BE1025090B1 - Procede et kit de purification de proteines - Google Patents
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Abstract
L’invention fournit un procédé et un kit pour l’inactivation virale et la capture/purification combinées d’un échantillon contenant une protéine d’intérêt. Le procédé comprend les étapes de: conditionnement de l’échantillon de telle sorte que sa conductivité soit d’au plus 15 mS/cm et que son pH soit d’au moins 4; mise en contact de l’échantillon avec un moyen de séparation comprenant des particules chargées négativement; conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que son pH soit d’au plus 4,5 et maintien dudit pH pendant au moins 5 min; et conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que sa conductivité soit d’au moins 7 mS/cm et que son pH soit de 5 à 8, en éluant ainsi la protéine d’intérêt.
Description
(30) Données de priorité :
(73) Titulaire(s) :
UNIVERCELLS SA
6041, GOSSELIES Belgique (72) Inventeur(s) :
CASTILLO José 1000 BRUXELLES Belgique
MEDVEDEV Vasily 1400 NIVELLES Belgique (54) PROCEDE ET KIT DE PURIFICATION DE PROTEINES (57) L’invention fournit un procédé et un kit pour l’inactivation virale et la capture/purification combinées d’un échantillon contenant une protéine d’intérêt. Le procédé comprend les étapes de: conditionnement de l’échantillon de telle sorte que sa conductivité soit d’au plus 15 mS/cm et que son pH soit d’au moins 4; mise en contact de l’échantillon avec un moyen de séparation comprenant des particules chargées négativement; conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que son pH soit d’au plus 4,5 et maintien dudit pH pendant au moins 5 min; et conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que sa conductivité soit d’au moins 7 mS/cm et que son pH soit de 5 à 8, en éluant ainsi la protéine d’intérêt.
Fig. 1
BE2017/5211
Procédé et kit de purification de protéines
Domaine technique
La présente invention concerne un procédé et un kit pour la capture/purification et l'inactivation virale combinées d'un échantillon comprenant une protéine d'intérêt.
Arrière-plan
Avec le nombre croissant de candidats thérapeutiques protéiques, en particulier des anticorps monoclonaux (AcM) entrant dans différents stades de développement, les sociétés biopharmaceutiques recherchent de plus en plus des solutions innovantes pour distribuer cette filière. Pour le développement de processus de fabrication d'anticorps, le maintien des attributs de qualité souhaités tout en réduisant le temps de mise sur le marché, le maintien du rapport coût-efficacité, et la fourniture d'une flexibilité de fabrication sont des problèmes clés dans le marché concurrentiel d'aujourd'hui. Étant donné que les thérapies par anticorps peuvent nécessiter de fortes doses sur une longue période de temps, la substance médicamenteuse doit être produite en grandes quantités avec une efficacité de coût et de temps pour répondre aux exigences cliniques et ouvrir la voie à la commercialisation. Cela est également le cas pour d'autres protéines thérapeutiques recombinantes y compris, mais sans s'y limiter, des protéines de fusion, des enzymes thérapeutiques et des fragments d'anticorps.
En général, les protéines sont produites par culture cellulaire, en utilisant des lignées cellulaires, des lignées cellulaires bactériennes ou des virus conçus pour produire la protéine d'intérêt. Les lignées cellulaires utilisées sont alimentées avec un milieu de croissance complexe comprenant des sucres, des acides aminés et des facteurs de croissance. Pour une utilisation en tant que thérapeutiques humaines, les molécules cibles ou la protéine cible exprimées par les cellules cultivées doivent être traitées pour (i) inactiver les virus et (ii) purifier et séparer la protéine souhaitée du mélange de composés ajouté aux cellules et des sous-produits des cellules elles-mêmes. En général, (i) et (ii) sont des étapes distinctes du processus de purification de la protéine souhaitée. Dans la plupart des processus de fabrication contemporains, la protéine d'intérêt est tout d'abord purifiée puis traitée séparément pour inactiver les virus qui sont potentiellement contenus dans l'échantillon. Bien qu'il s'agisse d'une pratique acceptée, cela prend du temps et entraîne un nombre accru d'opérations et du temps pour les exécuter.
Le but de la présente invention est de fournir un procédé et un kit qui surmontent au moins une partie des inconvénients mentionnés ci-dessus. Par conséquent, l'invention fournit un procédé et un kit pour la capture/purification et l'inactivation virale combinées de protéines.
BE2017/5211
Résumé de l'invention
Dans un premier aspect, la présente invention fournit un procédé pour l'inactivation virale et la purification combinées d'un échantillon contenant une protéine d'intérêt comprenant les étapes de:
(a) conditionnement de l'échantillon de telle sorte que sa conductivité soit d'au plus mS/cm et que son pH soit d'au moins 3, (b) mise en contact de l'échantillon avec un moyen de séparation comprenant des particules chargées négativement, (c) conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que son pH soit d'au plus
4,5 et maintien dudit pH pendant au moins 5 min, (d) conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que sa conductivité soit d'au moins 5 mS/cm et que son pH soit de 5 à 8, en éluant ainsi la protéine d'intérêt.
