TWI582083B - 胺基吡啶基氧基吡唑化合物 - Google Patents

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Description

胺基吡啶基氧基吡唑化合物
本發明係關於抑制轉型生長因子β受體1(TGFβR1)之活性的新穎胺基吡啶基氧基吡唑化合物，包含該等化合物之醫藥組合物，及使用該等化合物治療癌症(較佳結腸癌、黑色素瘤、肝細胞癌(HCC)、腎癌、神經膠母細胞瘤(GBM)、胰臟癌、骨髓發育不良症候群(MDS)、肺癌及胃癌)及/或纖維化(較佳肝纖維化及慢性腎病)之方法。
轉型生長因子β(TGF-β或TGFβ)為多功能細胞介素，其結合至TGF-β I型及II型絲胺酸/蘇胺酸激酶受體之雜聚複合物，且活化TGF-β受體複合物，該TGF-β受體複合物磷酸化且活化SMAD2及SMAD3，接著該SMAD2及SMAD3與SMAD4締合，且遷移至細胞核中，且調節不同靶基因的表現。TGF-β受體信號轉導路徑之關鍵成員包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβR1、TGFβR2、SMAD、SnoN、SARA、SKI、DAB、TRAP、TAK1、SMIF、E2F4、E2F5、RBL1、RBL2、RB1、TFDP1、TFDP2、SMURF1、SMURF2、P300、CBP及JUN。SMAD介導之TGF-β受體路徑調節各種細胞及生理過程，諸如增殖、分化、生長、遷移、髓鞘形成、細胞週期停滯、細胞凋亡及發育。
TGFβR1之小分子抑制劑在治療癌症及/或纖維化的技術中是已知的。參看例如WO2012/002680、WO2009/022171、WO2004/048382及WO2002/094833。不幸地，針對諸多類型之癌症或纖維化的治癒性療 法尚不存在。應需要具有其他用於治療癌症、較佳結腸癌、黑色素瘤、肝細胞癌(HCC)、腎癌、神經膠母細胞瘤(GBM)、胰臟癌、骨髓發育不良症候群(MDS)、肺癌及胃癌及/或纖維化、較佳肝纖維化及慢性腎病的TGFβR1之小分子抑制劑，尤其為用於TGFβR1之較有選擇性的化合物。
本發明提供一種下式化合物：
其中：R1為氫、異丙基、二氟甲基、二氟乙基或環丙基；R2為乙基、第三丁基、吡啶-2-基、四氫哌喃-4-基、四氫呋喃-3-基、環丙基或環丁基；且R3為胺甲醯基苯基、吡啶-2-基、(1-羥基-1-甲基乙基)吡啶基、1-甲基-2-側氧基-1H-吡啶-4-基、1-甲基吡唑基、吡嗪-2-基、2-甲氧基嘧啶-4-基、1-甲基-2-側氧基-1H-嘧啶-4-基、噠嗪-3-基、6-氯噠嗪-3-基、6-甲基噠嗪-3-基或6-甲氧基噠嗪-3-基；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇-4-甲基苯磺酸鹽。
本發明亦提供結晶2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇4-甲基苯磺酸 鹽本發明進一步提供結晶2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇4-甲基苯磺酸鹽，其特徵為X射線粉末繞射圖(Cu輻射，λ-1.54060Ǻ)，其包含在17.8°處之峰與一或多個選自由19.7°、18.4°及22.0°(2θ±0.2°)組成之群的峰。
本發明亦提供一種治療需要該治療之患者的癌症、較佳結腸癌、黑色素瘤、肝細胞癌(HCC)、腎癌、神經膠母細胞瘤(GBM)、胰臟癌、骨髓發育不良症候群(MDS)、肺癌及胃癌之方法，其包含投與該患者有效量之本發明之化合物或鹽。
本發明亦提供一種治療需要該治療之患者的纖維化、較佳肝纖維化及慢性腎病的方法，其包含投與該患者有效量之本發明之化合物或鹽。
本發明亦提供包含本發明之化合物或鹽及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑的醫藥組合物。
本發明亦提供用於療法的本發明之化合物或鹽。此外，本發明提供用於治療癌症、較佳結腸癌、黑色素瘤、肝細胞癌(HCC)、腎癌、神經膠母細胞瘤(GBM)、胰臟癌、骨髓發育不良症候群(MDS)、肺癌及胃癌及/或纖維化、較佳肝纖維化及慢性腎病的本發明之化合物或鹽。此外，本發明提供本發明之化合物或鹽的用途，其用於製造供治療癌症、較佳結腸癌、黑色素瘤、肝細胞癌(HCC)、腎癌、神經膠母細胞瘤(GBM)、胰臟癌、骨髓發育不良症候群(MDS)、肺癌及胃癌及/或纖維化、較佳肝纖維化及慢性腎病用之藥劑。
以下段落描述本發明之較佳種類：a)R1為二氟甲基、二氟乙基或環丙基；b)R2為吡啶-2-基、四氫哌喃-4-基或環丙基；c)R3為胺甲醯基苯基或(1-羥基-1-甲基乙基)吡啶基； d)R1為環丙基，且R2為四氫哌喃-4-基；e)R1為環丙基，且R2為環丙基；f)R1為二氟乙基，且R2為四氫哌喃-4-基；g)R1為二氟甲基，且R2為吡啶-2-基；h)R1為環丙基，R2為四氫哌喃-4-基，且R3為(1-羥基-1-甲基乙基)吡啶基；i)R1為環丙基，R2為環丙基，且R3為(1-羥基-1-甲基乙基)吡啶基；j)R1為二氟乙基，R2為四氫哌喃-4-基，且R3為(1-羥基-1-甲基乙基)吡啶基；且k)R1為二氟甲基，R2為吡啶-2-基，且R3為胺甲醯基苯基。
習此相關技藝之讀者應理解，本發明之化合物之游離鹼形式能夠形成鹽，且該等鹽預期成為本發明之部分。本發明之游離鹼化合物為胺，且因此與多種無機及有機酸中之任一者反應以形成醫藥學上可接受之酸加成鹽。該等醫藥學上可接受之酸加成鹽及製備其之常見方法在此項技術中為人所熟知。參看例如P.Stahl,等人,HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2008)；S.M.Berge,等人,「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences,第66卷,第1期,1977年1月。熟練的技術者應瞭解，可輕易地測定鹽化學計量。參看例如D.Risley,等人,Simultaneous Determination of Positive and Negative Counterions Using a Hydrophilic Interaction Chromatography Method,LCGC NORTH AMERICA,第24卷,第8期,2006年8月第776-785頁。
本發明之某些化合物為結晶。在結晶學技術中熟知，對於任何既定晶形，由於由諸如晶體形態及習性之因素所引起之較佳取向，繞射峰之相對強度可改變。在存在較佳取向之作用的情況下，峰強度改 變，但多晶型物之特徵峰位置不變。參見例如美國藥典(The United States Pharmacopeia)第23版,國民處方集(National Formulary)第18版,第1843-1844頁,1995。此外，在結晶學技術中亦熟知，對於任何既定晶形，角峰位置可略微改變。舉例而言，峰位置可由於分析樣品時之溫度或濕度變化、樣品移位或存在或不存在內標而偏移。在本發明之情況下，2θ±0.2之峰位置變化性將考慮此等潛在變化而不妨礙明確鑑別所指示之晶形。晶形之確認可基於有區別之峰，通常為較突出之峰(以° 2θ為單位)的任何獨特組合來進行。基於NIST 675標準峰，在8.853及26.774度2-θ處，調整在環境溫度及相對濕度下收集的晶形繞射圖。
本發明之化合物可根據以下合成流程利用此項技術中已熟知且已瞭解之方法製備。用於此等流程之步驟的適合反應條件在此項技術中為熟知的，且溶劑及共試劑之適當取代物在此項技術之技能內。熟習此項技術者同樣應瞭解，可按需要或期望利用各種熟知技術來分離及/或純化合成中間體，且時常將可能在伴隨少量或無純化的後續合成步驟中直接使用各種中間體。此外，熟練的技術者應瞭解，在某些情況下，引入部分的次序不重要。製備本發明之化合物所要求的步驟之特定次序如熟練的化學工作者所很好瞭解，視所合成之特定化合物、起始化合物及經取代之部分的相對傾向而定。除非另外指明，否則所有取代基均如先前所定義，且所有試劑在此項技術中已熟知且已瞭解。
本發明之某些中間體或化合物可具有一或多個對掌性中心。本發明涵蓋所有個別對映異構體或非對映異構體以及包括外消旋體之該等化合物之對映異構體及非對映異構體的混合物。本發明之化合物較佳含有至少一個以單一對映異構體或非對映異構體形式存在的對掌性中心。單一對映異構體或非對映異構體可用對掌性試劑開始或利用立 體選擇性或立體特異性合成技術製備。或者，單一對映異構體或非對映異構體可利用標準對掌性層析或結晶技術自混合物分離。熟練的技術者應瞭解，在某些情況下，由於不同層析柱及移動相，對映異構體或非對映異構體之溶離次序可為不同的。
