TWI255183B - Pharmaceutical compositions of water soluble camptothecin for the treatment of a tumor - Google Patents

Description

1255183 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 槪略而言本發明係關於用於治療腫瘤、自體免疫病及 再狹窄之醫藥組合物領域。本發明亦係關於抗癌劑之醫 藥製劑領域’例如帕克里達瑟爾（紫杉酚（Taxol))及杜西達 瑟爾（紫杉萜（Taxotere))，特別藉接合藥物至水溶性部分 使帕克里達瑟爾變成水溶性。 【先前技術】 帕克里達瑟爾爲一種抗微細管劑，萃取自太平洋紫杉 樹一短葉紅豆杉（Taxus brevifolia)…之針葉及樹皮， 顯示用於人體癌症之第I期硏究及第II及III期早期試 驗具有顯著抗腫瘤效果（Horwitz等人，1993)。報告主要 用於惡化的卵巢癌及乳癌。用於小細胞及非小細胞肺癌、 頭頸癌及轉移性黑素瘤於文獻也記載具有顯著活性。但 帕克里達瑟爾開發用於臨床試驗之主要困難爲其不溶於 水。 杜西達瑟爾係由10 -去乙醯基漿果赤黴素III，一種非 細胞毒性前驅物萃取自歐洲紅豆杉（Taxus baccata)針葉 且以化學合成支鏈酯化半合成生產（Cortes及 Pazdur，1 995 )。多種癌細胞系包括乳癌、肺癌、卵巢癌 及結腸直腸癌，及黑素瘤皆顯示對杜西達瑟爾有反應。 臨床試驗中，杜西達瑟爾用於乳癌、卵巢癌、頭頸癌及 惡性黑素瘤可獲得完整或部分效果。 帕克里達瑟爾典型配方爲濃溶液含有帕克里達瑟爾，6 毫克/毫升克莫佛（(：^111〇?11(^)£以聚氧乙基化蓖麻油）及 5 1255183 脫水醇（50 % v/v) ^投藥前須進一步稀釋 (Goldspiel,1994)。帕克里達瑟爾（紫杉酚）用於人體癌 症包括乳癌、卵巢癌、非小細胞肺癌及頭頸癌顯示顯著 活性（Rowi nsky及Donehowe r，1 995 )。用於患有惡化乳癌 且已經使用多種化學治療劑治療之病人也顯示顯著活性 (F 〇 a等人，1 9 9 4 )。但如同大半化學治療劑般，帕克里達 瑟爾的最大忍受劑量受其毒性所限。用於人體，帕克里 達瑟爾於1 00 - 250毫克/平方米劑量的主要毒性爲粒狀 血球減少（Holmes等人，1 995 );症候性周邊神經病變爲 其主要非血液方面毒性（Rowinsky等人，1993 )。 輸送需要量之帕克里達瑟爾之克莫佛EL用量顯著於高 於任何其它使用克莫佛配方的藥物。數種毒性係來自於 克莫佛，包括血管擴張、呼吸困難及血壓下降。此種賦 形劑也顯示於實驗動物及人體引發嚴重過敏（We i s s等 人，1990 )。事實上，藉靜脈大劑量注射投予小鼠之最大 帕克里達瑟爾劑量係受克莫佛賦形劑之臨床致死毒性所 限（E i s eman等人，1 994 )。此外，克莫佛EL爲界面活性 劑已知可由聚乙烯基氯袋及靜脈投藥管路中滲濾出酶酸 酯增塑劑如二（2-乙基己基）酶酸酯（DEHP)。已知DEHP引 起動物肝毒性而對齧齒類動物具有致癌性。此種帕克里 達瑟爾製劑也顯示隨著時間的經過形成粒狀物質，如此 在投藥前需要過濾（Goldspiel，1 994 )。因此對帕克里達 瑟爾溶液劑的製備及投藥上需要特別注意才能安全地投 藥病人，此等要求無可避免地造成成本增高。 先前嘗試獲得水溶性帕克里達瑟爾包括製備帕克里達 瑟爾前藥，係經由將增溶部分如丁二酸酯，磺酸，胺基 6 1255183 酸類及磷酸鹽衍生物置於2 ’ -羥基或7-羥基位置（Deu t s ch 等人，1989; mathew 等人，Zhao 及 Kingston，1991，1992; Nicolaou 等人’1993; Vy as 等人，1995, Rose 等人，1997)。 雖然若干前藥具有充分水中溶解度，但少數仍具有可媲 美親代藥物的抗腫瘤活性（Dr utsch等人，1 989 ; Mathew 等人，1 992 ; Rose等人，1 997 )。若干衍生物由於中性pH 之水溶液中不穩定，故不適合靜脈注射。例如Deutsch 等人（ 1 989 )報告帕克里達瑟爾之2夂丁二酸酯衍生物，但 鈉鹽之水中溶解度僅約0 . 1 %，三乙醇胺鹽及N -甲基麩 胺鹽溶解度僅約1 %。此外，據報告胺基酸酯不穩定。類 似結果亦由Mathew %人（1992)報告。 晚近Nicolaou等人（ 1 993 )報告合成及於試管試驗生物 評估一類新穎稱作「原紫杉酸（protaxols)」之前藥。此 等化合物具有較高水中溶解度，經由分子內水解機轉轉 成帕克里達瑟爾作爲活性藥物。但無法獲得原紫杉酚抗 腫瘤活性之活體試驗資料。Greenwa Id等人報告合成高度 水溶性帕克里達瑟爾之2·-及7-聚乙二醇酯（Greenwald 等人，1 994 )。使用聚合物鍵聯策略，其它仍開發水溶性 聚乙二醇（PEG)-接合帕克里達瑟爾（Li等人，1 996 ; G r e e n w a 1 d等人，1 9 9 6 )。雖然此等接合物之水溶性絕佳， 但其療效不優於自由態帕克里達瑟爾。此外，PEG於聚合 物鏈各端僅有兩個反應性官能基，如此有效限制PEG所 能攜帶的帕克里達瑟爾（U.S. 5,362,831)。 其它嘗試解決此等問題包括將帕克里達瑟爾微包囊於 脂小體及微球（Bartoni及Boitard, 1 990 )。脂小體配方 據報告如同自由態帕克里達瑟爾般有效，但唯有含低於2 7 1255183 %帕克里達瑟爾的脂小體配方才具有物理穩定性（Sh arm a 及Straubinger，1994)。不幸，微球配方證實有毒。因 此仍然需要有一種水溶性帕克里達瑟爾配方其可輸送有 效量之帕克里達瑟爾及杜西達瑟爾，而無藥物不溶性引 發的缺點。 廣泛使用帕克里達瑟爾之另一障礙爲帕克里達瑟爾的 生產來源有限，造成帕克里達瑟爾之治療昂貴。例如每 個療程達數千美元。另一缺點爲並非全部腫瘤皆對帕克 里達瑟爾治療有效，原因可能爲帕克里達瑟爾無法進入 腫瘤內部之故。因此，迫切需要一種有效帕克里達瑟爾 及相關藥物配方，其爲水溶性且具有長血淸半生期用於 治療腫瘤，自體免疫病如類風濕性關節炎，以及防止血 管受到創傷例如血管成形術及植入移植模後再狹窄。 【發明內容】 本發明追求克服此等及其它先前技術之特有缺點，經 由提供組合物包括一種化學治療藥及/或抗血管生成藥 如帕克里達瑟爾、杜西達瑟爾或其它紫杉類藥物接合至 水溶性聚合物如水溶性聚胺基酸，或接合至水溶性金屬 螯合劑。本發明之另一具體例爲一種包含帕克里達瑟爾 及聚麩胺酸之接合物的組合物於動物模式時具有驚人的 抗腫瘤活性，且又此種組合物於此處驗證爲一種新穎紫 杉烷（tax ane)，其具有與帕克里達瑟爾不同的醫藥性質。 此等組合物顯示作爲抗腫瘤劑對範例腫瘤模式具有驚人 效果，預期至少如同帕克里達瑟爾、杜西達瑟爾或其它 紫杉類藥物對已知紫杉烷類或紫杉類有效的疾病或病情 同等有效。本發明組合物提供水溶性紫杉類藥物可克服 8 1255183 藥物本身不溶性關聯的缺點，也提供改良效果及控制釋 放之優點，故以動物模式說明之腫瘤於單次靜脈投藥如 提供新穎紫杉烷後被淸除。聚丨_麩胺酸）接合帕克里達 瑟爾於後述實例中顯示具有新穎藥物活性；此外具有改 良之輸送至腫瘤及提供控制釋放。 此處所述方法也包括製造其它治療劑、對比劑及藥物 之水溶性聚合物接合物，包括帕克里達瑟爾，塔莫西芬 (taxoxifen)，紫杉萜，伊托賽（etopside)，丹托賽 (teniposide)，富達必（fludarabine)，多索汝必辛 (doxorubicin)，道諾黴素（daunomycin)，伊莫定 (emod i η )，5 -氟尿嚼 D定（5 - f 1 uo r ou r a c i 1 )，FUDR，雌二 醇（estradiol)，喜樹驗（camptothecin)，維生素 A 酸 類（retinoids)， 維洛密（verapamil)， 伊波西隆 (epothilones)，環孢靈（cyclosporin)，及其它紫杉類 (t axo 1 d s )。特別，具有自由羥基之藥劑藉此處對帕克里 達瑟爾所述類似化學反應接合至聚合物。此種接合爲化 學業界人士眾所周知，如此不屬於本發明之請求專利範 圍。該等藥劑包括但非限於伊托賽，丹托賽，喜樹鹼及 伊波西隆。如此處使用，接合至水溶性聚合物表示藥物 共價接合至聚合物或螯合劑。 亦須了解本發明之水溶性接合物可連同其它藥物包括 其它抗腫瘤劑或抗癌劑投藥。此種組合爲業界眾所周知。 水溶性帕克里達瑟爾，杜西達瑟爾或其它紫杉類，或於 本發明之較佳具體例中，聚-(1 -麩胺）酸接合帕克里達瑟 爾（PG-TXL)於某些治療類型可合倂鉑藥物、抗腫瘤劑如 多索汝必幸或道諾黴素（daunorubicin)或其它與紫杉酚 9 1255183 合倂使用之藥物或合倂外部或內部放射線照射，換言之 由外部來源或由系統性例如注射或舌服放射性質如含放 射性同位素配方投予放射線治療。 化學治療藥與聚合物接合爲降低身體毒性及改良治療 指數之具有吸引力的辦法。分子量大於30kDa之聚合物 不易擴散通過正常微血管及腎絲球體內皮，因此正常組 織幾乎不會受到不相關藥物媒介之毒性（Maeda及

