CN111363757B - 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 - Google Patents
一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111363757B CN111363757B CN202010057144.6A CN202010057144A CN111363757B CN 111363757 B CN111363757 B CN 111363757B CN 202010057144 A CN202010057144 A CN 202010057144A CN 111363757 B CN111363757 B CN 111363757B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- temperature
- temperature switch
- threonine
- fermentation
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title abstract description 11
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 76
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 75
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 71
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 41
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 13
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 11
- 101100545229 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ZDS2 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101100167209 Ustilago maydis (strain 521 / FGSC 9021) CHS8 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101150001823 alaA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101100113084 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) mcs2 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100055234 Escherichia coli (strain K12) alaC gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101100462488 Phlebiopsis gigantea p2ox gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150094644 rhtC gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100493587 Escherichia coli (strain K12) avtA gene Proteins 0.000 claims description 5
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 101100398785 Streptococcus agalactiae serotype V (strain ATCC BAA-611 / 2603 V/R) ldhD gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100386830 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 31821 / ZM4 / CP4) ddh gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 101150026107 ldh1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150111581 pflB gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150085126 tdcC gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108091032917 Transfer-messenger RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 101710116850 Molybdenum cofactor sulfurase 2 Proteins 0.000 claims 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 abstract description 73
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 abstract description 15
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 abstract description 15
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 13
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 abstract description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 abstract description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 abstract 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 22
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 101150108780 pta gene Proteins 0.000 description 16
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 201000001718 Roberts syndrome Diseases 0.000 description 11
- 208000012474 Roberts-SC phocomelia syndrome Diseases 0.000 description 11
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 8
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 7
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 6
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N Triclosan Chemical compound OC1=CC(Cl)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Substances CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003500 triclosan Drugs 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 101100351124 Bacillus subtilis (strain 168) pckA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101000787195 Escherichia coli (strain K12) Aldose sugar dehydrogenase YliI Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 102000000818 NADP Transhydrogenases Human genes 0.000 description 2
- 108010001609 NADP Transhydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 101000728677 Pseudomonas sp Bifunctional aspartate aminotransferase and L-aspartate beta-decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100492609 Talaromyces wortmannii astC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150116772 aatA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150005925 aspC gene Proteins 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 2