Dans un second aspect, la présente invention fournit un kit pour l'inactivation virale et la purification combinées d'un échantillon contenant une protéine d'intérêt contenant au moins un moyen de séparation comprenant des particules chargées négativement, des solutions appropriées pour conditionner le moyen de séparation et/ou l'échantillon comme décrit par l'invention et au moins une notice comprenant des instructions pour l'utilisateur.
Le procédé et le kit de la présente invention présentent plusieurs avantages parmi lesquels la simplification du processus de purification des protéines en fusionnant deux étapes distinctes en une seule étape et en réduisant le risque de contamination du produit final, c'est-à-dire de la protéine d'intérêt. Cela entraîne une diminution du temps et des coûts de production, ce qui réduit le coût du produit final. En outre, le procédé selon la présente invention offre un traitement en aval continu de la récolte de culture cellulaire car il est dépourvu d'installation séparée pour l'inactivation virale. En particulier, le procédé de l'invention fournit des avantages pour le traitement en aval de la récolte de culture cellulaire où une étape de capture d'affinité n'est pas applicable et la capture de la molécule cible est réalisée par chromatographie d'échange de cations. En comparaison avec les procédés de la technique antérieure - qui impliquent des étapes d'affinité en combinaison avec une élution à faible pH et une inactivation virale discontinue - le procédé de l'invention réduit considérablement la teneur en agrégats et empêche même l'agrégation des molécules cibles. Cela provient de la réalisation de l'étape d'inactivation virale pendant que la molécule d'intérêt est liée au moyen de séparation par échange de cations. Le procédé de l'invention augmente considérablement le rendement de purification et la qualité des molécules purifiées.
Description des figures
La Fig. 1 présente une SDS-PAGE d'une fraction de lavage et d'une fraction de protéine cible, toutes les deux obtenues selon le procédé de l'invention.
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La Fig. 2 présente une SDS-PAGE des fractions de lavage et d'une fraction de protéine cible obtenues selon le procédé de l'invention.
Description détaillée de l'invention
La présente invention concerne un procédé et un kit pour l'inactivation virale et la purification combinées d'un échantillon comprenant des protéines d'intérêt telles que des anticorps, des molécules dérivées d'anticorps, des protéines de fusion, des enzymes, etc.
Sauf définition contraire, tous les termes utilisés dans la révélation de l'invention, y compris les termes techniques et scientifiques, ont la signification telle que généralement comprise par une personne de compétence ordinaire dans la technique à laquelle cette invention appartient. Au moyen de conseils supplémentaires, les définitions des termes sont incluses pour mieux apprécier l'enseignement de la présente invention.
Tels qu'utilisés ici, les termes suivants ont les significations suivantes:
« Un », « une », « le » et « la », tels qu'utilisés ici, désignent des référents à la fois au singulier et au pluriel, à moins que le contexte ne dicte clairement le contraire. À titre d'exemple, « un compartiment » désigne un ou plus d'un compartiment.
« Environ », tel qu'utilisé ici en référence à une valeur mesurable telle qu'un paramètre, une quantité, une durée temporelle et analogues, est destiné à englober des variations de +/-20% ou moins, de préférence +/-10% ou moins, plus préférablement +/-5% ou moins, encore plus préférablement +/-1% ou moins, et toujours plus préférablement +/-0,1% ou moins de et à partir de la valeur spécifiée, dans la mesure où de telles variations sont appropriées pour fonctionner dans l'invention révélée. Cependant, il faut comprendre que la valeur à laquelle le modificateur « environ » se réfère est elle-même également spécifiquement révélée.
« Comprendre », « comprenant » et « comprend » et « composé de », tels qu'utilisés ici, sont synonymes de « inclure », « incluant », « inclut » ou « contenir », « contenant », « contient » et sont des termes inclusifs ou ouverts qui spécifient la présence de ce qui suit, par exemple d'un composant, et n'excluent ou n'empêchent pas la présence de composants, caractéristiques, éléments, membres, étapes supplémentaires, non mentionnés, connus dans la technique ou révélés ici.
La mention de plages numériques par des extrémités inclut tous les nombres et les fractions subsumés dans cette plage, ainsi que les extrémités mentionnées.
L'expression « % en poids » (pourcentage en poids), ici et dans toute la description, sauf définition contraire, désigne le poids relatif du composant respectif sur la base du poids total de la formulation. L'expression « 1% p/p » désigne ce qui peut être compris comme 1g de composant respectif pour 100 g de la formulation, l'expression « 1% p/v » désigne ce qui peut être compris comme 1g de composant respectif pour 100 mL de la formulation, l'expression
BE2017/5211 « 1% v/v » désigne ce qui peut être compris comme 1 mL de composant respectif pour
100 mL de formulation.
