JP5006325B2 - 酸素によって調節される微生物 - Google Patents
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Description
本願は、2005年9月8日に出願された米国仮特許出願第60/715,702号、および2006年8月18日に出願された国際特許出願PCT/2006/032525号の利益を主張する。これらの内容は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、微生物の新規株およびこれらの微生物に関する醗酵プロセスに関する。より具体的には、本発明は、遺伝子改変された微生物株と、商業的製品(例えば、組換えタンパク質、核酸、アミノ酸および専門的化学物質)の産生のためのその株の使用に関する。本発明はまた、そのような使用のための微生物株の調製法に関する。
細菌のような微生物は、生物製剤、ワクチン構成要素、プラスミドDNA、ワクチンDNAおよび多くの専門的化学物質(アミノ酸を含む)を製造するために、産業プロセスにおいて広範に使用されている。産業プロセスにおいて使用される細菌は、代表的に、炭素源としてグルコースを補充した液体培地中で増殖する。容量生産性を最大にするため、専門的な化学物質を生産するため、そして細菌の維持のために所望される高密度に細菌を増殖させるために、産業プロセスでは、大量のグルコースが必要とされる。細菌は、代謝産物を高速で取り込み、同化する。代謝産物のフラックスは、特定の代謝産物の濃度が上昇するにつれて、その細菌の中心炭素経路における1以上の生化学反応を圧倒するほどに高いものになり得る。細菌は、1以上の「オーバーフロー」経路を使用することによって、高濃度の代謝産物を蓄積する。
種々の実施形態において、本発明は、酸素レベルによって調節される炭素源由来代謝フラックスを有する微生物を提供する。この微生物は、原核生物(例えば、E.coli、Shigella、Salmonella、Corynebacter、LactococcusまたはStreptomycetes)であり得る。この微生物はまた、真核生物(例えば、酵母)であり得る。この酵母は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombeまたはPichia種であり得る。上記炭素源は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、マルトース、N−アセチルグルコサミン、β−グルコシド、マンニトール、セルビオース、ソルボース、グルシトール、またはガラクチトールであり得る。
本発明は種々の形態において実施されることができ、本開示が本発明の例示であるとみなされるべきであり、本発明を例示される具体的な実施形態に限定することを意図されないという理解の下で、いくつかの実施形態の以下の説明がなされる。表題は例示のためのみに提供され、決して本発明を限定すると解釈されるべきではない。任意の表題の下に例示される実施形態が、任意の他の表題の下に例示される実施形態と組み合わされ得る。
上記微生物は、任意の親微生物に由来し得る。代表的な親微生物は、American Type Culture Collectionから入手可能である。他の代表的な微生物は、S.Y.Lee,”High Density Culture of Escherichia coli”,Tibtech 14:98−103(1996)に記載されている。この親微生物は、酵母のような真核生物であり得る。酵母の代表的な例としては、S.cerevisiae、S.pombeおよびPichia種が挙げられるが、これらに限定されない。この親微生物は細菌のような原核生物でもあり得、有機栄養生物(chemoheterotrophic organotroph)であり得る。細菌の代表的な例としては、E.coli、Shigella、Salmonella、Corynebacter、Lactococcus、およびStreptomycetesが挙げられるが、これらに限定されない。
酸素レベルは、微生物における炭素源の代謝フラックスを調節し得る。炭素源の代謝は、その炭素源の移入(importation)において調節され得る。例えば、その炭素源の移入に関与するタンパク質の発現が、酸素調節型プロモーターの制御下に置かれ得る。
上記炭素源は、(天然に、またはその炭素源を代謝することができる酵素をコードする異種遺伝子またはオペロンを導入することによってのいずれかで)上記微生物の増殖および/または代謝をサポートすることができる任意の炭素源であり得る。この炭素源は、単糖(例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトースまたはマンノース)であり得る。この炭素源はまた、二糖(例えば、スクロース)であり得る。他の炭素源としては、マルトース、N−アセチルグルコサミン、β−グルコシド、マンニトール、セルビオース、ソルボース、グルシトールおよびガラクチトールが挙げられるが、これらに限定されない。
スクロースは、上記微生物のための炭素源として使用され得る。スクロースは、グルコースとフルクトースとの二糖である。代謝されるためには、スクロースは、細胞内に輸送され得、次いで単糖単位に分けられ得る。グルコースおよびフルクトースは両方、次いで、グルコース−6−リン酸およびフルクトース−6−リン酸として解糖系に入る。
炭素源からの代謝フラックスは、その炭素源の代謝に関与する1つ以上のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結された酸素感受性プロモーターによって調節され得る。酸素の存在下で活性化されるプロモーターの代表的な例は、cyoオペロンおよび酸化ダメージに対して細胞を保護する酵素をコードするスーパーオキシドジスムターゼ(sodA)内のプロモーターである。野生型K12 sodA染色体領域は、図2に示される。