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 150000004727 oxaloacetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 101150000475 pntAB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 101150117659 rhtA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1h-imidazole Chemical compound FC1=CC=CC(C=2NC=CN=2)=C1 JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 2-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101710085033 Beta-galactosidase LacZ Proteins 0.000 description 1
- 101000981884 Brevibacillus parabrevis Valine racemase [ATP-hydrolyzing] Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182843 D-Lactic acid Natural products 0.000 description 1
- DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N D-glucaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940022769 d- lactic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000010259 detection of temperature stimulus Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000010435 extracellular transport Effects 0.000 description 1
- 101150072202 fabV gene Proteins 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229940050411 fumarate Drugs 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 101150106096 gltA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150042350 gltA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000006861 primary carbon metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000005001 rutherford backscattering spectroscopy Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
- C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
- C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用，具体涉及一种利用温度开关***调控胞内代谢流分布提高苏氨酸产量的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。本发明应用温度开关***将整个发酵过程分为细胞生长和发酵生产两个阶段，以适应工程菌株发酵过程中不同时期的胞内环境变化。该***通过控制丙酮酸羧化酶异源表达，并结合草酰乙酸温敏易脱羧的化学特性，在丙酮酸和草酰乙酸之间重新平衡代谢流量，动态调节中心代谢途径保证还原型辅因子的供应来促进L‑苏氨酸生产。本发明得到的温控苏氨酸生产菌株TWF106/pFT24rp和TWF113/pFT24rpa1，其苏氨酸摩尔转化率分别为111.78％和124.03％。
Description
技术领域
本发明涉及一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用，具体涉及一种利用温度开关***调控胞内代谢流分布提高苏氨酸产量的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。
背景技术
代谢工程与代谢调控相结合已被应用来提高天然化学品的产量，特别是大宗氨基酸产品。然而，长期以来，细胞生长和理想产物之间不平衡的细胞代谢流分布限制了产物的产率和生产力的进一步提高。传统的技术(如使旁路途径的相关基因失活和过表达异源途径的相关基因)不能处理更复杂的碳分布的挑战(如需要多个辅因子参与产物合成)。过强的异源途径会和细胞供能代谢途径竞争，将更多的碳源转变为中间代谢物，导致生长停滞，生产产量与产率下降。近年来，调控基因表达水平来优化代谢流分布的方法已经取得了一些进展，如构建工程启动子、调控核糖体结合序列的强度、表达小调控RNA等。虽然这些技术能有效和快速调节基因表达水平来提高工程菌株生产性能，但是这些调节方式都属于静态控制方式，很难响应动态的代谢环境，导致菌株在次优状态下合成目标产物。
目前，可以通过合成生物传感器动态调节代谢途径，并通过基因回路改道代谢流的方法，有效提高工程菌株的产率和生产力。这些生物传感器合成后经过设计被用来生产脂肪酸乙酯、葡萄糖二酸、2-岩藻糖乳糖、γ-氨基丁酸等物质。然而大多数生物传感器需要巨大工作量的基因回路元件调试，来适配特定发酵条件下的目标菌株。此外，由于罐体发酵过程中存在细菌感染的高风险和高昂的下游纯化成本，工业发酵生产中很少采用诱导剂。
热敏生物传感器的活性受温度控制，可以减轻细胞生长阶段宿主的代谢负担，已应用于重组蛋白的表达、D-乳酸的合成和衣康酸的合成。尽管温度依赖调控模块有很大的工业应用前景，但由于其不确定性，很少的相关产品被报告。例如，当热敏的生物传感器调节温度变化，可能会引起全局细胞代谢的未知影响和热敏启动子的渗漏表达。
苏氨酸作为一种典型的草酰乙酸衍生物，不能被人、动物合成的必需氨基酸，其已可以通过微生物发酵工业化生产。到目前为止，工程微生物的苏氨酸产率已经有了很大的提高，但是其合成途径与TCA循环之间复杂的代谢流分布成为苏氨酸转化率进一步提高的瓶颈，目前报道的最高摩尔转化率仅为87.8％。苏氨酸合成途径与中心代谢途径竞争共同前体代谢物，但也需要TCA循环提供多种辅因子(NADPH和ATP)，因为TCA循环是细胞在有氧条件下生长的主要供能途径。
为了提高苏氨酸生产能力，工程菌株需要连续供应前体代谢产物草酰乙酸，而草酰乙酸是糖酵解、L-天冬氨酸和TCA循环之间的主要代谢分支。传统方法中，在大肠杆菌中积累草酰乙酸主要是通过过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)或异源表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)，催化磷酸烯醇丙酮酸生成草酰乙酸。然而，相对较丰富的丙酮酸通常会在TCA循环中脱羧并彻底氧化为二氧化碳，导致大量还原因子(NADH，NADPH和ATP)积累。细胞内丙酮酸合成途径主要包括丙酮酸激酶和PTS***偶联途径以及ED途径，丰富的丙酮酸很容易被浪费，产生多余的能量物质和不需要的副产物(醋酸盐、甲酸盐、乳酸盐和乙醇)。这些有机酸副产物会导致糖酵解途径和中心碳代谢的紊乱，从而阻碍细胞生长和导致不利的产物合成。丙酮酸羧化酶(PYC)是从丙酮酸到草酰乙酸的另一种异源途径，已被应用于在大肠杆菌中生产多种TCA循环中间代谢物的衍生产品。在以前的研究中，无需考虑辅助因子供应的情况下，高水平表达PYC使尽可能多的碳源用来合成目标产物。可是，低水平表达PYC很难积累更多的草酰乙酸，导致草酰乙酸衍生物转化率较低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明构建了一种动态调控中心代谢途径代谢流的方法，通过再平衡微生物细胞碳分布，来提高草酰乙酸下游产物转化率并使其具有工业实用性。
本发明的第一个目的是提供一种温度开关载体，是将温度开关回路连接到载体上得到的；所述温度开关回路含温敏回路cIts-pR-pL和严谨型回路tetR-PLtetO-1；所述温敏回路cIts-pR-pL由温敏抑制子基因cIts和串联启动子pR-pL组成，所述严谨型回路tetR-PLtetO-1由抑制子基因tetR和启动子PLtetO-1。
所述温度开关载体是将质粒pFW001中的pMB1替换为中等拷贝数复制子p15A，并将质粒pFW001中的PJ23101启动子替换为温度开关回路。所述温度开关回路是将温敏抑制子基因cIts、启动子pR-pL、RBS、抑制子基因tetR、多克隆位点序列MCS1、终止子T7、启动子PLtetO-1、多克隆位点序列MCS2、终止子T1依次串联。
在本发明的一种实施方式中，所述温度开关载体包括pFT22或在pFT22的基础上构建的重组载体，或者，pFT24或在pFT24的基础上构建的重组载体。当上述RBS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示时，得到的温度开关载体为pFT22；当上述RBS的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示时，得到的温度开关载体为pFT24。
在本发明的一种实施方式中，所述温度开关载体包括pFT24r、pFT24p、pFT24pm、pFT24rp、pFT24t1、pFT24t2、pFT24t3、pFT24t4、pFT24rpt3、pFT24rpa1、pFT24rpa2、pFT24rpa3或pFT24rpa4，具体构建方法见表2。
在本发明的一种实施方式中，所述温度开关载体的温控范围在30～42℃之间。
本发明的第二个目的是提供一种调节细胞内丙酮酸和草酰乙酸相对水平的方法，所述方法通过上述温度开关载体控制丙酮酸羧化酶表达，在发酵的细胞生长阶段关闭丙酮酸羧化酶的表达，来保证菌株生物量快速积累；当发酵生物量积累足够后，开启丙酮酸羧化酶的表达，为需要合成的目标产物提供充足的草酰乙酸。
