TWI554517B - 藉陽離子交換層析法純化抗體 - Google Patents

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Description

藉陽離子交換層析法純化抗體
本發明一般係關於蛋白質純化。詳言之，本發明係關於一種使用陽離子交換層析法自包含抗體及至少一種污染物之組合物純化該抗體之方法，其中使用高pH值洗滌步驟來移除污染物，隨後使用具有增加電導率之溶離緩衝液溶離所需抗體。
本申請案主張2007年10月30日申請之美國臨時專利申請案第60/983825號之利益，該申請案之揭示內容之全文係出於所有目的以引用的方式併入本文中。
蛋白質之大規模經濟純化為生物技術工業之一日益重要之問題。一般而言，使用經工程化以產生所關注之蛋白質的真核或原核細胞株，藉由細胞培養產生蛋白質，其中該工程化係藉由***含有該蛋白質之基因的重組質體達成。由於通常所用之細胞為活的有機體，故其必須饋以複合生長培養基，該複合生長培養基含有糖、胺基酸及通常由動物血清製劑提供之生長因子。自饋入細胞中之化合物混合物及細胞本身之副產物分離足以用作人類治療劑之純度的所需蛋白質提出了艱巨的挑戰。
自細胞碎片純化蛋白質之程序最初視蛋白質表現之位點而定。一些蛋白質可歸為直接自細胞分泌至周圍生長培養基中；其他蛋白質 則以細胞內方式產生。對於後者蛋白質，純化過程之第一步驟包括將細胞溶解，此可藉由包括機械剪切、滲透衝擊或酶促處理之多種方法進行。該破裂將細胞之全部內容物釋放至勻漿中，且另外產生由於尺寸較小而難以移除之亞細胞片段。其通常藉由差速離心或藉由過濾移除。直接分泌蛋白由於蛋白產生進行過程中細胞之自然死亡及細胞內宿主細胞蛋白之釋放而出現相同問題，但規模較小。
在獲得含有所關注蛋白質之澄清溶液之後，該蛋白質自細胞所產生之其他蛋白質之分離通常使用不同層析技術之組合來嘗試。該等技術基於蛋白質之電荷、疏水性程度或尺寸來分離蛋白質混合物。對於該等技術中之每一者可獲得若干不同層析樹脂，使得能夠精確定製所涉及之特定蛋白質之純化方案。該等分離方法中之每一者之本質在於可使蛋白質沿長管柱以不同速率移動以達成物理分離，當蛋白質進一步沿管柱通過時其量得以增加，或可使蛋白質選擇性地與分離介質黏著，隨後由不同溶劑差別溶離。在一些情況下，當雜質特異性地黏著於管柱且所關注之蛋白質不黏著於管柱時，亦即所關注之蛋白質以"流過"形式存在時，將所需蛋白質自雜質分離。
離子交換層析法為一種通常用於純化蛋白質之層析技術。在離子交換層析法中，溶質表面上之帶電部分由層析基質所附著之相反電荷吸引，其限制條件為周圍緩衝液之離子強度較低。溶離通常係藉由增加緩衝液之離子強度(亦即電導率)以與溶質競爭離子交換基質之帶電位點達成。改變pH值且因此改變溶質之電荷為達成溶質溶離之另一方法。電導率或pH值之改變可為逐漸(梯度溶離)或逐步(分步溶離)的。在過去，該等變化為漸進的；亦即pH值或電導率沿單方向增加或減少。
美國專利第6,339,142號、第6,417,355號、第6,489,447號及第7,074,404號(Basey等人)描述用於純化多肽之離子交換層析法。美國 專利第6,127,526號、第6,333,398號及第6,797,814號(Blank，G.)描述藉由蛋白質A層析法純化諸如抗HER2抗體之蛋白質。美國申請公開案第2004/0082047號描述藉由離子交換層析法純化蛋白質(諸如抗體)之方法。
美國專利第5,110,913號提及純化水溶液中之抗體，其係藉由使該抗體在4.6之第一pH值下與離子交換樹脂結合，在5.5之第二pH值下洗滌且在pH 6.5下將抗體溶離達成，其中該等三個步驟之溶液的離子強度保持恆定。Zhang等人提及人類抗體之Q膜陰離子交換層析法(Zhang等人"Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process"，BioProduction，10月26-27日。Munich，Germany，2004中所提供之海報)。其他關於蛋白質純化之公開案包括：Barnthouse等人，J.Biotech.66：125-136(1998)；Blank等人，Bioseparation 10：65-71(2001)；Follman及Fahrner，J.Chromatog.1024：79-85(2004)；Iyer等人，BioPharm 15(1)：14-16，18，20，53(2002)；US 2004/0082047 A1；EP 333,574；EP 460,426B1；EP 556,083；WO 89/05157；WO 92/22653；WO 93/06217；WO 95/22389；WO 96/33208；WO 96/40883；US 4,753,894；US 4,966,851；US 5,110,913；US 5,112,951；US 5,115,101；US 5,118,796；US 5,169,774；US 5,196,323；US 5,256,769；US 5,279,823；US 5,429,746；US 5,451,662；US 5,525,338；US 5,677,171；US 6,005,081；US 6,054,561；US 6,127,526；US 6,267,958；US 6,339,142；US 6,417,335；US 6,489,447；Adachi等人，Journal of Chromatography.A.763(1-2)：57-63(1997年2月28日)；Gagnon，P.，Purification Tools for Monoclonal Antibodies，Tucson：Validated Biosystems，Inc.，第4章，第57-86頁(1996)；Graf等人，Bioseparation 4(1)：7-20(1994年2月)；Mhatre等人，Journal of Chromatography A 707(2)：225-231(1995年7月21日)；Neidhardt等人，Journal of Chromatography 590(2)：255-261(1992)；Protein Purification Applications-A Practical Approach，Harris及Angal，IRL Press第151-156頁(1995)；Sofer等人，Handbook of Process Chromatography：A Guide to Optimization，Scale-up，and Validation，San Diego：Academic Press第65-80頁(1997)；Tishchenko等人，Journal of Chromatography B 706(1)：157-166(1998年2月27日)。
本發明係關於抗體之陽離子交換層析之改良方法，其中使用高pH值洗滌步驟移除污染物，隨後溶離所需抗體產物。該過程尤其使得中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)污染物之移除得以改良。
根據第一態樣，本發明提供自包含抗體及至少一種污染物之組合物純化該抗體之方法，該方法包含以下連續步驟：(a)將該組合物裝載於陽離子交換物質上，其中該組合物具有第一pH值；(b)以第一洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第一洗滌緩衝液具有大於(a)中該組合物pH值之pH值，其中該第一洗滌緩衝液之pH值為約6.8至約9.0；(c)以第二洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第二洗滌緩衝液具有小於該第一洗滌緩衝液pH值之pH值；及(d)以溶離緩衝液自該陽離子交換物質溶離該抗體，其中該溶離緩衝液具有大體上大於該第二洗滌緩衝液之電導率的電導率。
較佳地，該抗體結合人類CD20，諸如利妥昔單抗(rituximab)，或結合人類血管內皮生長因子(VEGF)，諸如貝伐單抗(bevacizumab)。
根據一較佳實施例，本發明係關於一種自組合物純化結合人類 CD20之抗體之方法，該組合物包含該抗體及一或多種選自由以下各物組成之群的污染物：中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)、浸出蛋白A、DNA及凝集CD20抗體，該方法包含以下連續步驟：(a)將該組合物裝載於陽離子交換物質上，其中該組合物具有約4.0至約6.0之pH值；(b)以第一洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第一洗滌緩衝液具有約6.8至約9.0之pH值；(c)以第二洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第二洗滌緩衝液具有約5.0至約6.0之pH值；及(d)使用溶離緩衝液自該陽離子交換物質溶離該抗體，其中該溶離緩衝液具有約5.0至約6.0之pH值及約10至約100mS/cm之電導率。較佳地，該CD20抗體為利妥昔單抗。
根據另一較佳實施例，本發明係關於一種自組合物純化結合人類血管內皮生長因子(VEGF)之抗體的方法，該組合物包含該抗體及一或多種選自由以下各物組成之群的污染物：細胞培養基組份慶大黴素(garamycin)、中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)、DNA、病毒污染物及凝集VEGF抗體，該方法包含以下連續步驟：(a)將該組合物裝載於陽離子交換物質上，其中該組合物具有約4.0至約6.0之pH值；(b)以第一洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第一洗滌緩衝液具有約6.8至約8.0之pH值；(c)以第二洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第二洗滌緩衝液具有約5.0至約6.0之pH值；及(d)使用溶離緩衝液自該陽離子交換物質溶離該抗體，其中該溶離緩衝液具有約5.0至約6.0之pH值及約10至約100mS/cm之電導率。較佳地，該VEGF抗體為貝伐單抗。
本發明亦係關於一種組合物，其包含於包含約25mM HEPES(pH值為約7.8)之緩衝液中的利妥昔單抗。
此外，本發明提供一種組合物，其包含於包含約25mM MOPS(pH值為約7.0)之緩衝液中的貝伐單抗。
圖1A及1B提供利妥昔單抗抗體之重鏈(SEQ ID No.1)及輕鏈(SEQ ID No.2)之胺基酸序列。鑑別出各可變區中之構架區(FR1-4)中之每一者及CDR區(CDR1-3)中之每一者，亦鑑別出人類γ1重鏈恆定序列及人類κ輕鏈恆定序列。可變重鏈(VH)區位於SEQ ID No.3中。可變輕鏈(VL)區位於SEQ ID No.4中。CDR之序列標識符為：CDR H1(SEQ ID No.5)、CDR H2(SEQ ID No.6)、CDR H3(SEQ ID No.7)、CDR L1(SEQ ID No.8)、CDR L2(SEQ ID No.9)及CDR L3(SEQ ID No.10)。
圖2A及2B提供貝伐單抗抗體之重鏈(SEQ ID No.11)及輕鏈(SEQ ID No.12)之胺基酸序列。各可變區之末端以∥表示。可變重鏈(VH)區位於SEQ ID No.13中。可變輕鏈(VL)區位於SEQ ID No.14中。各可變區中三個CDR中之每一者加下劃線。CDR之序列標識符為：CDR H1(SEQ ID No.15)、CDR H2(SEQ ID No.16)、CDR H3(SEQ ID No.17)、CDR L1(SEQ ID No.18)、CDR L2(SEQ ID No.19)及CDR L3(SEQ ID No.20)。
圖3提供藉由改良利妥昔單抗過程之陽離子交換層析過程達成之宿主細胞蛋白質移除與原始過程所達成之移除相比之並列對照。以該新穎過程移除較多CHOP。
定義：
在本文中，以術語"約"開始之數值範圍或量清楚地包括確切範圍 或確切數值量。
本文中欲純化之"組合物"包含所關注之抗體及一或多種污染物。組合物可經"部分純化"(亦即已進行一或多個純化步驟)或可直接由產生抗體之宿主細胞或生物體獲得(例如，組合物可包含所獲得之細胞培養液)。
如本文中所使用之"多肽"通常係指具有超過約10個胺基酸之肽及蛋白質。較佳地，多肽為哺乳動物蛋白，其實例包括：腎素；生長激素，包括人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；副甲狀腺素；促甲狀腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促濾泡激素；降血鈣素；促黃體素；升糖素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子及溫韋伯氏因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，諸如蛋白C；心房利尿鈉因子；肺界面活性劑；血漿素原活化因子，諸如尿激酶或人類尿或組織類型血漿素原活化因子(t-PA)；鈴蟾素；凝血酶；生血生長因子；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；腦啡肽酶；RANTES(調節活化，通常為T細胞所表現及分泌)；人類巨噬細胞發炎蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；苗勒管抑制物；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；前鬆弛素；小鼠***相關肽；微生物蛋白，諸如β-內醯胺酶；DNase；IgE；細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子受體；蛋白A或蛋白D；類風濕因子；神經營養因子，諸如骨衍生之神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5或神經營養蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或諸如NGF-β之神經生長因子；血小板衍生之生長因子(PDGF)；纖維母細胞生長因子，諸如aFGF及bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF- β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II(IGF-I及IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、CD19及CD20；紅血球生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態生成蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；介白素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如AIDS包膜之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整合素，諸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18，ICAM、VLA-4及VCAM；腫瘤相關抗原，諸如HER2、HER3或HER4受體；及以上所列多肽中之任一者之片段及/或變異體以及與以上所列多肽之任一者結合之抗體，包括抗體片段。較佳多肽為與人類CD20結合之完整抗體或抗體片段，例如利妥昔單抗；或與人類血管內皮生長因子(VEGF)結合之完整抗體或抗體片段，例如貝伐單抗。
"污染物"為不同於所需抗體產物之物質。污染物包括(但不限於)：宿主細胞物質，諸如中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)；浸出蛋白A；核酸；所需抗體之變異體、片段、凝集物或衍生物；另一多肽；內毒素；病毒污染物；細胞培養基組份(例如慶大黴素；GENTAMYCIN®)等。
短語"陽離子交換物質"係指帶負電荷且具有游離陽離子供與通過或通入固相之水溶液中之陽離子交換的固相。電荷可藉由使一或多種電荷配位體與固相連接，例如藉由共價鍵聯來提供。另外或其他，電荷可為固相之固有特性(例如，與具有整體負電荷之二氧化矽之情況一樣)。市售陽離子交換物質包括羧基-甲基-纖維素、BAKERBOND ABXTM、固定於瓊脂糖上之磺丙基(SP)(例如來自GE Healthcare之SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM、SP-SEPHAROSE FAST FLOW XLTM或 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCETM)、CAPTO STM(GE Healthcare)、FRACTOGEL-SO3TM、FRACTOGEL-SE HICAPTM及FRACTOPREPTM(EMD Merck)、固定於瓊脂糖上之磺醯基(例如來自GE Healthcare之S-SEPHAROSE FAST FLOWTM)及SUPER SPTM(Tosoh Biosciences)。本文中之較佳陽離子交換物質包含塗佈有以磺丙基官能化之多羥基聚合物的交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通粒子(固相)(例如POROS 50 HS®層析樹脂)。
"固相"意謂一或多種電荷配位體可黏著之非水性基質。固相可為純化管柱(包括(但不限於)擴張床及填充床管柱)、離散粒子之不連續相、膜或過濾器等。形成固相之物質的實例包括多醣(諸如瓊脂糖及纖維素)及其他機械穩定性基質，諸如二氧化矽(例如可控孔隙玻璃)、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、聚丙烯醯胺、陶瓷粒子及以上各物中之任一者之衍生物。
本文中之術語"裝載"係指裝載於陽離子交換物質上之組合物。較佳地，將陽離子交換物質與平衡緩衝液平衡隨後裝載待純化之組合物。
"緩衝液"為一種藉由酸鹼結合組份之作用阻止pH值改變之溶液。可視(例如)緩衝液之所需pH值而定來使用之各種緩衝液係描述於Buffers.A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems，Gueffroy，D.，編.Calbiochem Corporation(1975)中。
"平衡緩衝液"為一種用於在將包含所關注之抗體及一或多種污染物之組合物裝載於陽離子交換物質上之前平衡陽離子交換物質之緩衝液。較佳地，本文中之平衡緩衝液之pH值係在約5.0至約6.0，較佳約5.5之範圍內。較佳地，本文中之平衡緩衝液之電導率係在約1至約8mS/cm，較佳約4至約8mS/cm，且最佳約5至約8mS/cm之範圍內。視情況，平衡緩衝液包含諸如NaCl之鹽，NaCl之量為例如約40mM至約 80mM，較佳約60mM。
本文中所使用之術語"洗滌緩衝液"係指在裝載組合物之後且在溶離所關注之蛋白之前，在陽離子交換物質上通過之緩衝液。洗滌緩衝液可用以自陽離子交換物質移除一或多種污染物而不會實質上溶離所需抗體產物。根據本發明之較佳實施例，使用"第一洗滌緩衝液"及"第二洗滌緩衝液"。
在本文中，表述"第一洗滌緩衝液"係指相對於裝載及/或平衡緩衝液之pH值，pH值增加之洗滌緩衝液。可在本文中使用第一洗滌緩衝液以自陽離子交換物質溶離一或多種污染物，而不會實質上由此溶離所關注之抗體產物。術語"第一"不應解釋為排除使用裝載與第一洗滌緩衝液之間的一或多種其他洗滌液或其他緩衝液。較佳地，本文中之第一洗滌緩衝液之pH值係在約6.8至約9.0，較佳約7.0至約8.0之範圍內，且最佳pH值為約7.0或pH值為約7.8。較佳地，本文中之第一洗滌緩衝液之電導率係在約0.01至約5mS/cm，較佳約0.1至約3mS/cm且最佳約0.2至約2mS/cm之範圍內。視情況，該第一洗滌緩衝液中大體上無鹽(諸如NaCl)。
出於本申請案之目的之表述"第二洗滌緩衝液"係指在第一洗滌緩衝液之後使用以製備用於溶離所關注抗體之陽離子交換物質的洗滌緩衝液。術語"第二"不應解釋為排除使用第一洗滌緩衝液與第二洗滌緩衝液之間的一或多種其他洗滌液或其他緩衝液。較佳地，本文中之第二洗滌緩衝液之pH值係在約5.0至約6.0，較佳約5.5之範圍內，且最佳pH值為5.5。較佳地，本文中之第二洗滌緩衝液之電導率係在約0.01至約5mS/cm，較佳約0.1至約3mS/cm且最佳約0.5至約3.0mS/cm之範圍內。
"溶離緩衝液"係用於自固相溶離所關注之抗體。在本文中，溶離緩衝液具有相對於第二洗滌緩衝液之電導率大體上增加之電導率以使 所需抗體產物自陽離子交換物質溶離。較佳地，溶離緩衝液之電導率大體上大於裝載之電導率及前述緩衝液中之每一者(亦即平衡緩衝液、第一洗滌緩衝液及第二洗滌緩衝液)之電導率。"大體上較大"之電導率意謂(例如)該緩衝液具有至少2、3、4、5或6個電導率單位(mS/cm)的大於其所比較之組合物或緩衝液之電導率的電導率。在一實施例中，溶離緩衝液之pH值大體上與平衡及/或第二洗滌緩衝液之pH值相同。較佳地，本文中之溶離緩衝液之pH值係在約5.0至約6.0，較佳約5.5之範圍內，且最佳pH值為5.5。較佳地，本文中之溶離緩衝液之電導率係在約10mS/cm至約100mS/cm，較佳約12mS/cm至約30mS/cm且最佳約12至約20mS/cm之範圍內。增加之電導率可藉由向溶離緩衝液中添加諸如氯化鈉、乙酸鈉、氯化鉀之鹽達成。較佳地，溶離緩衝液包含約100至約300mM NaCl，較佳約150mM至約200mM NaCl，例如約175mM NaCl或約160mM NaCl。