Dans un premier aspect, la présente invention fournit un procédé pour l'inactivation virale et la purification combinées d'un échantillon contenant une protéine d'intérêt. Le procédé comprend les étapes de:
(a) conditionnement de l'échantillon de telle sorte que sa conductivité soit d'au plus 15 mS/cm et que son pH soit d'au moins 3, (b) mise en contact de l'échantillon avec un moyen de séparation comprenant des particules chargées négativement, en liant ainsi la protéine d'intérêt aux particules du moyen de séparation, (c) conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que son pH soit d'au plus
4,5 et maintien dudit pH pendant au moins 5 min, en inactivant ainsi les virus, (d) conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que sa conductivité soit d'au moins 5 mS/cm et que son pH soit de 5 à 8, en éluant ainsi la protéine d'intérêt. La protéine d'intérêt est un anticorps, un fragment d'anticorps, un dérivé d'anticorps ou une protéine de fusion. La protéine d'intérêt peut également être n'importe quelle autre protéine recombinante telle qu'une enzyme, un peptide ou un polypeptide, ou d'autres biomolécules exprimées par les cellules.
faut comprendre que le conditionnement de la conductivité et/ou du pH de l'échantillon pourrait être realisé par n'importe quel procédé connu de la personne compétente dans la technique, y compris une dilution, un échange de tampon, un titrage ou toute combinaison de ceux-ci. Le conditionnement de la conductivité et du pH du moyen de séparation est obtenu en faisant passer à travers ledit moyen de séparation un volume suffisant d'une solution ayant la conductivité et/ou le pH cibles. Par exemple, un conditionnement visant à diminuer la conductivité d'un échantillon pourrait être obtenu en diluant l'échantillon avec de l'eau ultrapure ou avec une solution tampon à faible teneur en sel, telle que de l'acétate de sodium 20 mM pH 5,3. Un conditionnement qui vise à augmenter la conductivité d'un échantillon pourrait être obtenu par titrage de l'échantillon avec une solution de chlorure de sodium 5M jusqu'à atteindre la conductivité souhaitée. Le pH d'une solution pourrait être abaissé en utilisant une solution d'acide chlorhydrique 0,2M à 1,0M ou de l'acide acétique 1M. Le pH d'une solution pourrait être augmenté en utilisant de l'hydroxyde de sodium 0,2M à 1,0M ou avec une base TRIS 2M pH 9,50.
Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon est conditionné dans l'étape (a) de telle sorte que sa conductivité soit d'au moins 2 mS/cm, de préférence d'au moins 3 mS/cm, plus préférablement d'au moins 4 mS/cm, le plus préférablement d'au moins 5 mS/cm ou de toute valeur intermédiaire. Ladite conductivité est d'au plus 13 mS/cm, de préférence d'au plus mS/cm, plus préférablement d'au plus 10 mS/cm, encore plus préférablement d'au plus 7 mS/cm, le plus préférablement d'au plus 6 mS/cm, toujours plus préférablement de
5,5 mS/cm ou de toute valeur intermédiaire. L'échantillon est également conditionné dans
BE2017/5211 l'étape (a) de telle sorte que son pH soit d'au moins 4, de préférence d'au moins 4,5, plus préférablement d'au moins 5 et d'au plus 9, de préférence d'au plus 8, plus préférablement d'au plus 7, le plus préférablement d'au plus 6 ou de toute valeur intermédiaire. Le conditionnement de l'échantillon dans l'étape (a) conduit à une charge de surface positive nette de la protéine ou de la molécule d'intérêt et/ou à une conductivité qui favorise la liaison de ladite molécule au moyen de séparation, en particulier un moyen de séparation par échange de cations. Le conditionnement assure une capture appropriée de la protéine d'intérêt et augmente la capacité de liaison dynamique du moyen de séparation.
L'échantillon est n'importe quelle matière ou solution comprenant la protéine souhaitée. De préférence, l'échantillon est au moins une récolte de culture cellulaire qui peut être obtenue en cultivant des cellules dans au moins un bioréacteur jusqu'à atteindre un point prédéterminé du processus. Ledit échantillon ou ladite récolte de culture cellulaire est de préférence clarifié avant d'être traité selon le procédé de la présente invention.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre l'étape de clarifier l'échantillon avant l'étape (a). Dans le cas où l'échantillon est une culture cellulaire, ladite clarification pourrait être réalisée lorsque la culture cellulaire est à l'intérieur et/ou à l'extérieur du bioréacteur. La clarification peut être obtenue par n'importe quel procédé connu de la personne compétente dans la technique.
De préférence, la clarification de la culture cellulaire commence avec la détermination du poids cellulaire humide (WCW) de la culture cellulaire. Le WCW peut être déterminé selon n'importe quel procédé connu de la personne compétente dans la technique. De préférence, le WCW est déterminé comme suit: des échantillons de culture cellulaire sont prélevés du bioréacteur après avoir atteint la densité cellulaire prédéterminée. De préférence, au moins 3 échantillons de 15 à 50 ml chacun sont collectés. Les échantillons sont centrifugés de 4000 à 5000 g pendant 5 à 10 minutes pour sédimenter les cellules. Le surnageant obtenu est jeté et le WCW est calculé sur la base de la différence entre le poids des tubes centrifuges vides et le poids des tubes centrifuges contenant les cellules déposées. La moyenne des trois mesures est calculée et enregistrée en tant que WCW en gramme par litre.
La clarification de la culture cellulaire comprend ensuite l'addition à ladite culture d'un acide gras ayant 7 à 10 atomes de carbone, d'allantoïne, d'au moins un composé électropositif, de terre de diatomées (TD) ou de toute combinaison de ceux-ci. Ces composés pourraient être sous forme liquide ou solide et pourraient être introduits sous forme d'un mélange ou séparés les uns des autres.