在本发明的一种实施方式中，所述方法结合了草酰乙酸的化学特性：温度可以加速草酰乙酸自发脱羧(见图7)。菌株从葡萄糖合成苏氨酸需要更多草酰乙酸为其提供前体中间代谢物，同时需要足够的丙酮酸被氧化产生充足的还原力(NADPH、NADH和ATP)。通过温度开关载体控制丙酮酸羧化酶的表达和草酰乙酸这一化学特性，来动态调节中心代谢途径代谢流分布(见图1)。
本发明的第三个目的是提供一种生产苏氨酸的菌株，其表达上述的温度开关载体。
在本发明的一种实施方式中，是将上述温度开关载体转入苏氨酸生产平台菌株中，所述苏氨酸生产平台菌株包括大肠杆菌TWF001、TWF101、TWF102、TWF103、TWF104、TWF105、TWF106、TWF107、TWF108、TWF110、TWF111、TWF112或TWF113。所述TWF001过表达了编码吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB和涉及苏氨酸生产的相关基因ppc、aspC、lysC、asd、thrAG433RBC和rhtA，构建方法公开于文献：Zhao,H.,Fang,Y.,Wang,X.,Zhao,L.,Wang,J.,Li,Y.,2018.Increasing L-threonine production in Escherichia coli byengineering the glyoxylate shunt and the L-threonine biosynthesis pathway中。所述TWF101、TWF102、TWF103、TWF104、TWF105、TWF106、TWF107、TWF108、TWF110、TWF111、TWF112、TWF113是在TWF001的基础上，进一步独立或组合敲除了与有机酸合成有关的不重要基因poxB,pflB,ldhA,adhE,pta、编码苏氨酸转运蛋白的基因tdcC、丙氨酸合成途径相关基因avtA,alaA,alaC(见图2)，具体构建方法见表1。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株在TWF106的基础上，利用温度开关载体控制编码苏氨酸胞外转运蛋白的rhtC基因、编码丙酮酸羧化酶的pyc基因和基于pyc密码子优化的编码丙酮酸羧化酶的pycmt基因独立表达或组合表达，获得高产苏氨酸的菌株TWF106/pFT24r、TWF106/pFT24p、TWF106/pFT24p和TWF106/pFT24rp，其苏氨酸产量分别是17.24g/L、20.15g/L、20.60g/L和23.29g/L，对应的摩尔糖酸转化率是72.44％、81.50％、98.43％和111.78％。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株在TWF106/pFT24rp基础上，进一步使用温度开关载体关闭丙氨酸合成途径，获得苏氨酸转化率更高的菌株TWF113/pFT24rpa1。所述TWF113/pFT24rpa1的构建方法是在TWF106的基础上，同时敲除avtA、alaA和alaC三个基因，获得TWF113；在温度开关载体pFT24rpa1的基础上，用启动子PLtetO-1控制alaA表达，获得表达载体pFT24rpa1；将pFT24rpa1转入TWF113中，即得TWF113/pFT24rpa1，其苏氨酸产量达25.85g/L，其摩尔糖酸转化率为124.03％。
本发明的第四个目的是提供一种生产苏氨酸的方法，是以上述生产苏氨酸的菌株为发酵菌株，发酵生产苏氨酸。
在本发明的一种实施方式中，将初始OD600为0.2～0.3的发酵菌株种子培养物接种到发酵培养基中，发酵培养至葡萄糖全部被消耗完。
在本发明的一种实施方式中，将初始OD600为0.2～0.3的发酵菌株种子培养物接种到发酵培养基中，36～38℃发酵培养5～8h，41～43℃继续培养至发酵液中葡萄糖全部被消耗完。
在本发明的一种实施方式中，种子培养基为STF培养基，配方为：10g/L蔗糖、20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、15g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4，pH 7.3；所述发酵培养基配方为：35g/L葡萄糖、25g/L(NH4)2SO4、7.46g/L KH2PO4、2g/L酵母提取物、2g/L柠檬酸、2g/LMgSO4·7H2O、5mg/L FeSO4·7H2O、5mg/L MnSO4·4H2O，pH 7.1。
本发明的第五个目的是提供上述温度开关载体在生产蛋白中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述温度开关载体在化工领域的应用。
本发明的优点和效果：
(1)本发明构建了一种温度开关***调控胞内代谢流分布来促进苏氨酸生产，该开关***包含一个温度开关载体，其具有中等拷贝的复制子p15A、耐三氯生筛选基因fabV和两个代谢途径非依赖的调控回路模块(温控回路cIts-pR-pL和严谨性回路tetR-PLtetO-1)，该***经过逐步的优化升级，最终被用来提高苏氨酸产量。温度开关载体经过升级改良后，开关温控范围在30～42℃之间，其有效最窄温控范围在37～40℃之间。
(2)本发明中温度开关***是代谢途径非依赖型调控***，不受胞内代谢环境的影响，可以随意控制目标基因的过表达和代谢途径中其他基因的关闭表达。通过弱化抑制子TetR的RBS强度，有效缓解启动子pR-pL的表达渗漏，减弱常温条件下严谨型回路tetR-PLtetO-1的表达抑制，保证目标基因在开关启动前拥有足够的表达水平。
(3)将本发明中的温度开关***应用于工程菌株进行分阶段发酵，可将整个发酵过程分成细胞生长和发酵生产两个阶段，使工程菌株同时具有快速的生物量积累和高效的发酵生产双重优势，来进一步提高菌株的生产性能，缩短发酵周期。
(4)将本发明中的温度开关***应用于生产发酵，无需添加诱导剂和抗生素，只需要添加微量的三氯生来维持质粒稳定。且该开关***非常适合与工厂规模的发酵设备结合，实现工业化大量生产。
(5)将本发明中的温度开关***用来过表达丙酮酸羧化酶，结合草酰乙酸受热脱羧的化学特性，可智能调节中心代谢途径中丙酮酸和草酰乙酸的比例，从而达到极大提高草酰乙酸下游产物产量的目的，同时保证足够的辅因子(NADPH和ATP)的供应。
(6)将本发明中的温度开关***应用到苏氨酸生产平台菌株中，大幅提高了苏氨酸的转化率，得到两株苏氨酸生产菌株TWF106/pFT24rp和TWF113/pFT24rpa1，经过变温摇瓶发酵，其苏氨酸产量分别是23.29g/L和25.85g/L，对应的苏氨酸摩尔转化率分别为111.78％和124.03％。
附图说明
图1：温度开关***动态调控草酰乙酸胞内水平示意图。粗线表示代谢途径中的基因被过表达。
图2：平台菌株构建所涉及旁路途径的基因敲除。
图3：温度开关载体构成元件及环路调控示意图。
图4：温度开关载体改造优化示意图。
图5：从翻译水平和转录水平检测温度开关***控制基因表达可行性。
图6：从翻译水平和转录水平检测温度开关***控制基因表达灵敏性。
图7：草酰乙酸自发脱羧受到温度和时间的影响。
图8：摇瓶发酵种子培养基优化及苏氨酸生产菌TWF001以LB和STF作为种子培养基进行苏氨酸发酵对比图。
图9：旁路途径基因敲除的底盘菌株在37℃恒温发酵和变温发酵条件下苏氨酸摇瓶发酵对照图。
图10：温度开关***调控苏氨酸胞外运输蛋白RhtC和丙酮酸羧化酶PYC表达生产苏氨酸摇瓶发酵结果。
图11：温度开关***控制pta基因关闭示意图。
图12：控制pta基因关闭的苏氨酸生产菌产苏氨酸摇瓶发酵结果。
图13：温度开关***控制L-丙氨酸合成途径关闭示意图。
图14：控制L-丙氨酸合成途径关闭的苏氨酸生产菌产苏氨酸摇瓶发酵结果。
图15：温度开关***调控苏氨酸生产菌逐步提高苏氨酸转化率示意图。
具体实施方式
1、温度开关***的工作机制：热敏CIts阻遏物在室温下结合pR-pL启动子并抑制转录，而高温条件引起CIts阻遏物失活和pR-pL启动子激活。TetR抑制子可抑制PLtetO-1启动子的转录，其对应的基因tetR被pR-pL启动子控制。检测温度开关***的效果时，以β-半乳糖苷酶LacZ和绿色荧光蛋白GFP作为报告蛋白，分别置于pR-pL启动子和PLtetO-1启动子下表达。将SsrA降解尾巴添加至GFP的C端以消除GFP残余蛋白，以达到基因完全关闭的效果。低温条件下，热敏CIts阻遏物结合pR-pL启动子并抑制下游基因tetR和lacZ转录，则PLtetO-1启动子和gfp可正常转录；高温条件下，CIts阻遏蛋白失活，不能与pR-pL启动子结合，下游基因tetR和lacZ正常转录，抑制PLtetO-1启动子和gfp的转录(见图3)。
当温度开关***应用于苏氨酸生产菌株中时，温度开关载体可以控制一些细胞生长必需或影响细胞生长的基因，在不同的发酵阶段开启表达和关闭表达。乙酸合成途径和丙氨酸合成途径对于菌株生长和生物量积累是必需的，但是这两个旁路途径会与目的产物合成途径竞争碳源，会降低目的产物的转化率，所以需要在细胞生长阶段表达和在发酵阶段切断。然而，丙酮酸羧化酶的过表达会竞争进入TCA循环的碳源，阻碍菌株正常生长，但是丙酮酸羧化酶的表达可以积累更多的前体中间代谢物——草酰乙酸，促进苏氨酸生产，提高目的产物的糖酸转化率，所以需要在细胞生长阶段关闭其表达和在发酵阶段开启其表达。以上这些基因表达控制都可以利用该温度开关载体通过温度的改变来实现。
2、基因敲除的方法
CRISPR-Cas9敲除***被用来高效编辑大肠杆菌基因组。编辑质粒pCas首先被电转入苏氨酸生产大肠杆菌中，该质粒包含具有组成型表达的cas9基因和***糖诱导表达的编码lambda Red重组酶的基因，得到含有pCas的菌株。含有pCas的菌株经过过夜培养(8-14h)，保证初始OD600为0.04，接种到LB培养基，并添加50mg/L的卡那霉素和10mM***糖，然后在30℃下，200rpm生长直至OD600达到0.6。收集50mL已诱导培养后的含pCas的菌株培养物，并用冰浴的10％甘油溶液洗涤三次，然后添加2mL冰浴的10％甘油溶液悬浮菌株，分装到1.5mL EP管中于-70℃下保存，得到带有pCas的感受态细胞。
