBlue-GltA進行PCR以建立 ApaI與 SalI等限制酶的切點於質體上。以 ApaI與 SalI等限制酶處理質體pLoxCm-LacO以取得LE*- kan-RE*- lacO盒匣，並接合至建立有 ApaI與 SalI等限制酶之切點的質體pBlue-GltA來取得一質體pBlue-GltO。最後，以RC14025引子（SEQ ID NO：42）與RC14026引子（SEQ ID NO：43）對質體pKD3進行PCR以得到FRT- Cm-FRT盒匣。將PCR產物***至經 EcoRI與 SalI等限制酶處理過的質體pBlue-GltO，使FRT- Cm-FRT盒匣取代LE*- kan-RE*盒匣並得到一質體pB-gltO-Cm。同樣，以RC13197引子（SEQ ID NO：35）與RC13201引子（SEQ ID NO：39）對質體pB-gltO-Cm進行PCR以得到一客座DNA，並電穿孔至菌株內和移除***的標記基因。

製備例3：分析方法

此處分析方法主要參照Saini et al, 2015。使用配有Reflective Index RID-10A的高效液相層析儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC；購自Shimadzu，日本）測量葡萄糖與甘油。使用氣相層析儀Trace 130測量正丁醇（購自Thermo Scientific，美國）。

胞內NADH含量為用螢光NAD ^＋/NADH檢測套組（購自Cell Technology，美國）測得的。此項測量流程可參考使用者說明書。簡言之，先對細菌培養液進行離心，並將離心得到的細胞團回溶於200μL分解緩衝液與200μLNADH萃取液。將所得的混合液置於60℃下約20分鐘。於對混合液離心後，取出離心所得的上層物並與反應試劑混合。將得到的混合物置於暗處、室溫下1小時以進行反應。最後，以波長530至570nm的激發光與波長590至600nm的放射光測量反應產物以取得NADH含量。

製備例4：酵素活性分析

細胞培養液離心後，將離心得到的細胞團回溶於1mL溶解緩衝液。先以超音波震盪破壞細胞，再離心。收集離心取得的上層物並稱之為「無細胞萃取物（cell-free extract）」。無細胞萃取物中的總蛋白質濃度為採用Bio-Rad蛋白質分析套組測得的。丙酮酸去氫酶的活性如Bond-Watts et al. 2011所述於室溫下用波長340nm監測NAD ^＋的還原，所用的反應溶液含有50mM磷酸鉀（pH7.9）、5mM丙酮酸鈉、1.3mM輔酶A、0.5mM硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate）、與5mM氯化鎂。為開啟還原反應，取100μL無細胞萃取物至1mL反應溶液。葡萄糖-6-磷酸去氫酶的活性如Snoep et al. 1996所述用波長340nm監測NADP ^＋的還原，所用反應溶液含2mM葡萄糖-6-磷酸、0.67mMNADP ^＋、10mM氯化鎂、與50mMTris-氯化氫（pH7.5）。為開啟還原反應，於30℃下取100μL無細胞萃取物至1mL反應溶液中。6-磷酸葡萄糖酸内酯酶之活性的測量如葡萄糖-6-磷酸去氫酶的活性測量（Sinha and Maitra 1992），除了所用的反應溶液有50μM葡萄糖-6-磷酸酶、0.5mMNADP ^＋、50mMTris-氯化氫、10mM氯化鎂、與50mMTris-氯化氫（pH7.5）。此外，檸檬酸合成酶之活性的測量如Walsh and Koshland Jr 1985所述，所使用的反應溶液含有0.1mM乙醯輔酶A、0.5mM草醋酸、0.2mM5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic Acid)）、與50mMTris-氯化氫（pH7.5）。