在化合物名稱中「異構體1」之命名表示當一對對映異構體之混合物利用對掌性層析法分離時，本發明之對應中間體或化合物為兩個溶離對映異構體中之第一個。在化合物名稱中「異構體2」之命名表示當一對對映異構體之混合物利用對掌性層析法分離時，本發明之對應中間體或化合物為兩個溶離對映異構體中之第二個。
本發明之化合物可如以下流程中所說明來合成，其中R1、R2及R3如先前所定義。
流程1說明式I化合物之一般合成。使化合物1與2-氯吡啶-4-醇於適合之溶劑(諸如，二甲基甲醯胺(DMF)或丙酮)中在適合之鹼(諸如，碳酸銫或碳酸鉀)存在下在室溫或高溫下反應，得到化合物2。使化合物2與1,1-二甲氧基-N,N-二甲基-甲胺在高溫下反應，形成化合物3。化合物3可經純化或未經進一步純化即用於與肼於乙酸中反應，得到化合物4。化合物4可與適合之烷化試劑(諸如烷基三氟硼酸鉀或烷基 酸)在陳-林偶合(Chan-Lam coupling)條件下反應，形成化合物5。更特定言之，首先將2,2'-聯吡啶及乙酸銅(II)於適合之溶劑(諸如，1,2-二氯乙烷)中之懸浮液加熱至高溫，且用氮氣淨化，且接著過濾反應混合物，且將該濾液添加至化合物4、適合之酸鹽(諸如，烷基三氟硼酸鉀或烷基酸)及適合之鹼(諸如，碳酸鈉)於適合之溶劑(諸如，1,2-二氯乙烷)中之混合物中。將反應混合物加熱至高溫，得到化合物5。化合物4亦可與適合之烷基鹵化物(諸如，烷基碘化物、烷基溴化物或烷基氯化物)在適合之鹼(諸如，氫化鈉)存在下於適當溶劑(諸如，DMF或四氫呋喃(THF))中反應，得到化合物5。使化合物5與適合之胺在熟知的布赫瓦爾德偶合(Buchwald coupling)條件下反應，得到式I化合物。更特定言之，使化合物5與適合之胺在高溫下在適合之鹼(諸如，碳酸銫)、適合之配位試劑(諸如，4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃)及適合之催化劑(諸如，乙酸鈀(II))存在下於適當溶劑(諸如，1,4-二噁烷)中反應，得到式I化合物。
流程2說明當R1為H時，式I化合物之一般合成。如所說明，在流程1之步驟4中，當烷化試劑為2-(三甲基矽烷基)乙氧基甲基氯時，化合物6可藉由經由步驟4之烷化及經由步驟5之布赫瓦爾德偶合反應來獲得。化合物6可與三乙基矽烷於三氟乙酸中反應，得到R1為H的式I化合物。當R1為H時，熟練的技術者已知，式I化合物可以一對互變異構體形式存在，其中氫可在吡唑基環上之兩個氮之間遷移。
流程3說明當R3為(胺甲醯基)苯基時，式I化合物之一般合成。當R3為經適當取代之苯甲腈時，化合物7可利用流程1之步驟5中說明的方法製得。當R3為(胺甲醯基)苯基時，使化合物7與過氧化氫及適合之鹼(諸如，碳酸鉀)於二甲亞碸(DMSO)中反應，得到式I化合物。
如本文所用，以下術語具有以下指示意義：「ACN」係指乙腈；「BSA」係指牛血清白蛋白；「DCM」係指二氯甲烷；「DMF」表示N,N-二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「EGTA」係指乙二醇四乙酸；「ELISA」係指酶聯結免疫吸附劑分析法；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「EtOH」係指乙醇；「FBS」係指胎牛血清；「HEC」係指羥乙纖維素；「HPLC」係指高效液相層析法；「IVTI」係指活體內靶向抑制；「MS」係指質譜分析；「MeOH」係指甲醇；「NMR」係指核磁共振；「THF」係指四氫呋喃；「TBS」係指tris緩衝鹽水；「TED」係指臨限有效劑量；「UVW」係指紫外線波長，且「XRD」係指X射線繞射。
除非相反地指出，否則本文中所說明之化合物使用ACDLABS或Accelrys Draw 4.1命名及編號。
製備1
2-(4-溴-2-吡啶基)丙-2-醇
將三公升、三頸圓底燒瓶用加料漏斗、回流冷凝器、氮氣入口及溫度探針裝備。饋入溴化甲基鎂(3.2M於2-甲基四氫呋喃中，239.07mL，765.01mmol)，且在冰浴中冷卻。向該加料漏斗添加4-溴吡啶-2-甲酸乙酯(80.0g，347.73mmol)於THF(800.0mL)中之溶液。在保持內部溫度低於25℃的同時，將該溶液逐滴添加至溴化甲基鎂溶液中。移除冷卻浴，且允許在25℃下攪拌30分鐘。將反應混合物冷卻至5℃，且在保持內部溫度低於30℃的同時，在逐滴添加鹽酸水溶液(1M)下謹慎地淬滅。再添加鹽酸水溶液(1M)直至該混合物之pH達到約7。移除冷卻浴，且用乙酸乙酯(EtOAc；200mL)稀釋。分離有機層，經無水硫酸鈉乾燥，經由CELITE®短柱過濾，且用EtOAc沖洗。濃縮濾液，得到橙色油狀物。藉由使用矽膠短柱用己烷/EtOAc(3/1)溶離來純化，得到呈無色油狀物之標題化合物(63.15g；84.0%產率)。MS(m/z)：216/218(M+1/M+3)。
基本上利用製備1之方法製備以下化合物。
製備3
2-(4-胺基-2-吡啶基)丙-2-醇
將銅(粉末網目，12.6g，198.6mmol)、2-(4-溴-2-吡啶基)丙-2-醇(63.1g，292.0mmol)及氫氧化銨(28重量/重量%於水中，757.2mL)饋 入具有攪拌棒之兩公升Parr反應器中。在大氣下攪拌反應混合物30分鐘直至其變為深藍色。移除攪拌棒，連接機械攪拌頂部，密封且置放在攪拌器上。將混合物加熱至100℃(內部，在120℃下之加熱浴)，且攪拌隔夜。將反應混合物冷卻至室溫，且添加2-甲基四氫呋喃(600mL)。經由CELITE®短柱過濾，且用2-甲基四氫呋喃沖洗。分離有機層，且用2-甲基四氫呋喃(200mL)萃取水層。合併有機層，且經無水硫酸鈉乾燥。在真空下過濾、濃縮且乾燥隔夜，得到呈黃色油狀物之標題化合物(31.3g；70.4%產率)。MS(m/z)：153(M+1)。
基本上利用製備3之方法製備以下化合物。
製備5
2-溴-1-四氫哌喃-4-基-乙酮
方法1：
將乙二醯氯(28.69mL，330.73mmol)逐滴添加至四氫哌喃-4-甲酸(39.13g，300.67mmol)於DCM(250mL)及DMF(15滴)中之混合物中。在室溫下在氮氣下攪拌混合物2.5小時。在減壓下濃縮且將殘餘物溶解於DCM(250mL)中。將所得溶液在-10℃下逐滴添加至(三甲基矽烷基)重氮甲烷(2M於己烷中，450mL，900.00mmol)，且在室溫下攪拌混合物隔夜。將混合物冷卻至0℃，且逐滴添加氫溴酸(48重量/重量%於水中，52mL，462.73mmol)。在室溫下攪拌混合物兩小時。將混合物冷卻至0℃，且逐滴添加氫溴酸(48重量/重量%於水中， 26mL，231.36mmol)。在室溫下攪拌混合物兩小時。添加水(250mL)、DCM(250mL)，且分離有機層。用DCM(2×250mL)萃取水層。合併有機層，且用碳酸氫鈉飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經無水硫酸鈉乾燥，且在減壓下濃縮，得到呈褐色固體狀之標題化合物(58.2g；93.48%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 4.00(m,2H),3.95(s,2H),3.45(m,2H),2.98(m,1H),1.78(m,4H)。
方法2：
將1-四氫哌喃-4-基乙酮(10g，78.02mmol)於甲醇(MeOH；50mL)中之溶液冷卻至-10℃。逐滴添加溴(4.01mL，78.02mmol)。在0℃下攪拌混合物45分鐘，且接著在10℃下攪拌45分鐘。添加硫酸(11M，27.5mL，302.50mmol)之水溶液，且在室溫下攪拌所得混合物隔夜。添加水，且用***萃取三次。合併有機層。用碳酸氫鈉及水之水溶液洗滌。經無水硫酸鈉乾燥，且在減壓下濃縮，得到呈白色固體狀之標題化合物(12g；74.28%產率)。1H NMR(400.13MHz,CDCl3)δ 4.00(m,2H),3.95(s,2H),3.45(m,2H),2.98(m,1H),1.78(m,4H)。
製備6
2-[(2-氯-4-吡啶基)氧基]-1-四氫哌喃-4-基-乙酮
方法1：
