CN101058799B - 一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法及其专用工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法及其专用工程菌。该工程菌，是将含有串联的缺氧诱导启动子与聚羟基脂肪酸酯合成基因的重组表达载体转入宿主菌后得到的重组菌。该生产聚羟基脂肪酸酯的方法是将所述的工程菌，在缺氧条件下，发酵得到聚羟基脂肪酸酯。本发明的方法，在发酵合成PHA过程中无须通入空气或氧气，也无须提供严格的厌氧条件，即不用不断通入氮气，利用廉价碳源发酵，综合降低了PHA的生产成本。

Description

一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法及其专用工程菌

技术领域

本发明涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法及其专用工程菌。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是广泛存在于微生物体内的一类高分子生物聚酯，在生物体内主要作为碳源和能量的贮藏物质(Anderson AJ，Dawes EA.Occurrence，metabolism，metabolic role，and industrial use ofbacterial polyhydroxyalkanoates.Microbiol.Rev.，1990，54：450-472；MadisonLL，Huisman GW.Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates)：from DNAto plastic.Microbiol.Mol.Biol.Rev.，1999，63：21-53)。自然界的多种微生物均可以合成PHA，其分子量一般由几万至几百万(Sudesh K，Abe H，Doi Y.Synthesis，structure and properties of polyhydroxyalkanoates：biologicalpolyesters.Prog.Polym.Sci.，2000，25：1503-1555)。

PHA的结构通式为：

其中n＝1、2、3或4；通常n＝1，即为聚-3-羟基脂肪酸酯。m表示聚合度，决定分子量的大小。R是可变基团，可为饱和或不饱和、直链或含侧链及取代基的烷基。

PHA与传统的、以石油为原料合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯等有相似的材料学性质，但可以用可再生的能源(如植物光合作用产生的碳水化合物、脂肪酸等)合成，并且可以完全降解进入自然界的生态循环，因此被认为是一种环境友好的“绿色塑料”，可以替代不可降解的传统塑料，而引起世界各国科学界和产业界的广泛重视(Steinbüchel A.Perspectives for biotechnological production andutilization of biopolymers：metabolic engineering of polyhydroxyalkanoatebiosynthesis pathways as a successful example.Macromol.Biosci.，2001，1：1-24；Chen GQ，Wu Q，Xi JZ，et al.Microbial production of biopolyesters-polyhydroxyalkanoates.Prog.Nat.Sci.，2000，10：843-850；Lee SY.Bacterialpolyhydroxyalkanoates.Biotechnol.Bioeng.，1996，49：1-14)。当前困扰PHA产业化的主要原因是其生产成本相对石油塑料来说仍然较高。

目前，传统的生产PHA的方法多为利用野生PHA生产菌在好氧条件下发酵积累PHA。然而在好氧条件下，作为碳源的糖类经过糖酵解途径产生的乙酰辅酶A随即进入三羧酸循环体系为生物体生长提供能量，最终一部分碳源变成二氧化碳被排出，剩余碳源则分别用于菌体生长和产物PHA的积累。在此过程中，有氧代谢还会产生额外的NADH造成代谢的不平衡，导致发酵过程中的高耗氧和原料中能量的浪费。此外，在实际的发酵生产过程中，发酵过程的耗氧动力成本往往高达发酵总耗能成本的50％左右。因此现在已有的PHA发酵生产技术存在碳源转化率低，且发酵成本高的问题。所以迫切需要开发能够在缺氧条件下合成PHA的技术，降低PHA的生产成本。所谓缺氧发酵是指在无氧或微氧(溶解氧DO＜0.5mg/L)状态下进行的发酵培养。相比好氧条件下的培养，缺氧发酵无需向发酵液中额外供应纯氧或者空气供微生物代谢之用。严格的厌氧发酵需要在培养过程中不断通入氮气。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法及其专用工程菌。

本发明所提供的生产聚羟基脂肪酸酯用工程菌，是将含有缺氧诱导启动子和串联于所述缺氧诱导启动子下游的聚羟基脂肪酸酯合成基因的重组表达载体转入到宿主菌后得到的重组菌。

所述缺氧诱导启动子可为乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase简称ADH)的启动子(简称P_adhE)(自GENBANK号为NC_000913的5′端第1294197-1294669位核苷酸)，丙酮酸-甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase简称PFL)的启动子(自GENBANK号为NC_000913的5′端第4143715-4144281位核苷酸)，乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase)的启动子(自GENBANK号为NC_000913的5′端第1439568-1439878位核苷酸)，甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase简称GLD)的启动子(P_IdhA)(自GENBANK号为NC_000913的5′端第4135492-4135955位核苷酸)，有氧呼吸调控蛋白(aerobic respiration control protein简称ARC)的启动子(P_arcA)(自GENBANK号为NC_000913的5′端第3348236-3348711位核苷酸)等。

所述聚羟基脂肪酸酯合成基因可为合成短链PHA-聚羟基丁酸酯PHB的基因，如来源于罗氏真养菌Ralstonia eutropha的合成短链PHA的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK号为AM260479的5′端第1557353-1561203位核苷酸)或者巨大产碱杆菌Alcaligenes latus的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK号为U47026的5′端第533-4336位核苷酸)；也可为合成中长链PHA的合成基因，如来源于假单胞菌属Pseudomonas的中长链PHA合成基因phaC1ZC2(自GENBANK号为AY278219的5′端第1-4746位核苷酸)和phaC(自GENBANK号为NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸)，还可为短链和中长链PHA共聚物合成基因，如来源于气单胞菌属Aeromonas的PHA合成基因phaPCJ(自GENBANK号为AY093685的5′端第292-2920位核苷酸)。

所述宿主菌可为大肠杆菌、巨大产碱杆菌、罗氏真养菌、假单胞菌或嗜水性气单孢菌，优选为大肠杆菌，比如野生大肠杆菌K-12及其两株乙酸合成途径的缺失突变体E.coli ackA^-和E.coli pta^-等。一些启动子如乙醇脱氢酶启动子(简称P_adhE)和丙酮酸-甲酸裂解酶启动子(简称P_flp)在某些大肠杆菌的突变体(如乙酸合成途径突变体E.coli ackA^-和E.coli pta^-)中活性会高于野生型大肠杆菌。

所述在大肠杆菌中重组表达的载体的出发载体为pBluescript IISK(-)(NCBIGenBank检索号为X52330)。所述在假单胞菌和嗜水性气单孢菌中重组表达的载体的出发载体为pBBR1MCS-2(NCBI GenBank号为U23751)。