分析例1：丙酮酸氧化途徑的放大

本實施例的起始菌株為大腸桿菌菌株BuT-8（Saini et al. 2015），其具備了生產正丁醇的輔酶A依賴途徑，並含有丙酮丁醇梭桿菌的 hbd基因、 crt基因、與 adhE2基因、鉤蟲貪銅菌的 phaA基因、及齒垢密螺旋體的 ter基因。此外，為減少碳源耗損與保存NADH，自此菌株中移除涉入不必要途徑的內源基因，如 adhE基因、 ldhA基因、 pta基因、 frdA基因。如圖1所示，自一個葡萄糖還原合成成一個正丁醇需要的NADH量比醣解所提供者來的多。依此，可期待透過補充NADH來促進正丁醇的生產。於本實施例中，連結醣解的丙酮酸節點（node）與檸檬酸循環顯然為一可行的標的。於大腸桿菌內，丙酮酸在有氧環境下透過丙酮酸去氫酶氧化成乙醯輔酶A，而在發酵條件下透過丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate-formate lyase）氧化成乙醯輔酶A（White 2007）。甲酸為丙酮酸甲酸裂解酶反應的還原產物。其他微生物的甲酸去氫酶，如博伊丁假絲酵母（ Candida boidinii） fdh、釀酒酵母 fdh1，能氧化甲酸成二氧化碳與NADH（Berrios-Rivera et al. 2002）。此二基因早已用於大腸桿菌內來提升胞內NADH，藉此增加正丁醇的生產（Chiang et al. 2012、Shen et al. 2011）。於是，受 trc啟動子調控的釀酒酵母 fdh1***至菌株BuT-8內。如圖2所示，所得到的菌株BuT-8-Fdh1於有限供氧條件下生長24小時可產生3.1g/L正丁醇，且其正丁醇濃度較菌株BuT-8的正丁醇濃度約增加25％。

相對丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸去氫酶的反應生成了NADH作為還原產物。因此，可期望透過控制丙酮酸去氫酶的表現來改變胞內的NADH。這可於菌株BuT-8-Fdh1中透過PλP _L啟動子結合至 aceEF基因操縱組達成。為使丙酮酸去氫酶對NADH的抑制不靈敏，去除內源 lpdA基因並額外建構一E354K點突變的 lpdA（亦即 lpdA*）於菌株BuT-8-Fdh1內，且 lpdA*受PλP _L啟動子控制。此時，得到的菌株稱為菌株BuT-9。如圖3所示，於同樣條件下，菌株BuT-9可生產4.3g/L正丁醇。又如表2所示，菌株BuT-9中的丙酮酸去氫酶活性約為菌株BuT-8的1.3倍，且前者菌株中的NADH量較後者菌株多45％。表2 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 菌株 </td><td> 正丁醇濃度（g/L） </td><td> 正丁醇生產速率（g/L/h） </td><td> 正丁醇葡萄糖轉換率（g/g） </td><td> NADH（μmol/細胞重量g） </td><td> 酵素活性（U/每mg的蛋白質） </td></tr><tr><td> PDH </td><td> Zwf </td><td> Pgl </td><td> GltA </td></tr><tr><td> BuT-8 </td><td> 2.7 </td><td> 0.11 </td><td> 0.14 </td><td> 42.2 </td><td> 0.7 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> BuT-9 </td><td> 4.3 </td><td> 0.18 </td><td> 0.22 </td><td> 60.9 </td><td> 1.6 </td><td> 6.1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> BuT-10 </td><td> 4.9 </td><td> 0.20 </td><td> 0.25 </td><td> 75.8 </td><td> - </td><td> 18.3 </td><td> 0.5 </td><td> - </td></tr><tr><td> BuT-12 </td><td> 5.4 </td><td> 0.23 </td><td> 0.27 </td><td> 82.6 </td><td> - </td><td> </td><td> 6.2 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> BuT-14 </td><td> 6.1 </td><td> 0.21 </td><td> 0.31 </td><td> 96.1 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1.5 </td></tr></TBODY></TABLE>

同樣方式早已應用於具備輔酶A依賴合成途徑之大腸桿菌的正丁醇生成（Shen et al. 2012、Bond-Watt et al. 2011、Lim et al. 2013）。然而，習用的菌株為培養於價格昂貴的TB培養液中；反之，本實施例的菌株為培養於相對便宜的M9Y培養液。