將2-溴-1-四氫哌喃-4-基-乙酮(24.35g，117.60mmol)於DMF(50mL)中之溶液在室溫下逐滴添加至攪拌中的2-氯吡啶-4-醇(13.85g，106.91mmol)及碳酸銫(69.67g，213.82mmol)於DMF(380mL)中之混合物中。在90℃下攪拌所得混合物2.5小時。冷卻至室溫，得到粗混 合物。與另外2.85g(2-氯吡啶-4-醇)之粗混合物合併，如上所指示進行規模反應。用水(200mL)及EtOAc(300mL)稀釋該經合併之混合物。分離有機層，且用EtOAc(3×250mL)萃取水層。合併有機層，且用水(100mL)及飽和氯化鈉水溶液(100mL)洗滌。經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，得到呈棕色油狀物之標題化合物(29.32g；88.96%產率)。MS(m/z)：256(M+1)。
方法2：
將2-溴-1-四氫哌喃-4-基-乙酮(10.03g，48.42mmol)及碳酸鉀(10.14g，72.62mmol)添加至2-氯吡啶-4-醇(6.40g，48.42mmol)於丙酮(150mL)中之溶液中，且在室溫下攪拌所得混合物隔夜。過濾以移除固體，且用DCM洗滌該固體。在減壓下濃縮濾液，定量地得到標題化合物。MS(m/z)：256(M+1)。
基本上利用製備6之方法2製備以下化合物。
製備13
2-氯-4-[(3-四氫哌喃-4-基-1H-吡唑-4-基)氧基]吡啶
在100℃下攪拌2-[(2-氯-4-吡啶基)氧基]-1-四氫哌喃-4-基-乙酮(29.3g，114.59mmol)及1,1-二甲氧基-N,N-二甲基-甲胺(65mL，486.83mmol)之混合物兩小時。冷卻至室溫，在減壓下濃縮，且溶解殘餘物於EtOAc(400mL)中。用水(100mL)及氯化鈉飽和水溶液(100mL)洗滌。經無水硫酸鈉乾燥，且在減壓下濃縮，得到棕色固體。溶解於乙酸(350mL)中，且冷卻至0℃。添加單水合肼(16.8mL，345.66mmol)，且在室溫下在氮氣下攪拌隔夜。將混合物傾倒至冰/水混合物(250mL)中，且用EtOAc(4×200mL)萃取。合併有機層，且用水(200mL)、碳酸氫鈉飽和水溶液(100mL)及氯化鈉飽和水溶液(100mL)洗滌。經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，得到棕色油狀 物。藉由使用矽膠短柱用EtOAc溶離來純化該棕色油狀物。合併適當溶離份，且在減壓下濃縮。在真空下乾燥，得到呈黃色固體狀之標題化合物(24.43g；76.22%產率)。MS(m/z)：280(M+1)。
基本上利用製備13之方法製備以下化合物。
製備20
2-氯-4-(1-環丙基-3-四氫哌喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶
方法1：
將2,2'-聯吡啶(13.73g，87.90mmol)及乙酸銅(II)(15.97g，87.90mmol)於1,2-二氯乙烷(244.3mL)中之混合物在75℃下回流25分鐘，且接著冷卻至室溫。添加2-氯-4-[(3-四氫哌喃-4-基-1H-吡唑-4-基)氧基]吡啶(24.43g，79.91mmol)於1,2-二氯乙烷(335.30mL)中之溶液，接著添加環丙基酸(13.73g，159.82mmol)及碳酸鈉(16.94g，159.82mmol)。在75℃下在氧氣氛圍下加熱反應混合物兩小時，且冷卻至室溫。用EtOAc(200mL)稀釋，經由矽膠短柱過濾，且用EtOAc(250mL)沖洗。用水(200mL)及氯化鈉飽和水溶液(200mL)洗滌濾液。經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，且在真空下在室溫下乾燥殘餘物隔夜。藉由矽膠管柱層析法用6-27% EtOAc/DCM來純化，得到呈黃色固體狀之標題化合物(20.75g；81.2%產率)。MS(m/z)：320(M+1)。
方法2：
將2,2'-聯吡啶(28.8g，56.5mmol)及乙酸銅(II)(8.2g，45.2mmol)於1,2-二氯乙烷(50mL)中之懸浮液加熱至70℃，且用氮氣淨化3分鐘。過濾，且將濾液添加至2-氯-4-[(3-四氫哌喃-4-基-1H-吡唑-4-基)氧基]吡啶(8g，22.6mmol)、環丙基(三氟)硼酸鉀(6.7g，45.2mmol)及碳酸鈉(4.8g，45.2mmol)於1,2-二氯乙烷(50mL)中之混合物中。在70℃下將反應混合物加熱四天。冷卻至室溫。過濾，且用DCM沖洗。用氯化銨飽和水溶液及碳酸氫鈉飽和水溶液洗滌濾液。 經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析法用1-10% MeOH/DCM來純化，得到標題化合物(6.0g；82.2%產率)。MS(m/z)：320(M+1)。
基本上利用製備20之方法1製備以下化合物。指示在處理程序中的更改。
基本上利用製備20之方法2製備以下化合物。
製備27
2-氯-4-(1-環丙基-3-四氫呋喃-3-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶，異構體1
用對掌性層析法純化2-氯-4-(1-環丙基-3-四氫呋喃-3-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶(製備25)之外消旋混合物，得到作為標題化合物之第一溶離對映異構體。MS(m/z)：306(M+1)。
純化條件：CHIRALPAK® IC；移動相：20%乙醇(EtOH)/二氧化碳；流動速率：300g/min；UVW：240nm；滯留時間：2.44分鐘。
製備28
2-氯-4-(1-環丙基-3-四氫呋喃-3-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶，異構體2
用對掌性層析法純化2-氯-4-(1-環丙基-3-四氫呋喃-3-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶(製備25)之外消旋混合物，得到作為標題化合物之第二溶離對映異構體。MS(m/z)：306(M+1)。
純化條件：CHIRALPAK® IC；移動相：20% EtOH/二氧化碳；流動速率：300公克/分鐘；UVW：240nm；滯留時間：2.93分鐘。
製備29
2-氯-4-[1-(二氟甲基)-3-(2-吡啶基)吡唑-4-基]氧基-吡啶
在冰浴中冷卻2-氯-4-[[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]氧基]吡啶(2.0g，7.33mmol)於DMF(73.34mL)中之溶液，且逐份添加氫化鈉(60%於礦物油中，880.02mg，22.00mmol)。在0℃下攪拌混合物10分鐘，允許其升溫至室溫，且攪拌10分鐘。添加二氟碘基甲烷(10重量%於THF中，27.19mL，36.67mmol)，且在45℃下攪拌反應混合物隔夜。冷卻至室溫，且用EtOAc稀釋。首先用5%氯化鋰水溶液洗滌，且接著用氯化鈉飽和水溶液洗滌。經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析法用0-50% EtOAc/DCM來純化殘餘物。合併適當溶離份，且在減壓下濃縮。藉由矽膠管柱層析法用0-10% EtOAc/DCM來純化殘餘物，得到標題化合物(1.56g；65.9%產率)。MS(m/z)：323(M+1)。
基本上利用製備29之方法製備以下化合物。指示在溶劑、鹼及/或反應溫度中的更改。
製備41
2-氯-4-{[3-(吡啶-2-基)-1-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡唑-4-基]氧基]吡啶
將氫化鈉(60%懸浮液於礦物油中，484mg，12.10mmol)在0℃下添加至2-氯-4-[[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]氧基]吡啶(3.0g，11.00mmol)於THF(110mL)中之溶液中。在0℃下攪拌15分鐘，且添加2-(三甲基矽烷基)乙氧基甲基氯(2.02g，12.10mmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。濃縮混合物。在DCM與水之間分配殘餘物。分離有機層，且經硫酸鈉乾燥。過濾混合物，且在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析法用0-30% EtOAc/己烷來純化殘餘物，得到標題化合物(3.64g；82.1%產率)。MS(m/z)：403(M+1)。