De préférence, 0,3% à 0,6% v/v d'acide gras, 0,5% à 3% p/v d'allantoïne et 0,01% à 1% p/v d'au moins un composé électropositif sont utilisés pour la clarification de l'échantillon. Plus préférablement, lesdits 0,4% à 0,5% p/v d'acide gras, 1% à 2% p/v d'allantoïne et 0,05% à
0,1% p/v d'au moins un composé électropositif sont utilisés pour la clarification de
BE2017/5211 l'échantillon. De préférence, le poids moléculaire du chitosane est de 30 kDa à 1000 kDa.
Ledit chitosane pourrait avoir n'importe quel degré d'acétylation.
Dans un mode de réalisation préféré, le composé électropositif est n'importe quelle particule chargée électropositive, telle qu'un polysaccharide électropositif, un polymère électropositif, le chitosane, des dérivés de chitosane, des polymères synthétiques tels que la poly(allylamine) et la polyéthylènimine benzylées, des particules disponibles dans le commerce telles que TREN (BioWorks, WorkBeads TREN, high) ou des tensioactifs cationiques comme le bromure d'hexadécyltriméthylammonium (également connu sous le nom de CTAB).
Dans un mode de réalisation préféré, la formule structurale générale de l'acide gras est CH3(CH2)nCOOH, où n est un nombre entier de 4 à 12 inclus, de préférence de 5 à 8 inclus. L'acide gras peut être l'acide énanthique (acide heptanoïque), l'acide caprylique (acide octanoïque), pélargonique (acide nonanoïque), l'acide caprique (acide décanoïque), l'acide nonénoïque ou toute combinaison de ceux-ci. L'acide gras peut être ajouté sous la forme d'un sel, tel qu'un sel de sodium, par exemple, le caprylate de sodium. La partie grasse de l'acide gras peut être constituée d'une chaîne linéaire « droite » d'atomes de carbone. Dans certains modes de réalisation, la partie grasse de l'acide gras peut être constituée d'une chaîne ramifiée, telle que l'acide 2-éthylhexanoïque, qui contient une chaîne à 2 atomes de carbone en position numéro 2 de la chaîne primaire à 6 atomes de carbone, produisant un total de 8 atomes de carbone. L'acide gras peut inclure une double liaison à n'importe quelle position dans la chaîne carbonée. La chaîne d'acide gras peut contenir 6 ou 7 ou 8 ou 9 atomes de carbone.
Dans un mode de réalisation préféré, l'acide gras, l'allantoïne et l'au moins un composé électropositif sont ajoutés à la culture cellulaire à l'intérieur du bioréacteur et sont laissés dans ledit bioréacteur pendant 5 à 360 minutes, de préférence 15 à 240 minutes, plus préférablement 60 à 120 minutes, le plus préférablement 30 à 60 minutes, ou pendant un intervalle intermédiaire. La culture cellulaire est de préférence agitée de 60 à 120 tr/min à une température ambiante ou au-dessus de la température ambiante jusqu'à environ 37 °C.
Dans un mode de réalisation préféré, la TD est ajoutée à la culture cellulaire après addition de l'acide gras, de l'allantoïne et du composé électropositif et agitation dans les conditions mentionnées ci-dessus. La quantité de TD ajoutée est de 20 à 60%, de préférence de 25 à 45%, plus préférablement de 30 à 48%, encore plus préférablement de 35 à 45%, le plus préférablement d'environ 40% du WCW de la culture cellulaire. La TD peut être de différents grades qui sont commercialement disponibles sur le marché. Par exemple, pour des cultures de cellules CHO, le grade Celpure 300© ou le grade Celpure 1000© sont de préférence utilisés.
De préférence, la TD est ajoutée après 45 minutes en comptant à partir de l'addition de l'acide gras, de l'allantoïne et du composé électropositif. Après addition de la TD, l'agitation est maintenue pendant 5 à 60 min, de préférence pendant 8 à 40 min, plus préférablement pendant 10 à 30 min, le plus préférablement pendant 15 à 20 min. L'agitation est maintenue
BE2017/5211 de 60 à 180 tr/min. La culture cellulaire est ensuite filtrée en utilisant au moins un moyen de filtration imperméable à la TD. Ledit moyen de filtration est au moins partiellement perméable à au moins certains composants de la culture cellulaire non clarifiée, y compris les petites impuretés des cellules hôtes, et est entièrement perméable aux protéines ou molécules d'intérêt.