本发明所提供的生产聚羟基脂肪酸酯的方法，是将上述工程菌，在缺氧条件下，发酵得到聚羟基脂肪酸酯。

所述缺氧条件为无氧或微氧条件，即溶解氧DO＜0.5mg/L；在发酵过程中不需要在PHA积累过程中通入空气或富氧气体或者提供严格厌氧条件；根据工艺需要，也可在培养前期进行有氧发酵积累菌体，培养至中后期停止通气转为缺氧培养，并在缺氧条件下进行PHA的合成。

所述大肠杆菌工程菌的发酵温度为28-38℃；优选为37℃。

所述大肠杆菌工程菌的发酵培养基为含有3-7g/L酵母提取物、6-12g/L蛋白胨、6-12g/L NaCl、10-30g/L葡萄糖的培养基；为了防止杂菌污染，所述培养基中还可加入60-100μg/mL氨苄青霉素。大肠杆菌工程菌的发酵培养基优选为含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl、20g/L葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素。

所述假单胞菌工程菌可选用下述三种培养基中的任意一种：

1)每升培养基含：酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 8-12g/L，葡萄糖18-22g/L，其余为水。

2)每升培养基含：酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，葡萄糖40-60g/L，(NH₄)₂SO₄ 5-7g/L；MgSO₄ 0.38-0.45g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 9.6-9.7g/L；KH₂PO₄ 1.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余为水；每升微量元素溶液I含：Fe(III)-NH₄-Citrate 4-6g/L，CaCl₂·2H₂O 1.8-2.2g/L，其余为0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含：ZnSO₄·7H₂O 80-120mg/L，MnCl₂·4H₂O 25-35mg/L，H₃BO₃ 280-320mg/L，CoCl₂·6H₂O 180-220mg/L，CuSO₄·5H₂O8-12mg/L，NiCl₂·6H₂O 18-22mg/L，NaMoO₄·2H₂O 28-32mg/L，其余为0.4-0.6M HCl。

3)每升培养基含：月桂酸7-9g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.8-2.2g/L；MgSO₄ 0.38-0.45g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 9.6-9.7g/L；KH₂PO₄ 1.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余为水；每升微量元素溶液I含：

Fe(III)-NH₄-Citrate 4-6g/L，CaCl₂·2H₂O 1.8-2.2g/L，其余为0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含：ZnSO₄·7H₂O 80-120mg/L，MnCl₂·4H₂O 25-35mg/L，H₃BO₃280-320mg/L，CoCl₂·6H₂O 180-220mg/L，CuSO₄·5H₂O 8-12mg/L，NiCl₂·6H₂O 18-22mg/L，NaMoO₄·2H₂O 28-32mg/L，其余为0.4-0.6M HCl。

在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如30-50μg/mL硫酸卡那霉素和60-100μg/mL氨苄青霉素。

所述假单胞菌工程菌的发酵温度为30-35℃。

所述巨大产碱杆菌、罗氏真养菌和嗜水气单胞菌的发酵培养基为矿物培养基(MM培养基)中加入长链脂肪酸或葡萄糖酸钠作为碳源。

所述矿物培养基包括以下四种组分：

组分I(20×)：Na₂HPO₄·12H₂O 180g/L，KH₂PO₄ 30g/L；

组分II：(NH₄)₂SO₄ 0.5～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L；

组分III(100×)：Fe(III)-NH₄-Citrate 5g/L，CaCl₂·2H₂O 2g/L；

组分IV(1000×)：ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，MnCl₂·4H₂O 30mg/L，H₃BO₃300mg/L，CoCl₂·6H₂O 200mg/L，CuSO₄·5H₂O 10mg/L，NiCl₂·6H₂O 20mg/L，NaMoO₄·2H₂O 30mg/L。

其中组分III和组分IV为微量元素，用1mol/L的盐酸溶液配制。

灭菌时，以组分II为基底，四种组分分开单独灭菌，使用前按所述比例混合。组分IV在灭菌前稀释成100倍浓度的母液再灭菌。

接种前在上述矿物培养基中加入8-10g/L长链脂肪酸如癸酸、月桂酸等作为碳源。在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加1g/L酵母粉来促进菌体生长；还有一定浓度的抗生素以维持质粒稳定性，如30-50μg/mL硫酸卡那霉素和60-100μg/mL氨苄青霉素。

所述巨大产碱杆菌、罗氏真养菌和嗜水气单胞菌的工程菌的发酵温度为30-35℃。

本发明的方法通过构建得到的缺氧发酵条件下可高效表达PHA菌种，利用该菌种，在缺氧条件下合成PHA。本发明的方法，在发酵合成PHA过程中无须通入空气或氧气，也无须提供严格的厌氧条件，即不用不断通入氮气，利用廉价碳源发酵，综合降低了PHA的生产成本。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶，均购自TaKaRa公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行；提取质粒、回收DNA片段所用的试剂盒购自申能***公司，相应的操作完全按照其产品说明书进行；实验中涉及的测序工作交由奥科生物公司进行。

下述实施例中涉及的细菌培养基如下，如未特殊指明，培养基均用去离子水配制；如未特殊指明，培养基的灭菌条件均为115℃，20分钟：

LB液体培养基：含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl，pH 7.0；

LB-Amp液体培养基：含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和100μg/mL氨苄青霉素；

LB-Amp固体培养基：含有15g/L琼脂、5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和100μg/mL氨苄青霉素；

LB-Km液体培养基：每升培养基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余为水。

LB-Km固体培养基：每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余为水。

LB-Km-Amp液体培养基：每升培养基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。

LB-Km-Amp固体培养基：每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。

LBG-Amp液体培养基：含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl、20g/L葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素。

MM培养基包括以下四种组分：

组分I(20×)：Na₂HPO₄·12H₂O 180g/L，KH₂PO₄ 30g/L；

组分II：(NH₄)₂SO₄ 0.5～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L；

组分III(100×)：Fe(III)-NH₄-Citrate 5g/L，CaCl₂·2H₂O 2g/L；

组分IV(1000×)：ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，MnCl₂·4H₂O 30mg/L，H₃BO₃300mg/L，CoCl₂·6H₂O 200mg/L，CuSO₄·5H₂O 10mg/L，NiCl₂·6H₂O20mg/L，NaMoO₄·2H₂O 30mg/L；