製備42
4-[[4-(1-環丙基-3-四氫哌喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-2-吡啶基]胺基]苯甲 腈
用氮氣淨化2-氯-4-(1-環丙基-3-四氫哌喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶(400mg，1.2mmol)、對胺基苯甲腈(219.9mg，1.9mmol)、碳酸銫(568.5mg，1.7mmol)、4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃(134.6mg，0.23mmol)於1,4-二噁烷(15mL)中之溶液5分鐘。用乙酸鈀(II)(26.1mg，0.12mmol)處理所得混合物，且用氮氣淨化5分鐘。封閉瓶，且在100℃下攪拌兩小時，接著在80℃下攪拌過週末。冷卻至室溫，經由CELITE®短柱過濾，且用5% MeOH/DCM洗滌。濃縮濾液，得到標題化合物(467mg；100%產率)。MS(m/z)：402(M+1)。
基本上利用製備42之方法製備以下化合物。指示在催化劑及/或溶劑中的更改。
實例1
2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶- 2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇
方法1：
用氮氣淨化2-氯-4-(1-環丙基-3-四氫哌喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-吡啶(45.6g，142.6mmol)、2-(4-胺基-2-吡啶基)丙-2-醇(26.0g，171.1mmol)及苯酚鈉(26.5g，228.2mmol)於1,4-二噁烷(456mL)中之溶液20分鐘。用4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃(8.25g，14.3mmol)及雙(二亞苄基丙酮)鈀(4.10g，7.13mmol)處理所得混合物。回流21小時。將反應物冷卻至室溫，且攪拌隔夜。經由CELITE®短柱過濾，且用DCM(500mL)洗滌。將濾液濃縮至矽膠上。藉由矽膠管柱層析法用0-10% MeOH/EtOAc來純化。濃縮適當溶離份，且在真空下乾燥隔夜，得到標題化合物(58.7g；91.7%產率)。MS(m/z)：436(M+1)。使用以上方法製備若干批次之產物。將經合併之批次的標題化合物(92.4g)溶解於EtOH(1L)中。用QUADRASIL® MP(100g，1.0-1.5mmol/g)處理溶液，且在60℃下攪動一小時。冷卻至室溫，且過濾以移除固體。濃縮以移除溶劑。在100℃下加熱的同時，將殘餘物溶解於EtOH(500mL)中。接著將混合物緩慢冷卻至室溫，且緩慢添加水(500mL)。在攪拌的同時，將該混合物冷卻至5℃。藉由過濾收集固體，且在真空下在45℃下乾燥隔夜，得到標題化合物(81.8g)。MS(m/z)：436(M+1)。
方法2：
在瓶中，將2-氯-4-(1-環丙基-3-四氫哌喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-吡 啶(400mg，1.2mmol)溶解於1,4-二噁烷(15mL)中。添加2-(4-胺基-2-吡啶基)丙-2-醇(266.5mg，1.6mmol)、碳酸銫(568.5mg，1.7mmol)、4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃(134.6mg，0.23mmol)，且用氮氣淨化5分鐘。添加乙酸鈀(II)(26.1mg，0.12mmol)，且用氮氣淨化5分鐘。密封該瓶，且在100℃下攪拌隔夜。將反應物冷卻至室溫，經由CELITE®短柱過濾，且用5% MeOH/DCM洗滌。濃縮，且藉由逆相層析法(Redisep Rf Gold高效能C18逆相管柱，0-100%甲酸/乙腈(ACN)/甲酸/水)純化。濃縮適當溶離份，且在真空下乾燥，得到標題化合物(341mg；67.3%產率)。MS(m/z)：436(M+1)。
基本上利用實例1之方法2製備以下化合物。鹼、催化劑、配位及/或溶劑的更改如示。
實例62
4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]苯甲醯胺
將碳酸鉀(80.4mg，0.58mmol)添加至4-[[4-(1-環丙基-3-四氫哌喃-4-基-吡唑-4-基)氧基-2-吡啶基]胺基]苯甲腈(467mg，1.16mmol)於DMSO(5mL)中之溶液中。添加30%過氧化氫(1.77mL，17.45mmol)，且在環境溫度下攪拌反應混合物隔夜。用水稀釋，且用DCM萃取四次。合併有機層，且用氯化鈉飽和水溶液洗滌。經無水硫酸鈉乾燥。過濾混合物，且在減壓下濃縮濾液。藉由逆相層析法(Redisep Rf Gold高效能C18逆相管柱，0-100%甲酸/丙烯腈/甲酸/水)純化殘餘物，得到標題化合物(220mg；45.9%產率)。MS(m/z)：420(M+1)。
基本上利用實例62之方法製備以下化合物。
實例70
2-{4-[(4-{[3-環丙基-1-(丙-2-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇
在密封瓶中用氮氣淨化4-[[4-(3-環丙基-1-異丙基-吡唑-4-基)氧基-2-吡啶基]胺基]吡啶-2-甲酸甲酯(298mg，0.76mmol)於THF(6mL)中之溶液。逐滴添加溴化甲基鎂(3M於***中，1.01mL，3.03mmol)，且在室溫下攪拌混合物兩小時。在減壓下濃縮混合物，且用DCM及碳酸氫鈉飽和水溶液稀釋殘餘物。分離有機層，且用DCM萃取水層。合併有機層，且用氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析法用5-10% MeOH/DCM純化，得到標題化合物(160mg；53.69%產率)。MS(m/z)：394(M+1)。
實例71
2-{5-[(4-{[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇
在冰浴中將2-[5-[[4-[3-(2-吡啶基)-1-(2-三甲基矽烷基乙氧基-甲 基)吡唑-4-基]氧基-2-吡啶基]胺基]-2-吡啶基]丙-2-醇(500mg，0.96mmol)於三氟乙酸(3mL)中之溶液冷卻至0℃。添加三乙基矽烷(1mL，6.24mmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。濃縮，且藉由逆相層析法(Redisep Rf Gold高效能C18逆相管柱，0-100% 10mM碳酸氫銨/ACN)純化殘餘物。濃縮適當溶離份以移除ACN。用DCM萃取剩餘水性混合物，分離有機層，且經硫酸鈉乾燥。過濾，且在減壓下濃縮濾液，得到標題化合物(168mg；44.9%產率)。MS(m/z)：389(M+1)。
實例72
N-[4-({1-(二氟甲基)-3-(四氫呋喃-3-基)-1H-吡唑-4-基}氧基)吡啶-2-基]噠嗪-3-胺，異構體1
用對掌性層析法純化N-[4-[1-(二氟甲基)-3-四氫呋喃-3-基-吡唑-4-基]氧基-2-吡啶基]噠嗪-3-胺(製備49)之外消旋混合物，得到作為標題化合物之第一溶離對映異構體。MS(m/z)：375(M+1)。
純化條件：CHIRALPAK® IC；移動相：含有0.2%異丙基胺之30%異丙醇/二氧化碳；流動速率：70公克/分鐘；UVW：280nm；滯留時間：3.93分鐘。
基本上利用實例72之方法製備以下化合物。指示替代純化條件。
用於實例77-79之X射線粉末繞射收集程序
在裝備有CuKa源(λ=1.54060Å)及Vantec偵測器之Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上，以35kV及50mA操作，獲得結晶固體之XRD圖。在2θ 4與40°之間，以步長2θ 0.009°及掃描速率0.5秒/步，及發散度0.6mm、固定式抗散射5.28及偵測器狹縫9.5mm掃描樣品。在石英樣品架上填充乾粉，且使用玻璃載片獲得光滑表面。在環境溫度及相對濕度下收集晶形繞射圖。