Matsumura，1989 ; Reynolds, 1 995 )。它方面，已經確 定惡性腫瘤具有病害之微血管內皮且比正常組織血管系 有較大之滲透性（Maeda及Matsumura，1 989; Fidler等 人’ 1 987 )。腫瘤常缺乏淋巴血管系來去除滲透入腫瘤組 織內部的大分子（Maeda及Ma t s umur a , 1 989 )。如此聚合 物-藥物接合物通常可保留於血管系由血管中選擇性滲濾 進入腫瘤內部，結果導致腫瘤內堆積活性治療藥。水溶 性聚合物例如較佳具體例之PG - TXL具有與未接合藥物（亦 即帕克里達瑟爾）不同的藥理性質。此外聚合物-藥物接 合物可作爲長效藥物用於持續釋放，使腫瘤細胞長期暴 露於藥物。最後，水溶性聚合物（例如水溶性聚胺基酸） 可用於穩定藥物，以及增溶其它不可溶之藥物。目前已 經檢驗多種合成及天然聚合物之促進腫瘤特異性藥物輸 送的能力（1(〇06〇6^:，199〇，1^6(1&及1^151111111]：&，1989)。 但據發明人所知僅有少數目前正在進行臨床評估包括曰 本之 SMANCS 及英國之 HPNA-Dox(Maeda，1991; Kopecek 及 Kopeckova，1 993 )。 本發明揭示內容中，需了解紫杉類包括帕克里達瑟爾 類及杜西達瑟爾等化合物，以及其它具有紫杉烷主幹的 10 1255183 化合物（Cortes及Pazdur，1995)，可由天然來源如杉木、 由細胞培養或化學合成分子分離；較佳紫杉烷爲具化學 通式C47H51N〇14之化學品包括〔2aR-〔 2a α，4 /3，4 α冷， 6/3，9a(aR*，^S*)，lla，12a，12aa，12ba〕]-/5(苯甲醯胺基）-a -羥苯丙酸6，12b -貳（乙醯氧）-12-(苯 甲醯氧）-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氫-4，11-二羥- 4a，8，13，13 -四甲基-5-氧基-7, 11-低甲基-ΙΗ-运癸〔3,4〕苯并-〔l，2-b〕一氧肆園- 9-基酯。需了解帕克里達瑟爾及杜西達瑟爾比其它對抗某 型腫瘤之藥物更有效，於本發明實務中，對特定紫杉類 較爲敏感的腫瘤將使用該種水溶性紫杉類或紫杉烷接合 物治療。 於帕克里達瑟爾接合至水溶性金屬螯合劑之具體例 中，組合物進一步包含至螯合金屬離子。本發明之螯合 金屬離子可爲任一種離子形式包括銘，硼，銘，鉻，銘， 銅，鏑，餌，銪，iL，鎵，鍺，鈥，銦，銥，鎂，錳， 鎳，鉑，銶，鈸I，釕，釤，鈉，铽，钍，錫，釔或鋅。 若干較佳具體例中，螯合金屬離子爲放射性核種，亦即 所列舉金屬之一之放射性同位素。較佳放射性核種包括 但非限於 UGa^Ga/nin^mTc^Y，114%!!及 193mPt。 用於本發明實務之較佳水溶性螯合劑包括但非限於二 伸乙基三胺五乙酸（DTPA)，伸乙基二胺四乙酸（EDTA )， 1,4,7，10-吖環十二烷-^川"，^-四乙酸酯（〇0丁八）， 四吖環十四烷-N，N \ N "，N " 1 -四乙酸（TETA )，羥亞乙基二 膦酸酯（HEDP)，二锍丁二酸（DMSA)，二伸乙基三胺四亞 甲基膦酸（DTTP)及1-(對-胺基苄基卜DTPA，1,6-二胺基 11 1255183 己烷^川’，[^川’-四乙酸，〇?0?，及伸乙基貳（氧伸乙基 腈基）-四乙酸，以DTPA爲最佳。本發明之較佳具體例亦 爲包含奨inIn-DTPA-帕克里達瑟爾及Na-DTPA-帕克里達 瑟爾之組合物。 本發明之若干具體例中，帕克里達瑟爾、杜西達瑟爾 或其它紫杉類可接合至水溶性聚合物，聚合物較佳接合 至帕克里達瑟爾、杜西達瑟爾或其它紫杉類之2’或7 -羥 基或二者。聚·麩胺酸（PG)爲可於本發明提供若干優點之 聚合物。首先，含有大量分支鏈羧基官能基可供藥物附 接。第二，PG易由溶小體酶分解成爲其無毒基本成分：^ 麩胺酸’ d-麩胺酸及（Π-麩胺酸。最後，據報告麩胺酸納 可防止帕克里達瑟爾誘發神經病變的表現，如此可忍受 更高劑量帕克里達瑟爾（Boyle等人，1 996 )。較佳聚合物 ' 包括但非限於聚（1 -麩胺酸），聚-(d -鍵胺酸），聚（彳1 _變 ' 胺酸），聚（1-天冬酸），聚（d-天冬酸），聚（dl_天冬酸）， 聚（1-離胺酸），聚（d-離胺酸），聚（dl-離胺酸），前述聚 胺基酸與聚乙一醇、聚己內酯、聚乙醇酸、及聚乳酸之 共聚物，以及聚（2 -羥乙基1-麩胺），角質聚糖，經甲基 _ 葡萄聚糖，玻璃酸，人血淸白蛋白及褐藻酸；其中以聚 麩胺酸爲特佳。於分子量之低限，本發明之聚合物較佳 具有分子量約1，000，約2,000，約3,000，約4,000， 約 5,000，約 6,000，約 7,000，約 8,000，約 9,〇〇〇，約 10,000，約 11，000 ’ 約 12,000，約 13，〇〇〇，約 i4,〇〇〇 , 約 1 5,000,約 16,〇〇〇,約 1 7,000,約 18,〇〇〇，約 19,〇〇〇， 約 20,0 00,約 21，〇〇〇,約 22,000,約 23,000,約 24,〇〇〇， 約 25,000,約 26,〇〇〇,約 27,000,約 28,000,約 29,000 ， 12 1255183 約 30,000,約 31，000,約 32,000,約 33，000,約 34,000， 約 35,000,約 36,000,約 37,000,約 38,000,約 39,000 ， 約 40,000,約 41，000,約 42,000,約 43，000,約 44,000， 約 45,000,約 46,000,約 47,000,約 48,000,約 49,000 ， 至約50,000kd。於分子量之高限，本發明之聚合物較佳 具有分子量約 51，000,約 52,000,約 53 ,000,約 54,000， 約 55,000,約 56,000,約 57,000,約 58,000,約 59,000， 約 60,000,約 61，000,約 62,0 00,約 63，000,約 64,000， 約 65，000，約 66，000，約 67，000，約 68，000，約 69，000， 鲁 約 70,000,約 71,000,約 72,000,約 73,000,約 74,000 ， 約 75,000,約 76,000,約 77,000,約 78,000,約 79,000 ， 約 80,000,約 81，000,約 82,000,約 83，000,約 84,000， 約 85,000,約 86,000,約 87,000,約 88,000,約 89,000 ， 約 90,000,約 91，000,約 92,000,約 93,000,約 94,000， ' 約 95,000,約 96,000,約 97,000,約 98,000,約 99,000 ， 約1 00,000kd。此等範圍內聚合物之分子量較佳於約5,000 至約100,0OOkd之範圍，以約20,000至約80,000爲佳， 或甚至以約25,000至約50,000爲更佳。 _ 本發明之另一方面爲本發明組合物如PG-TXL也可接合 至第二親脂性或不良溶解性抗腫瘤劑如喜樹鹼，伊波西 隆，西普定（cisplatin)，梅法蘭（melphalan)，紫杉 ， 伊托賽，丹托賽，富達必，維洛密，或環孢靈（舉例）， 或甚至結合至水溶性劑如5-氟尿嘧啶（5 FU)或氟去氧尿 苷（FUDR)，多索汝必辛或道諾黴素。 需了解本發明組合物可分散於下述醫藥可接受性載劑 溶液。此等溶液爲無菌或具防腐性，且包括水、緩衝液、 13 1255183 等張劑及業界已知投予動物體或人體時不會引起過敏或 其它有害反應的成分。因此，本發明也可敘述爲醫藥組 合物包含化學治療劑或抗癌藥如帕克里達瑟爾，杜西達 瑟爾或其它紫杉類接合至高分子量水溶性聚合物或螯合 劑。醫藥組合物包括聚乙二醇，聚麩胺酸類，聚天冬胺 酸類，聚離胺酸或螯合劑，較佳DTPA。也需了解放射性 核種可用作抗腫瘤劑或藥物，及本醫藥組合物可包括治 療量之螯合放射性異構物。 若干具體例中，本發明可描敘述爲一種決定腫瘤組織 | 攝取化學治療藥如帕克里達瑟爾、杜西達瑟爾或其它紫 杉類之方法。此種方法包含獲得藥物與帶有螯合金屬離 子之金屬螯合劑之接合物，腫瘤組織接觸組合物，及檢 測螯合金屬離子於腫瘤組織的出現情況。腫瘤組織存有 螯合金屬離子表示被腫瘤組織攝取。螯合金屬離子可爲 ^ 放射性核種，其檢測爲閃爍攝影術。腫瘤組織也可含於 動物體或人體而將組合物投予該個體。 本發明於若干具體例也可描述爲於個體治療腫瘤之方 法。該方法包括獲得一種組合物包含化學治療藥如帕克 鲁 里達瑟爾、杜西達瑟爾或其它紫杉類接合至水溶性聚合 物或螯合劑，及分散於醫藥可接受性溶液，將該溶液以 可有效治療腫瘤用量投予個體。較佳組合物包含帕克里 達瑟爾、杜西達瑟爾或其它紫杉類接合至水溶性聚胺基 酸，包括但非限於聚（1 -天冬胺酸），聚（d -天冬胺酸）， 聚（dl-天冬胺酸），聚（1-離胺酸），聚（d-離胺酸），或聚 (dl-離胺酸），及更佳接合至聚（1-麩胺酸），聚- (d-麩胺 酸），或聚（dl -麩胺酸）。需了解本發明組合物可有效對 14 1255183 抗任何未接合紫杉類已經顯示有效之癌症，包括但非限 於乳癌、卵巢癌、惡性黑素瘤、肺癌、頭頸癌。本發明 組合物也可用於對抗胃癌、攝護腺癌、結腸癌、白血病、 或卡波西氏肉瘤。如此處使用「治療」癌症一詞需了解 表示任何患有腫瘤的個體之醫事處置。該詞包括抑制腫 瘤生長或轉移，或任何嘗試抑制、減慢或阻止腫瘤生長 或轉移。該方法包括藉細胞死亡之非細胞调零程序 (apop t 〇 t i c )以及細胞凋零程序機轉殺死癌細胞。腫瘤治 療方法包括於投予治療藥物前預先使帕克里達瑟爾或杜 西達瑟爾攝取於腫瘤，使用方法包括但非限於大劑量注 射或輸注，以及動脈內、靜脈、腹內或腫瘤內部投予藥 物。 此種方法包括前述任何造影技術，其中帕克里達瑟爾-螯合劑-螯合金屬投予個體並於腫瘤檢測。此步驟提供具 成本效益之方式決定特定腫瘤，因藥物未到達腫瘤而不 期待該種腫瘤對DTPA-帕克里達瑟爾治療無效。預期造影 技術可用於預測對帕克里達瑟爾的反應以及識別可能反 應的病人，可節省重大費用及關鍵時間。假設若無合理 量之化學治療劑沈積於腫瘤，則腫瘤對該藥劑的反應相 當小。 本發明之若干具體例可描述爲獲得個體身體造影之方 法。身體造影之獲得方式係投予有效之放射性金屬離子 螯合至帕克里達瑟爾-螯合劑接合物，並測量放射性金屬 之閃爍攝影信號來得知影像。 本發明也可於某些廣義方面描述爲減少至少一種全身 性自體免疫症狀之方法，包含對患有全身性自體免疫病 15 1255183 病人投予有效量之組合物包含帕克里達瑟爾或杜西達瑟 爾拘侷至聚合物，以聚胺基酸爲較佳，而以聚麩胺酸爲 更佳。特別令人感興趣之揭示內容爲治療類風濕性關節 炎，其已知於某些病例中當投予標準克莫佛配方時，對 帕克里達瑟爾有效（美國專利5，583，1 53，倂述於此以供 參考）。如同治療腫瘤，預測本發明之水溶性紫杉類或紫 杉烷之效果不會因接合至水溶性部分而消失。因此，本 發明之組合物預期對類風濕性關節炎如同帕克里達瑟爾 般有效。帕克里達瑟爾爲抗血管生成劑。類風濕性關節 炎產生新形成的血管積聚而彌爛鄰近關節。也需了解本 發明之紫杉類或紫杉烷組合物可合倂其它藥物使用，例 如血管生成抑制劑（AGM- 1470)(01 iver等人，1994)或其 它腫瘤藥如梅索瑞（methotrexate)。 發現帕克里達瑟爾也可於汽球血管成形術後抑制再狹 窄’指示本發明之水溶性帕克里達瑟爾及杜西達瑟爾可 有多種超出直接腸外投藥的用途（W0 9625176，倂述於此 以供參考）。例如預測水溶性帕克里達瑟爾可用作植入醫 療裝置的塗層，如管路、分流管、導管、人工植入物、 針、電力植入物例如心跳節律器，及特別動脈或靜脈移 植模包括可藉汽球擴張的移植模。此等具體例中，預期 水溶性帕克里達瑟爾可結合至可植入醫療裝置，或另外 水溶性帕克里達瑟爾可被動吸附於可植入裝置表面。例 如移植模可浸泡於聚合物-藥物溶液或噴灑此種溶液，而 塗布以聚合物-藥物接合物。可植入裝置之適當材料包括 生物相同且無毒材料，可選自金屬如鎳-鈦合金、不鏽鋼 或生物相容聚合物、水凝膠類、聚胺基甲酸酯類、聚乙 16 1255183 烯類、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等。較佳具體例中，水溶 性帕克里達瑟爾特別PG-TXL接合物塗布於移植模上用於 汽球血管成形術後***動脈或靜脈內。因此就某些廣義 方面而言，本發明可描述爲一種於血管創傷後抑制動脈 再狹窄或動脈阻塞之方法，包含對有需要之個體投予一 種組合物包含帕克里達瑟爾或杜西達瑟爾接合至聚麩胺 酸或其它水溶性聚胺基酸。該方法之實施用中，個體可 爲冠狀動脈繞道、血管手術、器官移植或冠狀動脈或任 何其它動脈血管成形術病人（舉例），及組合物可直接經 | 靜脈投藥，或甚至塗布於移植模上待植入血管創傷位置。 因此本發明之一具體例爲一種可植入醫藥裝置，其中 該裝置塗布以可有效抑制平滑肌細胞增生的組合物，包 含帕克里達瑟爾或杜西達瑟爾接合至聚麩胺酸或水溶性 聚胺基酸。較佳裝置爲此處所述塗布以本發明組合物之 - 移植模，及於若干較佳具體例中，移植模適合於汽球血 管成形術期間或其後使用，該塗層可有效抑制再狹窄。 若干較佳具體例中，本發明可敘述爲一種組合物包含 聚麩胺酸接合至帕克里達瑟爾、杜西達瑟爾或其它紫杉 擊 類之2'或7羥基或二者；或甚至一種組合物包含水溶性 聚胺基酸接合至帕克里達瑟爾、杜西達瑟爾或其它紫杉 類之厂或7羥基或二者。 如此處使用「聚麩胺酸」一詞包括聚（1 -麩胺酸），聚_ (d-麩胺酸）及聚（dl-麩胺酸），「聚天冬胺酸」一詞包括 聚（1 -天冬胺酸），聚（d -天冬胺酸），聚（d 1 _天冬胺酸）； 「聚離胺酸」一詞包括聚（1-離胺酸），聚（d -離胺酸）， 聚（d卜離胺酸）；及「水溶性聚胺基酸」或「水溶性胺基 17 1255183 酸聚合物」一詞包括但非限於聚麩胺酸，聚天冬酸，聚 離胺酸，及胺基酸鏈包含麩胺酸、天冬酸及/或離胺酸 混合物。若干具體例中，「水溶性聚胺基酸」或「水溶 性胺基酸聚合物」一詞包括胺基酸鏈包含d及/或1異 構物構物之構型之麩胺酸及/或天冬胺酸及/或離胺酸 組合。若干較佳具體例中，此種「水溶性聚胺基酸」含 有一或多種麩胺酸、天冬胺酸及/或離胺酸殘基。此種 「水溶性聚胺基酸」也包含此處所述任何天然、改質或 非尋常胺基酸，只要大半殘基，亦即超過50%殘基，包 含麩胺酸及/或天冬胺酸及/或離胺酸即可。若干具體 例中，含有多於一型不同胺基酸殘基之水溶性胺基酸聚 合物，偶而於此處稱作「共聚物」。 若干具體例中，多種天然、不尋常或化學改質胺基酸 之取代可製作於「水溶性聚胺基酸」或特別「聚麩胺酸」 之胺基酸組合物來產生本發明之紫杉類-聚胺基酸接合 物，且仍然獲得具有類似或期望的溶解度及/或療效特 性。聚胺基酸例如聚麩胺酸，聚天冬胺酸，聚離胺酸， 或水溶性胺基酸鏈或聚合物包含麩胺酸、天冬胺酸及/ 或離胺酸混合物於胺基酸取代範圍之下限可含有約1，約 2，約3，約4 ’約5，約6，約7，約8，約9，約1 〇， 約1 2，約1 3，約1 4，約1 5，約1 6，約1 7，約1 8，約1 9， 約20，約21，約22，約23，約24或約25或更多個麩 胺酸、天冬胺酸或離胺酸殘基由此處所述天然、改質或 不尋常胺基酸取代。本發明之其它方面，聚胺基酸如聚 麩胺酸、聚天冬胺酸、聚離胺酸或包含若干或全部三種 胺基酸之混合物之聚胺基酸鏈於其下限可含有約1%，約 18 1255183 2%，約 3%，約 4%，約 5%，約 6%，約 7%，約 8%， 約 9 %，約 1 〇 %，約 1 1 %，約 12 %，約 13 %，約 14 % , 約 15%，約 16% ’ 約 17%，約 18%，約 19%，約 20%， 約2 1 %，約2 2 % ’約2 3 %，約2 4 %或約2 5 %或以上麩 胺酸、天冬胺酸或離胺酸殘基由任何此處所述天然、改 質或不尋常胺基酸取代。 本發明之另一方面，聚胺基酸例如聚麩胺酸、聚天冬 胺酸或聚離胺酸於胺基酸取代範圍之上限可含有約25 %，約 26%，約 27%，約 28%，約 29%，約 30%，約 31%，約 32%，約 33%，約 34%，約 35%，約 36%， 約 37%，約 38%，約 39%，約 40%，約 41%，約 42% , 約 43%，約 44% ’ 約 45%，約 46% ’ 約 47%，約 48%， 約49%至約約50%左右麩胺酸、天冬胺酸或離胺酸殘基 由此處所述之任一種天然、改質或不尋常胺基酸取代， 只要大半殘基包含麩胺酸及/或天冬胺酸及/或離胺酸 即可。於多種水溶性胺基酸聚合物之胺基酸取代中，以 具有親水性指數爲+1或以上之殘基爲佳。 本發明之某些方面，每個水溶性聚合物接合的抗腫瘤 藥物量可改變。於其下限，此種組合物包含約1%，約2 %，約 3%，約 4%，約 5%，約 6%，約 7%，約 8%， 約 9 % 或約 1 〇 %，約 11 %，約 1 2 %，約 13 % ’ 約 14 %， 約 15%，約 16%，約 17%，約 18%，約 19%，約 20%， 約 21%，約 22%，約 23%，約 24%，至約 25%(w/w)抗 腫瘤藥物相對於接合物質量。於上限，此種組合物包含 約 26%，約 27%，約 28%，約 29%，約 30%，約 31%， 約 32%，約 33%，約 34%，約 35%，約 36%，約 37%， 19 1255183 約38%，約39%，至約40%或以上（w/w)抗腫瘤藥相對 於接合物質量。較佳抗腫瘤藥包含帕克里達瑟爾、杜西 達瑟爾其它紫杉類，及較佳水溶性聚合物包含水溶性胺 基酸聚合物。 本發明之某些其它方面，每分子水溶性聚合物接合的 抗腫瘤藥分子數可改變。於下限，此種組合物包含約1， 約2，約3，約4，約5，約6，約7，約8，約9，約10， 約12，約1 3，約14，約15，約16，約17，約18，約19 至約20或以上個分子抗腫瘤藥/每分子水溶性聚合物。 於上限，此種組合物包含約21，約22，約23，約24， 約25，約26，約27，約28，約29，約30，約3卜約32， 約33，約34，約35，約36，約37，約38，約39，約40， 約41，約42，約43，約44，約45，約46，約47，約48， 約49，約50，約51，約52，約53，約54，約55，約56， 約5 7 ’約5 8，約5 9，約6 0，約6 1，約6 2，約6 3，約6 4， 約65 ’約66，約67，約68，約69，約70，約71，約72， 約73，約74，約75或以上分子或以上抗腫瘤藥/每分 子水溶性聚合物。較佳抗腫瘤藥包括帕克里達瑟爾、杜 西達瑟爾或其它紫杉類，及其較佳水溶性聚合物包括水 溶性胺基酸聚合物。較佳每分子水溶性聚合物接合的抗 腫瘤藥分子束爲約7分子抗腫瘤藥/每分子水溶性聚合 物。 具有各種殘基取代接合至帕克里達瑟爾、杜西達瑟爾 或其他紫杉類之水溶性胺基酸聚合物稱作「生物功能相 當物」。「生物功能相當物」構成接合至紫杉類之「水 溶性聚胺基酸」定義之一部分，且由此處所述檢定分析 20 1255183 以及任何其它業界人士已知之適用檢定分析識別’該等 檢定分析用於測量比較用於生產特定水溶性胺基酸聚合 物-紫杉類組合物的未接合紫杉類具有改良的水中溶解 度。本發明之其它方面，水溶性胺基酸-紫杉類聚合物之 「生物功能相當物」可進一步藉由此處所述檢定分析以 及業界人士已知之任何適用的檢定分析經由測量比較用 於生產特定水溶性胺基酸聚合物-紫杉類組合物的非接合 水溶性胺基酸聚合物之抗腫瘤細胞活性具有改良之抗腫 瘤細胞活性而予識別。此處用於說明本發明之此方面之 「生物功能相當物」容後詳述。 除非另行定義，否則此處使用全部技術及科學術語皆 具有如本發明所屬業界人士一般了解的定義。又如此處 使用，「一」一詞包括「一或多」之定義。雖然任何類似 或相當於此處所述之方法及材料皆可用於實施或測試本 發明，但現在說明較佳方法及材料。 【實施方式】 本發明源自於發現新穎水溶性帕克里達瑟爾及杜西達 瑟爾配方，以及此等配方對活體內腫瘤細胞之出人意外 的活性。以聚（1 -麩胺酸）接合物帕克里達瑟爾（PG-TXL) 投予帶有卵巢癌（OCA-I)之小鼠，比投予相等劑量帕克里 達瑟爾但不含PG者引起顯著延遲腫瘤生長。單獨使用帕 克里達瑟爾或使用自由態帕克里達瑟爾及PG組合處理小 鼠最初顯不腫瘤生長延遲’但於丨〇日後腫瘤再度生長至 可媲美未處理對照組的程度。此外，於PG - TXL接合物之 最大忍受劑量（MTD)( 160毫克當量帕克里達瑟爾/千 克），腫瘤生長完全受抑制，腫瘤萎縮，治療後觀察小鼠 21 1255183 2個月仍然未患腫瘤（MTD):定義爲單次靜脈注射後2周 內可產生15%或以下體重損失的最大劑量）。平行硏究 中，檢視PG-TXL用於患有大鼠乳腺癌（ 1 3 672F)之大鼠之 抗腫瘤活性。再度觀察到於40 - 60毫克當量帕克里達瑟 爾/千克PG-TXL可完全淸除腫瘤。此出入意外的結果驗 證聚合物-藥物接合物PG-TXL於單次靜脈注射後可於小 鼠及大鼠成功地淸除已經相當成長的實體腫瘤。 除了於同質基因小鼠具有顯著抗腫瘤（乳癌、卵巢癌等） 之數據外，PG-TXL用於裸小鼠對抗人乳癌（MDA- 43 5 )及卵 巢癌（SKOV3i pi)之良好活性也觀察得知。裸小鼠爲特殊 動物其免疫系統不完全，因此可生長人體腫瘤。此處所 示數據使發明人歸結PG-TXL爲一種新穎紫杉類物種，其 藥理性質與先前帕克里達瑟爾或紫杉酚製劑不同。例如 PG-TXL於血漿內之分布與自由態帕克里達瑟爾不同。雖 然帕克里達瑟爾停留於小鼠血漿極短時間，但PG-TXL顯 然可停留遠更長時間。預期如此提供腫瘤長期暴露於藥 物’造成反應增強的優點。PG-TXL轉成帕克里達瑟爾之 速率緩慢，注射帕克里達瑟爾-聚合物複合體後48小時 內由放射性標記PG-TXL回收爲放射性帕克里達瑟爾之放 射性低於1%。此項發現提示新穎藥物PG-TXL可以非單 純由於徐緩釋放帕克里達瑟爾本身之方式於腫瘤細胞內 造成死亡。 PG-TXL新穎性之進一步證據爲注射後短時間內腫瘤細 胞內出現相對高放射性來自放射性標記PG-TXL。但腫瘤 細胞內僅有小量放射性係來自自由態帕克里達瑟爾之釋 放。又腫瘤組織內來自帕克里達瑟爾本身之放射活性百 22 1255183 分比隨著時間的經過並無些許增高，再度提示PG-TXL爲 緩慢釋放帕克里達瑟爾之前藥。也於特化人類結腸腺癌 細胞轉移系統硏究PG-TXL相對於帕克里達瑟爾之攝取。 雖然放射性標記PG-TXL關聯的放射性容易進入細胞，但 僅其中10%係來自於自由態帕克里達瑟爾。此等數據與 組織分布硏究所見者相似，再度提示PG-TXL不同於帕克 里達瑟爾，有若干機轉或方式導致癌細胞死亡。 另一項硏究中，發現新鮮製備PG-TXL不會支援帕克里 達瑟爾依賴性細胞系的生長，提示自由態帕克里達瑟爾 僅緩慢由聚合物-帕克里達瑟爾複合體釋放，以及聚合物 -帕克里達瑟爾複合體本身對藥理表現不似「紫杉酚」。 老化可促進PG-TXL的分解，且確實提高所得物質支援帕 克里達瑟爾依賴性細胞生長的能力，但程度比自由態帕 克里達瑟爾更低。 近晚由使用帕克里達瑟爾處理小鼠所得腫瘤細胞分 析，提示如所預期，此種藥物可於腫瘤本身內部形成許 多細胞凋零體。細胞凋零程序爲一種機轉，其中細胞自 行自殺或走上程式規劃的細胞死亡，係有機體用於傷口 癒合及組織重新模式化的自然過程。接受PG-TXL處理小 鼠之腫瘤比自由態帕克里達瑟爾更少細胞凋零體，但腫 瘤壞死及水腫發生率增高，提示帕克里達瑟爾及PG-TXL 可以兩種分別不同路徑導致腫瘤細胞死亡。 此等硏究及特定實例所述硏究驗證PG-TXL爲新穎紫杉 烷，其不僅對乳癌及及卵巢癌極爲具有活性，同時副作 用有限。現已淸楚帕克里達瑟爾之聚合物接合生成一種 化合物（PG-TXL)，其具有新穎且較強之總體抗腫瘤活性。 23 1255183 本發明之另一方面包括聚合物組合物之分子，其可將 治療組合物鎖定在疾病或腫瘤部位或特定器官或組織目 標。多種鎖定目標分子爲業界已知，且可接受物至本發 明之水溶性抗腫瘤組合物。此等分子或化學劑之例包括 但非限於抗體如抗腫瘤抗體；抗細胞受體抗體；組織特 異性異體；激素劑如歐瑞泰（〇 c t r e 〇 t i d e )，***及塔 莫西芬；生長因子；細胞表面受體配基；酶；缺氧作用 劑如密索尼唑（misonidazole)及赤絲硝咪唑 (erythronitroimidazole);及抗血管生成劑。 本發明之另一組成物爲DTPA-帕克里達瑟爾，此處也顯 示於使用B16黑素瘤細胞系進行之試管試驗抗腫瘤強度 檢定分析證實與帕克里達瑟爾同等有效。DTP A -帕克里達 瑟爾於單次注射40毫克/千克體重劑量時，對MCa-4乳 癌之抗腫瘤效果比帕克里達瑟爾並無顯著差異。此外，111 銦標記DPTA -帕克里達瑟爾藉伽瑪閃爍攝影術證實堆積於 MCa-4腫瘤內部，驗證本發明之螯合劑接合抗腫瘤藥爲有 用有效的腫瘤造影劑。 本發明之新穎化合物及方法提供優於先前方法及組合 物之顯著優點，以水溶性帕克里達瑟爾來改良以帕克里 達瑟爾爲基礎之抗癌治療效果，提供水溶性與控制釋放 之帕克里達瑟爾衍生組合物，其亦具有與未修改之帕克 里達瑟爾不同的抗腫瘤性質。此等組合物可免除先前帕 克里達瑟爾組合物副作用之相關溶劑。此外，放射性標 記帕克里達瑟爾顯示保有抗腫瘤活性，也可用於腫瘤造 影。又本發明可藉閃爍攝影、單光子發射電腦斷層掃描 術（SPECT)或正子發射斷層掃描術（PET)決定帕克里達瑟 24 1255183 爾是否被特定腫瘤攝取。此項決定可用於預測抗癌治療 效果。該資訊也有助於指導臨床醫師選擇接受螯合劑-帕 克里達瑟爾治療病人。 帕克里達瑟爾可以多種方式變成水溶性：亦即經由接 合帕克里達瑟爾至水溶性聚合物作爲藥物載劑，及經由 使用水溶性螯合劑衍生抗癌藥物。後述辦法也提供以放 射性核種（例如luIn，9QY，166Ho，68Ga，99mTc )標記用於核造 影及/或放射治療硏究。帕克里達瑟爾、聚乙二醇-帕克 里達瑟爾（PEG -帕克里達瑟爾）、聚麩胺酸-帕克里達瑟爾 接合物（PG-TXL)及二伸乙基三胺五乙酸-帕克里達瑟爾 (DTPA-帕克里達瑟爾）之結構示於第i圖。 本發明之某些具體例中，DTPA _帕克里達瑟爾或其它帕 克里達瑟爾-螯合劑接合物如EDTA-帕克里達瑟爾，DTTP-帕克里達瑟爾或DOTA -帕克里達瑟爾可製備成水溶性鹽 (鈉鹽，鉀鹽，四丁基銨鹽，鈣鹽，鐵鹽等）。此等鹽可 用作腫瘤治療劑。其次，DTPA-帕克里達瑟爾或其它帕克 里達瑟爾螯合劑可用作診斷劑，其當以放射性核種如1 u工n 或9()mTc標記時，可作爲放射性追蹤劑合倂核成像技術檢 測某些腫瘤。需了解除帕克里達瑟爾（紫杉酚TM)及杜西 達瑟爾（紫杉萜）外，其它紫杉烷衍生物可配合用於本發 明組合物及方法，所有此等組合物及方法皆涵蓋於本發 明之範圍。 至於本發明之水溶性聚合物如水溶性聚胺基酸或水溶 性金屬螯合劑結構可進行之修改及變化且仍然獲得具有 類似或所需特性者，此種「生物功能相當物」或「功能 相當物」也涵蓋於本發明之範圍。 25 1255183 例如業界人士了解某些於聚胺基酸結構中某些胺基酸 可以其它胺基酸取代，包括水溶性胺基酸聚合物如聚麩 胺酸、聚天冬胺酸或聚離胺酸，而未可察覺的損失與結 構式例如化學治療藥或抗血管生成藥如帕克里達瑟爾或 杜西達瑟爾等之交互作用結合活性。此外，接合至化學 治療劑及/或抗腫瘤生成劑如帕克里達瑟爾或杜西達瑟 爾等之水溶性聚胺基酸之胺基酸取代範例包括但非限於 PG - TXL，仍可保有此處揭示之部分或全部新穎藥理性質。 由於交互作用活性及蛋白質性質定義蛋白質之生物功能 活性，故可於聚胺基酸序列作出某些胺基酸序列取代， 但仍獲得具有類似（促效）性質的聚胺基酸。如此，發明 人預期於藥物接合物例如但非限於PG-TXL之水溶性聚胺 基酸順序可作種變化而未可察覺地喪失其生物用途或活 性。 就功能相當物而言，業界人士眾所周知「水溶性聚胺 基酸之生物功能相當物」定義中特有的構想爲於部分分 子內作出有限數目改變，而仍獲得具有可接受的相等生 物活性之分子。水溶性聚胺基酸之生物功能相當物如此 於此處定義爲水溶性聚胺基酸，其中某些但非全部胺基 酸可經非水溶性胺基酸包括天然，不尋常或化學改質胺 基酸取代。 特別當考慮長度較短的水溶性聚胺基酸時，預期於特 定肽可作出較小胺基酸。較長領域具有中等變化數目。 如此處所述，最長水溶性聚胺基酸鏈對大量變化的忍受 性最高。當然，具有不同取代之多種不同水溶性聚胺基 酸例如但非限於聚麩胺酸，聚天冬胺酸或聚離胺酸容易 26 1255183 製造且用於本發明。 眾所周知，某些殘基對聚胺基酸之生物或結構性質特 別重要，此等殘基通常不可交換。藉此方式，功能相當 於此處定義爲保有實質量之其天然生物活性的水溶性聚 胺基酸。 胺基酸取代通常係基於胺基酸分支鏈取代基之相對類 似性，例如其疏水性、其親水性、電荷、大小等。分析 胺基酸分支鏈取代基之大小、形狀及類型顯示精胺酸、 離胺酸及組胺酸全部皆爲帶正電荷殘基；丙胺酸、甘胺 酸及絲胺酸全部皆具有類似大小；及苯基丙胺酸、色胺 酸及酪胺酸全部皆具有槪略類似形狀。因此基於此等考 慮重點，精胺酸、離胺酸及組胺酸；丙胺酸、甘胺酸及 絲胺酸；及苯基丙胺酸、色胺酸及酪胺酸；於此處定義 爲生物功能相當物。 爲進行更量化之變化，考慮胺基胺之水路徑指數。各 胺基酸基於其疏水性及電荷特性被指定一個水路徑指數 分別爲；異白胺酸（+4.5);纈胺酸（+4 . 2);白胺酸（+3 . 8); 苯基丙胺酸（+2.8);半胱胺酸/胱胺酸（+2.5);蛋胺酸 ( + 1.9);丙胺酸（ + 1.8);甘胺酸（-0.4);蘇胺酸（-0.7); 絲胺酸（-0.8);色胺酸（-0·9);酪胺酸（-1.3);脯胺酸 (-1 . 6 );組胺酸（-3 · 2 );麩胺酸鹽（-3 . 5 );麩胺（-3 . 5 ); 天冬胺酸鹽（-3 · 5 );天冬醯胺（-3 · 5 );離胺酸（-3 . 9 ); 及精胺酸（-4 . 5 )。 胺基酸之水路徑指數對蛋白質以及對應之聚胺基酸提 供交互作用生物功能之重要性爲業界所知（Kyte & Doolittle，1 982，倂述於此以供參考）。已知某些胺基酸 27 1255183 可取代其它具有類似水路徑指數或分數，而仍然保有類 似生物活性的胺基酸。基於水路徑指數作其它變化時， 以水路徑指數於± 2範圍內之胺基酸取代爲佳，於土 1以 內者爲特佳，及±0.5以內者爲又更特佳。 業界也了解類似胺基酸之取代基於親水性變有效。如 美國專利4,5 54, 1 0 1詳細說明，下列胺基酸之親水性質 如後：精胺酸（+3.0);離胺酸（ + 3.0);天冬胺酸鹽（+3.0 士 1 );麩胺酸鹽（+3 . 0 ± 1 );絲胺酸（+0 · 3);天冬醯胺 (+0.2);麩胺（+0.2);甘胺酸（0);蘇胺酸（-0.4);脯胺 酸（-0.5±1);丙胺酸（-0.5);組胺酸（-0.5);半胱胺酸 (-1 . 0 );蛋胺酸（-1 · 3 );纈胺酸（-1 . 5 );白胺酸（-1 · 8 ); 異白胺酸（-1 · 8 );酪胺酸（-2 · 3 );苯基丙胺酸（-2 . 5 ); 色胺酸（-3 · 4 )。基於類似親水性數値作改變時，以親水 性値於土 2範圍內之胺基酸取代爲佳，以± 1以內者爲特 佳，及以土 0.5以內者爲又更特佳。如此參照親水性，精 胺酸、離胺酸，天冬胺酸及麩胺酸於此處定義爲生物爲 功能相當物，特別用於水溶性麩胺酸聚合物。 除此處所述水溶性聚胺基酸-化學治療劑及/或抗血管 生成藥物化合物，例如帕克里達瑟爾或杜西達瑟爾接合 至水溶性胺基酸等，例如但非限於PG-TXL化合物外，發 明人也意圖含括其它立體性質類似之化合物可調配成模 擬水溶性聚胺基酸結構之關鍵部分。此等化合物定義爲 擬肽素（peptidomimetics)可以本發明之肽之相同方式使 用，因此亦屬功能相當物。 某些模擬物可模擬蛋白質一級結構兀素，述於]〇 h n s η 等人（1993)。使用肽模擬物潛在的理論爲蛋白質之肽主 28 1255183 幹包括聚胺基酸主要可使胺基酸分支鏈定向爲有助於分 子交互作用，例如抗體與抗原的交互作用。如此蛋白質 模擬物設計爲允許產生類似天然分子之分子交互作用。 肽模擬物構想之若干成功用途集中於蛋白質內部之/3 -轉 彎模擬物，其已知具有高度抗原性。同理，多肽內部的 /3 -轉彎結構也可藉此處討論之基於電腦的演算法預測。 一旦該轉彎的成分胺基酸經決定，可構成模擬物而達到 類似胺基酸分支鏈必要元素的類似空間取向。 其它結構相當物或模擬物的產生可藉業界人士已知之 模式化及化學設計技術達成。受體模式化技術爲今曰眾 所周知，藉此此等方法可設計然後合成可結合至水溶性 胺基酸之化學品。需了解所有此等經過立體設計的構成 體皆屬於本發明之範圍。 除了透過遺傳密碼提供的20種「標準」胺基酸外，改 質或不尋常胺基酸也意圖用於本發明。範例改質或不尋 常表提供如後，但非僅限於此。 表1改質及不尋常胺基酸 縮寫 胺基酸 縮寫 胺基酸 Aad 2-胺基己二酸 EtAsn N-乙基天冬醯胺 bAad 3-胺基己二酸 Hyl 羥離胺酸 bAl a /3-丙胺酸，石-胺基丙酸 aHyl 別-羥離胺酸 Abu 2-胺基丁酸 3Hyp 3-羥脯胺酸 4Abu 4-胺基丁酸，六氫吡啶酸 4Hyp 4-羥脯胺酸 29 1255183 表 1 續 表1 5文質及不尋常胺基酸 縮寫 胺 基 酸 縮寫 胺 基 酸 Acp 6-胺基己酸 Ide 異鎖鏈離胺酸 Ahe 2-胺基庚酸 alle 別-異別胺酸 Abi 2-胺基異丁酸 MeGl y N-甲基甘胺酸，肌胺酸 BAib 3-胺基異丁酸 Melle N-甲基異白胺酸 Apm 2-胺基庚二酸 MeLy s 6-N-甲基離胺酸 Dbu 2,4-二胺基丁酸 MeVa 1 甲基纈胺酸 Des 鎖鏈離胺酸(De s mo s i ne) Nva 新穎胺酸 Dpm 2,2’-二胺基庚二酸 Nle 新白胺酸 Dpr 2,3-二胺基丙酸 〇m 鳥胺酸 EtGly N-乙基甘胺酸 DTPA-帕克里達瑟爾之毒性硏究、藥力學及組織分布硏 究顯示於小鼠DPTA-帕克里達瑟爾單劑靜脈注射之 LD5G(50%致死劑量）爲約ι〇〇毫克/千克體重。難以直接 與帕克S達瑟爾比較，原因爲帕克里達瑟爾之溶解度有 限造成劑量-容積限制，以及靜脈注射關聯的媒劑毒性。 但鑑於此處揭示’化學治療業界人士可於人體臨床硏究 決定有效及最大忍受劑量（MTD)。 本發明之若干具體例中，以聚合物-帕克里達瑟爾接合 物塗佈的移植模可用於防止汽球血管成形術後動脈血管 開口的再狹窄。晚近使用可藉汽球膨脹的移植於冠狀血 管成形術之臨床硏究顯示比較標準汽球血管成形術具有 可專利性及再狹窄減少的明顯效果（Serruys等人， 1 9 94 )。根據傷害反應假說，血管內膜新生形成與血管細 30 1255183 胞增生增加有關。目前，一般觀點認爲臨床手術導致血 管損傷造成自發及加速血管粥瘤硬化者爲平滑肌細胞 (SMC )增生。（Ph i 1 1 i p s - Hughe s 及 K 及 a r p a，1 99 6 )。 因動脈受傷後SMC表現型細胞增生類似腫瘤細胞增生， 故抗癌藥物可用於防止血管內膜新生的SMC堆積。塗布 以聚合物鍵聯抗增生劑可長時間以足夠濃度釋放此等藥 劑的移植模可防止血管內膜的過度增植向內生長進內管 腔內部，因而減少再狹窄。 因帕克里達瑟爾顯示可於小鼠模式抑制膠原誘發關節 炎（Oliver等人1994)，故本發明配方也預期可用於治療 自體免疫病及/或發炎病如類風濕性關節炎。帕克里達 瑟爾結合於微管蛋白移動穩定微細管聚合物平衡，因而 使此種藥物阻斷後期G2有絲***階段的細胞而可作爲真 核細胞複製的強力抑制劑。若干機轉涉及受帕克里達瑟 爾抑制的關節炎。例如帕克里達瑟爾之分期特異性細胞 毒性效應可能影響快速增生的發炎細胞，此外帕克里達 瑟爾可抑制細胞有絲***、遷移、趨化性、細胞內輸送 及嗜中性血球產生過氧化氫。此外，帕克里達瑟爾經由 阻斷配價接合內皮細胞遷移而具有抗血管生成活性 (Oliver等人1994)。因此，本發明之水溶性聚胺基酸接 合帕克里達瑟爾可用於治療類風濕性關節炎。此處揭示 之聚合物接合物接合配方也可提供控制釋放藥物及溶解 度增高的優點。配方可注射或直接植入患部關節之關節 療法也構成本發明之一方面。 適合注射用之帕克里達瑟爾或杜西達瑟爾醫藥製劑包 括無菌水溶液或分散液，及製備無菌注射用溶液劑或分 31 1255183 散液之無菌粉劑。各例中，該等劑型必須無菌且須爲流 體可供注射。於製造及儲存條件下必須穩定，且須可保 藏不受微生物如細菌及黴菌的污染，載劑可爲溶劑或分 散介質含有例如水，乙醇，多元醇（如甘油，丙二醇，及 液體聚乙二醇等），其適當混合物及植物油。微生物之預 防可利用多種抗菌及抗黴菌劑例如對羥苯甲酸酯類，氯 丁醇，酚，山梨酸，柳硫汞等。許多例中，較佳含括等 張劑例如糖類或氯化鈉。 無菌注射溶液劑之製法係將活性化合物以需要量於適 當溶劑攙混多種其它前述成分（視需要而定），接著經過 濾滅菌製備。通常分散液之製法係將多種無菌活性成分 攙混於含有基本分散介質之無菌賦形劑，以及前述其它 需要成分。於製備無菌注射溶液劑之無菌粉劑之例，較 佳製法爲真空乾燥及凍乾技術由先前經滅菌過濾之溶液 獲得活性成分加任何其它預定成分之粉末。 如此處使用「醫藥可接受性載劑」一詞包括任何及全 部溶劑、分散介質、塗層、抗菌及抗黴菌劑及等張劑等。 此種介質及藥劑用於醫藥活性物質爲業界眾所周知。除 非任何習知介質或化學劑與活性成分不相容，否則意圖 含括其用於治療組合物。補充用活性成分也可攙混於組 合物。 「醫藥可接受性」一詞表示分子實體及組合物其當投 予動物或人類時，不會造成過敏等非期望反應。呈水性 溶液劑供腸外投藥（舉例），若有所需溶液劑須經適當緩 衝，液體稀釋劑首先使用足量鹽水或葡萄糖調整爲等張 性。此等特定水溶液劑特別適合供靜脈及腹內投藥。就 32 1255183 此方面而言，鑑於本揭示內容。可使用業界人士已知之 無菌水性介質。 含括下列實例驗證本發明之較佳具體例。業界人士了 解後文實例揭示之技術代表本發明發現的可於本發明實 務發揮良好功能的技術。如此視爲構成其實施之較佳模 態。但業界人士鑑於本揭示內容，可於未悖離本發明之 精髓及範圍下對此處揭示之特定具體例作出多種修改， 而仍然獲得相同或類似的結果。 實例1 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG - TXL ) 本例係有關帕克里達瑟爾接合至水溶性聚合物，聚（1 -麩胺酸）（PG)及該製劑對小鼠及大鼠之多種腫瘤的效果。 作爲藥物載劑之水溶性聚合物之可能性已明確建立 (Kopecek， 1990; Maeda 及 Matsumura， 1989)。 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG-TXL)之合成 PG被選用作爲帕克里達瑟爾之載劑，原因爲其易藉溶 小體酶分解，於血漿穩定及含有足量官能基供藥物附接。 若干抗腫瘤藥包括亞利亞黴素（Adriamycin)(Van Hesswijk 等人，1 985; Hose 等人，1 984 )，環磷醯胺 (cyclophosphamide)(Hirano 等人，1979)，作者 Ara-C (Kato 等人，1 984)及梅法蘭（meophalan)(作者 Morimoto 等人，1 987 )曾經接合至PG。但聚天冬胺酸可使用此處對 PG-TXL所述反應計劃接合至抗腫瘤藥。 反應計劃示於第1 B圖。聚（1 -麩胺酸）（PG )鈉鹽係得自 S i gma公司（蒙大拿州，聖路易）。聚合物藉黏度測量具有 分子量36, 200，及藉低角雷射光散射（LALLS)測量具有 33 1255183 數均分子（Mn) 24,000。批次特異性多分散性（Mw/Mn)爲 ’ 1 . 1 5，此處Mw爲重均分子量。pg鈉鹽之（MW34K，S i gma， 〇 · 3 5克）首先於其質子形式轉成pG。pg鈉鹽水溶液之pH 使用Q · 2M HC1調整至2 . 0。收集沈殿，並對蒸餾水透析， 及凍乾獲得Q.29克PG。 於PG(75毫克，重複單位FW170，0.44毫莫耳）於無水 N，N-二甲基甲醯胺（DMF)(1.5毫升）之溶加入22毫克帕克 里達瑟爾（0.026毫莫耳，莫耳比pg/帕克里達瑟爾= 17)，15毫克二環己基甲二醯亞胺（DCC)( 0.073毫莫耳） 及微量二甲基胺基吡D定（DM AP )。帕克里達瑟爾由Η及e Tech(德州，休斯頓）供給，純度藉HPLC檢定分析證實爲 99%或以上。 任反應於室溫進行1 2 - 1 8小時。藉層層析術（TLC，砂 膠）顯示帕克里達瑟爾（Rf= 0.55)完全轉成聚合物接合物 、