其中组分III和组分IV为微量元素，用1mol/L的盐酸溶液配制。

灭菌时，以组分II为基底，四种组分分开单独灭菌，使用前按照倍数稀释混合。组分IV在灭菌前稀释成100倍浓度的母液再灭菌。

本发明是利用缺氧诱导启动子启动聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成基因表达生成聚羟基脂肪酸酯(PHA)；所述缺氧诱导启动子包括乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase简称ADH)的启动子(P_adhE)(自GENBANK号为NC_000913的5′端第1294197-1294669位核苷酸)，丙酮酸-甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase简称PFL)的启动子(P_pfIC)(自GENBANK号为NC_000913的5′端第4143715-4144281位核苷酸)，乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase)的启动子(自GENBANK号为NC_000913的5′端第1439568-1439878位核苷酸)，甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase简称GLD)的启动子(自GENBANK号为NC_000913的5′端第4135492-4135955位核苷酸)，有氧呼吸调控蛋白(aerobic respiration control protein简称ARC)的启动子(P_arcA)(自GENBANK号为NC_000913的5′端第3348236-3348711位核苷酸)，以及其它在缺氧条件下能够表达的启动子；

所述聚羟基脂肪酸酯合成基因可为合成短链PHA-聚羟基丁酸酯PHB的基因，如来源于罗氏真养菌Ralstonia eutropha的合成短链PHA的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK号为AM260479的5′端第1557353-1561203位核苷酸)或者巨大产碱杆菌Alcaligenes latus的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK号为U47026的5′端第533-4336位核苷酸)；也可为合成中长链PHA的合成基因，如来源于假单胞菌属Pseudomonas的中长链PHA合成基因phaC1ZC2(自GENBANK号为AY278219的5′端第1-4746位核苷酸)和phaC(自GENBANK号为NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸)，还可为短链和中长链PHA共聚物合成基因，如来源于气单胞菌属Aeromonas的PHA合成基因phaPCJ(自GENBANK号为AY093685的5′端第292-2920位核苷酸)。

实施例1、利用乙醇脱氢酶启动子(简称P_adhE)和聚-3-羟基丁酸酯(PHB)合成的相关基因(phaCAB)生产PHA及其效果验证

下述实施例的方法利用乙醇脱氢酶启动子(简称P_adhE)和聚-3-羟基丁酸酯(PHB)合成的相关基因(phaCAB)为例子构建缺氧诱导表达聚-3-羟基丁酸酯的重组载体pPadhE-CAB，通过电转化的方式将pPadhE-CAB导入野生大肠杆菌E.coli K-12及其两株乙酸合成途径的缺失突变体E.coli ackA^-和E.coli pta^-得到三株缺氧诱导表达聚-3-羟基丁酸酯的工程菌。其中phaCAB来源于质粒pBHR68(按照文献(Spiekermann，P.，et al.，A sensitive，viable-colony staining method usingNile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoicacids and other lipid storage compounds.Arch Microbiol，1999.171(2)：p.73-80)所述方法构建)，乙醇脱氢酶启动子(简称P_adhE)来源于野生大肠杆菌Escherichia coli K-12(ATCC编号：25404)基因组，使用原核表达载体pBluescriptII SK(-)(NCBI GenBank检索号为X52330)作为出发载体。

一、缺诱导氧表达聚-3-羟基丁酸酯的工程菌的获得

1、缺氧诱导启动子P_adhE的克隆及其表达载体质粒pPadhE的构建

1)大肠杆菌基因组的提取

取1.5mL大肠杆菌Escherichia coli K-12(ATCC编号：25404)37℃过夜培养物于离心管中，12000rpm离心1min，弃去上清，收集菌体。加入400μL裂解液(40mM Tris-醋酸，20mM醋酸钠，1Mm EDTA，1％SDS，pH 7.8)混匀，置于37℃水浴1小时。然后加入5M的氯化钠溶液200μL，混匀后于13000rpm离心15min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M，pH 5.8)，-20℃保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后得到大肠杆菌基因组DNA，溶于50μL TE溶液中。

2)乙醇脱氢酶基因的启动子的获得

在标准的聚合酶链反应条件下，以步骤1)中提取的大肠杆菌基因组为模板，以P1：AAAACTCGAGGGTTAGCTCCGAAGCAAAAG(XhoI)和P2：CAGCCATATGGCTCTCCTGATAATGTTAAAC(NdeI)为上下游引物扩增得到473bp的片段，经测序表明，该片段含有乙醇脱氢酶基因的启动子(具有GENBANK号为NC_000913的5′端第1294197-1294669位核苷酸序列)，用限制性内切酶XhoI/NdeI酶切处理后，回收该473bp含有乙醇脱氢酶基因的启动子的片段。

3)含有乙醇脱氢酶基因的启动子的重组载体(pPadhE)的构建

用限制性内切酶XhoI和NdeI对质粒pBluescript IISK(-)(NCBI GenBank检索号为X52330)进行双酶切，回收酶切片段，将该片段与上述PCR获得的乙醇脱氢酶基因的启动子片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应完成后，将连接产物用电转化的方法导入到E.coli JM109(ATCC编号：53323)中，将转化子涂布于LB-Amp固体培养平板上，在37℃、200rpm下培养12h；挑取在LB-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Amp液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶XhoI和NdeI对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经双酶切后可产生大小约为2969bp及473bp的DNA片段，以pBluescript II SK(-)载体多克隆位点上游引物M13 primer对克隆得到的乙醇脱氢酶启动子(P_adhE)进行测序，确认其序列正确无误，将经检测表明正确的含有P_adhE的重组载体命名为pPadhE。

2、缺氧诱导表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的重组表达载体(pPadhE-CAB)的构建

在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pBHR68(按照文献(Spiekermann，P.，et al.，A sensitive，viable-colony staining method using Nile red for directscreening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and otherlipid storage compounds.Arch Microbiol，1999.171(2)：p.73-80)所述方法构建)为模板，用P3：AGCCATATGGCGACCGGCAAAGGC(NdeI)和P4：CGCGGATTCGTCAGCCCATGTGCAGGC(BamHI)为上下游引物扩增出phaCAB基因，将扩增出的片段用NdeI和BamHI酶切处理后，回收得到3863bp的片段(具有自GenBank检索号为NC_008313的5′端第1557353-1561203位核苷酸序列)，即为phaCAB基因片段；

使用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切处理质粒pPadhE，回收酶切后片段，将其与步骤1)中得到的phaCAB基因片段用T4连接酶进行连接；连接反应完成后，将连接产物用电转化的方法导入到E.coli JM109(ATCC编号：53323)中，将转化子涂布于LB-Amp固体培养基，培养12h；

从LB-Amp固体培养基上挑取单克隆到LB-Amp液体培养基中，培养12h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，并通过XhoI和BamHI酶切确认质粒构建是否成功；阳性质粒经上述步骤处理后，酶切产物为两段DNA片断，大小为4320bp及2969bp，将检测表明正确的含有乙醇脱氢酶启动子(P_adhE)和PHA合成基因phaCAB的质粒命名为pPadhE-CAB。