實例77
2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶- 2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇，(2Z)-丁-2-烯二酸酯(1：1)
添加含2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇(142mg)之ACN(2mL)。以80℃/1000rpm攪拌的同時，固體完全溶解。將順丁烯二酸(48mg，1.20當量，在80℃下於1mL之ACN中)添加至所得溶液。混合物最初為混濁的，但迅速變為澄清溶液。終止加熱，且攪拌。將溶液冷卻至室溫。再添加2mL之ACN，以懸浮固體。藉由真空過濾分離白色固體，且在氣流下在過濾器上適當位置乾燥該固體15分鐘。在65℃真空烘箱中乾燥所得固體隔夜，得到標題化合物(132mg，73.4%產率)。在單鹽之形成之鹽中順丁烯二酸離子的理論百分比為21.0%。根據HPLC之相對離子分析測定出在所形成之鹽中順丁烯二酸離子的實際百分比為17.2%。相對離子分析指示單鹽。
實例77之X射線粉末繞射
實例77之製備樣品使用CuKa輻射藉由XRD圖表徵為具有如以下表13中所述之繞射峰(2-θ值)，且尤其具有在9.6°處之峰以及一或多個選自由12.5°、17.5°及16.9°組成之群的峰；其中繞射角之公差為0.2度。
實例78
2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇，甲磺酸鹽(1：1)
添加含2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇(113mg)之丙酮(2mL)。以60℃/1000rpm攪拌的同時，固體完全溶解。將甲磺酸(21μL，1.24當量)添加至所得溶液。終止加熱，且攪拌。將溶液冷卻至室溫。再添加3mL丙酮以懸浮固體。藉由真空過濾分離白色固體，且在氣流下在過濾器上適當位置乾燥該固體15分鐘。在65℃真空烘箱中乾燥所得固體隔夜，得到標題化合物(87mg，63.08%產率)。在單鹽之形成之鹽中甲磺酸離子的理論百分比為18.1%。根據HPLC之相對離子分析測定出在形成之鹽中甲磺酸離子的實際百分比為16.2%。相對離子分析指示單鹽。
實例78之X射線粉末繞射
實例78之製備樣品使用CuKa輻射藉由XRD圖表徵為具有如以下表14中所述之繞射峰(2-θ值)，且尤其具有在7.0°處之峰以及一或多個選自由14.1°、10.8°及18.6°組成之群的峰；其中繞射角之公差為0.2度。
實例79
2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇4-甲基苯磺酸鹽(1：1)
添加含2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇(122mg)之EtOAc(2mL)。以80℃/1000rpm攪拌的同時，固體完全溶解。將單水合對甲苯磺酸(1.23當量，在80℃下於1mL之EtOAc中)添加至所得溶液。以80℃/1000rpm漿化混合物30分鐘。停止加熱，且隨著混合物冷卻至室溫，保持以1000rpm攪拌該混合物。藉由真空過濾分離所得白色固體，且在氣流下在過濾器上適當位置乾燥該固體15分鐘。在65℃真空烘箱中乾燥所得固體隔夜，得到標題化合物(159mg，93.40%產率)。在單鹽之形成之鹽中對甲苯磺酸離子的理論百分比為29.3%。根據HPLC之相對離子分析測定出在形成之鹽中對甲苯磺酸離子的實際百分比為28.3%。相對離子分析指示單鹽。
實例79之X射線粉末繞射
實例79之製備樣品使用CuKa輻射藉由XRD圖表徵為具有如以下表15中所述之繞射峰(2-θ值)，且尤其具有在17.8°處之峰以及一或多個選自由19.7°、18.4°及22.0°組成之群的峰；其中繞射角之公差為0.2度。
經由TGFβ路徑之信號傳導在若干適應症中係與癌症及腫瘤進展相關聯(Elliott等人(2005)J Clin Oncol 23：2078；Levy等人(2006)Cytokine & Growth Factor Rev 17：41-58)。在若干類型的癌症中，其中由腫瘤或由腫瘤微環境中之基質所產生的TGFβ配體可能會參與腫瘤進展。MATLyLu大鼠***癌細胞(Steiner及Barrack(1992)Mol.Endocrinol 6：15-25)及MCF-7人類乳癌細胞(Arteaga等人(1993)Cell Growth及Differ.4：193-201)經用表現小鼠TGFβ1之載體轉染後會變得更具致瘤性且更具轉移性。在人類***癌及晚期胃癌中，TGF-β1係與血管生成、癌轉移及不佳預後相關聯(Wikstrom,P.等人(1998)Prostate 37：19-29；Saito,H.等人(1999)Cancer 86：1455-1462)。在乳癌中，不佳預後與上升的TGF-β相關聯(Dickson等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：837-841；Kasid等人(1987)Cancer Res.47：5733-5738；Daly等人(1990)J.Cell Biochem.43：199-211；Barrett-Lee等人(1990)Br.J Cancer 61：612-617；King等人(1989)J.Steroid Biochem. 34：133-138；Welch等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：7678-7682；Walker等人(1992)Eur.J.Cancer 238：641-644)，且經他莫昔芬(tamoxifen)治療誘導的TGF-β1(Butta等人(1992)Cancer Res.52：4261-4264)與他莫昔芬治療乳癌的失效具有相關聯(Thompson等人(1991)Br.J.Cancer 63：609-614)。抗TGFβ1抗體會抑制無胸腺小鼠體內的MDA-231人類乳癌細胞生長(Arteaga等人(1993)J.Clin.Invest.92：2569-2576)，一種與增加脾自然殺手細胞活性相關的治療。用潛伏TGFβ1轉染之CHO細胞在裸小鼠體內亦會展示減少之NK活性及增加之腫瘤生長(Wallick等人(1990)J.Exp.Med.172：1777-1784)。因此，由***腫瘤分泌的TGF-β可導致內分泌免疫抑制。已展示出較高血漿濃度之TGFβ1指示晚期乳癌患者之不佳預後(Anscher等人(1993)N.Engl.J.Med.328：1592-1598)。在高劑量化學療法及自體骨髓移植之前，具有高循環TGFβ之患者有患肝靜脈閉塞疾病(所有患者中之15-50%，且死亡率高達50%)及特發性間質肺炎(所有患者中之40-60%)的高風險。此等發現之含義為1)TGFβ之血漿含量升高可用於鑑別有風險的患者，以及2)TGFβ信號傳導減少可降低用於乳癌患者之此等常見治療的罹病率及死亡率。
近期公開案亦已建議，TGFβ信號傳導在驅動腫瘤對標準護理療法(包括化學療法及受體酪胺酸激酶)的抵抗性中至關重要(WO2012138783)。確切而言，在結腸癌中，特定基因表現標籤已展示隔離對常見一線治療具有抵抗性的一組患者。當TGFβ路徑用TGFβRI特異性小分子抑制劑阻斷時，此等腫瘤細胞恢愎對療法之敏感性(Huang等人(2012)Cell 151：937-950；Sadanandam等人(2013)Nat Med 19：619-625；Vermeulen等人(2013)Nat Ned 19：614-618；Roepman等人(2014)134：552-562)。
骨髓發育不良症候群(MDS)為骨髓腔中造血系統之病症，且其特 徵為骨髓細胞之無效產生。MDS係與由SMAD7含量減少所代表之TGFβ路徑改變有關。SMAD7為抑制性SMAD，其功能是抑制TGFβ介導之SMAD信號傳導且係在經由TGFβRI及TGFβRII之配體活化信號傳導的下游。SMAD7之過度表現因此認為導致在MDS中TGFβ信號傳導之過度活化，且此表型可藉由用TGFβRI小分子抑制劑治療加以逆轉(Zhou等人(2011)Cancer Res.71：955-963)。類似地，在神經膠母細胞瘤(GBM)中，TGFβ配體含量會升高且與疾病進展相關。反義寡核苷酸治療AP1002已在一子組GBM患者中展示潛在活性(Bogdahn等人(2011).Curr Pharm Biotechnol)。在黑色素瘤中，TGFβ路徑信號傳導活化亦與對BRAF及MEK抑制劑的抵抗性有關(Sun等人(2014)Nature.508：118-122)。
