ES2593084T3

ES2593084T3 - Procedimiento para la producción de una cantidad elevada de ácido glicólico mediante fermentación

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Publication number: ES2593084T3
Application number: ES10709743.8T
Authority: ES
Inventors: Wanda Dischert; Philippe Soucaille
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2016-12-05
Anticipated expiration: 2030-03-23
Also published as: WO2010108909A1; EP2233562A1; CA2754949A1; MY164623A; MX2011010024A; KR101764933B1; EP2411502A1; BRPI1012693B1; JP2012521206A; US20120315682A1; CN102365357A; JP5800795B2; CA2754949C; BRPI1012693A2; EP2411502B1; AR075927A1; KR20120002593A; US8945888B2

Abstract

Procedimiento para la producción fermentativa de ácido glicólico, sus derivados o precursores, mediante el cultivo de un microorganismo modificado en un medio de cultivo adecuado que comprende una fuente de carbono y la recuperación del ácido glicólico del medio de cultivo, en el que dicho microorganismo modificado es una bacteria gramnegativa modificada genéticamente para la producción de ácido glicólico que comprende además una atenuación del gen mgsA y una atenuación del gen IdhA.

Description

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dependiente de NADPH a partir de genes ubicados de forma cromosómica, utilizando una o varias copias del genoma que se pueden introducir mediante procedimientos de recombinación conocidos por los expertos en la materia. En el caso de los genes extracromosómicos, se pueden utilizar distintos tipos de plásmidos que difieren con respecto a su origen de replicación y, de esta manera, a su número de copias en la célula. Es posible que estén presentes como 1 a 5 copias, aproximadamente 20 o hasta 500 copias, según los plásmidos de número bajo de copias con replicación limitada (pSC101, RK2), plásmidos de número bajo de copias (pACYC, pRSF1010) o plásmidos de gran número de copias (pSK bluescript II). Los genes ycdW o yiaE se pueden expresar utilizando promotores con distinta resistencia que necesitan o no ser inducidos por moléculas inductoras. Son ejemplos los promotores Ptrc, Ptac, Plac, el promotor lambda cI o demás promotores conocidos por los expertos en la materia. La expresión de los genes también se puede reforzar con elementos que estabilicen el correspondiente ARN mensajero (Carrier y Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) o la proteína (por ejemplo, marcas GST, Amersham Biosciences).

-aumento de la disponibilidad de NADPH para la glioxilato reductasa dependiente de NADPH. Esta modificación de las características del microorganismo se puede obtener a través de la atenuación de al menos uno de los genes seleccionados entre los siguientes: pgi que codifica la glucosa-6-fosfato isomerasa, udhA que codifica la transhidrogenasa soluble y edd que codifica la actividad de la 6-fosfogluconato deshidratasa. Con estas modificaciones genéticas, todos los glucosa-6-fosfatos tendrán que ingresar en la glicólisis a través de la vía del pentosa fosfato y se producirán 2 NADPH por glucosa-6-fosfato metabolizado.

Como se ha expuesto anteriormente, el microorganismo ya modificado para la producción de ácido glicólico comprende, en particular, una atenuación del gen aceK. La enzima de la derivación del ácido glicólico ICL está en competición directa con la enzima isocitrato deshidrogenasa (ICDH) del ciclo de Krebs por su sustrato común y, aunque la ICDH tiene mucha más afinidad con el isocitrato, con el flujo de carbono por la ICL gracias al alto nivel intracelular del isocitrato y la fosforilación/inactivación reversible de una gran fracción de ICDH. La inactivación reversible se debe a la fosforilación reversible catalizada por la ICDH cinasa/fosfatasa, llamada AceK, que presenta ambas actividades catalíticas en el mismo polipéptido (Laporte DC 1989, Biochimie Sep-Oct; 71(9-10):1051-7; Ikeda TP, 1992, J Bacteriol. Feb;174(4):1414-6.; Cozzone AJ, El-Mansi M. 2005, J Mol Microbiol Biotechnol. 9(3-4):13246).

Sería ventajoso para el procedimiento de la invención controlar totalmente la actividad de la ICDH eliminando de la célula todas las regulaciones, incluyendo aceK. Una deleción de aceK puede causar una disminución de la actividad de la ICDH. Sin embargo, la expresión artificial más baja del gen icd mediante modificación genética de su promotor permite la construcción de cepas productoras con un nivel bajo definido de ICDH, permitiendo la producción de glioxilato y, de esta manera, glicolato en un fondo de ∆aceK.

El microorganismo según la invención es un microorganismo inicialmente modificado para la producción de ácido glicólico que además comprende una atenuación de los genes ldhA y mgsA. El gen ldhA codifica la lactatodeshidrogenasa (EC 1.1.1.27) que convierte piruvato, el producto final de la glicólisis, en ácido láctico. El gen mgsA codifica la metilglioxal sintetasa (EC 4.2.3.3) que convierte el fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) en metilglioxal.