= 0，CHCl3/MeOH = 10 : 1)爲了終止反應，將混合物 倒入氯仿。收集所得沈澱及真空腔水，獲得70毫克聚合 物-藥物接合物。經由改變起始物料之帕克里達瑟爾對PG 之重量比’可合成不等帕克里達瑟爾濃度之聚合物接合 鲁 物。 PG - TXL接合物納鹽係經由溶解產物於1 · 碳酸氫鈉獲 得。PG-TXL水溶液對蒸餾水（Mwc〇 10,000)透析去除低分 子量污染及過量碳酸氫鈉鹽。凍乾透析產物獲得98毫克 產物呈白色粉末。此聚合物接合物之帕克里達瑟爾含量 藉紫外光測得爲20-22% (w/w)。產率：98% (轉成聚合物 結合的帕克里達瑟爾，紫外光）。水中溶解度大於20毫 克帕克里達瑟爾/毫升。類似方法單純經由提高帕克里 34 1255183 達瑟爾對PG的用量比可用於合成具較高帕克里達瑟爾含 量（高達35% )之PG-TXL。 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG-TXL)之鑑定 紫外光光譜係使用相同濃度PG水溶液作爲對照，而於 貝克曼（Beckman)DU-70分光光度計獲得。PG-TXL顯示特 徵性帕克里達瑟爾吸收，具有Amax移位由228至230nm。 帕克里達瑟爾於PG-TXL接合物之濃度係基於使用已知濃 度帕克里達瑟爾於甲醇於228nm吸收所得標準曲線估計， 假設聚合物接合於水於230nm及自由態藥物於甲醇於 228nm具有相等莫耳消光，且二者皆遵循藍伯特比爾 (L a m b e r t B e e r )法則。 ^ NMR光譜係使用GE型號GN 500( 500HG)光譜儀於D20 記錄。PG部分及帕克里達瑟爾部分可區別，聚合物接合 至帕克里達瑟爾偶合物光學分割不良，無法以充分準確 度測量。於7.75至7. 36ppm之共振可歸因於帕克里達瑟 爾之芳族成分，M6.38ppm(C1Q-H)，5.97ppm(C13-Η)，5 · 63ppm(C2, - H， d)，5 · 55-5 · 3 6ppm(C3, - Η 及 C2- J,m),5.10ppra(C5-H), 4.39ppra(C7-H), 4.1Oppm(C2〇 - H)，1 .97ppm(OCOCH3)，及 1 · 18-1 .20ppm(C CH3)之共振 嘗試性歸因於帕克里達瑟爾之脂族成分。其它共振因PG 的共振而模糊。PG共振於4,27ppm(H-a)，2.21ppm(H-r )，及2.01ppm(H -占）係根據純PG光譜。但於5.6 3ppm 之峰嘗試歸因於C-21旨之C-2’質子，無取代帕克里達瑟 爾之C-2’質子於4.78ppm也存在，提示所得接合物含有 帕克里達瑟爾取代於C-2,及C-7二位置。接合物之100 毫克/毫升溶液產生淸澈、黏稠但又具有流動性之液體。 35 !255183 此種程序一致產生PG-TXL接合物含有20%重量比帕克里 達瑟爾，亦即各聚合物鏈約接合7帕克里達瑟爾分子。 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（P G - T X L )之凝膠滲透層析術硏究 P G - T X L之相對分子量藉凝膠渗透層析術特徵化。P G C 系統係由兩個LDC型號111泵偶合LDC梯度主機，PL凝 膠GPC管柱，及Waters 990光電二極體陣列檢測器組成。 溶離劑（DMF )之流速爲1 . 〇毫升/分鐘，紫外光檢測設定 於270nm。對PG-TXL鈉鹽，使用適合分析水溶性聚合物 之TKS-凝膠管柱，系統以1.0毫升/分鐘之0.2Mm pbs φ (ΡΗ6.8)溶離。帕克里達瑟爾接合至PG獲得PG-TXL分子 量增高，如停留時間由PG之6.4分鐘移動到至PG-TXL 接合物之5 . 0分鐘可證。粗產物含有小分子量污染物（停 - 留時間8.0至10.0分鐘，及11.3分鐘），其可藉將PG-TXL _ 轉成其鈉鹽有效去除，接著透析。 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG - TXL )接合物之水解分解 爲了了解帕克里達瑟爾及相關分子物種由PG-TXL之釋 放動力學，PG-TXL於各種pH之PBS測試其水解穩定性。 φ 高效液相層析（PHLC)證實PG-TXL於PBS溶液培育可產生 帕克里達瑟爾及若干其它物種包括比帕克里達瑟爾更具 疏水性的物種（代謝產物1 )。此等物種皆衍生自帕克里達 瑟爾係透過使用PG-[3H]TXL進行類似分解硏究證實。基 於其於HPLC之停留時間，代謝產物-1可能爲7-表帕克 里達瑟爾，此乃帕克里達瑟爾之生物活性異構物。事實 上，於PBS回收之代謝產物1之量於pH7 . 4及pH9 . 5分 別培育5日及1日後超過帕克里達瑟爾之回收量（第6 36 1255183 圖）。於PH5.5及pH7.4，代謝產物1之側錄圖指示假零 級動力學，顯示延遲時間由3日（pH 5 . 5 )改變成7小 時（pH 7.4)，提示代謝產1爲一種二級產物。顯然PG-TXL 於酸性溶液比鹼性溶液穩定。 活體內試驗抗腫瘤活性 全部動物硏究皆係於M.D.及er son癌症中心動物機構 根據該機構的指南進行。C3H/Kam小鼠經育種，且維持於 實驗輻射腫瘤科之無致病原機構內。 藉PG-TXL誘發腫瘤生長延遲之情形，係於植入卵巢癌 (0CA-I)之C3Hf/Kam小鼠的***中測量。全部腫瘤皆爲 該種系的同質基因。於雌性C3H/Kam小鼠（ 25 - 30克）之右 大腿肌肉注射5X105鼠卵巢癌細胞（0CA-I)、乳癌（MCa-4)、肝癌（HCa-I)或纖維肉瘤（FSa-II)產生實體腫瘤。平 行硏究中，雌費雪344大鼠（125-150克注射1.0X1 05存 活1 3762F腫瘤細胞於0. 1毫升PBS。當小鼠體內腫瘤生 長至5 00立方毫米（直徑10毫米），或大鼠的腫瘤生長至 2 400立方毫米（平均直徑17毫米）時開始治療。 PG-TXL溶解於鹽水（10毫克當量帕克里達瑟爾/毫 升），及帕克里達瑟爾溶解於克莫佛EL媒劑（6毫克/毫 升）。資料係以腫瘤容積之平均土標準差表示。對照硏究 中，使用鹽水（0.6毫升）克莫佛媒劑〔50/ 50克莫佛/ 乙醇以鹽水稀釋（1 : 4 )〕，PG溶液於鹽水，及帕克里達 瑟爾加PG。PG-TXL及帕克里達瑟爾於正常雌性C3Hf/Kam 小鼠之最大忍受劑量（MTD)估計爲160毫克/千克及80 毫克/千克。單劑PG-TXL於鹽水或帕克里達瑟爾於克莫 佛EL媒劑係以40至160毫克當量帕克里達瑟爾/千克 37 1255183 體重之劑量投藥。每日測量三個正交腫瘤直徑而決定腫 瘤生長情況（第7A，7B，7C，7D及7E圖）。腫瘤容積係 根據式（AXBXC)/2計算。小鼠之絕對生長延遲（AGD)定 義爲使用各種藥物治療的腫瘤由500立方毫米生長至 2，000立方毫米之日數減使用鹽水對照處理小鼠的腫瘤由 500立方毫米生長至2, 000立方毫米之日數。當腫瘤大小 達2000立方毫米時求出腫瘤生長延遲；腫瘤約2500立 方毫米時犧牲小鼠。PG-TXL組爲（n= 6及7)，其它各組 爲（η二5)。表2摘述PG-帕克里達瑟爾用於大鼠之急性 毒性，且與帕克里達瑟爾/克莫佛比較。表3摘述有關 PG-TXL對小鼠MCa-4, FSa-II及HCa-I腫瘤的效果資料。 結果也摘述於第7A至7E圖。 表2 PG-TXL用於費雪大鼠之急性毒性。