以原始pTargetF载体(pMB1复制子，壮观霉素抗性)为模板，采用嵌有目标基因N20序列的引物来扩增整个质粒。用DpnI消化PCR产物来消除模板质粒，将其转化到大肠杆菌DH5α中，通过末端重叠序列来产生环状质粒。
根据已有文献报道(Jiang Y,Chen B,Duan C,et al.Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System)进行基因敲除菌株的构建。例如敲除poxB，将上述PCR产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑取转化子，过夜培养，提取质粒pTargetF-poxB(含有靶向poxB基因座的N20序列)。通过重叠延伸PCR获得具有对应poxB基因座的上下游区域的两个同源臂的敲除模板片段。将pTargetF-poxB与敲除模板片段一起电穿孔转化到菌株TWF001中，该菌株中pCas质粒上的编码lambda Red重组酶的基因已经被诱导表达，挑取转化子，过夜培养。离心浓缩1mL细胞培养物涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB琼脂平板上以进行筛选。使用验证引物进行菌落PCR，获得poxB基因敲除菌株，随后加入0.5mM IPTG去除pTargetF-poxB，42℃孵育去除温度敏感质粒pCas。本发明中的其他敲除菌株的构建与以上步骤相同。
3、比色法测定β-半乳糖苷酶(LacZ)活性，详见参考文献：Li,W.,Zhao,X.,Zou,S.,Ma,Y.,Zhang,K.,Zhang,M..Scanning assay of beta-galactosidase activity。
4、实时定量PCR检测菌株中两个报告基因的相对转录水平，详见参考文献：Livak,K.J.,Schmittgen,T.D..Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method。
5、胞外代谢物分析方法
使用UV-1800分光光度计测定OD600的吸光度来实时监测不同时间点的发酵样品菌体浓度。经过13000×g离心10分钟，取培养物上清液用于分析胞外代谢物含量，主要包括残留葡萄糖、氨基酸和有机酸。用生物传感器分析仪(SBA-40C，山东省科学院生物研究所)测量培养液中的残留葡萄糖浓度。氨基酸通过高效液相色谱在Agilent 1200或1260系列仪器上使用Thermo ODS-2HYPERSIL C18色谱柱(250mm×4.0mm)进行定量。用商品化的邻苯二甲醛试剂溶液(Agilent Technologies)衍生化样品，进样量1μL。氨基酸分析方法程序见参考文献：Koros,A.,Varga,Z.,Molnar-Perl,I..Simultaneous analysis of amino acidsand amines as their o-phthalaldehyde-ethanethiol-9-fluorenylmethylchloroformate derivatives in cheese by high-performance liquidchromatography。
通过与氨基酸标准品(Sigma)进行比较来测定苏氨酸产量。有机酸的测定采用Aminex HPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm；Bio-Rad Laboratories)，色谱柱温度为55℃。将5mM硫酸用作流动相，流速为0.6mL/min。用DAD检测器在发射波长210nm处检测，进样量10μL，扫描各个组分的UV光谱，包括丙酮酸、乙酸根、苹果酸、富马酸根、草酰乙酸等。
6、培养基及发酵生产苏氨酸的条件
STF种子培养基：10g/L蔗糖、20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、15g/L(NH4)2SO4、1g/LMgSO4，pH 7.3。
发酵培养基：35g/L葡萄糖、25g/L(NH4)2SO4、7.46g/L KH2PO4、2g/L酵母提取物、2g/L柠檬酸、2g/L MgSO4·7H2O、5mg/L FeSO4·7H2O、5mg/L MnSO4·4H2O，pH 7.1。
37℃恒温摇瓶发酵：将包含温度开关载体的菌株接种到50mL灭菌的STF种子培养基，并在37℃、200rpm条件下培养5h，以初始OD600＝0.2将该种子培养物接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养直至发酵液中葡萄糖全部被消耗完。
变温摇瓶发酵：将包含温度开关载体的菌株接种到50mL灭菌的STF种子培养基，并在37℃、200rpm条件下培养5h，以初始OD600＝0.2将该种子培养物接种到灭菌的发酵培养基中，发酵6h后，将温度调高至42℃，发酵培养直至发酵液中葡萄糖全部被消耗完。
本发明中涉及的苏氨酸生产平台菌株和温度开关载体的构建方法见表1，基因或蛋白的来源或序列见表2。
表1苏氨酸生产平台菌株和温度开关载体的构建方法
注：Δ表示敲除，(M)、(L)、(H)表示扩增目的基因时，使用的引物不同，如PRL::tetR,MCS1,PLtetO1::pta(M)表示扩增pta时，使用的引物对为pta-Mrbs-F和pta-R；PRL::tetR,MCS1,PLtetO1::pta(LAA)(H)表示扩增pta时，使用的引物对为pta-Hrbs-F和pta-LAA-R，具体见表3。
表2基因或蛋白的来源或序列
通过下述实施例对本发明进行具体描述。
实施例1温度开关载体构建和表征
(1)温度开关载体的构建
以质粒pFW001(含三氯生抗性和高拷贝数的pMB1复制子)为基础，使用中等拷贝数复制子p15A替换pMB1，使用温度开关回路替换PJ23101启动子，得到温度开关载体。所述的质粒pFW001来源于2018年公开的论文：Zhao,H.,Fang,Y.,Wang,X.,Zhao,L.,Wang,J.,Li,Y.,2018.Increasing L-threonine production in Escherichia coli by engineeringthe glyoxylate shunt and the L-threonine biosynthesis pathway。
温度开关回路包括温敏回路cIts-pR-pL、TetR抑制子基因tetR和严谨调控启动子PLtetO-1。这些基因由化学合成获得。为了得到独立的遗传调控，将双多重克隆位点(MCS1和MCS2)和不同的转录终止子(来自噬菌体T7RNA聚合酶的T7和来自大肠杆菌rrnB基因的T1)分别***温敏回路cIts-pR-pL、严谨型回路tetR-PLtetO-1两个独立的模块中。得到的温度开关回路是将温敏抑制子基因cIts、启动子pR-pL、抑制子基因tetR、多克隆位点序列MCS1、终止子T7、启动子PLtetO-1、多克隆位点序列MCS2、终止子T1依次串联。
使用ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒(Vazyme,Jiangsu,China)，将温度开关回路和来源于pSU2718的p15A复制子一起整合到骨架质粒pFW001上，从而得到环状的温度开关载体。为了使温度开关载体更加适应工程菌株中独立于代谢途径的基因表达控制，对原始温度开关载体作进一步优化和修饰，从而产生了一系列温度开关载体，检测这些载体是否能在低温条件(30℃)下不表达LacZ蛋白，且在高温条件(42℃)下能有效启动lacZ基因。经过初步检测筛选，其中pFT22和pFT24具有较好的性能。
当温度开关回路(温敏抑制子基因cIts、启动子pR-pL、RBS、抑制子基因tetR、多克隆位点序列MCS1、终止子T7、启动子PLtetO-1、多克隆位点序列MCS2、终止子T1依次串联)中的RBS(高强度)的核苷酸序列为TTAAAGAGGAGAAAGGTACC时，得到的温度开关载体为pFT22；当温度开关回路中的RBS(低强度)的核苷酸序列为AAACGAAGCATTGGGATCTT时，得到的温度开关载体为pFT24(见图4)。
(2)温度开关载体的表征
将两个报告基因lacZ和gfp分别***到温度开关载体的MCS1、MCS2上(pR-pL启动子控制MCS1、PLtetO-1启动子控制MCS2)，以评估温度开关***。
使用带有高强度RBS的引物从大肠杆菌基因组上扩增lacZ片段，并使用ClonExpress II一步克隆试剂盒(Vazyme,Jiangsu,China)将其分别***pFT22和pFT24的MCS1的SpeI酶切位点，得到pFT22-lacZ和pFT24-lacZ载体。类似地，将绿色荧光蛋白基因gfp整合到pFT22-lacZ和pFT24-lacZ载体的MCS2的EcoRI酶切位点，得到pFT22-lacZ-gfp和pFT24-lacZ-gfp。本发明还构建了另外一种重组表达载体，用标准SsrA降解肽链(AADENYALAA，“LAA”)标记GFP，产生了pFT22-lacZ-gfp(LAA)和pFT24-lacZ-gfp(LAA)。将pFT22-lacZ-gfp、pFT24-lacZ-gfp、pFT22-lacZ-gfp(LAA)和pFT24-lacZ-gfp(LAA)转化到大肠杆菌TWF001的lacZI簇敲除菌株TWF101中，以去除基因组上lacZ的背景表达。
为了表征温度开关载体调节基因表达的能力，使用SpectraMax M3酶标仪(Molecular Devices,USA)和UV-1800分光光度计(Shimadzu,Japan)对pFT22和pFT24上两个报告基因的蛋白质水平进行定量。将LB琼脂平板上的菌苔(上述转化的过程中产生的转化子)接种到新鲜的STF种子培养基中，30℃下培养过夜(8-14h)。将种子培养物以初始OD600＝0.4接种量接种至24孔培养板中，每孔含有2mL的发酵培养基，不同的培养板中种子培养物被置于不同培养温度条件(从30℃到42℃)，200rpm培养4h。为了测试温度开关***pFT24的灵敏度，在开关开启后，测量两个报告蛋白的表达水平变化速率。
将上述在30℃下的过夜培养物以1:30的比例(V/V)稀释到含有30mL发酵培养基的500mL带挡板的摇瓶中，并在37℃，200rpm下孵育直到OD600达到2.0；然后，将生长条件更改为较高的温度(42℃)作为开始时间，并每20min收集1mL细胞培养物。以上涉及到的培养基中均添加0.9mg/L三氯生以维持质粒稳定。将收集的培养物在96孔板上用于荧光定量，使用488±10nm激发波长和525±10nm发射波长。用600nm吸光度检测细胞密度，所测荧光值用OD600标准化。使用比色法用5mm石英比色皿测定β-半乳糖苷酶(LacZ)活性。