3、缺氧诱导表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的重组工程菌(E.coli K-12(pPadhE-CAB)、E.coli ackA^-(pPadhE-CAB)或E.coli pta^-(pPadhE-CAB))的获得

1)大肠杆菌乙酸合成途径缺失突变体E.coli ackA^-和E.coli pta^-的获得

i)电转化感受态制备：分别接种E.coli K-12新鲜种子液1mL至装有100mL LB液体培养基，37℃下剧烈振荡培养1.5-2小时至OD 600值达到0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟；细胞在4℃、5000rpm下离心10分钟，弃上清液；用灭菌的冰水重悬浮细胞，然后按照上面步骤重复离心，小心弃去上清液；用20mL灭菌的、预冷后的10％甘油重悬浮细胞，然后按照上面步骤离心，小心弃去上清液，用1ml预冷的10％甘油重悬浮细胞，即得到E.coli K-12的电转化感受态；将感受态细胞液分别按100μL等份装入微量离心管，于-80℃保存；

ii)将质粒pKD46(GENBANK号为AY048746，大小为6329bp；按照文献(Datsenko，K.A.and B.L.Wanner，One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A，2000.97(12)：p.6640-5)所述的方法构建)转入E.coli K-12感受态得到含有pKD46的E.coli K-12；

iii)以pKD13(GENBANK号为AY048744，大小为3434bp；按照文献(Datsenko，K.A.and B.L.Wanner，One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A，2000.97(12)：p.6640-5)所述的方法构建)为模板，以P1：

GTGTCCCGTATTATTATGCTGATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和P2：

TTACTGCTGCTGTGCAGACTGTTTCCGGGGATCCGTCGACC为上下游引物扩增得到含有磷酸转乙酸酶phosphotransacetylase基因(简称pta)同源序列(引物下划线部分)的Km(卡那霉素)抗性基因片段，将PCR产物经测序表明正确后回收；

iV)通过电转化的方式将上述PCR产物导入到含有质粒pKD46的E.coli K-12中，通过存在于质粒pKD46上的red重组酶作用将pta基因用Km抗性基因替换，因而重组子具有了Km(卡那霉素)抗性可在LB-Km-Amp固体培养基平板上筛选得到重组子(即E.coli K-12基因组中pta基因用Km抗性基因替换，并含有pta基因置换了Km抗性基因的质粒pKD46的菌株)；将得到的重组子在无抗性的LB培养基中42℃培养24小时后，将重组子分别接种到LB-Km固体培养基和LB-Amp固体培养基上培养，筛选有Km抗性而无Amp抗性的菌株(即E.coli K-12基因组中pta基因用Km抗性基因替换，而pta基因置换了Km抗性基因的质粒pKD46丢失的菌株)，即为pta基因缺失突变体E.coli pta^-。

V)以pKD13为模板，以P3：

ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和P4：

TCAGGCAGTCAGGCGGCTCTTTCCGGGGATCCGTCGACC为上下游引物扩增得到含有乙酸激酶acetate kinase基因(简称ackA)同源序列(引物下划线部分)的Km抗性基因片段，将PCR产物经测序表明正确后回收；

Vi)通过电转化的方式将PCR产物导入到含有质粒pKD46的E.coli K-12中，通过存在于质粒pKD46上的red重组酶作用将ackA基因用Km抗性基因替换，因而重组子具有了Km抗性可在Amp(氨卞青霉素)，Km双抗平板上筛选得到重组子(即E.coli K-12基因组中ackA基因用Km抗性基因替换，并含有ackA基因置换了Km抗性基因的质粒pKD46的菌株)；将得到的重组子在无抗性的LB培养基中42℃培养24小时后，将重组子分别接种到LB-Km固体培养基和LB-Amp固体培养基上培养，筛选有Km抗性而无Amp抗性的菌株(即E.coli K-12基因组中ackA基因用Km抗性基因替换，而ackA基因置换了Km抗性基因的质粒pKD46丢失的菌株)，即为ack基因缺失突变体E.coli ackA^-。

2)从E.coli JM109(pPadhE-CAB)中提取新鲜质粒pPadhE-CAB，分别取1L质粒加入步骤1)制备的E.coli K-12、E.coli ackA^-和E.coli pta^-的电转化感受态中，冰上混合约5分钟；转移DNA/细胞混合物至冷却后的1mm电穿孔容器(Bio-rad公司)中；对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆，25μFd，1.25千伏)，立即添加800μL的LB至电穿孔容器中，37℃下培养细胞复苏45分钟后涂布LB-Amp固体培养基；从LB-Amp固体培养基上挑取单克隆到LB-Amp液体培养基中，培养12h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒验证转化是否成功，正确的质粒大小为7.308kb；通过XhoI和BamHI酶切进一步确认该质粒，质粒pPadhE-CAB经上述步骤处理后，酶切产物为两段DNA片段，大小为4320bp及2969bp，将经检测确认含有pPadhE-CAB质粒的E.coli K-12命名为E.coli K-12(pPadhE-CAB)；将经检测确认含有pPadhE-CAB质粒的E.coli ackA^-命名为E.coli ackA^-(pPadhE-CAB)；或将经检测确认含有pPadhE-CAB质粒的E.coli pta^-命名为E.coli pta^-(pPadhE-CAB))。

二、工程菌E.coli K-12(pPadhE-CAB)厌氧培养生产PHA的摇瓶实验

将E.coli K-12(pPadhE-CAB)在LB-Amp液体培养基中培养12h(37℃摇床，200rpm)作为种子液；按体积比1％的接种量(即5×10⁹cfu/L)将种子液接种到LBG-Amp液体培养基中，接种后随即在摇瓶中加入20mL灭菌石蜡隔绝空气，形成缺氧环境；分成两组，分别在30℃或37℃培养箱中静止培养48h。用气相色谱法(Gaschromatography，GC)对发酵产物定性检测，结果表明采用这种方法生产得到的PHA组分为聚β-羟基丁酸酯(PHB)。

按照下述方法进行菌体中PHA含量的气相色谱法(Gas chromatography，GC)检测：

气相色谱分析使用安捷伦公司的HP 6890气相色谱仪。色谱柱为HP-5毛细管柱，长30m，内径320μm，固定相为25nm厚的苯基甲基聚硅氧烷。检测器为火焰离子化检测器(Flame ionization detector，FID)。用高纯氮气作为载气，氢气作为燃气，空气为助燃气。