組 別 劑量(毫克 /千克） 中毒死亡 頭數 體重損失 ,% 患病時間 (日數） 全痊癒時間 (日數） PG-TXL3 60 1/4 15.7 7 14 PG-TXL3 40 0/4 11.1 6 11 帕克里達瑟爾b 60 1/4 16.7 6 15 帕克里達瑟爾b 40 0/3 17.9 6 16 帕克里達瑟爾b 20 0/5 17.0 5 N/A 藥物係以單次靜脈注射投予帶有1 3 7 6 2 F腫瘤之費雪大 鼠雌鼠，1 3 0克） G-TXL溶液係將接合物溶解於鹽水製備（8毫克當量帕 克里達瑟爾/毫升）。於60毫克/千克之注射容積爲 每頭大鼠0.975毫升。 38 1255183 帕克里達瑟爾克莫佛溶液係將帕克里達瑟爾溶解於乙 醇及克莫佛之1 : 1混合物製備（30毫克/毫升）。此 備用溶液進一步於注射前以鹽水稀釋（1 : 4 )。帕克里 達瑟爾於溶液之終濃度爲6毫克/毫升。於60毫克 /千克之注射容積爲每頭大鼠1.3毫升。 PG溶液係將聚合物溶解於鹽水製備（22毫克/毫升）。 注射劑量爲0.3克/千克（每頭大鼠1 . 8毫升），相當 於帕克里達瑟爾劑量60毫克/千克。 克莫佛媒劑之製備係以以鹽水稀釋乙醇及克莫佛（1 : 1 ) 混合物（1 : 4)。

39 1255183 表3 : PG-TXL對活體內試驗各型鼠腫瘤之抗腫瘤效果 腫瘤 藥 物a 生長 500-2000 AGDC Τ-試驗d 立方毫米時間b Mca-4 鹽水 4· 8±0·8(5) - - PG(0.6克/千克） 9·3±1·4(4) 4.5 0.0114 克莫佛賦形劑 6.1±0·7(5) 1.3 0.265 PG-TXL(40毫克/千克） 8.6±1 ·2(4) 3.8 0.026 PG-TXL(60毫克/千克） 14·2±1·1(5) 9.4 0.0001 PG-TXL(120毫克/千克） 44.4±2.9(5) 39.6 <0.0001 帕克里達瑟爾(40毫克/千克） 9.0±0.6(4) 4.2 0.0044 帕克里達瑟爾(60毫克/千克） 9·3±0·3(5) 4.5 0.0006 Fsa-II 鹽水 1.9±0.1(5) - - PG(0,8克/千克） 2·8±0·2(6) 0.9 0.0043 克莫佛賦形劑 2.2±0.2(6) 0.3 0.122 PG-TXL(80毫克/千克） 3·8±0·4(6) 1.9 0.0016 PG-TXL(160毫克/千克） 5·1±0.3(13) 3.2 <0.0001 帕克里達瑟爾(80毫克/千克） 4·2±0·3(6) 2.3 0.0002 PG+帕克里達瑟爾 3·0±0·2(6) 1.1 0.0008 Hca-I 鹽水 7·3±0·3(5) - - PG(0.8克/千克） 7·7±0·4(4) 0.4 0.417 克莫佛賦形劑 6·8±0.8(5) -0.5 0.539 PG-TXL(40毫克/千克） 8.2±0.7(5) 0.9 0.21 PG-TXL(80毫克/千克） 8.6±0.2(5) 1.3 0.00 PG-TXL(160毫克/千克） 11.0±0·8(4) 3.7 0.00 帕克里達瑟爾(80毫克/千克） 6.4±0.5(5) -0.9 0.13 PG+帕克里達瑟爾 6.7±0.4(5) -0.9 0.29