另外，通过实时定量PCR检测菌株中两个报告基因的相对转录水平。将0.2mL细胞培养物样品与0.4mL RNAstore(Tiangen,Beijing,China)混合，并在4℃下暂时保存直至处理。使用RNA提取试剂盒(BioFlux,Beijing,China)提取预处理样品的总RNA，并使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific,Wilmington,MA,USA)测量RNA浓度。接下来，使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme,Jiangsu,China)去除总RNA中残留的DNA，并逆转录合成cDNA，确保每个反应均包含等量的RNA进行标准化。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,Jiangsu,China)，在ABI Step Onereal-time PCR instrument(Applied Biosystems,San Mateo,CA,USA)上进行实时定量PCR，并以大肠杆菌16S rRNA作为内参。按照试剂盒提供的说明书进行mRNA定量。扩增步骤如下：在95℃预变性30s，然后在95℃下10s，60℃下30s进行40次循环，此外在95℃下15s，60℃下60s，95℃下15s进行熔解曲线分析。自动设置阈值循环值，并监控每个样品的CT值，用于计算两个报告基因与TWF101/pFT22或TWF101/pFT24的相对转录水平的倍数差异。
数据显示，在pFT22和pFT24温度开关***中，LacZ的表达水平在37～40℃之间显著增加，LacZ酶活在较高温度下保持在350Miller Units左右。在37℃或更低的温度下，pR-pL启动子被热敏CI蛋白有效抑制(如图5所示)。因此，工程菌在发酵过程中的生物量积累可以设定在37℃(大肠杆菌生长的适宜温度)。在这两个***中，PLtetO-1启动子驱动GFP的表达，当升高温度时会触发其表达水平下调。与其他对照组相比，pFT24-lacZ-gfp(LAA)在30～37℃之间具有较高的荧光值(高于2000a.u.)，而在40℃以上几乎没有GFP蛋白残留。
此外，为了检测pFT24***的开关敏感性，将在37℃培养的对数期菌株转移到42℃，用来量化两个报告蛋白随时间的变化。在pFT24-lacZ-gfp(LAA)中，GFP荧光在80min内几乎完全消失，同时LacZ活性达到相当高的水平(如图6所示)。当gfp基因的转录被关闭时，带降解标签尾巴的残余GFP蛋白被更快地清除。为了表征不同菌株中相应启动子的强度，同步监测报告基因的转录水平。数据表明，细胞内mRNA水平的相对趋势与上述蛋白水平数据一致。
实施例2应用温度开关***提高苏氨酸菌株生产能力
(1)优化和改造苏氨酸生产菌株：
以TWF001为出发菌株，该菌株的基因组上已过表达吡啶核苷酸转氢酶(pntAB)和涉及苏氨酸生产的相关基因(ppc、aspC、lysC、asd、thrAG433RBC和rhtA)(见图1)。为了提高菌株苏氨酸生产性能并减少碳源浪费，一些与有机酸合成有关的不重要基因(poxB、pflB、ldhA、adhE和pta)和编码苏氨酸转运蛋白的基因(tdcC)分别被敲除(见图2)，从而产生了平台菌株TWF102、TWF103、TWF104、TWF105、TWF106、TWF107、TWF108，如表1所示。这些平台菌株分别在37℃恒温和变温(从37℃到42℃)条件下进行摇瓶发酵生产苏氨酸，来评估温度变化对菌株产苏氨酸能力影响。
结果如图9所示，摇瓶发酵数据显示了不同平台菌株在37℃恒温发酵和变温(从37℃到42℃)发酵，发酵15h内的细胞生长、葡萄糖消耗、苏氨酸产量和有机酸产量的趋势。首先，和37℃恒温发酵条件相比，变温发酵条件对苏氨酸生产菌生产苏氨酸的性能没有明显的负面影响。其次，通过对比各菌株在变温发酵条件下产苏氨酸产量，菌株TWF106/pFT24具有一定的优势。而菌株TWF107/pFT24被敲除了pta，该菌株在发酵前期生长受到明显的抑制，它的苏氨酸生产能力明显下降。
利用温度开关***关闭一些影响菌株生长的碳源竞争途径，包括乙酸合成途径和L-丙氨酸合成途径。为了构建乙酸合成途径关闭***，苏氨酸生产菌基因组上编码磷酸盐乙酰转移酶的pta基因被敲除。将pta基因***到PLtetO-1启动子之后，得到表达载体pFT24t1、pFT24t2、pFT24t3、pFT24t4、pFT24rpt3，使PLtetO-1启动子控制pta基因在细胞生长阶段正常表达，发酵生产阶段关闭其表达，从而节省碳源(如图11所示)。如图12所示，将表达载体pFT24t1、pFT24t2、pFT24t3、pFT24t4、pFT24rpt3转入敲除了pta的菌株TWF108，但相比于TWF106/pFT24，它们的苏氨酸生产能力没有提高。类似地，L-丙氨酸合成途径通过L-丙氨酸合成转氨酶将丙酮酸转化为L-丙氨酸，包括三种主要蛋白质：AvtA，AlaA和AlaC。因此，构建多敲除菌株TWF113(TWF106ΔavtAΔalaAΔalaC)，用以进一步设计用于关闭L-丙氨酸合成的温度开关***。包含不同RBS序列(见表3)的alaA和alaC基因被分别***到PLtetO-1启动子之后，得到pFT24rpa1、pFT24rpa2、pFT24rpa3和pFT24rpa4，使温度开关载体pFT24控制其在菌株生长时期进行基因表达，以恢复菌株正常生长和生物量积累(如图13所示)。发酵时期关闭这些途径，来减少过多的碳源分流到其他途径，从而集中更多的碳源来合成目标产物。
(2)优化和改造温度开关载体：
为了验证温度开关***对中心代谢途径动态调控效果，使用含有高强度的RBS序列的引物从乳酸乳球菌中扩增了异源基因pyc。类似地，从大肠杆菌TWF001基因组上扩增获得含有高强度的RBS序列的rhtC基因，使用的引物见表3。使用一步克隆试剂盒，将密码子优化的合成基因pycmt以及pyc和rhtC分别***温度开关载体pFT24的SpeI位点，该位点位于pR-pL启动子的下游。两个基因rhtC和pycmt在cIts-pR-pL环路的控制下共表达，得到温度开关载体pFT24rp。
将这些温度开关载体分别电转化导入工程菌株TWF106中，产生一系列重组菌株。为了提高工程微生物中苏氨酸生产效率，尝试对影响细胞生长的竞争途径的几个关键基因从大肠杆菌染色体迁移到温度开关载体上。用附加了“LAA”降解尾巴的引物从大肠杆菌基因组分别扩增出pta,gltA,alaA和alaC，分别克隆到载体pFT24或pFT24rp的EcoRI限制性位点，酶切位点位于PLtetO-1启动子下游。将含有不同强度RBS的目标基因的互补质粒导入到目标菌株中，以恢复细胞生长。
实施例3发酵生产苏氨酸
STF种子培养基是以LB培养基为基础，经过优化改良后得到的。对LB培养基中的蔗糖和蛋白胨含量进行调节后，用来培养TWF001菌株，检测该菌株在不同成分的种子培养基中生长状况及苏氨酸产量(如图8所示)。结果显示，采用STF种子培养基作为种子培养基，采用37℃恒温摇瓶发酵，发酵18h后，TWF001的苏氨酸产量为15.37g/L，相比LB作为种子培养基提高了50.54％。
重组菌株TWF106/pFT24r、TWF106/pFT24p、TWF106/pFT24pm和TWF106/pFT24rp，经过变温摇瓶发酵(如图10所示)，其苏氨酸产量分别是17.24g/L、20.15g/L、20.60g/L和23.29g/L，对应的摩尔糖酸转化率是72.44％、81.50％、98.43％和111.78％。
在苏氨酸发酵过程中，乙酸的积累会影响菌株正常生长，同时降低菌株苏氨酸生产能力。通过传统的敲除pta来切断乙酸生产途径，会严重抑制菌株的生长，进而降低菌株生产苏氨酸能力(如图9所示)。我们尝试通过温度开关***来关闭pta的表达，来节约碳源减少乙酸形成。苏氨酸摇瓶发酵数据显示，相比TWF106/pFT24rp，关闭pta表达虽然最终的菌株生物量增多，但并没有进一步提高菌株苏氨酸生产能力。
在高产苏氨酸菌TWF106/pFT24rp基础上，进一步使用温度开关载体关闭丙氨酸合成途径，获得重组菌株TWF113/pFT24rpa1(如图14所示)，具体为：在TWF106基础上，同时敲除avtA、alaA和alaC三个基因，获得菌株TWF113；在温度表达载体pFT24rp基础上，用启动子PLtetO-1控制alaA表达，获得表达载体pFT24rpa1。重组菌株TWF113/pFT24rpa1经过变温摇瓶发酵，苏氨酸产量达25.85g/L，其摩尔糖酸转化率为124.03％(如图15所示)。检测所有菌株在摇瓶发酵过程中有机酸形成情况，发现这几株菌在发酵前期生产的丙酮酸和乙酸，均能在温度开关***开启后被重新吸收利用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggctggtt ctcgcagaaa gaaacatatc catgaaatcc cgccccgaat tcatatgtct 60
agattagata aaagtaaagt gattaacagc gcattagagc tgcttaatga ggtcggaatc 120
gaaggtttaa caacccgtaa actcgcccag aagctaggtg tagagcagcc tacattgtat 180
tggcatgtaa aaaataagcg ggctttgctc gacgccttag ccattgagat gttagatagg 240
caccatactc acttttgccc tttagaaggg gaaagctggc aagatttttt acgtaataag 300
gctaaaagtt ttagatgtgc tttactaagt catcgcgatg gagcaaaagt acatttaggt 360
acacggccta cagaaaaaca gtatgaaact ctcgaaaatc aattagcctt tttatgccaa 420
caaggttttt cactagagaa tgcattatat gcactcagcg ctgtggggca ttttacttta 480