Lors de l'introduction de la culture cellulaire dans le moyen de filtration, la TD s'accumule d'un côté du moyen de filtration et s'assemble progressivement en structure de TD comprenant une pluralité de canaux. La taille ou le diamètre des canaux sont définis par la taille des particules de la TD ajoutée à la première solution. La taille des particules de TD peut être choisie en fonction de la taille de la biomolécule d'intérêt et/ou des propriétés de la culture cellulaire et/ou des propriétés des cellules utilisées pour exprimer la molécule d'intérêt (cela inclut le type de cellules (par exemple, des cellules CHO) et la densité cellulaire de la récolte à clarifier). La structure de TD formée sert d'outil de filtration. La matière de grande taille, telle que les cellules, les débris cellulaires et les molécules non cibles, est retenue par la structure de TD, tandis que les biomolécules cibles, ayant une petite taille, s'écoulent à travers les canaux de la structure de TD. Une culture cellulaire clarifiée comprenant la protéine d'intérêt est ainsi obtenue. Éventuellement, un filtre en profondeur est positionné en aval de la structure de TD et du moyen de filtration. Le filtre en profondeur est choisi de telle sorte que la protéine d'intérêt le traverse tout en retenant d'autres contaminants ou impuretés éventuels. Cela réduit encore la présence de contaminant dans la culture cellulaire clarifiée. La clarification de l'échantillon ou de la culture cellulaire en utilisant la TD améliore la filtrabilité des cellules cultivées traitées/floculées en éliminant au moins partiellement les impuretés cellulaires et les autres molécules non cibles de l'échantillon.
Le moyen de séparation contient des particules chargées négativement ou une résine échangeuse de cations. Le moyen de séparation peut être n'importe quel milieu, n'importe quelle colonne ou membrane de chromatographie d'échange de cations commercialement disponible sur le marché. En outre, ledit milieu, ladite colonne ou membrane de chromatographie peut être de nature multimodale avec des propriétés d'échange de cations, par exemple, des échangeurs de cations tolérants aux sels, des échangeurs de cations ayant des groupements hydrophobes, etc. Ladite colonne est préparée pour utilisation de préférence selon le manuel du vendeur. Après la préparation, ladite colonne est conditionnée pour avoir des paramètres, c'est-à-dire le pH et la conductivité, égaux, similaires ou proches des paramètres de l'échantillon contenant la molécule cible. Le milieu de chromatographie peut être un échangeur de cations que l'on appelle « fort » aussi bien qu'un échangeur de cations que l'on appelle « faible ». Le moyen de séparation peut également être une membrane de séparation comprenant des groupes fonctionnels ou ce que l'on appelle un adsorbeur à membrane.
L'échantillon clarifié et conditionné est ensuite mis en contact avec le moyen de séparation. Cela peut être obtenu en introduisant l'échantillon dans la colonne de chromatographie ou en
BE2017/5211 le mettant en contact avec le moyen de séparation. Le contact entre l'échantillon clarifié et le moyen de séparation peut être réalisé manuellement ou automatiquement en utilisant des tubes et/ou des pompes et/ou un instrument de chromatographie appropriés.
Comme des molécules non cibles pourraient se lier au moyen de séparation, au moins une étape de lavage est éventuellement réalisée. L'étape de lavage peut être réalisée avant et/ou après l'étape (c) du procédé. Dans un mode de réalisation préféré, le moyen de séparation est lavé par:
- introduction dans le moyen de séparation de la solution utilisée pour l'équilibrer, et/ou
- conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que sa conductivité soit de 7 à 15 mS/cm et/ou que son pH soit de 3 à 8. Ce lavage élimine les molécules non cibles du moyen de séparation tout en maintenant la protéine d'intérêt liée à audit moyen de séparation. Cela augmente la pureté de la protéine d'intérêt qui sera éluée à un stade ultérieur.
Dans un mode de réalisation préféré, le moyen de séparation est conditionné dans l'étape (c) pour avoir un faible pH, ce qui inactive ainsi les virus présents dans l'échantillon. Cela assure la clairance virale de la fraction qui sera éluée et permet d'intégrer l'étape de clairance virale avec le mode de capture/purification par chromatographie contrairement aux approches connues dans lesquelles les deux étapes sont réalisées séparément. Le pH du moyen de séparation est de préférence abaissé en utilisant une solution tampon appropriée. Ledit pH est abaissé de telle sorte qu'il soit d'au moins 2, plus préférablement d'au moins 3, encore plus préférablement d'au moins 3,4, le plus préférablement d'au moins 3,6 ou de toute valeur intermédiaire. Ledit pH est d'au plus 4,5, de préférence d'au plus 4, plus préférablement d'au plus 3,9, encore plus préférablement d'au plus 3,8, le plus préférablement d'au plus 3,7 ou de toute valeur intermédiaire. L'abaissement du pH du moyen de séparation entraîne l'inactivation des virus présents dans l'échantillon. De préférence, le faible pH du moyen de séparation est maintenu pendant au moins 15 min, de préférence au moins 25 min, plus préférablement au moins 35 min, encore plus préférablement au moins 45 min, le plus préférablement au moins 60 min ou toute valeur intermédiaire. Ledit faible pH est maintenu pendant au plus 4 heures, de préférence au plus 3 heures, plus préférablement au plus 2 heures, le plus préférablement au plus 1 heure ou toute valeur intermédiaire. Le faible pH du moyen de séparation peut être maintenu en arrêtant complètement ou en maintenant un faible débit à travers le moyen de séparation. De préférence, le débit est d'au plus 600 cm/h, de préférence d'au plus 500 cm/h, plus préférablement d'au plus 400 cm/h, le plus préférablement d'au plus 300 cm/h ou de toute valeur intermédiaire. Ledit débit est d'au moins 50 cm/h, de préférence d'au moins 100 cm/h, plus préférablement d'au moins 150 cm/h, le plus préférablement d'au moins 200 cm/h ou de toute valeur intermédiaire. Éventuellement, au moins un agent facilitant la clairance virale est ajouté à la solution tampon utilisée pendant l'étape d'inactivation virale. La concentration de l'agent facilitant la clairance virale est de 0,01 à 10% v/v, de préférence de 1 à 8% v/v, plus préférablement de 3 à 7% v/v, plus préférablement d'environ 5% v/v et l'agent d'inactivation virale préféré est l'alcool isopropylique. En outre, la solution de lavage d'inactivation virale peut également contenir du
BE2017/5211 triton X-100 et du phosphate de tri-n-butyle ou toute combinaison de ceux-ci pour faciliter la clairance virale.