右腿帶有500立方毫米腫瘤之小鼠使用單次靜脈注 射各種劑量PG-TXL( 40 - 1 60毫克當量帕克里達瑟爾 /千克）於鹽水或帕克里達瑟爾於克莫佛賦形劑。 40 1255183 對照動物係以鹽水（〇 . 6毫升），克莫佛賦形劑（Ο . 5 毫升），PG於鹽水溶液，或PG加帕克里達瑟爾（80 毫克/千克）處理。 b腫瘤生長係以卡規每日測量三個正交直徑測定，並 以（A X B X C )/ 2計算容積。顯示各組使用的小鼠頭 數。由50 0立方毫米生長至2000立方毫米之時間（日 數）係以平均土標準差表示。 e絕對生長延遲（AGD)定義爲使用各種藥物處理腫瘤 由500生長至2000立方毫米之時間日數減使用鹽 水對照處理腫瘤由500生長至2000立方毫米之時 間曰數。 d由500生長至2000立方毫米之日數時間使用學生 t -試驗對治療組及鹽水組進行比較。P値爲雙邊， 且當P値小於至等於0 . 0 5時視爲有意義。 由此等硏究獲得兩大發現。第一，類似帕克里達瑟爾， 水溶性PG-TXL之抗腫瘤效果於各種腫瘤間有變化。PG-TXL對MCa-4及0CA-1腫瘤最有效。第二，以相等毫克 帕克里達瑟爾爲基準，PG-TXL用於MCa-4, HCa - I及OCA - 1 腫瘤之案例中比帕克里達瑟爾更有效，且最大忍受劑量 (MTD)顯著更高。 平行硏究中，檢視PG-TXL用於患有已經確定大鼠乳 腺癌1 3 762F之費雪大鼠之抗腫瘤活性。雌性費雪344 大鼠（ 1 25 - 1 50克）注射1.ΟΧΙΟ5活1 3762F腫瘤細胞於 0.1毫升PBS。一旦腫瘤到達平均容積2000立方毫米（平 均直徑1.6厘米），動物使用前述類似方案處理。每曰 測量三個正交腫瘤直徑測定腫瘤生長。腫瘤容積根據式 41 1255183 (AXBXO/2計算。單齊丨J PG-TXL於鹽水或帕克里達瑟 爾於克莫佛EL賦形劑以20至60毫克當量帕克里達瑟 爾/千克體重之不等劑量投藥。於對照硏究則使用鹽 水，克莫佛EL賦形劑〔50/ 5 0克莫佛/乙醇以鹽水稀 釋（1 : 4 )〕，PG溶液於鹽水及帕克里達瑟爾加PG。再 度觀察於PG-TXL之MTD(60毫克當量帕克里達瑟爾/千 克）腫瘤完全淸除。給予較低劑量40毫克當量帕克里達 瑟爾/千克PG-TXL也獲得腫瘤完全退行（第7B圖）。相 反地，帕克里達瑟爾於克莫佛EL之MTD小於20毫克/ 千克。於此劑量之帕克里達瑟爾引起腫瘤生長延遲（腫 瘤生長延遲定義爲使用試驗藥物腫瘤由2, 000立方毫米 生長至1 0,000立方毫米之時間日數減使用鹽水對照處 理腫瘤由2,000立方毫米生長至1 0,000立方毫米之時 間曰數）僅5日，而相當帕克里達瑟爾劑量之PG-TXL 可獲得腫瘤生長延遲23日（第7B圖）。注射人乳癌且使 用PG-TXL處理之裸鼠硏究 裸鼠接受 2X106 MDA-435-Lung2 細胞（MDA-MB- 432 人 乳癌細胞系變異株）注射於***脂肪墊。腫瘤達到5毫 米平均直徑（腫瘤注射後27日）時，小鼠接受靜脈注射 PG-TXL或各種對照處理（參考表4)。每周測量腫瘤。生 長至1 · 5厘米的腫瘤以手術去除。全部小鼠皆於1 2 0曰 時犧牲，移出其餘腫瘤並稱重。檢視小鼠之轉移情況， 肺臟作用組織學硏究，且對器官之單一剖面評分是否存 在有顯微轉移腫瘤。 42 表4 處理 取腫瘤a 平均腫瘤 重量（克）b 退行腫 瘤數e 肺臟轉移d PBS 5/6 1 .3土0.24 4/5(80% ) 克莫佛 9/9 1 ·26±0.67 - 4/8(50% ) PGA 10/10 1·13±0·7 - 4/7(57% ) 紫杉酚/克莫 10/10 1 ·31±0.69 - 3/7(42% ) 氟60毫克/千克 PG-TXL 60 毫 10/10 1·23±0·38 2/10 5/8(62 · 5% )克/千 克 PG-TXL 120 毫 9/10 0·925±0·12 4/8 1/4(25%) 克/千克 1255183 a治療時帶有5毫米腫瘤之小鼠頭數/注射小鼠頭數 b屍體解剖時取出之腫瘤平均重量 e屍體解剖時已經退行的腫瘤數 d帶有肺臟轉移之小鼠頭數（巨觀所見或組織學製備發現） /患腫瘤小鼠頭數。本攔之取得腫瘤及患腫瘤小鼠頭數 間的若干矛盾係由於小鼠因非相關理由被犧牲或死亡， 例如出現葡萄球菌性膿痕。PG-TXL 120毫克組有一頭小 鼠由於處理後體重減輕過多故犧牲；否則其它並無顯著 與治療相關的死亡。裸鼠無法忍受160毫克/千克當量 PG-TXL。 由單次大劑量給予PG -接合帕克里達瑟爾（PG-TXL)硏究 結果’於藥物相當於120毫克/千克帕克里達瑟爾時，顯 然MD A - 4 3 5腫瘤細胞系對藥物有反應，此種藥物配方比克 莫佛作爲媒劑時忍受度更佳。 43 1255183 使用MDA-MB- 43 5之乳癌硏究中，僅較高劑量之pg-TXL 可抑制***脂肪墊腫瘤生長速率。由生長曲線顯然易知單 次注射接合物後約30日腫瘤恢復生長。但生長曲線並未 顯示於PG-TXL 120毫克/千克組其中有許多腫瘤退行。 如表3所示，殘留腫瘤小鼠之肺轉移發生率也減低。雖 然硏究中之小鼠頭數少，但未提示該治療可有效減少局部 腫瘤生長及轉移的發生率。 本硏究設計無法區別轉移發生率降低係由於原發部位 之腫瘤質量減小，或由於對治療時已經建立的任何顯微轉 移的直接作用。 使用多次注射PG-TXL於活體內試驗治療人類乳癌 爲了試驗多次注射PG-TXL的效果，裸小鼠注射2X106 MDA· 43 5-Lung 2細胞（MDA-MB-435人類乳癌細胞系變異株 至***脂肪墊。腫瘤達平均5毫米直徑時開始治療，且 以14日間隔（24，38，52日）重複共注射3次。每周測 量腫瘤。小鼠於注射腫瘤細胞後第1 05日殺死，記錄腫瘤 重量及轉移發生率。肺臟作組織學處理，單次剖面記錄是 否存在有顯微轉移。結果示於表5。 表5 處理 取得腫瘤a 平均重量（克）b 腫瘤退行c 轉移d Μ 4/5 1.83土0· 15 4/4(100% ) PG對照 6/10 1.7土0.11 - 5/6(83% ) PG-TXL/ 7/10 1 ·36±0.28 - 6/7(86% ) 60毫克 PG-TXL/ 8/10 0·97±0·22 2/8 2/6(33%) 120毫克 -O.Olle 44 1255183 註·· a治療時帶有5毫米腫瘤之小鼠頭數/注射小鼠頭數 b腫瘤平均重量（土標準差） e屍體解剖時腫瘤退行數目 d巨觀或微觀帶有肺轉移小鼠頭數/腫瘤小鼠頭數 e非成對t試驗比較處理小鼠及對照pg組腫瘤重量 所得P値。 使用PG-TXL接合物於活體內試驗治療人卵巢癌 裸鼠腹內注射人卵巢癌細胞系SK0V3ipl。腫瘤注射後5 曰，小鼠靜脈注射濃度相當於120毫克/千克或160毫 克/千克帕克里達瑟爾之PG-帕克里達瑟爾（PG-TXL)最初 計劃以7日間隔重複注射，但單次注射160毫克/千克 劑量殺死1 0頭小鼠中的5頭。故僅有1 20毫克/千克組 接受三劑注射。硏究於第98日終止，並殺死任何存活小 鼠。結果不於第14圖及表6。 各組之存活中間値爲：未處理=47曰，PG對照=43日， PG-TXL(120 毫克 / 千克）=83 日，PG-TXL(160 毫克 / 千 克）=8 3日〔注射此非包括因藥物初始毒性死亡的小鼠〕。 表6 處理 取得腫瘤a 存活中間値（範圍）b 腹水e ....... ....—--- 平均容積（毫升）d ^frrp 無 1010 56(38-98) 8/10 2·2±1.6 PG對照 8/9 45(39-98) 8/8 2·2±1·6 PG-120 7/8 82(59-98) 3/7 2·7±1.4 PG-120 3/5c 84(34-98) 0/3 - 註：； a腫瘤發生率/注射小鼠頭數 存活時間中間値，曰數 45 1255183 e腹水發生率/帶腫瘤之小鼠頭數 d腹水平均容積（及標準差） e僅接受單劑PG-帕克里達瑟爾160毫克/千克之 小鼠而不包括於治療5日內死亡的小鼠。 f於第34日殺死的小鼠極少帶有腫瘤但下身痲痺 (可能毒性？）。 PG-TXL 120毫克/千克比較單獨注射PG的小鼠可顯 著延長帶有腹內SKOV3 1 pi (人卵巢癌細胞系其過度表現 HER2/neu)小鼠的存活時間。多劑及/或提高接合物劑 量除了延長存活時間外，也可顯著減少腫瘤發生。 前述裸鼠硏究中，生長曲線顯示雖然乳癌的生長僅藉 帕克里達瑟爾檢驗，特別使用較高劑量接合PG檢驗， 但治療後約1個月腫瘤大小仍持續加大。第二（或第三） 回合治療可使腫瘤生長變成平台狀態，或使更多腫瘤退 行。生長曲線不包括已經退行的腫瘤，如表4所示， 使用最高劑量PG-TXL處理小鼠之50%腫瘤收縮/消 失，其中4頭於硏究結束時帶有漸進生長的腫瘤，僅 有一頭於肺臟有顯微轉移。故該處理可減少原發腫瘤的 生長，也降低轉移發生。其它各治療組包括克莫佛及PG 對照組之轉移發生率皆低於PBS對照組，故無法陳述紫 杉酚/克莫佛組之轉移發生率降低爲一項有意義的發 現。 實例2 DTPA-帕克里達瑟爾 DTPA-帕克里達瑟爾之合成： 於帕克里達瑟爾（100毫克，0.117毫莫耳）於無水 46 1255183 DMF ( 2 . 2毫升）之溶液於〇 °C加入二伸乙基三胺五乙酐 (DTPAA) (210毫克，0.585毫莫耳）。反應混合物於4°C 攪拌隔夜。懸浮液經過濾（〇 · 2微米密利波（Μ 1 1 1 1 p〇 r e ) 濾膜）去除未反應之DTPA酐。濾液傾注於蒸餾水，於4 。(：攪拌2 0分鐘及收集沈澱。粗產物於C i 8矽膠板藉製備 性TLC純化，及於乙腈/水U : 1 )展開。帕克里達瑟爾 具有1値0.3 4。帕克里達瑟爾上方具有I値〇·65至0.75 之帶藉刮下取出，以乙腈/水（1 : 1 )混合物溶離，去除 溶劑獲得1 5毫克DTPA -帕克里達瑟爾呈產物（產率10.4 % ) : mp : >22 6°C分解。紫外光譜（鈉鹽於水）顯示最大 吸收於228nm，其亦爲帕克里達瑟爾之特徵。質譜： (FAB)m/e 1229(M+H)+ ，1251(M+Na)， 1267(M+K)。沱 NMR 譜（DMSO-d6)中，DTPA 之 NCH2CH2N 及 CH2COOH 共振出現 爲複合系列信號於5 2. 71-2. 96ppm及呈多峰於5 3.42ppm。於4.10ppm之C7-H之共振於帕克里達瑟爾移 至5 . 5 1 ppm，提示7 -位置酯化。光譜其餘部分符合帕克 里達瑟爾光譜。 DTPA-帕克里達瑟爾之鈉鹽之獲得方式係將DTPA-帕 克里達瑟爾於乙醇溶液加入等量0.0 5M碳酸氫鈉，接著 凍乾獲得水溶性固體粉末（溶解度>120毫克當量帕克里 達瑟爾/毫升）。 DTPA-帕克里達瑟爾之水解安定性： DTPA-帕克里達瑟爾之水解安定性係於加速條件下硏 究。簡言之，1毫克DTPA-帕克里達瑟爾溶解於1毫 升0.5M碳酸氫鈉水溶液（pH9.3)及藉PHLC分析。PHLC 系統係由Waters 15〇x3.9(內徑）毫米Nova-Pak管柱塡 47 1255183 裝（]184微米石夕膠，？01：]^1141[]^1*等角1^栗，？£^1$〇11 900系列介面，Spectra-Physic s UV/Vis檢測器及資料 站組成。溶離劑（乙腈/甲醇/ 0 . 02M乙酸銨=4 : 1 : 5)以1.0毫升/分鐘於228nm使用紫外光檢測進行。 DTP A -帕克里達瑟爾及帕克里達瑟爾之停留時間分別爲 1.38及8.83分鐘。峰面積經量化，且與標準曲線比較 來決定DTPA-帕克里達瑟爾於0.5M碳酸氫鈉溶液之半 生期估値於室溫爲約16日。DTPA-帕克里達瑟爾用於試 管試驗對B1 6小鼠黑素瘤生長的效果： 細胞以2 . 5 X 1 04細胞/毫升播種於24孔平板，及於 50: 50杜別克（Dublecco)改質最低必需培養基（DEM)及 F1 2培養基含有10%小牛血淸於37°C於97%潮濕5.5% 二氧化碳氣氛下培育24小時。然後培養基以新鮮培養 基含帕克里達瑟爾或DTPA-帕克里達瑟爾濃度於5X109 Μ至75 X 1 Ο9 Μ之範圍替代。40小時細胞利用胰蛋白18. 分解釋放，且於庫特（Couol ter )計數器計算數目。 DMS0(用於溶解帕克里達瑟爾）及0.05M碳酸氫鈉溶液 (用於溶解DTP A -帕克里達瑟爾）於細胞培養基之終濃度 低於0 · 0 1 %。此種溶解量藉對照硏究測定對細胞生長 不造成影響。 DTPA-帕克里達瑟爾對B16黑素瘤細胞生長的影響示 於第2圖。以不等濃度培養40小時後，就細胞毒性比 較DTPA-帕克里達瑟爾及帕克里達瑟爾。帕克里達瑟爾 及DTPA-帕克里達瑟爾之ic5G分別爲15nM及7.5nM。對 乳癌MCa-4腫瘤模組之抗腫瘤效果： 雌性C3Hf/Kam小鼠於右大腿肌肉（5X105細胞/小鼠） 48 1255183 接種乳癌（MCa - 4 )。腫瘤生長至8毫米（約2周）時， 以10、20及40毫克當量帕克里達瑟爾/〒克體重投予 單劑帕克里達瑟爾或DTPA -帕克里達瑟爾。對照硏究使 用鹽水及以鹽水稀釋的絕對醇/克莫佛5 0 / 50 ( 1 : 4 )。 每曰測量三個正交腫瘤直徑而決定腫瘤的生長。腫瘤直 徑達12毫米時，計算腫瘤生長延遲。腫瘤約15毫米時 犧牲小鼠。腫瘤生長曲線示於第3圖。比較對照，帕 克里達瑟爾及DTPA-帕克里達瑟爾於40毫克/千克劑 量皆顯示抗腫瘤效果。也分析資料決定腫瘤直徑1 2毫 米之平均日數。統計分析顯示DTPA -帕克里達瑟爾比鹽 水處理對照於40毫克/千克劑量可顯著延遲腫瘤生長 (p<0.01 )。腫瘤生長達直徑1 2毫米之平均時間對DTPA-帕克里達瑟爾爲12.1日，比較帕克里達瑟爾爲9.4日（第 4圖）。 使用111 I η對DTP A -帕克里達瑟爾作放射性標記 2毫升之V字形小瓶內循序加入40微升〇 . 6M乙酸 鈉（PH5.3)緩衝液，40微升0.06M檸檬酸鈉緩衝液 (pH5 . 5)，20微升DTPA-帕克里達瑟爾溶液於乙醇（2% w/v)，及20微升lllInCl3溶液（l.OmCi)於乙酸鈉緩衝 液（？们.5)。於室溫培育30分鐘後，經標記的111111-DTPA-帕克里達瑟爾藉通過C18 Sep-Pac卡匣使用鹽水 隨後使用乙醇作動相純化。藉鹽水移出游離111!^-DTPA(<3% )，同時收集111 In-DTPA-帕克里達瑟爾於乙 醇洗液。乙醇於氮氣下蒸發’經標記產物於鹽水中重構。 放射化學產率：84%。 min-DTPA-帕克里達瑟爾之分析： 49 1255183 HPLC用於分析反應混合物及^In-DTPA-帕克里達瑟 爾純度。系統係由 LDC二元泵，100 X 8 . 0毫米（內 徑）Waters柱塡裝ODS 5微米矽膠組成。管柱以1毫 升/分鐘流速使用水及甲醇之梯度混合物（經1 5分鐘由 0%至85%甲醇梯度）溶離。梯度系統使用碘化鈉晶體 檢測器及Spec t ra-Phy s 1 cs UV/ Vi s檢測器監控。由PHLC 分析可證藉Sep-Pak卡匣純化可去除大半luIn-DTPA， 其停留時間爲2.7分鐘。min-DTPA可能衍生自DTPA-帕克里達瑟爾中之微量DTPA污染物。M1In-DTPA-帕克 里達瑟爾之放射性層析圖與其紫外光層析圖之交互關係 指出於1 2 . 3分鐘之峰値確實爲目標化合物。於相同層 析條件下，帕克里達瑟爾之停留時間爲1 7 . 1分鐘。最 終製劑之放射性化學純度藉HPLC分析測得爲90%。 全體閃燦攝影術= 雌性C3Hf/Kam小鼠於右大腿肌肉接種乳癌（MCa-4)(5 X 1 05細胞）。腫瘤生長至直徑1 2毫米時，將小鼠分成 兩組。第I組小鼠藉腹內注射戊基巴比妥鈉麻醉，接 著經尾靜脈注射 ulIn-DTPA-帕克里達瑟爾（100-2 0 0mC i )。配備有中能準直儀的7 -攝影機安置於小鼠（每 組3頭）。於注射後5，30，60，120，240分鐘及24 小時收集每5分鐘之數據。第I I組遵循相同程序’但 小鼠注射luIn-DTPA作爲對照。第5圖顯示注射 min-DTPA及luIn-DTPA-帕克里達瑟爾小鼠之伽瑪閃爍 相片。luIn-DTPA之特徵爲由血漿快速廓淸，於尿中快 速高度***，於腎臟停留時間極短’於腫瘤、肝臟、腸 及其它器官或身體部分的停留時間可忽略。相反地， 50 1255183 lilIn-DTPA-帕克里達瑟爾具有類似帕克里達瑟爾之藥理 輪廓圖（Ei seman等人，1 994 )。腦部之放射性可忽略。 肝及腎具有最大組織：血漿比。放射性標記DTP A -帕克 里達瑟爾或其代謝產物之肝膽分泌爲藥物由血中廓淸的 主要的途徑之一。不似帕克里達瑟爾。顯著量之1111 η -DTP A -帕克里達瑟爾也經由腎臟分泌，腎臟於帕克里達 瑟爾之廓淸上面顯示次要角色。腫瘤顯著攝取 ulIn-DTPA-帕克里達瑟爾。結果驗證奨 In-DTPA-帕克里達瑟 爾可檢測某些腫瘤及定量111 In-DTPA-帕克里達瑟爾於 | 腫瘤的攝取，而其又有助於選擇接受帕克里達瑟爾治療 病人。相反地，較小的PG-TXL接合物具有與DTPA-帕克 里達瑟爾不同的分布部分局限於試驗動物肝臟及腫瘤。 實例3 聚乙二醇-帕克里達瑟爾 · 聚乙二醇-帕克里達瑟爾（PEG-帕克里達瑟爾）之合成 合成係以二步驟完成。首先根據報告程序製備2 ’ - 丁 二醯基-帕克里達瑟爾（Deutsch等人，1989)。帕克里達 瑟爾（200毫克，0.23毫莫耳）及丁二酐（288毫克。2.22 # 毫莫耳）於無水吡啶（6毫升）於室溫反應3小時。然後 蒸發去除啦啶，及殘餘物以水處理，攪拌2 0分鐘及過 濾。沈殿溶解於丙酮，緩慢加水，及收集細小晶體獲得 180毫克2、丁二醯基-帕克里達瑟爾。pEG_帕克里達瑟 爾係藉N -乙氧羰基-2-乙氧- i，2 -二氫喹啉（EEDQ)媒介的 偶合反應合成。2，-丁二醯基-帕克里達瑟爾（160毫克， 0.18毫旲耳）及甲氧聚氧伸乙基胺（pEG_NH2 , MW5〇〇〇，9〇〇 毫克’ 〇·18毫莫耳）於二氯甲烷之溶液內加入EEDq(180 51 1255183 毫克，Ο .72毫莫耳）。反應混合物於室溫攪拌4小時。 粗產物於矽膠層析，使用乙酸乙酯接著藉氯仿-甲醇 (10 : 1)溶離。獲得3 50毫克產物。1H NMR譜（CDC13) 5 2.76(m, 丁 二酸， C0CH2CH2C02) ’ 5 3.63(PEG，〇CH2CH20)，（54.42(C7-H)及 55.51(C2’-H)。 最大紫外光吸收係於288nm，其亦爲帕克里達瑟爾之特 徵。附著於PEG大爲改良帕克里達瑟爾之水中溶解度（>20 毫克當量帕克里達瑟爾/毫升水）。 PEG -帕克里達瑟爾拉之水解安定性 PEG-帕克里達瑟爾以0.4mM濃度溶解於各種pH之磷 酸鹽緩衝液（0.01M)，溶液以溫和振搖於37°C培育。於 選定的時間間隔取出整分（ 200微升）及凍乾。所得乾粉 再度溶解於二氯甲烷接受凝膠滲透層析術（GPC分析）。 PGC系統係由 Perkin-Elmer PL凝膠混合床管柱， Perkin-Elmer 等 LC 栗，PE Nelson 900 系列介面， Spectra-Physics UV/Vis檢汾器及資料站組成。溶離劑 (二氯甲烷）係以1 · 0毫克/分鐘流過。紫外光檢測器設 定於228nm。PEG-帕克里達瑟爾及帕克里達瑟爾之停留 時間分別爲6 . 1及8 · 2分鐘。定量峰面積及計算剩餘PEG -帕克里達瑟爾百分率及釋放帕克里達瑟爾百分率。於 PH7 · 4藉線性最小平方測得PEG -帕克里達瑟爾半生期爲 54分鐘。於ρΗ9·0之半生期爲7.6分鐘。於PH7.4帕克 里達瑟爾由PEG-帕克里達瑟爾之釋放側錄圖顯示於第8 圖。 於試管試驗使用B16小鼠黑素瘤細胞進行PEG_帕克里 達瑟爾之細胞毒性硏究。 52 1255183 遵照使用DTPA -帕克里達瑟爾之細胞毒性硏究所述程 序，黑素瘤細胞以2 . 5 X 1 04細胞/毫升濃度播種於24 孔平板，及於5 0 : 5 0杜別克改質最低必需培養（DME )及 F12培養基含10%小牛血淸於37t於97%濕化5.5%二 氧化碳氣氛生長24小時。然後培養基以新鮮培養基含 帕克里達瑟爾或其衍生物濃度於5X109M至7 5 X 1 0 9M之 範圍替代。40小時後，細胞藉胰蛋白18.分解釋放並於庫 特計數器計算數目。DMSO(用於溶解帕克里達瑟爾）及 0.05M碳酸氫鈉溶液（用於溶解PEG-帕克里達瑟爾）於細 胞培養基之終濃度低於0 . 0 1 %。此種溶劑量藉對照硏究 決定對細胞生長無影響。此外，PEG於使用濃度範圍產 生帕克里達瑟爾當量濃度由5Χ1(Γ9Μ至75Χ10·9Μ至也 不影響細胞增生。 PEG-帕克里達瑟爾用於小鼠對MCa-4腫瘤之抗腫瘤效果 爲了評估PEG -帕克里達瑟爾對實體***腫瘤的抗腫瘤 效果，MCa-細胞（5 X 105細胞）注射於雌（C3Hf/Kam小鼠 之右大腿肌肉。如實例1以DTPA-帕克里達瑟爾所述， 當腫瘤生長至8毫米（約2周）時，以10、20及40毫 克當量帕克里達瑟爾/千克體重注射單劑帕克里達瑟爾 或PEG-帕克里達瑟爾。帕克里達瑟爾最初溶解於含等量 容積克莫佛之絕對乙醇。此備用溶液進一步以無菌生理 鹽水於注射的1 5分鐘以內稀釋（1 : 4容積比）。PEG-帕 克里達瑟爾溶解於鹽水（6毫克當量帕克里達瑟爾/毫 升），及經無菌濾膜（密利玻，4 . 5微米）過濾。鹽水、帕 克里達瑟爾媒劑、絕對醇：克莫佛（1 : 1 )以鹽水（1 : 4 ) 稀釋，及PEG溶液於鹽水（ 600毫克/千克體重）用於對 53 1255183 照硏究。每日測量三根正交腫瘤直徑決定腫瘤生長。當 腫瘤大小達直徑1 2毫米時，計算腫瘤生長延遲。 腫瘤生長曲線顯示於第9圖。於4 0毫克/千克劑量， PEG -帕克里達瑟爾及帕克里達瑟爾皆可有效延遲腫瘤生 長。帕克里達瑟爾比PEG-帕克里達瑟爾更有效，但差異 不具有統計學意義。帕克里達瑟爾處理腫瘤需9.4曰才 能達到12毫米直徑，而PEG-帕克里達瑟爾處理腫瘤需 要8.5日。統計學上此等數値比較其對應之對照組有意 義（p>0 · 0 5 )，其對照組對帕克里達瑟爾媒劑爲6 . 7曰， 及PEG鹽水爲6 . 5日（第4圖）。 實例5 聚（1 -麩胺酸）-帕克里達瑟爾（PG-TXL)及帕克里達瑟爾 藥理性質 本硏究目標係比較PG - TXL及帕克里達瑟爾於試管試 驗促進微管蛋白組合，對大鼠***腫瘤細胞系1 3762F 及人***腫瘤細胞系抑制腫瘤細胞生長，誘發p53蛋白 質，及挽救帕克里達瑟爾相關性突變細胞系等藥理性 質。帕克里達瑟爾於活體內由PG-TXL釋放，經測量而 決定PG-TXL之作用機轉是否係歸因於自由態帕克里達 瑟爾。 使用聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG - TXL )及帕克里達瑟爾 進行微細管聚合 爲了測試完整PG-TXL對促進微管蛋白聚合是否具有 生物活性，比較帕克里達瑟爾，PG-TXL，及「老化」PG-TXL 於試管試驗中促進經純化之牛腦微管蛋白組合的相對能 力。微管蛋白組合反應係於32°C於PEM緩衝液（80mM PIPES 緩衝液，ImM EGTA，ImM MgCl2, PH6.9)於微管 54 1255183 蛋白（牛腦，Cy toskele ton公司，科羅拉多州，伯多） 濃度1毫克/毫升（10//M)於有或無藥物（1.0//M當量帕 克里達瑟爾）及l.OmM鳥糞22· 5’-三磷酸（GTP)存在下進 行。「老化」PG-TXL 係將 PG-TXL 於 PBS(pH7.4)於 37 °C放置3日獲得。微管蛋白聚合反應係藉隨著時間之 經過測量溶液於340 nm之吸光率追蹤。添加1//M帕克 里達瑟爾至微管蛋白於組合緩衝液溶液造成微管蛋白聚 合成爲微細管，導致光散射增加的明確吸光率增高。相 反地，10#M帕克里達瑟爾當量PG-TXL對聚合不具影 響。於PBS(pH7.4)於37t：「老化」3日之接合物溶液 具有增高的活性，但其促進微管蛋白聚合能力仍顯著低 於帕克里達瑟爾（第10圖）。 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG-TXL)於試管試驗對大鼠及 人腫瘤細胞系生長的影響 爲了評估於動物觀察得PG-TXL之優異抗腫瘤活性是 否來自於細胞毒性增高，PG - TXL及帕克里達瑟爾比較 其對已經建立的大鼠***腫瘤細胞系1 3 762F之抑制細 胞生長能力。PG - TXL對細胞生長的效果係藉a -接種效 率檢定分析檢驗。大鼠1 3 762F細胞播種（ 200細胞）於60 毫米培養皿含藥物濃度由0至200nM於生長培養基（α 改質最低培養基〔α -MEM〕含5%胎牛血淸，50單位/ 毫升青黴素，及50微克/毫升鏈黴素）。生長6日後， 細胞使用0 . 1 %甲基藍染色並計算菌落數目。然後計算 可產生50%菌落形成抑制之藥物濃度（IC5())。連續暴露 6日後之槪鼻 IC5〇値爲帕克里達瑟爾（2111^)，？〇-TXL( 1 OOnm)，「老化」（參見下文）PG-TXL( 50nM)。顯然 PG-TXL之強度比帕克里達瑟爾本身低約30 - 50倍。當 55 1255183 PG - TXL於3 7 °C於磷酸鹽緩衝鹽水溶液（pbs，pH7 . 4 )培 育3日而獲得「老化」溶液時，僅釋放約丨〇 %帕克里 達瑟爾。因「老化」溶液比新鮮溶解PG-TXL強，故PG-TXL 於試管試驗分解或釋放活性藥物顯然對PG _ TXL發揮此 種生物活性相當重要。但即使於「老化」後，PG-TXL 的強度仍比帕克里達瑟爾低2 5倍。 類似硏究中，PG-TXL對人乳癌細胞系之細胞生長效 果於連續暴露3日後藉MTT檢定分析檢驗。雖然PG-TXL 比帕克里達瑟爾對MDA3 3 0及MDA-MB4 5 3細胞系強8倍 及30，但PG-TXL對MCF7/her-2及MCF7細胞系之效果 比帕克里達瑟爾低2倍及3倍。此等結果提示PG - TXL 及帕克里達瑟爾並不同細胞系的活性不同。PG - TXL可 爲具有與帕克里達瑟爾不同藥理性質的產物。 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG-TXL)於試管試驗支援帕克 里達瑟爾依賴型細胞系的能力 發明人硏究PG - TXL拯救帕克里達瑟爾依賴型突變細 胞系的能力。Tax 18爲對帕克里達瑟爾具抗性的CHO 細胞系，爲已經明確特徵化之突變株，發現其需要連續 存在有帕克里達瑟爾才能細胞***。於無藥藥物存在 下，功能有絲***者器件無法形成（C a b r a 1等人， 1 9 8 3 )。細胞週期的有絲***期延長結果無法分開染色 體分成子細胞。雖言如此，細胞仍然通過細胞週期進展 並增生DNA，結果導致生成大型多套細胞最終由於基因 不穩定死亡（Cabras及Barlow，1991)。低濃度帕克里 達瑟爾經由允許微細管組合及形成足量有絲***軸纖維 而拯救突變的表現型。如此，此等細胞對可促進微細管 56 1255183 組合之藥劑提供方便的生物檢定方法。帕克里達瑟爾依 賴型CHO突變株Tax-18細胞生長係於24孔組織培養皿 上進行。約1 00個細胞加至含生長培養基之孔內，且含 0至1.0//M之當量帕克里達瑟爾。於3 7°C培育6日後， 移出培養基，細胞以甲基藍染色。 於無藥物存在下細胞數目少或未增加，但0 . 0 5 - 0 . 2 # Μ濃度之帕克里達瑟爾明確支援此細胞系生長。較高 濃度帕克里達瑟爾由於如同正常細胞觀察者般，微細管 過度穩定，因此推定對細胞有毒。它方面，新鮮製備 PG-TXL即使於最高試驗帕克里達瑟爾當量濃度（l#M) 拯救Tax-18細胞生長的能力極低。當PG-TXL於3 7°C 於PBS「老化」6日時，其支援Tax-18細胞生長的能 力部分恢復。此等資料指示PG - TXL不會促進微細管組 合，「老化」PG - TXL之試管試驗生物活性係歸因於由 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG - TXL )釋放的帕克里達瑟 爾。 於活體內由PG-[3H]TXL釋放[3H]帕克里達瑟爾 爲了評估帕克里達瑟爾於活體內之藥力學及釋放特 性，正常雌性C3Hf/Kam小鼠（ 2 5 - 3 0克）於尾靜脈注射20 毫克當量劑量之[3H]帕克里達瑟爾或PG-[3H]帕克里達 瑟爾。各頭小鼠接受6/zCi放射性標記藥物。[3H]帕克 里達瑟爾溶解於克莫佛EL賦形劑，而PG-[3H]帕克里 達瑟爾溶解於鹽水。注入各頭小鼠的容積爲〇 . 2至0 . 3 毫升。於注射後0、5、15、30分鐘及1、2、4、8、16、 24、48小時’犧牲動物並收集血樣（每個時間點4-5點 小鼠）°使用10微升整分血漿藉液體閃爍計數（Beckman 57 1255183 型號LS650Q ’加州，富林頓）測量血漿之總放射性。2 〇 〇 微升血漿使用3倍量乙酸乙酯根據Longnecker等人 ( 1 9 87 )萃取。帕克里達瑟爾之萃取效率爲8〇%。樣本 於2 5 0 Or pm離心5分鐘，分離上淸液並乾燥。乾燥後 之萃出物以195微升HPLC動相重新調製，混合5微升 冷帕克里達瑟爾0.2毫克/毫升），及1〇〇微升注入HPLC 用於測定自由態帕克里達瑟爾放射性。藥力學參數係使 用WinNonl in套裝輪藉非腔室模式分析。產生的各資料 點爲4 - 5頭小鼠平均値。 兩種藥物中血漿之廓淸率顯示於第1 1圖。雖然帕克 里達瑟爾於小鼠血漿之半生期極短（t1/2，29分鐘）， PG-TXL半生期顯著延長（t1/2，317分鐘）。PG-TXL自由 中之廓淸較慢爲聚合物-藥物接合物的設計特點，用於 改良腫瘤攝取目的。出乎意外地，PG-TXL轉成帕克里 達瑟爾之轉化速率慢，於藥物注射後1 44小時內呈[3H ] 帕克里達瑟爾由PG-[3H]TXL回收的放射性低於0.1% (第11圖）。 分開硏究中，如前述準備帶有OC A - 1腫瘤的小鼠。腫 瘤達500立方毫米時，動物尾靜脈注射20毫克當量帕 克里達瑟爾/千克之[3H]帕克里達瑟爾或PG-[3H]TXL。 動物於注射後2、5、9、24、48及144小時殺死。取出 腫瘤、稱重及與3倍容積PBS(w/v)均化。每克組織之 注入劑量百分比係基於腫瘤相關總放射性計算’放射性 係藉計數製妥的組織均化物整分測定。一整分組織均化 物混合組織增溶劑，接著加入閃爍溶劑，並計算總放射 性。計算效率可藉標準添加方法證實。另外，組織均化 58 1255183 物整分使用乙酸乙酯萃取並藉HPLC分析自由態帕克里 達瑟爾。HPLC系統係由150X3.9毫米Nova-Pak管柱 (W a t e r s，麻省，密利佛），液相層析術泵（W a t e r s型號 510)，UV/ Vi s 檢測器設定於 228nm( Wat ers 型號 486 )， 流動閃爍分析儀（Packard型號500TR，伊利諾州，道尼 灣），及Packard放射性計數軟體供資料分析組成。溶 離溶劑（甲醇：水二2 : 1 )流速爲1 . 0毫克/分鐘。OC A -1腫瘤攝取的總藥物量係以每克組織之投藥劑量百分比 表示，OC A - 1腫瘤內部呈自由態帕克里達瑟爾結合的放 射性係以每克組織dpm表示。 腫瘤攝取定量評估顯示比較放射性標記帕克里達瑟 爾，於注射後不久腫瘤組織內出現的來自放射性標記 PG-TXL之放射活性程度相當高（第12A圖）。但腫瘤組 織內僅有小量放射性係來自於釋放自由態帕克里達瑟爾 (第12B圖）。第12A及12B圖所示資料係每個時間點由 3頭小鼠所得平均土標準差。腫瘤組織內部之來自帕克 里達瑟爾之放射性百分比隨著時間的經過不會可察覺地 增高，提示PG-TXL並非單純爲逐漸釋放帕克里達瑟爾 的前藥。