分析例2：五碳糖磷酸途徑的放大

醣解途徑於葡萄糖-6-磷酸結點分支。以葡萄糖-6-磷酸為起始代謝物，五碳糖磷酸途徑產生供核酸與芳香族胺基酸合成的前驅物，並供應大量供還原性生物合成的NADPH（White 2007）。於是，可透過調節葡萄糖-6-磷酸結點來提升NADH的取得。葡萄糖-6-磷酸去氫酶可於五碳糖磷酸途徑中催化第一步，故菌株BuT-9的 zwf基因融合有PλP _L啟動子。於大腸桿菌內，吡啶核苷酸轉氫酶的功能為NADH與NADPH的互相轉變（Canocaco et al. 2001），故菌株BuT-9的 udhA基因融合有PλP _L啟動子。如圖4所示，所得到的菌株BuT-10可生產4.9g/L正丁醇。如表2所示，相較於菌株BuT-9，菌株BuT-10中的葡萄糖-6-磷酸去氫酶活性約增加2倍，且生產的正丁醇量約增加10％。

由於菌株BuT-8衍生自大腸桿菌BL21，故其缺乏 pgl基因（Meier et al. 2012）。内酯酶主要於五碳糖磷酸途徑中負責葡萄糖-6-磷酸去氫酶之後的步驟。因此，由提升表現之葡萄糖-6-磷酸去氫酶引導至五碳糖磷酸途徑中的碳流量可能會於内酯酶調控的步驟受限。為解決此問題，自大腸桿菌K-12取得受PλP _L啟動子調控的 pgl基因並導入至菌株BuT-10。最後，如圖5所示，所得到的菌株BuT-12可生產5.4g/L正丁醇。如表2所示，相較於菌株BuT-10，菌株BuT-12中的内酯酶活性約增加10倍，生成的NADH量約增加36％，且其正丁醇量約增加25.6％。

由上可知，於醣解與五碳糖磷酸途徑中碳流量的重新分布可影響胞內NADH的含量。須注意的是，一個葡萄糖進入五碳糖磷酸途徑會產生二個還原性等效物並浪費一個二氧化碳。儘管如此，相較於菌株BuT-8，菌株BuT-12生成的NADH量約增加96％，且生產的正丁醇量約增加為2倍。

分析例3：經五碳糖磷酸途徑的葡萄糖代謝

依大腸桿菌的中央代謝，每單位葡萄糖經五碳糖磷酸途徑較經醣解多生成85％的還原效能。故，透過將碳流量自醣解轉移至五碳糖磷酸途徑可有效提升胞內NADH量。磷酸葡糖異構酶負責於葡萄糖-6-磷酸的異構化，且失活可讓五碳糖磷酸途徑為葡萄糖代謝的主要途徑（Hua et al. 2003）。故，藉由剔除菌株BuT-12中的 pgi基因來得到菌株BuT-13。如圖6所示，相較於菌株BuT-12，菌株BuT-13於生物質量與葡萄糖利用約減少32％與30％。於發酵30小時後，菌株BuT-13並無法完全消耗葡萄糖且產生較少的正丁醇（4.6g/L）。

透過缺乏 pgi基因的菌株可實現改善NADPH的取得，但此菌株卻於比生長率（specific growth rate）減少47％（Chemler et al. 2010）。這種缺乏 pgi基因所致的生長缺失乃因過剩的NADPH會傷害細胞的生理狀態（Canonaco et al. 2001）。有趣的是，葡萄糖-6-磷酸去氫酶與吡啶核苷酸轉氫酶的高活性可促進缺乏 pgi基因的菌株生長（Canonaco et al. 2001、Flores et al. 2004）。然而，菌株BuT-13雖有高葡萄糖-6-磷酸去氫酶與吡啶核苷酸轉氫酶的活性、及正丁醇合成途徑，但仍受到生長缺失所影響。此結果意謂著此菌株存在失衡的還原狀態。