Ambas enzimas consumen moléculas con una importante participación bioquímica en la vía metabólica de la glicólisis y producen lactato. Con el fin de ahorrar un poco de carbono para la producción de glicolato y para evitar la acumulación de lactato como subproducto, la deleción de ldhA y mgsA se realiza en la cepa utilizada en el procedimiento de la invención. El objetivo de dichas deleciones es mejorar el rendimiento de la producción del glicolato y facilitar la purificación de nuestro producto.

Otra forma de realización de la invención proporciona el procedimiento en el que el microorganismo según la invención comprende además una atenuación del gen arcA. Tal como se utiliza en la presente memoria, “ArcA” y “arcA” se refieren a un polipéptido y a una región codificadora, respectivamente.

ArcA es uno de los dos polipéptidos que componen el sistema regulatorio ArcAB. Los sistemas de transducción de señales de dos componentes permiten que las bacterias detecten, respondan y se adapten a una amplia gama de entornos, tensiones y condiciones de crecimiento. En el sistema de dos componentes prototípico, una histidina cinasa sensora cataliza su autofosforilación y, posteriormente, transfiere el grupo fosforilo a un regulador de respuesta que puede realizar cambios en la fisiología celular generalmente regulando la expresión génica. Por ejemplo, ArcB es la histidina cinasa enlazada a la membrana y ArcA, el regulador de respuesta (Georgellis et al., 1999). El sistema regulador permite que E. coli responda a una amplia gama de concentraciones de oxígeno, desde condiciones totalmente aerobias a microaerobias a totalmente anaerobias.

ArcA controla la expresión de numerosos operones en E. coli y demás bacterias gramnegativas. Incluidos en el regulón de ArcA se encuentran principalmente los factores que participan en las rutas que generan energía celular a partir de sustratos de azúcares: numerosas deshidrogenasas de la clase de las flavoproteínas, oxidasas terminales, enzimas del ciclo de ácido tricarboxílico, enzimas de derivación del glioxilato, enzimas que participan en el metabolismo fermentativo (Iuchi, S. y Lin, E. C. C. (1993) Mol. Microbiol. 9, 9-15; Bauer, C. E., Elsen, S. y Bird, T. H. (1999) Annu. Rev. Microbiol. 53, 495-523). ArcA provoca una disminución de la expresión de muchos de estos

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Gen: Nombres de oligos SEC ID nº Homología con la región cromosómica (Ecogene) Secuencias

ldhAR (Opg 0014) DldhA R: N°4 1439878-1439958 TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTC GCCTTTTTCCAGATTGCTTAAGTTTTGC AGCGTAGTCTGAGAAATACTGGTCAGC ATATGAATATCCTCCTTAG

mgsA Km: DmgsAKF N°5 1026316-1026245 GCAGGCTTTTTCGGTCTTTATCTTGCA GCGATAAGTGCTTACAGTAATCTGTAG GAAAGTTAACTACGGATGATTCCGGGG ATCCGTCGACCTGCAGTTC

DmgsAKR: N°6 1025721-1025800 GGATGTGCCGGTGGCGAGAAAACCGT AAGAAACAGGTGGCGTTTGCCACCTGT GCAATATTACTTCAGACGGTCCGCGAG TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

mgsA Cm: Obu 0085 DmgsA F N°7 1026273-1026193 GTAATCTGTAGGAAAGTTAACTACGGA TGTACATTATGGAACTGACGACTCGCA CTTTACCTGCGCGGAAACATATTGCGC CATATGAATATCCTCCTTAG

Obu 0086 DmgsA R: N°8 1025758-1025838 GGCGTTTGCCACCTGTGCAATATTACT TCAGACGGTCCGCGAGATAACGCTGA TAATCGGGGATCAGAATATCGACCGC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

arcA: Ome 914 DarcAF N°9 4638322-4638245 CCCCGCACATTCTTATCGTTGAAGACG AGTTGGTAACACGCAACACGTTGAAAA GTATTTTCGAAGCGGAAGGCTATGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG

ome 915 DarcAR: N°10 4637621-4637699 CCAGATCACCGCAGAAGCGATAACCTT CACCGTGAATGGTGGCGATGATTTCC GGCGTATCCGGCGTAGATTCGAAATG CATATGAATATCCTCCTTAG

glcA: DglcA-loxP F Oag 0123 DglcA-loxP F N°11 3119299-3119221 GGTTACCTGGACCCAAATGTATATGCC GATGGGAGGACTGGGGCTATCCGCTC TGGTCGCCCTGATCCCGATAATATTCA ATTAACCCTCACTAAAGGG