與帕克里達瑟爾相反，使用PG-TXL進行試管試驗硏 究無論製備成新鮮溶液或甚至於緩衝液「老化」後，皆 明白顯示複合體並非強力生物毒性物種。複合體既不會 強力支援微管蛋白聚合，也不會支援帕克里達瑟爾依賴 型CH0細胞系的生長及純化。此外’得自藥力學硏究資 料指示帕克里達瑟爾於血漿釋放程度及速率極慢（1 44 小時低於0 . 1 % )。雖然使用相當抗腫瘤劑量時’ PG - TXL 59 1255183 之攝取比帕克里達瑟爾之攝取高約5倍，但得以進入 組織且存在於組織的主要形式顯示並非自由態帕克里達 瑟爾。 實例6 聚合物結構對水溶性聚胺基酸-帕克里達瑟爾接合物活 性的影響 本硏究評估聚合物-帕克里達瑟爾接合物之抗腫瘤活 性是否受藥物用於接合的聚胺基酸結構影響。帕克里達 瑟爾根據前述程序偶合至聚（1 -變胺酸），聚（d -變胺 酸），及聚（1-天冬胺酸）。此等聚胺基酸-帕克里達瑟爾 接合物具有類似的帕克里達瑟爾含量、水中溶解度及分 子量（30-40K)。帶有鼠0CA-1卵巢癌（處理時爲500立 方毫米）之C3Hf/Kam小鼠單次靜脈注射聚（1-麩胺酸）-帕克里達瑟爾，劑量爲80毫克當量帕克里達瑟爾/千 克體重，相對於鹽水處理對照產生腫瘤生長延遲2 1曰。 聚（d -麩胺酸）-帕克里達瑟爾效果同聚（1 -麩胺酸）-帕克 里達瑟爾。但與聚（1-天冬胺酸）接合的帕克里達瑟爾對 〇C A - 1腫瘤完全無活性。分開硏究中，比較不同分子量 (1K，13K及36K)聚合物-帕克里達瑟爾接合物之抗腫瘤 活性。較低分子量接合物顯著比較高分子量接合物無 效。高於50, 00 0之較高分子量太過黏稠。 實例7 聚麩胺酸-帕克里達瑟爾（PG - TXL )誘生之細胞凋零程序 比帕克里達瑟爾少 爲了評估PG-TXL關聯的抗腫瘤活性機轉，檢視由帕 克里達瑟爾及PG-TXL處理小鼠切除的OCA-1腫瘤的組 60 1255183 織切片。帶有OCA - 1腫瘤小鼠如前述製備。當腫瘤體積 達5 00立方毫米時，動物注射帕克里達瑟爾（80毫克/ 千克）或PG-TXL(160毫克當量帕克里達瑟爾/千克）。 於處理後0至1 44小時的不同時間點，腫瘤作組織學分 析根據M i 1 a s等人（1 9 9 5 )定量其有絲***及細胞凋零活 性。小鼠藉斬首殺死，即刻切除腫瘤並置於中性緩衝液 福馬林內，然後處理組織並以h e m a t ο X y 1 i η及伊紅染 色。有絲***及細胞凋零皆係於有初度的玻片上藉400 倍放大顯微鏡檢查評分。於各個組織學檢體隨意選擇五 區非壞死區，於各區記錄每1 00個核之細胞周零核及有 絲***細胞數目，並以百分比表示。該値係基於每個時 間點得自3頭鼠之1 500個細胞核評分。 於帕克里達瑟爾處理組小鼠觀察得之變化就定量方面 而言類似前述者（Mi 1 as等人，1 995 )。腫瘤細胞顯示明 顯細胞核分段，且生成細胞凋零體，於第1日特別顯 著（第13圖）。至144小時此等腫瘤仍然存在有帶有正 常絲***的存活腫瘤細胞團塊，指示此種腫瘤最終再度 生長。使用PG - TXL處理僅導致有絲***暫停細胞及凋 零細胞的輕度增加，推定由於PG - TXL釋放出少量自由 態帕克里達瑟爾故（第13圖）。至96小時，PG-TXL處 理組小鼠之腫瘤出現全面水腫及壞死，僅殘存少量邊緣 存活腫瘤細胞。至1 44小時時，殘餘腫瘤團塊比較對照 組係由較大的、較爲多行性的、且顯示較低有絲***活 性的細胞組成。 此等資料提示本揭示之水溶性PG - TXL接合物具有優 異抗腫瘤效果，毒性比習知自由態帕克里達瑟爾製劑 61 1255183 此等修改皆涵蓋於本發明之範圍。 動物硏究 此等硏究係於大鼠及小獵犬進行，各種藥物劑量約硏 究3頭動物。劑量提高至發現威脅生命之毒性爲止。 動物進行血液試驗及屍體檢驗而決定對此種藥物毒性敏 感的器官系統，預測於人體硏究的副作用。一旦決定可 引起1 0 %動物死亡的毒性，則推薦該劑量的.1 / 1 〇作 爲人體硏究之開始劑量。此乃食品藥物管理局（EDA ) — 般推薦作爲第〗期人體硏究的初劑量。 第I期硏究 此藥藥物之第I期硏究係使用動物硏究定義的開始 劑量進行。藥物以數分鐘時間注射入靜脈，或可以至多 約0至1 5分鐘之短時間輸注。溶劑容積爲1 〇毫升至約 1 〇〇毫升，取決於採用何種靜脈注射方法，藥物每隔3周 投藥。此種用法係基仿早期動物硏究，以及帕克里達瑟 爾於克莫佛之用法。三位病人以動物硏究決定的最低劑 量開始，以注射PG-TXL治療。於基線及每週進行血液 試驗來評估血球數目；每3週測肝功能及腎功能。預 期血球數目及生理參數於前次治療後3週之下個處理 週期時，可由PG - TXL充分恢復。若爲此情況時，則處 理將每3週重複一次。若第一期三位病人可忍受藥物 3週，則此等病人允許以尋常用於第I期硏究的預定 用法用量提高劑量。一旦三位病人已經忍受過第一週 期，則其次3位病人開始接受次一較高劑量。此種提 高劑量過程連續至3位人中至少有2位於使用該劑量 之副作用太嚴重，而無法繼續投藥爲止。此種情況下’恰 64 1255183 於毒性劑量前的劑量被視爲隨後硏究之投藥劑量。6至 1 0位病人接受第π期硏究之推薦劑量來證實其忍受 性。一旦決定適當劑量及評估藥物的急性毒性副作用， 則開始第11期硏究。 第11期硏究 PG-TXL之第π期硏究係於數種類型腫瘤進行。各硏 究係遵照Gahan或Simon設計以尋常標準第II期方式 設計。簡言之’對特定腫瘤類型約丨4位病人開始接受 治療’若該腫瘤類型並無抗癌活性證據，則放棄PG - TXL ^ 用於該型腫瘤的進一步硏究。但若至少一位病人有臨床 效果’定義爲腫瘤垂直剖面直徑之積之和至少縮小50 % ’則使用PG-TXL治療的該型腫瘤病人數將增至30， 此等硏究允許定義PG-TXL於各型腫瘤的活性，並精密 考慮有關藥物副作用資訊。PG - TXL特定感興趣的腫瘤 類型爲對帕克里達瑟爾及杜西達瑟爾顯示良好反應的類 型。包括卵巢癌、乳癌及肺癌。對PG-TXL有反應之腫 瘤進行聚麩胺酸-帕克里達瑟爾與帕克里達瑟爾之比較 硏究。此種硏究稱作第III期硏究。 _ PG-帕克里達瑟爾之第hi期硏究