上記微生物は、豊富な炭素源の存在下で増殖される場合、改善された増殖速度を有し得る。0%〜最大許容%濃度の炭素源を含む液体培地内で増殖される場合、その微生物は、その微生物の親と比較した場合、約25%〜約400%大きい(しかしこれらに限定されない)増殖速度を有する。この微生物は、w/vで、少なくとも約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%または10%で、炭素源を含む培地内で増殖され得る。そのような条件では、この微生物は、親微生物と比較して、約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、180%、185%、190%、195%、200%、205%、210%、215%、220%、225%、230%、235%、240%、245%、250%、255%、260%、265%、270%、275%、280%、285%、290%、295%、300%、305%、310%、315%、320%、325%、330%、335%、340%、345%、350%、355%、360%、365%、370%、375%、380%、385%、390%、395%、または400%大きい増殖速度を有し得る。
上記微生物は、豊富な炭素源の存在下で増殖される場合、改善された代謝フラックスを有し得る。0%〜最大許容%濃度の炭素源を含む液体培地内で増殖される場合、その微生物は、所望される産物に関する炭素源の約5%〜約90%(しかし、これらに限定されない)を含む代謝フラックスを有し得る。株は、約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%の代謝フラックスを有し得る。
本発明の微生物は、高速で、最終代謝物または他の目的の産物を産生することができる。0%〜最大許容%濃度の炭素源を含む液体培地内で増殖される場合、その微生物は、所望の産物に関する炭素源の約0.001g/L〜約100g/Lの最終代謝物または他の目的の産物を産生し得る。株は、約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または80%の代謝フラックスを有し得る。
代謝のフラックスを制御する能力の観点から、上記微生物は、種々の速度で、そして種々の割合の効率の炭素源利用において、種々の量の最終代謝物を産生し得る。本発明の株は、少なくとも、約10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、または100g/Lを含む(しかし、これらに限定されない)レベルで最終代謝物を産生し得る。
上記微生物は、豊富な炭素源を含む培地において、高レベルの効率で目的の産物を産生するために使用され得る。この微生物によって産生される目的の産物は、化学物質、アミノ酸、ビタミン、補因子、核酸(例えば、DNA)、脂肪酸、増殖因子、タンパク質およびそれらの中間体を含む(しかし、これらに限定されない)任意の1またはそれより多い産物であり得る。目的の産物は、その微生物によって天然に産生される産物であり得る。目的の産物はまた、その微生物に異種遺伝子が加えられた結果として産生される非天然産物であり得る。
上記微生物は、回分培養(必要とされる量の炭素源全てが、発酵の開始時に加えられ得る)において所望の産物を産生させるために使用され得る。改変細胞は、酸素のアベイラビリティーに対して炭素源消費を変更することができるのみではなく、この株はまた、半回分培養において所望の産物を産生するためにも使用され得る。炭素源の供給速度は、最大許容濃度を生じるまでの任意の量であり得るが、しかし好ましくは、最大増殖速度を維持するのに必要とされる最小量である。この株はまた、発酵の継続(continuous)様式または「ケモスタット」様式(これらは、より高い希釈率の維持を可能にし得る)において所望の産物を産生し得る。
E.coli K12のスクロース異化(Suc+)株を、ネイティブsodA遺伝子を、図3に示されるようなE.coli O157:H7のスクロース代謝モジュールと置き換えることによって作製した。この遺伝子を、cscB遺伝子を逆向きにし、そしてそれをcscKと並べて配置することによって、そのモジュール内でオリジナルの構成から再配列した。プロモーター−オペレーター領域をsodA遺伝子のプロモーターおよび調節エレメントによって置換するために、cscR遺伝子を削除した。cscKなしでもまた、この株は作製されえることに注意すべきである。なぜなら、その遺伝子産物の活性は、E.coli K12のfruK遺伝子のものとリダンダントであるからである。この株はまた、スクロース代謝モジュールを、プラスミド上に、またはsodAのような別個のプロモーターの制御下でゲノムに導入することによっても作製され得る。
インベルターゼは、スクロース代謝が流れなければならないボトルネックであり得る。細胞質酵素のように、インベルターゼは、膜タンパク質よりもより迅速にターンオーバーすることができる。このことは、機能の高速のシャットダウンを達成するのに重要である。実際に、その変性の速度は、ユビキチンタグによって、または他のそのような改変によって、必要に応じてスピードアップされ得る。対照的に、cscBのレベルは、シンポーター(symporter)が膜タンパク質であるため迅速な制御はできそうにない。その結果、本発明者らは、図6に示されるSuc+株を作製した。構築物は、lacプロモーターを使用してスクロースシンポーターcscBを独立して調節するために、別個のオペロンを提供する。前述の通り、フルクトキナーゼ遺伝子(cscK)は余分であり得る。