諸多惡性細胞會分泌轉型生長因子-β(TGF-β)(一種有效免疫抑制劑)，此推測TGFβ產生可能代表自宿主免疫監測之顯著腫瘤逃避機制(Flavell等人(2010)Nat Rev Immunol 10：554-567；Kast等人(1999)Leukemia 13：1188-1199)。建立具腫瘤攜帶宿主中之經破壞TGFβ信號傳導的白血球亞群提供針對癌症免疫療法之潛在方法，其可單獨使用或與一或多種其他免疫療法組合使用，例如與一或多種PD-1抑制劑，諸如尼沃單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、PD-L1抑制劑、癌症疫苗及雙特異性免疫參與分子(諸如，IMCgp100)組合。淋巴細胞所產生之TGFβ配體已在臨床前展示出拮抗腫瘤免疫監測(Donkor等人(2012)Development.Oncoimmunology 1：162-171，Donkor等人(2011)Cytokine Immunity 35：123-134)；已在臨床前展示出破壞此軸線會在鼠類模型中及在活體外提供抗腫瘤益處(Zhong等人(2010)Cancer Res 16：1191-1205；Petrausch等人(2009)J Immunol 183：3682-3689)；Wakefield等人(2013)Nat.Rev Cancer 13：328-341)。帶有在T細胞中破壞之TGFβ信號傳導的轉殖基因動物模型能夠根除一般致死 的TGFβ過度表現淋巴瘤腫瘤EL4(Gorelik及Flavell,(2001)Nature Medicine 7(10)：1118-1122)。下調腫瘤細胞中的TGFβ分泌會導致宿主體內的免疫原性復原，同時T細胞對TGFβ的不敏感性會導致加速分化及自體免疫，可能需要其中的要素以便對抗具有耐受性之宿主體內的自體抗原表現腫瘤。TGFβ之免疫抑制作用亦已參與低於基於其CD4/CD8 T細胞計數的預測免疫反應之HIV患者之亞群(Garba等人J.Immunology(2002)168：2247-2254)。TGFβ中和抗體能夠在培養物中逆轉該作用，顯示TGFβ信號傳導抑制劑可有效逆轉此亞組HIV患者體內存在的免疫抑制。
在癌發生之最早階段期間，TGFβ1可充當有效腫瘤抑制因子，且可介導某些化學預防劑之作用。然而，在惡性贅瘤之發展及進展期間的某一時刻，腫瘤細胞在微環境中生物活性TGFβ出現的同時，呈現自TGFβ依賴性生長抑制逃避。TGFβ之雙重腫瘤遏制/腫瘤促進角色已在角質細胞中的過度表現TGFβ之轉殖基因系統中最明顯地闡明。儘管轉殖基因對良性皮膚病變之形成較具有抵抗性，但在轉殖基因中轉移性轉化之速率大大增加(Cui等人(1996)Cell 86(4)：531-42)。由原發腫瘤中的惡性細胞產生之TGFβ1似乎隨著腫瘤進展之前進階段增加。對諸多大部分上皮癌症的研究表明，由人類癌症增加之TGFβ產生在腫瘤進展期間作為相對晚期事件出現。此外，此腫瘤相關聯的TGFβ提供具有選擇性優勢的腫瘤細胞，且促進腫瘤進展。TGFβ對細胞/細胞及細胞/基質相互作用之作用導致侵入及癌轉移的較大傾向。腫瘤相關聯的TGFβ可允許腫瘤細胞自免疫監測逃避，因為其為活化淋巴細胞之純系擴增之強力抑制劑。TGFβ亦已展示抑制血管生長抑素之產生。癌症治療模態(諸如，放射線療法及化學療法)誘發腫瘤中的活化TGFβ產生，由此選擇對TGFβ生長抑制性作用具有抵抗性的惡性細胞之生長物。因此，此等抗癌治療增加風險，且促進具有增強之生長 及侵襲性的腫瘤之發展。在此情況下，靶向TGFβ介導之信號轉導的藥劑可為一種極有效的治療策略。腫瘤細胞對TGFβ的抵抗性已展示使大量放射線療法及化學療法之細胞毒素作用無效，且在基質中的TGFβ之治療依賴性活化甚至可為有害的，因為其可使微環境較有利於腫瘤進展且有助於導致纖維化的組織損壞。TGFβ信號轉導抑制劑之發展有可能益於單獨及與其他療法組合的進展之癌症的治療。
此外，此項技術中已知，TGFβ信號傳導涉及纖維化條件，諸如肝纖維化及慢性腎病。參看例如，Ueha S等人2012.Front Immunol.3：71.Cellular and molecular mechanisms of chronic inflammation-associated organ fibrosis；Bottinger等人2002.J Amer Soc Nephrol.13：2600.TGF-β Signaling in Renal Disease；Trachtman H.等人2011.Kidney International 79：1236.A phase 1,single-dose study of fresolimumab,an anti-TGF-β antibody,in treatment-resistant primary focal segmental glomerulosclerosis；及Rosenbloom J等人2010.Narrative review：fibrotic diseases：cellular and molecular mechanisms and novel therapies.Ann Intern Med 152：159-166。
以下分析展現例示性化合物在生物化學分析中、在細胞層面上及在動物模型中抑制TGFβR1。
TGFβR1活性的生物化學分析
此活體外分析之目的為鑑別抑制TGFβR1的化合物。
蛋白質表現及純化
將編碼人類TGFβR1(NM_004612.2)之胺基酸200-503(其中在位置204處之胺基酸Thr變成Asp)的核苷酸序列***至具有N末端HIS標籤的PFASTBACTM1(Invitrogen，目錄號10360-014)載體內。根據BAC-TO-BAC®桿狀病毒表現系統(Invitrogen，目錄號10359-016)之方案生成桿狀病毒。使用每公升培養物15mL P1病毒感染1.5×106個細胞 /毫升之Sf9細胞，且在28℃下培育48小時。收集細胞，且在-80℃下儲存以供後續蛋白質純化。在4℃下進行蛋白質純化。將來自2L培養物之集結粒懸浮在含有0.2% Triton X-100及Roche不含EDTA完全蛋白酶抑制劑混合液的100mL緩衝液A(50mM Tris-HCl，pH8，200mM NaCl，1mM DTT，5mM咪唑，10%甘油)中，且均質化。藉由在Bechman JA-18轉子中以16,500rpm離心45分鐘來使細胞溶解物澄清。將上清液與5mL之Ni-NTA金屬親和樹脂(Qiagen)一起培育三小時。將樹脂填充至管柱上，且用緩衝液A洗滌。用含0-400mM咪唑梯度之緩衝液A溶離HIS-TGFβR1(200-503)(T204D)蛋白質。彙集且濃縮含有HIS-TGFβR1(200-503)(T204D)之溶離份，且裝載至HiLoad 16.600 Superdex 200管柱(GE Healthcare Bioscience)上。用儲存緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM DTT)溶離該管柱。彙集且濃縮含有HIS-TGFβR1(200-503)(T204D)之溶離份。利用UV280測定蛋白質濃度。將蛋白質等分試樣，且在-80℃下儲存。
TR-FRET分析條件
化合物與重組His-TGFβR1(200-503)(T204D)及Eu-抗HIS偵測抗體(InVitrogen，目錄號PV5597)一起在半區黑色培養盤中預培育。自含1mM儲備測試化合物之DMSO製備化合物連續稀釋液。3倍連續稀釋儲備溶液於DMSO中，獲得最終化合物濃度在2μM至0.1nM範圍內之十點稀釋曲線。在分析中，最終DMSO濃度為4%。藉助於添加激酶示蹤劑(激酶示蹤劑178，Life Technologies PR9080A，InVitrogen)來啟動反應。在45-60分鐘之後，在培養盤讀取器上讀取螢光。
計算相對於最小抑制組(僅DMSO，未處理)的經化合物處理之組之抑制百分比。使用4參數非線性邏輯方程式(其中絕對IC50=導致50%抑制之濃度)使用ActivityBase資料分析軟體計算絕對IC50。此等分析之結果展現，例示性化合物為TGFβR1之有效抑制劑。舉例而 言，所有例示性化合物展現IC50值小於1μM。確切而言，實例1之IC50為0.027μM。