气相色谱分析的条件如下：

柱温：80℃开始，停留1.5min；30℃/min的速率升温到140℃，停留0min；40℃/min的速率升温到220℃，停留0.5min；总计时间为6min。

柱压：10psi开始，停留1.5min；2.5psi/min的速率升压到20psi，停留0.5min。(psi为压力单位，即磅/平方英寸，1psi＝6.89476kPa)

进样口：温度为200℃，分流模式，分流比为30～100。

检测器：温度为220℃，氢气流量为30mL/min，空气为400mL/min。

检测步骤如下：

1)将上述发酵培养的E.coli K-12(pPadhE-CAB)菌液，离心(8000rpm，10min)收集细菌，然后用蒸馏水洗涤后再次离心；将细胞冰冻干燥，测定细胞干重(Cell dryweight，CDW)；

2)取30-50mg左右干细胞于酯化管中，加入2mL酯化液(3％体积的浓硫酸溶于甲醇中，含1g/L苯甲酸作为内标)、2mL氯仿，加盖密闭，100℃烘箱中酯化4h；冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡，静置分层；待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相进行气相色谱(GC)分析；

3)根据样品浓度的不同，进样量为0.4～1μL，使用安捷伦公司的微量进样器。采用内标法对PHA进行定量分析，根据峰面积定量。PHA含量定义为PHA对细胞干重的比值，PHA产量＝PHA含量×细胞干重。

菌体内积累PHA的含量及细胞干重结果如表1所示，结果表明，E.coli K-12(pPadhE-CAB)在上述缺氧条件下能够合成PHB，且在37℃培养时PHB的含量可达细胞干重的50％。表1中剩余生物量为细胞干重扣除PHA的量。

表1.菌株E.coli K-12(pPadhE-CAB)缺氧培养积累PHA摇瓶结果

	细胞干重(g/L发酵液)	PHA含量(％)	PHA产量(g/L发酵液)	剩余生物量(g/L发酵液)
					30℃培养	1.29±0.05	45.94±1.51	0.59±0.07	0.69±0.04
37℃培养	0.70±0.07	50.23±1.55	0.35±0.03	0.35±0.05

三、工程菌E.coli ackA^-(pPadhE-CAB)缺氧培养生产PHA摇瓶实验

将E.coli ackA^-(pPadhE-CAB)在LB-Amp液体培养基中培养12h(3℃摇床，200rpm)作为种子液；按体积比1％的接种量(即5×10⁹cfu/L)将种子液接种到LBG-Amp液体培养基中，接种后随即在摇瓶中加入20mL灭菌石蜡隔绝空气，形成缺氧环境；分成两组，分别在30℃或37℃培养箱中静止培养48h。用气相色谱法对发酵产物定性检测，结果表明采用这种方法生产得到的PHA组分为聚β-羟基丁酸酯(PHB)。

按照实施例2中所述方法检测进行菌体中PHA含量，每升发酵液积累PHA的含量及细胞干重检测结果如表2所示。结果表明，E.coli ackA^-(pPadhE-CAB)在上述缺氧条件下能够合成PHB，且在37℃培养时PHB的含量可提高至细胞干重的58％。

表2  菌株E.coli ackA^-(pPadhE-CAB)缺氧培养积累PHA摇瓶结果

	细胞干重(g/L发酵液)	PHA含量(％)	PHA产量(g/L发酵液)	剩余生物量(g/L发酵液)
					30℃培养	1.00±0.02	48.83±2.89	0.49±0.03	0.51±0.04
37℃培养	0.65±0.08	58.61±3.68	0.38±0.07	0.27±0.03

四、工程菌E.coli pta^-(pPadhE-CAB)缺氧培养生产PHA的摇瓶实验

将E.coli pta^-(pPadhE-CAB)在LB-Amp液体培养基中培养12h(3℃摇床，200rpm)作为种子液；按体积比1％的接种量(即5×10⁹cfu/L)将种子液接种到LBG-Amp液体培养基中，接种后随即在摇瓶中加入20mL灭菌石蜡隔绝空气，形成缺氧环境；分成两组，分别在30℃或37℃培养箱中静止培养48h。用气相色谱法对发酵产物定性检测，结果表明采用这种方法生产得到的PHA组分为PHB。

按照实施例2中所述方法检测进行菌体中PHA含量，菌体内积累PHA的含量及细胞干重检测结果如表3所示。结果表明，E.coli pta^-(pPadhE-CAB)在上述缺氧条件下能够合成PHB，且在37℃培养时PHB的含量可进一步提高至细胞干重的65％。

表3  菌株E.coli pta^-(pPadhE-CAB)缺氧培养积累PHA摇瓶实验结果

	细胞干重(g/L发酵液)	PHA含量(％)	PHA产量(g/L发酵液)	剩余生物量(g/L发酵液)
					30℃培养	0.95±0.04	55.34±5.64	0.53±0.04	0.43±0.09
37℃培养	0.57±0.04	65.13±5.48	0.37±0.05	0.20±0.03

实施例2、利用丙酮酸-甲酸裂解酶的启动子和phaCAB基因串联在缺氧条件下生产PHA及其效果验证

利用丙酮酸-甲酸裂解酶启动子(简称P_pflC)和聚-3-羟基丁酸酯(PHB)合成的相关基因(phaCAB)为例子构建缺氧诱导表达聚-3-羟基丁酸酯的重组载体pPpflC-CAB，通过电转化的方式将pPpflC-CAB导入野生大肠杆菌E.coli K-12及其两株乙酸合成途径的缺失突变体E.coli ackA^-和E.coli pta^-得到三株缺氧诱导表达聚-3-羟基丁酸酯(PHB)的工程菌。其中phaCAB来源于质粒pBHR68(按照文献(Spiekermann，P.，et al.，A sensitive，viable-colony staining method using Nile red fordirect screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids andother lipid storage compounds.Arch Microbiol，1999.171(2)：p.73-80)所述方法构建)，丙酮酸-甲酸裂解酶启动子(简称P_pflC)来源于野生大肠杆菌Escherichia coli K-12(ATCC编号：25404)基因组，使用原核表达载体载体pBluescript II SK(-)(NCBI GenBank检索号为X52330)作为载体。