分析例4：自檸檬酸循環之碳流量的轉移

乙醯輔酶A是合成正丁醇的前驅物且亦可於檸檬酸循環中氧化。為適應氧氣張力，檸檬酸循環可進行氧化途徑或還原途徑以產生不同程度的還原等效物（White 2007）。檸檬酸合成酶可催化檸檬酸循環的第一步。可以期待透過降低檸檬酸合成酶活性來從檸檬酸循環將碳流量轉移，從而保留乙醯輔酶A與調控還原等效物的產生。此可透過於菌株BuT-13中以操作子 lacO取代檸檬酸合成酶原來的啟動子P2。接著，培養所得的菌株BuT-14並分析其發酵能力。因此，幾乎回復菌株BuT-14生長且其生物質量與菌株BuT-12相當。如圖7所示，菌株BuT-14的葡萄糖利用稍為緩慢並於29小時後產生6.1g/L正丁醇。如表2所示，相較於菌株BuT-12，菌株BuT-14生成的NADH量約增加16％，且其檸檬酸合成酶活性約降低32％。為進一步瞭解菌株BuT-14對於更低檸檬酸合成酶活性的反應，將 lacI ^Q 導入至此菌株內。發現相較於菌株BuT-12，所得之菌株BuT-14-A的檸檬酸合成酶活性約降低50％。而且，此菌株亦展現不佳的生長、僅耗損40％葡萄糖且於30小時產生1.8g/L正丁醇（結果未示）。過去咸知，降低檸檬酸合成酶活性90％並未影響大腸桿菌於葡萄糖中的生長（Walsh and Koshland Jr 1985）。相對地，缺乏 pgi基因的菌株於葡萄糖的生長則與檸檬酸合成酶的活性相關。透過調控檸檬酸合成酶的活性，可讓菌株自缺乏 pgi基因導致的缺陷復原。這可能是檸檬酸合成酶的調控破壞胞內的還原狀態。顯然地，此菌株展現了對胞內還原狀態的高感受性，且適度調節檸檬酸合成酶活性對於確保菌株優異的表現是必要的。

甲酸去氫酶的使用及丙酮酸去氫酶表現的提升為大腸桿菌內用來提升NADH取得的常見方法。透過建構乙醯輔酶A與NADH的驅動，Shen et al. 2011已使用甲酸去氫酶來達到0.2g/L/h正丁醇產生速率與88％轉換率。另外，Bond-Watts et al. 2011已透過丙酮酸去氫酶來達到0.065g/L/h正丁醇產生速率。再者，Lim et al. 2013已透過甲酸去氫酶與丙酮酸去氫酶來達0.26g/L/h正丁醇產生速率與0.27g/g正丁醇葡萄糖轉換率。須注意的是，這些前案使用的培養基為昂貴的TB培養基，且培養基中非葡萄糖的組份可貢獻15％正丁醇生產（Shen et al. 2011）。於本實施例，採用較便宜的M9Y培養基來系統性地調控胞內NADH。首先，於菌株BuT-8中提升甲酸去氫酶及丙酮酸去氫酶的活性，此菌株的正丁醇生產速率為0.18g/L/h、正丁醇葡萄糖轉換率為0.22g/g。其次，菌株BuT-12可引導碳流量至五碳糖循環來增加NADPH並透過吡啶核苷酸轉氫酶將NADPH轉變為NADH，其正丁醇生產速率與正丁醇葡萄糖轉換率各為0.23g/L/h、0.27g/g。最後，於菌株BuT-14中透過引導碳流量至五碳糖循環並自檸檬酸循環轉移碳流量來改善還原效力。菌株BuT-14的NADH量與正丁醇濃度均為起始菌株BuT-8的1.3倍，且其正丁醇生產速率為0.21g/L/h、正丁醇葡萄糖轉換率為0.31g/g。理論上，於經五碳糖磷酸循環的葡萄糖代謝中每莫耳葡萄糖會產生0.85莫耳（非1莫耳）正丁醇，這歸咎於二氧化碳的產生。如此一來，正丁醇葡萄糖之轉換率的理論值為0.35g/g。經計算後，菌株BuT-14的正丁醇葡萄糖轉換率約為此理論值的89％。

綜上所述，說明著本發明所構築的菌株可有效地生產正丁醇，且正丁醇的生產可於相對便宜的培養基中實現。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