ggttgcgtat tggaagatca agagcatcaa gtcgctaaag aagaaaggga aacacctact 540
actgatagta tgccgccatt attacgacaa gctatcgaat tatttgatca ccaaggtgca 600
gagccagcct tcttattcgg ccttgaattg atcatatgcg gattagaaaa acaacttaaa 660
tgtgaaagtg ggtcttaa 678
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagctctcta gaactagtgg atcctgcagg a 31
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttg 48
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaattcgat atcactcgag gtacc 25
<210> 5
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg 60
gtgaacgctc tcctgagtag gacaaat 87
<210> 6
<211> 3414
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaaaaaac tgctggtcgc aaatcgtgga gaaatcgccg ttcgtgtctt tcgtgcctgt 60
aatgaactcg gactttctac agtagccgtc tatgcacgtg aagatgaata ttccgttcat 120
cgctttaaag cagatgaatc ttaccttatc ggtcaaggta aaaaaccaat tgatgcttat 180
ttggatattg atgatattat tcgtgttgct cttgaatcag gagcagatgc cattcatccg 240
ggttatggtc ttttatctga aaatcttgaa tttgctacaa aagttcgtgc agcaggatta 300
gtttttgtcg gtcctgaact tcatcatttg gatattttcg gcgataaaat caaagcaaaa 360
gccgcagctg atgaagctca agttccgggc attccgggaa caaatggtgc agtagatatt 420
gacggcgctc ttgaatttgc tcaaacttac ggatatccag tcatgattaa ggcagcattg 480
ggcggcggcg gtcgtggaat gcgtgttgcg cgtaatgacg ctgaaatgca cgacggatat 540
gctcgtgcga aatcagaagc tatcggtgcc tttggttctg gagaaatcta tgttgaaaaa 600
tacattgaaa atcctaagca tattgaagtt caaattcttg gggatagtca tggaaatatt 660
gtccatttgc acgaacgtga ttgctctgtc caacgccgta atcaaaaagt cattgaaatt 720
gctccagccg taggactctc accagagttc cgtaatgaaa tttgtgaagc agcagttaaa 780
ctttgtaaaa atgttggcta tgttaatgct gggacggttg aatttttagt caaagatgat 840
aagttctact ttatcgaagt caacccacgt gttcaagttg aacacacaat taccgagctt 900
attacaggtg tagatattgt tcaagcacaa attttgattg ctcaaggcaa agatttacat 960
acagaaattg gtatcccggc acaagctgaa attccacttt tgggctcagc cattcaatgt 1020
cgtattacta cagaagaccc gcaaaatggc ttcttgccag atacaggtaa aatcgatacc 1080
taccgttcac caggtggttt cggcattcgt ttggacgttg gaaatgccta tgctggttat 1140
gaagtgactc cgtattttga ctctctttta gtaaaagttt gtacctttgc taatgaattt 1200
agcgatagtg tacgtaaaat ggatcgtgtg cttcatgaat ttcgtattcg tggggtgaaa 1260
actaatattc catttttgat taatgttatt gccaatgaaa actttacgag cggacaagca 1320
acaacaacct ttattgacaa tactccaagt cttttcaatt tcccacgctt acgtgaccgt 1380
ggaacaaaaa ccttacacta cttatcaatg attacagtca atggtttccc agggattgaa 1440
aatacagaaa aacgccattt tgaagaacct cgtcaacctc tgcttaacat tgaaaagaaa 1500
aagacagcta aaaatatctt agatgaacaa ggggctgatg cggtagttga atatgtgaaa 1560
aatacaaaag aagtattatt gacagataca actttacgtg atgctcacca gtctcttctt 1620
gccactcgtt tgcgtttgca agatatgaaa ggaattgctc aagccattga ccaaggactt 1680
ccagaacttt tctcagctga aatgtggggt ggggcaacct ttgatgtcgc ttatcgtttc 1740
ttgaatgaat cgccttggta tcgtctgcgt aaattacgta aactcatgcc aaataccatg 1800
ttccaaatgc ttttccgtgg ttcaaatgca gttggatatc aaaactatcc tgataatgtc 1860
attgaagaat ttatccacgt agctgcacat gaaggaatcg atgtctttcg tatctttgat 1920
agcctcaact ggttgccaca aatggaaaaa tcaatccaag cagtgcgtga taatggaaaa 1980
attgccgaag caaccatttg ttatacagga gatatccttg acccaagtcg tccaaaatat 2040
aatatccaat actacaaaga tttggcaaaa gagttagaag ctactggggc tcatatcctt 2100
gccgttaaag atatggcggg cttgttgaaa cctcaagcgg catatcgctt gatttcagaa 2160
ttaaaagata cggttgactt accaattcac ttgcatacac atgatacttc aggaaatggt 2220
attattacct attctggtgc aactcaagca ggagtagata ttattgatgt ggcaactgcc 2280
agtcttgctg gtggaacttc tcaaccttca atgcaatcaa tttattatgc ccttgaacat 2340
ggtccgcgtc atgcttcaat taatgtgaaa aatgcagagc aaattgacca ttattgggaa 2400
gatgtgcgta aatattatgc accttttgag gcaggaatta cgagcccaca aactgaagtt 2460
tacatgcatg aaatgcctgg cggacaatat actaacttga aatctcaagc agcagctgtt 2520
ggacttggac atcgttttga tgaaatcaaa caaatgtatc gtaaagtaaa catgatgttt 2580
ggcgatatca ttaaagtaac tccttcatca aaagtagttg gtgatatggc actctttatg 2640
attcaaaacg aattgacaga agaggatgtc tatgcgcgtg gaaatgagct taacttccct 2700
gaatcagtag tctcattctt ccgtggtgat ttaggacagc ctgttggagg tttcccagaa 2760
gaactgcaaa aaattattgt aaaagacaaa tcggtcatta tggatcgtcc aggattacat 2820
gccgaaaaag ttgattttgc aactgtaaaa gctgacttgg aacaaaaaat tggttatgaa 2880
ccaggtgatc atgaagttat ctcttacatt atgtatccac aagttttcct tgattatcaa 2940
aaaatgcaac gtgaatttgg agctgtcaca ctgctcgata ctccaacttt cttacacgga 3000
atgcgcctca atgaaaaaat tgaagtccaa attgaaaaag gtaaaacgct cagcattcgt 3060
ttagatgaaa ttggagaacc tgacctcgct ggaaatcgtg tgctcttctt taacttgaac 3120
ggtcagcgtc gtgaagttgt tattaatgac caatccgttc aaactcaaat tgtagctaaa 3180
cgtaaggccg aaacaggtaa tccaaaccaa attggagcaa ctatgccggg ttctgttctt 3240
gaaatcctgg ttaaagctgg agataaagtt aaaaaaggac aagctttgat ggttactgaa 3300
