TWI578998B - 抗ｉｌ－６受體的抗體 - Google Patents

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TWI578998B TW097137133A TW97137133A TWI578998B TW I578998 B TWI578998 B TW I578998B TW 097137133 A TW097137133 A TW 097137133A TW 97137133 A TW97137133 A TW 97137133A TW I578998 B TWI578998 B TW I578998B
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Description

抗IL-6受體的抗體
本發明係有關於包含抗IL-6受體的抗體作為活性成分之醫藥組合物，以及製造該組合物之方法等。
作為醫藥品，抗體因為在血漿(血液)高度安定，有極少的副作用而吸引注意。在其中，大量的IgG類型的抗體藥品可在市面上購得，而許多抗體藥物目前還在開發(Janice M Reichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden & Matthew C Dewitz. Monoclonal antibody successes in the clinic. Nature Biotechnology(2005)23,1073-1078;Pavlou AK,Belsey MJ. The therapeutic antibodies market to 2008. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96)。
干擾素-6(IL-6)是一種細胞激素，與多種自體免疫疾病有關(Nishimoto N,Kishimoto T. Interleukin 6:from bench to bedside. Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26)。一種人造抗IL-6受體的IgG1抗體TOCILIZUMAB被認為可用於IL-6相關疾病，例如類風濕性關節炎的藥物，因為其專一性地與IL-6受體結合，並因而中和其活性(WO 92/19759;WO 96/11020;WO 96/12503;Maini RN,Taylor PC,Szechinski J,Pavelka K,Broll J,Balint G,Emery P,Raemen F,Petersen J,Smolen J,Thomson D,Kishimoto T,CHARISMA Study Group. Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist,Tocilizumab,in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate. Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(9):2817-29)。事實上，TOCILIZUMAB在日本已被許可作為Castleman氏症(Castleman’s disease)的治療藥物(Nishimoto N,Kanakura Y,Aozasa K,Johkoh T,Nakamura M,Nakano S,Nakano N,Ikeda Y,Sasaki T,Nishioka K,Hara M,Taguchi H,Kimura Y,Kato Y,Asaoku H,Kumagai S,Kodama F,Nakahara H,Hagihara K,Yoshizaki K,Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood 2005 Oct 15;106(8):2627-32)。
可應用於第二代抗體藥物的多種技術已經被發展，包括那些增強效應作用(effector function)、抗原結合活性、在血漿的滯留度(retention)、或穩定性、以及那些降低免疫原性(immunogenicity；抗原性(antigenicity))風險者。
用於增強藥物效果或降低劑量的方法，透過在IgG抗體的Fc區域(domain)之胺基酸取代以增加抗體依賴型細胞調節的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)或補體依賴型細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)的技術已經被報導(Kim SJ,Park Y,Hong HJ. Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Mol. Cells 2005 Aug 31;20(1):17-29 Review)。此外，親和性成熟(affinity maturation)被報導作為增強抗原結合活性或抗原中和活性的技術(Rothe A,Hosse RJ,Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert. Opin. Biol. Ther. 2006 Feb;6(2):177-87)。這個技術經由變異區之CDR區域的胺基酸突變的導入或類似情形使抗原結合活性增強。抗原結合活性的增強能改善在體外的生物性活性或降低劑量，進而改善在體內的效率(Rajpal A,Beyaz N,Haber L,Cappuccilli G,Yee H,Bhatt RR,Takeuchi T,Lerner RA,Crea R. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub. 2005 Jun 6)。目前，臨床試驗正在進行以評估Motavizumab(由親和性成熟所產生的)，其被認為具有比Palivizumab(抗-RSV抗體的第一代藥物)更好的效果(Wu H,Pfarr DS,Johnson S,Brewah YA,Woods RM,Patel NK,White WI,Young JF,Kiener PA. Development of Motavizumab,an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J. Mol. Biol.(2007)368,652-665)。另外，更良好的效果可經由與不同抗原決定位(epitope)的結合而被產生。例如，與Rituximab(抗-CD20的抗體)辨識不同抗原決定位之Oftamumab已被報導，顯示在活體內具有比Rituximab更良好的效果。目前，臨床試驗已被導入以評估Oftamumab(Teeling JL,Mackus WJ,wiegman LJ,van den Brakel JH,Beers SA,French RR,van Meerten T,Ebeling S,Vink T,Slootstra JW,Parren PW,Glennie MJ,van de Winkel JG. The biological activity of human CD20 monoclonal antibodies is linked to unique epitopes on CD20. J. Immunol. 2006 Jul 1;177(1):362-71)。先前並無敘述人類、人類化的(humanized)、或嵌合的(chimeric)抗-IL-6-受體的抗體具有高於1nM之親和性的報告。
現今抗體藥物所遭遇的問題在於，與極大量蛋白的使用有關之高製造成本。例如，一種人類化的抗-IL-6受體的IgG1抗體TOCILIZUMAB經由靜脈注射的劑量，已被評估約為8/毫克/公斤/月(Maini RN,Taylor PC,Szechinski J,Pavelka K,Broll J,Balint G,Emery P,Raemen F,Petersen J,Smolen J,Thomson D,Kishimoto T,CHARISMA Study Group. Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist,Tocilizumab,in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate. Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(9):2817-29)。其較佳的給藥形式為用於慢性自體免疫疾病之皮下製劑(subcutaneous preparations)。通常，所需要的皮下製劑為高濃度的製劑。基於穩定性或類似性質之目的，IgG類型的抗體製劑之濃度限制通常約為100毫克/毫升(Shire SJ,Shahrokh Z,Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J. Pharm. Sci. 2004 Jun;93(6):1390-402)。可被較長間隔經皮下給藥的低成本、方便之第二代抗體藥物可以被提供，經由增加抗體在血漿的半衰期，以延長其療效並因而降低使用之蛋白質的劑量，並經由給予高穩定性的抗體，使得高濃度的製劑得以被製備。
一種可能用於改善抗體在血漿之半衰期的方法已經被報導，其係人工地替換恆定區(constant region)中的胺基酸(Hinton PR,Xiong JM,Johlfs MG,Tang MT,Keller S,Tsurushita N. An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life. J. Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56;Ghetie V,Popov S,Borvak J,Radu C,Matesoi D,Medesan C,Ober RJ,ward ES. Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis. Nat. Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40)。然而，基於免疫原性風險的觀點，在恆定區之非天然序列的導入並不恰當。雖然基於免疫原性風險的觀點，較佳為在變異區而非恆定區導入股基酸的取代，並無報導經由在變異區胺基酸的取代對於抗體在血漿之半衰期的改善，或是人類、人類化的、或嵌合之IL-6-受體抗體在血漿之半衰期的改善。
用於改善穩定性之方法已有報導，這些方法包括在變異區的骨架之胺基酸取代(substitution)或移動(shuffling)，以改善物化穩定性(中間溫度的熱變性；intermediate temperature of thermal denaturation)(Ewert S,Honegger A,Pluckthun A. Stabitity improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications:CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. Methods. 2004 Oct;34(2):184-99 Review;Damschroder MM,Widjaja L,Gill PS,Krasnoperov V,Jiang W,Dall’Acqua WF,Wu H. Framework shuffling of antibodies to reduce immunogenicity and manipulate functional and biophysical properties. Mol. Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60)。然而，先前並無報導暗示這類胺基酸取代能改善濃度高於100毫克/毫升之製劑的穩定性(抑制凝集)。之前亦無關於在濃度高於100毫克/毫升的製劑之穩定人類或人類化的IL-6-受體的抗體分子的報導。
發展生物藥劑所遭遇之其他重要的問題是免疫原性(immunogenicity)。通常，小鼠抗體之免疫原性經由抗體的人類化作用(humanization)而被降低。被假設免疫原性風險可以進一步被降低，經由在抗體的人類化作用使用種系(germline)骨架序列作為模版(Hwang WY,Almagro JC,Buss TN,Tan P,Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods. 2005 May;36(1):35-42)。然而，即便是Adalimumab，一種全長之人類抗-TNF的抗體，仍顯示高機率(13%至17%)的免疫原性，而其療效被發現於表現免疫原性之病患降低(Bartelds GM,Wijbrandts CA,Nurmohamed MT,Stapel S,Lems WF,Aarden L,Dijkmans BA,Tak P,Wolbink GJ. Clinical response to adalimumab:The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. Jul;66(7):921-6 Epub 2007 Feb 14;Bender NK,Heilig CE,Droll B,Wohlgemuth J,Armbruster FP,Heilig B. Immunogenicity,efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol. Int. 2007 Jan;27(3):269-74)。可能因為T-細胞之抗原決定位亦可表現於人類抗體的CDR區域，而這些抗原決定位係為免疫原性的可能原因。電腦模擬(in silico )與活體外(in vivo )預測T-細胞抗原決定位之方法已經被提出(Van Walle I,Gansemans Y,Parren PW,Stas P,Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development. Expert Opin. Biol. Ther. 2007 Mar;7(3):405-18;Jones TD,Pbillips WJ,Smith BJ,Bamford CA,Nayee PD,Baglin TP,Gaston JS,Baker MP. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thromb. Haemost. 2005 May;3(5):991-1000)。其假設免疫原性風險可經由利用這類方法去除被預測的T-細胞抗原決定位而被降低(Chirino AJ,Ary ML,Marshall SA. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov. Today 2004 Jan 15;9(2):82-90)。TOCILIZUMAB是一種人類化的抗-IL-6受體IgG1抗體，係人類化小鼠的PM-1抗體而獲得。抗體利用人類NEW與REI骨架序列分別當作H與L鏈的模版，經由CDR剪接而產生；然而，一個5胺基酸的小鼠序列仍被維持在抗體裡當作骨架，且其係維持抗體活性所必須者(Sato K,Tsuchiya M,Saldanha J,Koishihara Y,Ohsugi Y,Kishimoto T,Bendig MM. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)。先前並無報導關於對於保持於人類化的抗體TOCILIZUMAB之骨架的小鼠序列之人類序列的取代，並無活性的損失。此外，TOCILIZUMAB的CDR序列是小鼠的序列。因此，有一個可能性，就像Adalimumab一樣，TOCILIZUMAB在CDR區域具有T-細胞抗原決定位，這暗示著一個潛在的免疫原性風險。此外，TOCILIZUMAB屬於IgG1子集合，並因此可與Fcγ受體結合。因為Fcγ受體被表現於抗原表現細胞(antigen-presenting cells)，與Fcγ受體結合的分子容易被當作抗原表現。已被報導，免疫原性是且可以被增強，經由連接蛋白質或胜肽至IgG1的Fc功能區塊(Guyre PM,Graziano RF,Goldstein J,Wallace PK,Morganelli PM,wardwell K,Howell AL. Increased potency of Fc-receptor-targeted antigens. Cancer Immunol. Immunother. 1997 Nov-Dec;45(3-4):146-8;US 20050261229A1)。在TOCILIZUMAB的臨床試驗，對抗TOCILIZUMAB的抗體並未被偵測到，當TOCILIZUMAB係以有效劑量(8毫克/公斤)被使用時。然而，免疫原性於2與4毫克/公斤的劑量被觀察到(專利申請號WO 2004096273(A1))。這暗示著人類化的抗-IL-6受體的IgG1抗體TOCILIZUMAB的免疫原性可以被降低。然而，並無關於TOCILIZUMAB(一種人類化的PM-1抗體)經過胺基酸取代而有降低之免疫原性風險的報導。
近年來，抗體藥物的安全性變得很重要。抗體Fc功能區塊與Fcγ受體之間的交互作用被假設為造成TGN1412在第一期臨床試驗所遭遇之嚴重副作用的原因(Strand V,Kimberly R,Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology:lessons learned,future directions. Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92)。以中和抗原之生物活性為目標的抗體藥物，Fc功能區塊與Fcγ受體的結合是非必須的；其中Fcγ受體對於如ADCC之作用子功能而言是很重要的。此外，如先前所述，與Fcγ受體的結合由免疫原性與副作用的觀點，可能並不適宜。
用於降低對Fcγ受體之結合的方法能改變IgG抗體的異構型(isotype)由IgG1為IgG2或IgG4；然而，這個方法不能完全地抑制結合作用(Gessner JE,Heiken H,Tamm A,Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann. Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48)。被報導用於完全地抑制與Fcγ受體結合之方法是人工地修改Fc功能區塊。例如，抗-CD3抗體與抗-CD4抗體的作用子功能(effector functions)會造成副作用。因此，不存在於野生型序列之胺基酸被導入Fc的Fcγ受體-結合功能區塊(Cole MS,Anasetti C,Tso JY. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J. Immunol. 1997 Oct 1;159(7):3613-21;Reddy MP,Kinney CA,Chaikin MA,Payne A,Fishman-Lobell J,Tsui P,Dal Monte PR,Doyle ML,Brigham-Burke MR,Anderson D,Reff M,Newman R,Hanna N,Sweet RW,Truneh A. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J. Immunol. 2000 Feb 15;164(4):1925-33)，而臨床試驗目前正在進行，以評估未與Fcγ受體結合之抗-CD3的抗體以及具有突變的Fc功能區塊之抗-CD4的抗體(Strand V,Kimberly R,Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology:lessons learned,future directions. Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92;Chau LA,Tso JY,Melrose J,Madrenas J. HuM291(Nuvion),a humanized Fc receptor-nonbinding antibody against CD3,anergizes peripheral blood T cells as partial agonist of the T cell receptor. Transplantation 2001 Apr 15;71(7):941-50)。此外，Fcγ受體-未結合(nonbinding)之抗體可以被製備，經由改變IgG1的FcγR-結合功能區塊(在EU編碼系統的位置233、234、235、236、327、330、以及331)成為IgG2或IgG4序列(Armour KL,Clark MR,Hadley AG,Williamson LM. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur. J. Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24;WO 99/58572)。然而，這些分子具有新穎的9至12個胺基酸之非天然胜肽序列，可能構成T-細胞抗原決定位胜肽，並因而造成免疫原性風險。先前並無克服這些問題之Fcγ受體-未結合抗體的報導。
同時，抗體蛋白質的物理特性，尤其是同質性(homogeneity)與穩定性(stability)，對於抗體藥物的發展非常重要。對於IgG2異構型，源自絞鏈區之雙硫鍵結的異質性(heterogeneity)已被報導(Chu GC,Chelius D,Xiao G,Khor HK,Coulibaly S,Bondarenko PV. Accumulation of Succinimide in a Recombinant Monoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers Under Elevated Temperatures. Pharm. Res. 2007 Mar 24;24(6):1145-56)。很難大規模生產抗體藥物，如要維持產品內標的物質與相關物質之比例的異質性。因此，如果可能的話，較佳為發展用於藥物的抗體分子是單一物質。
IgG2與IgG4在酸性環境不穩定。IgG類型的抗體通常在利用蛋白質A(Protein A)與病毒去活性過程(virus inactivation process)之純化程序接觸酸性環境。因此，有一個可能性，IgG2與IgG4在這些過程中，經過變性(denaturation)與聚集(aggregation)。因此，發展做為藥物的抗體分子較佳在酸性環境下也是穩定的。天然的IgG2與IgG4、以及源自IgG2或IgG4之Fcγ受體-未結合抗體有這類問題(Gessner JE,Heiken H,Tamm A,Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann. Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48;Cole MS,Anasetti C,Tso JY. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J. Immunol. 1997 Oct 1;159(7):3613-21;WO 99/58572)。當發展抗體做為藥物時，最好能解決這些問題。
IgG1-類型抗體在酸性環境相對地穩定，源自絞鏈區之雙硫鍵的異質性程度在這類抗體也較低。然而，IgG1-類型抗體被報導，當被儲存為製劑時，溶液之絞鏈區經過非酵素性胜肽鍵的分解，而Fab片段結果成為雜質(AJ Cordoba,BJ Shyong,D Breen,RJ Harris. Nonenzymatic hinge region fragmentation of antibodies in solution. J. Chromatogr. B. Anal. Technol. Biomed. Life Sci.(2005)818,115-121)。當發展抗體做為藥物時，最好能克服雜質的產生。
此外，關於抗體C-端序列異質性的報導，其係源自一個C-端胺基酸殘基Lys或二個C-端胺基酸殘基Gly與Lys之刪除而導致C-端胺基的醯胺化(Johnson KA,Paisley-Flango K,Tangarone BS,Porter TJ,Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal. Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83)。當發展抗體做為藥物時，最好去除這類異質性。
以中和抗原為目的之抗體藥物的恆定區較佳地具有能克服前述全部問題的序列。然而，符合全部需求的恆定區尚未被報導。
相較於第一代分子，沒有對於表現改善之抗原-中和活性與即使降低給藥頻率仍產生延長的療效，具有降低的免疫原性與改善的安全性與物理特性之第二代分子開發的報導。也沒有第二代TOCILIZUMAB的報導，對前述需求而言具有更多的優點，係經由改變人類化的抗-IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB之變異與恆定區的胺基酸序列。
本發明以前述情況的觀點完成。本發明之一目的在於提供醫藥組合物，包括第二代分子，其較人類化的抗IL-6受體之IgG1抗體TOCILIZUMAB優秀，以及用於製造此類醫藥組合物之方法。第二代分子已被改善於血清中存在增強的抗原-中和活性與滯留度，因而產生延長的療效，即使給藥的頻率是被降低的；亦已被改善具有降低的免疫原性以及改善的安全性與物理特性，經由更改TOCILIZUMAB變異區與恆定區的胺基酸序列。
本發明之發明人進行專注的研究，以生產比第一代人類化的抗IL-6受體之IgG1抗體TOCILIZUMAB更優良的第二代分子，已經被改良以表現增強的藥效以及在血清中的滯留度，並因此即使給藥的頻率被降低，仍產生延長的療效。發明人亦已經改善以具有降地的免疫原性與改善的安全性與物理特性(穩定性與同質性)，經由改變TOCILIZUMAB變異區與恆定區的胺基酸序列。因此，本發明之發明人在TOCILIZUMAB的變異區發現多重CDR突變，能改善抗原結合活性(親和性)。本發明之發明人因而成功地顯著改良親和性，利用這類突變的組合。本發明之發明人亦成功地改善血清滯留度，經由改變變異區的序列為較低的抗體等電點(isoelectric point)。此外，本發明之發明人成功地降低免疫原性風險，經由移除部分電腦預測的變異區T細胞抗原決定位胜肽以及維持在TOCILIZUMAB骨架的小鼠序列。另外，本發明之發明人成功地增加在高濃度時的穩定性。更進一步，本發明之發明人也成功地發現新穎的恆定區序列，其不會與Fcγ受體結合，因而改善酸性環境的穩定性、源自絞鏈區之雙硫鍵的異質性、源自H鏈C端的異質性、以及高濃度配方的穩定性，透過最小化TOCILIZUMAB恆定區的新T細胞抗原決定位胜肽產生。本發明之發明人成功地發現更優於TOCILIZUMAB的第二代分子，經由結合CDR、變異區、與恆定區之胺基酸序列的變化。
本發明係有關於醫藥組合物，包括一人類化的抗IL-6受體IgG1抗體，其被改善以表現更優良的抗原(IL-6受體)-結合活性、更延長的血清滯留度、更佳的安全性與物理特性(穩定性與同質性)、以及進一步被降低的免疫原性風險，經由改變人類化的抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB之變異區與恆定區的胺基酸序列；以及製造此醫藥組合物的方法。更特別地，本發明提供：
[1]一種抗IL-6受體的抗體，包括以下任一種：\
(a)一抗體，包括具有CDR1之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:1之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代；
(b)一抗體，包括具有CDR1之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:1之胺基酸序列位置5的Trp已被其他胺基酸取代；
(c)一抗體，包括具有CDR2之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置1的Tyr已被其他胺基酸取代；
(d)一抗體，包括具有CDR2之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置8的Thr已被其他胺基酸取代；
(e)一抗體，包括具有CDR2之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置9的Thr已被其他胺基酸取代；
(f)一抗體，包括具有CDR3之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代；
(g)一抗體，包括具有CDR3之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置2的Leu已被其他胺基酸取代；
(h)一抗體，包括具有CDR3之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置5的Thr已被其他胺基酸取代；
(i)一抗體，包括具有CDR3之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置7的Ala已被其他胺基酸取代；
(j)一抗體，包括具有CDR3之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置8的Met已被其他胺基酸取代；
(k)一抗體，包括具有CDR3之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置1的Ser以及位置5的Thr已被其他胺基酸取代；
(l)一抗體，包括具有CDR3之重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置2的Leu、位置7的Ala以及位置8的Met已被其他胺基酸取代；
(m)一抗體，包括具有CDR1之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:4之胺基酸序列位置1的Arg已被其他胺基酸取代；
(n)一抗體，包括具有CDR1之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:4之胺基酸序列位置4的Gln已被其他胺基酸取代；
(o)一抗體，包括具有CDR1之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:4之胺基酸序列位置9的Tyr已被其他胺基酸取代；
(p)一抗體，包括具有CDR1之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:4之胺基酸序列位置11的Asn已被其他胺基酸取代；
(q)一抗體，包括具有CDR2之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:5之胺基酸序列位置2的Thr已被其他胺基酸取代；
(r)一抗體，包括具有CDR3之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:6之胺基酸序列位置1的Gln已被其他胺基酸取代；
(s)一抗體，包括具有CDR3之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:6之胺基酸序列位置3的Gly已被其他胺基酸取代；
(t)一抗體，包括具有CDR1之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:4之胺基酸序列位置9的Tyr已被其他胺基酸取代，以及CDR3之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:6之胺基酸序列位置3的Gly已被其他胺基酸取代；
(u)一抗體，包括具有CDR3之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:6之胺基酸序列位置5的Thr已被其他胺基酸取代；
(v)一抗體，包括具有CDR3之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:6之胺基酸序列位置1的Gln以及位置5的Thr已被其他胺基酸取代；
(w)一抗體，包括具有CDR2之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置9的Thr已被其他胺基酸取代，以及CDR3之輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置1的Ser以及位置5的Thr已被其他胺基酸取代；
(x)一抗體，具有(k)的重鏈變異區以及(v)的輕鏈變異區；以及
(y)更包括(e)之CDR2的該(x)抗體；
[2]一種具有輕鏈變異區之抗IL-6受體的抗體，包括CDR2，在其中位於SEQ ID NO:5之胺基酸序列位置2的Thr已被其他胺基酸取代；
[3]一種抗IL-6受體的抗體，包括以下任一種
(a)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置13的Arg已被其他胺基酸取代；
(b)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置16的Gln已被其他胺基酸取代；
(c)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置23的Thr已被其他胺基酸取代；
(d)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置30的Thr已被其他胺基酸取代；
(e)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置13的Arg、位置16的Gln、位置23的Thr、以及位置30的Thr已被其他胺基酸取代；
(f)一抗體，包括具有FR2的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:8之胺基酸序列位置8的Arg已被其他胺基酸取代；
(g)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置4的Met已被其他胺基酸取代；
(h)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置5的Leu已被其他胺基酸取代；
(i)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置16的Arg已被其他胺基酸取代；
(j)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置27的Val已被其他胺基酸取代；
(k)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置4的Met、位置5的Leu、位置16的Arg、以及位置27的Val已被其他胺基酸取代；
(l)一抗體，包括具有FR4的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:10之胺基酸序列位置3的Gln已被其他胺基酸取代；
(m)一抗體，包括具有FR1的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:11之胺基酸序列位置18的Arg已被其他胺基酸取代；
(n)一抗體，包括具有FR2的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:12之胺基酸序列位置11的Lys已被其他胺基酸取代；
(o)一抗體，包括具有FR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:13之胺基酸序列位置23的Gln已被其他胺基酸取代；
(p)一抗體，包括具有FR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:13之胺基酸序列位置24的Pro已被其他胺基酸取代；
(q)一抗體，包括具有FR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:13之胺基酸序列位置27的Ile已被其他胺基酸取代；
(r)一抗體，包括具有FR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:13之胺基酸序列位置23的Gln、位置24的Pro、以及位置27的Ile已被其他胺基酸取代；
(s)一抗體，包括具有FR4的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:14之胺基酸序列位置10的Lys已被其他胺基酸取代；
(t)一抗體，包括具有FR4的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:10之胺基酸序列位置5的Ser已被其他胺基酸取代；
(u)一抗體，包括具有FR4的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:10之胺基酸序列位置3的Gln以及位置5的Ser已被其他胺基酸取代；
(v)一抗體，包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:184之FR3的重鏈變異區；
(w)一抗體，包括具有(e)的FR1、(f)的FR2、(k)的FR3、以及(l)或(u)的FR4之重鏈變異區；
(x)一抗體，包括具有(m)的FR1、(n)的FR2、(r)的FR3、以及(s)的FR4之輕鏈變異區；以及
(y)一抗體，具有(w)的重鏈變異區以及(x)的輕鏈變異區；
[4]一種抗IL-6受體的抗體，包括以下任一種：
(a)一抗體，包括具有CDR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:1之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代；
(b)一抗體，包括具有CDR2的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置9的Thr已被其他胺基酸取代；
(c)一抗體，包括具有CDR2的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置16的Ser已被其他胺基酸取代；
(d)一抗體，包括具有CDR2的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置9的Thr以及位置16的Ser已被其他胺基酸取代；
(e)一抗體，包括具有CDR1的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:4之胺基酸序列位置1的Arg已被其他胺基酸取代；
(f)一抗體，包括具有CDR2的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:5之胺基酸序列位置2的Thr已被其他胺基酸取代；
(g)一抗體，包括具有CDR2的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:5之胺基酸序列位置4的Arg已被其他胺基酸取代；
(h)一抗體，包括具有CDR2的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:5之胺基酸序列位置2的Thr以及位置4的Arg已被其他胺基酸取代；
(i)一抗體，包括具有CDR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:6之胺基酸序列位置5的Thr已被其他胺基酸取代；
(j)一抗體，包括具有SEQ ID NO:3之胺基酸序列之(a)的CDR1、(d)的CDR2、以及CDR3的重鏈變異區；
(k)一抗體，包括具有(e)的CDR1、(h)的CDR2、以及(i)的CDR3的輕鏈變異區；以及
(l)一抗體，具有(j)的重鏈變異區以及(k)的輕鏈變異區；
[5]一種以下任一種的抗IL-6受體的抗體：
(a)一抗體，包括一重鏈變異區，具有CDR1，其中位於SEQ ID NO:1之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代；CDR2，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置9的Thr以及位置16的Ser已被其他胺基酸取代；以及CDR3，其中位於SEQ ID NO:3之胺基酸序列位置1的Ser以及位置5的Thr已被其他胺基酸取代；
(b)一抗體，包括一輕鏈變異區，具有CDR1，其中位於SEQ ID NO:4之胺基酸序列位置1的Arg已被其他胺基酸取代；CDR2，其中位於SEQ ID NO:5之胺基酸序列位置2的Thr以及位置4的Arg已被其他胺基酸取代；以及CDR3，其中位於SEQ ID NO:6之胺基酸序列位置1的Gln以及位置5的Thr已被其他胺基酸取代；
(c)一抗體，具有包括SEQ ID NO:22之胺基酸序列的重鏈變異區；