無

圖1為大腸桿菌菌株BuT-14的正丁醇生產途徑；圖中符號○＋為強化基因的表現，○－為減弱或抑制基因的表現。圖2為大腸桿菌菌株BuT-8-Fdh1於培養液中培養24小時後的各種物質濃度。圖3為大腸桿菌菌株BuT-9於培養液中培養24小時後的各種物質濃度。圖4為大腸桿菌菌株BuT-10於培養液中培養24小時後的各種物質濃度。圖5為大腸桿菌菌株BuT-12於培養液中培養24小時後的各種物質濃度。圖6為大腸桿菌菌株BuT-13於培養液中培養不同時間後的各種物質濃度。圖7為大腸桿菌菌株BuT-14於培養液中培養不同時間後的各種物質濃度。

＜110＞逢甲大學＜120＞可生產正丁醇的菌株及其應用＜160＞43 ＜210＞1 ＜211＞29 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC10178引子＜400＞1 ataaggatcc atatctaaca ccgtgcgtg 29 ＜210＞2 ＜211＞30 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11210引子＜400＞2 cacaccatat gttagaattc attaccttcg 30 ＜210＞3 ＜211＞29 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11403引子＜400＞3 tttgcggtac caagcccttt gcaaattgc 29 ＜210＞4 ＜211＞28 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11404引子＜400＞4 cagcagagct cgaatggatc gcgttatc 28 ＜210＞5 ＜211＞27 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11405引子＜400＞5 agaatcatat ggcggtaacg caaacag 27 ＜210＞6 ＜211＞31 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11406引子＜400＞6 cttaaggatc ctaacccggt acttaagcca g 31 ＜210＞7 ＜211＞28 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11407引子＜400＞7 cgtaaggtac ctgacgcatg cgcgtttg 28 ＜210＞8 ＜211＞30 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11408引子＜400＞8 acttagagct ctaaatgcgg cttccaccag 30 ＜210＞9 ＜211＞29 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11409引子＜400＞9 gccctcatat gccacattcc tacgattac 29 ＜210＞10 ＜211＞33 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11410引子＜400＞10 tgttcggatc cataaaagca acagaatggt aac 33 ＜210＞11 ＜211＞20 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11417引子＜400＞11 ccaagccctt tgcaaattgc 20 ＜210＞12 ＜211＞20 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11418引子＜400＞12 ctcgaatgga tcgcgttatc 20 ＜210＞13 ＜211＞19 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11419引子＜400＞13 cctgacgcat gcgcgtttg 19 ＜210＞14 ＜211＞20 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC11420引子＜400＞14 ctaaatgcgg cttccaccag 20 ＜210＞15 ＜211＞30 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12058引子＜400＞15 aataacatat gtcagaacgt ttcccaaatg 30 ＜210＞16 ＜211＞30 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12059引子＜400＞16 ctatctctag acgttgagtt ttctggaacc 30 ＜210＞17 ＜211＞21 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12060引子＜400＞17 ccagttcgag gtcttttttc g 21 ＜210＞18 ＜211＞30 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12085引子＜400＞18 tatggggtac cagttcgagg tcttttttcg 30 ＜210＞19 ＜211＞28 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12086引子＜400＞19 caatggagct ctgcttcatc tgctaagg 28 ＜210＞20 ＜211＞19 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12154引子＜400＞20 gcgatatcgt cggtcaacc 19 ＜210＞21 ＜211＞28 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12155引子＜400＞21 tgagaagctt cagtccgcat caccagag 28 ＜210＞22 ＜211＞27 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12171引子＜400＞22 gcaagcttat ttcttctgtc cataagc 27 ＜210＞23 ＜211＞33 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12215引子＜400＞23 gtccatcgcc tataccaaac cagaagttgc atg 33 ＜210＞24 ＜211＞33 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12216引子＜400＞24 catgcaactt ctggtttggt ataggcgatg gac 33 ＜210＞25 ＜211＞31 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12288引子＜400＞25 aactgctcga gttacttctt cttcgctttc g 31 ＜210＞26 ＜211＞29 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12289引子＜400＞26 aagtggatcc atacccgtcg tctttcagg 29 ＜210＞27 ＜211＞＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12290引子＜400＞27 ccatgagctc ggcttttttc tggtaatctc 30 ＜210＞28 ＜211＞31 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12314引子＜400＞28 tctggggatc cttctgaaat gagctgttga c 31 ＜210＞29 ＜211＞30 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC12331引子＜400＞29 actctcgaat tctggtcgtc ctatcgcttc 30 ＜210＞30 ＜211＞28 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13001引子＜400＞30 ttgaattccg cctttaaaga tcgccatg 28 ＜210＞31 ＜211＞20 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13034引子＜400＞31 catctcacca gatatcatgc 20 ＜210＞32 ＜211＞28 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13035引子＜400＞32 aatcggagct cgaaagtgaa ctgtttgg 28 ＜210＞33 ＜211＞29 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13195引子＜400＞33 atcttcccgg gcggaattca ttaccgttc 29 ＜210＞34 ＜211＞38 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13196引子＜400＞34 gaaattgtta tccgctcaca attccgggta cccaattc 38 ＜210＞35 ＜211＞21 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13197引子＜400＞35 cagcaaaata ccttcatcac c 21 ＜210＞36 ＜211＞19 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13198引子＜400＞36 ttcaggggaa gagaggctg 19 ＜210＞37 ＜211＞32 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13199引子＜400＞37 tcaatgggcc cacactgtta cataagttaa tc 32 ＜210＞38 ＜211＞32 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13200引子＜400＞38 ttaatgtcga cgattgctaa gtacttgatt cg 32 ＜210＞39 ＜211＞18 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13201引子＜400＞39 ggtacccaga agccacag 18 ＜210＞40 ＜211＞28 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13292引子＜400＞40 atcccgggaa gcaaacagtt tatatcgc 28 ＜210＞41 ＜211＞29 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC13293引子＜400＞41 atctcgagtt agtgtgcgtt aaccaccac 29 ＜210＞42 ＜211＞28 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC14025引子＜400＞42 gaggaattct gtaggctgga gctgcttc 28 ＜210＞43 ＜211＞27 ＜212＞DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞RC14026引子＜400＞43 aacggtcgac atgggaatta gccatgg 27