gccatgaaga tggaaacgac cattgagtca ccatttgatg gagaggttat tgcccttcat 3360
gttgtcaaag gtgaagccat tcaaacacaa gacttattga ttgaaattga ctaa 3414
Claims (2)
1.一种生产苏氨酸的菌株，其特征在于，所述菌株表达温度开关载体，所述温度开关载体为pFT24rp或pFT24rpa1；所述pFT24rp是将温度开关回路连接到载体上得到的；所述温度开关回路含温敏回路cIts-pR-pL和严谨型回路tetR-PLtetO-1；所述温敏回路cIts-pR-pL由温敏抑制子基因cIts和串联启动子pR-pL组成，所述严谨型回路tetR-PLtetO-1由抑制子基因tetR和启动子PLtetO-1组成；将质粒pFW001中的pMB1替换为中等拷贝数复制子p15A，并将质粒pFW001中的PJ23101启动子替换为温度开关回路；所述温度开关回路是将温敏抑制子基因cIts、启动子pR-pL、低强度RBS、抑制子基因tetR、多克隆位点序列MCS1、终止子T7、启动子PLtetO-1、多克隆位点序列MCS2、终止子T1依次串联；所述低强度RBS的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；并将pyc基因和rhtC基因置于pR-pL启动子的下游，将基因rhtC和pycmt在cIts-pR-pL环路的控制下共表达，得到温度开关载体pFT24rp；所述pFT24rpa1是在pFT24rp基础上，在MCS2中***了用标准SsrA降解肽链标记的alaA基因；在大肠杆菌TWF106中表达温度开关载体pFT24rp；在大肠杆菌TWF113中表达温度开关载体pFT24rpa1；所述大肠杆菌TWF106是以TWF001为出发菌株，敲除基因poxB、pflB、ldhA、adhE、tdcC；所述大肠杆菌TWF113是以TWF106为出发菌株，敲除基因avtA、alaA、alaC。
2.一种生产苏氨酸的方法，其特征在于，是以权利要求1所述菌株为发酵菌株，生产苏氨酸，将初始OD600为0.2～0.3的发酵菌株种子培养物接种到发酵培养基中，36～38℃发酵培养5～8h，41～43℃继续培养至发酵液中葡萄糖全部被消耗完。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010057144.6A CN111363757B (zh) | 2020-01-19 | 2020-01-19 | 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 |
| PCT/CN2020/138263 WO2021143468A1 (zh) | 2020-01-19 | 2020-12-22 | 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 |
| US17/746,130 US20240060076A1 (en) | 2020-01-19 | 2022-05-17 | Thermal switch system and application thereof in improving yield of amino acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010057144.6A CN111363757B (zh) | 2020-01-19 | 2020-01-19 | 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111363757A CN111363757A (zh) | 2020-07-03 |
| CN111363757B true CN111363757B (zh) | 2022-08-09 |
Family
ID=71206158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010057144.6A Active CN111363757B (zh) | 2020-01-19 | 2020-01-19 | 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240060076A1 (zh) |
| CN (1) | CN111363757B (zh) |
| WO (1) | WO2021143468A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111363757B (zh) * | 2020-01-19 | 2022-08-09 | 江南大学 | 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 |
| CN112662694A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-16 | 康九生物科技(长春)有限公司 | 一种麦芽糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白表达载体、重组工程菌及其应用 |
| CN114317579A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-12 | 南京合谷生命生物科技有限公司 | 一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及应用 |
| CN114774419B (zh) * | 2022-04-24 | 2023-08-11 | 江南大学 | 一种温敏型基因回路***及其构建方法与应用 |
| CN117946954B (zh) * | 2024-03-26 | 2024-06-14 | 天津科技大学 | 一种亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用 |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1457365A (zh) * | 2001-02-13 | 2003-11-19 | 第一制糖株式会社 | L－苏氨酸的生产方法 |
| CN103409361A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-11-27 | 上海瀚正生物技术服务有限公司 | 温敏微载体及其制备工艺和使用方法 |
| CN104560852A (zh) * | 2014-09-22 | 2015-04-29 | 江南大学 | 一种l-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌 |
| CN105238724A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-01-13 | 江南大学 | 一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 |
| CN106867952A (zh) * | 2017-01-09 | 2017-06-20 | 天津科技大学 | 一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产l‑苏氨酸的方法 |
| CN107699525A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-02-16 | 吉林大学 | L‑苏氨酸高产基因工程菌及其应用 |
| CN109576253A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-04-05 | 江南大学 | 一种提高l-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体 |
| CN109735478A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-05-10 | 江南大学 | 一株高产l-苏氨酸基因工程菌的构建方法及其应用 |
| CN109852572A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-06-07 | 江南大学 | 一种敲除大肠杆菌pts***提高l-苏氨酸产量的方法 |
| CN110241062A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-17 | 江南大学 | 新大肠杆菌表达*** |
| CN110317767A (zh) * | 2019-07-04 | 2019-10-11 | 江南大学 | 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108611357B (zh) * | 2016-12-13 | 2021-12-07 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | 一种重组表达质粒、转化子及其应用 |
| CN109852631A (zh) * | 2019-02-14 | 2019-06-07 | 湖北大学 | 一种不同强度核糖体结合位点和启动子筛选方法及元件 |
| CN111363757B (zh) * | 2020-01-19 | 2022-08-09 | 江南大学 | 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 |
-
2020
- 2020-01-19 CN CN202010057144.6A patent/CN111363757B/zh active Active
- 2020-12-22 WO PCT/CN2020/138263 patent/WO2021143468A1/zh active Application Filing
-
2022
- 2022-05-17 US US17/746,130 patent/US20240060076A1/en active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1457365A (zh) * | 2001-02-13 | 2003-11-19 | 第一制糖株式会社 | L－苏氨酸的生产方法 |