"再生緩衝液"可用於再生陽離子交換物質以使其可再使用。再生緩衝液具有需要大體上自陽離子交換物質移除所有污染物及所關注之抗體的電導率及/或pH值。
術語"電導率"係指水溶液在兩個電極之間傳導電流之能力。在溶液中，電流藉由離子轉運流動。因此，使水溶液中所存在之離子量增加，則該溶液將具有更高電導率。度量電導率之基本單位為西門子(或姆歐)、姆歐(mS/cm)，且可使用諸如各種型號之Orion電導率計之電導率計來量測。由於電導率為溶液中離子攜帶電流之能力，故溶液之電導率可藉由改變其中之離子濃度而改變。舉例而言，溶液中緩衝劑之濃度及/或鹽(例如氯化鈉、乙酸鈉或氯化鉀)之濃度可經改變以達成所需電導率。較佳地，各種緩衝液之鹽濃度經改動以達成所需電導率。
自包含抗體及一或多種污染物之組合物"純化"該抗體意謂藉由自 組合物(完全或部分)移除至少一種污染物提高組合物中該抗體之純度。"純化步驟"可為產生"均質"組合物之整個純化過程之一部分。本文中使用之"均質"係指包含以組合物之總重量計至少約70重量%，較佳至少約80重量%，更佳至少約90重量%，甚至更佳至少約95重量%所關注抗體的組合物。
使分子與陽離子交換物質"結合"意謂在適當條件(pH值及/或電導率)下將該分子暴露於陽離子交換物質以使該分子藉助於分子與陽離子交換物質之帶電基團之間的離子相互作用可逆地固定於陽離子交換物質中或陽離子交換物質上。
"洗滌"陽離子交換物質意謂將適當緩衝液通入或通過陽離子交換物質。
自陽離子交換物質"溶離"分子(例如抗體或污染物)意謂由此移除該分子。
在本發明之較佳實施例中，本文中之待純化抗體為重組抗體。"重組抗體"為以編碼該抗體之核酸轉型或轉染之宿主細胞中所產生之抗體，或由同源重組產生該抗體。"轉型"及"轉染"可互換使用以指示將核酸引入細胞中之過程。轉型或轉染之後，核酸可整合於宿主細胞基因組中或可作為染色體外因子存在。"宿主細胞"包括活體外細胞培養物中之細胞以及宿主動物內之細胞。舉例而言，重組產生多肽之方法係如美國專利第5,534,615號中所述，該專利係以引用的方式清楚地併入本文中。
起始多肽之"變異體"或"胺基酸序列變異體"為包含不同於起始多肽之胺基酸序列的胺基酸序列之多肽。一般而言，變異體與原生多肽具有至少80%序列一致性，較佳至少90%序列一致性，更佳至少95%序列一致性且最佳至少98%序列一致性。序列一致性百分比係(例如)藉由Fitch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：1382-1386(1983)， Needleman等人，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)所述之算法形式在序列比對之後測定以提供最大同源性。多肽之胺基酸序列變異體可藉由將適當核苷酸變化引入編碼該多肽之DNA中或藉由肽合成來製備。該等變異體包括(例如)所關注之多肽胺基酸序列內之殘基的缺失及/或***及/或取代。進行缺失、***及取代之任何組合以達成最終構築體，其限制條件為該最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可能在多肽之轉譯加工後改變，諸如藉由改變糖基化位點之數目或位置。其他轉譯後修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化，絲胺醯基、羥丁胺醯基或酪胺醯基殘基之羥基的磷酸化，離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈α-胺基的甲基化，(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86頁(1983))。舉例而言，產生多肽之胺基酸序列變異體之方法係如美國專利第5,534,615號中所述，該專利係以引用之方式清楚地併入本文中。
術語"抗體"係以最為廣泛之意義使用，尤其涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要其展現所需結合特異性。
本文中之抗體係針對所關注之"抗原"。較佳地，該抗原為生物學重要多肽，且向患有疾病或病症之哺乳動物投與該抗體可在該哺乳動物中產生治療效益。然而，亦涵蓋針對非多肽抗原(諸如腫瘤相關糖脂抗原；參見美國專利5,091,178)之抗體。若抗原為多肽，則其可為跨膜分子(例如受體)或配位體(諸如生長因子)。例示性抗原包括上述多肽。本發明所涵蓋之抗體的較佳分子標靶包括CD多肽，諸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20及CD34；HER受體家族成員，諸如EGF受體(HER1)、HER2、HER3或HER4受體；細胞黏著分子，諸如LFA-1、Mac1、p150、p95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及av/b3整合素，包括其a或b亞單位(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生 長因子，諸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖症(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；多肽C等。可溶抗原或其片段，視情況與其他分子結合，可用作產生抗體之免疫原。對於跨膜分子，諸如受體，其片段(例如受體之胞外域)可用作免疫原。或者，表現跨膜分子之細胞可用作免疫原。該等細胞可來自天然來源(例如癌細胞株)或可為已由重組技術轉型以表現跨膜分子之細胞。
本文中欲純化抗體之實例包括(但不限於)HER2抗體，包括曲妥珠單抗(trastuzumab，HERCEPTIN®)(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285-4289(1992)、美國專利第5,725,856號)及帕妥珠單抗(pertuzumab，OMNITARGTM)(WO 01/00245)；CD20抗體(參見下文)；IL-8抗體(St John等人，Chest,103：932(1993)及國際公開案第WO 95/23865號)；VEGF或VEGF受體抗體，包括人源化及/或親和力成熟VEGF抗體，諸如人源化VEGF抗體huA4.6.1貝伐單抗(bevacizumab，AVASTIN®)及蘭尼單抗(ranibizumab，LUCENTIS®)(Kim等人，Growth Factors，7：53-64(1992)、1998年10月15日公開之國際公開案第WO 96/30046號及第WO 98/45331號)；PSCA抗體(WO 01/40309)；CD11a抗體，包括依法珠單抗(efalizumab，RAPTIVA®)(美國專利第5,622,700號，WO 98/23761，Steppe等人，Transplant Intl.4：3-7(1991)及Hourmant等人，Transplantation 58：377-380(1994))；結合IgE之抗體，包括奧瑪利珠單抗(omalizumab，XOLAIR®)(Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993)及國際公開案第WO 95/19181號；1998年2月3日頒布之美國專利第5,714,338號，或1992年2月25日頒布之美國專利第5,091,313號，1993年3月4日公開之WO 93/04173或1998年6月30日申請之國際申請案第PCT/US98/13410號，美國專利第5,714,338號)；CD18抗體(1997年4月22日頒布之美國專利第5,622,700號或1997年7月31日公開 之WO 97/26912中者)；Apo-2受體抗體抗體(1998年11月19日公開之WO 98/51793)；組織因子(TF)抗體(1994年11月9日授予之歐洲專利第0 420 937 B1號)；α4-α7整合素抗體(1998年2月19日公開之WO 98/06248)；EGFR抗體(例如1996年12月19日公開之WO 96/40210中之嵌合或人源化225抗體西妥昔單抗，ERBUTIX®)；CD3抗體，諸如OKT3(1985年5月7日頒布之美國專利第4,515,893號)；CD25或Tac抗體，諸如CHI-621(SIMULECT®)及ZENAPAX®(參見1997年12月2日頒布之美國專利第5,693,762號)；CD4抗體，諸如cM-7412抗體(Choy等人Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；CD52抗體，諸如CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann等人。Nature 332：323-337(1988))；Fc受體抗體，諸如針對Fc之M22抗體(Graziano等人。J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中之RI)；癌胚抗原(CEA)抗體，諸如hMN-14(Sharkey等人。Cancer Res.55(23增刊)：5935s-5945s(1995))；針對***上皮細胞之抗體，包括huBrE-3、hu-Mc3及CHL6(Ceriani等人。Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；及Richman等人。Cancer Res.55(23增刊)：5916s-5920s(1995))；與結腸癌細胞結合之抗體，諸如C242(Litton等人。Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；CD38抗體，例如AT 13/5(Ellis等人。J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；CD33抗體，諸如Hu M195(Jurcic等人。