De préférence, après l'inactivation virale, la conductivité du moyen de séparation est maintenue constante, c'est-à-dire d'au plus 7 mS/cm, tandis que son pH est ajusté de 6 à 8. L'ajustement du pH sert à (i) préparer l'élution de la protéine d'intérêt tout en maintenant ladite protéine liée au moyen de séparation. En effet, l'élution dans des conditions de pH neutre réduit considérablement le risque d'agrégation de la protéine d'intérêt qui tend à s'agréger dans des conditions acides et (ii) obtenir une plus grande pureté de la protéine du fait que les impuretés restant dans le moyen de séparation s'éluent en raison du changement de pH alors que la protéine d'intérêt reste liée au moyen de séparation. Cela augmente la pureté de la protéine d'intérêt qui sera éluée.
Ensuite, le moyen de séparation est conditionné de telle sorte que sa conductivité soit d'au moins 7 mS/cm (étape d), de préférence d'au moins 7,5 mS/cm, plus préférablement d'au moins 8 mS/cm, encore plus préférablement d'au moins 9 mS/cm et le plus préférablement d'au moins 10 mS/cm. Cette conductivité est d'au plus 14 mS/cm, de préférence d'au plus 13 mS/cm, plus préférablement d'au plus 12 mS/cm, le plus préférablement d'au plus 11 mS/cm. Cela entraîne l'élution de la protéine d'intérêt dans un état purifié et avec une teneur nulle ou diminuée en impuretés et/ou agrégats.
Dans un second aspect, la présente invention fournit un kit pour l'inactivation virale et la purification combinées d'un échantillon contenant une protéine d'intérêt contenant au moins un moyen de séparation comprenant des particules chargées négativement, des solutions appropriées pour conditionner le moyen de séparation et/ou l'échantillon comme décrit cidessus et au moins une notice comprenant des instructions pour l'utilisateur.
Exemples
Exemple 1: une récolte non clarifiée de culture de cellules CHO a été traitée avec de l'acide caprylique (0,45% v/v), de l'allantoïne (1% p/v), du chitosane à poids moléculaire élevé (0,08% p/v) et de la terre de diatomées de grade Celpure 300© (38% p/p du poids des cellules humides) et clarifiée par filtration par nourrissement avec de la terre de diatomées à un pH de 5,30. La culture cellulaire exprimait l'anticorps monoclonal IgG1 avec un point isoélectrique théorique de 8,61.
Après la clarification ci-dessus, la récolte a été encore clarifiée avec un filtre en profondeur Sartoclear DL20. La récolte clarifiée a été diluée jusqu'à une conductivité de 5 mS/cm avec de l'eau ultrapure. Le pH de la récolte clarifiée a été ajusté à 5,3 avec de l'acide acétique 1M. Un milieu d'échange de cations fort Toyopearl GigaCap S-650M, préemballé dans une colonne de chromatographie de volume de colonne (VC) de 5 ml, ayant des dimensions de lit de 8 mm x 100 mm, a été utilisé en tant que moyen de capture/inactivation virale, et la procédure suivante a été appliquée:
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- la colonne de chromatographie a été désinfectée avec de l'hydroxyde de sodium 0,5N pendant 60 minutes avec un débit de 100 cm/h puis neutralisée avec de l'HEPES 50 mM pH 7,0, 5 VC à 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été conditionné avec de l'acétate de sodium 50 mM, du chlorure de sodium 1M pH 5,30 pour 10 VC avec un débit linéaire de 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été équilibré avec de l'acétate de sodium 50 mM, du chlorure de sodium avec une conductivité de 5,0 mS/cm, pH 5,3 pour 10 VC à un débit de 600 cm/h;
- la récolte clarifiée contenant la protéine d'intérêt a été chargée sur la colonne à 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été lavé (lavage 1) avec un tampon d'équilibrage: acétate de sodium 50 mM, chlorure de sodium ayant une conductivité de 5,0 mS/cm pour 5 VC à un débit de 600 cm/h;
- l'inactivation virale a été réalisée (lavage 2) en faisant passer une solution d'acétate de sodium 50 mM, pH 3,70, à travers le milieu d'échange de cations à 100 cm/h pendant 60 minutes;
- le milieu d'échange de cations a été lavé (lavage 3) avec le tampon d'équilibrage: acétate de sodium 50 mM, chlorure de sodium ayant une conductivité de 5,0 mS/cm pour 5 VC à un débit de 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été lavé (lavage 4) avec de l'acétate de sodium 50 mM, du chlorure de sodium, conductivité de 11 mS/cm, pH 5,30 pour 7 VC à un débit de 600 cm/h;
- la protéine d'intérêt a été éluée avec de l'acétate de sodium 50 mM, du chlorure de sodium, conductivité de 14,5 mS/cm, pH 5,30 à un débit de 150 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été dépouillé avec de l'acétate de sodium 50 mM, du NaCl 1M pH 5,30 pour 5 VC à un débit de 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été désinfecté avec du NaOH 0,5N pendant 60 minutes avec un débit de 100 cm/h et stocké dans de l'HEPES 50 mM, 20% v/v d'éthanol pH 7,0.