針對TGFβR1活性的基於細胞之螢光素酶報導體分析
此分析之目的為在基於細胞之分析中鑑別選擇性地干擾SMAD 2,3-依賴性基因表現的化合物，展現其在細胞層面上抑制TGFβR1。
工程改造HEK293細胞(ATCC，CRL-1573)以回應於TGFβ刺激自SMAD 2,3-反應性啟動子表現螢火蟲螢光素酶。該細胞株可經由用慢病毒粒子(SA Biosciences)感染且選擇嘌呤黴素抵抗性來生成。在96孔培養盤中，將來自分析備用冷凍儲備液的HEK293_SMAD 2/3細胞以15,000個細胞/孔塗於含有10%胎牛血清的OPTI-MEM®培養基中。在72小時之後，將培養基變為含有0.1%牛血清白蛋白的OPTI-MEM®。製備測試化合物於DMSO中以製得10mM儲備溶液。3倍連續稀釋儲備溶液於DMSO中，獲得最終化合物濃度在20μM至1nM範圍內之十點稀釋曲線，其中在分析中最終DMSO濃度為0.5%。添加測試化合物，且在一小時平衡之後，添加TGFβ(最終濃度=2nM，R&D Systems)。
在24小時之後，將溶解緩衝液[Glo溶解緩衝液(目錄號E2661)]及螢光素酶試劑[Promega Bright Glo螢光素酶試劑(目錄號E2620)]添加至各孔直至雙倍於孔體積。將等分試樣(80μL)轉移至白色實心底部培養盤以供在培養盤讀取器(發射濾波器：Luminescence 700，1秒讀取)上讀取發光。計算相對於最小抑制組(僅DMSO，未處理)的經化合物處理之組之抑制百分比。自劑量反應研究計算各化合物之相對IC50，且該相對IC50為達到50%抑制所必需的濃度。使用ActivityBase資料分析軟體將自劑量反應研究生成的資料擬合於四參數邏輯方程式。此等分析之結果展現，例示性化合物為來自TGFβ刺激之HEK293_SMAD2/3細胞的螢光素酶報導體活性之有效抑制劑。舉例而 言，所有例示性化合物展現IC50值小於1μM。確切而言，實例1之IC50為0.0824μM(±0.005，n=2)。
IVTI分析
此分析之目的為量測測試化合物在EMT6-LM2同基因型動物模型中的腫瘤中抑制pSMAD2表現的能力，換言之，該分析量測測試化合物在實體腫瘤動物模型中抑制TGFβR1信號傳導的能力。
EMT6-LM2細胞生成
將EMT-6細胞(ATCC，CRL-2755)皮下(5×105個/動物)植入至免疫勝任BALB/cAnNHsd小鼠(Harlan Laboritories)之側腹。當腫瘤達至約3000mm3時，藉由CO2窒息處死動物。自腫瘤攜帶動物分離肺，且置放在培養物中。平緩地均質化該等肺以形成單細胞懸浮液。在培養基(1MDM，10% FBS)中生長細胞，且分離該等腫瘤細胞，得到EMT6-LM1細胞。藉由使用EMT6-LM1細胞植入來重複以上過程，生成EMT-LM2細胞。
純化之磷酸化HIS-SMAD2(pSMAD2)
將編碼全長人類SMAD2(NM_005901.5)之核苷酸序列***至PFASTBACHTATM(Invitrogen，目錄號10584-027)載體內，得到表現HIS-SMAD2蛋白質的桿狀病毒構築體。將編碼人類TGFβR1(NM_004612.2)之胺基酸148-503(其中在位置204處之胺基酸Thr變成Asp)的核苷酸序列***至PFASTBACHTATM(Invitrogen，目錄號10584-027)載體內，得到表現HIS-TGFβR1(148-503)(T204D)蛋白質的桿狀病毒構築體。根據BAC-TO-BAC®桿狀病毒表現系統(Invitrogen)之方案生成桿狀病毒。使用每公升培養物10mL HIS-SMAD2之P1病毒及HIS-TGFβR1(148-503)(T204D)之P1病毒感染1.5×106個細胞/毫升之Sf9細胞，且在28℃下培育45小時。添加岡田井酸(okadaic acid)至最終濃度為0.1μM。在再培育三小時之後，收集細胞，且在-80℃下 儲存以供後續蛋白質純化。在4℃下進行蛋白質純化。藉由在含有0.1% TRITON® X-100及Roche不含EDTA完全蛋白酶抑制劑混合液的300mL冷緩衝液A(50mM磷酸鈉，pH7.5，300mM NaCl，2mM β-巰基乙醇，5mM咪唑，10%甘油，0.1μM岡田井酸)中在攪拌下培育，溶解來自6L培養物之冷凍的細胞集結粒，且均質化。藉由在Bechman JA-18轉子中以16,500rpm離心45分鐘來使細胞溶解物澄清。用10mL之TALON金屬親和樹脂(Clontech，目錄號635504)培育上清液兩小時。用100mL含有0.1% TRITON® X-100之緩衝液A洗滌該批料。將樹脂填充至管柱上，且用緩衝液A洗滌。用含0-100mM咪唑梯度之緩衝液A溶離HIS-SMAD2蛋白質。彙集含有磷酸化HIS-SMAD2之溶離份並補充0.1μM岡田井酸及5mM EDTA。藉由BioRad蛋白質分析(BioRad DC蛋白質分析套組號500-0116)使用BSA作為標準來測定蛋白質濃度。將蛋白質等分試樣，且在-80℃下儲存。
活體階段
在補充有10% FBS、2mM Glutamax及0.1mM非必需胺基酸的伊思考夫改良之達爾伯克氏培養基(Iscoves Modified Dulbecco's Media，MDM)中培養EMT6-LM2細胞，且在5% CO2中在37℃下培育。以胰蛋白酶處理且分離來自培養物的細胞。將該等細胞再懸浮於漢克氏平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution，HBSS)中，接著與MATRIGEL®(1：1)混合。將細胞(5×105個/動物)皮下植入至小鼠(雌性BALB/c小鼠，Harlan)的後側腹中。用測徑規量測腫瘤體積，且量測體重，一週兩次。在腫瘤體積達到約200-250mm3之後，使動物及組隨機化至媒劑對照組及化合物治療組中。將化合物(在1%羥乙纖維素(HEC)及0.25% TWEEN® 80及0.05%消泡劑中配製)及媒劑對照(1% HEC及0.25% TWEEN® 80及0.05%消泡劑)藉由經口管飼投與。藉由遵照單一劑量：2.7、8.3、25、75或150mg/kg在單一時間點(2小時)測試化合 物來生成劑量反應。在單一劑量之後藉由在1小時與16小時之間的多個時間點處死小鼠，自劑量反應研究在經計算之(方法在下文中詳述)TED50或TED80劑量下進行時間過程。
組織處理
收集腫瘤組織，且如下所述均質化。在液氮中冷凍腫瘤組織(各約100mg)，且用研杵粉碎。將經粉碎之組織置放至在乾冰上的管(溶解基質A管，MPBio號6910-100)中，且在溶解緩衝液(各0.6mL)(150mM NaCl；20mM Tris，pH 7.5；1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；1mM乙二醇四乙酸(EGTA)；1% TRITON® X-100；蛋白酶抑制劑混合液(Sigma P8340)；磷酸酶抑制劑混合液II(Sigma P5726)；磷酸酶抑制劑混合液III(Sigma P0044))中使用Bio101 FASTPREP® FP120均質機(設定4.5)均質化25秒。在4℃下藉由以14,000×g離心10分鐘來集結細胞殘渣及珠粒。將溶解物轉移至新微量離心管，且在4℃下以14,000×g再次離心10分鐘。將經離心之溶解物轉移至深孔96孔培養盤中，且保持在冰上。如下使用BioRad蛋白質分析(BioRad DC蛋白質分析套組號500-0116)來測定各溶解物的蛋白質濃度。藉由將套組試劑S(20μL)添加至分析所需的每份1mL套組試劑A來製備工作試劑。製備蛋白質標準物自0.2mg/mL至1.5mg/mL蛋白質之3-5倍稀釋液，且生成標準曲線。將5μL之標準物及樣品用吸管轉移至清潔、乾燥的微量滴定盤中。將25μL工作試劑添加至各孔。將200μL試劑B添加至各孔中，且攪動5秒。在15分鐘之後，在750nM下讀取各孔之吸光度。藉由將樣品孔之吸光度與自標準孔獲得之標準曲線比較來測定各孔的蛋白質含量。在製備中將腫瘤溶解物用溶解緩衝液歸一化至10mg/mL以便利用ELISA如下文所述之方法分析pSMAD2及總SMAD2/3。
SMAD ELISA