(d)一抗體，具有包括SEQ ID NO:23之胺基酸序列的輕鏈變異區；
(e)一抗體，具有(a)的重鏈變異區以及(b)的輕鏈變異區；以及
(f)一抗體，具有(c)的重鏈變異區以及(d)的輕鏈變異區；
[6]一種以下任一種的人類抗體恆定區：
(a)一人類抗體恆定區，同時包括SEQ ID NO:19的胺基酸序列之位置329的Gly(EU編碼系統446)與位置330的Lys(EU編碼系統447)的刪除；
(b)一人類抗體恆定區，同時包括SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置325的Gly(EU編碼系統446)與位置326的Lys(EU編碼系統447)的刪除；以及
(c)一人類抗體恆定區，同時包括SEQ ID NO:21的胺基酸序列之位置326的Gly(EU編碼系統446)與位置327的Lys(EU編碼系統447)的刪除；
[7]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置209(EU編碼系統330)、210(EU編碼系統331)、以及218(EU編碼系統339)的胺基酸已被其他胺基酸取代；
[8]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置276(EU編碼系統397)的胺基酸已被其他胺基酸取代；
[9]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置14(EU編碼系統131)、102(EU編碼系統219)、及/或16(EU編碼系統133)的胺基酸已被其他胺基酸取代；
[10]如[9]的IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置20(EU編碼系統137)以及21(EU編碼系統138)的胺基酸已被其他胺基酸取代；
[11]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置147(EU編碼系統268)的His、234(EU編碼系統355)的Arg、及/或298(EU編碼系統419)的Gln已被其他胺基酸取代；
[12]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置209(EU編碼系統330)、210(EU編碼系統331)、218(EU編碼系統339)、276(EU編碼系統397)、14(EU編碼系統131)、16(EU編碼系統133)、102(EU編碼系統219)、20(EU編碼系統137)、以及21(EU編碼系統138)的胺基酸已被其他胺基酸取代；
[13]如[12]的IgG2恆定區，其更同時包括位置325(EU編碼系統446)的Gly以及位置326(EU編碼系統447)的Lys的刪除；
[14]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置276(EU編碼系統397)、14(EU編碼系統131)、16(EU編碼系統133)、102(EU編碼系統219)、20(EU編碼系統137)、以及21(EU編碼系統138)的胺基酸已被其他胺基酸取代；
[15]如[14]的IgG2恆定區，其更同時包括位置325(EU編碼系統446)的Gly以及位置326(EU編碼系統447)的Lys的刪除；
[16]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置14(EU編碼系統131)的Cys、位置16(EU編碼系統133)的Arg、位置102(EU編碼系統219)的Cys、位置20(EU編碼系統137)的Glu、位置21(EU編碼系統138)的Ser、位置147(EU編碼系統268)的His、位置234(EU編碼系統355)的Arg、以及位置298(EU編碼系統419)的Gln已被其他胺基酸取代；
[17]如[16]的IgG2恆定區，其更同時包括位置325(EU編碼系統446)的Gly以及位置326(EU編碼系統447)的Lys的刪除；
[18]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置14(EU編碼系統131)的Cys、位置16(EU編碼系統133)的Arg、位置102(EU編碼系統219)的Cys、位置20(EU編碼系統137)的Glu、位置21(EU編碼系統138)的Ser、位置147(EU編碼系統268)的His、位置234(EU編碼系統355)的Arg、位置298(EU編碼系統419)的Gln、以及位置313(EU編碼系統434)的Asn已被其他胺基酸取代；
[19]如[18]的IgG2恆定區，其更同時包括位置325(EU編碼系統446)的Gly以及位置326(EU編碼系統447)的Lys的刪除；
[20]一種IgG4恆定區，其中SEQ ID NO:21的胺基酸序列之位置289(EU編碼系統409)的胺基酸已被其他胺基酸取代；
[21]一種IgG4恆定區，其中SEQ ID NO:21的胺基酸序列之位置289(EU編碼系統409)、位置14、16、20、21、97、100、102、103、104與105(EU編碼系統131、133、137、138、214、217、219、220、221與222)、以及位置113、114、與115(分別為EU編碼系統233、234與235)的胺基酸已被其他胺基酸取代，以及位置116(EU編碼系統236)的胺基酸已被刪除；
[22]如[21]的IgG4恆定區，其更同時包括位置326(EU編碼系統446)的Gly以及位置327(EU編碼系統447)的Lys的刪除；
[23]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置209(EU編碼系統330)的Ala、位置210(EU編碼系統331)的Pro、位置218(EU編碼系統339)的Thr、位置14(EU編碼系統131)的Cys、位置16(EU編碼系統133)的Arg、位置102(EU編碼系統219)的Cys、位置20(EU編碼系統137)的Glu、以及位置21(EU編碼系統138)的Ser已被其他胺基酸取代；
[24]如[23]的IgG2恆定區，其更同時包括位置325(EU編碼系統446)的Gly以及位置326(EU編碼系統447)的Lys的刪除；
[25]一種IgG2恆定區，其中SEQ ID NO:20的胺基酸序列之位置14(EU編碼系統131)的Cys、位置16(EU編碼系統133)的Arg、位置102(EU編碼系統219)的Cys、位置20(EU編碼系統137)的Glu、以及位置21(EU編碼系統138)的Ser已被其他胺基酸取代；
[26]如[25]的IgG2恆定區，其更同時包括位置325(EU編碼系統446)的Gly以及位置326(EU編碼系統447)的Lys的刪除；
[27]一種具有SEQ ID NO:24之胺基酸序列的恆定區；
[28]一種具有SEQ ID NO:118之胺基酸序列的恆定區；
[29]一種具有SEQ ID NO:25之胺基酸序列的恆定區；
[30]一種具有SEQ ID NO:151之胺基酸序列的恆定區；
[31]一種具有SEQ ID NO:152之胺基酸序列的恆定區；
[32]一種具有SEQ ID NO:153之胺基酸序列的恆定區；
[33]一種具有SEQ ID NO:164之胺基酸序列的恆定區；
[34]一種具有SEQ ID NO:194(M40 GK)之胺基酸序列的恆定區；
[35]一種具有SEQ ID NO:192(M86 GK)之胺基酸序列的恆定區；
[36]一種具有[6]至[32]之任何一種恆定區的抗體；
[37]如[36]的抗體，其與IL-6受體結合；
[38]一種抗IL-6受體的抗體，其與受體之結合活性為1nM或更低；
[39]一種抗IL-6受體的抗體，其中被測量之全長抗體的等電點為7.0或更低，或變異區的理論等電點為5.0或更低；
[40]一種抗IL-6受體的抗體，其中置於25℃、具有pH值6.5至7.0之20mM組胺酸-鹽酸(Histidine-HCl)與150mM氯化鈉的緩衝液內一個月後，抗體聚集之增加比例為0.3%或更低，當該抗體濃度為100毫克/毫升時；以及
[41]一種包括[36]至[40]之任一項的抗體之醫藥組合物。
本發明提供醫藥組合物，包含第二代分子，其較人類化的抗IL-6受體之IgG1抗體TOCILIZUMAB更優良，並已被改善於血清中存在增強的藥效與滯留度，因而產生延長的療效，即使給藥的頻率是被降低的。它們也被改善以具有降低的免疫原性與改善的安全性與物理特性，經由改變TOCILIZUMAB變異區與恆定區的胺基酸序列；以及用於生產此種醫藥組合物的方法。本發明亦提供適於醫藥的抗體恆定區。
本發明係有關於抗IL-6受體的抗體，具有優良的抗原結合活性、中和活性、血清滯留度、穩定性、及/或同質性，以及降低的免疫原性風險。
較佳地，該抗IL-6受體的抗體係為人類化的PM-1抗體(TOCILIZUMAB)。更特別地，本發明提供具有增強的抗體結合活性之人類化的PM-1抗體、具有增強的中和活性之人類化的PM-1抗體、顯示改善的血清滯留度之人類化的PM-1抗體、具有降低的免疫原性風險之人類化的PM-1抗體、具有改善的穩定性之人類化的PM-1抗體、以及具有改善的同質性之人類化的PM-1抗體，這些全部透過胺基酸取代而達成。
人類化的PM-1抗體與人類IL-6受體結合，因而抑制人類IL-6與人類IL-6受體之間的結合。在此處，序列表的SEQ ID對應以下所顯示之人類化PM-1抗體的胺基酸序列。
重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:15
輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:16
重鏈變異區胺基酸序列：SEQ ID NO:17
輕鏈變異區胺基酸序列：SEQ ID NO:18
重鏈CDR1(HCDR1)胺基酸序列：SEQ ID NO:1
重鏈CDR2(HCDR2)胺基酸序列：SEQ ID NO:2
重鏈CDR3(HCDR3)胺基酸序列：SEQ ID NO:3
重鏈FR1(HFR1)胺基酸序列：SEQ ID NO:7
重鏈FR2(HFR2)胺基酸序列：SEQ ID NO:8
重鏈FR3(HFR3)胺基酸序列：SEQ ID NO:9
重鏈FR4(HFR4)胺基酸序列：SEQ ID NO:10
輕鏈CDR1(LCDR1)胺基酸序列：SEQ ID NO:4
輕鏈CDR2(LCDR2)胺基酸序列：SEQ ID NO:5
輕鏈CDR3(LCDR3)胺基酸序列：SEQ ID NO:6
輕鏈FR1(LFR1)胺基酸序列：SEQ ID NO:11
輕鏈FR2(LFR2)胺基酸序列：SEQ ID NO:12
輕鏈FR3(LFR3)胺基酸序列：SEQ ID NO:13
輕鏈FR4(LFR4)胺基酸序列：SEQ ID NQ:14
<具有增強的親和性與中和活性的抗體>
本發明提供具有強烈人類IL-6受體結合及/或中和活性之抗人類IL-6受體的抗體。更特別地，本發明提供下列(a)至(y)的抗體，以及製造抗體的方法：
(a)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR1，其中位於SEQ ID NO:1(HCDR1)之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Trp(RD_68)、Thr(RD_37)、Asp(RD_8)、Asn(RD_11)、Arg(RD_31)、Val(RD_32)、Phe(RD_33)、Ala(RD_34)、Gln(RD_35)、Tyr(RD_36)、Leu(RD_38)、His(RD_42)、Glu(RD_45)、或Cys(RD_46)。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Trp的序列如SEQ ID NO:26所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Thr的序列如SEQ ID NO:27所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Asp的序列如SEQ ID NO:28所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Asn的序列如SEQ ID NO:29所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Arg的序列如SEQ ID NO:30所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Val的序列如SEQ ID NO:31所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Phe的序列如SEQ ID NO:32所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:33所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Gln的序列如SEQ ID NO:34所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Tyr的序列如SEQ ID NO:35所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Leu的序列如SEQ ID NO:36所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為His的序列如SEQ ID NO:37所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Glu的序列如SEQ ID NO:38所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Cys的序列如SEQ ID NO:39所示。
(b)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR1，其中位於SEQ ID NO:1(HCDR1)之胺基酸序列位置5的Trp已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，取代較佳為Ile(RD_9)或Val(RD_30)。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置5的Trp被取代為Ile的序列如SEQ ID NO:40所示。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置5的Trp被取代為Val的序列如SEQ ID NO:41所示。
(c)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR2，其中位於SEQ ID NO:2(HCDR2)之胺基酸序列位置1的Tyr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Phe(RD_82)。
由SEQ ID NO:2胺基酸序列位置1的Tyr被取代為Phe的序列如SEQ ID NO:42所示。
(d)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR2，其中位於SEQ ID NO:2(HCDR2)之胺基酸序列位置8的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Arg(RD_79)。
由SEQ ID NO:2胺基酸序列位置8的Thr被取代為Arg的序列如SEQ ID NO:43所示。
(e)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR2，其中位於SEQ ID NO:2(HCDR2)之胺基酸序列位置9的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Ser(RD_12)或Asn(RD_61)。
由SEQ ID NO:2胺基酸序列位置9的Thr被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:44所示。
由SEQ ID NO:2胺基酸序列位置9的Thr被取代為Asn的序列如SEQ ID NO:45所示。
(f)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Ile(RD_2)、Val(RD_4)、Thr(RD_80)或Leu(RD_5)。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Ile的序列如SEQ ID NO:46所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Val的序列如SEQ ID NO:47所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Thr的序列如SEQ ID NO:48所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Leu的序列如SEQ ID NO:49所示。
(g)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置2的Leu已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Thr(RD_84)。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置2的Leu被取代為Thr的序列如SEQ ID NO:50所示。
(h)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置5的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Ala(RD-3)或Ile(RD-83)。此外，位置5的Thr較佳亦被取代為Ser(RDC_14H)。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置5的Thr被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:51所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置5的Thr被取代為Ile的序列如SEQ ID NO:52所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置5的Thr被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:53所示。
(i)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置7的Ala已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Ser(RD_81)或Val(PF_3H)。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置7的Ala被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:54所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置7的Ala被取代為Val的序列如SEQ ID NO:55所示。
(j)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置8的Met已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Leu(PF_4H)。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置8的Met被取代為Leu的序列如SEQ ID NO:56所示。
(k)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置1的Ser與位置5的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係以Leu取代位置1的Ser以及Ala取代位置5的Thr(RD_6)。其他較佳的取代包括：以Val取代位置1的Ser與Ala取代位置5的Thr(RDC_2H)、以Ile取代位置1的Ser與Ala取代位置5的Thr(RDC_3H)、以Thr取代位置1的Ser與Ala取代位置5的Thr(RDC_4H)、以Val取代位置1的Ser與Ile取代位置5的Thr(RDC_5H)、以Ile取代位置1的Ser與Ile取代位置5的Thr(RDC_6H)、以Thr取代位置1的Ser與Ile取代位置5的Thr(RDC_7H)、以及以Leu取代位置1的Ser與Ile取代位置5的Thr(RDC_8H)。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Leu以及位置5的Thr被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:57所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Val以及位置5的Thr被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:58所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Ile以及位置5的Thr被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:59所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Thr以及位置5的Thr被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:60所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Val以及位置5的Thr被取代為Ile的序列如SEQ ID NO:61所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為I1e以及位置5的Thr被取代為I1e的序列如SEQ ID NO:62所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Thr以及位置5的Thr被取代為I1e的序列如SEQ ID NO:63所示。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置1的Ser被取代為Leu以及位置5的Thr被取代為I1e的序列如SEQ ID NO:64所示。
(1)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置2的Leu、位置7的Ala、與位置8的Met已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係以Thr取代位置2的Leu、以Val取代位置7的Ala、以及以Leu取代位置8的Met(RD_78)。
由SEQ ID NO:3胺基酸序列位置2的Leu被取代為Thr、位置7的Ala被取代為Val、以及位置8的Met被取代為Leu的序列如SEQ ID NO:65所示。
(m)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR1，其中位於SEQ ID NO:4(LCDR1)之胺基酸序列位置1的Arg已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，取代較佳為Phe(RD_18)。
由SEQ ID NO:4胺基酸序列位置1的Arg被取代為Phe的序列如SEQ ID NO:66所示。
(n)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR1，其中位於SEQ ID NO:4(LCDR1)之胺基酸序列位置4的Gln已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，取代較佳為Arg(RD_26)或Thr(RD_20)。
由SEQ ID NO:4胺基酸序列位置4的Gln被取代為Arg的序列如SEQ ID NO:67所示。
由SEQ ID NO:4胺基酸序列位置4的Gln被取代為Thr的序列如SEQ ID NO:68所示。
(o)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR1，其中位於SEQ ID NO:4(LCDR1)之胺基酸序列位置9的Tyr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Phe(RD_73)。
由SEQ ID NO:4胺基酸序列位置9的Tyr被取代為Phe的序列如SEQ ID NO:69所示。
(p)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR1，其中位於SEQ ID NO:4(LCDR1)之胺基酸序列位置11的Asn已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Ser(RD_27)。
由SEQ ID NO:4胺基酸序列位置11的Asn被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:70所示。
(q)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR2，其中位於SEQ ID NO:5(LCDR2)之胺基酸序列位置2的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Gly。
由SEQ ID NO:5胺基酸序列位置2的Thr被取代為Gly的序列如SEQ ID NO:71所示。
(r)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列位置1的Gln已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係被取代為Gly(RD_28)、Asn(RD_29)、或Ser(RDC_15L)。
由SEQ ID NO:6胺基酸序列位置1的Gln被取代為Gly的序列如SEQ ID NO:72所示。
由SEQ ID NO:6胺基酸序列位置1的Gln被取代為Asn的序列如SEQ ID NO:73所示。
由SEQ ID NO:6胺基酸序列位置1的Gln被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:74所示。
(s)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:6之胺基酸序列位置3的Gly已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係取代為Ser。
由SEQ ID NO:6胺基酸序列位置3的Gly被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:75所示。
(t)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR1，其中位於SEQ ID NO:4(LCDR1)之胺基酸序列位置9的Tyr已被其他胺基酸取代，以及一輕鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列位置3的Gly已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，位於SEQ ID NO:4(LCDR1)之胺基酸序列位置9的Tyr較佳地係被Phe所取代，而位於SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列位置3的Gly較佳地係被Ser所取代(RD_72)。
(u)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列位置5的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係被取代為Arg(RD_23)或Ser。
由SEQ ID NO:6胺基酸序列位置5的Thr被取代為Arg的序列如SEQ ID NO:76所示。
由SEQ ID NO:6胺基酸序列位置5的Thr被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:77所示。
(v)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一輕鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列位置1的Gln與位置5的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，較佳係以Gly取代位置1的Gln，而以Ser取代位置5的Thr(RD_22)。其他較佳的取代包括以Gly取代位置1的Gln，而以Arg取代位置5的Thr(RDC_11L)。
由SEQ ID NO：6胺基酸序列位置1的Gln被取代為Gly，且位置5的Thr被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:78所示。
由SEQ ID NO:6胺基酸序列位置1的Gln被取代為Gly，且位置5的Thr被取代為Arg的序列如SEQ ID NO:79所示。
(w)一種抗人類IL-6受體的抗體，具有一重鏈CDR2，其中位於SEQ ID NO:2(HCDR2)之胺基酸序列位置9的Thr已被其他胺基酸取代，以及一重鏈CDR3，其中位於SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置1的Ser與位置5的Thr已被其他胺基酸取代。
位於SEQ ID NO:2(HCDR2)之胺基酸序列位置9的Thr較佳地係被Asn所替換。此外，較佳的取代SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列位置1的Ser與位置5的Thr之胺基酸組合包括；Leu與Ala(RDC_27H)、Val與Ala(RDC_28H)、Ile與Ala(RDC_30H)、Thr與Ala(RDC_4H)、Val與Ile(RDC_29H)、Ile與Ile(RDC_32H)、Thr與Ile(RDC_7H)、以及Leu與Ile(RDC_8H)。
(x)一種抗體，包括具有(k)的重鏈CDR3之變異區以及具有(v)的輕鏈CDR3之變異區。
(y)一種(x)的抗體，其更包括(e)的重鏈CDR2。
本發明提供包括至少一種前述(a)至(y)任意一種之胺基酸取代的抗體，及製造該抗體的方法。因此，本發明之抗體亦可包括除了前述(a)至(y)任意一種之胺基酸取代的其他胺基酸取代。此外，本發明之抗體亦包括前述(a)至(y)任意一種胺基酸取代的組合。前述(a)至(y)任意一種胺基酸取代包括對前述其他胺基酸之胺基酸CDR序列的取代。胺基酸取代除了前述(a)至(y)，包括，例如在其他CDR區域之胺基酸序列的取代、刪除、添加、及/或嵌入。這些取代亦包括在FR區域之胺基酸序列的取代、刪除、添加、及/或嵌入。這些取代更包括在恆定區域之取代、刪除、添加、及/或嵌入。
此外，本發明之抗體亦包括將本發明發現之高親和性CDR接枝於除了人類化PM-1抗體之任何骨架的抗體。本發明之抗體亦包括其親和性的減少係將本發明所發現之高親和性CDR接枝於除了人類化PM-1抗體之任何骨架而抵銷導入骨架區域之突變以回復原先親和性的抗體(請參照，例如Curr. Opin. Biotechnol. 1994 Aug;5(4):428-33)，以及其親和性的減少被導入CDR區域以回復原先親和性之突變所抵銷的抗體(請參照，例如美國專利申請號US 2006/0122377)。
在本發明中，前述(a)至(y)之任一種的胺基酸取代較佳地被導入人類化的PM-1抗體。被導入前述(a)至(y)之任一種的胺基酸取代之人類化PM-1抗體具有強力的IL-6受體中和活性。被導入前述(a)至(y)之任一種的胺基酸取代之人類化PM-1抗體作為藥物對於IL-6相關的發炎反應，例如風濕性關節炎有效果。
具有前述(a)至(y)之任一種的胺基酸取代之抗體較佳地可如下(1)或(2)所述。具有(a)的取代之抗體的例子係如此處所述；具有(b)至(y)之任一種取代之其他抗體亦可由相同方式所示。
(1)一種抗體，包括重鏈變異區具有CDR1胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:1之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代。
(2)一種抗體，包括H鏈具有CDR1胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:1之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代。
<具有增強的結合活性之抗體>
本發明更提供一種具有強力IL-6受體結合活性之抗IL-6受體的抗體。在此，“具有強力IL-6受體結合活性之抗IL-6受體的抗體(anti-IL-6 receptor antibodies with strong IL-6 receptor-binding activity)”典型地係指抗體，其親和性被測量為1nM或以下，於37℃在生理條件，較佳為0.1nM或以下，更佳為0.04nM或以下。這類具有強力IL-96受體結合活性之抗IL-6受體的抗體被認為具有增強的中和抗原生物活性的活性。
對於導入本發明具有強力IL-6受體結合活性之抗IL-6受體的抗體之胺基酸取代的類型並無限制。這類胺基酸取代包括，例如，前述的胺基酸取代。
IL-6受體的類型並未特定被限制；然而，較佳為人類的IL-6受體。
結合活性可以經由熟悉技藝人士習知的方法決定，例如，利用以表面電漿共振(surface plasmon resonance,SPR)為基礎之Biacore法(BIACORE)或類似方法。
<具有降低的免疫原性風險之CDR序列的抗體>
本發明亦提供具有降低的免疫原性之抗IL-6受體的抗體，特別是，人類化的PM-1抗體。免疫原性認為會被增強，當抗體的序列具有與HLA結合的T細胞抗原決定位時。因此，抗體的免疫原性可以被降低，透過序列取代以去除抗體序列之T細胞抗原決定位。
本發明提供具有降低的免疫原性之人類化的抗人類IL-6受體的抗體之輕鏈變異區，尤其是那些人類化的PM-1抗體，其T細胞抗原決定位經由取代胺基酸序列，特別是CDR序列之其他胺基酸而被去除。本發明亦提供具有此類輕鏈變異區之抗體。
更特別地，本發明提供輕鏈CDR2，其中位於SEQ ID NO:5(LCDR2)之胺基酸序列位置2的Thr已被其他胺基酸取代。本發明亦提供具有此類輕鏈CDR2之輕鏈變異區。本發明亦提供具有此輕鏈變異區之抗IL-6受體的抗體。取代後的胺基酸序列並無特殊限制；然而，取代為Gly是較佳的。具有SEQ ID NO:5胺基酸序列位置2的Thr被取代為Gly的序列，如SEQ ID NO:71所示。胺基酸取代較佳地被導入人類化PM-1抗體的輕鏈變異區。
<H53/L28的FR與CDR>
本發明亦提供具有改善的血清藥物動力學、增加的穩定性、及/或降低的免疫原性之抗人類IL-6受體的抗體。具有相同Fc功能區塊之IgG在血清的半衰期被發現與等電點為高相關係數之正相關。於是，本發明之發明人嘗試改變對應不同抗原之二個抗體變異區的等電點，並成功地控制其在血清的半衰期，不論其抗原形式為何而不改變Fc功能區塊。內皮細胞非專一性攝入抗體的速率被假設與IgG及負電性的細胞表面之理化庫倫交互作用(physicochemical Coulomb interaction)有關。降低IgG的等電點可恢復庫倫交互作用，其降低內皮細胞的非專一性攝入作用，而結果為內皮細胞的代謝作用被降低。這可延長在血清的滯留度。
特別地，本發明提供具有降低的等電點以及改善的血清滯留度之抗人類IL-6受體的抗體，經由取代抗I-6受體的抗體，尤其是人類化的PM-1抗體之胺基酸序列的胺基酸。特別地，人類化的PM-1抗體被修改以降低其等電點，經由取代其他胺基酸於H13(位於SEQ ID NO:7位置13的胺基酸)、H16(位於SEQ ID NO:7位置16的胺基酸)、H43(位於SEQ ID NO:8位置8的胺基酸)、H81(位於SEQ ID NO：9位置16的胺基酸)、H105(位於SEQ ID NO:10位置3的胺基酸)、L18(位於SEQ ID NO:11位置18的胺基酸)、L45(位於SEQ ID NO:12位置11的胺基酸)、L79(位於SEQ ID NO:13位置23的胺基酸)、L107(位於SEQ ID NO:14位置10的胺基酸)、H31(位於SEQ IDN0:1位置1的胺基酸)、L24(位於SEQ ID N0:4位置1的胺基酸)、及/或L53(位於SEQ ID N0:5位置4的胺基酸)，其位置係依據Kabat氏編碼系統所編號(Kabat EA等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)。這些取代可以減低人類化PM-1抗體的等電點而不影響其結合活性與穩定性。有些源自小鼠序列而保持在人類化PM-1抗體未被取代之胺基酸殘基維持其結合活性，即使在小鼠序列之人類化作用後。更特別地，在人類化PM-1抗體之胺基酸H27(位於SEQ ID NO:7位置27的胺基酸)、H28位於SEQ ID NO:7位置28的胺基酸)、H29(位於SEQ ID NO:7位置29的胺基酸)、H30(位於SEQ ID NO:7位置30的胺基酸)、以及H71(位置係如前述Kabat氏編碼系統所編號)是小鼠的序列。HFR1可以被轉換為人類序列經由取代H13、H16、H23、以及H30，其可產生免疫原性風險小於人類化PM-1抗體之抗體。此外，既然人類化PM-1抗體係為經由CDR剪接而進行人類化的，其穩定性可能被進一步地改善。抗體可以被穩定化，例如，經由以親水性胺基酸取代暴露於抗體變異區表面之胺基酸殘基。可選擇地，抗體亦可以被穩定化，經由以Ile取代H69的Met(位於SEQ ID NO:9位置4的胺基酸)(斥水性核心的穩定化)、以Ser取代H70的Leu(位於SEQ ID NO:9位置5的胺基酸)(暴露於表面殘基成為親水性殘基的轉換)、以Asn取代H58的Thr(位於SEQ ID NO:2位置9的胺基酸)(重鏈CDR2成為通用序列(consensus sequence)的改變)、以Gly取代H65的Ser(位於SEQ ID NO:2位置16的胺基酸)(位於轉彎區之Gly的取代及重鏈CDR2成為通用序列的改變)、或以Ser取代L93的Thr(位於SEQ ID NO:6位置5的胺基酸)(暴露於表面殘基成為親水性殘基的轉換)(位置係依據前述Kabat氏編碼系統所編號)。可選擇地，前述電腦預估的T細胞抗原決定位可以被移除，經由以Gly取代LCDR2(SEQ ID NO:5)位置2之L51的Thr，這可以降低免疫原性風險而不影響結合活性與穩定性。具有改善的穩定性與血清抗體動力學特性、以及降低的免疫原性之抗IL-6受體的抗體可以被得到，經由使用這些胺基酸取代組合。
這類抗體包括，例如，下述(1)至(37)的抗體。
(1)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置13的Arg已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Lys是較佳的。
由SEQ ID NO:7胺基酸序列位置13的Arg被取代為Lys的序列如SEQ ID NO:80所示。
(2)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置16的Gln已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Glu是較佳的。
白SEQ ID NO:7胺基酸序列位置16的Gln被取代為Glu的序列如SEQ ID NO:81所示。
(3)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置23的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ala是較佳的。
由SEQ ID NO:7胺基酸序列位置23的Thr被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:82所示。
(4)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置30的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ser是較佳的。
由SEQ ID NO:7胺基酸序列位置30的Thr被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:83所示。
(5)一抗體，包括具有FR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:7之胺基酸序列位置13的Arg、位置16的Gln、位置23的Thr、以及位置30的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，較佳係以Lys取代位置13的Arg、以Glu取代位置16的Gln、以Ala取代位置23的Thr、以及Ser取代位置30的Thr。