基於帕克里達瑟爾於卵巢癌、乳癌及肺癌之活性，採 用此等腫瘤類型進行PG-TXL及帕克里達瑟爾之比較硏 究。鑑於此種隨機硏究需要大量病人，發明人預期可能 需要多硏究機構硏究。發明人之硏究機構係利用合作社 區腫瘤計劃（CDDP)及多個其它多機構硏究小組。除了 PG - TXL相對於帕克里達瑟爾之可能臨床效果外，也適 合評估兩種藥物的經濟衝擊。預期短時間輸注PG - TXL 65 1255183 成本較低。因此預期PG -TXL相對於帕克里達瑟爾之單 一療法具有成本效益。不僅輸注時間較短，也預期不存 在有克莫佛之副作用’因此副作用較低，也不再需要包 括類固醇及靜脈注射H2及Η1遮斷劑之前期給藥處理。 所有此等因素將導致治療成本下降。 結語 預期初期動物毒性評估需時6個月。隨後若可取得 藥物配方，則第I期人體硏究又需6至9個月。一 旦此硏究完成，於各型腫瘤之第II期硏究又需時6至 9個月。此時發明人獲得此種藥物有效的觀點，因而 設計並開始鎖定目標的第I I I期硏究。也可能第Π期 硏究顯示充分臨床活性，因此縮短第III期硏究或無需 第III期硏究。 實例12 藉聚（L-麩胺酸）-帕克里達瑟爾接合物促進鼠卵巢癌之 腫瘤放射性反應 引言 化學治療及放射性治療合倂用於治療各型腫瘤已經使 得完全反應及存活率顯著改善（R0tman，1992)。試管硏 究及活體硏究皆驗證帕克里達瑟爾可強力增強腫瘤之放 射性反應。動物硏究中，隨腫瘤類型、藥物濃度及用法 量而定，增強因數於1.2至大於2.0之範圍。此項硏究 係了解聚（L -麩胺酸）-帕克里達瑟爾（pG - TXL )之放射性 敏化效果。 實驗方法 PG-TXL如此處所述係由聚（l-麩胺酸）（sigma，黏度 66 1255183 分子量：31Κ)合成。接合物含有20%帕克里達瑟爾（w/w) 透過酯鍵聯偶合至PG。雌性C3Hf/Kam小鼠於右後腿肌 肉接種5 X105卵巢OCa-Ι癌細胞。當腫瘤直徑達8毫 米時，將小鼠隨機分成1 2組，每組含6至1 2頭小鼠。 第1 - 5組的小鼠給予鹽水，第1 4組單獨以Gy照射，或 單獨PG-TXL以48、80或120毫克當量帕克里達瑟爾/ 千克處理。第6-9組小鼠給予PG-TXL以47毫克當量帕 克里達瑟爾/千克，及於PG-TXL處理後2、24、48及 144小時接受14Gy局部照射。第10組給予PG-TXL 80 毫克當量帕克里達瑟爾/千克，及於PG-TXL處理後24 小時接受14Gy照射。第11及12組給予PG-TXL 12 0毫 克當量帕克里達瑟爾/千克，及於PG-TXL處理前24小 時或後24小時接受14Gy照射。PG-TXL以單次靜脈注 射投藥。腫瘤之局部伽瑪附線照射係由37Cs施照體以 每分鐘7Cy劑量照射。藉測量三條正交腫瘤直徑決定腫 瘤生長延遲至腫瘤直徑達14毫米爲止。 結果與討論 PG-TXL之放射性敏化效果與劑量有關。於47毫克當 帕克里達瑟爾/千克之較低PG-TXL劑量，觀察得低於 加成效果。隨放射性照射時間而定，平均促進因數由 0.54變化至0·75。但於較高PG-TXL劑量觀察得超過加 成效果。當PG-TXL係於照射前24小時給藥，且PG-TXL 劑量由47加至80及120毫克當量帕克里達瑟爾/千克 時，平均促進因數由0.75增加至1.8及4.2(表7)。使 用PG-TXL較低劑量觀察得化學放射性治療之低於成效 果可能原因爲細胞殺死不足，而存活細胞重新快速增 67 1255183 長。於較高劑量時，PG - TXL對週期循環腫瘤細胞族群 及/或腫瘤之再氧合產生顯著效果，結果獲得放射性敏 化效果顯著增高。令人感興趣地，當腫瘤使用PG-TXL 120 毫克當量帕克里達瑟爾/千克處理前以14Gy照射時， 觀察得超過加成效果，促進因數爲4 . 3 (表7 )。此項結 果係於帕克里達瑟爾於放射線照射後給藥誘發放射線抗 性之先前觀察現象相反（Ingram及Redpath，1997)。 表7 PG-TXL對鼠卵巢OCa-1腫瘤之放射性反應之影 處理 放射性 (14Gy) 腫瘤由8生長至 14毫米日數(平 均士標準差） 絕對生長 延遲曰數3 規度化生長 延遲（平均 土標準差)b 促進因數 (95% C.I)C 鹽水 否 17.2土2.2 PG-TXL 47 毫 克當量/千克 否 19·8±0·98 2.7 PG-TXL 80 毫 克當量/千克 否 25·3±3.9 8.1 PG-TXL 120 毫 克當量/千克 否 29.7±3.2 12.5 14Gy單獨照射 是 37.9±6·1 20.7 PG-TXL 47 毫 克當量/千克 是 35.3±4.7 18.2 15·5±4·7 0.75(0.5-0.98) PG-TXL 80 毫 克當量/千克 是 62 ± 4.6 45.6 37.5土4.6 1.8(1.5-2.2) PG-TXL 120 毫 克當量/千克 是 115 ± 3 98.4 85.9土3.0 4.2(3.9-4.3)° PG-TXL 120 毫 克當量/千克 是 117±1.2 100.5 88 ± 1.2 4.3(4.1-4.4)c 絕對生長延遲定義爲處理組腫瘤由8生長至1 5毫米 曰數減鹽水處理組腫瘤由8生長至1 4毫米日數。 68 1255183 b.規度化生長延遲定義爲接受PG-TXL及放射性合倂處理 組小鼠之腫瘤由8生長至14毫米日數減單獨使用PG-TXL處理組小鼠腫瘤由8生長至1 4毫米日數。 。.促進因數係將接受PG-TXL加放射性處理小鼠之規度化 腫瘤生長延遲除以單獨使用放射性處理小鼠之絕對生 長延遲獲得。 d. 放射性係於PG-TXL處理前24小時照射。其它組合組： 放射性係於PG-TXL處理後24小時照射。 e. 資料係基於第120日時再度生長的腫瘤。兩組6頭小 鼠中有2頭的腫瘤於第1 20日仍然無法測量。 討論 本硏究結果指出PG-TXL合倂放射性治療可有效用於放 射性照射前或後來促進放射性敏化。此等結果進一步提 示放射性敏化劑及抗癌藥物接合至水溶性聚合物載劑， 可提供較強的放射性敏化效果。鑑於本揭示內容，業界 人士了解可改變PG-TXL及此處揭示之其它組合物劑量， 以及經外部或內部投藥（亦即由外部幅射來源投藥或經系 統性投藥，例如藉注射或吞服放射性物質如含放射性同 位素配方）之幅射劑量。處理計劃及劑量可因應人而異， 考慮例如病人體重及年齢、接受治療的腫瘤類型、病情 嚴重程度、先前及/或同時接受的治療處置、投藥方式 等因素，業界人士容易依此等因素決定治療計劃及劑量。 例如預期PG-TXL之較佳劑量範圍於相等帕克里達瑟爾劑 量時爲約0.5倍至約2倍TXL之最大忍受劑量。PG-TXL 之投藥量可於整個放射性治療過程分成小劑量投藥。也 預期較佳照射範圍爲約50至70蓋格（Gy)經約5至週投 69 1255183 藥，或約每週1 0蓋格。較佳投藥劑量包括於照射前約1至 約2日，或照射後約1至約2日投予PG-TXL。當然PG-TXL 及其它聚合物-抗腫瘤藥或螯合劑-抗腫瘤藥組合物之投 藥劑量可由業界人士判定對各病人獲得最大效益而改變 及/或重複。 氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺 雖然已經就較佳具體例說明本發明組合物及方法，業 界人士顯然易和可對此處所述組合物、方法及方法步驟 或方法步驟順序作出變化而未悖離本發明之構想、精髓 及範圍。特別顯然某些藥劑具有化學及/或生理相關性， 其它水溶性聚合物-藥物接合物可替代此處揭示之藥劑而 仍達成相同或類似的效果。所有此等業界人士顯然易知 之類似替代及修改皆視爲屬於如隨附之申請專利範圍界 定之本發明之精髓、範圍及構想範圍內。 參考文獻 下列參考文獻提供此處所述之補充範例程序及其它細 節，特別倂述於此以供參考。

Bartom及Boitard,"自由態及包囊紫杉酚之試管及 活體試驗抗腫瘤活性"，微包囊期刊，7 : 1919-197，1 990。

Berstein等人，”道諾黴素連結至葡萄聚糖之較高抗腫 瘤效果：試管及活體硏究π，國家癌症協會期刊，60 : 379-384 ， 1978 。

Boy 1 e等人，"藉麩胺酸鹽防止紫杉酚誘發神經病變”， 癌症硏究，37: 290，1996。

Cab r a 1及Ba I· 1 ow，"對抗有絲***劑之抗性作爲微細 管結構及功能之基因探針π，醫藥治療學，52 : 1 59 - 1 7 1， 70 1255183 1991。

Cabral、Wible、Brenner、Brinkley，"紫杉酉分需要中 國倉鼠卵巢細胞之變異株附有受損的有絲***心軸總成 π，細胞生物學硏究，9 7 : 3 0 - 3 9，1 9 8 3。

Cortes，J.E·及 Pazdur，R·，11杜西達瑟爾 Do cetaxel) 〃，臨床腫瘤學期刊，13 : 2643-2655，1995。

Deutsch等，π同源物及原體之合成。3具有強力抗腫 瘤活性之帕克里達瑟爾之水溶性原體”，醫藥化學期刊， 32 ： 788-792 ， 1989 °

Duncan等，’'抗腫瘤劑耦合至Ν-(2-羥丙基）甲基丙基 醯胺共聚物。3亞力亞黴素接合物於活體試驗對小鼠白 血病L1 210之評估"，控制釋放期刊，10 : 51-63，1 989 °