La protéine d'intérêt a été éluée et recueillie dans différentes fractions qui ont été analysées. La concentration en protéine cible dans la fraction d'écoulement a été surveillée en utilisant un essai Fc-ELISA et les résultats étaient négatifs dans chaque fraction recueillie ainsi que dans l'ensemble d'écoulement. Les fractions de lavage et les fractions d'élution ont été analysées par SDS-PAGE (Fig. 1) qui a confirmé que les fractions de lavage (piste 1 dans la Fig. 1) contenaient principalement des impuretés à BPM et un pourcentage très faible de la protéine d'intérêt. La fraction d'élution (piste 2, Fig. 1) contenait l'anticorps cible. La piste 3 de la Fig. 1 montre une bande et la piste 10 de la Fig. 1 montre un marqueur de poids moléculaire. La teneur en protéines de cellules hôtes dans la fraction d'élution a été surveillée en utilisant un kit HCP ELISA disponible dans le commerce auprès de Cygnus Technologies, et la concentration en HCP dans la fraction d'élution a été estimée à environ 500 ppm.
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Exemple 2: une récolte non clarifiée de culture de cellules CHO a été traitée avec de l'acide caprylique (0,45% v/v), de l'allantoïne (1% p/v), du chitosane à poids moléculaire élevé (0,08% p/v) et de la terre de diatomées de grade Celpure 300© (38% p/p du poids des cellules humides) et clarifiée par filtration par nourrissement avec de la terre de diatomées à un pH de 5,30. La culture cellulaire exprimait l'anticorps monoclonal IgG1 avec un point isoélectrique théorique de 8,61.
Après la clarification ci-dessus, la récolte a été encore clarifiée avec un filtre en profondeur Millipore B1HC. L'échantillon clarifié a été dilué jusqu'à une conductivité de 5 mS/cm avec de l'eau ultrapure. Le pH de la récolte clarifiée a été ajusté à 5,3 avec de l'acide acétique 1M. Un milieu d'échange de cations Toyopearl GigaCap S-650M, préemballé dans une colonne de chromatographie de volume de colonne (VC) de 5 ml, ayant des dimensions de lit de 8 mm x 100 mm, a été utilisé en tant que moyen de capture/inactivation virale, et la procédure suivante a été appliquée:
- la colonne de chromatographie a été désinfectée avec de l'hydroxyde de sodium 0,5N pendant 60 minutes avec un débit de 100 cm/h et puis neutralisée avec de l'HEPES 50 mM pH 7,0, 5 VC à 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été conditionné avec de l'acétate de sodium 30 mM, du NaCl 1M pH 5,30 pour 10 VC à un débit de 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été équilibré avec de l'acétate de sodium 30 mM, du chlorure de sodium ayant une conductivité de 5,0 mS/cm, pH 5,30 pour 10 VC à un débit de 600 cm/h;
- la récolte clarifiée contenant la protéine d'intérêt a été chargée sur la colonne à 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été lavé (lavage 1) avec un tampon d'équilibrage d'acétate de sodium 30 mM, du chlorure de sodium ayant une conductivité de 5,0 mS/cm pour 5 VC à un débit de 600 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été lavé (lavage 2) avec de l'acétate de sodium 30 mM, du chlorure de sodium ayant une conductivité de 11 mS/cm, pH 5,3 pour 7 VC avec un débit linéaire de 600 cm/h;
- l'inactivation virale a été réalisée (lavage 3) en faisant passer de l'acétate de sodium 30 mM, du chlorure de sodium ayant une conductivité de 5 mS/cm, pH 3,7 pendant 45 minutes avec un débit linéaire de 100 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été lavé (lavage 4) avec de l'HEPES 30 mM, du chlorure de sodium ayant une conductivité de 5 mS/cm, pH 7,2 pour 6 VC avec un débit de 600 cm/h;
- la protéine d'intérêt a été éluée avec de l'HEPES 20 mM, du chlorure de sodium, conductivité de 12 mS/cm, dans 4 VC avec un débit linéaire de 150 cm/h;
- le milieu d'échange de cations a été dépouillé avec de l'HEPES 20 mM, du chlorure de sodium 1M, pH 7,2 pour 5 VC à un débit linéaire de 600 cm/h;
BE2017/5211
- le milieu d'échange de cations a été désinfecté avec de l'hydroxyde de sodium 0,5N pendant 60 minutes avec un débit de 100 cm/h et stocké dans de l'HEPES 50 mM,
20% v/v d'éthanol pH 7,0.