使用獨立ELISA培養盤分析腫瘤溶解物，其中一個培養盤用於測 定總SMAD 2/3含量，其他培養盤用於測定磷酸化SMAD 2含量。儘管包被抗體在兩個培養盤中為相同的，但二級抗體對總SMAD 2/3或磷酸化SMAD 2具有特異性。此等培養盤統稱為「ELISA培養盤」，且分別稱為「總ELISA培養盤」或「磷酸化ELISA培養盤」。在BupH碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液(抗-SMAD 2/3單株抗體，BD Biosciences號610843；來自Pierce號28382的BupH碳酸鹽-碳酸氫鹽)中以2.5μg/mL製備包被抗體，且以100微升/孔添加至96孔免疫培養盤(Thermo Scientific號439454)，且在4℃下在平台震盪器上培育隔夜以生成ELISA培養盤。接著，用洗滌緩衝劑(0.5% TWEEN® 20於tris緩衝鹽水(TBS)中，pH 8.0，來自Sigma號T-9039)洗滌該等ELISA培養盤四次，且隨後用200微升/孔之阻斷緩衝液(1%牛血清白蛋白(BSA)於1×TBS中)在室溫下在平台震盪器上阻斷兩小時。用洗滌緩衝劑洗滌四次。將100微升/孔之腫瘤溶解物或媒劑溶解物以10mg/ml添加至磷酸化SMAD ELISA培養盤的適當孔中。將98微升/孔之溶解緩衝液及2微升/孔之10mg/ml腫瘤溶解物或媒劑溶解物添加至總ELISA培養盤的適當孔(0.02mg最終蛋白質溶解物)中。標準曲線亦使用純化之pSMAD2添加至各ELISA培養盤(磷酸化及總ELISA兩者)。培育隔夜。用洗滌緩衝劑再次洗滌該等ELISA培養盤四次。在補充有1% BSA之溶解緩衝液中以1：500稀釋來製備二級抗體(Millipore抗磷酸化SMAD2兔單株抗體號04-953；Millipore抗-SMAD2/3兔多株抗體號07-408)，且以100微升/孔添加至適當培養盤。在室溫下培育培養盤兩至三小時。用洗滌緩衝劑洗滌四次，且將100微升/孔之報導體抗體(抗兔HRP，GE Healthcare號NAV934V，在阻斷緩衝液中1：10,000稀釋)添加至該等培養盤。在室溫下培育一小時，且用洗滌緩衝劑洗滌培養盤最後四次，且添加100微升/孔之室溫3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB；Surmodics/BioFX號TMBW-0100-01)。在37℃下培育培養盤直至30分 鐘。藉助於添加100μL之終止溶液(1N H2SO4)來終止反應。在培養盤讀取器上在450nm下讀取吸光度(OD)。
使用媒劑組的總SMAD(tSMAD)比磷酸化SMAD(pSMAD)之比率測定pSMAD信號之最小抑制(0%)。計算相對於媒劑組之最小pSMAD抑制的經化合物處理之組之抑制百分比。藉由使用SAS(版本9.3，Cary，NC)中的NLIN程序自劑量反應研究(在此時間點分別獲得50%及80%抑制所必需的劑量)計算TED50及TED80。此分析展現，實例1之TED50值在1個劑量之後2小時為10.8mg/kg，且TED80為24.1mg/kg。在時間過程研究中在TED50劑量(11pmk)下，在給藥之後實例1在一小時下展現48%抑制，且在兩小時下展現39%抑制。在時間過程研究中在(25mpk)下，在給藥之後實例1在一小時下展現71%抑制，且在兩小時下展現70%抑制。
本發明之化合物通常在較寬劑量範圍內有效。舉例而言，每天的劑量一般落在約1-2000mg之每日範圍內。該等劑量較佳落在10-1000mg之每日範圍內。該等劑量更佳落在10-100mg之每日範圍內。該等劑量甚至更佳落在10-80mg之每日範圍內。該等劑量最佳落在10-50mg之每日範圍內。在一些情況下，低於前述範圍之下限的劑量含量可超過足量，而在其他情況下仍可採用較大劑量，且因此以上劑量範圍不意欲以任何方式限制本發明之範疇。應瞭解，實際上投與之化合物量將由醫師鑒於相關情況(包括待治療之病症、所選擇之投藥途徑、投與的實際化合物、個別患者之年齡、體重及反應以及患者症狀嚴重度)確定。

Claims (18)

  1. 一種下式化合物或其醫藥學上可接受之鹽， 其中：R1為氫、異丙基、二氟甲基、二氟乙基或環丙基；R2為乙基、第三丁基、吡啶-2-基、四氫哌喃-4-基、四氫呋喃-3-基、環丙基或環丁基；且R3為胺甲醯基苯基、吡啶-2-基、(1-羥基-1-甲基乙基)吡啶基、1-甲基-2-側氧基-1H-吡啶-4-基、1-甲基吡唑基、吡嗪-2-基、2-甲氧基嘧啶-4-基、1-甲基-2-側氧基-1H-嘧啶-4-基、噠嗪-3-基、6-氯噠嗪-3-基、6-甲基噠嗪-3-基或6-甲氧基噠嗪-3-基。
  2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其為2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其為2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇4-甲基苯磺酸鹽。
  4. 如請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其為結晶2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇4-甲基苯磺酸鹽。
  5. 如請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其為結晶2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇4-甲基苯磺酸鹽，其包含至少一個在17.8°處之峰以及一或多個選自由19.7°、18.4°及22.0°(2θ±0.2°)組成之群的峰。
  6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之化合物或鹽及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
  7. 一種如請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於製造作為轉型生長因子β受體1(TGFβR1)抑制劑之藥劑。
  8. 一種2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療癌症用的藥劑。
  9. 如請求項8之用途，其中該鹽為4-甲基苯磺酸鹽。
  10. 如請求項8或9之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：結腸癌、黑色素瘤、肝細胞癌、腎癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、骨髓發育不良症候群、肺癌及胃癌。
  11. 一種2-{4-[(4-{[1-環丙基-3-(四氫-2H-哌喃-4-基)-1H-吡唑-4-基]氧基}吡啶-2-基)胺基]吡啶-2-基}丙-2-醇或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造供治療纖維化用的藥劑。
  12. 如請求項11之用途，其中該鹽為4-甲基苯磺酸鹽。
  13. 如請求項11或12之用途，其中該纖維化係選自由肝纖維化及慢性腎病組成之群。
  14. 如請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係作為轉型生長因子β受體1(TGFβR1)抑制劑。
  15. 如請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療癌症。
  16. 如請求項15之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該癌症係選自由以下組成之群：結腸癌、黑色素瘤、肝細胞癌、腎癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、骨髓發育不良症候群、肺癌及胃癌。
  17. 如請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療纖維化。
  18. 如請求項17之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該纖維化係選自由肝纖維化及慢性腎病組成之群。
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