一、缺氧诱导表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的重组工程菌的获得

1、丙酮酸-甲酸裂解酶启动子(简称P_pflC)DNA片段的获得

以大肠杆菌Escherichia coli K-12(ATCC编号：25404)基因组为模板，在标准的聚合酶链式反应条件下，以P1：AAAACTCGAGAAAAGTCCGCGCTCGCTTA(XhoI)和P2：CAGCCATATGCCTGGATCTCCTTCGAC(NdeI)为上下游引物扩增得到567bp的片段，经测序表明，该片段含有丙酮酸-甲酸裂解酶基因的启动子(具有自GENBANK号NC_000913的5′端第4143715-4144281位核苷酸序列)，用限制性内切酶XhoI/NdeI酶切处理后，回收该567bp含有丙酮酸-甲酸裂解酶基因的启动子的片段。

2、缺氧诱导表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的重组表达载体(pPpflC-CAB)的构建

使用限制性内切酶XhoI/NdeI酶切处理质粒pPadhE-CAB(实施例1步骤一中的步骤2制备)，使其中含有的乙醇脱氢酶启动子(P_adhE)切掉。将上述得到的含有丙酮酸-甲酸裂解酶基因的启动子的片段用XhoI/NdeI双酶切后，与去掉乙醇脱氢酶启动子(P_adhE)的pPadhE-CAB连接，使丙酮酸-甲酸裂解酶基因的启动子(P_pflC)与丙酮酸-甲酸裂解酶基因的启动子(P_pflC)替换；测序验证，将验证表明含有丙酮酸-甲酸裂解酶基因的启动子(P_pflC)片段和PHA合成基因phaCAB的质粒命名为pPpflC-CAB。

3、工程菌株E.coli K-12(pPpflC-CAB)、E.coli ackA^-(pPpflC-CAB)和E.colipta^-(pPpflC-CAB)的获得

按照实施例1的步骤一中的步骤3所述方法将质粒pPpflC-CAB分别导入E.coliK-12、E.coli ackA^-和E.coli pta^-中，得到工程菌株E.coli K-12(pPpflC-CAB)、E.coli ackA^-(pPpflC-CAB)和E.coli pta^-(pPpflC-CAB)。

二、工程菌E.coli K-12(pPpflC-CAB)、E.coli ackA^-(pPpflC-CAB)和E.colipta^-(pPpflC-CAB)缺氧培养生产PHA的摇瓶实验

按照实施例1的步骤一中步骤2所述方法对上述三株菌进行厌氧摇瓶发酵实验和产物PHA的气相色谱检测。结果表明，工程菌E.coli K-12(pPpflC-CAB)、E.coliackA^-(pPpflC-CAB)和E.coli pta^-(pPpflC-CAB)采用这种方法生产得到的PHA组分均为PHB。其中E.coli K-12(pPpflC-CAB)可以在菌体中积累44％的PHB，在突变体工程菌E.coli ackA^-(pPpflC-CAB)和E.coli pta^-(pPpflC-CAB)中，菌体内PHB的含量可分别提高至54％和57％。

实施例3、利用甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase简称GLD)的启动子(简称P_gldA)和phaC2基因串联在缺氧条件下生产PHA

下述方法利用甘油脱氢酶启动子(简称P_gldA)和低底物特异性PHA合成基因(phaC2)(GENBANK检索号AY278219的5′端第2873-4555位核苷酸序列)为例子构建缺氧诱导表达聚-3-羟基丁酸酯的重组载体pPgld-phaC2，通过电转化的方式将pPgld-phaC2导入野生大肠杆菌E.coli K-12及罗氏真养菌Ralstonia eutropha合成缺陷型突变株Ralstonia eutropha PHB-4中得到大肠杆菌工程菌E.coii K-12(pPgld-phaC2)或罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgld-phaC2)。其中低底物特异性PHA合成基因(phaC2)来自Pseudomonas stutzeri 1317(Chen JY，Liu T，ZhengZ，et al.Polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1 and PhaC2 from Pseudomonasstutzeri 1317 had different substrate specificities，FEMS MICROBIOLOGYLETTERS 234(2)：231-237 MAY 15 2004)；突变体R.eutropha PHB-4购自德国微生物菌种公司(DSM 541)。

一、缺氧诱导表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的重组工程菌的获得

1、缺氧诱导表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的重组表达载体pPgld-phaC2的构建

1)甘油脱氢酶启动子(简称P_gldA)DNA片段的获得

以大肠杆菌Escherichia coli K-12(ATCC编号：25404)基因组为模板，在标准的聚合酶链式反应条件下，以P1：AAAAATCGATAGGATAAGTAAGCTGCACA(ClaI)和P2：CAGC AAGCTTACCTACTCCAAACTCCCG(HindIII)为上下游引物扩增得到464bp的片段，经测序表明，该片段含有甘油脱氢酶的启动子(具有自GENBANK号为NC_000913的5′端第4135492-4135955位核苷酸序列)。

用限制性内切酶ClaI和HindIII双酶切上述获得的含有甘油脱氢酶的启动子的片段***到含有phaC2的质粒pCJY08(质粒pCJY08来源于广范宿主载体pBBR1MCS-2(NCBI GenBank号为U23751)，按照文献(Chen JY，Song G and Chen GQ.A LowerSpecificity PhaC2 Synthase from Psuedomonas stutzeri Catalyses theProduction of Copolyesters Consisting of Short-Chain-Length andMedium-Chain-Length 3-Hydroxyalkanoates.Antonie van Leewenhoek 89(2006)157-167)所述的方法构建)经过ClaI和HindIII酶切位点之间，并测序检测，将经测序表明含有甘油脱氢酶启动子和phaC2基因的重组质粒命名为pPgldA-phaC2。

2、大肠杆菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)的获得

将质粒pPgld-phaC2用电转化的方式分别导入大肠杆菌E.coli K-12及罗氏真养菌合成缺陷型突变株R.eutropha PHB-4中，将转入pPgld-phaC2的大肠杆菌E.coli K-12命名为大肠杆菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和将转入pPgld-phaC2的罗氏真养菌命名为罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)。

二、大肠杆菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)生产PHA的摇瓶发酵实验

分别对大肠杆菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)进行厌氧摇瓶发酵实验，大肠杆菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)的摇瓶发酵实验同实施例1的步骤一中步骤2所述方法；罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)的厌氧摇瓶发酵是将罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)按照5×10⁹cfu/L的量接入含有20g/L葡萄糖酸钠和8g/L辛酸钠的MM培养基中，在30℃静置培养48h。

发酵培养结束后，分别收集菌体并进行产物PHA的气相色谱检测。结果表明，大肠杆菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)生产得到的PHA组分均为短链共聚PHA或中长链共聚PHA，其中4碳组分约占80％，其余为6碳、8碳、10碳和12碳组分，含量从2％到12％不等。在大肠杆菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)中PHA的总积累量达到38.4％，在罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)中PHA的总积累量达到42.5％。