由SEQ ID NO:7胺基酸序列以Lys取代位置13的Arg、以Glu取代位置16的Gln、以Ala取代位置23的Thr、以及Ser取代位置30的Thr之序列如SEQ ID NO:84所示。
(6)一抗體，包括具有FR2的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:8之胺基酸序列位置8的Arg已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Glu是較佳的。
由SEQ ID NO:8胺基酸序列位置8的Arg被取代為G1u的序列如SEQ ID NO:85所示。
(7)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置4的Met已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ile是較佳的。
由SEQ ID NO:9胺基酸序列位置4的Met被取代為Ile的序列如SEQ ID NO:86所示。
(8)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置5的Leu已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ser是較佳的。
由SEQ ID NO:9胺基酸序列位置5的Leu被取代為Ser的序列如SEQ ID NO:87所示。
(9)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置16的Arg已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Lys是較佳的。
由SEQ ID NO:9胺基酸序列位置16的Arg被取代為Lys的序列如SEQ ID NO:88所示。
(10)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9之胺基酸序列位置27的Val已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ala是較佳的。
由SEQ ID NO:9胺基酸序列位置27的Val被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:89所示。
(11)一抗體，包括具有FR3的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:9(HFR3)之胺基酸序列位置4的Met、位置5的Leu、位置16的Arg、以及位置27的Val已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，以Ile取代位置4的Met、Ser取代位置5的Leu、Lys取代位置16的Arg、以及Ala取代位置27的Val是較佳的。
由SEQ ID NO:9胺基酸序列以Ile取代位置4的Met、Ser取代位置5的Leu、Lys取代位置16的Arg、以及Ala取代位置27的Val之序列如SEQ ID NO:90所示。
(12)一抗體，包括具有FR4的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:10(HFR4)之胺基酸序列位置3的Gln已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為G1u是較佳的。
由SEQ ID NO：10胺基酸序列位置3的G1n被取代為G1u的序列如SEQ ID N0：91所示。
(13)一抗體，包括具有FR1的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO：11(LFR1)之胺基酸序列位置18的Arg已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ser是較佳的。
由SEQ ID NO：11胺基酸序列位置18的Arg被取代為Ser的序列如SEQ ID NO：92所示。
(14)一抗體，包括具有FR2的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO：12(LFR2)之胺基酸序列位置11的 Lys已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為G1u是較佳的。
由SEQ ID NO：12胺基酸序列位置11的Lys被取代為G1u的序列如SEQ ID NO：93所示。
(15)一抗體，包括具有FR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO：13之胺基酸序列位置23的G1n已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為G1u是較佳的。
由SEQ ID NO:13胺基酸序列位置23的Gln被取代為Glu的序列如SEQ ID NO:94所示。
(16)一抗體，包括具有FR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:13之胺基酸序列位置24的Pro已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ala是較佳的。
由SEQ ID NO:13胺基酸序列位置24的Pro被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:95所示。
(17)一抗體，包括具有FR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:13之胺基酸序列位置27的Ile已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ala是較佳的。
由SEQ ID NO:13胺基酸序列位置27的Ile被取代為Ala的序列如SEQ ID NO:96所示。
(18)一抗體，包括具有FR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:13(LFR3)之胺基酸序列位置23的Gln，位置24的Pro、以及位置27的Ile已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，以Glu取代位置23的Gln、Ala取代位置24的Pro、以及Ala取代位置27的Ile是較佳的。
由SEQ ID NO:13胺基酸序列以Glu取代位置23的Gln、Ala取代位置24的Pro、以及Ala取代位置27的Ile之序列如SEQ ID NO:97所示。
(19)一抗體，包括具有FR4的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:14(LFR4)之胺基酸序列位置10的Lys已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Glu是較佳的。
由SEQ ID NO:14胺基酸序列位置10的Lys被取代為Glu的序列如SEQ ID NO:98所示。
(20)一抗體，包括具有FR4的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:10(HFR4)之胺基酸序列位置5的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Thr是較佳的。
由SEQ ID NO:10胺基酸序列位置5的Ser被取代為Thr的序列如SEQ ID NO:132所示。
(21)一抗體，包括具有FR4的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:10(HFR4)之胺基酸序列位置3的Gln、以及位置5的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，以Glu取代位置3的Gln、及Thr取代位置5的Ser是較佳的。
由SEQ ID NO:10胺基酸序列以Glu取代位置3的Gln、及Thr取代位置5的Ser之序列如SEQ ID NO:133所示。
(22)一抗體，其具有人類化PM-1抗體之重鏈變異區，包括(5)、(6)、(11)以及(21)的胺基酸取代。
(23)一抗體，其具有人類化PM-1抗體之輕鏈變異區，包括(13)、(14)、(18)以及(19)的胺基酸取代。
(24)一抗體，其具有(22)的重鏈變異區以及(23)的輕鏈變異區。
(25)一抗體，包括具有CDR1的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:1(HCDR1)之胺基酸序列位置1的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Asp是較佳的。
由SEQ ID NO:1胺基酸序列位置1的Ser被取代為Asp的序列如SEQ ID NO:28所示。
(26)一抗體，包括具有CDR2的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置16的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Gly是較佳的。
由SEQ ID NO:2胺基酸序列位置16的Ser被取代為Gly的序列如SEQ ID NO:99所示。
(27)一抗體，包括具有CDR2的重鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:2(HCDR2)之胺基酸序列位置9的Thr、以及位置16的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，以Asn取代位置9的Thr、及Gly取代位置16的Ser是較佳的。
由SEQ ID NO：2胺基酸序列以Asn取代位置9的Thr、及Gly取代位置16的Ser之序列如SEQ ID NO:100所示。
(28)一抗體，包括具有CDR1的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:4(LCDR1)之胺基酸序列位置1的Arg已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Gln是較佳的。
由SEQ ID NO:4胺基酸序列位置1的Arg被取代為Gln的序列如SEQ ID NO:101所示。
(29)一抗體，包括具有CDR2的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:5之胺基酸序列位置4的Arg已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Glu是較佳的。
由SEQ ID NO:5胺基酸序列位置4的Arg被取代為Glu的序列如SEQ ID NO:102所示。
(30)一抗體，包括具有CDR2的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:5(LCDR2)之胺基酸序列位置2的Thr、以及位置4的Arg已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，以Gly取代位置2的Thr、Glu取代位置4的Arg是較佳的。
由SEQ ID NO:5胺基酸序列以Gly取代位置2的Thr、Glu取代位置4的Arg之序列如SEQ ID NO:103所示。
(31)一抗體，包括具有CDR3的輕鏈變異區，其中位於SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列位置5的Thr已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ser是較佳的。
由SEQ ID NO：6胺基酸序列位置5的Thr被取代為Ser的序列如SEQ ID NO：77所示。
(32)一抗體，其具有重鏈變異區，包括(25)與(27)的胺基酸取代。
(33)一抗體，其具有輕鏈變異區，包括(28)、(30)以及(31)的胺基酸取代。
(34)一抗體，其具有(32)的重鏈變異區以及(33)的輕鏈變異區。
(35)一抗體，其包括具有SEQ ID NO：104(H53/L28的VH)胺基酸序列之重鏈變異區。
(36)一抗體，其包括具有SEQ ID NO：105(H53/L28的VL)之輕鏈變異區。
(37)一抗體，其具有(35)的重鏈變異區以及(36)的輕鏈變異區。
前述(1)至(37)之任一種胺基酸取代較佳地係導入人類化的PM-1抗體。本發明提供包括前述(1)至(37)任一種之至少一種的胺基酸取代的抗體以及製造那些抗體的方法。因此，本發明之抗體亦包括具有除了前述(1)至(37)任一種胺基酸取代以外之其他胺基酸取代的抗體。本發明之抗體亦包括具有前述(1)至(37)多重胺基酸取代之組合抗體。前述(1)至(37)的胺基酸取代包括，例如，前述FR與CDR胺基酸序列的取代。前述(1)至(37)以外的胺基酸取代包括在前述那些以外之FR與CDR序列的其他取代、刪除、添加、及/或嵌入。胺基酸取代亦包括在恆定區的胺基酸序列之取代、刪除、添加、及/或嵌入。
此外，除了前述那些，導致不失損抗IL-6受體的抗體活性之較低等電點的胺基酸變化包括，例如，位於SEQ ID NO:2之胺基酸序列位置15的Lys及/或位置16的Ser被其他胺基酸取代。取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Gln取代位置15的Lys、及Asp取代位置16的Ser是較佳的。包括以Gln取代位置15的Lys、及Asp取代位置16的Ser之SEQ ID NO:2胺基酸序列係如SEQ ID NO:121所示。可選擇地，這類胺基酸取代可能也被導入SEQ ID NO:100的胺基酸序列。包括以Gln取代位置15的Lys、及Asp取代位置16的Ser之SEQ ID NO:100胺基酸序列係如SEQ ID NO:122所示。因此，本發明提供具有CDR2的重鏈變異區之抗體，其中位於SEQ ID NO:2或100之胺基酸序列位置15的Lys及/或位置16的Ser被其他胺基酸取代。
其他導致較低等電點之變化包括位於SEQ ID NO:4之胺基酸序列位置4的Gln被其他胺基酸取代。取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Glu是較佳的。具有以Glu取代SEQ ID NO:4胺基酸序列位置4的Gln之序列係如SEQ ID NO:123所示。可選擇地，這個胺基酸取代也可能被導入SEQ ID NO:101的胺基酸序列。具有以Glu取代SEQ ID NO:101胺基酸序列位置4的Gln之序列係，如SEQ ID NO:124所示。因此，本發明提供具有CDR1的輕鏈變異區之抗體，其中位於SEQ ID NO:4或101之胺基酸序列位置4的Gln已被其他胺基酸取代。
其他導致較低等電點之變化包括位於SEQ ID NO:5之胺基酸序列位置6的His被其他胺基酸取代。取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Glu是較佳的。具有以Glu取代SEQ ID NO:5胺基酸序列位置6的His之序列係如SEQ ID NO:125所示。可選擇地，這個胺基酸取代也可能被導入SEQ ID NO:103的胺基酸序列。具有以Glu取代SEQ ID NO:103胺基酸序列位置6的His之序列係如SEQ ID NO:126所示。因此，本發明提供具有CDR2的輕鏈變異區之抗體，其中位於SEQ ID NO:5或103之胺基酸序列位置6的His已被其他胺基酸取代。
此外，造成降低免疫原性風險之變化包括位於SEQ IDNO:90之胺基酸序列重鏈FR3之位置27(Kabat氏編碼系統為H89)的Ala被Val取代。具有以Val取代SEQ ID NO:90之胺基酸序列重鏈FR3之位置27的Ala之序列係如SEQ ID NO:127所示。因此，本發明提供具有FR3的重鏈變異區之抗體，其中Val取代SEQ ID NO:90之胺基酸序列位置27的Ala。
仍維持於SEQ ID NO:9與90之重鏈FR3胺基酸序列的唯一小鼠序列是位置6的Arg(Kabat氏編碼系統為H71)。具有完整人類序列所組成之骨架的抗人類IL-6受體抗體可以被製造，藉由使用FR3序列，該序列為人類VH1次群組(SEQ ID NO：128)或人類VH3次群組(SEQ ID NO：129)的人類序列，而Arg在H71為保留的。因此，本發明提供包括具有SEQ ID NO：128或129之FR3重鏈變異區之抗體。
此外，改善穩定性的變化包括位於SEQ ID NO：10重鏈FR4胺基酸序列位置5(Kabat氏編碼系統H107)的I1e取代Ser。具有以IIe取代SEQ ID NO：10之胺基酸序列位置5的Ser之序列，係如SEQ ID NO：130所示。可選擇地，這個胺基酸序列亦可能被導入SEQ ID NO：91的胺基酸序列。具有以I1e取代SEQ ID NO：91之胺基酸序列位置5的Ser之序列，係如SEQ ID NO：131所示。因此，本發明提供包括具有FR4重鏈變異區之抗體，其中Ile取代SEQ ID NO：10或91之胺基酸序列位置5的Ser。
這類胺基酸取代較佳地被導入人類化PM-1抗體、H53/L28(具有SEQ ID NO：104的重鏈變異區以及SEQ ID NO：105的輕鏈變異區之抗體)、或PF1抗體(具有SEQ ID NO：22的重鏈變異區以及SEQ ID NO：23的輕鏈變異區之抗體)。本發明提供具有至少一種此類胺基酸取代的抗體以及製造該抗體的方法。因此，本發明之抗體包括除了這類胺基酸取代，具有前述(1)至(37)任一種胺基酸取代及/或除了前述(1)至(37)胺基酸取代之其他胺基酸取代的抗體。前述(1)至(37)以外之其他胺基酸取代包括前述那些以外在FR與CDR序列之其他取代、刪除、添加、及/或嵌入。胺基酸取代亦包括在恆定區的胺基酸序列之取代、刪除、添加、及/或嵌入。
<具有低等電點之抗人類IL-6受體的抗體>
本發明亦提供具有低等電點之抗IL-6受體的抗體。本發明之具有低等電點的抗體包括整個抗體被測量之等電點低的抗體，以及變異區(VH/VL)之理論值等電點低的抗體。
在此，“整個抗體被測量低等電點之抗IL-6受體的抗體”典型地係指抗體，其被測量的等電點為7.5或以下、較佳為7.0或以下、以及更佳為6.0或以下。測量的等電點可以被決定，經由熟悉技藝人士已知的方法，例如，非變性凝膠等電性聚焦法(non-denaturation gel isoelectric focusing)或毛細管等電性聚焦法。
在此，“變異區理論值等電點低之抗IL-6受體的抗體”典型地係指抗體，其理論值等電點為5.5或以下、較佳為5.0或以下、以及更佳為4.0或以下。理論值等電點可以被決定，經由熟悉技藝人士已知的方法。例如，變異區之VH與VL的理論值等電點可利用軟體，例如GENETYX(GENETYX公司)而計算。
對於被導入以得到本發明具有低等電點之抗IL-6受體的抗體之胺基酸取代的類型並無限制。這類胺基酸取代包括，例如，前述的胺基酸取代。此類具有低等電點之抗IL-6受體的抗體被認為在血清表現被延長的滯留度。
IL-6受體的類型並無特殊限制；然而，人類IL-6受體是較佳的。
<在高濃度穩定之抗人類IL-6受體的抗體>
此外，本發明提供在高濃度穩定之抗人類IL-6受體的抗體。
在此，“在高濃度穩定”係指抗IL-6受體的抗體聚集的部分(凝膠過濾層析法的峰值面積/凝膠過濾層析法的總峰值面積x100)在高濃度抗體溶液(100毫克/毫升(mg/ml))於25℃、1個月所產生量為0.3%或以下、較佳為0.2%或以下、以及更佳為0.1%或以下，當抗體於適合皮下注射之pH 6.5至7.0的緩衝液之內，例如20mM組胺酸-鹽酸(histidine-HCl)、150mM氯化鈉(NaCl)。抗IL-6受體的抗體之濃度可為100毫克/毫升或更高，例如200或300毫克/毫升。
對於本發明之高濃度穩定抗IL-6受體的抗體並無限制。該抗體可以被製備，例如，以前述胺基酸取代或類似的方法。
IL-6受體的類型並無特殊限制；然而，人類IL-6受體是較佳的。
本發明亦提供人類化PM-1抗體，包括任一種前述(1)至(37)胺基酸取代，並進一步包括任一種前述(a)至(y)的胺基酸取代，以改善其結合活性及/或中和活性。在一實施例中，這類抗體包括那些具有重鏈變異區包含SEQ ID NO:22(PF1_H)胺基酸序列以及輕鏈變異區包含SEQ ID NO:23(PF1_L)(PF1)胺基酸序列，但不以此為限。
此外，本發明提供下列任何一種抗IL_6受體的抗體；(A)一重鏈變異區，包括具有SEQ ID NO:165(VH5_M83的CDR1)胺基酸序列之CDR1、具有SEQ ID NO:166(VH5_M83的CDR2)胺基酸序列之CDR2、以及具有SEQ ID NO:167(VH5_M83的CDR3)胺基酸序列之CDR3；(B)一輕鏈變異區，包括具有SEQ ID NO:101(VL5的CDR1)胺基酸序列之CDR1、具有SEQ ID NO:168(VL5的CDR2)胺基酸序列之CDR2、以及具有SEQIDNO:79(VL5的CDR3)胺基酸序列之CDR3；(C)一抗體，其具有(A)的重鏈變異區以及(B)的輕鏈變異區；(D)一重鏈變異區，包括具有SEQ ID NO:169(VH3_M73的CDR1)胺基酸序列之CDR1、具有SEQ ID NO:17O(VH3_M73的CDR2)胺基酸序列之CDR2、以及具有SEQ ID NO:171(VH3_M73的CDR3)胺基酸序列之CDR3；(E)一輕鏈變異區，包括具有SEQ ID NO:172(VL3的CDR1)胺基酸序列之CDR1、具有SEQ ID NO:173(VL3的CDR2)胺基酸序列之CDR2、以及具有SEQ ID NO:79(VL3的CDR3)胺基酸序列之CDR3；(F)一抗體，其具有(D)的重鏈變異區以及(E)的輕鏈變異區；(G)一重鏈變異區，包括具有SEQ ID NO:169(VH4_M73的CDR1)胺基酸序列之CDR1、具有SEQ ID NO:174(VH4_M73的CDR2)胺基酸序列之CDR2、以及具有SEQ ID NO:171(VH4-M73的CDR3)胺基酸序列之CDR3；(H)一輕鏈變異區，包括具有SEQ ID NO:175(VL1的CDR1)胺基酸序列之CDR1、具有SEQ ID NO:173(VL1的CDR2)胺基酸序列之CDR2、以及具有SEQ ID NO:79(VL1的CDR3)胺基酸序列之CDR3；以及(I)一抗體，其具有(G)的重鏈變異區以及(H)的輕鏈變異區。
此外，本發明提供下列任何一種抗IL-6受體的抗體；(a)一抗體，包括具有SEQ ID NO:159(H96-IgG1變異區)胺基酸序列之重鏈變異區；(b)一抗體，包括重鏈變異區，其胺基酸序列中位於SEQ ID NO:159(H96-IgG1變異區)胺基酸序列位置35的Trp、位置51的Tyr、位置63的Ser、位置65的Lys、位置66的Gly、位置99的Val、位置103的Ile、位置108的Tyr、位置111的Glu、以及位置113的Thr之至少一種胺基酸已被其他胺基酸取代；(c)一抗體，包括重鏈變異區，其胺基酸序列中位於SEQ ID NO:159(H96-IgG1變異區)胺基酸序列位置65的Lys、位置66的Gly、位置99的Val、位置103的Ile、位置108的Tyr、位置111的Glu、以及位置113的Thr已被其他胺基酸取代；(d)一抗體，包括重鏈變異區，其胺基酸序列中位於SEQ ID NO:159(H96-IgG1變異區)胺基酸序列位置35的Trp、位置51的Tyr、位置63的Ser、位置65的Lys、位置66的Gly、位置99的Val、位置103的Ile、位置108的Tyr、位置111的Glu、以及位置113的Thr已被其他胺基酸取代；(e)一抗體，包括具有SEQ ID NO:160(F2H-IgGl變異區)胺基酸序列之重鏈變異區；(f)一抗體，包括具有SEQ ID NO:161(VH5-M83變異區)胺基酸序列之重鏈變異區；(g)一抗體，包括輕鏈變異區，具有胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:23(PF1L)位置27的Gln及/或位置55的His已被其他胺基酸取代；(h)一抗體，包括具有SEQ ID NO:162(L39變異區)胺基酸序列之輕鏈變異區；(i)一抗體，包括具有SEQ ID NO:163(VL5-kappa變異區)胺基酸序列之輕鏈變異區；(j)一抗體，包括具有SEQ ID NO:176(VH3-M73變異區)胺基酸序列之重鏈變異區；(k)一抗體，包括具有SEQ ID NO:178(VH4-M73變異區)胺基酸序列之重鏈變異區；(1)一抗體，包括具有SEQ ID NO:177(VL3-kappa變異區)胺基酸序列之輕鏈變異區；(m)一抗體，包括具有SEQ ID NO:179(VL1-kappa變異區)胺基酸序列之輕鏈變異區；(n)一抗體，包括(e)的重鏈變異區以及(h)的輕鏈變異區；(o)一抗體，包括(f)的重鏈變異區以及(i)的輕鏈變異區(FV5-M83變異區的組合)；(p)一抗體，包括(j)的重鏈變異區以及(l)的輕鏈變異區(FV4-M73變異區的組合)；以及(q)一抗體，包括(k)的重鏈變異區以及(m)的輕鏈變異區(FV3-M73變異區的組合)。
在前述(a)至(d)的重鏈變異區之胺基酸取代的取代後胺基酸類型並無特別限制；然而，以Val取代位置35的Trp、Phe取代位置51的Tyr、Thr取代位置63的Ser、Gln取代位置65的Lys、Asp取代位置66的Gly、Leu取代位置99的Val、Ala取代位置103的Ile、Val取代位置108的Tyr、Gln取代位置111的Glu、Ile取代位置113的Thr是較佳的。可選擇地，在前述(g)的輕鏈變異區之胺基酸取代的取代後胺基酸類型並無特別限制；然而，以Glu取代位置27的Gln、以及Glu取代位置55的His是較佳的。除了前述胺基酸取代的胺基酸取代、刪除、嵌入及/或增加可以被包括。
本發明之抗體恆定區並無特殊限制，任何恆定區可以被使用。例如，恆定區包括中性序列，如IgG1、IgG2、與IgG4以及經由在具有中性序列之恆定區導入胺基酸取代、刪除、添加、及/或嵌入所製備之變化的恆定區可以被使用。這類變化恆定區的例子包括下述的恆定區。
使用本發明前述變異區之抗體的例子包括；(1)一抗體，包括具有SEQ ID NO:134(H96-IgG1)胺基酸序列之重鏈；(2)一抗體，包括具有SEQ ID NO:135(F2H-IgG1)胺基酸序列之重鏈；(3)一抗體，包括具有SEQ ID NO:137(VH5-IgG1)胺基酸序列之重鏈；(4)一抗體，包括具有SEQ ID NO:139(VH5-M83)胺基酸序列之重鏈；(5)一抗體，包括具有SEQ ID NO:136(L39)胺基酸序列之重鏈；(6)一抗體，包括具有SEQ ID NO:138(VL5-kappa)胺基酸序列之重鏈；(7)一抗體，包括具有SEQ ID NO:180(VH3-M73)胺基酸序列之重鏈；(8)一抗體，包括具有SEQ ID NO:182(VH4-M73)胺基酸序列之重鏈；(9)一抗體，包括具有SEQ ID NO:181(VL3-kappa)胺基酸序列之輕鏈；(10)一抗體，包括具有SEQ ID NO:183(VL1-kappa)胺基酸序列之輕鏈；(11)一抗體，包括(2)的重鏈以及(5)的輕鏈；(12)一抗體，包括(3)的重鏈以及(6)的輕鏈變異區；(13)一抗體，包括(4)的重鏈以及(6)的輕鏈(FV5-M83)；(14)一抗體，包括(7)的重鏈以及(9)的輕鏈(FV4一M73)；(15)一抗體，包括(8)的重鏈以及(10)的輕鏈(FV3-M73)；以及(16)一抗體，具有與(1)至(15)的抗體任何一種相等之活性。
在此，“具有相等活性(equivalent activity)”係指抗體結合活性及/或中和活性是相等的。本發明之“相等活性”並不需要指完全相同的活性，但可能是，例如50%或以上的活性、較佳為70%或以上、以及更佳為90%或以上。
此外，本發明提供下列任一種CDR與FR；(i)一重鏈FR1，包括SEQ ID NO:84(VH5的重鏈FR1)之胺基酸序列；(ii)一重鏈FR1，包括SEQ ID NO:186(VH3與VH4的重鏈FR1)之胺基酸序列；(iii)一重鏈FR2，包括SEQ ID NO:85(VH3、VH4、與VH5的重鏈FR2)之胺基酸序列；(iv)一重鏈FR3，包括SEQ ID NO:184(VH3、VH4、與VH5的重鏈FR3)之胺基酸序列；(v)一重鏈FR4，包括SEQ ID NO:133(VH3、VH4、與VH5的重鏈FR4)之胺基酸序列；(vi)一輕鏈FR1，包括SEQ ID NO:92(VL1、VL3、與VL5的輕鏈FR1)之胺基酸序列；(vii)一輕鏈FR2，包括SEQ ID NO:93(VL1、VL3、與VL5的輕鏈FR2)之胺基酸序列；(viii)一輕鏈FR3，包括SEQ ID NO:97(VL1、VL3、與VL5的輕鏈FR3)之胺基酸序列；(ix)一輕鏈FR4，包括SEQ ID N0:98(VL1、VL3、與VL5的輕鏈FR4)之胺基酸序列；(x)一重鏈CDR1，包括SEQ ID NO:169(VH3與VH4的重鏈CDR1)之胺基酸序列；(xi)一重鏈CDR1，包括SEQ ID N0:165(VH5的重鏈CDR1)之胺基酸序列；(xii)一重鏈CDR2，包括SEQ ID NO:170(VH3的重鏈CDR2)之胺基酸序列；(xiii)一重鏈CDR2，包括SEQ ID NO:174(VH4的重鏈CDR2)之胺基酸序列；(xiv)一重鏈CDR2，包括SEQ ID NO:166(VH5的重鏈CDR2)之胺基酸序列；(xv)一重鏈CDR3，包括SEQ ID NO:171(VH3與VH4的重鏈CDR3)之胺基酸序列；(xvi)一重鏈CDR3，包括SEQ ID NO:167(VH5的重鏈CDR3)之胺基酸序列；(xvii)一輕鏈CDR1，包括SEQ ID NO:175(VL1的輕鏈CDR1)之胺基酸序列；(xviii)一輕鏈CDR1，包括SEQ ID NO:172(VL3的輕鏈CDR1)之胺基酸序列；(xix)一輕鏈CDR1，包括SEQ ID NO:101(VL5的輕鏈CDR1)之胺基酸序列；(xx)一輕鏈CDR2，包括SEQ ID NO:173(VL1與VL3的輕鏈CDR2)之胺基酸序列；(xxi)一輕鏈CDR2，包括SEQ ID NO:168(VL5的輕鏈CDR2)之胺基酸序列；以及(xxii)一輕鏈CDR3，包括SEQ ID NO:79(VL1、VL3與VL5的輕鏈CDR3)之胺基酸序列。
本發明之抗體亦包括抗體之片段與過程產物，具有任何前述胺基酸取代者。這類抗體片段包括，例如Fab、F(ab’)2、Fv、單鏈Fv(scFv)，在其中H與L鏈係經由適當的連接子接合、單一功能區塊H鏈與單一功能區塊L鏈(例如Nat. Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36)，Unibody(WO 2007059782 A1)，以及SMIP(WO 2007014278 A2)。抗體的來源並無特別限制。抗體包括人類、小鼠、大鼠、以及兔子抗體。本發明之抗體可為嵌合的(chimeric)、人類化的(humanized)、完全地人類化抗體、或類似物。
尤其，這類抗體片段經過以酵素處理抗體而得到，例如，木瓜蛋白酶(papain)或胃蛋白酶(pepsin)，或經由構築編碼此類抗體片段之基因，將其嵌入表現載體，並在適當的宿主細胞中表現(請參照，例如Co,M. S.等人,J. Immunol.(1994)152,2968-2976;Better,M. and Horwitz,A. H. Methods in Enzymology(1989)178,476-496;Plckthun,A.;Skerra,A.,Methods in Enzymology(1989)178,497-515;Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,652-663；Rousseaux,J.等人，Methodsin Enzymology(1989)121,663-66;Bird,R. E.等人，TIBTECH(1991)9,132-137)。
scFv經由連接抗體V與L鏈的V區域而獲得。在此scFv，H鏈V區經由連接子(linker)而與L鏈V區結合，較佳為胜肽連接子(Huston,J.S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85,5879-5883)。一個scFV的H鏈與L鏈可以衍生自任何前述的抗體。連接V區的胜肽連接子包括，例如，12至19個胺基酸殘基之任意的單鏈胜肽。
＜抗體恆定區＞
本發明亦提供下述(i)至(xix)的抗體恆定區，其已經過胺基酸取代改良。恆定區係指IgG1、IgG2、或IgG4類型恆定區。人類IgG1、IgG2、以及IgG4恆定區的胺基酸序列為已知的(人類IgG1恆定區，SEQ ID NO：19；人類IgG2恆定區，SEQ ID NO:20；以及人類IgG4恆定區SEQ ID NO:21)。人類IgG4恆定區的序列已被改變以改善絞鏈區(hinge region)的穩定性(Mol. Immuno1. 1993 Jan;30(1):105-8)。本發明亦提供抗體，其包括具有此類胺基酸取代的抗體恆定區。該抗體恆定區較佳為人類的抗體恆定區。
本發明之具有此類胺基酸取代的抗體恆定區可能包括其他胺基酸取代或修飾，只要其包括下列所述(i)至(xix)任一種的胺基酸取代。因此，在IgG2恆定區包含本發明之胺基酸取代的IgG2恆定區具有包括IgG2恆定區之SEQ ID N0:20的胺基酸序列，其包括一或多個胺基酸取代及/或SEQ ID N0:20胺基酸序列的修飾，更包括本發明之胺基酸取代，如同IgG2恆定區，其具有本發明之胺基酸取代，更包括一或多個胺基酸取代及/或修飾。同樣用於IgG1恆定區，其包括SEQ ID NO:19的胺基酸序列，以及IgG4恆定區，其包括SEQ ID NO:21的胺基酸序列。
此外，EU編碼系統位置297的醣鏈(參照免疫學蛋白質序列，NIH Publication No.91-3242)可為任何的醣鏈結構，或者該處並未有任何醣鏈相連(例如，恆定區在不進行醣化作用的宿主細胞產生，例如大腸桿菌)。
(i)IgG2恆定區在酸性環境之穩定性的改善在一實施例中，本發明具有胺基酸取代之IgG2恆定區包括IgG2恆定區，在其中位於SEQ ID NO:20胺基酸序列位置276的Met(EU編碼系統位置397)已被其他胺基酸取代。取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，取代為Val是較佳的。在酸性環境之抗體穩定性可以被改善，經由以其他胺基酸取代SEQ ID NO:276胺基酸序列位置276(EU編碼系統位置397)的Met。
(ii)IgG2恆定區異質性的改善在一實施例中，本發明IgG2恆定區包括IgG2恆定區之胺基酸取代，其中SEQ ID NO:20胺基酸序列位置14的Cys(EU編碼系統位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統位置133)、以及位置102的Cys(EU編碼系統位置219)已經被其他胺基酸取代。取代後的胺基酸並無特別限制；然而，以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統位置131)、Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統位置133)、以及Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統位置219)(IgG2-SKSC)是較佳的。
這些取代可以降低源自絞鏈區的異質性。本發明之IgG2恆定區包含具有前述三種胺基酸取代中至少一種的IgG2恆定區；然而，該IgG2恆定區較佳地包括以其他胺基酸對位置14之Cys的取代與位置102之Cys的取代或前述胺基酸取代的全部三種。
(iii)IgG2恆定區對FcγR結合的修復在一實施例中，本發明亦提供IgG2恆定區，包括一胺基酸序列，其中SEQ ID NO:20胺基酸序列位置209的Ala(EU330)、位置210的Pro(EU331)、及/或位置218的Thr(EU339)已經分別被Ser、Ser、以及Ala所取代。位置209的Ala(EU330)、位置210的Pro(EU331)的取代已被報導能改善與Fcγ受體的結合(Eur.J.Immunol.1999Aug:29(8):2613-24)。由免疫原性風險的觀點，然而，這些改變並非適當的，因為其導致非人類源的胜肽產生，而變成T細胞抗原決定位。然而，IgG2與Fcγ受體的結合可以被降低，透過同時以Ala取代位置218的Thr(EU339)而達成，以及可以變成T細胞抗原決定位之9至12個胺基酸胜肽僅源自於人類。
包含胺基酸取代之本發明IgG2恆定區具有至少一種前述之三種胺基酸取代；然而，IgG2恆定區較佳地包含前述全部三種的胺基酸取代。在一較佳實施例，包含有胺基酸取代之本發明IgG2恆定區包括一個具有胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:20胺基酸序列位置209的Ala(EU330)、位置201的Pro(EU331)、以及位置218的Thr(EU339)已經分別被Ser、Ser、與Ala所取代之IgG2恆定區。
(iv)IgG2恆定區之C端異質性的改善本發明提供IgG2恆定區，具有胺基酸序列，其中在SEQ ID NO:20胺基酸序列位置325的Gly(EU編碼系統為位置446)以及位置326的Lys(EU編碼系統為位置447)已經被刪除。源自抗體H鏈之C端的異質性可以被降低，僅在前述二個胺基酸同時被刪除時。
(v)經由修改IgG恆定區改善在血清滯留度具有本發明胺基酸取代之IgG2恆定區，具有IgG2恆定區，其中位於SEQ ID NO:20位置147的His(EU編碼系統為位置268)、位置234的Arg(EU編碼系統為位置355)、以及位置298的Gln(EU編碼系統為位置419)取代已被其他胺基酸取代。這些胺基酸能夠改善抗體在血清的滯留度。取代後的胺基酸類型並未被特別限制；然而，以Gln取代位置147的His(EU編碼系統為位置268)、Gln取代位置234的Arg(EU編碼系統為位置355)、以及Glu取代位置298的Gln(EU編碼系統為位置419)是較佳的。具有本發明胺基酸取代之IgG2恆定區包括IgG2恆定區，具有前述三種胺基酸取代的至少一種；然而，IgG2恆定區較佳地包括全部前述的三種胺基酸取代。
(vi)IgG4恆定區在酸性環境穩定性的改善本發明提供IgG4恆定區包括胺基酸序列，其中SEQ ID NO:21胺基酸序列位置289的Arg(EU編碼系統為位置409)已被其他胺基酸取代。取代後的胺基酸類型並無被特別限制；然而，取代為Lys是較佳的。抗體在酸性環境的穩定性可以被改善，經由以其他胺基酸取代SEQ ID NO:21胺基酸序列位置289的Arg(EU編碼系統為位置409)。
(vii)IgG4恆定區之C端異質性的改善本發明提供IgG4恆定區包括一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:21胺基酸序列位置326的Gly(EU編碼系統為位置446)以及位置327的Lys(EU編碼系統為位置447)已被刪除。源自抗體H鏈C端的異質性可以被降低，僅在前述二個胺基酸均被刪除時。
(viii)IgG1恆定區之C端異質性的改善本發明提供IgG1恆定區，具有一胺基酸序列，其中SEQ ID NO:19胺基酸序列位置329的Gly(EU編碼系統為位置446)與位置330的Lys(EU編碼系統為位置447)已被刪除。源自抗體H鏈C端的異質性可以被降低，僅在前述二個胺基酸均被刪除時。
(ix)本發明提供IgG1恆定區，具有一胺基酸序列，其中SEQ ID NO:19胺基酸序列位置317的Asn(EU編碼系統為位置434)已被其他胺基酸所取代。
取代後胺基酸的類型並無特殊限制；然而，取代為Ala是較佳的。
(x)本發明提供IgG2恆定區，包括一胺基酸序列，其中SEQ ID NO:20胺基酸序列位置209的Ala(EU編碼系統為位置330)、位置210的Pro(EU編碼系統為位置331)、位置218的Thr(EU編碼系統為位置339)、位置276的Met(EU編碼系統為位置397)、位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、以及位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置209的Ala、Ser取代位置210的Pro、Ala取代位置218的Thr、Val取代位置276的Met、Ser取代位置14的Cys、Lys取代位置16的Arg、Ser取代位置102的Cys、Gly取代位置20的Glu、以及Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)是較佳的。
(xi)本發明提供IgG2恆定區，包括一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:20胺基酸序列位置209的Ala(EU編碼系統為位置330)、位置210的Pro(EU編碼系統為位置331)、位置218的Thr(EU編碼系統為位置339)、位置276的Met(EU編碼系統為位置397)、位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、以及位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)已被其他胺基酸取代，同時位置325的Gly(EU編碼系統為位置446)與位置326的Lys(EU編碼系統為位置447)已被刪除。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置209的Ala、Ser取代位置210的Pro、Ala取代位置218的Thr、Val取代位置276的Met、Ser取代位置14的Cys、Lys取代位置16的Arg、Ser取代位置102的Cys、Gly取代位置20的Glu、以及Gly取代位置21的Ser是較佳的。
(xii)本發明提供IgG2恆定區，包括一胺基酸序列，其中SEQ ID NO:20胺基酸序列位置276的Met(EU編碼系統為位置397)、位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、以及位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並未被特別限制；然而，以Val取代位置276的Met、Ser取代位置14的Cys、Lys取代位置16的Arg、Ser取代位置102的Cys、Gly取代位置20的Glu、以及Gly取代位置21的Ser係為較佳的。
(xiii)本發明提供之IgG2恆定區，包含一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:20胺基酸序列位置276的Met(EU編碼系統為位置397)、位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、以及位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)已被其他胺基酸取代，同時位置325的Gly(EU編碼系統為位置446)以及位置326的Lys(EU編碼系統為位置447)已被刪除。
取代後的胺基酸類型並未被特別限制；然而，以Val取代位置276的Met、Ser取代位置14的Cys、Lys取代位置16的Arg、Ser取代位置102的Cys、Gly取代位置20的Glu、以及Gly取代位置21的Ser是較佳的。
(xiv)本發明提供之IgG2恆定區，包括一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:20胺基酸序列位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)、位置147的His(EU編碼系統為位置268)、位置234的Arg(EU編碼系統為位置355)、以及位置298的Gln(EU編碼系統為位置419)已被其他胺基酸取代，同時位置325的Gly(EU編碼系統為位置446)與位置326的Lys(EU編碼系統為位置447)已被刪除。
取代後的胺基酸類型並未被特別限制；然而，以Ser取代位置14的Cys、Lys取代位置16的Arg、Ser取代位置102的Cys、Gly取代位置20的Glu、Gly取代位置21的Ser、Gln取代位置147的His、Gln取代位置234的Arg、以及Glu取代位置298的Gln是較佳的。
(xv)本發明提供IgG2恆定區，包括一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:20胺基酸序列位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)、位置147的His(EU編碼系統為位置268)、位置234的Arg(EU編碼系統為位置355)、位置298的Gln(EU編碼系統為位置419)、以及位置313的Asn(EU編碼系統為位置434)已被其他胺基酸取代，同時位置325的Gly(EU編碼系統為位置446)與位置326的Lys(EU編碼系統為位置447)已被刪除。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置14的Cys、Lys取代位置16的Arg、Ser取代位置102的Cys、Gly取代位置20的Glu、Gly取代位置21的Ser、Gln取代位置147的His、Gln取代位置234的Arg、Glu取代位置298的Gln、以及Ala取代位置313的Asn是較佳的。
(xvi)本發明提供IgG4恆定區，包括一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:21胺基酸序列位置289的Arg(EU編碼系統為位置409)、位置14的Cys、位置16的Arg、位置20的Glu、位置21的Ser、位置97的Arg、位置100的Ser、位置102的Tyr、位置103的Gly、位置104的Pro、以及位置105的Pro(EU編碼系統分別為位置131、133、137、138、214、217、219、220、221、與222)、位置113的Glu、位置114的Phe、以及位置115的Leu(EU編碼系統分別為位置233、234與235)已被其他胺基酸取代，同時位置116的Gly(EU編碼系統為位置236)已被刪除。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)、Thr取代位置97的Arg(EU編碼系統為位置214)、Arg取代位置100的Ser(EU編碼系統為位置217)、Ser取代位置102的Tyr(EU編碼系統為位置219)、Cys取代位置103的Gly(EU編碼系統為位置220)、Val取代位置104的Pro(EU編碼系統為位置221)、Glu取代位置105的Pro(EU編碼系統為位置222)、Pro取代位置113的Glu(EU編碼系統為位置233)、Val取代位置114的Phe(EU編碼系統為位置234)、Ala取代位置115的Leu(EU編碼系統為位置235)、以及Lys取代位置289的Arg(EU編碼系統為位置409)是較佳的。
(xvii)本發明提供IgG4恆定區，包括一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:21胺基酸序列位置289的Arg(EU編碼系統為位置409)、位置114的Cys、位置16的Arg、位置20的Glu、位置21的Ser、位置97的Arg、位置100的Ser、位置102的Tyr、位置103的Gly、位置104的Pro、以及位置105的Pro(EU編碼系統分別為位置131、133、137、138、214、217、219、220、221與222)、位置113的Glu、位置114的Phe、以及位置115的Leu(EU編碼系統分別為位置233、234與235)已被其他胺基酸取代，同時位置116的Gly(EU編碼系統為位置236)、位置326的Gly(EU編碼系統為位置446)、以及位置327的Lys(EU編碼系統為位置447)已被刪除。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)、Thr取代位置97的Arg(EU編碼系統為位置214)、Arg取代位置100的Ser(EU編碼系統為位置217)、Ser取代位置102的Tyr(EU編碼系統為位置219)、Cys取代位置103的Gly(EU編碼系統為位置220)、Val取代位置104的Pro(EU編碼系統為位置221)、Glu取代位置105的Pro(EU編碼系統為位置222)、Pro取代位置113的Glu(EU編碼系統為位置233)、Val取代位置114的Phe(EU編碼系統為位置234)、Ala取代位置115的Leu(EU編碼系統為位置235)、以及Lys取代位置289的Arg(EU編碼系統為位置409)是較佳的。
(xviii)本發明提供IgG1恆定區包括一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:19胺基酸序列位置317的Asn(EU編碼系統為位置434)已被其他胺基酸取代，同時位置329的Gly(EU編碼系統為位置446)以及位置330的Lys(EU編碼系統為位置447)已被刪除。
位置317的Asn(EU編碼系統為位置434)被取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Ala是較佳的。
(xix)以下為本發明之IgG2的較佳實施例，其在絞鏈區具有降低的異質性，及/或降低的Fcγ受體結合活性。
包含IgG2恆定區之抗體具有一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:20胺基酸序列位置209的Ala、位置210的Pro、位置218的Thr、位置14的Cys、位置16的Arg、位置102的Cys、位置20的GIu、以及位置21的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置209的Ala(EU編碼系統為位置330)、Ser取代位置210的Pro(EU編碼系統為位置331)、Ala取代位置218的Thr(EU編碼系統為位置339)、Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、以及Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)是較佳的。
這類IgG2恆定區包括，例如，具有SEQ ID NO:191胺基酸序列(M86)之IgG2恆定區。
在另一較佳實施例，本發明之IgG2恆定區包括在前述IgG2恆定區位置325的Gly以及位置326的Lys之刪除以降低C端異質性所生成的IgG2恆定區。這類抗體包括，例如包括具有SEQ ID NO:192(M86ΔGK)之恆定區的IgG2。
(xx)以下為本發明IgG2恆定區之另一較佳實施例，其在絞鏈區具有較低的異質性。
IgG2恆定區具有一胺基酸序列，其中位於SEQ ID NO:20胺基酸序列位置14的Cys、位置16的Arg、位置102的Cys、位置20的Glu、以及位置21的Ser已被其他胺基酸取代。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、以及Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)是較佳的。
這類IgG2恆定區包括，例如，具有SEQ ID NO:193(M40)胺基酸序列之IgG2恆定區。
在另一較佳實施例，本發明之IgG2恆定區包括更具有刪除前述IgG2恆定區位置325的Gly與位置326的Lys之IgG2恆定區。這類抗體包括，例如，包括SEQ ID NO:194(M40ΔGK)胺基酸序列之IgG2恆定區。
(xxi)M14ΔGK、M17ΔGK、M11ΔGK、M31ΔGK、M58、M73、M86ΔGK、M40ΔGK以及M83本發明亦提供一具有SEQ ID NO:24(M14ΔGK)之胺基酸序列的抗體恆定區。本發明亦提供一具有SEQ ID NO:116(M17ΔGK)之胺基酸序列的抗體恆定區。本發明亦提供一具有SEQ ID NO:25(M11ΔGK)之胺基酸序列的抗體恆定區。本發明更提供一具有SEQ ID NO:118(M31ΔGK)之胺基酸序列的抗體恆定區。本發明更提供一具有SEQ ID NO:151(M58)之胺基酸序列的抗體恆定區。本發明更提供一具有SEQ ID NO:153(M73)之胺基酸序列的抗體恆定區。本發明更提供一具有SEQ ID NO:192(M86ΔGK)之胺基酸序列的抗體恆定區。本發明更提供一具有SEQ ID NO:194(M40ΔGK)之胺基酸序列的抗體恆定區。本發明更提供一具有SEQ ID NO:164(M83)之胺基酸序列的抗體恆定區。這些抗體恆定區已被最佳化，以具有降低的Fcγ受體結合活性、降低的免疫原性風險、改善的在酸性環境之穩定性、降低的異質性、改善的血清滯留度、及/或相較於IgG1恆定區在製劑之較高穩定性
本發明提供具有前述(i)至(xxi)任何一種抗體恆定區的抗體。對於抗原類型與抗體來源並無限制，只要該抗體具有前述之抗體恆定區。較佳的抗體包括，例如，人類化的抗體。此類抗體包括，例如，具有人類化PM-1抗體變異區之抗體。這類人類化PM-1抗體的變異區可能具有任何前述的胺基酸取代，或其他胺基酸取代、刪除、添加、及/或嵌入。特別地，取代包括，例如，改善前述(a)至(y)之親和性的改變、降低前述(i)至(viii)之等電點的改變、改善下述(α)至(ζ)之穩定性的改變、以及降低免疫原性之改變，但不以此為限。
於一實施例，這類抗體包括抗體，其具有重鏈變異區包括SEQ ID NO:113(PF_1+M14ΔGK)的胺基酸序列以及輕鏈變異區包括SEQ ID NO:23(PF1_L)的胺基酸序列(輕鏈變異區可為kappa或lambda、或其變化形式)，但不以此為限。
可選擇地，前述之抗體恆定區及/或包括前述抗體恆定區之抗體分子可為Fc融合分子之形式，與類抗體結合分子(支架分子(scaffold molecules))、生物活性胜肽、結合胜肽或類似物連接。
本發明之抗體亦可被獲得，例如，經由除了那些實施例所述者以外之下列方法。於一得到本發明之抗體的實施例，一或多個胺基酸殘基首先在熟悉技藝人士所已知由抗IL-6受體的抗體之CDR、FR與恆定區所組成之群組中至少一個區域被標的胺基酸所取代。熟悉技藝人士已知得到抗IL-6受體的抗體之方法並無限制。以標的胺基酸在選自CDR、FR與恆定區所組成之群組中至少一個區域取代一或多個胺基酸殘基的方法包括，例如定點突變法(site-directed mutagenesis；Hashimoto-Gotoh,T.,Mizuno,T.,Ogasahara,Y.,and Nakagawa,M. An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site一directed mutagenesis. Gene(1995)152,271-275;Zoller,M. J.,and Smith,M. Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol.(1983)100,468-500;Kramer,W.,Drutsa,V.,Jansen,H. W.,Kramer,B.,Pflugfelder,M.,and Fritz,H. J. The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res.(1984)12,9441-9456;Kramer W.,and Fritz H. J. Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol.(1987)154,350-367;Kunkel,T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985)82,488-492)。這些方法可被用於以標的胺基酸取代抗體之目標胺基酸。取代胺基酸的方法包括資料庫技術(library technologies)，例如框架滑動法(framework shuffling；Mol. Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60)以及CDR修復法(CDR repair；US2006/0122377)。利用這些方法，胺基酸可以被取代至適當的框架與CDR。
獲得抗體之另一實施例，與IL6受體結合之抗體首先以熟悉技藝人士已知的方法製備。當製備的抗體係源自於非人類的動物，其可以被人類化。隨後，已製備的抗體被測試，以熟悉技藝人士已知的方法評估其是否具有中和活性。抗體的結合活性與中和活性可以被決定，例如，經由實施例所述的方法；然而，這類方法不僅限於此。之後，在選自抗體的CDR、FR與恆定區之至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸所取代。
更特別地，本發明係有關於製造具有改善的中和活性、結合活性、或穩定性、或降低的免疫原性之抗體的方法，其包括步驟：(a)表現編碼H鏈的DNA，在其中於選自抗體的CDR、FR與恆定區之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代，以及表現編碼L鏈的DNA，在其中於選自抗體的CDR與FR之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代；以及(b)收集步驟(a)之表現產物。
本發明之製造方法的第一步驟係表現編碼突變的抗IL-6受體的抗體之H鏈的DNA，在其中於選自CDR、FR與恆定區之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代，以及表現編碼突變的抗IL-6受體的抗體之L鏈的DNA，在其中於選自抗體的CDR與FR之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代。編碼H鏈的DNA，在其中選自CDR、FR與恆定區之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代，可以被製備，例如經由得到編碼野生型H鏈之CDR、FR與恆定區的DNA，以及導入一個合適的取代作用，使編碼特定胺基酸之密碼在選自CDR、FR與恆定區之群組至少一個區域編碼標的胺基酸。此外，編碼L鏈的DNA，在其中選自CDR與FR之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代，可以被製備，例如經由得到編碼野生型L鏈之CDR及/或FR的DNA，以及導入一個合適的取代作用，使編碼特定胺基酸之密碼在CDR及/或FR編碼標的胺基酸。
可選擇地，編碼H鏈之DNA，在其中選自CDR、FR與恆定區之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代，亦可以被製備，經由設計並隨後化學合成編碼蛋白質的DNA，在其中於選自野生型H鏈之CDR、FR與恆定區所組成之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代。此外，編碼L鏈之DNA，在其中CDR及/或FR區域之一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代，亦可以被製備，經由設計並隨後化學合成編碼蛋白質的DNA，在其中野生型L鏈之CDR及/或FR區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代。
胺基酸取代的類型包括此處所述之取代，但不以此為限。
可選擇地，編碼H鏈之DNA，在其中選自CDR、FR、及恆定區所組成之群組至少一個區域的一或多個胺基酸殘基被標的胺基酸取代，亦可經由部分DNA的組合而被製備。這類部分DNA的組合包括，例如，編碼變異區之DNA與編碼恆定區之DNA的組合、以及編碼Fab區之DNA與編碼Fc區之DNA的組合，但不以此為限。編碼L鏈之DNA亦可由部分DNA的組合而被製備。
表現前述DNA的方法包括下述方法。例如，一個H鏈表現載體被構築，經由將編碼H鏈變異區之DNA與編碼H鏈恆定區之DNA一起嵌入表現載體。類似地，一個L鏈表現載體被構築，經由將編碼L鏈變異區之DNA與編碼L鏈恆定區之DNA一起嵌入表現載體。可選擇地，這些H與L鏈基因可以被嵌入單一載體。表現載體包括，例如，SV40病毒為基礎的載體、EB病毒為基礎的載體、以及BPV(乳突病毒(papillomavirus))為基礎的載體，但不以此為限。
宿主細胞與前述方法所構築的抗體表現載體一起被轉型。這類宿主細胞包括前述細胞，例如CHO(中國倉鼠卵巢)細胞以及微生物，例如 大腸桿菌、酵母菌、桿菌(Bacillus subtilis)、以及植物與動物(Nature Biotechnology(2007)25,563-565;Nature Biotechnology(1998)16,773-777;Biochemical and Biophysical Research Communications(1999)255,444-450;Nature Biotechnology(2005)23,1159-1169;Journal of Virology(2001)75,2803-2809;Biochemical and Biophysical Research Communications(2003)308,94-100)。轉型作用(transformation)可以較佳地被達成，利用電穿孔法(electroporation)、脂質體法(lipofectinmethod；R. W. Malone et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1989)86,6077;P. L. Felgner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1987)84,7413)、磷酸鈣法(calcium phosphate method；F. L. Graham & A. J. van der Eb,Virology(1973)52,456-467)、DEAE葡聚糖法(DEAE-Dextran method)、以及類似方法。
在抗體製造的下一步驟，步驟(a)得到的表現產物被收集。表現產物可以被收集，例如，經由培養轉型物(transformants)、以及從轉型細胞或培養液分離產物。抗體的分離與純化可以被達成，透過適當的方法組合，例如離心、硫酸銨分級分離(ammonium sulfate fractionation)、鹽析(salting out)、超過濾(ultrafiltration)、1q管柱(columns of 1q)、FcRn、蛋白質A(Protein A)、以及蛋白質G(Protein G)、親和層析法(affinity chromatography)、離子交換層析法(ion exchange chromatography)、以及膠體過濾層析法(gel filtration chromatography)。
那些熟悉技藝人士可以適當地根據製備抗體之方法準備本發明的恆定區。
本發明更有關於增強抗IL-6受體的抗體結合或中和IL-6受體的活性，其包括至少下列群組所組成之一步驟：(A)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:1(HCDR1)胺基酸序列位置1的Ser；(B)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:1(HCDR1)胺基酸序列位置5的Trp；(C)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:2(HCDR2)胺基酸序列位置1的Try；(D)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:2(HCDR2)胺基酸序列位置8的Thr；(E)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:2(HCDR2)胺基酸序列位置9的Thr；(F)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置1的Ser；(G)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置2的Leu；(H)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置5的Thr；(I)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置7的Ala；(J)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置8的Met；(K)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置1的Ser與位置5的Thr；(L)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置2的Leu、位置7的Ala與位置8的Met；(M)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:4(LCDR1)胺基酸序列位置1的Arg；(N)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:4(LCDR1)胺基酸序列位置4的Gln；(O)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:4(LCDR1)胺基酸序列位置9的Tyr；(P)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:4(LCDR1)胺基酸序列位置11的Asn；(Q)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:5(LCDR2)胺基酸序列位置2的Thr；(R)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:6(LCDR3)胺基酸序列位置1的Gln；(S)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:6(LCDR3)胺基酸序列位置3的Gly；(T)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:4(LCDR1)胺基酸序列位置9的Tyr以及SEQ ID NO:6(LCDR3)胺基酸序列位置3的Gly；(U)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:6(LCDR3)胺基酸序列位置5的Thr；(V)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:6(LCDR3)胺基酸序列位置1的Gln與位置5的Thr；以及(W)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:2(HCDR2)胺基酸序列位置9的Thr、以及SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置1的Ser與位置5的Thr；或(X)包含(V)與(W)的步驟。
在前述的(A)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Trp、Thr、Asp、Asn、Arg、Val、Phe、Ala、Gln、Tyr、Leu、His、Glu、或Cys是較佳的。
在前述的(B)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Ile或Val是較佳的。
在前述的(C)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Phe是較佳的
在前述的(D)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Arg是較佳的。
在前述的(E)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Ser或Asn是較佳的。
在前述的(F)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Ile、Val、Thr、或Leu是較佳的。
在前述的(G)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Thr是較佳的。
在前述的(H)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Ala、Ile、或Ser是較佳的。其他較佳的取代包括以Ser取代位置5的Thr。
在前述的(I)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Ser或Val是較佳的。
在前述的(J)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Leu是較佳的。
在前述的(K)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，以Leu取代位置1的Ser以及Ala取代位置5的Thr是較佳的。其他較佳的取代包括那些以Val取代位置1的Ser與Ala取代位置5的Thr、Ile取代位置1的Ser與Ala取代位置5的Thr、Thr取代位置1的Ser與Ala取代位置5的Thr、Val取代位置1的Ser與Ile取代位置5的Thr、Ile取代位置1的Ser與Ile取代位置5的Thr、Thr取代位置1的Ser與Ile取代位置5的Thr、以及Leu取代位置1的Ser與Ile取代位置5的Thr。
在前述的(L)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，以Thr取代位置2的Leu、Val取代位置7的Ala、以及Leu取代位置8的Met是較佳的。
在前述的(M)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Phe是較佳的。
在前述的(N)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Arg或Thr是較佳的。
在前述的(O)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Phe是較佳的。
在前述的(P)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Ser是較佳的。
在前述的(Q)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Gly是較佳的。
在前述的(R)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Gly、Asn、或Ser是較佳的。
在前述的(S)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Ser是較佳的。
在前述的(T)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，以Phe取代SEQ ID NO:4(LCDR1)胺基酸序列的Tyr、以及Ser取代SEQ ID NO:6(LCDR3)胺基酸序列的Gly是較佳的。
在前述的(U)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，取代為Arg或Ser是較佳的。
在前述的(V)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要其親和性被改善；然而，以Gly取代位置1的Gln以及Ser取代位置5的Thr是較佳的。其他較佳的取代包括那些以Gly取代位置1的Gln與Arg取代位置5的Thr。
在前述的(W)，以Asn取代SEQ ID NO:2(HCDR2)胺基酸序列位置9的Thr是較佳的。較佳之取代SEQ ID NO:3(HCDR3)胺基酸序列位置1的Ser與位置5的Thr後之胺基酸的組合包括Leu與Ala、Val與Ala、Ile與A1a、Thr與Ala、Val與Ile、Ile與Ile、Thr與Ile、以及Leu與Ile。
在前述步驟(A)至(X)，胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被完成，例如，前述定點突變法或實施例所述的方法。當胺基酸在重鏈變異區被取代，取代前之重鏈變異區原來的胺基酸序列較佳為人類化PM-1抗體之重鏈變異區的胺基酸序列。可選擇地，當胺基酸在輕鏈變異區被取代，取代前之輕鏈變異區原來的胺基酸序列較佳為人類化PM-1抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列。此外，較佳為在人類化PM-1抗體導入前述步驟(A)至(X)的胺基酸取代。
本發明用於增強抗IL-6受體的抗體結合或中和活性之方法包括至少一種前述步驟(A)至(X)之任何一種。特別地，本發明之方法可能包括二或多種前述的步驟(A)至(X)。此外，本發明的方法可能包括其他步驟(例如，除了前述(A)至(X)的胺基酸取代、刪除、添加及/或嵌入)，只要其包括前述步驟(A)至(X)之任何一種。此外，例如，FR可能具有胺基酸取代、刪除、添加及/或嵌入，且恆定區可能具有胺基酸取代、刪除、添加及/或嵌入。較佳係對人類化PM-1抗體導入前述的胺基酸取代。
<降低抗IL-6受體的抗體之免疫原性風險的方法>
本發明亦有關於降低抗IL-6受體的抗體之免疫原性的方法，其包括以Gly取代SEQ ID NO:5(LCDR2)胺基酸序列位置2的Thr之步驟。本發明用於降低抗IL-6受體的抗體之免疫原性的方法可包括其他的胺基酸取代步驟，只要其包括以Gly取代SEQ ID NO:5(LCDR2)胺基酸序列位置2的Thr之步驟。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被達成，例如，經由前述定點突變方法或實施例所述的方法。
較佳係對人類化的PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物導入前述的胺基酸取代。
<減低抗IL-6受體的抗體之等電點的方法>
本發明亦有關於減低抗IL-6受體的抗體之等電點的方法，其包括選自下列步驟所組成之群組的至少一種：(i)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:7(HFR1)胺基酸序列位置16的Gln；(ii)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:8(HFR2)胺基酸序列位置8的Arg；(iii)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:9(HFR3)胺基酸序列位置16的Arg；(iv)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:10(HFR4)胺基酸序列位置3的Gln；(v)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:11(LFR1)胺基酸序列位置18的Arg；(vi)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:12(LFR2)胺基酸序列位置11的Lys；(vii)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:13(LFR3)胺基酸序列位置23的Gln；(viii)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:14(LFR4)胺基酸序列位置10的Lys；(ix)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:1(HCDR1)胺基酸序列位置1的Ser；(x)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:4(LCDR1)胺基酸序列位置1的Arg；(xi)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:5(LCDR2)胺基酸序列位置4的Arg；(xii)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:7(HFR1)胺基酸序列位置13的Arg；(xiii)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:2(HFR1)或100胺基酸序列位置15的Lys及/或位置16的Ser；(xiv)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:4(LCDR1)或101胺基酸序列位置4的Gln；以及(xv)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:5(LCDR2)胺基酸序列位置6的His。
在前述(i)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述(ii)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述(iii)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Lys是較佳的。
在前述(iv)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述(v)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Ser是較佳的。
在前述(vi)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述(vii)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述(viii)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述(ix)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Asp是較佳的。
在前述(x)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Gln是較佳的。
在前述(xi)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述(xii)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Lys是較佳的。
在前述(xiii)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，以GIn取代位置15的Lys以及Asp取代位置16的Ser是較佳的。
在前述(xiv)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述(xv)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要該等電點被降低；然而，取代為Glu是較佳的。
在前述步驟(i)至(xv)，胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被達成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。當胺基酸在重鏈變異區被取代，取代前重鏈變異區之原來的胺基酸序列較佳為人類化PM-1抗體之重鏈變異區的胺基酸序列。可選擇地，當胺基酸在輕鏈變異區被取代，取代前輕鏈變異區之原來的胺基酸序列較佳為人類化PM-1抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列。此外，較佳係對人類化PM-1抗體導入前述步驟(i)至(xv)的胺基酸取代。
本發明用於減低抗IL-6受體的抗體之等電點的方法包括至少一種前述步驟(i)至(xv)的任何一種。特別地，本發明之方法可能包括前述步驟(i)至(xv)的二或多種。此外，本發明的方法可能包括其他步驟(例如，除了前述(i)至(xv)的胺基酸取代、刪除、添加及/或嵌入)，只要其具有任何一種前述(i)至(xv)的步驟。此外，例如，恆定區可能包括胺基酸取代、刪除、添加及/或嵌入。
<改善抗IL-6受體的抗體之穩定性的方法>
本發明亦有關於改善抗IL-6受體的抗體之穩定性的方法，其包括選自下列步驟所組成之群組的至少一種；(α)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:9(HFR3)胺基酸序列位置4的Met；(β)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:9(HFR3)胺基酸序列位置5的Leu；(γ)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:2(HCDR2)胺基酸序列位置9的Thr；(δ)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:6(LCDR3)胺基酸序列位置5的Thr；(ε)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:2(HCDR2)胺基酸序列位置16的Ser；(ζ)以其他胺基酸取代SEQ ID NO:10(FR4)胺基酸序列位置5的Ser。
在前述的(α)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要穩定性被改善；然而，取代為Ile是較佳的。
在前述的(β)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要穩定性被改善；然而，取代為Ser是較佳的。
在前述的(γ)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要穩定性被改善；然而，取代為Asn是較佳的。
在前述的(δ)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要穩定性被改善；然而，取代為Ser是較佳的。
在前述的(ε)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要穩定性被改善；然而，取代為Gly是較佳的。
在前述的(ζ)，取代後的胺基酸類型並無特別限制，只要穩定性被改善；然而，取代為Ile是較佳的。
在前述的(α)至(ζ)，胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被完成，例如，經由前述定點突變法或實施例所述的方法。當胺基酸在重鏈變異區被取代，取代前重鏈變異區之原來的胺基酸序列較佳為人類化PM-1抗體之重鏈變異區的胺基酸序列。可選擇地，當胺基酸在輕鏈變異區被取代，取代前輕鏈變異區之原來的胺基酸序列較佳為人類化PM-1抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列。此外，較佳係對人類化PM-1抗體導入前述步驟(α)至(ζ)的胺基酸取代。
本發明用於改善抗IL-6受體的抗體之穩定性的方法包括至少一種前述步驟(α)至(ζ)的任何一種。特別地，本發明之方法可能包括前述步驟(α)至(ζ)的二或多種。此外，本發明的方法可能包括其他步驟(例如，除了前述(α)至(ζ)的胺基酸取代、刪除、添加及/或嵌入)，只要其具有任何一種前述(α)至(ζ)的步驟。此外，例如，恆定區可能包括胺基酸取代、刪除、添加及/或嵌入。
<降低抗IL-6受體的抗體之免疫原性的方法>
本發明亦有關於降低抗IL-6受體的抗體之免疫原性的方法，尤其關於人類化的PM-1抗體，其包括在SEQ ID NO:7(HFR1)胺基酸序列，以Lys取代位置13的Arg、Glu取代位置16的Gln、Ala取代位置23的Thr、及/或Ser取代位置30的Thr之步驟。本發明用於降低抗IL-6受體的抗體之免疫原性的方法可能包含其他的胺基酸取代步驟，只要其包括在SEQ ID NO:7(HFR1)胺基酸序列以Ser取代位置30的Thr的步驟。
本發明更有關於降低抗IL-6受體的抗體之免疫原性的方法，尤其是人類化PM-1抗體，其包括在SEQ ID NO:90(HFR3)胺基酸序列以Val取代位置27的Ala之步驟。本發明用於降低抗IL-6受體的抗體之免疫原性的方法可能包括其他的胺基酸取代步驟，只要其包括在SEQ ID NO:90(HFR3)胺基酸序列以Val取代位置27的Ala之步驟。
胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被達成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
本發明更有關於降低抗抗體免疫原性的方法，其包括轉換抗IL-6受體的抗體的FR3，尤其是人類化PM-1抗體、H53/L28、或PF1抗體，為具有SEQ ID NO:128或129之胺基酸序列的FR3。
<改善在酸性環境下抗體穩定性的方法>
本發明亦有關於改善在酸性環境下抗體穩定性的方法，其包括在SEQ ID NO:20(IgG2)胺基酸序列以其他胺基酸取代位置276的Met(EU編碼系統為位置397)之步驟。本發明用於改善在酸性環境下抗體穩定性的方法可能包括其他的胺基酸取代步驟，只要其包含在SEQ ID NO:20(1gG2)胺基酸序列以其他胺基酸取代位置276的Met(EU編碼系統為位置397)之步驟。取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，取代為val是較佳的。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被達成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
<降低源自於IgG2恆定區之絞鏈區異質性的方法>
本發明亦有關於降低抗體異質性的方法，其包括在SEQ ID NO:20(1gG2)胺基酸序列以其他胺基酸取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、及/或位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)之步驟。取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置14的Cys、Lys取代位置16的Arg、以及Ser取代位置102的Cys是較佳的。本發明用於降低抗體異質性的方法可能包含胺基酸取代的其他步驟，只要其包括在SEQ ID NO:20(1gG2)胺基酸序列以其他胺基酸取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、及/或位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)之步驟。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被達成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。在胺基酸取代，前述三個胺基酸全部可能被取代，或其中一或二個被取代(例如位置14與102)。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
<降低在IgG2恆定區源自於C端胺基酸刪除之異質性的方法>
本發明亦有關於降低抗體異質性的方法，其包括在具有SEQ ID NO:20胺基酸序列之IgG2恆定區刪除位置325的Gly(EU編碼系統為位置446)與位置326的Lys(EU編碼系統為位置447)的步驟。本發明用於降低抗體異質性的方法，可能包含胺基酸取代的其他步驟，只要其包括在具有SEQ ID NO:20胺基酸序列之IgG2恆定區刪除位置325的Gly(EU編碼系統為位置446)與位置326的Lys(EU編碼系統為位置447)的步驟。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被達成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
<當維持IgG2恆定區人類序列時，降低FcγR結合的方法>
本發明亦有關於降低FcγR與抗體結合的方法，其包括在具有SEQ ID NO:20胺基酸序列之IgG2恆定區以Ser取代位置209的Ala(EU330)、Ser取代位置210的Pro(EU331)、以及Ala取代位置218的Thr(EU339)的步驟。本發明用於降低FcγR與抗體結合的方法可能包含其他胺基酸取代的步驟，只要其包括在具有SEQ ID NO:20胺基酸序列之IgG2恆定區以Ser取代位置209的Ala(EU330)、Ser取代位置210的Pro(EU331)、以及Ala取代位置218的Thr(EU339)的步驟。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被達成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
(經由取代IgG2恆定區胺基酸以改善在血清滯留度的方法>
本發明亦有關於改善抗體在血清滯留度的方法，其包括在具有SEQ ID NO:20胺基酸序列之IgG2恆定區取代位置147的His(EU268)、位置234的Arg(EU355)、及/或位置298的Gln(位置419)的步驟。本發明用於改善抗體在血清滯留度的方法可能包含其他的胺基酸取代步驟，只要其包括前述步驟。取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Gln取代位置147的His(EU268)、Gln取代位置234的Arg(EU355)、以及Glu取代位置298的Gln(EU419)是較佳的。
本發明亦有關於改善抗體在血清滯留度的方法，其包括在具有SEQ ID NO:20或151(M58)胺基酸序列之IgG2恆定區取代位置313的Asn(EU434)的步驟。取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，取代為Ala是較佳的。本發明用於改善抗體在血清滯留度的方法可能包含其他的胺基酸取代步驟，只要其包括前述的步驟。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
本發明亦有關於降低源自於IgG2的絞鏈區之異質性的方法、改善酸性環境下抗體穩定性的方法、降低源自C端之抗體異質性的方法、及/或降低Fcγ R與抗體結合的方法，其全部包括在IgG2恆定區具有SEQ ID NO:20(M14ΔGK)胺基酸序列，步驟為：(a)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置209的Ala(EU編碼系統為位置330)；(b)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置210的Pro(EU編碼系統為位置331)；(c)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ala取代位置218的Thr(EU編碼系統為位置339)；(d)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Val取代位置276的Met(EU編碼系統為位置397)；(e)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)；(f)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)；(g)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)；(h)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)；(i)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)；以及(j)在SEQ ID NO:20胺基酸序列刪除位置325的Gly以及位置326的Lys(EU編碼系統分別為位置446與447)。
本發明的方法可能包含其他步驟，例如胺基酸取代與刪除，只要它們包含前述的步驟。胺基酸取代與刪除的方法並無特別限制。取代與刪除可以被達成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
本發明亦有關於降低源自於IgG2的絞鏈區之異質性的方法、改善酸性環境下抗體穩定性的方法、及/或降低源自C端之抗體異質性的方法，其全部包括在IgG2恆定區具有SEQ ID NO:20(M31ΔGK)胺基酸序列，步驟為：(a)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Val取代位置276的Met(EU編碼系統為位置397)；(b)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)；(c)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)；(d)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)；(e)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)；(f)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)；以及(g)在SEQ ID NO:20胺基酸序列刪除位置325的Gly以及位置326的Lys(EU編碼系統分別為位置446與447)。
本發明亦有關於降低源自於IgG2的絞鏈區之異質性的方法、改善酸性環境下抗體穩定性的方法、及/或降低源自C端之抗體異質性的方法，其全部包括在IgG2恆定區具有SEQ ID NO:20(M58)胺基酸序列，步驟為：(a)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)；(b)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)；(c)在SEQ ID NO：20胺基酸序列以Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)；(d)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)；(e)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)；(f)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gln取代位置147的His(EU編碼系統為位置268)；(g)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gln取代位置234的Arg(EU編碼系統為位置355)；(h)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Glu取代位置298的Gln(EU編碼系統為位置419)；以及(i)在SEQ ID NO:20胺基酸序列刪除位置325的Gly以及位置326的Lys(EU編碼系統分別為位置446與447)。
本發明亦有關於降低源自於IgG2的絞鏈區之異質性的方法、改善抗體在血清滯留度的方法、及/或降低源自C端之抗體異質性的方法，其全部包括在IgG2恆定區具有SEQ ID NO:20(M73)胺基酸序列，步驟為：(a)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)；(b)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)；(c)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)；(d)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)；(e)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)；(f)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gln取代位置147的His(EU編碼系統為位置268)；(g)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Gln取代位置234的Arg(EU編碼系統為位置355)；(h)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Glu取代位置298的Gln(EU編碼系統為位置419)；(i)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以Ala取代位置313的Asn(EU編碼系統為位置434)；以及(j)在SEQ ID NO:20胺基酸序列刪除位置325的Gly以及位置326的Lys(EU編碼系統分別為位置446與447)。
本發明亦有關於降低源自於IgG2的絞鏈區之異質性的方法、降低源自C端之抗體異質性的方法、及/或降低FcγR與抗體結合的方法，其全部包括在IgG2恆定區具有SEQ ID NO:20(M86ΔGK)胺基酸序列，步驟為；(a)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置209的Ala(EU編碼系統為位置330)；(b)在SEQ ID NO：20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置210的Pro(EU編碼系統為位置331)；(c)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置218的Thr(EU編碼系統為位置339)；(d)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)；(e)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)；(f)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)；(g)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)；(h)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)；以及(i)在SEQ ID NO:20胺基酸序列刪除位置325的G1y以及位置326的Lys(EU編碼系統分別為位置446與447)。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置209的Ala(EU編碼系統為位置330)、Ser取代位置210的Pro(EU編碼系統為位置331)、Ala取代位置218的Thr(EU編碼系統為位置339)、Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、以及Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)是較佳的。
本發明更有關於降低源自於IgG2的絞鏈區之異質性的方法、及/或降低源自C端之抗體異質性的方法，其全部包括在IgG2恆定區具有SEQ ID NO:20(M40ΔGK)胺基酸序列，步驟為：(a)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)；(b)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)；(c)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)；(d)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)；(e)在SEQ ID NO:20胺基酸序列以其他胺基酸取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)；以及(f)在SEQ ID NO:20胺基酸序列刪除位置325的Gly以及位置326的Lys(EU編碼系統分別為位置446與447)。
取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)、Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)、Ser取代位置102的Cys(EU編碼系統為位置219)、Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)、以及Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)是較佳的。
本發明之方法可能包含其他步驟，例如胺基酸取代與刪除，只要它們包括前述步驟。胺基酸取代與刪除的方法並無特別限制。取代與刪除可以被達成，例如，經由前述定點突變方法或實施例所述的方法。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
<改善IgG4恆定區在酸性環境之穩定性的方法>
本發明亦有關於改善在酸性環境下抗體穩定性的方法，其包括在具有SEQ ID NO:21胺基酸序列之IgG4恆定區以其他胺基酸取代位置289的Ala(EU編碼系統為位置409)的步驟(Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8)。本發明用於改善在酸性環境下抗體穩定性的方法可能包含其他的胺基酸取代步驟，只要它們包括在SEQ ID NO:21胺基酸序列(人類IgG4恆定區)以其他胺基酸取代位置289的Ala(EU編碼系統為位置409)的步驟。取代後的胺基酸類型並無特別限制；然而，取代為Lys是較佳的。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被完成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
<降低在IgG4恆定區源自於C端的刪除之異質性的方法>
本發明亦有關於降低抗體之異質性的方法，其包括在SEQ ID NO:21之胺基酸序列刪除位置326的Gly(EU編碼系統為位置446)以及位置327的Lys(EU編碼系統為位置447)的步驟(Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8)。本發明用於降低抗體之異質性的方法可能包含其他的胺基酸取代步驟，只要它們包括在具有SEQ ID NO:21胺基酸序列之IgG4恆定區刪除位置327的Lys(EU編碼系統為位置447)及/或位置326的Gly(EU編碼系統為位置446)的步驟(Mol. Immunol. 1993Jan;30(1):105-8)。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被完成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
本發明亦有關於改善在酸性環境之穩定性的方法、降低源自於C端之異質性的方法、及/或降低FcγR與抗體結合的方法，其全部包括在IgG4恆定區具有SEQ ID NO:21(M11ΔGK)胺基酸序列(Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8)，步驟為：(a)在SEQ ID NO：21胺基酸序列以Ser取代位置14的Cys(EU編碼系統為位置131)；(b)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Lys取代位置16的Arg(EU編碼系統為位置133)；(c)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Gly取代位置20的Glu(EU編碼系統為位置137)；(d)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Gly取代位置21的Ser(EU編碼系統為位置138)；(e)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Thr取代位置97的Arg(EU編碼系統為位置214)；(f)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Arg取代位置100的Ser(EU編碼系統為位置217)；(g)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Ser取代位置102的Tyr(EU編碼系統為位置219)；(h)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Cys取代位置103的Gly(EU編碼系統為位置220)；(i)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Val取代位置104的Pro(EU編碼系統為位置221)；(j)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Glu取代位置105的Pro(EU編碼系統為位置222)；(k)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Pro取代位置113的Glu(EU編碼系統為位置233)；(l)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Val取代位置114的Phe(EU編碼系統為位置234)；(m)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Ala取代位置115的Leu(EU編碼系統為位置235)；(n)在SEQ ID NO:21胺基酸序列刪除位置116的Gly(EU編碼系統為位置236)；(o)在SEQ ID NO:21胺基酸序列以Lys取代位置289的Arg(EU編碼系統為位置409)；以及(p)在SEQ ID NO:21胺基酸序列刪除位置236的Gly與位置237的Lys(EU編碼系統分別為位置446與447)。
本發明之方法可能包含其他步驟，例如胺基酸取代與刪除，只要它們具有前述的步驟。胺基酸取代與刪除的方法並無特別限制。取代與刪除可以被完成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
<降低在IgG1恆定區源自於C端胺基酸刪除之異質性的方法>
本發明亦有關於降低抗體異質性的方法，其包括在具有SEQ ID NO:19胺基酸序列之IgG1恆定區刪除位置329的Gly(EU編碼系統為位置446)以及位置330的Lys(EU編碼系統為位置447)的步驟。本發明用於降低抗體異質性的方法可能包含其他的胺基酸取代步驟，只要它們包括在具有SEQ ID NO:19胺基酸序列之IgG1恆定區刪除位置330的Lys(EU編碼系統為位置447)以及位置329的Gly(EU編碼系統為位置446)的步驟。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代可以被達成，例如，經由前述的定點突變或實施例所述的方法。
<藉由取代IgG1恆定區之胺基酸以改善在血清滯留度的方法>
本發明係有關於改善抗體在血清滯留度的方法，其包括在具有SEQ ID NO:19胺基酸序列之IgG1恆定區以其他胺基酸取代位置317的Asn(EU434)的步驟。取代後的胺基酸類型並無特殊限制；然而，取代為Ala是較佳的。本發明用於改善抗體在血清滯留度的方法可能包括其他胺基酸取代的步驟，只要它們包含前述的步驟。
本發明亦有關於改善抗體在血清滯留度的方法及/或降低源自於C端之異質性的方法，其二者均包括在IgG4恆定區具有SEQ ID NO:19(M83)胺基酸序列，步驟為：(a)在SEQ ID NO:19胺基酸序列以Ala取代位置317的Asn(EU434)；以及(b)在SEQ ID NO:19胺基酸序列刪除位置330的Lys(EU編碼系統為位置447)與位置329的Gly(EU編碼系統為位置446)。
標的抗體的類型並無特別限制；然而，該抗體較佳為抗人類IL-6受體的抗體，更佳為人類化PM-1抗體或其具有取代、刪除、及/或嵌入之變異物。
本發明前述之恆定區可被與任何抗體變異區組合，而較佳係與源自對抗人類IL-6受體之抗體的變異區。對抗人類IL-6受體之抗體的變異區包括，例如，人類化PM-1抗體的變異區。人類化PM-1抗體的變異區可能不包括任何胺基酸取代或可能包括如前所述的取代。
本發明提供包括本發明之抗體的醫藥組合物。本發明之醫藥組合物係有用於治療與IL-6相關疾病，例如類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)。
本發明醫藥組合物可以被配製，除了抗體，以已知方法加入藥學上可接受的載體(pharmaceutically acceptable carriers)。例如，組合物可以被非經腸道使用(parenterally)，當抗體被以無菌溶液或懸浮液配製，以利用水或任何其他藥學上可接受的液體注射。例如，組合物可被配製，經由適當組合抗體與藥學上可接受的載體或液體，特別是，無菌水或生理食鹽水、蔬菜油、乳化劑、懸浮劑、介面活性劑、穩定劑、香味劑、賦形劑、載體、防腐劑、結合劑以及類似物，經由以通常可接受之醫藥使用方式所需要的單位劑量或形式混和它們。在這類配方中活性成分的含量可以被調整，以便能得到所需範圍之適當劑量。
用於注射的無菌組合物可以依據標準程序利用載體配製，例如用於注射的蒸餾水。
用於注射的水溶液包括，例如生理食鹽水與具有葡萄糖或其他佐劑，如山梨糖醇(D-sorbitol)、甘露糖(D-mannose)、甘露糖醇(D-mannitol)與氯化鈉之等張溶液。這些可與適合的助溶劑(solubilizer)結合使用，例如醇類，特別是乙醇，多元醇，例如丙烯乙二醇(propylene glycol)與聚乙二醇(polyethylene glycol)，以及非離子性介面活性劑，例如聚山梨醇酯(Po1ysorbate)80TM與HCO-50。
油類包括芝麻油與大豆油，且可與助溶劑組合，例如苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)或苯甲醇(benzyl alcohol)。這些亦可與緩衝液配製，例如磷酸緩衝液或醋酸碘緩衝液；與止痛劑(ana1gesics)，例如鹽酸普魯卡因(procaine hydrochloride)；與穩定劑，例如苯甲醇或酚類；或與抗氧化劑。配製的注射劑通常以適當的容器配製為一份。
給藥較佳地係以非經腸道式進行，且特別地包括注射、鼻腔給藥、肺部給藥、以及經皮給藥。例如，注射可以被系統性或局部性進行，經由靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、或皮下注射。
此外，給藥方法可以被適當的選擇，根據患者的年齡與症狀。具有抗體或編碼抗體之聚胜肽之醫藥組合物的單一劑量可以被選擇，例如，由每公斤體重為0.0001至1,000毫克的範圍。可選擇地，劑量可為，例如每人0.001至100,000毫克。然而，劑量並非僅限於這些數值。給藥劑量與方法的變化依據患者的體重、年齡、與症狀而不同，且可由熟悉技藝人士進行適當的選擇。
如此處所使用的，對應胺基酸的三字母與單一字母密碼如下所示：丙胺酸(Alanine):Ala(A)精胺酸(Arginine):Arg(R)天冬醯胺酸(Asparagine):Asn(N)天冬胺酸(Aspartic acid):Asp(D)胱胺酸(Cysteine):Cys(C)麩醯胺酸(Glutamine):Gln(Q)麩胺酸(Glutamic acid):Glu(E)甘胺酸(Glycine):Gly(G)組胺酸(Histidine):His(H)異白胺酸(Isoleucine):Ile(I)白胺酸(Leucine):Leu(L)離胺酸(Lysine):Lys(K)甲基胺酸(Methionine):Met(M)***酸(Phenylalanine):Phe(F)脯胺酸(Proline):Pro(P)絲胺酸(Serine):Ser(S)穌胺酸(Threonine):Thr(T)色胺酸(Tryptophan):Trp(W)酪胺酸(Tyrosine):Tyr(Y)纈胺酸(Valine):Val(V)本發明所提供之第二代分子，其比人類化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB更優良，已被改善以表現增強的抗原中和活性與血清滯留度，因此產生延長的療效，即使給藥的頻率已經降低。它們亦被改善以具有降低的免疫原性，與改善的安全性與物理特性，經由改變TOCILIZUMAB的變異與恆定區之胺基酸序列。此外，本發明亦提供適用於醫藥之抗體恆定區。
所有引用之前案文件在此整體加入作為本發明之引用文獻。
實施例
以下，本發明特別地以實施例加以敘述，但其不構成限制。
實施例1：利用親和性突變技術透過修改CDR對抗原結合活性之改善
SR344的製備(Preparation of SR344)報導於J. Biochem.(1990)108,673-676(Yamasaki等人,Science(1988)241,825-828(GenBank#X12830))，持續表現可溶性人類IL-6R(以下稱為SR344)之N端1st 至344th 胺基酸序列的CHO細胞株被製備。
SR344從表現SR344的CHO細胞之培養上清液被純化，利用三種管柱層析法：瓊脂糖凝膠6FF管柱層析法(Blue Sepharose 6 FF column chromatography)、具有SR344專一性抗體固定管柱的親和性層析法(affinity chromatography with an SR344-specific antibody-immobitized column)、以及膠體過濾管柱層析法(gel filtration column chromatography)。
培養上清液被直接地加入瓊脂糖凝膠6FF管柱(GE Healthcare Bio-Sciences)，以20mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)調整平衡，且未吸附的餾份被完全地以相同緩衝液洗去。隨後，管柱以具有300mM KCl的相同緩衝液清洗。吸附的蛋白質接著利用相同緩衝液，於300mM KCl存在下，以0至0.5M KSCN的線性濃度梯度被洗提。以KSCN濃度梯度洗提的餾份被以西方轉印法分析，利用SR344專一性抗體，而具有SR344的餾份被收集。
SR344專一性抗體固定之管柱被以Tris緩衝食鹽水(Tris-buffered saline，TBS)預先平衡。在第一步驟得到的SR344餾份被濃縮，經由利用Amicon Ultra-15(MILLIPORE；分子量10kDa的截留(cut-off))的超過濾，並於被加入管柱前以TBS稀釋為二倍。在管柱被以TBS沖洗後，吸附的蛋白質被以100mM甘胺酸-鹽酸(glycine-HCl)緩衝液(pH 2.5)洗提。洗提的餾份被加入1M Tris(pH8.1)而中和。所得到的餾份被以SDS-PAGE分析，以收集具有SR344的餾份。
第二步驟得到的餾份使用Amicon Ultra-15(分子量10kDa截留)而被濃縮，並加入至Superdex 200管柱(GE Healthcare Bio-Sciences)以PBDS調平衡。在主要波峰被洗提的餾份被用於SR344最後純化的樣本。
表現人類gp130之BaF3細胞株的建立
表現人類gp130之BaF3細胞株利用下述過程被建立，以得到IL-6依賴型生長的細胞株。
全長人類gp130 cDNA(Hibi等人,Cell(1990)63,1149-1157(GenBank #NM_002184))被以PCR複製並選殖至表現載體pCOS2Zeo以構築pCOS2Zeo/gp130。pCOS2Zeo是一個表現載體，其經由去除pCHOI的DHFR基因表現區域(Hirata等人，FEBS Letter(1994)356,244-248)，並***抗生素Zeoxin抗性基因的表現區域而構築。全長人類IL-6R cDNA被以PCR複製，並殖入pcDNA3.1(+)(Invitrogen)以構築hIL-6R/pcDNA3.1(+)。
10微克(μg)的pCOS2Zeo/gp130被與懸浮於PBS的BaF3細胞(0.8x107 個細胞)混合，隨後利用Gene Pulser(Bio-Rad)以0.33kV與950μFD電擊。經由電穿孔導入基因的BaF3細胞被培養一天一夜，於添加0.2毫微克(ng)/毫升小鼠介白素-3(interleukin-3，Peprotech)與10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS，HyClone)之RPMI 1640培養液(Invitrogen)，而後被收集，經由加入補充100毫微克/毫升人類介白素-6(R&D systems)、100毫微克/毫升人類介白素-6可溶性受體(R&D systems)、以及10%的FBS之RPMI 1640培養液，以建立表現人類gp130之BaF3細胞株(以下稱為BaF3/gp130)。這個BaF/gp130在人類介白素-6(R&D systems)與SR344存在的條件下增生，並因此可用於評估抗IL-6受體的抗體之生長抑制活性(或IL-6受體中和活性)。
改變的CDR庫的建立
首先，人類化PM-1抗體(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)被轉換為scFv。VH與VL區域被以PCR複製，以準備在VH與VL之間具有連接子序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:106)之人類化PM-1HLscFv。
二類型基因庫(library)被以PCR構築，利用所製備之編碼人類化PM-1 HL scFv的DNA當作模版。一個是標的庫(target library)，其中在CDR的胺基酸之一被標記為X，而其他為基因庫，其中僅有在CDR之熱點序列(hot spot sequence)被隨機的序列所取代。每個CDR之一個胺基酸被標記為X之標的庫被以如下方式所構築。基因庫部分(library portion)以PCR利用具有用於欲被嵌入基因庫之NNS的引子而構築，而其他部分則以標準PCR方式製備。二者被以組合PCR接在一起。在此構造，僅有一CDR會多元化為基因庫(see J. Mol. Biol.(1996)256,77-88)。同樣地，僅有熱點序列被以隨機的序列取代的基因庫被以PCR利用具有用於全部熱點胺基酸之NNS的引子而構築。在此構造，二個基因庫被構築：一個為僅有在VH的熱點被多元化的基因庫，而另一個為僅有在VL的熱點被多元化的基因庫(請參照Nature Biotechnology 1999 June;17:568-572)。
核糖體展示基因庫(ribosome display library)係根據文獻(J. Immunological Methods(1999)231,119-135)，使用前述基因庫而被構築。為了在無細胞之大腸桿菌系統中進行活體外的轉譯，SDA序列(核糖體結合位置)與T7啟動子被接於5’端，而部分基因3序列被當作核糖體展示連接子而利用SfiI接於3’端。
藉由核糖體展示之高親和性scFV的篩選
核糖體展示為基礎之篩選被進行(Nature Biotechnology 2000 Dec;18:1287-1292)。所製備的SR344利用NHS-PEO4-生物素(Pierce)進行生物素標記，隨後被當作抗原。解離速率篩選法(Off-rate selection)被進行，以便高效率得到高親和性scFv(JBC(2004)279(18),18870-18877)。生物素標記抗原與競爭抗圓的濃度分別為1nM與1μM。在第四輪競爭的時間為10日夜(O/N)。
scFV：嵌入噬菌質體、抗體結合與序列分析
PCR被進行以重新構築HL scFv，利用在第四輪得到之模版DNA池(DNA pool)與專一性引子。以SfiI分解後，片段被***預先以SfiI分解之噬菌質體pELBG lacI。XL1-Blue(Stratagene)與所產生的構築物轉型。利用所生成的菌落，抗原結合利用噬菌體ELISA被評估，且HL scFv序列被分析。噬菌體ELISA使用塗佈1μg/ml之SR344試驗盤進行(J. Mol. Biol.(1992)227,381-388)。表現SR344結合的菌株使用專一性引子分析其序列。
scFv至IgG的轉換，以及IgG的表現與純化
IgG的表現利用動物細胞表現載體進行。具有特定突變所加強的菌株被作為PCR標的，以複製它們的VL與VH。在XhoI/NheI分解以及EcoRI分解後，複製的DNA被***動物細胞表現載體。每個DNA片段的核苷酸序列被決定，使用DNA定序儀(ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer或ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems))，利用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，依據其所附的說明書所述。
IgG轉換之抗體的表現
抗體表現以下述方法進行。源自人類胚胎腎癌的HEK293H細胞(Invitrogen)被懸浮於補充10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養液(Invitrogen)。細胞(10毫升/盤，細胞密度為6 x 105 個細胞/毫升)以貼附細胞的方式種於培養盤(10公分直徑，CORNING)，並於二氧化碳培養器(CO2 incubator，37℃，5% CO2 )培養完整一天一夜。之後，培養液被抽取移除，而6.9毫升的CHO-S-SFM-II培養液(Invitrogen)被添加。所製備的質體DNA混合物(總共13.8微克)被與20.7微升的1微克/毫升聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，Polysciences公司)以及690微升CHO-S-SFMII培養液組合。產生的混合物被允許於室溫保持10分鐘，隨後添加於每個培養盤的細胞。細胞於CO2 培養器(37℃、5% CO2 )培養4至5小時。接著，6.9毫升的CHO-S-SFM-II培養液(Invitrogen)被加入培養盤，而細胞於CO2 培養器被培養三天。培養上清液被收集與離心(大約2000g、5分鐘、室溫)以去除細胞，並以0.22微米過濾膜MILLEX(R) -GV(Millipore)過濾滅菌。room temperature)to remove the cells,and sterilized through.樣品被儲存於4℃直到使用。
IgG轉換之抗體的純化
懸浮於TBS之50微升的rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)被加入所得到的培養上清液，組合的溶液於4℃被倒轉混合4小時或以上。溶液被轉移到Ultrafree(R) -MC(Millipore)00.22微米過濾杯。以500微升TBS沖洗三次後，rProtein A SepharoseTM 樹脂被懸浮於100微升的50mM醋酸鈉(pH3.3水溶液，該混合物被允許放置2分鐘以洗提抗體。立即地，洗提液被中和，經由加入6.7微升的1.5M Tris-HCl(pH 7.8)。洗提被進行二次，產生200微升的純化抗體。在波長280毫微米(nm)的吸收度被決定，利用ND-1000光譜儀(NanoDrop)或光譜儀DU-600(BECKMAN)，分別使用2或50微升的抗體溶液。抗體濃度由所得到的數值依據下列公式計算：
抗體濃度(毫克/毫升)=[吸收度 x 稀釋倍數]/14.6 x 10
IgG轉換之選殖株對人類IL-6受體中和活性的評估
IL-6受體中和活性被評估，使用BaF3/gp130，其以IL-6/IL-6受體依賴形式增生。以補充10% FBS的 RPMI1640清洗三次後，BaF3/gp130細胞被以5 x 104 細胞/毫升懸浮於添加60毫微克(ng)/毫升人類介白素一6(TORAY)、60毫微克/毫升的重組可溶性人類IL-6受體(SR344)、以及10% FBS的RPMI1640。細胞懸浮液以每孔50微升佈散於96孔盤(CORNING)。之後，純化的抗體以具有10% FBS的RPMI1640稀釋，並加入每孔(50微升/well)。細胞於37℃、5% CO2 被培養三天。WST-8試劑(細胞計數套組(Cell Counting Kit-8);Dojindo Laboratories)以PBS稀釋為二倍。緊接著在20微升的試劑被加入每孔之後，450毫微米的吸收度(參考波長：620毫微米)被測量，利用SUNRISE CLASSIC(TECAN)。在培養二小時後，450毫微米的吸收度(參考波長：620毫微米)再次被測量。IL-6受體中和活性被評估，利用二小時期間吸收度的變化作為指標。
結果，活性高於人類化PM-1抗體(野生型，WT)之抗體的數目被獲得。活性高於WT之抗體的突變如第4圖所示。例如，如第1圖所示，在100%抑制濃度(inhibitory concentration)下，RD_6的中和活性約比WT高50倍。
IgG轉換之選殖株的Biacore親和性分析
活性高於野生型之選殖株使用Biacore T100(BIACORE)以抗原-抗體反應動力學分析。抗原-抗體交互作用被測量，經由固定1800至2600共振單位(resonance units,RU)的rec-Protein A(ZYMED)(以下稱為Protein A)於感測晶片(sensor chip)，結合不同的抗體到晶片上，以及接著佈放抗原於晶片當作分析物(analyte)。不同濃度的重組人類IL-6R sR(R&D systems)(以下稱為rhIL-6sR)被當作抗原。全部的測量在25℃進行。動力學參數，結合速率常數(association rate constantka ,1/Ms)與解離速率常數(dissociation rate constant kd ,1/s)由測量得到的感應圖譜(sensorgrams)而計算。而後，KD (M)基於速率常數而被決定。對應的參數利用Biacore T100 Evaluation Software(BIACORE)而被決定。
結果，比人類化PM-1抗體(野生型，WT)表現較高親和性的抗體被獲得。例如，野生型(WT)與RD_6的感應圖譜分別如第2圖與第3圖所示。動力學參數分析的結果顯示RD_6具有比WT高約50倍的親和性(表一)。除了RD_6，具有比WT高數倍之親和性的抗體亦被得到。造成比WT親和性高的突變如第4圖所示。
實施例2：經由CDR改變的不同組合之抗體結合活性的改善
與強活性或高親和性有關的突變被結合，以創造具有較強活性與較高親和性的抗體。
被修改的抗體之生產、表現與純化
在選定位置的胺基酸被修改以生產被修改的抗體。特別地，突變被導入所製備之H(WT)變異區(H(WT),SEQ ID NO:107)以及L(WT)變異區(L(WT),SEQ ID NO:108),利用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，依據隨附說明手冊所述的方法。在被確認嵌入質體的抗體H鏈基因片段是標的之人類化抗體變異區基因序列後，質體被以XhoI與NotI分解。具有標的抗體L鏈基因片段之質體被以EcoRI分解。隨後，反應混合物被移至於1%凝膠電泳。預期尺寸(約400bp)的DNA片段被純化，利用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)，依據隨附說明手冊所述的方法。DNA以30微升的無菌水洗提。之後，抗體H鏈基因片段被嵌入動物細胞表現載體以構築標的之H鏈表現載體。用於L鏈之表現載體亦以相同方式構築。接合作用(Ligation)利用Rapid DNA Ligation Kit(Roche Diagnostics)進行。大腸桿菌品系DH5 α(Toyobo)與質體進行轉型。每個DNA片段之核苷酸序列以DNA定序儀(ABI PRISM 3730xL DNA Sequenceror ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems))決定，依據隨附之說明手冊所述的方法使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Rit(Applied Biosystems)。抗體使用構築的載體表現，以及如實施例1所述的方法純化。
中和人類IL-6受體之活性的評估
純化的抗體依實施例1所述方法被評估其中和活性。中和活性使用600毫微克/毫升之人類介白素-6(TORAY)而被評估。活性比WT強之新穎抗體的數目被獲得。抗體的CDR序列如第5圖所示。在其中，具有最強活性的抗體(即RDC_23)，具有RDC_5H為H鏈，以及RDC_11L為L鏈。RDC_23的中和活性如第6圖所示。在100%抑制濃度下，RDC_23的活性被顯示比WT高約100倍。改善的中和活性被觀察到，不僅在RDC_23，其係具有RDC_5H為H鏈以及RDC_11L為L鏈的抗體，亦在抗體RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_27、RDC_28、RDC_29、RDC_30、以及RDC_32，其均具有L(WT)為L鏈，以及分別以RDC_2H、RDC_3H、RDC_4H、RDC_5H、RDC_6H、RDC_7H、RDC_8H、RDC_27H、RDC_28H、RDC_29H、RDC_30H、與RDC_32H為H鏈，如同抗體RDC_11，其依序具有H(WT)與RDC_11L為H與L鏈。因此顯示，具有較強中和活性之抗體可以被得到，經由結合親和性成熟(affinity maturation)所發現之突變。此外，既然具有這類突變組合之抗體擁有改善的中和活性，其也被期待擁有改善的親和性。
使用蛋白質A的Biacore親和性分析
因此，具有改善之中和活性的抗體RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、以及RDC_23被分析抗原-抗體反應動力學，利用Biacore T100(BIACORE)。抗原-抗體交互作用被測量，經由固定4400至5000RU的rec-Protein A(ZYMED)透過胺基耦合法(aminecoupling method)固定於感應晶片，結合不同的抗體於晶片上，隨後將抗原佈放於晶片當作分析物。作為抗原，不同濃度的rhIL-6sR被使用。全部的測量在25℃進行。動力學參數，結合速率常數(ka ，1/Ms)與解離速率常數(kd ,1/s)由測量得到的感應圖譜而計算。而後，KD (M)基於速率常數而被決定。對應的參數利用Biacore T100 Evaluation Software(BIACORE)而被決定。結果顯示RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、以及RDC_23，其全部包含突變的組合，相較於具有單一突變的RD_28，具有較小的KD 值(表二)。具有較高之親和性的RDC_12的感應圖譜如第7圖所示。
這個發現暗示，這些抗體比不具突變組合之來源抗體具有更高親和性。在中和活性的情形，這顯示具有較高親和性的抗體可由組合親和性成熟所發現之突變而獲得。比WT具有更高活性或親和性之變異株的胺基酸序列係如下所示(與WT相關的突變以底線標示)。
(HCDR2)SEQ ID NO:45 YISYSGITNYNPSLKS(HCDR3)SEQ ID NO:57 LLARATAMDYSEQ ID NO:58 VLARATAMDYSEQ ID NO:59 ILARATAMDYSEQ ID NO:60 TLARATAMDYSEQ ID NO:61 VLARITAMDYSEQ ID NO:62 ILARITAMDYSEQ ID NO:63 TLARITAMDYSEQ ID NO:64 LLARITAMDY(LCDR3)SEQ ID NO:79 GQGNRLPYT
特別地，相較於WT，具有顯著地改善之親和性與中和活性之抗IL-6受體的抗體可以被製造，經由設計抗體在HCDR2胺基酸位置9為Asn、在HCDR3胺基酸位置1為Leu、Val、Ile、或Thr、在HCDR3胺基酸位置5為Ala或Ile、在LCDR3胺基酸位置1為Gly、以及在LCDR3胺基酸位置5為Arg
使用蛋白質A/G之Biacore親和性分析
WT與RDC_23被分析抗原-抗體反應動力學，利用Biacore T100(BIACORE)。抗原-抗體交互作用被測量，經由固定純化的Recomb Protein A/G(Pierce)(以下稱為蛋白質A/G)於感應晶片，結合不同的抗體於晶片上，隨後將抗原佈放於晶片當作分析物。不同濃度的rhIL-6sR(R&D systems)與重組的可溶性IL-6受體(實施例1所製備之SR344)被用於當作抗原。桿狀病毒感染之昆蟲細胞所生產之rhIL-6sR的糖鏈結構是高甘露糖類型(high-mannose type)。另一方面，由CHO細胞生產之SR344的糖鏈結構被認為其末端具有唾液酸(sialic acid)之複雜的糖鏈類型。既然在真實人體內之可溶性IL-6受體的糖鏈結構被認為係為末端具有唾液酸(sialicacid)之複雜的糖鏈類型，SR344被預期具有與人體內可溶性IL-6受體較相近的結構。因此，在本實施例進行rhIL-6sR與SR344之間的比較試驗。
動力學參數，結合速率常數(ka ,1/Ms)與解離速率常數(kd ,1/s)由測量得到的感應圖譜而計算。而後，KD (M)基於速率常數而被決定。對應的參數利用Biacore T100 Evaluation Software(BIACORE)而被決定。
感應晶片被製備，經由以胺基耦合法固定約3000 RU的蛋白質A/G於CM5(BIACORE)。二種可溶性IL-6受體((rhIL-6sR與SR344)以及抗體(WT與RDC_23)之間與蛋白質A/G結合交互作用的動力學利用已製備的感應晶片而分析。所使用之緩衝液(running buffer)為HBS-EP+，流速為20微升/分鐘。每個抗體被製備，以使約100 RU的抗體與蛋白質A/G結合。作為分析物，rhIL-6sR使用HBS-EP+製備為0、0.156、0.313、以及0.625微克/毫升，而SR344被調整為0、0.0654、0.131、以及0.261微克/毫升。在測量的第一步驟，標的抗體WT與RDC_23被與蛋白質A/G結合，而分析物溶液被加入。在交互作用三分鐘後，溶液被以HBS-EP+(BIACORE)置換，而解離層被觀察10分鐘。測量解離層後，感應晶片經由以10微升的10mM甘胺酸-鹽酸(glycine-HCl)緩衝液(pH 1.5)沖洗而被更新。結合、解離、與更新構成一次分析過程。所有的實驗在37℃進行。
WT與RDC_23被依據前述過程測量。所產生之二種可溶性IL-6受體，rhIL-6sR與SR344的感應圖譜如第8、9、10、與11圖所示。得到的感應圖譜利用Biacore T100 Evaluation Software(BIACORE)進行動力學分析，該軟體是專用於Biacore的資料分析軟體(表三)。結果顯示當比較rhIL-6sR與SR344時，WT與RDC_23二者對於SR344的親和性低二至三倍。對於rhIL-6sR與SR344二者，RDC_23具有相較於WT改善40至60倍之親和性。因此，顯示了因為由於親和性成熟所獲得之對應CDR修改的組合，RDC_23相較於WT對SR344亦具有顯著地高親和性，其結構被假設與人體的可溶性IL-6受體的結構相近。在此後實施例所述的全部測量均在37℃使用SR344與蛋白質A/G進行動力學分析抗原抗體反應。
實施例3：透過CDR與骨架修改之具有改善的血清滯留度與降低的免疫原性風險之H53/L28的產生
如文獻(Cancer Res. 1993Feb 15;53(4):851-6)所述由人類化小鼠PM-1抗體(以下稱為野生型或WT；WT的H與L鏈分別稱為H(WT)與L(WT))所得到的抗體，被修改以改善在血清的滯留度、降低免疫原性風險、以及增加穩定性。修改如下所述。基於改善在血清滯留度之目的，WT的H與L鏈變異區序列被修改以降低等電點。
人類化PM-1抗體之三D結構模型的建立
首先，為了確定暴露於人類化PM-1抗體(H(WT)/L(WT))變異區表面之胺基酸殘基，由人類化小鼠PM-1抗體所得到之抗體Fv功能區塊的模型，利用MOE軟體(Chemical Computing Group Inc.)經由同源性模式法(homology modeling)而被創造。
降低人類化PM-1抗體之等電點之修改位置的選擇
建立模型之詳細分析顯示暴露表面之FR序列的胺基酸H16、H43、H81、H105、L18、L45、L79、以及L107(Kabat氏編碼系統；numbering system;Rabat EA等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,NIH)，以及那些在CDR序列的胺基酸H31、H64、H65、L24、L27、L53、以及L55，係為用於修改以降低等電點而不降低活性或穩定性之位置的潛在候選者。
從人類化PM-1抗體之保持的小鼠序列
人類化PM-1抗體係為一抗體，其序列經由人類化小鼠PM-1抗體而獲得(Cancer Res. 1993 Feb15；53(4)：851-6)。人類化PM-1抗體的H鏈經由剪接CDR於人類抗體變異區之NEW骨架而獲得。然而，小鼠序列仍維持在H鏈的H27、H28、H29、H30、以及H71以保持活性。基於免疫原性風險的觀點，最佳的結果被預期，當小鼠序列的數目為最低時。因此，本發明之發明人尋找序列，以將H27、H28、H29、與H30轉換為人類序列。
用於改善人類化PM-1抗體穩定性之修改位置的選擇
本發明之發明人推測可能可以改善人類化PM-1抗體(H(WT)/L(WT))的穩定性，經由在其變異區以甘胺酸取代H65的絲胺酸(彎曲結構(turn structure)的穩定；透過轉換為HCDR2通用序列而穩定)、異白胺酸取代H69的甲基胺酸(斥水性核心的穩定)、絲胺酸取代H70的白胺酸(經過以親水性殘基替換暴露於表面之殘基而穩定)、天冬醯胺酸取代H58的穌胺酸(經由轉換為HCDR2通用序列而穩定)、絲胺酸取代L93的穌胺酸(經過以親水性殘基替換暴露於表面之殘基而穩定)、以及異白胺酸取代H107的絲胺酸(β片層(β sheet)的穩定)，並認為這些修改為增加穩定性的候選者。
電腦預測之源自人類化PM-1抗體之T細胞抗原決定位的去除
首先，人類化PM-1抗體的變異區(H(WT)/L(WT))被以TEPITOPE(Methods 2004 Dec;34(4)：468-75)分析。結果顯示L鏈CDR2具有許多與HLA結合的T細胞抗原決定位。因此，TEPITOPE分析被進行，以尋找降低L鏈CDR2免疫原性風險而不減少穩定性、結合活性、或中和活性的修改。結果顯示HLA結合T細胞抗原決定位可以被移除而不減少穩定性、結合活性、或中和活性，經由在L鏈CDR2以甘胺酸取代L51的穌胺酸。
對應之骨架序列的選擇
同源性搜尋可以個別框架(frame)進行，經由使用由公開資料庫可得之人類抗體胺基酸序列所建構的資料庫：Kabat Database(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)以及IMGT Database(http://imgt.cines.fr/)。基於降低等電點、去除殘留的小鼠序列、以及改善穩定性的觀點，人類框架經由搜尋具有前述修改之人類框架序列的資料庫而被選擇。結果表示被修改的抗體H53/L28符合前述需求而不減少結合活性或中和活性，當其對應之骨架由以下所示序列所組成時。來源(SOURCE)表示人類序列的來源。在每個序列中底線標記的胺基酸序列代表相對於WT被修改的胺基酸。
此外，前述H53的FR3具有一個非人類序列；因此，最好進一步降低其免疫原性風險。一個用於降低免疫原性風險的可能修改為序列取代，導致在H89以Val交換Ala(SEQ ID NO:127)。此外，既然在H53的FR3之H71的Arg對於結合活性很重要(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)，具有由全長人類序列組成之H與L鏈的抗人類IL-6受體的抗體可以被製造，經由使用人類VH1次群組(SEQ ID NO:128)或人類VH3次群組(SEQ ID NO:129)的FR3序列，在其中H71的Arg是被保留的。
對應之CDR序列的選擇
H53/L28的對應之CDR序列被如下所示選擇，基於降低等電點、改善穩定性、以及去除T細胞抗原決定位的觀點，以及最重要地，不減少結合活性或中和活性。
用於被修改之抗體表現載體的構築、抗體的表現與純化
用於被修改之抗體的表現載體被構築，且抗體利用實施例1所述的方法被表現與純化。人類化的小鼠PM-1抗體被持續地修改以具有選用於抗體H(WT)與L(WT)突變載體之框架與CDR序列。利用最後得到的編碼H53/L28之動物細胞表現載體(胺基酸序列：H53，SEQ ID NO:104；以及L28，SEQ ID NO:105)，其具有所選擇的框架與CDR序列，H53/L28被表現與純化，隨後被用於下述的評估。
修改的抗體H53/L28經等電聚焦法的等電點評估
WT與被修改的抗體H53/L28被以等電聚焦法分析，以評估由變異區胺基酸修改所造成的整個抗體等電點的改變。等電聚焦法的程序如下所述。使用Phastsystem Cassette(Amersham Biosciences)，Phast-Gel Dry IEF凝膠(Amersham Biosciences)於以下所示的補液.(rehydration solution)中被再水化(rehydrated)約30分鐘。
Milli-Q water　1.5毫升Pharmalyte 5-8 for IEF(Amersham Biosciences)50微升Pharmalyte 8-10.5 for IEF(Amersham Biosciences)50微升電泳於PhastSystem(Amersham Biosciences)進行，根據下列所示的程序使用復水凝膠。樣品被加入步驟2的凝膠。使用Calibration Kit for pI(Amersham Biosciences)以當作pI標識物。
步驟1:2000V　2.5mA　3.5W15℃ 75Vh步驟2:200V　2.5mA　3.5W15℃ 15Vh步驟3:　2000V　2.5mA　3.5W15℃ 410Vh
在電泳以後，凝膠被以20%的TCA固定，接著依據套組隨附的程序使用Silver Staining Kit、蛋白質(Amersham Biosciences)進行銀染。染色後，樣品(整個抗體)的等電點被計算，經由已知的pI標識物之等電點。結果顯示，WT的等電點為約9.3，而修改的抗體H53/L28的等電點為約6.5至6.7。在WY之胺基酸取代所產生的H53/L28，其等電點降低約2.7。H53/L28的變異區(VH與VL序列)之理論值等電點，被以GENETYX計算(GENETYX CORPORATION)。所決定的理論值等電點為4.52。同時，WT的理論值等電點為9.20。因此，在WY之胺基酸取代所產生的H53/L28，具有一個變異區，其理論值等電點降低約4.7。
H53/L28對人類IL-6受體中和活性的評估
WT與H53/L28被以實施例1所述的方法評估，結果如第12圖所示。修改的抗體H53/L28對中和BaF/gp130之活性相較於WT被改善數倍。特別地，H53/L28與WT的比較顯示當改善中和活性時，等電點可以被降低。
H53/L28對於人類IL-6受體之親和性的Biacore分析
WT與H53/L28對於人類IL-6受體之親和性被評估，利用Biacore T100(BIACORE)動力學分析。抗原-抗體交互作用被測量，經由固定純化的Recomb Protein A/G(Pierce)(以下稱為蛋白質A/G)於感應晶片，結合不同的抗體於晶片上，隨後將抗原佈放於晶片當作分析物。不同濃度的重組可溶性I1-1受體(SR344)被用於當作抗原。量測條件與實施例2所述者相同。
所得之WT與H53/L28感應圖譜係如第13圖所示。動力學分析使用專用於Biacore的資料分析軟體Biacore T100 Evaluation Software進行。結果如表六所示。該結果表示在H53/L28的KD 相較於WT降低約六倍，而這表示親和性被改善約六倍。特別地，H53/L28與WT的比較顯示親和性可以被改善六倍，當同時降低等電點的時候。詳細分析暗示對親和性改善有貢獻的胺基酸突變是在L51以甘胺酸取代穌胺酸。換言之，認為親和性可以被改善，經由在L51以甘胺酸取代穌胺酸。
在H53/L28之T細胞抗原決定位使用TEPITOPE的預測
H53/L28被以TEPITOPE分析(Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)。其結果表示潛在的HLA結合胜肽的數目與WT相比，在H53/L28被明顯地降低。這暗示在人類之免疫原性風險的降低。
實施例4:H53/L28的血清滯留度的評估
修改的抗體H53/L28在正常小鼠之對其血清藥物動力學的評估
為了評估具有降低的等電點之被修改抗體H53/L28的血清滯留度，利用正常小鼠比較WT與修改的抗體H53/L28之間的血清藥物動力學。
WT或H53/L28的單一劑量為非經腸道或皮下以1毫克/公斤對小鼠給藥(C57BL/6J;Charles River Japan,Inc.)。血液在給藥前，以及給藥15分鐘、2小時、8小時、1天、2天、5天、7天、14天、21天、以及28天後收集。需注意，血液在給藥15分鐘後收集僅在靜脈給藥組。收集的血液被以4℃、15,000rpm立即離心15分鐘，以得到血清。分離的血清以-20℃或更低被保存於冰箱至使用。
在小鼠血清的濃度利用ELISA決定。首先，重組人類11-6sR(R&D Systems)利用EZ-LinkTMSulfo-NFS-Biotinylation Kit(PIERCE)被生物素標記。生物素化的人類sIL-6R被噴灑於Reacti-BindStreptavidin High Binding Capacity(HBC)Coated Plates(PIERCE)，且接著被置於室溫一小時或更久。因此，人類-sIL-6R-固定之培養盤係如上述所製備。小鼠血清樣品與標準樣品(血清濃度為3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、以及0.05微克/毫升)被製備並散佈至人類-sIL-6R-固定之培養盤。樣品被置於室溫一小時，之後抗-人類IgG-AP(SIGMA)被加入反應。在使用BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories)作為受質以進行呈色反應後，在650nm的吸收度以培養盤讀取機測量。在小鼠的血清濃度依據使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)之校正曲線的吸收度而決定。WT與H53/L28在靜脈與皮下給藥後之血清濃度的時間進程分別如第14與15圖所示。
所得到的血清濃度-時間資料經由模式獨立分析(model-independent analysis)估算，利用藥物動力學分析軟體WinNonlin(Pharsight)，以評價藥物動力學參數(AUC、清除率(clearance,CL)、以及半衰期(half-life,T1/2))。T1/2由至少三點或那些由WinNonlin自動地選自末期狀態之血清濃度而估計。BA被計算，由皮下給藥後之AUC與靜脈給藥後之AUC的比率而得。決定之藥物動力學參數係如第7圖所示。
靜脈注射後H53/L28在血清之半衰期(T1/2)相較於WT被延長約1.3倍，而清除率被降低約1.7倍。皮下注射後H53/L28的T1/2相較於WT被延長約2倍，而清除率被降低約2.1倍。因此，H53/L28在血清的滯留度可以被明顯地改善，經由降低WT的等電點。
H53/L28是一個相較於人類化的PM-1抗體(WT)具有改善之結合活性與中和活性、降低的免疫原性風險、以及顯著地改善的血清滯留度之人類化的抗I1-6受體的抗體。因此，用於創造H53/L28的修改對於藥物發展可能非常有用。
實施例5：PF1抗體的製備
用於人類化PM-1抗體之表現與突變載體的構築
發現於實施例2的總數4個CDR突變，其改善RDC_23(H與L鏈各二個)，被導入實施例4所創造之H53/L28。由導入RDC_23的突變至H53/L28所得到的H與L鏈分別被命名為PF1_H與PF1_L。修改的抗體依實施例1所述的方法被製備、表現、以及純化。PF1_H與PF1_L的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:22與23所示。
人類IL-受體中和活性的評估
純化的PF1抗體之中和活性依實施例1所述的方法被評估。中和活性評估利用600毫微克/毫升的人類介白素-6(TORAY)進行。WT與PF1的中和活性如第16圖所示。在100%抑制濃度的情形下，PF1被證明具有比WT高約100至1000被的活性。
PF1抗體對人類IL-6受體之親和性的Biacore分析
測量依照實施例2所述的條件進行。所使用之緩衝液為HBS-EP+，流速為20微升/分鐘。每個抗體被製備，以使約100RU的抗體與蛋白質A/G結合。SR344使用HBS-EP+製備為0、0.0654、0.131、以及0.261微克/毫升，並當作分析物。在測量的第一步驟，溶液中的抗體與蛋白質A/G結合以互相反應。在交互作用三分鐘後，溶液被以HBS-EP+置換，而解離層被觀察10或15分鐘。測量解離層後，感應晶片經由以10微升的10mM甘胺酸-鹽酸緩衝液(pH 1.5)沖洗而被更新。結合、解離、與更新構成一次分析過程。
每個抗體均依此過程測量。
所得到的PF1感應圖譜如第17圖所示。感應圖譜利用專用於Biacore的資料分析軟體Biacore T100 Evaluation Software進行動力學分析。結果與WT與H53/L28一起如表八所示。結果表示PF1的親和性相較於WT約改進150倍。RDC_23具有高親和性，係因為親和性成熟之組合的結果，而H53/L28具有延長的血清滯留度與改善的親和性。透過二者的結合，PF1經由加成效應，得到比RDC_23或H53/L28還高的親和性。
PF1抗體之熱穩定性的示差熱分析評估
為了評估PF1抗體之熱穩定性，熱變性(thermal denaturation)的中間點(Tm值)透過示差熱分析(differential scanning calorimetry,DSC)決定。純化的WT與PF1抗體對應著20mM的醋酸鈉、150mM的氯化鈉，於pH6.0(EasySEP,TOMY)被透析。DSC測量被進行，以1℃/分鐘的加熱速率由40至100℃於大約0.1毫克/毫升的蛋白質濃度。結果顯示WT Fab功能區塊的Tm為約94℃，而PF1 Fab功能區塊的則為91℃。IgG1類型抗體分子的Tm通常在約60至85℃的範圍(Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007 Apr 13;355(3):751-7;Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60)。因此，所觀察到的PF1抗體之熱穩定性相較於典型IgG1分子特別地高。
高濃度下PF1抗體之穩定性的評估
PF1抗體被評估在高濃度配方的穩定性。純化的WT與PF1抗體對應著20mM組胺酸鹽酸(histidine chloride)、150mM氯化鈉於pH 6.5(EasySEP,TOMY)被透析，隨後以超過濾濃縮。抗體被測試高濃度下的穩定性，條件如下：抗體；WT與PF1緩衝液：20mM組胺酸鹽酸、150mM氯化鈉，pH 6.0濃度：145毫克/毫升儲存溫度與時間週期：25℃二週、25℃四週、或25℃七週聚集評估方法：系統：Waters Alliance管柱：G3000SWxl(TOSOH)移動相(Mobile phase)：50mM磷酸鈉、300mM氯化鉀、pH 7.0流速、波長：0.5毫升/分鐘、220nm100次稀釋樣品被分析。
在起始配方(立即製備後)以及儲存於不同條件之配方的聚集內容(content of aggregate)經由前述膠體過濾層析法而評價。關於起始配方聚集內容之差異(增加的量)如第18圖所示。結果，得到以下的發現：(1)WT與PF1二者都很穩定；(2)於25℃所增加之聚集量在7週期間約為WT 0.7%以及PF 10.3%，其表示於25℃聚集量每個月約分別增加0.4%與0.17%；以及(3)PF1在高濃度顯著地穩定。專利申請案WO 2003/039485揭露關於Daclizumab穩定性的資料，其為市場可購得之25℃，100毫克/毫升製劑的高濃度IgG。於25℃之每個月增加的聚集量為約0.3%於100毫克/毫升Daclizumab配方。即便與Daclizumab相比，PF1在高濃度存在極佳的穩定性。聚集數量的增加對於發展高濃度液體配方藥物是很大的問題。PF1抗體聚集的增加被證實非常少，甚至當PF1抗體的濃度很高。
PF1是一個WT修改所產生的分子。修改的目的包括抗原結合活性的改善、經由降低等電點對於血清滯留度的改善、經由去除T細胞抗原決定位與殘留之小鼠序列對於免疫原性風險的降低、以及穩定性的改善。甚至，PF1於100毫克/毫升或更高濃度製劑的穩定性被證實非常高，即便與WT相比。用於皮下注射之穩定與高度方便配方可以被提供，經由使用這類分子。
實施例6：使用人類IL-6受體基因轉殖小鼠之PF1抗體的PK/PD測試使用人類IL-6受體基因轉殖小鼠之藥物動力學(體內動力學)的測試實施例5製備的WT與PF1被評估在人類IL-6受體基因轉殖小鼠(hIL-6R tg小鼠；Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 1995 May 23;92(11):4862-6)之藥物動力學(體內動力學)，及其在體內之人類可溶性IL-6受體中和活性。WT與PF1被靜脈注射一次，以10毫克/公斤對hIL-6R tg小鼠給藥。血液在給藥前以及給藥15分鐘、2、4、與8小時、1天、2天、與7天後被收集。收集的血液被立即於4℃、15000rpm離心15分鐘以得到血清。被分離的血清以-20℃或更低被保存於冰箱至使用。
在小鼠血清的濃度由ELISA決定。標準樣品於6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、以及0.1毫微克/毫升被製備以做為在血清濃度。小鼠血清樣品與標準樣品被佈散於固定抗人類IgG((γ-chain specific)F(ab’)2(Sigma))之免疫盤(immunoplates)(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International))。樣品被允許置於室溫一小時，隨後山羊抗人類抗體(Goat Anti-Human IgG-BIOT,Southern Biotechnology Associates)與親和素酶聯接體(Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate,Roche Diagnostics)被依序加入反應。在使用BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories)作為受質呈色後，在650nm的吸收度以培養盤讀取機測量。在小鼠的血清濃度依據使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)之校正曲線的吸收度而決定。WT與PF1之血清滯留度的時間進程如第19圖所示。給藥4天後之血清PF1濃度比WT高約五倍。這暗示PF1在人類IL-6受體基因轉殖小鼠之血清滯留度相較於WT被改善。
人類IL-6受體基因轉殖小鼠已被證明產生在血清循環之人類可溶性IL-6受體。因此，在血清之人類可溶性IL-6受體中和效率可以被評估，經由對人類IL-6受體基因轉殖小鼠施用抗人類IL-6受體抗體。
在小鼠血清之游離人類可溶性IL-6受體的濃度被決定，以評估施用WT或PF1對人類可溶性IL-6受體中和作用的程度。6毫升的小鼠血清以含有BSA之稀釋緩衝液稀釋為二倍。稀釋的血清被加入於0.22微米過濾杯(Millipore)乾燥之適當數量的rProtein A Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)，而血清中全部IgG類型抗體(小鼠IgG、抗人類IL-6受體的抗體、以及抗人類IL-6受體的抗體-人類可溶性IL-6受體的複合體)被蛋白質A所吸附。之後，杯內的溶液利用高速離心機被離心收集濾過的溶液。既然濾過的溶液不具有蛋白質A結合抗人類IL-6受體的抗體-人類可溶性IL-6受體複合體，游離人類可溶性IL-6受體的濃度可以被決定，經由測量穿過溶液內的人類可溶性IL-6受體的濃度。人類可溶性IL-6受體的濃度利用Quantikine Human IL-6 sR(R&D Systems)而被決定。小鼠游離人類可溶性IL-6受體的濃度依具隨附的說明手冊，在WT或PF1給藥後4、8、24、48、96、以及168小時被測量。
結果如第20圖所示。在WT與PF1的二個案例中，游離可溶性IL-6受體的濃度為10微克/毫升或更低，4小時與高達至8小時，在WT或PF1以10毫克/公斤單一劑量靜脈給藥後，這表示人類可溶性IL-6受體被中和。然而，在施用WT後當游離可溶性IL-6受體的濃度為500微克/毫升24小時，其在施用PF1後為10微克/毫升或更低。這表示PF1以較WT更持續的方式(sustainable way)中和人類可溶性IL-6受體。
PF1被創造，經由結合經過親和性成熟所發現之RDC_23與具有改善的特性，例如延長的血清滯留度之H53/L28，並因此被預測在體內能表現延長的血清滯留度與高度中和活性。實際上，相較於WT，PF1被證明具有更持續於血清，並在生產人類可溶性IL-6受體之人類IL-6受體基因轉殖小鼠表現延長的中和效果。
由免疫原性風險以及在高濃度製劑的穩定性之觀點，PF1比WT(人類化PM-1抗體)更優良，如同在人類IL-6受體基因轉殖小鼠之血清滯留度與IL-6受體中和效果。因此，修改而創造之PG1可能非常有用於藥物開發。
實施例7：在酸性環境之IgG2與IgG4之穩定性的改善IgG2-或IgG4-轉換之人類化IL6受體的抗體之表現載體的構築以及該抗體的表現為了降低Fcγ受體之結合活性，人類化PM-1抗體的恆定區(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)，被以IgG2或IgG4取代(Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8)，以產生分子WT-IgG2(SEQ ID NO:109)與WT-IgG4(SEQ ID NO:110)。一個動物細胞表現載體被用於表現IgG。一個表現載體被構築，在其中用於實施例1之人類化PM-1抗體(IgG1)的恆定區被NheI/NotI分解，接著透過接合作用以IgG2或IgG4的恆定區取代。每個DNA片段的核苷酸序列以DNA定序儀(ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer or ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems))決定，依據隨附的使用說明利用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)。使用如實施例1所述的方法表現WT L鏈、WT-IgG1、WT-IgG2、以及WT-IgG4。
(1)人類化PM-1抗體(WT-IgG1)H鏈，SEQ ID NO:15(胺基酸序列)(2)WT-IgG2H鏈，SEQ ID NO:109(胺基酸序列)(3)WT-IgG4H鏈，SEQ ID NO:110(胺基酸序列)透過使用鹽酸之蛋白質A的洗提之WT-IgG1、WT-IgG2、與WT-IgG4的純化懸浮於TBS之50微升的rProtein A SepharoseTM FastFlow(Amersham Biosciences)被加入所得到的培養上清液，且組合的溶液於4℃被倒轉混合四小時或以上。溶液被移轉至Ultrafree(R) -MC(Millipore)的0.22微米過濾杯。以500微升TBS清洗三次後，rProtein A SepharoseTM 樹脂被懸浮於100微升的10mM鹽酸/150mM氯化鈉(pH 2.0)，且混合物被允許放置2分鐘，以洗提抗體(鹽酸洗提)。立即，洗提物藉由加入6.7微升的1.5M Tris-HCl(pH 7.8)而中和。洗提被進行二次，產生200微升的純化抗體。
由鹽酸洗提所純化之WT-IgG1、WT-IgG2、以及WT-IgG4的膠體過濾層析分析由鹽酸洗提得到之純化樣品的聚集內容以膠體過濾層析分析評估。
聚集評估的方法：系統：Waters Alliance管柱：G3000SWxl(TOSOH)移動相：50mM磷酸鈉、300mM KCl、pH 7.0流速、波長：0.5毫升/分鐘、220nm結果如第21圖所示。當純化後WT-IgG1聚集內容為約2%時，純化後WT-IgG2與WT-IgG4的則約為25%。這暗示IgG1在鹽酸洗提期間很穩定，相反的，IgG2與IgG4不穩定且進入變性/聚集。因此，IgG2與IgG4在酸性環境的穩定性被證實比IgG1的低。蛋白質A經常被用於純化IgG分子，且IgG分子在酸性環境下由蛋白質A被洗提出來。此外，發展IgG分子為藥物時所需要的病毒去活性作用(virus inactivation)，通常在酸性環境下進行。因此令人滿意的是，IgG分子在酸性環境的穩定性較高。然而，IgG2與IgG4在酸性環境的穩定性被發現比IgG1低，並首次暗示在酸性環境之變性/聚集對於發展IgG2與IgG4為藥物是個問題。可接受的是，這個變性/聚集的問題在發展藥物時可以被克服。至今，然而，仍未有經由胺基酸取代以解決此問題之方法被報導。
具有修改之CH3功能區塊之WT-IgG2與WT-IgG4的製備與評估在酸性環境之IgG2與IgG4的穩定性被證明比IgG1低。因此，IgG2與IgG4分子的修改型被測試改善在酸性環境之穩定性。根據IgG2與IgG4分子恆定區的模型，在酸性環境之潛在不穩定因子(destabitizing factors)之一被認為是CH3-CH3功能區塊界面的不穩定性。不同測試的結果，在IgG2之EU編碼系統位置397的甲基胺酸、或IgG4之EU編碼系統位置409的精胺酸被認為使CH3/CH3界面不穩定。之後，被修改的IgG2與IgG4抗體被製備。一個修改的IgG2抗體包括以纈胺酸取代EU編碼系統位置397的甲基胺酸(IgG2-M397V,SEQ ID NO:111(胺基酸序列))，以及一個修改的IgG4抗體包括以離胺酸取代EU編碼系統位置409的精胺酸(IgG4-R409K,SEQ ID NO:112(胺基酸序列))。
用於構築標的抗體之表現載體、以及表現與純化該抗體的方法，與前述那些用於鹽酸洗提者相同。膠體過濾層析分析被進行，以評估從蛋白質A鹽酸洗提所得到之純化樣品的聚集內容。
聚集評估方法：系統：waters Alliance管柱：G3000SWx1(TOSOH)移動相(Mobile phase)：50mM磷酸鈉、300mM氯化鉀、pH7.0流速、波長：0.5毫升/分鐘、220nm結果如第21圖所示。當純化後WT-IgG1聚集內容為約2%時，純化後WT-IgG2與WT-IgG4的則約為25%。相反的，在具有修改的CH3功能區塊、IgG2-M397V與IgG4-R409K之聚集內容與在IgG1者是可相比較的(約2%)。這個發現說明IgG2與IgG4在酸性環境的穩定性可以被改善，分別經由以纈胺酸取代IgG2之EU編碼系統位置397的甲基胺酸或以離胺酸取代IgG4之EU編碼系統位置409的精胺酸。此外，WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、以及IgG4-R409K之熱變性的中間點溫度以如實施例5所述之方法被決定。結果顯示在IgG2-M397V與IgG4-R409K之修改的CH3功能區塊之Tm值分別高於在WT-IgG2與WT-IgG4的。這暗示以熱穩定性之觀點，IgG2-M397V與IgG4-R409K分別優於WT-IgG2與WT-IgG4。
IgG2與IgG4在病毒去活化過程以及在使用蛋白質A之純化過程暴露於酸性環境中。因此，在前述過程之變性/聚集作用是一個題。然而，被發現該問題可以被解決，經由使用IgG2與IgG4恆定區序列之IgG2-M397V與IgG4-R409K。因此，這些修改顯現在發展IgG2與IgG4抗體藥物非常有用。此外，IgG2-M397V與IgG4-R409K的用處亦被示範，經由發現其在熱穩定性之優異性。
實施例8：源自IgG2之雙硫鍵之異質性的改善由蛋白質A透過醋酸洗提之WT-IgG1、WT-IgG2、與WT-IgG4的純化懸浮於TBS之50微升的rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)被加入實施例7所得到之培養上清液，，且組合的溶液於4℃被倒轉混合四小時或以上。溶液被移轉至Ultrafree(R) -MC(Millipore)的0.22微米過濾杯。以500微升TBS清洗三次後，rProtein A SepharoseTM 樹脂被懸浮於100微升的50mM醋酸鈉水溶液(pH3.3)，且混合物被允許放置2分鐘，以洗提抗體。立即，洗提物藉由加入6.7微升的1.5M Tris-HCl(pH7.8)而中和。洗提被進行二次，產生200微升的純化抗體。
WT-IgG1、WT-IgG2、以及WT-IgG4之陽離子交換層析分析純化的WT-IgG1、WT-IgG2、以及被以陽離子交換層析法分析同質性。
使用IEC之評估方法：系統：waters Alliance管柱：ProPac WCX-10(Dionex)移動相A：25mM MES-NaOH、pH 6.1B：25mM MES-NaOH,250mM醋酸鈉、pH 6.1流速、波長：0.5毫升/分鐘、280nm梯度(Gradient)B：50%至75%(75分鐘)於WT-IgG1的分析30%至55%(75分鐘)於WT-IgG2與wT-IgG4的分析結果如第22圖所示。WT-IgG2在離子交換分析表現超過一個峰值而WT-IgG1與WT-IgG4有一個峰值。這暗示相較於WT-IgG1與WT-IgG4，IgG2分子更為異質性。實際上，IgG2同型異構物已被報導具有源自絞鏈區雙硫鍵的異質性(Chu GC et al., Pharm. Res. 2007 Mar 24;24(6):1145-56)。因此，如第22圖所示IgG2之異波峰(hetero-peaks)亦被假設是源自雙硫鍵之期望物質/相關物質(desired substance/related substances)。很難以大規模生產抗體藥物，而維持在生產過程之期望物質/相關物質異質性之差異，因此，欲發展為藥物之抗體分子是期望儘量為同質性(較少異質性)的物質。對於野生型IgG2，發展為抗體藥物時有同質性的問題。事實上，美國專利申請案US20060194280(A1)已顯示，天然的IgG2在離子交換層析分析具有因為雙硫鍵之不同異波峰，且生物活性在這些波峰之間變化。US20060194280(A1)報導以純化過程之再折疊(refolding)作為組合異波峰為單一波峰的方法，但在製造時使用這類方法是昂貴與複雜的。因此，組合異波峰為單一波峰的較佳方法是基於胺基酸取代。雖然源自於絞鏈區之雙硫鍵的異質性可以被克服以發展IgG藥物，至今並無關於透過胺基酸取代以解決此問題之報導被發表。
修改的WT-IgG2 CH1功能區塊與絞鏈區之製備與評估如第23圖所示，有許多潛在的IgG2分子雙硫鍵型態(patterns)。源自IgG2絞鏈區之異質性的可能原因為雙硫鍵結與自由胱胺酸(free cysteines)的差異型態。IgG2在絞鏈區上游具有2個胱胺酸(EU編碼系統位置219與220)、以及這二個絞鏈區上游之胱胺酸的胱胺酸包括在H鏈CH1功能區塊EU編碼系統位置131的胱胺酸與L鏈C端的胱胺酸，以及在二元體搭檔之H鏈上游的2個對應的胱胺酸。特別地，在IgG2絞鏈區上游的附近總共有8個胱胺酸，當抗體為H2L2的結合形式時。這可能是造成錯誤雙硫鍵結與自由胱胺酸之異質性型態的原因。
絞鏈區序列以及IgG2之CH1功能區塊被修改以降低源自IgG2之異質性。檢驗被進行以避免因為雙硫鍵結與自由胱胺酸之差異型態的異質性。被修改抗體之檢驗結果的不同暗示，異質性可以被避免而不降低熱穩定性，經由分別在H鏈CH1功能區塊EU編碼系統位置131與133以絲胺酸與離胺酸取代胱胺酸與精胺酸，以及在野生型IgG2恆定區序列之H鏈的絞鏈區上游EU編碼系統位置219以絲胺酸取代胱胺酸(以下稱為IgG2-SKSC)(IgG2-SKSC,SEQ ID NO:120)。這些取代可使IgG2-SKSC在H與L鏈之間形成同質性共價鍵結，其為L鏈C端之胱胺酸與EU編碼系統位置220之胱胺酸之間的雙硫鍵(第24圖)。
實施例1所述之方法被用於建構IgG2-SKSC之表現載體，並表現與純化IgG2-SKSC。被純化的IgG2-SKSC與野生型IgG2(WT-IgG2)被以陽離子交換層析法分析同質性。使用IEC之評估方法：系統：Waters Alliance管柱：ProPac WCX-10(Dionex)移動相A：25mM MES-NaOH、pH 5.6B：25mM MES-NaOH、250mM醋酸鈉、pH 5.6流速、波長：0.5毫升/分鐘、280nm梯度B：50%至100%(75分鐘)結果如第25圖所示。如之前所預期的，IgG2-SKSC顯示被洗提為單一波峰，而WT-IgG2為多個波峰。這暗示源自於IgG2絞鏈區雙硫鍵之異質性可以被避免，利用如用於產生IgG2-SKSC之修改，其允許L鏈C端之胱胺酸與EU編碼系統位置220之胱胺酸之間之單一雙硫鍵的形成。WT-IgG1、WT-IgG2、以及IgG2-SKSC之熱變性的中間點溫度被以實施例5所述相同之方法決定。結果顯示WT-IgG2提供Fab功能區塊之一個波峰，其具有比WT-IgG1較低的Tm值，而IgG2-SKSC並無這樣的波峰。這暗示IgG2-SKSC在熱穩定性亦較WT-IgG2優秀。
雖然野生型IgG2被認為有同質性的問題，其對於發展抗體藥物很重要，被發現這個問題可以被克服，經由使用IgG2恆定區序列之IgG2-SKSC。因此，IgG2-SKSC對於發展IgG2抗體藥物非常有用。此外，IgG2-SKSC的用處亦被示範，透過發現其在熱穩定性之優異性。
實施例9：IgG分子之C端異質性的改善來自WT-IgG1之H鏈C端GK抗體之表現載體的構築有報導關於抗體C端序列之異質性，其係因為C端胺基酸離胺酸殘基的刪除與C端腇基因為2個C端胺基酸甘胺酸與離胺酸之刪除造成的醯胺化(amidation)(Johnson KA et al.,Anal. Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83)。發展抗體藥物時，這類異質性的消失是較佳的。實際上，在人類化PM-1抗體TOCILIZUMAB，主要戌分為缺少C端胺基酸離胺酸的序列，其係由轉譯後修飾被刪除之核苷酸序列所編碼，而次要成分具有亦共同存在為異質性之離胺酸。因此，C端胺基酸序列被修改以降低C端的異質性。特別地，本發明之發明人修改野生型IgG1的核苷酸序列以從IgG1的H鏈恆定區刪除離胺酸與甘胺酸，並評估是否C端胺基的醯胺化作用可否經由刪除2個C端胺基酸甘胺酸與離胺酸而抑制。
突變被導入H鏈的C端序列，利用編碼實施例1所得到之人類化PM-1抗體(wT)的pB-CH載體。編碼位於EU編碼系統位置447的Lys及/或位置446的Gly之核苷酸序列被轉換為停止密碼，藉由導入一個突變，依據所附的使用說明之方法，利用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)。因此，被設計為缺少C端胺基酸離胺酸(EU編碼系統位置447)之抗體以及被設計為缺少2個C端胺基酸甘胺酸與離胺酸(EU編碼系統位置分別為446與447)之抗體的表現載體被構築。H鏈C端之K與GK抗體被得到，經由表現改造的PM-1抗體之H鏈與L鏈。抗體以實施例1所述的方法表現與純化。
純化的H鏈C端GK抗體根據下列程序以陽離子交換層析法分析。C端刪除對異質性的影響被評估，經由陽離子交換分析，根據下述方法使用純化的H鏈C端GK抗體。陽離子交換分析之條件如下所述。人類化PM-1、H鏈C端K抗體、以及H鏈C端GK抗體的層析圖譜被比較(chromatogram)。
管柱：ProPac WCX-10,4 x 250mm(Dionex)移動相A：25mmol/l MES/NaOH,pH 6.1 B:25mmol/l MES/NaOH,250mmol/l NaCl,pH 6.1流速：0.5毫升/分鐘梯度：25% B(5分鐘)->(105分鐘)->67% B->(1分鐘)->100% B(5分鐘)偵測：280nm未修改之人類化PM-1抗體、H鏈C端K抗體、與H鏈C端GK抗體之分析結果如第26圖所示。依據Chu GC等人(Pharm Res.2007Mar24;24(6)：1145-56)，比主波峰更延長之滯留時間的基礎波峰具有位置449為Lys的H鏈C端以及位置447為Pro的H鏈C端。基礎波峰的強度在H鏈C端GK抗體顯著的降低，而在H鏈C端K抗體未觀察到如此顯著的降低。這暗示鏈之C端的異質性可以被降低，僅在該2個C端胺基酸從H鏈被刪除時。
H鏈C端GK抗體之熱變性的溫度以DSC決定，以評估H鏈C端2個殘基刪除對於熱穩定性的效果。為了DSC量測，抗體對具有150mM氯化鈉之20Mm醋酸緩衝液(pH6.0)透析以改變緩衝液。完全除氣後，人類化PM-1抗體與H鏈C端GK抗體溶液、以及參考溶液(外側透析物)被封於量熱室(calorimetric cells)，並完全地於40℃熱平衡。之後，樣品由40至100℃以1K/分鐘的速率掃瞄。結果之變性波峰被指定(Rodolfo等人，ImmunologyLetters,1999,p47-52)。結果表示C端刪除對於CH3功能區塊之熱變性溫度並無影響。
因此，源自C端的異質性可以不影響抗體之熱穩定性而被降低，經由在核苷酸序列層次從H鏈恆定區刪除C端離胺酸與甘胺酸。既然全部的人類抗體IgG1、IgG2、以及IgG4恆定區在其C端序列EU編碼系統位置446與447具有Gly與Lys，本實施例與其他所發現之用於降低C端胺基酸異質性之方法亦被期待可應用於IgG2與IgG4恆定區及其變異物。
實施例10：具有新穎最佳化之恆定區序列之M14 GK的構築當抗體藥物以中和抗原為目標，如Fc功能區塊之ADCC作用子功能並不需要，因而與Fcγ受體之結合不需要。與Fcγ受體的結合被假設並不適合，基於免疫原性與副作用的考量(Strand V et al.,Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92;Gessner JE et al.,Ann. Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48)。人類化的抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB不需要與Fcγ受體結合，因為其僅需要特別地與IL-6受體結合，並中和其生物學活性，以被作為用於IL-6相關疾病之治療藥物，例如風濕性關節炎。
Fcγ受體非結合、最佳化之恆定區M14 GK的構築與評估用於修復Fcγ受體結合的可能方法係轉換IgG抗體由IgG1異構型為IgG2或IgG4異構型(Ann. Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48)。作為完全地消除與Fcγ受體結合之方法，導入人造的修改至Fc功能區塊的方法已經被報導。例如，既然抗CD3抗體與抗CD4抗體的作用子功能造成副作用，在野生型序列不存在之胺基酸突變被導入Fc功能區塊的Fcγ受體結合區域(Cole MS et al.,J. Immunol. 1997 Oct 1;159(7):3613-21;Reddy MP et al.,J. Immunol.2000Feb 15;164(4):1925-33)，且所產生之Fcγ受體非結合之抗CD3與抗CD4抗體被進行臨床試驗(Strand V et al.,Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92;Chau LA et al., Transplantation 2001 Apr 15;71(7):941-50)。根據另一篇報導(專利申請號WO99/58572)，Fcγ受體非結合抗體可以被製備，經由轉換IgG1的FcγR結合區(位於EU編碼系統位置233、234、235、236、327、330、以及331)成為IgG2的序列(位於EU編碼系統位置233、234、235、以及236)或IgG4的序列(位於EU編碼系統位置327、330、以及331)。然而，如果全部前述的突變被導入IgG1，9個胺基酸之新穎胜肽序列，將會產生其係潛在地作為非天然之T細胞抗原決定位胜肽，且這增加免疫原性風險。在發展抗體藥物時，免疫原性風險應該被最低化。
為了克服上述問題，在IgG2恆定區的修改被考量。在IgG2恆定區之FcγR-結合功能區塊，位於EU編碼系統位置327、330、與331之殘基與IgG4非結合序列不同，其位於EU編碼系統位置233、234、235、與236為非結合類型之胺基酸。因此，需要修改位於EU編碼系統位置327、330、與331之胺基酸為IgG4的序列(G2 a，如Eur. J. Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24所述)。然而，既然在IgG4EU編碼系統位置339之胺基酸為丙胺酸，而在IgG2之對應殘基為穌胺酸，對於IgG4序列EU編碼系統位置327、330、與331之胺基酸的簡單修改並不受歡迎地產生一個9個胺基酸之新穎胜肽序列，其潛在地成為非天然T細胞抗原決定位胜肽，並因而增加免疫原性風險。接著，本發明之發明人發現新穎胜肽序列的產生可以被預防，經由在IgG2之EU編碼系統位置339導入丙胺酸取代穌胺酸，除了前述的修改以外。
除了前述的突變，其它的突變被導入，它們係為以纈胺酸取代IgG2之EU編碼系統位置397之甲基胺酸，其在實施例7被發現以改善IgG2在酸性環境下的穩定性；以及絲胺酸取代EU編碼系統位置131之胱胺酸，離胺酸取代EU編碼系統位置133之精胺酸，以及絲胺酸取代EU編碼系統位置219之胱胺酸，其被發現於實施例8以改善源自於絞鏈區雙硫鍵之異質性。此外，既然位於位置131與133之突變產生9個胺基酸之新穎胜肽序列，其潛在地成為非天然T細胞抗原決定位胜肽，並因而增加免疫原性風險，接近位置131與139之胜肽序列被轉換為天然的人類序列，經由導入甘胺酸取代EU編碼系統位置137之麩胺酸以及甘胺酸取代EU編碼系統位置138之絲胺酸。此外，EU編碼系統位置446與447之甘胺酸與離胺酸被從H鏈C端刪除以降低C端之異質性。恆定區序列具有全部被導入之突變者被命名為M14 GK(M14 GK,SEQ ID NO:24)。雖然在M14 GK位置219有一個胱胺酸變為絲胺酸的突變，如同新穎之9個胺基酸胜肽序列，其潛在地成為非天然T細胞抗原決定位胜肽，免疫原性被認為非常低，因為絲胺酸之胺基酸特性與胱胺酸相似。由TEPITOPE所預測之免疫原性亦暗示其在免疫原性並無差別。
用於抗體H鏈序列，其變異區為WT與恆定區為M14　GK(M14　GK,SEQ ID NO:24;WT-M14　GK,SEQ ID NO:113)表現載體被依據實施例1所述的方法構築。具有以WT-M14　GK當作H鏈以及WT當作L鏈之抗體被表現與純化，經由實施例1所述的方法。
此外，WT-M17　GK(M17　GK,SEQ ID NO:116;WT-M17　GK,SEQ ID NO:115)被以相同方法構築，經由導入突變於IgGl恆定區於EU編碼系統位置233、234、235、236、327、330、331、以及339(G1　ab，如Eur. J. Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24所述)，以修復Fcγ受體結合與經由刪除EU編碼系統位置446與447之胺基酸以降低C端異質性(實施例9)。用於WT-M11　GK(M11 GK,SEQ ID NO:25;WT-M11　GK,SEQ ID NO:114)之表現載體被構築。在WT-M11　GK，突變被導入IgG4恆定區於EU編碼系統位置233、234、235、以及236(G4　b described in Eur. J. Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24；這個修改新產生非人類序列，並增加免疫原性風險)以降低Fcγ受體結合。除了前述修改，為了降低免疫原性風險，突變被導入EU編碼系統位置131、133、137、138、214、217、219、220、221、以及222，使位於絞鏈區雙硫鍵之型態與M14　GK的相同；突變被導入EU編碼系統位置409(實施例7)以改善在酸性環境之穩定性；以及EU編碼系統位置446與447之胺基酸被刪除(實施例9)以降低C端異質性。WT-M17　GK 或WT-M11 GK被用於當作H鏈，而WT被用於當作L鏈。這些抗體被依據實施例1所述之方法所表現與純化。
WT-M14　GK、WT-M17　GK、以及WT-M11　GK對於Fcγ受體結合活性之評估FcγRI結合被評估，經由下述程序。使用Biacore T100，衍生自人類的Fcγ受體I(以下稱為FcγRI)被固定於感應晶片，以允許和IgG1、IgG2、IgG4、M11　GK、M14　GK、或M1　GK7交互作用作為分析物。結合抗體的含量被比較。測量被進行，利用Recombinant Human FcRIA/CD64(R&D systems)，作為衍生自人類的FcγRI，而IgG1、IgG2、IgG4、M11　GK、M14　GK、以及M17　GK為樣品。FcγRI被固定於感應晶片CM5(BIACORE)經由胺基耦合方法。被固定之hFc　RI的最後含量約為13000RU。使用之緩衝液為HBS-EP+，且流速為20微升/分鐘。樣品濃度利用HBS-EP+被調整為100微克/毫升。分析包括二步驟：2分鐘的結合期，其中10微升的抗體溶液被注射，而接著為4分鐘的解離期，其中注射被改為HBS-EP+。解離期後，感應晶片被更新，利用注射20微升的5mM過氧化鈉。結合、解離、與更新構成一個分析週期。不同抗體溶液被注射以得到感應圖譜。作為分析物，IgG4、IgG2、IgG1、M11、M14、以及M17被依此順序注射。這個注射系列被重複二次。結合抗體之被決定量資料的比較如第27圖所示。比較顯示結合抗體量依序降低：IgG1>IgG4>>IgG2=M11 GK=M14 GK=M17 GK。因此，這顯示野生型IgG2、M11 GK、M14 GK、以及M17 GK之Fc RI結合比野生型IgG1與IgG4弱。
FcγRIIa結合被評估，經由下述程序。利用Biacore T100，衍生自人類的Fcγ受體IIa(以下稱為FcγRIIa)被固定於感應晶片，以允許和IgG1、IgG2、IgG4、M11 GK、M14 GK、或M1 GK7進行交互作用作為分析物。結合抗體的量被比較。測量被進行，利用Recombinant Human FcRIIA/CD32a(R&D systems)作為衍生自人類的FcγRIIa，而IgG1、IgG2、IgG4、M11 GK、M14 GK、以及M17 GK為樣品。FcγRIIa被經由胺基耦合方法固定於感應晶片CM5(BIACORE)。被固定之Fc RIIa的最後含量約為3300RU。使用之緩衝液為HBS-EP+，且流速為20微升/分鐘。接著，緩衝液被注射直到基準穩定。在基準穩定後，測量被進行。被固定之Fc RIIa被允許與每一個IgG異構型(IgG1、IgG2、或IgG4)、或導入突變之抗體(M11 GK,M14 GK,or M17 GK)進行交互作用以當作分析物。結合抗體量被觀察。使用之緩衝液為HBS-EP+，且流速為20微升/分鐘。測量溫度為25℃。每個IgG或其修改型式的濃度被調整為100微克/毫升。20微升的分析物被注射，且被允許與固定的Fc RIIa交互作用。交互作用後，分析物由Fc RIIa解離，而感應晶片被經由注射200微升的緩衝液而更新。作為分析物，IgG4、IgG2、IgG1、M11 GK、M14 GK、以及M17 GK被依此順序注射。這個注射系列被進行二次。結合抗體量之資料的比較結果如第28圖所示。比較顯示結合抗體量依序降低：IgG1>IgG2=IgG4>M11 GK=M14 GK=M17 GK。因此，這顯示M11 GK、M14 GK、以及M17 GK之Fcγ RIIa結合比野生型IgG1、IgG2與IgG4弱。
Fcγ RIIb結合被評估，經由下述程序。利用Biacore T100，衍生自人類的Fcγ受體IIb(以下稱為Fcγ RIIb)被固定於感應晶片，以允許和IgG1、IgG2、IgG4、M11 GK、M14 GK、或M1 GK 7進行交互作用作為分析物。結合抗體量被比較。測量被進行，利用Recombinant Human FcRIIB/C(R&D systems)作為衍生自人類的Fcγ RIIb，而IgG1、IgG2、IgG4、M11 GK、M14 GK、以及M17 GK為樣品。Fcγ RIIb被經由胺基耦合方法固定於感應晶片CM5(BIACORE)。被固定之Fc RIIb的最後含量約為4300 RU。接著，緩衝液被注射直到基準穩定。在基準穩定後，測量被進行。被固定之Fc RIIb被允許與每一個IgG異構型(IgG1、IgG2、或IgG4)、或導入突變之抗體(M11 GK,M14 GK,or M17 GK)進行交互作用以當作分析物。結合抗體量被觀察。使用之緩衝液為HBS-EP+(10mM HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)，而流速為20微升/分鐘。測量溫度為25℃。每個IgG或其修改型式的濃度被調整為200微克/毫升。20微升的分析物被注射，且被允許與固定的Fc RIIb交互作用。交互作用後，分析物由Fc RIIb解離，而感應晶片被經由注射200微升的緩衝液而更新。作為分析物，IgG4、IgG2、IgG1、M11 GK、M14 GK、以及M17 GK被依此順序注射。這個注射系列被進行二次。結合抗體量之資料的比較結果如第29圖所示。比較顯示結合抗體量依序降低：IgG4>IgG1>IgG2>M11 GK=M14 GK=M17 GK。因此，這顯示M11 GK、M14 GK、以及M17 GK之Fcγ RIIb結合比野生型IgG1、IgG2與IgG4弱。
Fcγ RIIIa結合經由下述程序被評估。利用Biacore T100，衍生自人類的Fcγ受體IIIa(以下稱為Fcγ RIIIa)被固定於感應晶片，以允許和IgG1、IgG2、IgG4、M11GK、M14 GK、或M1 GK 7進行交互作用作為分析物。結合抗體量被比較。測量被進行，利用hFc RIIIaV-His6(在申請人公司所製備之重組hFc RIIIaV-His6)當作衍生自人類的Fcγ RIIIa，而IgG1、IgG2、IgG4、M11 GK、M14 GK、以及M17 GK為樣品。Fcγ RIIIa被經由胺基耦合方法固定於感應晶片CM5(BIACORE)。被固定之hFc RIIIaV-His6的最後含量約為8200RU。使用之緩衝液為HBS-EP+，而流速為5微升/分鐘。樣品濃度使用HBS-EP+調整為250微克/毫升。分析包括二步驟：2分鐘的結合期，其中10微升的抗體溶液被注射，而接著為4分鐘的解離期，其中注射被改為HBS-EP+。解離期後，感應晶片被更新，利用注射20微升的鹽酸。結合、解離、與更新構成一個分析週期。不同抗體溶液被注射以得到感應圖譜。作為分析物，IgG4、IgG2、IgG1、M11 GK、M14 GK、以及M17 GK被依此順序注射。結合抗體之被決定量資料的比較如第30圖所示。比較顯示結合抗體量依序降低：IgG1>>IgG4>IgG2>M17 GK>M11 GK=M14 GK。。因此，這顯示M11 GK、M14 GK、以及M17 GK之Fcγ RIIIa結合比野生型IgG1、IgG2與IgG4弱。此外，M11 GK、M14 GK之Fcγ RIIIa結合被發現較具有G1 ab突變之M17 GK弱，如Eur. J. Immunol. 1999 Aug；29(8):2613-24所報導。
前述發現說明 WT-M14 GK、WT-M17 GK、以及WT-M11 GK之Fcγ受體結合相較於野生型IgG1係顯著地降低。因為Fcγ受體調節之進入APC內在化所生之免疫原性風險以及作用子功能例如ADCC所生之副作用可以被避免，利用WT-M14 GK、WT-M17 GK、以及WT-M11 GK作為恆定區。因此，WT-M14 GK、WT-M17 GK、以及WT-M11 GK係有用於以中和抗原為目標之抗體藥物的恆定區序列。
WT-M14 GK、WT-M17 GK、以及WT-M11 GK在高濃度之穩定性的評估WT-M14 GK、WT-M17 GK、以及WT-M11 GK被評估在高濃度之穩定性。WT-IgG1、WT-M14 GK、WT-M17 GK、以及WT-M11 GK的純化抗體被對應20mM組胺酸鹽酸、150mM氯化鈉、pH6.5(EasySEP,TOMY)透析，隨後以超過濾濃縮。抗體被測試高濃度下的穩定性。條件如下：抗體：WT-IgG1、WT-M14 GK、WT-M17 GK、與WT一M11 GK緩衝液：20mM組胺酸鹽酸、150mM氯化鈉、pH 6.5濃度：61毫克/毫升儲存溫度與時間週期：40℃二週、40℃一個月、40℃二個月聚集評估方法：系統：Waters Alliance管柱：G3000SWx1(TOSOH)移動相(Mobile phase)：50mM磷酸鈉、300mM氯化鉀、pH 7.0流速、波長：0.5毫升/分鐘、220nm100次稀釋樣品被分析。
在起始配方(立即製備後)以及儲存於不同條件之配方的聚集內容(content of aggregate)經由前述膠體過濾層析法評價。關於起始配方聚集內容之差異(增加的量)如第31圖所示。結果顯示WT-M14 GK、WT-M17 GK、與WT-M11 GK之聚集量相較於WT-IgG1僅輕微增加，且約為WT的一半。此外，如第32圖所示，增加之Fab片段量可與WT-IgG1以及WT-M17 GK之間相比較，而在WT-M14 GK與WT-M11 GK之增加量約為WT量的四分之一。IgG類型抗體配方的分解路徑包括聚集的形成以及Fab降解物(degradate)的產生，如專利申請案WO2003/039485所述。根據這二個條件，聚集與fab片段的產生，WT-M14 GK與WT-M11 GK被證明相較於WT-IgG1在配方具有優良的穩定性。因此，即使用於具有不良穩定性之IgG1恆定區且不能製備為高濃度液體配方之抗體藥物之抗體，WT-M14 GK、WT-M17 GK、與WT-M11 GK作為恆定區之用途被期待能提供更穩定之高濃度液體配方的製造。
特別是，M14 GK被期待非常有用於作為一個新穎之恆定區序列，其將(1)克服原始IgG2分子在酸性環境之不穩定性；(2)改善源自絞鏈區雙硫鍵之異質性；(3)不與Fcγ受體結合；(4)具有最低數目之新穎9個胺基酸胜肽序列，其潛在地T細胞作為抗原決定位胜肽；以及(5)在高濃度配方具有比IgG1較佳之穩定性。
實施例11：PF1-M14 GK抗體的製備構築於實施例5之PF1(其恆定區為IgG1)的變異區被使用XhoI與NheI操作。構築於實施例7之M14 GK(其變異區為WT)的恆定區被使用NheI與NotI操作。二個抗體H鏈基因片段被嵌入動物細胞表現載體以構築一個用於標的H鏈之表現載體，PF1-M14 GK(PF1_H-M14 GK,SEQ ID NO:117)。所使用之L鏈為PF1_L。抗體PF1-M14 GK被依實施例1所述之方法表現與純化。
抗體PF1-M14 GK在不同觀點比WT(人類化PM-1抗體)優良，因此被期待非常有用於作為抗IL-6受體的抗體藥物。
實施例12：M31 GK的製備與評估實施例10所製備之M14 GK被修改，經由以IgG2序列在EU編碼系統位置330、331、與339取代胺基酸以構築M31 GK(M31 GK,SEQ ID NO:118)。用於變異區為WT而恆定區序列為M31 GK(WT-M31 GK,SEQ ID NO:119)之抗體H鏈序列的表現載體，被以實施例1所述之方法構築。利用WT-M31 GK之H鏈以及WT之L鏈，WT-M31被以實施例1所述之方法表現與純化。
除了WT-M31，WT-IgG2與WT-M14 GK同時被表現與純化，並以下述程序經由陽離子交換層析法分析。用於陽離子交換層析法分析之條件如下。WT-IgG2、WT-M14 GK與WT-M31 GK的層析圖譜被比較。
管柱：ProPac WCX-10,4 x 250mm(Dionex)移動相A：25mmol/l MES/NaOH,pH 6.1B：25mmol/l MES/NaOH,250mmol/l NaCl,pH 6.1流速：0.5毫升/分鐘梯度：0% B(5分鐘)->(65分鐘)->100% B->(1分鐘)偵測：280nmWT-IgG2、WT-M14 GK與WT-M31 GK的分析結果如第33圖所示。如同WT-M14 GK，WT-M31 GK被證明被洗提為單一波峰，而WT-IgG2則為多重波峰。這表示源自IgG2絞鏈區雙硫鍵之異質性在WT-M31 GK亦可被避免。
實施例13：完全人類化抗體F2H/L39-IgG1的製備PF1抗體之骨架序列的完全人類化位置71之精胺酸(Kabat氏編碼系統；KabatEA等人.1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)是唯一維持在實施例5所製備之PF1_H的小鼠序列。這在免疫原性的觀點適不適合的。通常，在H鏈位置71之殘基對於HCDR2的構型(conformation)是重要的序列。事實上，已被報導在人類化PM-1抗體的產生期間，位置71之殘基對於小鼠PM1抗體之結合活性是必需的。結合活性被證明顯著地被降低，經由在位置71以纈胺酸取代(Cancer Research 53,851-856,1993)。同時，PF1_H被分類為人類生殖腺基因(human germ line genes)的VH4家族，而位置71的纈胺酸在VH4家族是高度保守的。中和活性亦被證明顯著地被降低，經由在位置71以纈胺酸取代精胺酸。
因此，為了完全去除在位置71保留精胺酸之小鼠基因，本發明之發明人在人類生殖腺基因序列尋找，並報導人類抗體之序列，其在位置71具有精胺酸並享有對於抗體四級結構之維持重要的保守殘基。結果，發明人發現一個候選序列如表九所示，其具有重要的保守殘基，儘管其與PF1_H的同質性很低。表九
H96-IgG1(SEQ ID NO:134的胺基酸序列)被設計，經由以前述候選序列取代PF1_H-IgG1之Kabat氏編碼系統位置66至94的區域。抗體變異區被製備，經由PCR(組合PCR，assembly PCR)，利用合成之寡DNA(oligo-DNAs)的組合。恆定區被經由IgG1之表現載體以PCR複製。抗體變異區與恆定區被經由組合PCR連結至一起，隨後被嵌入動物細胞表現載體。H96/PF1L-IgG1以實施例1所述之方法表現與純化。
具有完全人類化骨架之抗體H96/PF1L-IgG1的評估純化之H96/PF1L-IgG1的Tm以實施例5所述方法決定。親和性測量基本上在與實施例5相同之條件下進行。需注意SR344的濃度被調整為0、0.36、以及1.4微克/毫升，而解離期被觀察　分鐘。結果顯示H96/PF1L-IgG1的Tm與親和性幾乎與PF1-IgG1相同(表十)。表十
如上所述，本發明之發明人產生具有完全地人類化的PF1抗體骨架，利用H96於PF1抗體H鏈以完全地從PF1抗體移除維持的小鼠序列同時維持其Tm與親和性。既然H96/PF1L-IgG1之骨架沒有小鼠相關序列，H96/PF1L-IgG1被期待較優良，尤其是以免疫原性的觀點。
具有降低的pI與弱化的免疫原性風險之F2H/L39-IgG1的構築如實施例4所示，在血清滯留度可以被延長，透過在抗體變異區之胺基酸修改降低pI。因此，如下所示之胺基酸取代進一步被導入之前構築的H96-IgG1。為了降低pI，麩醯胺酸被取代位置64的離胺酸，而天冬胺酸被取代位置65的甘胺酸。此外，為了降低免疫原性風險，麩醯胺酸被取代位置105的麩胺酸，以及異白胺酸被取代位置107的穌胺酸。另外，為了達成如實施例2的親和性增強，修改被導入，其中白胺酸被取代位置95的纈胺酸以及丙胺酸被取代位置99的異白胺酸。為了製備F2H-IgG1(SEQ ID NO:135的胺基酸序列)，這些胺基酸取代經由實施例1所述的方法導入H96-IgG1。
此外，以下的胺基酸取代被導入PF1L。為了降低pI，麩胺酸被取代位置27的麩醯胺酸以及麩胺酸被取代位置55的白胺酸。為了製備L39(SEQ ID NO:136的胺基酸序列)，這些胺基酸取代經由實施例1所述的方法導入PF1L。使用F2H-IgG1作為重鏈以及L39為輕鏈，F2H/L39-IgG1以實施例1所述的方法表現與純化。
F2H/L39-IgG1對人類IL-6受體之親和性的Biacore分析人類化PM1抗體(野生型(WT))、PF1抗體(實施例5所構築)、以及F2H/L39-IgG1被分析親和性。這個測量基本上在與實施例4相同條件下進行。需注意，SR344的濃度被調整為0、0.36、以及1.4微克/毫升，而解離期被觀察15分鐘(表十一)。表十一
結果顯示F2H/L39-IgG1具有很強的親和性(維持10至11次方的KD )，但其ka 降低為約PF1-IgG1的一半。
對F2H/L39-IgG1人類化IL-6受體中和活性之評估人類化PM1抗體(野生型(WT))與F2H/L39-IgG1之中和活性以實施例1所述方法評估。中和活性的評估利用600毫微克/毫升的人類介白素-6(TORAY)進行。如第34圖所示，F2H/L39-IgG1被證明具有很強的活性，在100%抑制濃度情形比WT高100倍或以上。
對F2H/L39-IgG1等電點利用等電聚焦法之評估F2H/L39-IgG1的等電點以實施例3所述的方法決定。F2H/L39-IgG1的等電點為5.5，暗示其血清滯留度被延長，因為與實施例5所製備之PF1相關之較低的等電點。
F2H/L39(VH與VL序列)之變異區的理論值等電點利用GENETYX(GENETYX CORPORATION)被計算為4.3。同時，WT的理論值等電點為9.20。因此，WT被轉換，經由胺基酸取代為F2H/L39，其具有理論值等電點被降低約4.9之變異區。
利用彌猴之F2H/L39-IgG1的PK/PD測試人類化PM1抗體(野生型(WT))、PF1抗體、以及F2H/L39-IgG1於彌猴被評估其藥物動力學以及藥效學。WT、PF1以及F2H/L39-IgG1於1.0毫克/公斤劑量被皮下給藥乙次，血液在給藥前與整個時間進程被收集。每個抗體在血清的濃度依實施例6所述之相同方式決定。WT、PF1以及F2H/L39-IgG1的血清濃度時間進程如第35圖所示。每個抗體中和膜結合(membrane-bound)之彌猴IL-6受體的效力被評估。彌猴IL-6在下背部以5微克/公斤劑量每天皮下給藥，在抗體給藥後第3天至第10天，而在每個動物之CRP濃度於24小時後被決定。WT或F2H/L39在給藥後之CRP濃度的時間進程如第36圖所示。為了評估每個抗體中和可溶性彌猴IL-6受體之效力，在彌猴血清之游離可溶性彌猴IL-6受體的濃度被決定。WT或F2H/L39在給藥後之游離可溶性彌猴IL-6受體濃度的時間進程如第37圖所示。
這些結果表示WT與PF1之血清濃度時間進程互相相當；然而，F2H/L39-IgG1的血清濃度，其具有較低的pI，被維持比這二種抗體高。同時，當與WT相比，具有IL-6受體高親和性之F2H/L39-IgG1被發現維持較低的CRP與游離可溶性彌猴IL-6受體濃度。
實施例14：WT-M14之血清滯留度的評估估計在人類血清滯留度之方法IgG分子在血清之被延長的滯留度(慢速排除，slowelimination)已知因為FcRn的作用，其已知為IgG分子的補救受體(salvagereceptor)(Nat. Rev. Immunol. 2007Sep;7(9):715-25)。當經由胞飲作用被包入核內體(endosomes)時，在核內體之酸性環境下(約pH6.0)，IgG分子與核內體表現之FcRn結合。當未與FcRn結合之IgG被移轉與降解於溶酶體，那些與FcRn結合者被轉移到細胞表現，接著在血清中性環境下(約pH 7.4)從FcRn再次被釋放回血清。
已知的IgG類型抗體包括IgG1、IgG2、IgG3、以及IgG4異構型這些異構型在人類血清半衰期被報導為IgG1與IgG2約36天，IgG3約29天，以及IgG4約16天(Nat.Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。因此，IgG1與IgG2之血清滯留度被相信是最長的。通常，用於藥劑之抗體異構型為IgG1、IgG2、以及IgG4。已被報導用於進一步延長這些IgG分子於血清滯留度之方法，包括用於改善前述與人類FcRn結合之活性，而這經由修改IgG恆定區之序列而達成(J. Biol. Chem. 2007 Jan 19;282(3):1709-17;J. Immuno1. 2006 Jan 1;176(1):346-56)。
小鼠FcRn與人類FcRn之間有品種專一性之差異(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Dec 5;103(49):18709-14)。因此，為了預測在人體具有修改之恆定區序列之IgG抗體的血清滯留度，較佳為在人類FcRn基因轉殖小鼠評估與人類FcRn之結合以及血清滯留度(Int. Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69)。
與人類FcRn結合之評估FcRn是FcRn與2-微球蛋白(2-microglobulin)的複合體。寡DNA引子以揭露之人類FcRn基因序列為基礎而被製備(J. Exp. Med. (1994)180(6),2377-2381)。編碼整個基因之DNA片段經由使用人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)做為模版與已製備之引子之PCR而被製備。利用得到之DNA片段做為模版，編碼具有訊息區(Metl-Leu290)之核外功能區塊的DNA片段被以PCR複製，並嵌入動物細胞表現載體(如SEQ ID NO:140所示之人類FcRn胺基酸序列)。相似地，寡DNA引子以揭露之人類2-微球蛋白基因序列為基礎而被製備(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(2002)99(26)，16899-16903)。編碼整個基因之DNA片段以利用人類cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA,CLONTECH)做為模版與已製備之引子之PCR製備。以所得到之DNA片段為模版，編碼具有訊息區(Metl-Met119)之整個2-微球蛋白之DNA片段以PCR複製，並嵌入動物細胞表現載體(如SEQ ID NO：141所示之人類2-微球蛋白胺基酸序列)。
可溶性人類FcRn依下列程序表現。構築用於人類FcRn與2-微球蛋白之質體被導入人類胚胎腎癌衍生之細胞株HEK293H(Invitrogen)的細胞，使用10%胎牛血清(Invitrogen)利用脂質體轉染。產生之培養上清液被收集，FcRn使用J. Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80所述之方法，利用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)收集，接著使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)進一步純化。
與人類FcRn之結合以Biacore 3000評估。抗體與固定於感應晶片之蛋白質L或兔子抗人類IgG Kappa鏈抗體結合，人類FcRn被添加作為與抗體交互作用之分析物，以及親和性(KD )經由結合之人類FcRn的量而計算。特別地，蛋白質L或兔子抗人類IgG Kappa鏈抗體被固定於感應晶片CM5(BIACORE)，經由胺基耦合方法，利用具有150mM NaCl之50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)作為緩衝液(running buffer)。隨後，抗體以具有0.02% Tween20之緩衝液稀釋，並被注射以與晶片結合。人類FcRn隨後被注射，以及人類FcRn與抗體之結合活性被評估。
親和性利用BIAevaluation Software計算。所得到之感應圖譜被用於計算hFcRn與抗體在人類FcRn注射結束前即時接合量。人類FcRn抗體親和性被計算，經由符合穩定狀態親和性法。
在人類FcRn基因轉殖小鼠之血清滯留度的評估在人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tgline 276+/+mice;Jackson Laboratories)之藥物動力學被以下列程序評估。抗體以1毫克/公斤之劑量被靜脈給藥乙次，且血液在適當之時間點被收集。所收集的血液立即地於15,000rpm以及4℃被離心15分鐘以得到血清。分離的血清在冰箱被保存於-20℃直到使用。血清濃度以ELISA決定。
WT-M14在人類之血清滯留度的預測評估WT-IgG1與WT-M14與人類FcRn結合之活性以BIAcore評估。如表十二所示，結果指出WT-M14的結合活性輕微地高於WT-IgG1。
如第38圖所示，然而，血清滯留度在WT-IgG1與WT-M14之間是相當的，當使用人類FcRn基因轉殖小鼠評估時。這個發現暗示在人類之M14恆定區的血清滯留度與IgG1恆定區相當。
實施例15：WT-M44、WT-M58、以及具有改善之血清滯留度之WT-M73的製備WT-M58分子的製備如實施例14所述，WT-M14在人類FcRn基因轉殖小鼠之血清滯留度與WT-IgG1相當。用於改善血清滯留度之已知方法包括那些降低抗體等電點者以及那些增強與FcRn結合者。在此，下述的修改被導入以改善WT-M14的血清滯留度。特別地，下列取代被導入WT-M31 GK，其係如實施例4所述從WT-M14所製備：以甲基胺酸取代EU編碼系統位置397的纈胺酸、麩醯胺酸取代位置268的組胺酸、麩醯胺酸取代位置355的精胺酸、以及麩胺酸取代位置419的麩醯胺酸。這4個取代被導入WT-M31 GK以產生WT-M58(SEQ ID NO:142的胺基酸序列)。表現載體以實施例1所述之相同方法製備。wT-M58與L(WT)分別被當作H鏈與L鏈。wT-M58以實施例1所述之方法表現與純化。
wT-M73分子的構築另一方面，wT-M44(SEQ ID NO:143的胺基酸序列)被產生，經由導入IgG1之EU編碼系統位置434胺基酸的丙胺酸取代。WT-M83(SEQ ID NO:185的胺基酸序列)亦被產生，經由EU編碼系統位置446之甘胺酸與EU編碼系統位置447之離胺酸的刪除以降低H鏈C端的異質性。此外，WT-M73(SEQ ID NO:144的胺基酸序列)被產生，經由導入wT-M58之EU編碼系統位置434的丙胺酸取代。
用於前述抗體之表現載體以實施例1所述之方法構築。WT-M44、WT-M58、或WT-M73被當作H鏈，而L(WT)被當作L鏈。WT-M44、WT-M58、以及WT-M73以實施例1所述之方法表現與純化。
WT-M44、WT-M58、以及WT-M73在人類之血清滯留度的預測評估WT-IgG1、WT-M44、WT-M58、以及WT-M73與人類FcRn之結合活性以BIAcore評估。如表十三所示，結果顯示WT-M44、WT-M58、以及WT-M73之結合活性高於WT-IgG1，且分別約為WT-IgG1的2.7、1.4、以及3.8倍。
WT-IgG1、WT-M14、以及WT-M58於人類FcRn基因轉殖小鼠之血清滯留度的評估結果如第39圖所示，WT-M58被確認具有相對於WT-IgG1與WT-M14增加的血清滯留度。此外，WT-IgG1、WT-M44、WT-M58、以及WT-M73被評估其在人類FcRn基因轉殖小鼠之血清滯留度。如第40圖所示，相較於WT-IgG1，WT-M44、WT-M58、以及WT-M73全體被確認具有改善的血清滯留度。血清滯留度之改善效果與人類FcRn之結合活性正相關。特別是，在第28天之WT-M73的血清濃度被改善為WT-IgG1的約16倍。這個發現暗示具有M73恆定區之抗體在人類的血清滯留度亦顯著地增加，相較於具有IgG1恆定區之抗體。
實施例16：新穎之恆定區M14與M58於不同抗體降低異質性之效果如實施例8所述，被證明源自IgG2絞鏈區之異原性可以被降低，經由在人類化抗IL-6受體PM1抗體(WT)轉換IgG2恆定區為M14。除了人類化PM1抗體之其他的IgG2類型抗體亦被測試以評估是否異質性可以經由轉換其恆定區為M14或M58而被降低。
除了人類化PM1抗體之其他的抗體為：抗IL-6受體的抗體F2H/L39(分別如SEQ ID NOs：145與146所示之F2H/L39_VH與F2H/L39 VL的胺基酸序列)、抗IL-31受體的抗體H0L0(分別如SEQ ID NOs:147與148所示之H0L0_VH與H0L0_VL的胺基酸序列)、以及抗RANKL抗體DNS(分別如SEQ ID NOs:149與150所示之DNS_VH與DNS_VL的胺基酸序列)。在每一個這些抗體，具有IgG1恆定區(SEQ ID NO:19)、IgG2恆定區(SEQ ID NO:20)、M14(SEQID NO:24)或M58(SEQ ID NO:151)的抗體被產生。
所產生的抗體被評估異質性，經由陽離子交換層析法，利用適合的梯度與適當的流速於ProPac WCX-10(Dionex)管柱(移動相A:20mM醋酸鈉(pH5.0)，移動相B:20mM醋酸鈉/1M NaCl(pH5.0))，由陽離子交換層析法(IEC)所得到之評估結果如第41圖所示。
如第41圖所示，由IgG1類型至IgG2類型之轉換被證實不僅在人類化抗IL-6受體PM1抗體(WT)增加異質性，亦在抗IL-6受體的抗體F2H/L39、抗IL-31受體的抗體H0L0、以及抗RANKL的抗體DNS。相反的，異質性可以在全部這些抗體被降低，經由轉換其恆定區為M14或M58。因此，被證明不論抗原類型或抗體變異區序列為何，源自天然IgG2之異質性可以被降低，經由在H鏈CH功能區塊EU編碼系統位置131以及在H鏈絞鏈區上游EU編碼系統位置219以絲胺酸取代胱胺酸。
實施例17：新穎之恆定區M58在不同抗體改善血清滯留度之效果如實施例15所述，說明在人類化抗IL-6受體PM1抗體(WT)之IgG1至M58的恆定區轉換改善對人類FcRn之結合活性以及在人類FcRn基因轉殖小鼠之血清滯留度。所以，除了人類化PM1抗體之其他的IgG1類型抗體亦被測試以評估是否其血清滯留度可以經由轉換其恆定區為M58而被改善。
人類化PM1抗體(WT)以外之其他抗體為抗IL-31受體的抗體H0L0(分別如SEQ ID NOs:147與148所示之H0L0_VH與H0L0_VL的胺基酸序列)、以及抗RANKL抗體DNS(分別如SEQ ID NOs:149與150所示之DNS_VH與DNS_VL的胺基酸序列)。在每一個這些抗體，具有IgG1恆定區(SEQ ID NO:19)或M58(SEQ ID NO:151)的抗體被產生，並且以實施例14所述的方法評估其對於人類FcRn之結合活性。結果如表十四所示。
如表十四所示，被證明作為恆定區由IgG1類型成為M58之轉換結果，相較於抗IL-6受體的抗體WT，抗IL-31受體的抗體H0L0與抗RANKL抗體DNS二者對人類FcRn的結合活性均被改善。這暗示著可能性，不論抗原類型或抗體變異區序列為何，在人類之血清滯留度可以被改善，經由轉換恆定區由IgG1類型為M58。
實施例18：在CHl功能區塊之胱胺酸對異質性與穩定性之效果如實施例8所述，在IgG2絞鏈區與CHl功能區塊之胱胺酸被取代以降低天然IgG2的異質性。不同修改之抗體的評估顯示異質性可以透過利用SKSC(SEQ ID NO:154)降低而不減少穩定性。SKSC(SEQ ID NO:154)是一個修改的恆定區，經由在H鏈CHl功能區塊EU編碼系統位置131以絲胺酸取代胱胺酸以及位置133以離胺酸取代精胺酸、以及在野生型IgG2恆定區序列H鏈上游絞鏈區EU編碼系統位置位置219以絲胺酸取代胱胺酸而被獲得。
同時，用於降低異質性的其他可能方法為單一取代，在H鏈上游絞鏈區EU編碼系統位置219以絲胺酸取代胱胺酸、或在位置220以絲胺酸取代胱胺酸。修改的IgG2恆定區SC(SEQ ID NO:155)被製備，經由在IgG2之EU編碼系統位置219以絲胺酸取代胱胺酸，以及CS(SEQ ID NO:156)被製備，經由在位置220以絲胺酸取代胱胺酸。WT-SC(SEQ ID NO:157)與WT-CS(SEQ ID NO:158)被製備以分別具有SC以及CS，且與WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SKSC、以及WT-M58比較異質性與熱穩定性。此外，F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、以及F2H/L39-M14，其分別具有IgG1(SEQ ID NO:19)、IgG2(SEQ ID NO:20)、SC(SEQ ID NO:155)、CS(SEQ ID NO:156)、SKSC(SEQ ID NO:154)、或M14(SEQ ID NO:24)之恆定區，由F2H/L39(分別如SEQ ID NOs:145與146所示之F2H/L39_VH與F2H/L39_VL的胺基酸序列)被製備，其為與WT不同之抗IL-6受體的抗體。抗體被比較異質性。
WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58、F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、以及F2H/L39-M14以陽離子交換層析法被評估異質性，利用適當的梯度與合適的流速於ProPac WCX-10(DioneX)管柱(移動相A：20mM醋酸鈉(pH 5.0)，移動相B：20mM醋酸鈉/1M NaCl(pH 5.0))。所得到之陽離子交換層析法的評估結果如第42圖所示。
如第42圖所示，恆定區由IgG1類型為IgG2類型之轉換被證實增加WT與F2H/L39二者之異質性。相反地，異質性被顯著地降低，經由轉換恆定區為SKSC與M14或M58。同時，轉換恆定區為SC顯著地降低異質性，如同在SKSC的情形。然而，轉換為CS並未顯著地改善異質性。
除了低異質性，高穩定性通常被需要，在抗體藥物之發展製備穩定配方時。因此，為了評估穩定性，熱變性的中間點溫度(Tm值)利用示差熱分析((DSC)(VP-DSC；Microcal))被決定。熱變性的中間點溫度(Tm值)作為穩定性的一個指標。為了製備穩定配方當作藥劑，較高的熱變性中間點溫度(Tm值)是較佳的(J. Pharm. Sci. 2008 Apr;97(4):1414-26)。WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、以及WT-M58對應20mM醋酸鈉、150mM NaC1、pH6.0之溶液被透析(EasySEP；TOMY)。DSC測量以1℃/分鐘之加熱速率於40至100℃的範圍進行，而蛋白質濃度約為0.1毫克/毫升。由DSC得到之變性曲線如第43圖所示。Fab功能區塊之Tm值如以下表十五所列。
WT-IgG1與WT-IgG2的Tm值幾乎相同(約94℃；IgG2的Tm值約低1℃)。同時，WT-SC與WT-CS的Tm值約為86℃，因此顯著地比WT-IgG1與WT-IgG2低。另一方面，WT-M58與WT-SKSC的 Tm值約為94℃，跟WT-IgG1與WT-IgG2相當。這暗示WT-SC與WT-CS相較於IgG2明顯地不穩定，因此，WT-SKSC與WT-M58，其二者亦包括在CH1功能區塊以絲胺酸取代胱胺酸，於抗體藥物之發展是較佳的。在WT-SC與WT-CS之Tm值相較於IgG2顯著降低的理由被認為是WT-SC或WT-CS與IgG2之間雙硫鍵結型態的差異。
另外，DSC變性曲線的比較顯示WT-IgG1、WT-SKSC、以及WT-M58每個均提供銳利而單一之Fab功能區塊變性波峰。相反地，WT-SC與WT-CS每個均提供較寬闊之Fab功能區塊變性波峰。WT-IgG2亦提供在Fab功能區塊變性波峰較低溫度側之肩狀波峰。通常，被認為單一成分提供一個銳利之DSC變性波峰，而當具有不同Tm值(稱為異質性)之二或多個成分存在時，變性波峰變得較寬闊。特別地，前述結果暗示著可能性，每一個WT-IgG2、WT-SC、以及WT-CS包含二或更多個成分，因此天然IgG2異質性在WT-SC與WT-CS並未顯著地降低。這個發現暗示不僅在絞鏈區之胱胺酸，也包括那些在CH1功能區塊者與野生IgG2異質性有關，需要修改在絞鏈區之胱胺酸以及那些在CH1功能區塊者，以降低DSC異質性。此外，如上所述，相當於野生型IgG2之穩定性可以被達成，僅在絞鏈區與CH1功能區塊之胱胺酸同時被取代時。
以上發現暗示，從異質性與穩定性之觀點，SC與CS，其恆定區被導入僅在絞鏈區胱胺酸之絲胺酸取代，作為恆定區並不足以降低源自IgG2絞鏈區之異質性。因此發現異質性可以被顯著地降低而維持IgG2相等之穩定性，除了絞鏈區之胱胺酸，僅在CH1功能區塊EU編碼系統位置131的胱胺酸被以絲胺酸取代時。這類恆定區包括前述的M14、M31、M58、以及M73。特別地，M58與M73是穩定而較少異質性，並具有改善之血清滯留度，因此被期待可用於抗體藥物之恆定區。
實施例19：具有改善的PK/PD之完全人類化抗IL-6受體的抗體的產生為了產生具有改善的PK/PD之完全人類化的抗IL-6受體的抗體，下述分子被創造經由修改TOCILIZUMAB(H鏈，wT-IgG1(SEQ ID NO:15)；L鏈，WT(SEQ ID NO:105))。
為了改善F2H-IgG1的ka ，以纈胺酸取代位置35的色胺酸、***酸取代位置50的酪胺酸、以及穌胺酸取代位置62的絲胺酸被進行，其為實施例2所得到之親和性增強取代。此外，為了降低pI而不增加免疫原性風險，以纈胺酸取代位置102的酪胺酸、麩胺酸取代位置105的麩醯胺酸、以及穌胺酸取代位置107的異白胺酸被進行，以及恆定區由IgG1類型成為M83之轉換被進行，並產生VH5-M83(SEQ ID NO:139的胺基酸序列)。另外，為了改善L39的ka，VL5-kappa(SEQ ID NO:181的胺基酸序列)被製備，其包括在位置27以麩醯胺酸取代麩胺酸。此外，TOCILIZUMAB變異株被製備，經由結合二或多種前述實施例所述之變異與恆定區突變以及新發現的突變。下列完全人類化IL-6受體的抗體利用不同的篩選測試而發現：Fv3-M73(H鏈，VH4-M73，SEQ ID NO：182；L鏈，VL1-kappa，SEQ ID NO:183)、Fv4-M73(H鏈，VH3-M73，SEQ ID NO:180；L鏈，VL3-kappa，SEQ ID NO:181)、以及Fv5-M83(H鏈，VH5-M83，SEQ ID NO:139；L鏈，VL5-kappa，SEQ ID NO:138)。
所製備之Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83對IL-6受體之親和性被與TOCILIZUMAB比較。這些抗IL6受體的抗體被決定之親和性如表十六所示。另外，它們的BaF/gp130中和活性被與TOCILIZUMAB以及控制組(如參考實施例所述之已知的高親和性抗IL-6受體的抗體、以及如美國專利申請案US 2007/0280945所述之VQ8F11-21hIgG1)比較。經由利用BaF/gp130決定這些抗體之生物活性所得到的結果如第44圖(TOCILIZUMAB、控制組、以及Fv5-M83於300毫微克/毫升之最終IL-6濃度)與第45圖(TOCILIZUMAB、Fv3-M73、以及Fv4-M73於30毫微克/毫升之最終IL-6濃度)所示。如表十六所示，Fv3-M73與Fv4-M73具有比TOCILIZUMAB高約2至3倍的親和性，而Fv5-M83表現比TOCILIZUMAB高約100倍的親和性(既然很難測量Fv5-M83的親和性，替代利用Fv5-IgG1決定親和性，其具有IgG1類型恆定區；該恆定區通常被認為不影響親和性)。如第45圖所示，Fv3-M73與Fv4-M73表現比TOCILIZUMAB輕微地較強之活性。如第44圖所示，Fv5-M83具有非常強烈的活性，在50%抑制濃度下，其較TOCILIZUMAB強100倍。在50%抑制濃度下，Fv5-M83亦展現較控制組(已知的高親和性抗IL-6受體的抗體)高10倍之中和活性。
TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83的等電點利用熟悉技藝人士已知的方法經由等電聚焦法決定。結果顯示等電點為TOCILIZUMAB約9.3、控制組約8.4至8.5、Fv3-M73約5.7至5.8、Fv4-M73約5.6至5.7、以及Fv5-M83約5.4至5.5。因此，相較於TOCILIZUMAB與控制組，每個抗體具有顯著地降低的等電點。此外，變異區VH/VL之理論值等電點以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算。結果顯示理論值等電點為TOCILIZUMAB約9.20、控制組約7.79、Fv3-M73約5.49、Fv4-M73約5.01、以及Fv5-M83約4.27。因此，相較於TOCILIZUMAB與控制組，每個抗體具有顯著地降低的等電點。於是，Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83的血清滯留度相較於TOCILIZUMAB與控制組被認為已被改善。
在TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、或Fv5-M83變異區序列之T細胞抗原決定位利用TEPITOPE(Methods.2004 Dec;34(4):468-75)分析。結果，TOCILIZUMAB被預測具有T細胞抗原決定位，其可與HLA結合。相反地，被預測與T細胞抗原決定位結合之序列數目在Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83顯著地降低。此外，Fv3-M73、Fv4-M73、或Fv5-M83之骨架不具有小鼠序列，因此為完全地人類化。這些暗示著可能性，相較於TOCILIZUMAB，免疫原性風險在Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83顯著地被降低。
實施例20：完全人類化IL-6受體的抗體在猴子之PK/PD測試TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83每一個以1毫克/公斤劑量對彌猴靜脈給藥乙次，以評估其血清濃度之時間進程(方法請參照參考實施例)。TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83在靜脈給藥後之血清濃度時間進程如第46圖所示。結果顯示The result showed that each of Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M8相較於TOCILIZUMAB與控制組每一個在彌猴展現顯著地改善之血清滯留度。在其中，相較於TOCILIZUMAB，Fv3-M73與Fv4-M73表現實質地改善之血清滯留度。
每個抗體中和膜結合彌猴IL-6受體之效力被評估。彌猴IL-6受體在抗體施用後(第3天至第10天，TOCILIZUMAB)第6天至第18天，於下背部每天以5微克/毫升劑量皮下給藥，以及24小時後每個動物之CRP濃度被決定(請參照參考實施例之方法)。每個抗體給藥後之CRP濃度的時間進程如第47圖所示。為了評估每個抗體中和可溶性彌猴IL-6受體之效力，在彌猴之游離可溶性彌猴IL-6受體的血清濃度被決定，以及可溶性IL-6受體中和作用的百分比被計算(請參照參考實施例之方法)。每種抗體給藥後之可溶性IL-6受體中和作用百分比的時間進程如第48圖所示。
Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83之每一種，相較於TOCILIZUMAB與控制組(已知的高親和性之抗I1-6受體的抗體)以更持續的方式中和膜結合彌猴IL-6受體，並且抑制CRP的增加於更長的期間。此外，Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83之每一種，相較於TOCILIZUMAB與控制組，以更持續的方式中和可溶性彌猴IL-6受體，並且抑制游離可溶性彌猴IL-6受體的增加於更長的期間。這些發現說明These findings demonstrate that all of Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83全體在持續膜結合與可溶性IL-6受體之中和作用比TOCILIZUMAB與控制組優良。在其中，Fv3-M73以及Fv4-M73在持續中和作用明顯地較佳。同時，Fv5-M83抑制CRP以及游離可溶性彌猴IL-6受體比Fv3-M73與Fv4-M73更強。因此，Fv5-M83被認為比Fv3-M73、Fv4-M73、與控制組(已知的高親和性IL-6受體的抗體)較強於中和膜結合以及可溶性IL6受體。被認為在彌猴體內的結果反映Fv5-M83對IL-6受體較強的親和性以及Fv5-M83在BaF/gp130試驗系統相較於控制組之較強的生物活性。
這些發現暗示Fv3-M73與Fv4-M73在維持其活性作為抗I1-6受體之中和抗體相較於TOCILIZUMAB與控制組是高度優秀，因此能顯著地降低給藥的劑量與頻率。另外，Fv5-M83被證明明顯地優良於抗I1-6受體之中和抗體活性的強度並且維持其活性。因此，Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83被期待有用於作為藥物IL-6拮抗劑。
參考實施例
可溶性重組彌猴IL-6受體(cIL-6R)之製備寡DNA引子被製備，依據被揭露之恆河猴IL-6受體基因序列(Birney等人，Ensembl 2006,Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34 (Database issue):D556-61)。編碼整個彌猴IL-6受體基因之DNA片段經由PCR製備，利用引子，以及做為模版由彌猴胰臟所製備之cDNA。結果之DN片段被嵌入動物細胞表現載體，以及適合的表現CHO株(cyno. sIL-6R-producing CHO cell line)使用該載體被製備。cyno. sIL-6R-producing CHO細胞之培養液被使用HisTrap管柱(GE Healthcare Bioscience)純化，隨後以Amicon Ultra-15 Ultrace1-10k(Millipore)濃縮。可溶性彌猴之IL-6受體(以下稱為cIL-6R)之最後純化樣品被得到，經由進一步在Superdex200pg16/60膠體過濾管柱(GE Healthcare Bioscience)之純化。
重組之彌猴IL-6(cIL-6)的製備彌猴IL-6依下述程序製備。寄存於SWISSPROTAccession No. P79341、編碼212個胺基酸之核苷酸序列被製備與選殖進入動物細胞表現載體。產生之載體被導入CH0細胞以製備穩定之表現細胞株(cyno. IL-6-producing CH0 cell line)。cyno. IL-6-producing CH0細胞的培養液被使用SP-Sepharose/FF管柱(GE Healthcare Bioscience)純化，接著以Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮。彌猴IL-6(以下稱為cIL-6)之最後純化的樣品被獲得，經由進一步在Superdex75pg26/60膠體過濾管柱(GE Healthcare Bioscience)之純化，接著以Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮。
已知的高親和性之抗IL-6受體的抗體之製備動物細胞表現載體被構築以表現VQ8F11-21 hIgG1，一種已知的高親和性之抗IL-6受體的抗體。VQ8F11-21hIgG1係如美國專利申請案US 2007/0280945 A1(US 2007/0280945 A1；H鏈與L鏈分別如SEQ ID NOs:19與27所示之胺基酸序列)所述。抗體變異區經由PCR構築，利用合成的寡DNA組合(組合PCR，assembly PCR)。抗體變異與恆定區經由組合PCR被組合在一起，隨後被嵌入動物細胞表現載體以構築用於標的H鏈與L鏈之表現載體。所產生之表現載體的核苷酸序列依熟悉技藝人士已知的方法決定。高親和性之抗IL-6受體的抗體(以下簡稱為“控制組”)被表現與純化，利用實施例1所述之方法所構築的表現載體，
與IL-6受體結合之Biacore分析抗原-抗體反應動力學使用Biacore T100(GE Healthcare)分析。SR344-抗體交互作用被測量，經由胺基耦合方法固定適量抗IgG(-鏈專一)F(ab’)2 於感應晶片，於pH7.4結合標的抗體在晶片，接著流動IL-6受體SR344在pH7.4於晶片調整為不同濃度以當作分析物。全部測量在37℃進行。動力學參數，結合速率常數(ka (1/Ms))以及解離速率常數(kd (1/s))由測量所得到之感應圖譜計算。之後，KD (M)以速率常數為基礎而被決定。對應的參數利用Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)而決定。
PK/PD試驗以決定在彌猴之抗體、CRP、以及游離可溶性IL-6受體之血清濃度在彌猴之血清濃度由ELISA利用熟悉技藝人士已知的方法決定。
CRP的濃度以自動分析儀(TBA-120FR；Toshiba Medical Systems Co.)利用Cias R CRP(KANTO CHEMICAL CO.,INC.)而決定。
游離可溶性彌猴IL-6受體在彌猴之血清濃度依下述程序決定。在血清之全部的IgG抗體(彌猴IgG、抗-人類IL-6受體的抗體、以及抗-人類IL-6受體的抗體-可溶性彌猴IL-6受體複合物)被吸附於蛋白質A，經由加入30微升的彌猴血清於以0.22微米過濾杯(Millipore)乾燥之適量的rProtein A Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)。接著，杯內的溶液利用高速離心機旋轉以收集穿過的溶液。透過的溶液不具有蛋白質A結合之抗-人類IL-6受體的抗體-可溶性彌猴IL-6受體複合物。因此，游離可溶性IL-6受體可以被決定，經由測量透過蛋白質A的溶液之可溶性彌猴IL-6受體濃度。可溶性彌猴IL-6受體的濃度使用熟悉技藝人士已知的方法決定，以測量可溶性人類IL-6受體的濃度。前述製備之可溶性彌猴IL-6受體(cIL-6R)被用於當作標準。
之後，可溶性IL-6受體中和作用的百分比依下列公式計算。
第1圖顯示WT與RD_6的BaF/gp130中和活性。
第2圖顯示rhIL-s6R(研發系統)與WT之間交互作用的感應圖譜。
第3圖顯示rhIL-s6R(研發系統)與RD_6之間交互作用的感應圖譜。
第4-1圖顯示與WT相較，改善親和性或中和活性之CDR突變的清單。
第4-2圖係為第4-1圖的延續。
第5圖顯示改善親和性或中和活性之CDR突變組合的清單。
第6圖顯示WT與RDC23的BaF/gp130中和活性。
第7圖顯示rhIL-s6R(研發系統)與RDC23之間交互作用的感應圖譜。
第8圖顯示rhsIL-6R與WT之間交互作用的感應圖譜。
第9圖顯示rhsIL-6R與RDC23之間交互作用的感應圖譜。
第10圖顯示SR344與WT之間交互作用的感應圖譜。
第11圖顯示SR344與RDC23之間交互作用的感應圖譜。
第12圖顯示WT與H53/L28的BaF/gp130中和活性。
第13圖顯示SR344與H53/L28之間交互作用的感應圖譜。
第14圖顯示對小鼠靜脈注射後，WT與H53/L28之血清濃度的轉變。
第15圖顯示對小鼠皮下注射後，WT與H53/L28之血清濃度的轉變。
第16圖顯示WT與PF1的BaF/gp130中和活性。
第17圖顯示SR344與PF1之間交互作用的感應圖譜。
第18圖顯示高濃度下測試WT與PF1之穩定性的結果。
第19圖顯示對人類化IL-6受體基因轉殖小鼠靜脈注射後，WT與PF1之血清濃度的轉變。
第20圖顯示對人類化IL-6受體基因轉殖小鼠給予WT或PF1的靜脈注射後，游離的人類可溶性IL-6受體之血清濃度的轉變。
第21圖顯示利用凝膠過濾層析法分析由鹽酸洗提所純化的聚集物之WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、以及IgG4-R409K的含量。
第22圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、以及WT-IgG4之陽離子交換層析法(IEC)分析的結果。
第23圖顯示預測的WT-IgG2絞鏈區雙硫鍵結。
第24圖顯示預測的WT-IgG2-SKSC絞鏈區雙硫鍵結。
第25圖顯示WT-IgG2與IgG2-SKSC之陽離子交換層析法(IEC)分析的結果。
第26圖顯示人類化的PM-1抗體、H鏈C端ΔK抗體、以及H鏈C端ΔGK抗體之陽離子交換層析法(IEC)分析的結果。
第27圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、以及WT-M11ΔGK與Fc RI結合量的比較。
第28圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、以及WT-M11ΔGK與Fc RIIa結合量的比較。
第29圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、以及WT-M11ΔGK與Fc RIIb結合量的比較。
第30圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14 Δ GK、WT-M17 Δ GK、以及WT-M11 Δ GK與FcRIIIa(Val)結合量的比較。
第31圖顯示高濃度下WT-IgG1、WT-M14 Δ GK、WT-M17 Δ GK、以及WT-M11 Δ GK穩定性測試之聚集的增加。
第32圖顯示高濃度下WT-IgG1、WT-M14 Δ GK、WT-M17 Δ GK、以及WT-M11 Δ GK穩定性測試之Fab片段的增加。
第33圖顯示WT-IgG2、WT-M14 Δ GK、以及WT-M31 Δ GK之陽離子交換層析法(IEC)分析的結果。
第34圖顯示WT與F2H/L39-IgG1的BaF/gp-130中和活性。
第35圖顯示以1.0毫克/公斤的劑量對彌猴皮下注射WT、PF1、或F2H/L39-IgG1後，抗體的血清濃度時間進程。
第36圖顯示以WT或F2H/L39-IgG1給藥之彌猴組的CRP濃度時間進程。
第37圖顯示以WT或F2H/L39-IgG1給藥之彌猴組的游離彌猴IL-6受體濃度。
第38圖顯示對人類FcRn基因轉殖小鼠靜脈注射後，WT-IgG1與WT-M14之血清濃度的時間進程。
第39圖顯示對人類FcRn基因轉殖小鼠靜脈注射後，WT-IgG1、WT-M14、以及WT-M58之血清濃度的時間進程。
第40圖顯示對人類FcRn基因轉殖小鼠靜脈注射後，WT-IgG1、WT-M44、WT-M58、以及WT-M73之血清濃度的時間進程。
第41圖顯示抗IL-6受體的抗體WT與F2H/L39、抗IL-31受體的抗體HOLO、以及抗RANKL的抗體DNS之恆定區異質性效應以陽離子交換層析法為基礎的評估。
第42圖顯示抗IL-6受體的抗體WT與F2H/L39的CHl功能區塊半胱胺酸之恆定區異質性效應以陽離子交換層析法為基礎的評估。
第43圖顯示抗IL-6受體的抗體WT的CHl功能區塊半胱胺酸之變性波峰以DSC為基礎的評估。
第44圖顯示TOCILIZUMAB、控制組、以及Fv5-M83中和BaF/g130的活性。
第45圖顯示TOCILIZUMAB、Fv3-M73、以及Fv4-M73中和BaF/gp130的活性。
第46圖顯示在靜脈注射後，彌猴之TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、以及Fv5-M83血清濃度的時間進程。
第47圖顯示靜脈注射TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、或Fv5-M83後，彌猴的CRP濃度時間進程。
第48圖顯示靜脈注射TOCILIZUMAB、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73或Fv5-M83後，彌猴之可溶性IL-6受體中和度百分比的時間進程。

Claims (5)

  1. 一種抗IL-6受體的抗體，包括一如SEQ ID NO：17之胺基酸序列所示之重鏈變異區和一如SEQ ID NO：18之胺基酸序列所示之輕鏈變異區，其中：(1)由SEQ ID NO：1之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR1中位置1的Ser已被Asp取代；(2)由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR2中位置9的Thr和位置16的Ser已被Asn和Gly分別取代；(3)由SEQ ID NO：7之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR1中位置13的Arg、位置16的Gln、位置23的Thr、及位置30的Thr已被Lys、Glu、Ala、及Ser分別取代；(4)由SEQ ID NO：8之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR2中位置8的Arg已被Glu取代；(5)由SEQ ID NO：9之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR3中位置4的Met、位置5的Leu、位置16的Arg、及位置27的Val已被Ile、Ser、Lys、及Ala分別取代；(6)由SEQ ID NO：10之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR4中位置3的Gln和位置5的Ser已被Glu和Thr分別取代；(7)由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR1中位置1的Arg已被Gln取代；(8)由SEQ ID NO：5之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR2中位置2的Thr和位置4的Arg已被Gly和Glu分別 取代；(9)由SEQ ID NO：6之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR3中位置5的Thr已被Ser取代；(10)由SEQ ID NO：11之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR1中位置18的Arg已被Ser取代；(11)由SEQ ID NO：12之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR2中位置11的Lys已被Glu取代；(12)由SEQ ID NO：13之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR3中位置23的Gln、位置24的Pro、及位置27的Ile已被Glu、Ala、及Ala分別取代；(13)由SEQ ID NO：14之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR4中位置10的Lys已被Glu取代。
  2. 一種抗IL-6受體的抗體，包括一如SEQ ID NO：17之胺基酸序列所示之重鏈變異區和一如SEQ ID NO：18之胺基酸序列所示之輕鏈變異區，其中：(1)由SEQ ID NO：1之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR1中位置1的Ser已被Asp取代；(2)由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR2中位置9的Thr和位置16的Ser已被Asn和Gly分別取代；(3)由SEQ ID NO：3之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR3中位置1的Ser和位置5的Thr已被Val和Ile分別取代；(4)由SEQ ID NO：7之胺基酸序列組成之重鏈變異區 FR1中位置13的Arg、位置16的Gln、位置23的Thr、及位置30的Thr已被Lys、Glu、Ala、及Ser分別取代；(5)由SEQ ID NO：8之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR2中位置8的Arg已被Glu取代；(6)由SEQ ID NO：9之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR3中位置4的Met、位置5的Leu、位置16的Arg、及位置27的Val已被Ile、Ser、Lys、及Ala分別取代；(7)由SEQ ID NO：10之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR4中位置3的Gln和位置5的Ser已被Glu和Thr分別取代；(8)由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR1中位置1的Arg已被Gln取代；(9)由SEQ ID NO：5之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR2中位置2的Thr和位置4的Arg已被Gly和Glu分別取代；(10)由SEQ ID NO：6之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR3中位置1的Gln和位置5的Thr已被Gly和Arg取代；(11)由SEQ ID NO：11之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR1中位置18的Arg已被Ser取代；(12)由SEQ ID NO：12之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR2中位置11的Lys已被Glu取代；(13)由SEQ ID NO：13之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR3中位置23的Gln、位置24的Pro、及位置27的Ile已被Glu、Ala、及Ala分別取代； (14)由SEQ ID NO：14之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR4中位置10的Lys已被Glu取代。
  3. 一種抗IL-6受體的抗體，包括一如SEQ ID NO：17之胺基酸序列所示之重鏈變異區和一如SEQ ID NO：18之胺基酸序列所示之輕鏈變異區，其中：(1)由SEQ ID NO：1之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR1中位置1的Ser已被Asp取代；(2)由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR2中位置9的Thr和位置16的Ser已被Asn和Gly分別取代；(3)由SEQ ID NO：3之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR3中位置1的Ser和位置5的Thr已被Val和Ile分別取代；(4)由SEQ ID NO：7之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR1中位置13的Arg、位置16的Gln、位置23的Thr、及位置30的Thr已被Lys、Glu、Ala、及Ser分別取代；(5)由SEQ ID NO：8之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR2中位置8的Arg已被Glu取代；(6)重鏈變異區FR3中的胺基酸序列已被SEQ ID NO：184之胺基酸序列取代；(7)由SEQ ID NO：10之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR4中位置3的Gln和位置5的Ser已被Glu和Thr分別取代；(8)由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之輕鏈變異區 CDR1中位置1的Arg已被Gln取代；(9)由SEQ ID NO：5之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR2中位置2的Thr和位置4的Arg已被Gly和Glu分別取代；(10)由SEQ ID NO：6之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR3中位置1的Gln和位置5的Thr已被Gly和Arg取代；(11)由SEQ ID NO：11之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR1中位置18的Arg已被Ser取代；(12)由SEQ ID NO：12之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR2中位置11的Lys已被Glu取代；(13)由SEQ ID NO：13之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR3中位置23的Gln、位置24的Pro、及位置27的Ile已被Glu、Ala、及Ala分別取代；(14)由SEQ ID NO：14之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR4中位置10的Lys已被Glu取代。
  4. 一種抗IL-6受體的抗體，包括一如SEQ ID NO：17之胺基酸序列所示之重鏈變異區和一如SEQ ID NO：18之胺基酸序列所示之輕鏈變異區，其中：(1)由SEQ ID NO：1之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR1中位置1的Ser已被Asp取代；(2)重鏈變異區CDR2中的胺基酸序列已被SEQ ID NO：122之胺基酸序列取代；(3)由SEQ ID NO：3之胺基酸序列組成之重鏈變異區CDR3中位置1的Ser和位置5的Thr已被Leu和Ala分別 取代；(4)由SEQ ID NO：7之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR1中位置13的Arg、位置16的Gln、位置23的Thr、及位置30的Thr已被Lys、Glu、Ala、及Ser分別取代；(5)由SEQ ID NO：8之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR2中位置8的Arg已被Glu取代；(6)重鏈變異區FR3中的胺基酸序列已被SEQ ID NO：184之胺基酸序列取代；(7)由SEQ ID NO：10之胺基酸序列組成之重鏈變異區FR4中位置5的Ser已被Ile取代；(8)由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR1中位置1的Arg和位置4的Gln已被Gln和Glu分別取代；(9)輕鏈變異區CDR2中的胺基酸序列已被SEQ ID NO：126之胺基酸序列取代；(10)由SEQ ID NO：6之胺基酸序列組成之輕鏈變異區CDR3中位置1的Gln和位置5的Thr已被Gly和Arg取代；(11)由SEQ ID NO：11之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR1中位置18的Arg已被Ser取代；(12)由SEQ ID NO：12之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR2中位置11的Lys已被Glu取代；(13)由SEQ ID NO：13之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR3中位置23的Gln、位置24的Pro、及位置27的Ile已被Glu、Ala、及Ala分別取代； (14)由SEQ ID NO：14之胺基酸序列組成之輕鏈變異區FR4中位置10的Lys已被Glu取代。
  5. 一種包括申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體的醫藥組合物。
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