この第3の実施例は、O157:H7のようなスクロース陽性株について、正常の様式で、細胞におけるスクロースのレベルを制御するために、スクロースリプレッサーCscRを保存する。このスキームは、O157:H7のスクロースオペロンにおける正常な位置から、sodAオペロン中へ、cscA遺伝子を配置換えすることと等価である。この制御方法は、酢酸塩を調節するために最も効率的であり得る。なぜなら、スクロースのプールが固定され、唯一の制御する関数がボトルネック酵素であるインベルターゼのレベルであるからである。cscR遺伝子をこのスキームから排除し、このことはスクロースの構成的輸送およびフルクトキナーゼ活性をもたらす。前述の通り、図8に示されるように、sodA遺伝子は、cscAによって置換されるか、またはcscAと一続きで組み合わされるかのいずれかである。
実施例1のMG1655 sodA::csc株の好気依存性増殖を、単一の炭素源およびエネルギー源としてスクロースを使用して、好気−嫌気−好気サイクルを通じての増殖をモニタリングして、試験した。このサイクルは、500mlのエアリフト醗酵において、醗酵槽を、空気から窒素および二酸化炭素の95:5混合物にスイッチし、次いで適切な間隔の後に空気に戻すことによって開始した。
ネイティブのPTSプロモーターのsodAプロモーターでの置換を、図13および図14に示す。所望される構築物は3工程で作製する。第1の工程は、一端で染色体標的に相同な独特の配列を共有し、対向する端で2つのPCR産物の融合を可能にするための共通配列を共有する、2つの別個のPCR産物の産生に関する。第1の最初のPCR産物は、cysK遺伝子の3’末端に相同な45塩基対の配列、完全なクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(CAT)とそのプロモーター、第2のPCR産物(以下に説明する)に相同性を提供するための非コードリンカー配列を含む。このCAT遺伝子は、配列
酸素調節型プロモーターによるPTS炭水化物輸送系の転写調節は、嫌気条件下での糖消費においてPTS系が果たす役割を低減させる。グルコースまたは他の炭水化物はなお非PTS系を介して取り込まれ得るが、吸収の速度は著しく低減される。なぜなら、PTS系が、E.coliにおいて最高速度の糖取り込み戦略を担っているからである。E.coliでの全てのPTS系における共通の役割を担っているptsH遺伝子およびptsI遺伝子の発現を酸素調節型プロモーターの制御下に持っていくことのさらなる利点は、全てのPTS糖の消費を制御するための単一点での調節を可能にすることである。先の実施例において記載されたスクロースモデルと直接的に関連させることによって、他の糖におけるE.coli株の増殖は、末端の電子アクセプターとしての酸素の利用可能性により密接にマッチするように制限され、それによって、広範な範囲のPTS糖について、操作された細胞によるいオーバーフロー代謝物の産生を最小化し得る。
Claims (9)
- 酸素レベルによって調節される、炭素源からの代謝フラックスを有する、大腸菌(E.coli)であって、
大腸菌(E.coli) O157.H7スクロース代謝モジュールのcscA遺伝子を含む配列、ならびに、大腸菌(E.coli)ホスホエノールピルビン酸依存ホスホトランスフェラーゼ系のptsH、ptsI、およびccr遺伝子を含む配列からなる群から選択される配列に作動可能に連結された酸素調節型プロモーターを含み、
該大腸菌(E.coli)における該炭素源からの代謝フラックスは酸素レベルの低減に応答して減少し、かつ、
該酸素調節型プロモーターが該cscA遺伝子を含む配列に作動可能に連結している場合、該大腸菌(E.coli)はスクロース異化性(Suc+)である、
大腸菌(E.coli)。 - 前記酸素調節型プロモーターは、大腸菌(E.coli)ホスホエノールピルビン酸依存ホスホトランスフェラーゼ系のptsH、ptsI、およびccr遺伝子を含む配列に作動可能に連結されている、請求項1に記載の大腸菌(E.coli)。
- 前記酸素調節型プロモーターは、大腸菌(E.coli) O157.H7スクロース代謝モジュールのcscA遺伝子を含む配列に作動可能に連結されている、請求項1に記載の大腸菌(E.coli)。
- 前記配列は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質とユビキチンとを含む1または複数の融合タンパク質をコードする、請求項2に記載の大腸菌(E.coli)。
- 前記配列は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質とユビキチンとを含む融合タンパク質をコードする、請求項3に記載の大腸菌(E.coli)。
- 大腸菌(E.coli)における代謝フラックスを調節する方法であって、請求項1に記載の大腸菌(E.coli)を、所望の代謝フラックスを生じるのに適した栄養条件および酸素濃度の下で培養する工程を包含する、方法。
- 大腸菌(E.coli)におけるオーバーフロー代謝産物の産生を減少させる方法であって、該方法は、請求項1に記載の大腸菌(E.coli)を、栄養条件下、および酸素の閾値レベルより下、閾値レベルより上、または閾値レベルの酸素濃度下で培養し、それによって該オーバーフロー代謝産物を産生する1以上の代謝経路を通る炭素の流れを変える工程を包含する、方法。
- 請求項3に記載の大腸菌(E.coli)であって、前記配列は、大腸菌(E.coli) O157.H7スクロース代謝モジュールのcscK遺伝子およびcscB遺伝子をさらに含む、大腸菌(E.coli)。
- 請求項3に記載の大腸菌(E.coli)であって、前記大腸菌(E.coli) O157.H7スクロース代謝モジュールのcscK遺伝子およびcscB遺伝子は、酸素調節型プロモーターと作動可能に連結されていない、大腸菌(E.coli)。
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