实施例4、乳酸脱氢酶启动子(简称P_ldhA)与phaPCJ基因串联在缺氧条件下生产PHA及其效果实验

利用乳酸脱氢酶启动子(简称P_ldhA)和来源于嗜水气单胞菌属Aeromonas的PHA合成基因phaPCJ(自GENBANK号为AY093685的5′端第292-2920位核苷酸)构建缺氧诱导表达聚-3-羟基丁酸酯的重组载体pPldh-PCJ，通过结合转化的方式将pPldh-PCJ导入嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)中，并在缺氧条件下合成PHA。

1、重组载体pMCS-Pldh-PCJ的构建

1)乳酸脱氢酶启动子(简称P_ldhA)DNA片段的获得

以大肠杆菌Escherichia coli K-12(ATCC编号：25404)基因组为模板，在标准的聚合酶链式反应条件下，以P1：CAGC AAGCTTCACATGCTGCCGGAAATC(HindIII)和P2：AAAAGAATTCATCTTGCCGCTCCCCTGC(EcoRI)为上下游引物扩增得到311bp的片段，经测序表明，该片段含有甘油脱氢酶的启动子(具有自GENBANK号为NC_000913的5′端第1439568-1439878位核苷酸序列)。

2)生产PHA的重组表达载体的获得

用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切处理上述得到的含有甘油脱氢酶的启动子的片段后，***到载体pBBR1MCS-2(NCBI GenBank号为U23751)的HindIII和EcoRI酶切位点之间，得到重组载体，测序验证，将经测序表明含有甘油脱氢酶的启动子的重组载体命名为pMCS-ldh。

以质粒pQd-APCJ(按照(Qiu YZ，Han J，Guo JJ，Chen GQ.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)from gluconate and glucose byrecombinant Aeromonas hydrophila and Pseudomonas putida.Biotech Lett 27(2005)：1381-1386)所述的方法构建)为模板，在标准的聚合酶链式反应条件下，以P1：AGCT GAATTC ATGAATATGGACGTGATCA(EcoRI)和P2：AAAAGGATCCTTAAGGCAGCTTGACCAC(BamHI)为上下游引物扩增得到2629bp的片段，经测序表明，该片段含有Aeromonas hydrophila 4AK4的PHA合成基因phaPCJ(具有自GENBANK号为AY093685的5′端第292-2920位核苷酸序列)，用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切处理后连接到2)中得到的中间质粒pMCS-ldh的BamHI和EcoRI酶切位点之间，测序验证，将含有乳酸脱氢酶启动子(简称P_ldhA)和来源于嗜水气性单胞菌Aeromonas hydrophila 4AK4的PHA合成基因phaPCJ的重组载体命名为pMCS-Pldh-PCJ。

2、工程菌Aeromonas hydrophila(pMCS-Pldh-PCJ)的获得及摇瓶实验

1)将构建的载体质粒pMCS-Pldh-PCJ用电转化法导入到E.coli S17-1(ATCC编号：47055)中，并将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h，得到菌株E.coli S17-1(pMCS-Pldh-PCJ)；

2)挑取阳性单克隆E.coli S17-1(pMCS-Pldh-PCJ)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Aeromonas hydrophila 4AK4菌株(Shaoping Ouyang，Jing Han，Yuanzheng Qiu，Lingfang Qin，Song Chen，QiongWu，Michael L.Leski，Guoqiang Chen.Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)Production in RecombinantAeromonas hydrophila 4AK4 Harboring phbA，phbB and vgb Genes.MacromolecularSymposia 224(2005)21-34)接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取1mL上述两种菌株的培养液至无菌小管中，8000rpm离心2分钟，弃去上清液，再各加入0.5mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，将两管重悬菌液混合，置于30℃培养箱中1小时，用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；

3)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Km-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h后，提取质粒，并用限制性内切酶BamH I对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为5144bp及2940bp的DNA片断，将正确转化有质粒pMCS-Pldh-PCJ的重组嗜水气性单胞菌命名为Aeromonas hydrophila(pMCS-Pldh-PCJ)。

4)对工程菌Aeromonas hydrophila(pMCS-Pldh-PCJ)行厌氧摇瓶发酵实验，培养基组分为矿物培养基(MM培养基)加8g/L月桂酸，培养方法为30℃静置培养48小时。发酵培养结束后，收集菌体并进行产物PHA的气相色谱检测。结果表明，采用这种方法生产得到的PHA组分为4碳或6碳共聚PHA(简称PHBHHx)，其中4碳组分约占85.3％，6碳组分含量约占14.7％。在嗜水气性单胞菌工程菌Aeromonashydrophila(pMCS-Pldh-PCJ)中PHA的积累量达到35.5％。

实施例5、有氧呼吸调控蛋白的启动子(简称P_arcA)与假单胞菌的中长链PHA合成基因phaC1ZC2串联在缺氧条件下生产PHA

利用有氧呼吸调控蛋白启动子(简称P_arcA)和来源于假单胞菌Pseudomonasputida KT2440的PHA合成基因phaC1ZC2(自GENBANK号为NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸)构建缺氧诱导表达中长链PHA的重组载体pMCS-arcA-phaC，通过结合转化的方式将pMCS-arcA-phaC导入罗氏真养菌R.eutropha合成缺陷型突变株R.eutropha PHB-4(购自德国微生物菌种公司(DSM 541))中得到罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)，并在缺氧条件下合成中长链PHA。

具体获得方法如下所述：

1、重组载体pMCS-arcA-phaC的构建

1)有氧呼吸调控蛋白启动子(简称P_arcA)DNA片段的获得

以大肠杆菌Escherichia coli K-12(ATCC编号：25404)基因组为模板，在标准的聚合酶链式反应条件下，以P1：CAGC AAGCTTATCGGCCTGGGCCAGAGG(HindIII)和P2：AAAAGAATTCCCCCGGCTAGACCGGGGT(EcoRI)为上下游引物扩增得到475bp的片段，经测序表明，该片段含有氧呼吸调控蛋白启动子(简称P_arcA)(具有自GENBANK号为NC_000913的5′端第3348236-3348711位核苷酸序列)。

2)生产PHA的重组表达载体的获得

用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切处理上述获得的含有氧呼吸调控蛋白启动子的片段，回收后，***到pBBR1MCS-2(NCBI GenBank号为U23751)的HindIII和EcoRI酶切位点之间，测序验证，将经测序表明含有氧呼吸调控蛋白启动子片段的重组载体命名为pMCS-acrA。