Cancer Res 55(23增刊)：5908s-5910s(1995))及CMA-676或CDP771；EpCAM抗體，諸如17-1A(PANOREX®)；GpIIb/IIIa抗體，諸如阿昔單抗(abciximab)或c7E3 Fab(REOPRO®)；RSV抗體，諸如MEDI-493(SYNAGIS®)；CMV抗體，諸如PROTOVIR®；HIV抗體，諸如PRO542；肝炎抗體，諸如Hep B抗體OSTAVIR®；CA 125抗體奧瓦瑞斯(OvaRex)；個體基因型GD3抗原決定基抗體BEC2；αvβ3抗體(例如VITAXIN®；Medimmune)；人類腎細胞癌抗體，諸如ch-G250；ING-1；抗人類17- 1An抗體(3622W94)；抗人類結腸直腸腫瘤抗體(A33)；針對GD3神經節苷脂之抗人類黑色素瘤抗體R24；抗人類鱗狀細胞癌(SF-25)；人類白細胞抗原(HLA)抗體，諸如Smart ID 10，及抗HLA DR抗體奧克靈(Oncolym，Lym-1)；CD37抗體，諸如TRU 016(Trubion)；IL-21抗體(Zymogenetics/Novo Nordisk)；抗B細胞抗體(Impheron)；B細胞靶向MAb(Immunogen/Aventis)；1D09C3(Morphosys/GPC)；LymphoRad 131(HGS)；Lym-1抗體，諸如Lym-1Y-90(USC)或抗Lym-1奧克靈(USC/Peregrine)；LIF 226(Enhanced Lifesci.)；BAFF抗體(例如WO 03/33658)；BAFF受體抗體(參見(例如)WO 02/24909)；BR3抗體；Blys抗體，諸如貝利單抗(belimumab)；LYMPHOSTAT-BTM；ISF 154(UCSD/Roche/Tragen)；格米利昔(gomilixima，Idec 152；Biogen Idec)；IL-6受體抗體，諸如安塔麗珠單抗(atlizumab，ACTEMRATM；Chugai/Roche)；IL-15抗體，諸如HuMax-II-15(Genmab/Amgen)；趨化因子受體抗體，諸如CCR2抗體(例如MLN1202；Millieneum)；抗補體抗體，諸如C5抗體(例如艾庫珠單抗(eculizumab)、5G1.1；Alexion)；人類免疫球蛋白之口服調配物(例如IgPO；Protein Therapeutics)；IL-12抗體，諸如ABT-874(CAT/Abbott)；特納利昔單抗(Teneliximab，BMS-224818；BMS)；CD40抗體，包括S2C6及其人源化變異體(WO 00/75348)及TNX 100(Chiron/Tanox)；TNF-α抗體，包括cA2或英利昔單抗(infliximab，REMICADE®)，CDP571，MAK-195，阿達木單抗(adalimumab，HUMIRATM)，聚乙二醇化TNF-α抗體片段，諸如CDP-870(Celltech)，D2E7(Knoll)，抗TNF-α多株抗體(例如PassTNF；Verigen)；CD22抗體，諸如LL2或依帕珠單抗(epratuzumab，LYMPHOCIDE®；Immunomedics)(包括依帕珠單抗Y-90及依帕珠單抗I-131)、Abiogen之CD22抗體(Abiogen，Italy)、CMC 544(Wyeth/Celltech)、肯伯特(combotox，UT Soutwestern)、 BL22(NIH)及LympoScan Tc99(Immunomedics)。較佳地，本文中所純化之抗體為與人類CD20結合之裸露完整抗體或與人類VEGF結合之裸露完整抗體。
人類"CD20"抗原或"CD20"為來自周邊血液或淋巴器官之90%以上B細胞表面上發現的約35-kDa，非糖基化磷蛋白。CD20存在於正常B細胞以及惡性B細胞上，但不表現於幹細胞上。文獻中CD20之其他名稱包括"B-淋巴細胞限制性抗原"及"Bp35"。CD20抗原(例如)在Clark等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：1766(1985)中描述。
本文中之"CD20抗體拮抗劑"為一種抗體，當其結合至B細胞上之CD20之後，其破壞或消耗個體之B細胞及/或干擾一或多個B細胞功能，例如藉由減小或預防由B細胞引發之體液反應。抗體拮抗劑較佳可消耗用其治療之個體中之B細胞(亦即減少循環B細胞含量)。該消耗可藉由各種機制達成，該等機制係諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，對B細胞增殖之抑制及/或B細胞死亡之誘導(例如經由細胞凋亡)。
如本文中所使用之"B細胞消耗"係指通常在藥物或抗體治療之後，與治療前B細胞含量相比動物或人類中B細胞含量減少。B細胞消耗可為部分或完全的。B細胞含量可使用熟知技術來量測，該等技術係諸如Reff等人，Blood 83：435-445(1994)或美國專利第5,736,137號(Anderson等人)中所述之技術。舉例而言，哺乳動物(例如一般靈長類)可以各種劑量之抗體或免疫黏著素治療，且周邊B細胞濃度可(例如)藉由計數B細胞之FACS方法測定。
CD20抗體之實例包括："C2B8"，其現稱為"利妥昔單抗"("RITUXAN®")(美國專利第5,736,137號)；釔-[90]-標記之2B8鼠抗體，稱為"Y2B8"或"替坦異貝莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)"(ZEVALIN®)，可購自IDEC Pharmaceuticals，Inc.(美國專利 第5,736,137號；2B8由ATCC以寄存編號HB11388於1993年6月22日存放)；鼠IgG2a "B1"，亦稱為"托西莫單抗(Tositumomab)"，視情況以131I標記以產生"131I-B1"或"碘I131托西莫單抗"抗體(BEXXARTM)，可購自Corixa(亦參見美國專利第5,595,721號)；鼠單株抗體"1F5"(Press等人。Blood 69(2)：584-591(1987))及其變異體，包括"經構架***"或人源化之1F5(WO 2003/002607，Leung，S.；ATCC存放HB-96450)；鼠2H7及嵌合2H7抗體(美國專利第5,677,180號)；人源化2H7(WO 2004/056312，Lowman等人，及下述人源化2H7)；2F2(HuMax-CD20)，靶向B細胞細胞膜中之CD20分子的全人類高親和力抗體(Genmab，Denmark；參見(例如)Glennie及van de Winkel，Drug Discovery Today 8：503-510(2003)及Cragg等人，Blood 101：1045-1052(2003)；WO 2004/035607；US 2004/0167319)；WO 2004/035607及US 2004/0167319(Teeling等人)中所述之人類單株抗體；US 2004/0093621(Shitara等人)中所述之具有與Fc區結合之複合N-糖苷-鍵聯糖鏈之抗體；與CD20結合之單株抗體及抗原結合片段(WO 2005/000901，Tedder等人)，諸如HB20-3、HB20-4、HB20-25及MB20-11；CD20結合分子，諸如AME系列抗體，例如WO 2004/103404及US 2005/0025764(Watkins等人，Eli Lilly/Applied Molecular Evolution，AME)中所述之AME 33抗體；CD20結合分子，諸如US 2005/0025764(Watkins等人)中所述之彼等分子；A20抗體或其變異體，諸如嵌合或人源化A20抗體(分別為cA20、hA20)或IMMU-106(US 2003/0219433，Immunomedics)；CD20結合抗體，包括抗原決定基缺失之Leu-16、1H4或2B8，視情況與IL-2結合，如US 2005/0069545 A1及WO 2005/16969(Carr等人)中；結合CD22及CD20之雙特異性抗體，例如hLL2xhA20(WO 2005/14618，Chang等人)；購自International Leukocyte Typing Workshop之單株抗體L27、G28-2、93- 1B3、B-C1或NU-B2(Valentine等人，於Leukocyte Typing III(McMichael編，第440頁，Oxford University Press(1987))中)；1H4(Haisma等人Blood 92：184(1998))；抗CD20 auristatinE結合物(Seattle Genetics)；抗CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope)；抗CD20 MAb療法(EpiCyte)；抗CD20抗體TRU 015(Trubion)。本文中較佳之CD20抗體為嵌合、人源化或人類CD20抗體，更佳為利妥昔單抗、人源化2H7、2F2(Hu-Max-CD20)人類CD20抗體(Genmab)及人源化A20或IMMUN-106抗體(Immunomedics)。
出於本文之目的，本文中之術語"利妥昔單抗"、"RITUXAN®"及"C2B8"係指如美國專利第5,736,137號，Anderson等人中所述與人類CD20抗原結合之重組嵌合抗體。該抗體較佳包括包含CDR H1(SEQ ID No.5)、CDR H2(SEQ ID No.6)、CDR H3(SEQ ID No.7)之重鏈及輕鏈，其中該輕鏈較佳包含CDR L1(SEQ ID No.8)、CDR L2(SEQ ID No.9)及CDR L3(SEQ ID No.10)；較佳地，該重鏈包括包含SEQ ID No.3之可變重鏈(VH)區及包含SEQ ID No.4之可變輕鏈(VL)區；且最佳包括包含SEQ ID No.1之重鏈(有或無C末端離胺酸殘基)及輕鏈，其中該輕鏈較佳包含SEQ ID No.2。該等術語清楚地包括變異體形式，諸如Moorhouse等人。J.Pharm Biomed.Anal.16：593-603(1997)中所述。
如本文中所使用之術語"人類VEGF"係指如Leung等人，Science 246：1306(1989)及Houck等人，Mol.Endocrin.5：1806(1991)所述具有165個胺基酸之人類血管內皮細胞生長因子及相關具有121個、189個及206個胺基酸之血管內皮細胞生長因子，以及天然產生之彼等生長因子之對偶基因及加工形式。
本發明提供抗VEGF拮抗抗體，其能夠抑制VEGF之一或多種生物學活性，例如其有絲***或血管生成活性。VEGF之拮抗劑藉由干 擾VEGF與細胞受體結合，藉由使由VEGF活化之細胞無能力或殺滅該等細胞，或藉由在VEGF與細胞受體結合之後干擾血管內皮細胞活化而發揮作用。出於本發明之目的，應認為由VEGF拮抗劑干預之所有該等活性為等效的。