DglcA-loxP R Oag 0124 DglcA-loxP R: N°12 3117622-3117701 CGAGACTAACATCCCGGTAAACACATA CGCCTGCAGCAGGGTGATAATGCCGA TAACGCTGGCAAAAATCAGACTGTGCT AATACGACTCACTATAGGG

lldP: DlldP F Oag 0051 DlldP F N°13 3775414-3775493 GACCTGCAATGAATCTCTGGCAACAAA ACTACGATCCCGCCGGGAATATCTGG CTTTCCAGTCTGATAGCATCGCTTCCC CATATGAATATCCTCCTTAG

DlldP R Oag 0052 DlldP R: N°14 3777054-3776976 CATAAGCCTGAAGCGTGGTGATCACG CCCACTATACAGGTGAAGATCAGGCTG TGTTTGACAGTAAAGCGGAACAAATCT GTAGGCTGGAGCTGCTTCG

yjcG: DyjcGF Oag 0133 DyjcGF nº 15 4282916-4282835 GTTCTGACGGCGCTTGCCGCCACACT CCCTTTCGCAGCTAACGCCGCGGATG CTATTAGCGGGGCCGTAGAGCGCCAG CCAATTAACCCTCACTAAAGGG

DyjcGR Oag 0134 DyjcGR: N°16 4281281-4281360 GCGCGCGGCCTTGCTCAACGCCAAAG CCGGTCTGGGAGCGGATAAACTGCGC GCGGAACAGTTCACGCTCACGCGCGC CTAATACGACTCACTATAGGG

pME101ycdW-TT7PaceA-aceA-TT01: Oag 0033 N°17 1097384-1097416 CCTACCGGTATGGGCGAGCAAATGCA GGAATATGC Parte de ycdW

Oag 0034: N°18 1098047-1098016 GCATGCATCCCGGGGCAGAAAGGCCC ACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGAAGAT CTTTAGTAGCCGCGTGCGCGGTCGAC TTGCCCGC Terminal de ycdW + el terminador TT7

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Oag 0037: N°19 4213337-4213361 CCCAAGCTTCATATTGTTATCAACAAGT TATC Promotor aceBAK e inicio de aceA

Oag 0038: N°20 4216438-4216419 TCCCCCGGGGCTTAGAACTGCGATTCT TC Terminal de aceA

Tabla 2

Oligonucleótidos utilizados para comprobar la inserción de un casete de resistencia o la pérdida del casete de resistencia

Gen: Nombres de oligos SEC ID nº Homología con la región cromosómica Secuencias

icd: Ome 704 sec Ptrc-icd F N°21 1194153-1194173 CAGAGATTATGAATTGCCGCA

Ome 705 sec Ptrc-icd R: N°22 1194540-1194520 CCAGGAGATTTTACGCTCGCC

ldhA: Opg 0011 ldhAF N°23 1439724-1439743 GCCATCAGCAGGCTTAGCGC

Opg 0012 ldhAR: N°24 1441029-1441007 GGGTATTGTGGCATGTTTAACC G

mgsA Km y Cm: Opg 0122 yccT R N°25 1026499-1026480 GATGGCAGATGACAGTACGC

Opg 0123 helD F2: N°26 1025689-1025704 CCCTCTCCCTTTGTGG

arcA: Ome 0916 arcAF N°27 4638746-4638727 CGACAATTGGATTCACCACG

Ome 0917 arcAR: N°28 4637308-4637328 GCGGTATTGAAAGGTTGGTGC

glcA: Oag 0049 glcA F N°29 3119492-3119473 CGATACTCTGCGTCTGCGTG

Oag 0050 glcA R: N°30 3117387-3117408 GCAAAAGCAACAGATAGAACG G

lldP: Oag 0053 lldP F N°31 3775227-3775247 CGCTTATCTGACCTCTGGTTC

Oag 0054 lldR R: N°32 3777257-3777239 GCACGCCTTCACTCACCAG

yjcG: Opg 0076 yjcHF N°33 4283167-4283147 CGGTTTGCCACCATCCTGTCG

Opg 0077 yjcFR: N°34 4281047-4281066 CGTTAATCAGGCAAAGAGGG

Ejemplo 1

10 Construcción del plásmido pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 (figura 2)

El plásmido pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 se produjo en tres etapas a partir del plásmido pME101-ycdW cuya descripción se presenta en las solicitudes de patentes PCT/EP2006/063046 y PCT/EP2007/055625 y a partir del plásmido pJB137-aceA.

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– La primera etapa fue construir el plásmido pME101-ycdW-TT07 mediante la adición de un terminador al terminal de ycdW. El terminal del gen ycdW se amplificó mediante PCR realizada en el ADN genómico con los oligonucleótidos, incluyendo el TT07 en su secuencia, que se muestran en la tabla 1. El fragmento de PCR digerido con AgeI/SmaI se clonó en el plásmido pME101-ycdW cortado por las mismas enzimas de

20 restricción para dirigirse al plásmido pME101-ycdW-TT7.