以Pseudomonas putida KT2440(ATCC编号：47054)的基因组为模板，以P1：AGCT GAATTC ATGACAGACAAACCGGCCA(EcoRI)和P2：AAAAGGATCCTCATCGGGTCAGCACGTA(BamHI)为上下游引物扩增得到1683bp的片段，经测序表明，该片段含有假单胞菌Pseudomonas putida KT2440的PHA合成基因phaC1ZC2(自GENBANK号为NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸)，将该片段用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切处理后连接到中间质粒pMCS-acrA的BamHI和EcoRI酶切位点之间，测序验证，将测序表明含有氧呼吸调控蛋白启动子和来源于假单胞菌属Pseudomonas的中长链PHA合成基因的重组载体命名为pMCS-arcA-phaC。

2、工程菌罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)的获得及摇瓶实验结果

将质粒pMCS-arcA-phaC用电转化的方式导入罗氏真养菌合成缺陷型突变株R.eutropha PHB-4中得到罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)。将罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)接入到含有8g/L月桂酸的MM培养基中在30℃静置培养48小时。发酵培养结束后，收集菌体并进行产物PHA的气相色谱检测。结果表明，罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)生产得到的PHA组分为中长链PHA(简称mcl-PHA)，其中6碳PHA组分约占13.7％，8碳PHA组分约占45.3％，10碳PHA组分约占23.6％，12碳PHA组分约占17.4％。在罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)中PHA的总积累量为38.4％。

实施例6、有氧呼吸调控蛋白的启动子(简称P_arcA)与巨大产碱杆菌的PHB合成基因phaCAB串联在缺氧条件下生产PHA

将有氧呼吸调控蛋白的启动子与来自巨大产碱杆菌Alcaligenes latus DSM1124(购自德国微生物菌种公司)的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK号为U47026的5′端第533-4336位核苷酸)串联在广泛宿主载体pBBR1MCS-2(NCBI GenBank号为U23751)上，构成载体pMCS-arcA-CAB。将载体pMCS-arcA-CAB分别导入巨大产碱杆菌A.latus和罗氏真养菌合成缺陷型突变株R.eutropha PHB-4中得到巨大产碱杆菌工程菌A.latus(pMCS-arcA-CAB)或罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)。

具体获得方法如下所述：

1、重组载体pMCS-arcA-CAB的构建

以巨大产碱杆菌Alcaligenes latus DSM 1124(购自德国微生物菌种公司)的基因组为模板，以P1：AGCT GAATTC GTGACCCTGCAAGCCATT(EcoRI)和P2：AAAAGGATCC TCAGCCCATGTGCAGGCC(BamHI)为上下游引物扩增得到3804bp的片段，经测序表明，该片段含有巨大产碱杆菌Alcaligenes latus的PHB合成基因(自GENBANK号为U47026的5′端第533-4336位核苷酸)，用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切处理后连接到实施例5中得到的含有有氧呼吸调控蛋白启动子的中间质粒pMCS-acrA BamHI和EcoRI酶切位点之间，测序验证，将经测序表明含有氧呼吸调控蛋白启动子和来源于巨大产碱杆菌Alcaligenes latus的PHB合成基因phaCAB的重组载体pMCS-arcA-CAB。

2、工程菌巨大产碱杆菌Alcaligenes latus(pMCS-arcA-CAB)和罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)的获得及摇瓶实验结果

通过电转化的方式将载体pMCS-arcA-CAB分别导入巨大产碱杆菌A.latus DSM1124(购自德国微生物菌种公司)(缺氧下不能合成PHA)和罗氏真养菌合成缺陷型突变株R.eutropha PHB-4(购自德国微生物菌种公司(DSM 541))中，将转入pMCS-arcA-CAB的巨大产碱杆菌A.latus命名为巨大产碱杆菌工程菌A.latus(pMCS-arcA-CAB)，将转入pMCS-arcA-CAB的罗氏真养菌命名为罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)。将巨大产碱杆菌工程菌A.latus(pMCS-arcA-CAB)或罗氏真养菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)分别按照5×10⁹cfu/L的量接种于含有8g/L月桂酸的MM培养基中在30℃静置培养48小时。发酵培养结束后，收集菌体并进行产物PHA的气相色谱检测。结果表明，采用这种方法在两株工程菌中得到的PHA组分均为PHB。在巨大产碱杆菌A.latus(pMCS-arcA-CAB)中PHB的积累量可以达到菌体干重的63.8％；在罗氏真养菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)中PHB的积累量可以达到菌体干重的54.2％。

Claims (7)

1.一种缺氧诱导表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌，是将含有缺氧诱导启动子和串联于所述缺氧诱导启动子下游的聚羟基脂肪酸酯合成基因的重组表达载体转入到宿主菌后得到的重组菌；所述缺氧诱导启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为NC_000913的5′端第1294197-1294669位核苷酸、自GENBANK号为NC_000913的5′端第4143715-4144281位核苷酸、自GENBANK号为NC_000913的5′端第1439568-1439878位核苷酸、自GENBANK号为NC_000913的5′端第4135492-4135955位核苷酸或自GENBANK号为NC_000913的5′端第3348236-3348711位核苷酸；

所述缺氧为无氧或微氧；所述微氧的溶解氧DO＜0.5mg/L；

所述宿主菌为大肠杆菌、巨大产碱杆菌、罗氏真养菌、假单胞菌或嗜水性气单孢菌。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述聚羟基脂肪酸酯合成基因的核苷酸序列为自GENBANK号为AM260479的5′端第1557353-1561203位的核苷酸、自GENBANK号为U47026的5′端第533-4336位核苷酸、自GENBANK号为AY278219的5′端第1-4746位的核苷酸、GENBANK号为NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸或自GENBANK号为AY093685的5′端第292-2920位的核苷酸。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：当所述宿主菌为大肠杆菌、罗氏真养菌时，所述重组表达载体的出发载体为pBluescript II SK(-)或pBBR1MCS-2；当所述宿主菌为巨大产碱杆菌、假单胞菌或嗜水性气单孢菌时，所述重组表达载体的出发载体为pBBR1MCS-2。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌K-12、E.coli ackA^-或E.coli pta^-。

5.一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，是将权利要求1-4任一项所述的工程菌，在缺氧条件下，发酵得到聚羟基脂肪酸酯；

所述缺氧条件为无氧或微氧；所述微氧的溶解氧DO＜0.5mg/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：当所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌时，所述发酵温度为28-38℃；当所述工程菌的宿主菌为巨大产碱杆菌、罗氏真养菌、假单胞菌或嗜水性气单孢菌时，所述发酵温度为30-35℃。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：当所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌时，所述发酵温度为37℃。