Claims

一種可生產正丁醇的菌株，係屬於大腸桿菌且包括：一丙酮丁醇梭桿菌（ Clostridium acetobutylicum）的 hbd基因、一丙酮丁醇梭桿菌的 crt基因、一丙酮丁醇梭桿菌的 adhE2基因、一鉤蟲貪銅菌（ Cupriavidus necator）的 phaA基因、一齒垢密螺旋體（ Terponema denticola）的 ter基因、一釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的 fdh1基因、一啟動子PλP _L、一操作子 lacO；其中，該啟動子PλP _L為鑲嵌於該菌株的染色體，以調控該染色體上的 zwf基因、 pgl基因、 udhA基因、以及 aceEF基因操縱組-E354K點突變的 lpdA基因；其中，該操作子 lacO為鑲嵌於該菌株的染色體，以調控該染色體上的 gltA基因；其中，該菌株缺少 pgi基因、 ldhA基因、 pta基因、 adhE基因、 frdA基因。
如請求項第1項所述之菌株，係衍生自大腸桿菌BL21。
如請求項第1項所述之菌株，其中該啟動子PλP _L為鑲嵌於該 zwf基因、該 pgl基因、該 udhA基因、及該 aceEF基因操縱組-E354K點突變之 lpdA基因的上游區域。
如請求項第1項所述之菌株，其中該操作子 lacO為鑲嵌於 gltA基因的上游區域。
如請求項第1項所述之菌株，其中該 hbd基因、該 crt基因、該 adhE2基因、該 phaA基因、該 ter基因、該 fdh1基因為受另一啟動子PλP _L調控。
一種生產正丁醇的方法，係包括：培養如請求項第1至5項中任一所述之菌株於一含葡萄糖的M9Y培養基中。
如請求項第6項所述之方法，其中該培養基包含： 6g/L磷酸氫二鈉（Na ₂HPO ₄）、3g/L磷酸二氫鉀（KH ₂PO ₄）、0.5g/L氯化鈉、1g/L氯化銨、1mM硫酸鎂、0.1mM氯化鈣、10mg/L維他命B1、5g/L酵母萃取物、20g/L葡萄糖。