出於本文之目的，本文中之術語"貝伐單抗"、"AVASTIN®"、"F(ab)-12"及"rhuMAb VEGF"係指如美國專利第7,169,901號，Presta等人中所述結合人類血管內皮生長因子(VEGF)抗原(rhuMAb VEGF)的重組人源化單株抗體。該抗體較佳包括包含CDR H1(SEQ ID No.15)、CDR H2(SEQ ID No.16)、CDR H3(SEQ ID No.17)之重鏈及輕鏈，其中該輕鏈較佳包含CDR L1(SEQ ID No.18)、CDR L2(SEQ ID No.19)及CDR L3(SEQ ID No.20)；最佳地，該重鏈包括包含SEQ ID No.13之可變重鏈(VH)區及包含SEQ ID No.14之可變輕鏈(VL)區；且較佳包括包含SEQ ID No.11之重鏈(有或無C末端離胺酸殘基)及輕鏈，其中該輕鏈較佳包含SEQ ID No.12。該等術語清楚地包括在產生重組抗體產物期間形成之變異體形式。
如本文中所用之術語"單株抗體"係指獲自一群大體上均質之抗體的抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可少量存在之可能天然產生突變外為相同的。單株抗體對單一抗原位點具有高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相比，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語"單株"指示獲自大體上均質之抗體群的抗體特徵且不應理解為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。舉例而言，根據本發明所使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述之融合瘤方法製備，或可藉由重組DNA方法(參見，例如美國專利第4,816,567號)製備。在另一實施例中，可自使用描述於McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)中之技術產生之抗體噬菌體庫分離"單株抗體"。Clackson等 人，Nature，352：624-628(1991)及Marks等人。J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分別描述使用噬菌體庫分離鼠及人類抗體。隨後之公開案描述藉由鏈改組(Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992))產生高親和力(nM範圍)人類抗體，以及作為構建極大噬菌體庫之策略的組合感染及活體內重組(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，該等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合瘤技術之可行替代方法。或者，現在可能產生免疫後能夠在不產生內源免疫球蛋白之情況下產生人類抗體之全部組成部分的轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈結合區(JH)基因的同型缺失導致對於內源抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等生殖系突變小鼠體內將會於抗原挑釁之後引起人類抗體之產生。參見，例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；及Duchosal等人，Nature 355：258(1992)。
本文之單株抗體特別包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體中的相應序列相同或同源，而該(該等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體中的相應序列相同或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現出所需生物活性即可(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
本文所用之術語"高變區"係指抗體之負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區包含來自"互補決定區"或"CDR"之胺基酸殘基(亦即輕鏈可變域中之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及重鏈可變域中之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Polypeptides of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))及/或彼等來自"高變環"之殘基(亦即輕鏈可變域中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk.J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。"構架"或"FR"殘基為除本文中所定義之高變區殘基以外的彼等可變域殘基。
非人類(例如鼠)抗體之"人源化"形式為含有最少之來源於非人類免疫球蛋白之序列的嵌合抗體。對於大多數部分而言，人源化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體高變區之殘基經具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)(供體抗體)高變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基係經相應非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含不出現於受體抗體或供體抗體中之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體之效能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域中之大體上全部，其中全部或大體上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且全部或大體上全部FR區為人類免疫球蛋白序列之FR。人源化抗體視情況亦應包含免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之恆定區之至少一部分。
欲用於製備人源化抗體之人類可變域之備選者(輕鏈與重鏈)對降低抗原性極其重要。根據所謂"最佳擬合"法，針對整個已知人類可變域序列庫篩選齧齒動物抗體之可變域序列。隨後，接受最接近於齧齒動物序列之人類序列作為人源化抗體之人類框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。
另一方法使用來源於具有特定輕鏈或重鏈亞群之所有人類抗體之一致序列的特定構架。相同構架可用於若干不同人源化抗體(Carter 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.，151：2623(1993))。
更重要的是，使抗體人源化且保留對抗原之高親和力及其他有利生物特性。為達成該目標，根據一較佳方法，藉由使用親本及人源化序列之三維模型分析親本序列及各種設想之人源化產物的方法來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可購得且為熟習此項技術者所熟知。可獲得說明且展示所選候選者免疫球蛋白序列之可能的三維構形結構的電腦程式。對該等展示之檢視使得可分析殘基在備選免疫球蛋白序列功能中之可能作用(亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基)。以此方式，FR殘基可選自受體及引入序列且與受體及引入序列組合以達成所需抗體特徵，諸如對標靶抗原之親和力增加。一般而言，CDR殘基係直接且實質上最涉及影響抗原結合。
"抗體片段"包含全長抗體之一部分，通常抗原結合區或其可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。已開發各種技術用於產生抗體片段。傳統上，該等片段經由完整抗體之蛋白水解消化衍生而來(參看，例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)及Brennan等人，Science 229：81(1985))。然而，該等片段現在可由重組宿主細胞直接產生。舉例而言，抗體片段可自上述抗體噬菌體庫分離。或者，可直接自大腸桿菌(E.coli)回收Fab'-SH片段且使其化學偶合以形成F(ab')2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。在另一實施例中，使用白胺酸拉鏈GCN4形成F(ab')2以促進F(ab')2分子之組裝。根據另一方法，F(ab')2片段可直接自重組宿主細胞培養物分離。產生抗體片段之其他技術對熟習此項技術者而言應顯而易見。
在其他實施例中，優選抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含抗體之VH及VL域，其中該等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，Fv多肽另外在VH域與VL域之間包含能夠使sFv形成抗原結合所需結構之多肽連接子。對於sFv之評述，參見Pluckthun，於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies中，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
術語"雙功能抗體"係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變域(VL)連接之重鏈可變域(VH)。藉由使用太短以致不能使同一鏈上兩個域之間配對的連接子，迫使該等域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於(例如)EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中。
在整個本申請案中所用之表述"線性抗體"係指Zapata等人，Polypeptide Eng.8(10)：1057-1062(1995)中所述之抗體。簡言之，該等抗體包含一對串聯Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一對抗原結合區。直鏈抗體可為雙特異性或單特異性抗體。
"多特異性抗體"具有對於至少兩個不同抗原決定基之結合特異性，其中該等抗原決定基通常來自不同抗原。雖然該等分子通常僅結合兩個抗原(亦即雙特異性抗體，BsAb)，但當在本文中使用時該表述亦涵蓋具有其他特異性之抗體(諸如三特異性抗體)。BsAb之實例包括具有針對腫瘤細胞抗原之一個臂及針對細胞毒性觸發分子之另一臂的BsAb，諸如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗惡性B細胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結腸癌)、抗CD3/抗促黑激素類似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經細胞黏著分子(NCAM)/抗CD3、抗葉 酸結合蛋白(FBP)/抗CD3、抗pan癌相關抗原(AMOC-31)/抗CD3；具有特異性結合腫瘤抗原之一個臂及與毒素結合之一個臂的BsAb，諸如抗沙泊寧(saporin)/抗Id-1、抗CD22/抗沙泊寧、抗CD7/抗沙泊寧、抗CD38/抗沙泊寧、抗CEA/抗蓖麻毒素A鏈、抗干擾素-α(IFN-α)/抗融合瘤個體基因型、抗CEA/抗長春花屬生物鹼；轉化酶活化之前藥的BsAb，諸如抗CD30/抗鹼性磷酸酶(其將絲裂黴素磷酸酯前藥催化轉化為絲裂黴素醇)；可用作纖維蛋白溶解劑之BsAb，諸如抗纖維蛋白/抗組織血漿素原活化因子(tPA)、抗纖維蛋白/抗尿激酶型血漿素原活化因子(uPA)；使免疫複合物靶向細胞表面受體之BsAb，諸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcγRI或FcγRIII)；適用於治療感染性疾病之BsAb，諸如抗CD3/抗疱疹單純型病毒(HSV)、抗T細胞受體：CD3複合物/抗流行性感冒、抗FcγR/抗HIV；用於活體外或活體內腫瘤偵測之BsAb，諸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作為疫苗佐劑之BsAb；及作為診斷工具之BsAb，諸如抗兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過氧化物酶(HRP)/抗激素、抗生長抑素/抗P物質、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特異性抗體之實例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37及抗CD3/抗CD8/抗CD37。可製備全長抗體或抗體片段形式之雙特異性抗體(例如，F(ab')2雙特異性抗體)。
涵蓋兩價以上之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人。J.Immunol.147：60(1991)。
出於本文之目的之"裸抗體"為未與細胞毒性部分結合或放射性標記結合之抗體。
本文之"完整抗體"為包含兩個抗原結合區及一個Fc區之抗體。較佳地，完整抗體具有功能性Fc區。
"治療"係指治療性治療與預防措施兩者。需要治療者包括已患有 病症者以及有待預防該病症者。
"病症"為將受益於以如本文所述純化之抗體治療之任何病狀。其包括慢性與急性病症及疾病，包括使哺乳動物易患所述病症之彼等病理學病狀。
本文所使用之詞語"標記物"係指與抗體直接或間接結合之可偵測化合物或組合物。該標記物本身為可偵測的(例如放射性同位素標記物或螢光標記物)或在酶標記物之情況下可催化可偵測之受質化合物或組合物的化學變化。
如本文中所使用之術語"細胞毒性劑"係指一種抑制或防止細胞功能且/或使細胞毀壞的物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及Lu之放射性同位素)，化學治療劑及毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物源之酶活性毒素或其片段。
進行本發明之模式
本發明提供自包含抗體及一或多種污染物之組合物(例如水溶液)純化該抗體之方法。該組合物通常為來源於重組產生抗體之組合物，但可為來源於藉由肽合成(或其他合成方法)產生抗體之組合物，或抗體可自該抗體之天然來源純化。較佳地，該抗體結合人類CD20抗原，諸如利妥昔單抗，或結合人類VEGF抗原，諸如貝伐單抗。
抗體之重組產生
為了重組產生抗體，將編碼抗體之核酸分離且***可複製載體中以便進一步選殖(擴增DNA)或表現。易於分離編碼抗體之DNA且使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)進行測序。可利用諸多載體。載體組份通常包括(但不限於)一或多種以下各物：信號序列、複製起點、一或多種標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列(例如如美國專利 5,534,615中所述，該專利係以引用的方式特別地併入本文中)。
適合用於選殖或表現本文載體中DNA之宿主細胞為原核生物、酵母或較高級真核生物細胞。用於該目的之適合原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌(Escherichia)，例如大腸桿菌(E.coli)；腸桿菌(Entero-bacter)；歐文氏菌(Erwinia)；克雷伯氏菌(Klebsiella)；變形桿菌(Proteus)；沙門氏菌(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌(Serratia)，例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)；及志賀氏菌(Shigella)；以及芽胞桿菌(Bacilli)，諸如枯草芽胞桿菌(B.subtilis)及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如，公開於1989年4月12日之DD 266,710中所揭示之地衣芽孢桿菌41P)；假單胞菌(Pseudomonas)，諸如綠膿桿菌(P.aeruginosa)；及鏈黴菌(Streptomyces)。儘管諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)之其他菌株適合，但一種較佳大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294(ATCC 31,446)。該等實例僅為說明而非用於限制。
除了原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為編碼抗體之載體的適合選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通麵包酵母為最常用之較低級真核宿主微生物。然而，許多其它屬、種及菌株通常可得且適用於本文，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo-myces pombe)；克魯維酵母(Kluyveromyces)宿主，諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦提克魯維酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母菌(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母菌(K.thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母 (K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；甲醇酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌(Candida)；里氏木黴(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)；許旺酵母(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，諸如鏈孢黴菌(Neurospora)、青黴菌(Penicillium)、彎頸黴菌(Tolypocladium)及麴菌(Aspergillus)宿主，諸如小巢狀麴菌(A.nidulans)及黑麴菌(A.niger)。
表現糖基化抗體之適合宿主細胞係來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別多種桿狀病毒菌株及變異體及相應容許之昆蟲宿主細胞，諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)之宿主。多種用於轉染之病毒株公開可得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5株，且該等病毒可用作本發明之病毒，尤其用於草地夜蛾細胞之轉染。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及煙草之植物細胞培養物亦可用作宿主。
然而，脊椎動物細胞最值得關注，且繁殖培養物(組織培養物)中之脊椎動物細胞成為一常規程序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例包括(但不限於)由SV40轉型之猴腎CV1細胞(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞(經次選殖以在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；嬰兒倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類宮頸癌細胞 (HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞(Hep G2)。CHO細胞較佳常用於表現抗體，且可有利地用於產生根據本發明純化之抗體。