-El plásmido pJB137-aceA se produjo clonando un fragmento de PCR en el plásmido pJB137 (EMBL -entrada número U75326) digerido con SmaI/HindIII. El fragmento de PCR se realizó en el ADN genómico a partir de una cepa de MG1655 ∆aceB descrita en las solicitudes de patentes PCT/EP2006/063046 y

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PCT/EP2007/055625 y oligonucleótidos (Oag0037 y Oag0038) descritos en la tabla 1. El gen aceA, como su propio promotor, se amplificó antes de ser clonado en el plásmido.

-La última etapa fue cortar el plásmido pJB137-aceA para obtener el fragmento PaceA-aceA-TT01, TT01

5 siendo el terminador de pJB137. El plásmido pJB137-aceA fue cortado con HindIII, tratado con la enzima Klenow y, por último, digerido por la enzima de restricción PstI. El fragmento de ADN resultante se clonó posteriormente en el plásmido pME101-ycdW-TT07 abierto secuencialmente con SmaI y PstI. El plásmido resultante fue el pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01, llamado pAG025.

10 Ejemplo 2

Construcción de una cepa capaz de producir ácido glicólico mediante fermentación: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTGicd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

15 La cepa de E. coli MG1655 ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta se construyó según la descripción presentada en las solicitudes de patentes PCT/EP2006/063046 y PCT/EP2007/055625.

La atenuación de la transcripción de icd se realizó mediante la sustitución del promotor natural de icd por uno

20 artificial llamado Ptrc50/RBSB/TTG que transporta un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa de E. coli MG1655 ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta. La construcción se realiza según la técnica descrita en el protocolo 1 con los oligonucleótidos respectivos (SEC ID nº:1 y 2) presentada en la tabla 1. El casete de cloranfenicol no se elimina.

25 El fragmento de PCR Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm se introdujo en primer lugar por electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) para producir la cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm, validada mediante secuenciación.

En una segunda etapa, la atenuación de la construcción de icd se introdujo en la cepa MG1655 ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta mediante transducción (consulte el protocolo 3) para producir

30 la cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta.

El plásmido pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 (ejemplo 1) se introdujo posteriormente en la cepa para producir MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01), llamado AG0662.

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Ejemplo 3

Construcción de una cepa para mejorar la producción de ácido glicólico mediante fermentación: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta ∆ldhA (pME101

40 ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

El gen ldhA se inactivó en la cepa de E. coli MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta (pKD46) mediante recombinación con un producto de PCR realizado con los oligos nº 3 y nº 4 presentados en la tabla 1 (ver el protocolo 1). La cepa resultante fue la MG1655

45 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta ∆ldhA::Km en la que se introdujo el plásmido pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 (ejemplo 1) en una última etapa. La cepa final se llamó AG0708.

Ejemplo 4

50 Construcción de una cepa para mejorar la producción de ácido glicólico mediante fermentación: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta ∆mgsA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

55 El gen mgsA se inactivó en la cepa de E. coli MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta mediante la técnica de transducción con el fago P1 descrito en el protocolo 3. La cepa donante MG1655 ∆mgsA::Km se produjo mediante la introducción de un fragmento de PCR en la cepa MG1655 (pKD46). Los oligonucleótidos utilizados para la construcción se presentan en la tabla 1. La cepa se validó mediante secuenciación.

60 El plásmido pAG025 se introdujo posteriormente en la cepa de E. coli MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta ∆mgsA::Km para dirigirse a la final, llamada AG0819 : MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ∆aceB ∆gcl ∆glcDEFGB ∆aldA ∆iclR ∆edd+eda ∆poxB ∆ackA+pta ∆mgsA::Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01).

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glicólico utilizando una cepa del ejemplo 5 (AG0956). Tabla 5 Evolución temporal representativa de fermentación para la producción de ácido glicólico mediante la cepa AG0956

en un fermentador Multifors (600 mL)

Tiempo (h): OD600 nm (AU) Glucosa (g/l) Ácido glicólico (g/l)

0,0: 1,8 17,4 0,4

15,33: 35,3 12,3 16,9

17,83: 49,4 12,7 23,7

20,33: 58,6 11,9 28,9

22,83: 63,6 12,4 33,3

25,33: 60,4 12,2 39,7

30,92: 58,2 11,0 47,1

39,33: 52,0 0,0 52,2

El título final obtenido fue 52,2 g/l de ácido glicólico con un rendimiento de la glucosa de 0,38 g/g y una productividad 10 de 1,33 g/l/h.

Citas

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Claims

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