Eiseman等，”帕克里達瑟爾CD2F1小鼠之血漿藥物動 力學及組織分佈”，癌症化學治療藥理學，34 : 465 -471 ’ 1994。

Fidler、Gersten、Hart，”癌症侵襲與轉移之生物學”’ 先進癌症硏究，28: 149-250，1987。

Foa、Norton、Seidman，M紫杉酣（帕克里達瑟爾）：藉 由顯著抗腫瘤活性之抗微細管劑”，國際臨床實驗室硏％ 期刊，24 : 6- 14，1 994。

GoldsP1el，”紫杉酚醫藥議題：製備、投藥、穩定性 以及與其他藥物的配伍性"，藥理治療學年度演講，28 : S23-26 ， 1994 。

Greenwald等，”高度水溶性紫杉酚衍生物：2^聚乙二 醇酯作爲強力產物"，生物有機及醫藥化學函件，4 : 2465-2470 ， 1994 。 71 1255183

Greenwald等，"高度水溶性紫杉酚衍生物’ 7-聚乙二 醇酯作爲強力產物"，有機化學期刊，60: 3 3 1 - 3 36，1 99 5 °

Greenwald等，"藥物輸送系統：水溶性紫杉酚2 '-聚（乙 二醇）酯原體設計及活體試驗效果"，醫藥化學期刊’ 39 : 424-431 ， 1996 。

Hi ratio等，"活化環磷醯胺之聚合物衍生物作爲抗腫瘤 治療之藥物輸送系統"，巨分子化學，ΙδΟ : 1 1 25 - 1 1 30， 1 979。

Hoes等，”抗腫瘤抗生素亞力亞黴素之巨分子原體之最 適化”，控制釋放期刊，2 : 205 - 2 1 3，1 98 5。

Holmes 、 Kudelka、 Kavanagh、 Huber、 Ajani 、 Valero ’ "帕克里達瑟爾及杜西達瑟爾之臨床硏究現況”於；紫杉 烷抗癌劑：基本科學及目前狀態，Georg、Chen、Oj ima、 Vyas編輯，美國化學會，華盛頓特區，31-57，1995。

Ho rw i t z等，"紫杉酚，作用及抗性機轉”，國家癌症硏 究院期刊單篇，No.15, pp.55-61，1 993。 I n g r a m及R e d p a t h，"放射性與紫杉酣於活體試驗之次 加成交互作用"，國際放射性腫瘤學生物物理學期刊，37 : 1139-1144 ， 1997 。

Kato等，"1-巴拉丙諾（barabino)㈦喃醣基胞22.接合聚 麩胺酸及其衍生物之抗腫瘤活性”，癌症硏究，44: 25 - 30， 1 984。

Kopecek及Kopeckova，”鎖定目標之水溶性聚合物抗 癌藥物：成就及未解決的問題’’，國際控制釋放生物活性 物質硏討會議事錄，20 : 1 90 - 19 1，1 99 3。

Kopecek，"水溶性聚合物載劑用於鎖定目標且爲部位 72 1255183 特異性藥物輸送之潛力"，控制釋放期刊，1 1 : 279 - 290， 1 990。 L i等，水溶性聚乙二醇帕克里達瑟爾接合物作爲帕克 里達瑟爾原體之合成及評估"抗癌藥物，7 : 642 - 648， 1 996。

Li、 Yu、 Newman、 Cabral 、 Stephens 、 Hunter、 Milas 、 Wallace，"使用新穎水溶性（L-麩胺酸）帕克里達瑟爾接 合物使用明確建立的腫瘤完全退行"癌症硏究，58 : 2404-2409 ， 1998 °

Liu等，”酪胺酸磷酸化作用於紫杉酚誘發人類卵巢腫 瘤細胞系之細胞凋零程序之關聯證據π，生化藥理學，48 : 1 265 - 1 272，1 994。

Longnecker等，”紫杉酌於人類血漿及尿液之高效液相 層析檢定分析及第一期試驗之藥理學"，癌症治療學71 : 53-59 ， 1987 。

Maeda及Matsumura，M巨分子藥物之親腫瘤細胞及親 淋巴細胞原理"，治療藥物載劑系統之關鍵綜論，6 : 193-210 ， 1989 。

Maeda，"SMANCS及聚合物接合巨分子藥物：癌症化學 治療之優點"，先進藥物輸送綜論，6 : 1 8 1 -1 93，1 99 1。

Maeda、Seymour、Miyamoto，π抗癌劑與聚合物之接合 體：活體試驗中巨分子治療學之優點"，生物接合化學， 3 ·· 3 5 1 - 362，1 992 〇

Magri及Kingston，”改質紫杉酚。2紫杉酚之氧化產 物"，有機化學期刊，5 1 : 797 - 802，1 986。

Mathew等，”具有抗腫瘤活性之紫杉酚之若干水溶性原 73 1255183 體及衍生物之合成與評估π，醫藥化學期刊，35: 1 45 -151， 1 992。

Mi 1 as等，使用紫杉酚治療鼠乳癌及弱卵巢癌之有絲分 裂停止及細胞凋零程序之動力學"，美國癌症化學治療藥 理學會議事錄，35: 297-303，1995。

Mosmann，T，"細胞生長及存活之快速比色檢定分析： 應用於增生及細胞毒性檢定分析"，免疫方法期刊，65 : 55-63 ， 1983 。

Nicolaou 、 Riemer 、 Kerr、 Rideout 、 wrasidio ，"原 紫杉酚之設計、合成及生物活性”，自然，364 - 464 -466， 1 99 3。

Oliver, S.J.等"使用血管生成抑制劑，AGM- 1 470及微 細管安定劑紫杉酚抑制膠原誘發的關節炎"，細胞免疫 學，157 : 291-299 ， 1994 。

Phillips-Hughes及Kandarpa，”血管再度狹窄：病理 生理及預防策略”，JVIR 7: 321-333，1996。

Reynolds, T.，”聚合物輔助引導癌症藥物至腫瘤目標 且將其維持於該處"，國家癌症硏究所期刊，87 : 1 582 -1584 ， 1995 。 R0Se等”水溶性帕克里達瑟爾衍生物之臨床前抗腫瘤活 性"，癌症化學治療之藥理學，39 : 48 6 - 492，1 997。

Rotman，"化學刺激：癌症治療的新啓示。1991年RSNA 放射性腫瘤學年度演講"，放射學，1 84 - 3 1 9 - 329，1 992。 owinsky及Donehower，"綜論帕克里達瑟爾（紫杉酣）"， 新英格蘭醫學期刊，332- 1004- 1014，1 9 9 5。

Rowinsky，Chaudhry，Cornblath，Donehower，"帕克 74 1255183 里達瑟爾及具有題粒細胞群落刺激因子之西鉑丁之第一 期及藥理學硏究：神經肌肉毒性具有劑量限制性〃，臨床 腫瘤學期刊，1 1 : 20 1 0 - 2020，1 993。 S c ud i e r 〇等M可溶性四唑鏺/呋贊用於人類及其他腫瘤 細胞系培養之細胞生長及藥物敏感性檢定分析評估"，癌 症硏究，48 : 4827 - 4733，1 988。

Serruys，De Jaegere，Kiemeneij 等"汽球擴張移植模 植入與汽球血管整形術用於冠心病病人之比較"，新英格 蘭醫藥期刊，331 : 489-495，1994。

Sharma及Straub inger，”新穎紫杉酚配方：含紫杉酚 脂小體之製備及特徵化"，藥物硏究，1 1 : 889 - 896，1994。

Trouet等"道諾汝必新及蛋白質與血淸穩定的共價鍵聯 以及藉溶小體水解酶逆轉，如對親溶小體藥物載劑接合 物所需：試管試驗及活體試驗硏究”，美國國家學術科學 議事錄，79 : 626 - 629，1 982。 美國專利5,362,83 1 美國專利5,583，153 van Heeswijk等”多肽-亞力亞黴素接合物之合成及特 徵化及其與亞力亞黴素之錯合物。第一部"，控制釋放期 刊，1 : 301 -315，1 985。

Vy as等，磷酸酶活化帕克里達瑟爾原體"，紫杉烷抗癌 劑：基礎科學及現況，Georg、Chen、Oj ima、Vyas編輯， 美國化學會，華盛頓特區，1 24- 1 37，1 995。

We 1 s s等"紫杉酚之過敏反應"，臨床腫瘤學期刊，8: 1 263 - 1 268，1 990。

Zhao，Z.及Kingston，D.G.I·，”改質紫杉酚。6水溶性 75 1255183 紫杉酚砑酸鹽之製備"，自然產物期刊，54 : 1 607- 1 6 1 1， 1991° 【圖式簡單說明】 第1A圖：帕克里達瑟爾，PEG帕克里達瑟爾達瑟爾及 DTPA -帕克里達瑟爾之化學結構式。 第1B圖：PG-TXL之生產之化學結構式及反應圖。 第2圖：帕克里達瑟爾，PEG-帕克里達瑟爾及DTPA-帕克里達瑟爾用於B16黑素瘤細胞增生的效果。 第3圖DTPA-帕克里達瑟爾用於MCa-4***腫瘤之抗 腫瘤效果。 第4圖：使用帕克里達瑟爾，DTPA-帕克里達瑟爾及PEG-帕克里達瑟爾治療後，腫瘤直徑達1 2毫米之時間中間値 (曰數）。 第5圖帶有MCa-4腫瘤小鼠於靜注射nQn-DTPA-帕克 里達瑟爾及11 4 n-DTPA之伽瑪閃爍相片。箭頭指示腫瘤。 第6圖：在不同ρ Η値，以時間爲函數，於P B S中測定 PG-TXL之水解分解情形。-◊-表示釋放的帕克里達瑟爾 百分比，-〇-表示產生的代謝產物-1。 第7Α圖：PG-TXL用於雌性C3Hf/Kam小鼠對抗同質基 因OCA-I卵巢癌之抗腫瘤效果。藥物以單劑靜脈注射。 數據以腫瘤容積之平均土標準差表示。a爲帶有0C A-1腫 瘤之小鼠注射-□-，PG對照（ 800毫克/千克；n = 9);-▲-，帕克里達瑟爾（80毫克/千克；n=7); -△-，帕克 里達瑟爾（80毫克/千克）加PG( 800毫克/千克；n = 5); _#-，？0 4乂1^(80毫克當量帕克里達瑟爾11=7);或-〇-， 爲PG-TXL(160毫克當量帕克里達瑟爾/千克；n = 6)。 76 1255183 第7B圖：PG-TXL用於雌性小鼠對抗1 3 762F腫瘤之抗 腫瘤效果。-□-表示PG對照（ 220毫克/千克；n = 7);-▲-表示帕克里達瑟爾（20毫克/千克；n=5) ; 表示 帕克里達瑟爾（40毫克/千克；n = 7); - ·-表示PG-TXL(20 毫克當量帕克里達瑟爾η二5)，-〇-表示PG-TXL(40毫克 或60毫克當量帕克里達瑟爾/千克；n=9)。 第7C圖：PG-TXL用於帶有MCa-4乳癌小鼠之抗腫瘤效 果。-□-表示對單劑靜脈注射鹽水的反應，-△-表示對單 劑靜脈注射PG(0.6克/千克）之反應；-♦-表示對PG-TXL(40毫克/千克）之反應表示對PG-TXL(60毫克 當量帕克里達瑟爾/千克）之反應，-〇-表示對PG-TXL(120毫克/千克）之反應。 第7D圖：PG-TXL用於小鼠對軟組織肉瘤（FSa-II)之抗 腫瘤效果。-□-表示對單劑靜脈注射鹽水的反應，-◊-表 示對單劑靜脈注射PG ( 〇 . 8克/千克）之反應；-〇-表示 對帕克里達瑟爾（80毫克/千克）之反應表示對 PG-TXL(160毫克當量帕克里達瑟爾/千克）之反應。 第7E圖：PG-TXL用於小鼠對同質基因肝癌細胞（HCa-I) 之抗腫瘤效果。-□-表示對單劑靜脈注射鹽水的反應，-△-表示對單劑靜脈注射PG(0.8克/千克）之反應；-〇-表示對PG-TXL(80毫克/千克）之反應，-△-表示對PG-TXL(160毫克當量帕克里達瑟爾/千克）之反應。 第8圖：由PEG-帕克里達瑟爾於磷酸鹽緩衝液（PH7.4) 釋放帕克里達瑟爾之輪廓（profile)。顯示由PEG -帕克里 達瑟爾（-〇-)於PH7.4釋放帕克里達瑟爾（-X-)之輪廓。 第9圖：PEG-帕克里達瑟爾用於MCa-4***腫瘤之抗 77 1255183 腫瘤效果。-□-表示單劑靜脈注射PEG鹽水溶液（60毫克 /毫升）之反應，表示對克莫佛/醇媒劑之反應，-〇 -表示對單劑40毫克/千克體重帕克里達瑟爾之反應，-參-表示PEG-帕克里達瑟爾於40毫克當量帕克里達瑟爾 /千克體重。 第10圖··於3 2°C於l.OmM GTP及1.0毫克/毫升微管 蛋白（tubulin)存在下進行微管蛋白聚合檢定分析。-□· 表示帕克里達瑟爾（1.0//M)，-△-表示PG-TXL(10/zM當 量帕克里達瑟爾）於PBS(pH7.4)於37°C培育3日，-〇- _ 表示新鮮溶解PG-TXL。 第11圖：於C3Hf/Kam小鼠靜脈注射PG-〔 3H〕帕克里 達瑟爾及〔3H〕帕克里達瑟爾後，放射性之血漿廓淸率。 -□-表示注射6 /zCi放射性標記PG-〔 3H〕帕克里達瑟 爾（20毫克當量帕克里達瑟爾/千克）後之pg-TXL放射 性，-X -表示注射6 /z C i放射性標記〔3H〕帕克里達瑟爾 (20毫克當量帕克里達瑟爾/千克）後之帕克里達瑟爾放 射性，-〇-表示由注射的PG -〔 3H〕帕克里達瑟爾釋放的 「帕克里達瑟爾」放射性。 ® 第12A圖：注射PG-〔 3H〕帕克里達瑟爾及〔3H〕帕克 里達瑟爾至小鼠體內後，與時間關聯之〇C A - 1腫瘤之放 射性含量。空心柱表示注射6 /z C i放射性標記PG - 3H〕 帕克里達瑟爾（20毫克當量帕克里達瑟爾/千克）後之 KPG - TXL放射性，實心柱表示注射6 // C i放射性標記〔3H〕 帕克里達瑟爾（20毫克當量帕克里達瑟爾/千克）後之帕 克里達瑟爾放射性。 第12B圖：PG-〔 3H〕帕克里達瑟爾於〇CA-l腫瘤內部 78 1255183 轉成〔3H〕帕克里達瑟爾。注射6 # C1放射性標記PG _ 〔3H〕帕克里達瑟爾後測得之總放射性顯示於空心柱，由 注射的〔3H〕帕克里達瑟爾釋放的「帕克里達瑟爾」衍生 放射性顯示於實心柱。 第13圖：0CA-1腫瘤於單劑靜脈注射160毫克當量帕 克里達瑟爾/千克PG-TXL(MTD)及80毫克/千克帕克里 達瑟爾（MTD )後之細胞凋零程序動力學。-□-表示對單劑 靜脈注射PG-TXL( 160毫克當量帕克里達瑟爾/千克MTD) 之反應，-〇-表示對帕克里達瑟爾（80毫克帕克里達瑟爾 4 /千克MTD)之反應。 第14圖：帶有人卵巢癌細胞（SKOV3i pi)之裸小鼠使用 PG-TXL治療之存活率。腫瘤注射後5日，小鼠靜脈注射 ， PG-帕克里達瑟爾（PG-TXL)或PG對照。PG-TXL之注射係 每7日（▼)投予120毫克/千克組，但未投予160毫克 /千克組。表示未經處理小鼠，-▲-表示對靜脈注射 多劑PG的反應表示對靜脈注射一劑PG-TXL(120 毫克當量帕克里達瑟爾/千克）之反應表示對靜脈 注射一劑PG-TXLU60毫克當量帕克里達瑟爾/千克）之 反應。 第15圖含麩胺酸之聚胺基酸之生產化學結構式及反應 圖。 79

Claims (1)

125518

十Ί請專利範圍： Lj補充中0 第93 1 36237號「治療腫瘤用之水溶性喜樹鹼之醫藥組成 物」專利案 ( 2006年1月修正） 1 . 一種用於治療腫瘤之醫藥組成物，其包含（A)喜樹鹼 (caniptothecin)接合至水溶性聚麩胺酸聚合物之接合 物作爲活性成分，以及（B ) —種醫藥可接受性載劑； 其中該聚麩胺酸聚合物具有分子量介於30,000至 50,000道耳吞。 2 .如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該聚合物爲 聚（L-麩胺酸）。 3 ·如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該接合物包 含2重量％至35重量％喜樹驗。 4 ·如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其可用於放射線 治療促進腫瘤對照射之反應，其中該接合後之喜樹驗 相對於對應之未接合藥物具有增強之水溶性、效果及 於腫瘤內部之堆積性。 5 .如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中該醫藥組成 物係於照射前投藥。 6 ·如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中該醫藥組成 物係於照射後投藥。 7 ·如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中該照射劑量 爲每週約1 0蓋格，及該醫藥組成物係於照射後1 _ 2日 內投藥。 8 .如申請專利範圍第丨項之醫藥組成物，其中該腫瘤爲乳 癌、卵巢癌、惡性黑素瘤、肺癌、胃癌、攝護腺癌、結 1255183 腸癌、頭頸癌、白血病或卡波西氏肉瘤。 9 .如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中喜樹鹼分子 對聚麩胺酸分子之比例爲1 - 75 : 1。

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