以上述用於產生抗體之表現或選殖載體轉型宿主細胞，且將其培養於經改良以適於誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。
可將用以產生本發明之抗體之宿主細胞培養於多種培養基中。市售培養基，諸如Ham氏F10(Sigma)、最低必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco氏改良之Eagle氏培養基(DMEM)(Sigma)，適用於培養宿主細胞。此外，以下文獻中所述培養基中之任一者可用作宿主細胞之培養基：Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利參考案30,985。此等培養基中之任一者均可視需要補充以激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如慶大黴素；GENTAMYCINTM)、微量元素(定義為無機化合物，通常以在微莫耳範圍內之最終濃度存在)及葡萄糖或等效能源。亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度的任何其他必要補充物。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為彼等先前經選擇用於表現之宿主細胞之條件，且將對一般技術者顯而易見。
當使用重組技術時，抗體可於細胞內產生、於周質空間產生，或經直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步驟，將微粒碎片，宿主細胞或溶解細胞(例如由均質化作用產生)(例如)藉由離心或超濾移除。若抗體分泌至培養基中，可使用市售蛋白濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)濃縮來自此等表現系統之上清液。
本發明之陽離子交換層析法
在本發明之較佳實施例中，欲進行本文之純化方法的組合物為重組產生之抗體，較佳完整抗體，由中國倉鼠卵巢(CHO)重組宿主細胞培養物表現。視情況，該組合物已在陽離子交換層析之前進行至少一個純化步驟。該組合物含有所關注之抗體及一或多種污染物，諸如中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)；浸出蛋白A；核酸；所需抗體之變異體、片段、凝集體或衍生物；另一多肽；內毒素；病毒污染物；細胞培養基組份(例如慶大黴素；GENTAMYCIN®)等。
可在陽離子交換層析法之前、期間或之後的其他純化程序之實例包括疏水相互作用層析上(例如在PHENYL-SEPHAROSETM上)分餾、乙醇沈澱、等電聚焦、逆相HPLC、二氧化矽層析、HEPARIN SEPHAROSETM上層析、陰離子交換層析、另一陽離子交換層析、混合模式離子交換、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、親水性電荷誘導層析及親和層析(例如使用蛋白A、蛋白G、抗體或特定受質、配位體或抗原作為捕獲試劑)。
根據本發明，陽離子交換純化方案通常包括以下依次執行之步驟：(1)平衡陽離子交換物質；(2)將待純化之組合物裝載於該陽離子交換物質上；(3)第一洗滌步驟；(4)第二洗滌步驟；及(5)溶離所關注之抗體。
藉由在陽離子交換純化方案中包括至少兩個洗滌步驟，其中至 少第一者在高pH值(約pH 6.8或pH 6.8以上)下進行，則純化功效可顯著改良。詳言之，使用pH值在約6.8至約9.0(例如約7.0至8.0)之範圍內，諸如約pH 7.8或約pH 7.0的洗滌緩衝液執行第一洗滌步驟，與使用約5.0至約5.5之習知較低pH值範圍相比較有效地移除上述污染物。因此，自陽離子交換物質溶離之包含該抗體之組合物的宿主細胞蛋白含量通常小於約200ppm，其低於使用一在約5至5.5之pH值下的洗滌步驟所達成之約500ppm水準。
在本發明之較佳實施例中，陽離子交換物質包含塗佈有以磺丙基官能化之多羥基聚合物的交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通粒子(固相)，例如購自Applied Biosystems之POROS 50 HS®管柱。
通常，在將包含所關注之抗體及一或多種污染物之組合物裝載於陽離子交換物質上之前，將平衡緩衝液通過或通入該陽離子交換物質。在本發明之較佳實施例中，平衡緩衝液具有約5.0至約6.0之pH值，例如約pH 5.5。一例示性平衡緩衝液包含19mM MES、60mM NaCl，pH 5.50。另一例示性平衡緩衝液包含23mM MES、60mM NaCl，pH 5.50。
平衡之後，將包含所關注之抗體及一或多種污染物的水溶液裝載於陽離子交換物質上。視情況，裝載物之pH值在約4.0至約6.0之範圍內，例如約pH 5.0或約pH 5.5。在一較佳實施例中，裝載來自先前純化步驟之經調節產物混合物。在一實施例中，將來自先前蛋白A層析純化之蛋白A混合物(pH 5.0)裝載於陽離子交換物質上。在另一實施例中，將經調節Q-SEPHAROSE®混合物(pH 5.5)裝載於陽離子交換物質上。例示性裝載密度係在約10至約100g/L樹脂，較佳約10至約60g/L樹脂，最佳約15至約45g/L樹脂之範圍內。經由該裝載步驟使得所關注之抗體與該陽離子交換物質結合。
裝載之後，將陽離子交換物質在第一洗滌步驟中以第一洗滌緩 衝液洗滌。在洗滌過程期間，使洗滌緩衝液通過陽離子交換物質。洗滌緩衝液之組成通常經選擇以自樹脂溶離儘可能多之污染物而不溶離大量所關注之抗體。第一洗滌緩衝液之pH值通常高於平衡緩衝液及/或所裝載組合物之pH值，例如高約2至約3個pH單位。較佳地，第一洗滌緩衝液之pH值係在約6.8至約9.0，較佳約6.8至約8.0之範圍內，例如約pH 7.8或約pH 7.0。在該pH值範圍內緩衝之緩衝液之實例包括(但不限於)HEPES、MES、乙酸鈉、TRIS/HCl、三乙醇胺鹽酸鹽/NaOH、Bicine/HCl、Tricine/HCl等。較佳第一洗滌緩衝液包含以下各物或由以下各物組成：(1)25mM HEPES(pH 7.8)或(2)25mM MOPS(pH 7.0)。
在該情況下，本發明提供包含於25mM HEPES(pH 7.8)中之重組嵌合CD20抗體(諸如利妥昔單抗)的組合物。本發明亦提供於25mM MOPS(pH 7.0)中之重組人源化VEGF抗體(諸如貝伐單抗)。該等組合物尤其適用作純化該等產物之中間組合物。
本發明通常需要使用第二洗滌緩衝液之至少另一或第二洗滌步驟。第二洗滌緩衝液之pH值較佳低於第一洗滌緩衝液之pH值，例如低約2至約3個pH單位。因此，例如，第二洗滌緩衝液之pH值可在約pH 5.0至約pH 6.0之範圍內。較佳地，第二洗滌緩衝液之pH值為約5.5。在該pH值範圍內緩衝之緩衝液之實例包括(但不限於)MES、乙酸/乙酸鈉或NaOH、NaH2PO3/Na2HPO4、Bis.Tris/HCl。MES(pH 5.5)為第二洗滌之較佳緩衝液。在一實施例中，第二洗滌緩衝液包含以下各物或由以下各物組成：19mM MES、10mM NaCl(pH 5.50)。在另一實施例中，第二洗滌緩衝液包含以下各物或由以下各物組成：23mM MES、10mM NaCl(pH 5.50)。
雖然可使用其他洗滌步驟，但較佳在溶離所需抗體之前僅執行第一及第二洗滌步驟。在第一及/或第二洗滌步驟期間自陽離子交換 物質移除諸如上述彼等污染物之污染物。較佳地，第一洗滌步驟移除大多數污染物。
上述洗滌步驟之後，自陽離子交換物質溶離所需抗體。抗體溶離可藉由增加電導率或離子強度達成。適宜地，溶離緩衝液之電導率大於約10mS/cm。增加之電導率可藉由在溶離緩衝液中包括相對較高鹽濃度達成。用於該目的之例示性鹽包括(但不限於)乙酸鈉、氯化鈉(NaCl)及氯化鉀(KCl)。在一實施例中，溶離緩衝液包含約100至約300mM NaCl。溶離緩衝液通常具有與第二洗滌緩衝液大致相同之pH值。較佳溶離緩衝液包含：19mM MES、160mM NaCl(pH 5.5)。另一較佳溶離緩衝液包含：23mM MES、175mM NaCl(pH 5.5)。溶離較佳包括分步溶離(相對於梯度溶離)。
雖然溶離步驟之後視情況進行再生步驟，但該再生步驟並非本發明之較佳實施例所必需。
雖然涵蓋其他步驟，但較佳本文之陽離子交換純化法僅由以下步驟組成：平衡(例如使用pH值為約5.5之平衡緩衝液)、裝載包含抗體及污染物之組合物(例如其中所裝載組合物之pH值為約5.0或約5.5)、用於溶離污染物之第一洗滌步驟(例如，使用pH值為約7.8之第一洗滌緩衝液或pH值為約7.0之第一洗滌緩衝液)、第二洗滌步驟(例如，使用pH值為約5.5之第二洗滌緩衝液)及溶離(例如，使用pH值為約5.5且電導率相對於先前步驟中之每一者增加之溶離緩衝液以溶離抗體)。
根據本文之陽離子交換層析法獲得之抗體製劑(若必要)可進行其他純化步驟。例示性其他純化步驟如上所述。
視情況，抗體(視需要)與一或多個異源分子結合。該異源分子可為(例如)增加抗體之血清半衰期之分子(例如聚乙二醇，PEG)，或其可為標記物(例如酶、螢光標記物及/或放射性核種)或細胞毒性分子 (例如毒素、化療藥物或放射性同位素等)。
藉由將具有所需純度之抗體與可選醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.編(1980))混合來製備呈凍乾調配物或水溶液形式的包含視情況與異源分子結合之抗體的治療用調配物。"醫藥學上可接受之"載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對受體無毒且包括：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽之平衡離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白複合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
活性成份亦可覆埋於(例如)藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微囊(例如分別為羥基甲基纖維素微囊或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或***液中。該等技術係揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.編(1980)中。
欲用於活體內投藥之調配物必須為無菌的。其易於藉由經由無菌過濾膜進行過濾來實現。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之合適實例包括含有 抗體變異體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成型物品(例如薄膜或微囊)之形式。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM(包含乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林(leuprolide)之可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
隨後將如本文中所揭示純化之抗體或包含該抗體及醫藥學上可接受之載劑的組合物用於該等抗體及組合物已知之各種診斷、治療或其他用途。舉例而言，該抗體可用於藉由向哺乳動物投與治療有效量之抗體來治療該哺乳動物之病症。在CD20抗體(諸如利妥昔單抗)的情況下，其可用於消耗B細胞，治療淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)，NHL)或白血病(例如慢性淋巴細胞白血病，CLL)以及自體免疫疾病，諸如類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化症(MS)、狼瘡等。對於與VEGF結合之抗體(諸如貝伐單抗)而言，其可用於抑制血管生成，治療癌症及治療黃斑退化等。
以下實例係以說明而非限制之方式提供。在本說明書中所有引用之揭示內容係以引入的方式清楚地併入本文中。
實例1：CD20抗體之純化
本實例描述一種純化CD20抗體利妥昔單抗之改良陽離子交換層析方法。利妥昔單抗係用於治療NHL、CLL、RA、MS等。利妥昔單抗分子之結構係揭示於5,736,137，Anderson等人(以引用的方式特別地併入本文中)以及本文之圖1A-1B中。利妥昔單抗可購自Genentech，Inc。
陽離子交換層析法係用於進一步降低CHOP、DNA、浸出蛋白A、慶大黴素(GENTAMYCIN®)、利妥昔單抗凝集體及潛在病毒之含 量。利妥昔單抗與管柱在裝載條件下結合。隨後將該管柱洗滌、溶離、再生/消毒且儲存直至下次使用。可使用多個循環以加工整批親和力混合物。陽離子交換混合物可保持在室溫至30℃下高達3日或在5℃下高達7日。
將陽離子交換樹脂(POROS 50 HS®，Applied Biosystems)裝填於管柱中至17-33cm之床高度。在裝載親和力混合物之前，以平衡緩衝液將陽離子交換管柱之儲存溶液清除。平衡之後，將親和力混合物裝載於管柱上。在該等條件下產物與管柱結合。隨後將管柱以洗滌液1緩衝液洗滌，繼而以洗滌液2緩衝液洗滌。使用高離子強度溶離緩衝液將利妥昔單抗自管柱溶離。
下表提供本發明之方法的條件與原始(對照)方法相比之對照。
下表提供利妥昔單抗方法中裝載及緩衝液之所需pH值、電導率及莫耳濃度範圍。
利妥昔單抗純化之例示性方法由於使大量宿主細胞蛋白在洗滌相中移除，在產物混合物(溶離混合物)中產生較低含量之宿主細胞蛋白及有利於後續下游步驟中雜質之移除而提高宿主細胞蛋白移除之有效性。圖3說明本發明方法在宿主細胞蛋白移除方面之優勢。
實例2：VEGF抗體之純化
本實例描述用於純化重組人源化血管內皮生長因子抗體(rhuMAb VEGF)貝伐單抗之陽離子交換層析方法。貝伐單抗分子之結構係揭示於美國專利7,169,901，Presta等人中，該專利係以引用的方式清楚地併入本文中。亦參見本文之圖2A-2B。貝伐單抗可購自Genentech，Inc。
本實例總結改良貝伐單抗純化方法之陽離子交換步驟上所執行的開發研究。在該等研究中評估了三種陽離子交換樹脂：CM SEPHAROSE FAST FLOW®、SP SEPHAROSE FAST FLOW®及POROS 50HS®。就以下態樣評估使用該等三種樹脂之陽離子交換純化方法：方法效能(雜質移除、反轉錄病毒移除及步驟產率)、產物品質、方法有效性及所有當前製備位點之方法適應性(process fit)。基於該等研究中所產生之數據，POROS 50HS®展示優良方法效能及有效性且被選為經改良純化方法之陽離子交換樹脂。
陽離子交換層析為純化方法中之最終層析步驟。其係用於移除細胞培養基組份(慶大黴素)、來源於宿主細胞之雜質(CHOP及DNA)及凝集形式之貝伐單抗。其亦充當病毒移除步驟。
該管柱係以結合及溶離模式運行且在環境溫度下執行。該管柱使用陽離子交換樹脂(POROS 50HS®)。該樹脂係由與帶負電官能基偶合之多孔、聚苯乙烯-二乙烯基苯床載體組成。藉由以平衡緩衝液洗滌自管柱移除儲存液。將病毒過濾混合物以0.3體積注射用水(WFI)稀釋以滿足5.5mS/cm之電導率限值。隨後將病毒過濾混合物裝載於經平衡管柱上。產物與樹脂結合。裝載之後，將管柱以高pH值緩衝液洗滌以經管柱沖洗裝載物及移除CHOP雜質。隨後將管柱以低鹽緩衝液洗滌以降低pH值及製備溶離管柱。使用高鹽緩衝液以最大7管柱體積分步溶離將產物溶離。溶離之後，將管柱及導板(skid)以消毒溶液(0.5N NaOH)消毒隨後儲存在儲存溶液(0.1N NaOH)中直至其下一用途。
下表提供本發明之貝伐單抗方法之描述。
下表提供貝伐單抗方法中之裝載及緩衝液之所需pH值、電導率及莫耳濃度範圍。
發現本發明方法優於使用pH值5.5之第一洗滌緩衝液之原始貝伐單抗方法。本文之新穎方法能夠達成具有降低之CHOP含量的混合物，其達成較高步驟產率且為在製備中進行之整體較有效方法。
<110> 美商建南德克公司
<120> 藉陽離子交換層析法純化抗體
<130> P2280RI WO
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Claims (16)

  1. 一種自包含抗體及至少一種污染物之組合物純化抗CD20抗體之方法，該方法包含以下連續步驟：(a)將該組合物裝載於陽離子交換物質上，其中該組合物具有4.5至5.5之pH且具有2.5至5.5mS/cm之電導率；(b)以第一洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第一洗滌緩衝液之pH大於(a)中之該組合物，其中該第一洗滌緩衝液之pH為7.5至8.1，且其中該第一洗滌緩衝液包含15至35mM HEPES且具有0.5至1.5mS/cm之電導率；(c)以第二洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第二洗滌緩衝液之pH為5.0至6.0，且其中該第二洗滌緩衝液包含14至23mM MES及5至15mM NaCl且具有0.6至2.2mS/cm之電導率；及(d)以溶離緩衝液自該陽離子交換物質溶離該抗體，該溶離緩衝液之pH為5.3至5.7，且其中該溶離緩衝液包含14至23mM MES及140至180mM NaCl且具有13.4至17.2mS/cm之電導率。
  2. 如請求項1之方法，其中該陽離子交換物質包含塗佈有磺丙基官能化之多羥基聚合物之交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通(flow-through)粒子。
  3. 如請求項1之方法，其中該污染物係選自由以下組成之群：中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)、浸出(leached)蛋白A、DNA、凝集抗體、細胞培養基組份、慶大黴素(garamycin)及病毒污染物。
  4. 如請求項1之方法，其另外包含在步驟(a)至(d)之前、期間或之後使包含該抗體之組合物進行一或多個其他純化步驟以獲得該抗體之均質製劑。
  5. 如請求項4之方法，其另外包含使該純化抗體與異源分子結合。
  6. 如請求項4或5之方法，其另外包含藉由將該抗體或結合抗體之均質製劑與醫藥學上可接受之載劑組合來製備醫藥組合物。
  7. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗體為利妥昔單抗(rituximab)。
  8. 一種自組合物純化結合人類血管內皮生長因子(VEGF)之抗體的方法，該組合物包含該抗體及一或多種選自由以下組成之群的污染物：細胞培養基組份、慶大黴素、中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)、DNA、病毒污染物及凝集之VEGF抗體，該方法包含以下連續步驟：(a)將該組合物裝載於陽離子交換物質上，其中該組合物具有5.2至5.8之pH且具有小於或等於6.5mS/cm之電導率；(b)以第一洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第一洗滌緩衝液具有6.6至7.4之pH，且其中該第一洗滌緩衝液包含15至35mM MOPS且具有0.2至1.2mS/cm之電導率；(c)以第二洗滌緩衝液洗滌該陽離子交換物質，其中該第二洗滌緩衝液具有5.1至5.9之pH，且其中該第二洗滌緩衝液包含13至33mM MES及5至20mM NaCl且具有1.2至1.8mS/cm之電導率；及(d)使用溶離緩衝液自該陽離子交換物質溶離該抗體，其中該溶離緩衝液具有5.4至5.6之pH，且其中該溶離緩衝液包含13至33mM MES及160至190mM NaCl且具有17.5mS/cm至18.5mS/cm之電導率。
  9. 如請求項8之方法，其中該陽離子交換物質包含塗佈有磺丙基官能化之多羥基聚合物之交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通粒子。
  10. 如請求項8之方法，其中該污染物係選自由以下組成之群：中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)、浸出(leached)蛋白A、DNA、凝集抗體、 細胞培養基組份、慶大黴素(garamycin)及病毒污染物。
  11. 如請求項8之方法，其另外包含在步驟(a)至(d)之前、期間或之後使包含該抗體之組合物進行一或多個其他純化步驟以獲得該抗體之均質製劑。
  12. 如請求項11之方法，其另外包含使該純化抗體與異源分子結合。
  13. 如請求項11或12之方法，其另外包含藉由將該抗體或結合抗體之均質製劑與醫藥學上可接受之載劑組合來製備醫藥組合物。
  14. 如請求項8至12中任一項之方法，其中該抗體為貝伐單抗(bevacizumab)。
  15. 一種抗CD20抗體之生產方法，其包含如請求項1至7中任一項之純化方法。
  16. 一種抗VEGF抗體之生產方法，其包含如請求項8至14中任一項之純化方法。
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