La protéine d'intérêt a été éluée et recueillie dans différentes fractions qui ont été analysées. La concentration en protéine cible, c'est-à-dire l'anticorps, dans la fraction d'écoulement a été surveillée en utilisant un essai Fc-ELISA et les résultats étaient négatifs dans chaque fraction recueillie ainsi que dans l'ensemble d'écoulement. Les fractions de lavage et les fractions d'élution ont été analysées par SDS-PAGE (Fig. 2) qui a confirmé que les fractions de lavage (pistes 1 et 2 dans la Fig. 2) contenaient principalement des impuretés à BPM et un pourcentage très faible de la protéine d'intérêt. La fraction d'élution (piste 3, Fig. 2) contenait l'anticorps cible. La piste 4 de la Fig. 2 montre une bande et la piste 10 de la Fig. 2 montre un marqueur de poids moléculaire. La teneur en protéines de cellules hôtes dans la fraction d'élution a été surveillée en utilisant un kit HCP ELISA disponible dans le commerce auprès de Cygnus, et la concentration en HCP dans la fraction d'élution a été estimée à être environ 500 ppm.
Il est supposé que la présente invention n'est limitée à aucune forme de réalisation décrite précédemment et que certaines modifications peuvent être ajoutées à l'exemple présenté sans réévaluation des revendications annexées.
BE2017/5211
Claims (13)
- Revendications1. Un procédé pour l'inactivation virale et la purification combinées d'un échantillon contenant une protéine d'intérêt comprenant les étapes de:(a) conditionnement de l'échantillon de telle sorte que sa conductivité soit d'au plus 15 mS/cm et que son pH soit d'au moins 3, (b) mise en contact de l'échantillon avec un moyen de séparation comprenant des particules chargées négativement, (c) conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que son pH soit d'au plus4.5 et maintien dudit pH pendant au moins 5 min, et (d) conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que sa conductivité soit d'au moins 5 mS/cm et que son pH soit de 5 à 8, en éluant ainsi la protéine d'intérêt.
- 2. Le procédé selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon est conditionné dans l'étape (a) de telle sorte que sa conductivité soit d'au moins 2 mS/cm et d'au plus 12 mS/cm, de préférence d'au moins 3 mS/cm et d'au plus 10 mS/cm, plus préférablement d'au moins 4 mS/cm et d'au plus 7 mS/cm, le plus préférablement d'au moins 5 mS/cm et d'au plus 6 mS/cm.
- 3. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1-2, dans lequel l'échantillon est conditionné dans l'étape (a) de telle sorte que son pH soit d'au moins 4,5 et d'au plus 7, de préférence d'au moins 5 et d'au plus 6.
- 4. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1-3, dans lequel le moyen de séparation est conditionné dans l'étape (c) de telle sorte que son pH soit d'au moins2.5 et d'au plus 4,3, de préférence d'au moins 3 et d'au plus 4, plus préférablement d'au moins 3,2 et d'au plus 3,9, le plus préférablement d'au moins 3,6 et d'au plus 3,8.
- 5. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans lequel le pH de l'étape (c) est maintenu pendant au moins 10 min et au plus 4 heures, de préférence au moins 45 min et au plus 60 minutes.
- 6. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1-5, dans lequel le moyen de séparation est conditionné dans l'étape (d) de telle sorte que sa conductivité soit d'au moins 7,5 mS/cm et d'au plus 15 mS/cm, de préférence d'au moins 8 mS/cm et d'au plus 13 mS/cm, plus préférablement d'au moins 9 mS/cm et d'au plus 12 mS/cm, le plus préférablement d'au moins 10 mS/cm et d'au plus 11 mS/cm.
- 7. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1-6, dans lequel l'échantillon est une culture cellulaire qui peut être obtenue en cultivant des cellules dans au moins un bioréacteur.BE2017/5211
- 8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1-7 comprenant en outre l'étape de clarifier l'échantillon avant l'étape (a).
- 9. Le procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape de clarification comprend l'ajout à l'échantillon d'au moins un acide gras ayant 7 à 10 atomes de carbone et/ou d'allantoïne, d'au moins un composé électropositif, de terre de diatomées ou de toute combinaison de ceux-ci.
- 10. Le procédé selon la revendication 9, dans lequel le composé électropositif est choisi parmi le groupe comprenant un polysaccharide électropositif, un polymère électropositif, le chitosane, un dérivé de chitosane, un polymère synthétique, un tensioactif cationique ou toute combinaison de ceux-ci.
- 11. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1-10 comprenant en outre, avant l'étape (c), les étapes de:- conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que sa conductivité soit de 9 à 15 mS/cm, en éliminant ainsi les molécules non cibles dudit moyen de séparation, et/ou- conditionnement du moyen de séparation de telle sorte que sa conductivité soit d'au plus 7 mS/cm.
- 12. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1-11, dans lequel la protéine d'intérêt est un anticorps, un fragment d'anticorps, un dérivé d'anticorps, une protéine de fusion ou une autre protéine recombinante.
- 13. Un kit pour l'inactivation virale et la purification combinées d'un échantillon contenant une protéine d'intérêt contenant au moins un moyen de séparation comprenant des particules chargées négativement, des solutions appropriées pour conditionner le moyen de séparation et/ou l'échantillon comme décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 12 et au moins une notice comprenant des instructions pour l'utilisateur.BE2017/5211
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