| CN103409361A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-11-27 | 上海瀚正生物技术服务有限公司 | 温敏微载体及其制备工艺和使用方法 |
| CN104560852A (zh) * | 2014-09-22 | 2015-04-29 | 江南大学 | 一种l-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌 |
| CN105238724A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-01-13 | 江南大学 | 一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法 |
| CN106867952A (zh) * | 2017-01-09 | 2017-06-20 | 天津科技大学 | 一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产l‑苏氨酸的方法 |
| CN107699525A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-02-16 | 吉林大学 | L‑苏氨酸高产基因工程菌及其应用 |
| CN109576253A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-04-05 | 江南大学 | 一种提高l-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体 |
| CN109735478A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-05-10 | 江南大学 | 一株高产l-苏氨酸基因工程菌的构建方法及其应用 |
| CN109852572A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-06-07 | 江南大学 | 一种敲除大肠杆菌pts***提高l-苏氨酸产量的方法 |
| CN110241062A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-17 | 江南大学 | 新大肠杆菌表达*** |
| CN110317767A (zh) * | 2019-07-04 | 2019-10-11 | 江南大学 | 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| A genetic bistable switch utilizing nonlinear protein degradation;Daniel Huang et al.;《 Journal of Biological Engineering》;20121231;第6卷;第1-13页 * |
| A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators;Elowitz et al.;《nature》;20000120;第403卷;第335-338页 * |
| Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli;Gardner et al.;《nature》;20000120;第403卷;第339-342页 * |
| 不同溶氧条件下L-苏氨酸生物合成菌株的代谢流量分析;黄金等;《微生物学报》;20080804;第48卷(第08期);第1056-1060页 * |
| 利用温度调节实现新型重组菌高效转化甘油为D-乳酸;田康明等;《生物工程学报》;20130125;第29卷(第01期);第111-114页 * |
| 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸;周丽等;《微生物学通报》;20151120;第42卷(第11期);第2273页左栏第1段、2279右栏第1段、2280页右栏最后1段及表2和图2 * |
| 碳代谢流分配及辅因子再生提高大肠杆菌苏氨酸产量;李慧玲;《中国万方在线学位论文数据库》;20190827;第5页第1段、第40页倒数1-2段、第43页倒数第2段、第45页第1段及图3-3和图3-6 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021143468A1 (zh) | 2021-07-22 |
| US20240060076A1 (en) | 2024-02-22 |
| CN111363757A (zh) | 2020-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111363757B (zh) | 一种温度开关***及其在提高氨基酸产量中的应用 | |
| Chen et al. | Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of 3-hydroxypropionic acid from glucose and xylose | |
| Ren et al. | Identification and inactivation of pleiotropic regulator CcpA to eliminate glucose repression of xylose utilization in Clostridium acetobutylicum | |
| Fang et al. | Rebalancing microbial carbon distribution for L-threonine maximization using a thermal switch system | |
| JP5486029B2 (ja) | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 | |
| Lara et al. | Transcriptional and metabolic response of recombinant Escherichia coli to spatial dissolved oxygen tension gradients simulated in a scale‐down system | |
| CN101688196A (zh) | 用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法 | |
| AU2003287625A8 (en) | Materials and methods for the efficient production of acetate and other products | |
| KR20160079897A (ko) | 유기산들을 생산하는 대장균의 대사적 진화 | |
| Liao et al. | The significance of proline on lignocellulose-derived inhibitors tolerance in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | |
| Phosriran et al. | An efficient production of bio-succinate in a novel metabolically engineered Klebsiella oxytoca by rational metabolic engineering and evolutionary adaptation | |
| Wang et al. | Improvement of acetyl‐CoA supply and glucose utilization increases l‐leucine production in Corynebacterium glutamicum | |
| Du et al. | New strategy for removing acetic acid as a by-product during L-tryptophan production | |
| CN108588108B (zh) | 一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用 | |
| Yang et al. | Design and application of artificial rare L-lysine codons in Corynebacterium glutamicum | |
| CN112779201A (zh) | 重组微生物及其用途、制备莽草酸和奥司他韦的方法 | |
| TWI622648B (zh) | 正丁醇表現匣、重組質體及正丁醇生產相關基因的表現方法 | |
| CN115506035B (zh) | 启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库 | |
| CN114854661B (zh) | 一种双菌共培养体系利用混糖原料生产l-鸟氨酸的方法 | |
| CN114015634B (zh) | 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN112592903B (zh) | 一种突变型丙酮酸氧化酶及其在2-丁酮酸代谢解毒中的应用 | |
| CN115449519B (zh) | 基于dapB基因的具有启动子活性的多核苷酸及其用途 | |
| WO2022257758A1 (zh) | 基于mdh基因的具有启动子活性的多核苷酸及其用途 | |
| KR101313846B1 (ko) | 산소-조절성 미생물 | |
| CN114480466A (zh) | 一种生产4-羟基异亮氨酸的动态调控菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |