CN109310385A - 抗trop-2-sn-38抗体药物缀合物用于检查点抑制剂复发/难治的肿瘤的疗法的功效 - Google Patents

抗trop-2-sn-38抗体药物缀合物用于检查点抑制剂复发/难治的肿瘤的疗法的功效 Download PDF

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    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Abstract

本发明涉及包含连接到抗Trop‑2抗体或抗原结合抗体片段的SN‑38的治疗性ADC，更特别是萨希珠单抗戈维替康。将ADC施用到患有对用检查点抑制剂的先前治疗有抗性或从用检查点抑制剂的先前治疗复发的Trop‑2阳性癌症的受试者。所述疗法有效治疗对检查点抑制剂有抗性的癌症。

Description

抗TROP-2-SN-38抗体药物缀合物用于检查点抑制剂复发/难 治的肿瘤的疗法的功效
相关申请
本申请根据35U.S.C.119(e)要求2016年4月27日提交的美国临时专利申请62/328,289的权益，该申请的全部文本以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式通过EFS-Web提交并且由此以引用的方式整体并入本文。2017年4月5日创建的所述ASCII拷贝被命名为IMM366WO2_SL.txt.，并且大小为13,002字节。
技术领域
本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)的治疗用途，所述抗体-药物缀合物包含抗Trop-2抗体或其抗原结合片段和喜树碱如SN-38，其具有改善靶向人受试者中的各种癌细胞的能力。在优选的实施方案中，所述抗体和治疗部分通过细胞内可裂解的键联来连接，这增加了治疗功效。在更优选的实施方案中，ADC以特定剂量和/或特定的施用方案施用，以优化治疗作用。令人惊讶的是，SN-38-缀合的抗体如萨希珠单抗戈维替康(sacituzumabgovitecan)的优化剂量和施用方案显示出意想不到的优异功效，这是从动物模型研究中无法预测的，其允许有效治疗对检查点抑制剂抗体如阿特珠单抗(atezolizumab)、帕姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、匹迪丽珠单抗(pidilizumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗、伊匹单抗(ipilimumab)或曲美木单抗(tremelimumab)有抗性的肿瘤。在具体的实施方案中，ADC可以以3mg/kg至18mg/kg、更优选4mg/kg至12mg/kg、最优选8mg/kg至10mg/kg的剂量施用到患有Trop-2阳性癌症的人受试者。令人惊讶的是，抗Trop-2-SN38抗体药物缀合物(ADC)有效治疗从检查点抑制剂疗法复发或对检查点抑制剂疗法显示抗性的患者的Trop-2阳性癌症，诸如胰腺癌、三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌和非小细胞肺癌。
发明背景
多年来，特异性靶向药物疗法领域的科学家一直致力于使用单克隆抗体(MAb)将毒性剂特异性递送至人癌症。已经开发了肿瘤相关的MAb和合适的毒性剂的缀合物，但是在人癌症的疗法中成败参半，并且几乎没有应用于诸如感染性和自身免疫性疾病的其他疾病。毒性剂最常见的是化疗药物，尽管粒子发射放射性核素或细菌或植物毒素也与MAb缀合，特别用于癌症的疗法(Sharkey和Goldenberg，CA Cancer J Clin.2006年7月至8月；56(4):226-243)并且最近，放射免疫缀合物用于某些传染病的临床前疗法(Dadachova和Casadevall，QJ Nucl Med Mol Imaging2006；50(3):193-204)。
使用MAb-化疗药物缀合物的优点是(a)化疗药物本身在结构上定义明确；(b)使用非常明确定义的缀合化学通常在远离MAb的抗原结合区的特异性位点将化疗药物与MAb蛋白连接；(c)MAb-化疗药物缀合物可以比涉及MAb和细菌或植物毒素的化学缀合物更可重复地制备并且通常具有更低的免疫原性，因此更易于商业开发和监管批准；(d)MAb-化疗药物缀合物在***上比放射性核素MAb缀合物的毒性低几个数量级，特别是对辐射敏感的骨髓而言。
喜树碱(Camptothecin；CPT)及其衍生物是一类有效的抗肿瘤剂。伊立替康(Irinotecan)(也称为CPT-11)和拓扑替康(topotecan)是已批准用作癌症治疗剂的CPT类似物(Iyer和Ratain,Cancer Chemother.Phamacol.42:S31-S43(1998))。CPT通过稳定拓扑异构酶I-DNA复合物来抑制拓扑异构酶I酶(Liu等人，The Camptothecins:UnfoldingTheir Anticancer Potential,Liehr J.G.、Giovanella,B.C.和Verschraegen(编),NYAcad Sci.,NY922:1-10(2000))。CPT在缀合物的制备中存在特定的问题。一个问题是大多数CPT衍生物在水性缓冲液中不溶解。其次，CPT为缀合到大分子的结构修饰提供特定的挑战。例如，CPT本身仅在环-E中含有叔羟基基团。在CPT的情况下的羟基官能团必须与适于随后蛋白质缀合的接头偶联；并且在有效的CPT衍生物如SN-38，化疗CPT-11的活性代谢物，以及其他含C-10-羟基的衍生物如拓扑替康和10-羟基-CPT中，在C-10位存在酚羟基使必要的C-20-羟基衍生化变得复杂。第三，喜树碱的E-环的δ-内酯部分在生理条件下的不稳定性导致抗肿瘤效力大大降低。因此，执行缀合方案使得其在7或更低的pH下执行以避免内酯环开环。然而，具有胺反应性基团的双官能CPT如活性酯的缀合通常将需要8或更高的pH。第四，细胞内可裂解部分优选并入连接CPT和抗体或其他结合部分的接头/间隔基中。
需要制备和施用抗体-CPT缀合物如抗Trop-2-SN-38缀合物(例如，萨希珠单抗戈维替康)的更有效的方法。优选地，所述方法包括优化的剂量和施用方案，其使功效最大化并使毒性最小化，以便在患有从检查点抑制剂抗体复发或对检查点抑制剂抗体有抗性的Trop-2阳性癌症的患者中使用。
发明内容
如本文所用，除非另有明确说明，否则缩写“CPT”可以指喜树碱或其任何衍生物如SN-38。本发明通过提供用于制备和施用CPT-抗体ADC的改进方法和组合物解决本领域中未满足的需要。优选地，喜树碱是SN-38，并且该抗体是抗Trop-2抗体(例如，萨希珠单抗戈维替康)。所公开的方法和组合物可用于治疗难治或对其他形式的疗法响应较弱的疾病，诸如对用检查点抑制剂抗体治疗有抗性或从检查点抑制剂抗体治疗复发的Trop-2+癌症。
优选地，ADC的抗体部分是单克隆抗体、抗体片段、双特异性或其他多价抗体或其他基于抗体的分子或化合物。该抗体可具有各种同种型，优选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更优选地包括人IgG1铰链和恒定区序列。抗体或其片段可以是嵌合人-小鼠、嵌合人-灵长类动物、人源化(人框架和鼠高变(CDR)区)或完全人抗体以及其变型形式，诸如半IgG4抗体(被称为“单抗体”)，如由van der Neut Kolfschoten等人描述(Science 2007；317:1554-1557)。更优选地，抗体或其片段可以设计或选择成包含属于特异性同种异型的人恒定区序列，从而可在ADC施用到人受试者时导致免疫原性降低。施用的优选同种异型包括非G1m1同种异型(nG1m1)，诸如G1m3、G1m3,1、G1m3,2或G1m3,1,2。更优选地，同种异型选自由以下组成的组：nG1m1、G1m3、nG1m1,2和Km3同种异型。
示例性抗Trop-2抗体是人源化RS7(hRS7)抗体，其包含轻链C DR序列CDR1(KASQDVSIAVA,SEQ ID NO:1)、CDR2(SASYR YT,SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT,SEQ IDNO:3)，以及重链CDR序列CDR1(NYGMN,SEQ ID NO:4)、CDR2(WINTYTGE PTYTDDFKG,SEQ IDNO:5)和CDR3(GGFGSSYWYFDV,SEQ I D NO:6)。
在优选的实施方案中，化疗部分选自喜树碱(CPT)及其类似物和衍生物，并且更优选为SN-38。然而，可以使用的其他化疗部分包括紫杉烷类(例如，浆果赤霉素III、紫杉醇)、埃坡霉素(epothilones)、蒽环类药物(anthracyclines)(例如，多柔比星(doxorubicin)(DOX)、表柔比星(epirubicin)、吗啉代多柔比星(吗啉代-DOX)、氰基吗啉代-多柔比星(氰基吗啉代-DOX)、2-吡咯啉代多柔比星(2-PDOX)或2-PDOX的前药形式(pro-2-PDOX)；参见，例如，Priebe W(编辑)，ACS symposium series 574，由American Chemical Society，Washington DC，1995(第332页)和Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2464-2469,1996)、由格尔德霉素(geldanamycin)示例的苯并醌安沙霉素(ansamycins)(DeBoer等人，Journal of Antibiotics 23:442-447,1970；Neckers等人，Invest.New Drugs 17:361-373,1999)等。优选地，抗体或其片段与至少一个化疗部分、优选1个至约5个化疗部分、更优选6个或更多个化疗部分、最优选约6个至约12个化疗部分连接。
各种实施方案可以涉及使用本发明的方法和组合物来治疗表达人Trop-2的癌症，这类癌症包括但不限于癌瘤，诸如食道、胰腺、肺、胃、结肠和直肠、膀胱、乳腺、卵巢、子宫、肾、尿路上皮和***的癌瘤。
在涉及治疗癌症的某些实施方案中，药物缀合物可以与手术、放射疗法、化疗、利用裸抗体的免疫疗法、放射性免疫疗法、免疫调节剂、疫苗等组合使用。这些组合疗法可以允许在这类组合中给予较低剂量的各治疗剂，由此减少某些严重副作用，并且可能缩短所需的疗程。当没有或具有最小程度的重叠毒性时，也可以给予每种药剂的全部剂量。在替代实施方案中，ADC可以与如下讨论的干扰素、检查点抑制剂抗体、布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂、PI3K抑制剂、PARP抑制剂或微管抑制剂组合施用。
ADC的优选最佳剂量可以包括3mg/kg至18mg/kg的静脉注射剂量，优选每周一次、每周两次或每隔一周一次给予。最佳给药方案可以包括连续两周治疗，然后休息一周、两周、三周或四周；或治疗周和休息周交替；或治疗一周，然后休息两周、三周或四周；或治疗三周，然后休息一周、两周、三周或四周；或治疗四周，然后休息一周、两周、三周或四周；或治疗五周，然后休息一周、两周、三周或四周；或每两周施用一次，每三周施用一次或每月施用一次的治疗周期。治疗可以延长任何数量的周期，优选至少2个周期，至少4个周期，至少6个周期，至少8个周期，至少10个周期，至少12个周期，至少14个周期或至少16个周期。示例性使用剂量可以包括4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg和18mg/kg。优选的剂量是4mg/kg、6mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg或12mg/kg。
在某些替代实施方案中，其中皮下施用ADC，诸如萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132)的ADC的剂量可能受到在没有沉淀或聚集的情况下浓缩ADC的能力以及可以皮下给予的施用量的限制(优选1ml、2ml或3ml或更少)。因此，对于皮下施用，ADC可以1.5mg/kg至4mg/kg给药，每天给药，持续1周，或每周给药3次，持续2周，或每周给药两次，持续两周，然后休息。在使用多位点皮下注射的情况下，可以提供高达8mg/kg的剂量。可以在诱导后每两到三周或每月一次静脉内或皮下施用维持剂量的ADC。或者，可以以8mg/kg至10mg/kg静脉内施用2至4个周期(每个周期是在两个21天周期的第1天和第8天施用ADC，其间有一周的休息期)，然后每周皮下注射活性剂量一次或多次或作为维持治疗进行诱导。可以基于临时肿瘤扫描和/或通过分析Trop-2阳性循环肿瘤细胞来调整剂量。
普通技术人员将认识到，在选择ADC的最佳剂量时，可以考虑多种因素，诸如年龄、一般健康状况、特定器官功能或体重以及先前疗法对特定器官***(例如，骨髓)的影响，以及在治疗过程期间可以增加或降低施用的剂量和/或频率。在少至4至8剂量后观察到肿瘤收缩的迹象的情况下，可以根据需要重复剂量。本文公开的优化剂量和施用方案在人受试者中显示出意想不到的优异功效和降低的毒性，这在动物模型研究中是无法预测的。令人惊讶的是，优异的功效允许治疗先前发现对包括检查点抑制剂疗法的一种或多种标准抗癌疗法有抗性的肿瘤。
本发明方法可以包括使用CT和/或PET/CT或MRI来定期测量肿瘤响应。还可以监测诸如CEA(癌胚抗原)、CA19-9、AFP、CA15.3或PSA的肿瘤标志物的血液水平。根据成像和/或标志物血液水平的结果，可以根据需要调整剂量和/或施用方案。
本发明要求保护的组合物和方法的令人惊讶的结果是即使在重复输注下，高剂量的抗体-药物缀合物也具有意想不到的耐受性，仅观察到恶劣和呕吐的相对低级的毒性或具有可控制的中性粒细胞减少症。另一个令人惊讶的结果是缺乏抗体-药物缀合物的积聚，这与具有与白蛋白、PEG或其他载体缀合的SN-38的其他产品不同。即使在重复给药或增加给药后，缺乏积聚也与改善的耐受性和缺乏严重毒性相关。这些令人惊讶的结果允许优化剂量和递送方案，具有出乎意料的高功效和低毒性。所要求保护的方法在具有先前抗性癌症的个体中提供15％或更多、优选20％或更多、优选30％或更多、更优选40％或更多的实体肿瘤尺寸收缩(如通过最长直径测量)。普通技术人员将认识到肿瘤尺寸可以通过诸如总肿瘤体积、任何维度的最大肿瘤尺寸或几个维度的尺寸测量的组合的各种不同的技术来测量。这可以使用诸如计算机断层扫描、超声波检查和/或正电子发射断层扫描的标准放射学程序进行。测量尺寸的方法不如观察用ADC治疗引起肿瘤尺寸减小的趋势重要，ADC治疗优选导致肿瘤消除。
虽然ADC可以周期性快速浓注来施用，但是在替代实施方案中，ADC可通过连续输注抗体-药物缀合物来施用。为了增加Cmax并且延伸ADC在血液中的PK，连续输注可例如通过留置导管来施用。这类设备在本领域中是已知的，诸如或PORT-A-导管(参见，例如，Skolnik等人，Ther Drug Monit32:741-48,2010)并且可使用任何这类已知的留置导管。各种连续输注泵在本领域中也是已知的并且可使用任何这类已知的输注泵。连续输注的剂量范围可在0.1mg/kg/天与3.0mg/kg/天之间。更优选地，这些ADC可通过在2至5小时，更优选地2-3小时的相对较短周期内静脉内输注来施用。
在特别优选的实施方案中，ADC和给药方案在对标准疗法有抗性的患者中可有效。例如，可以将抗Trop-2萨希珠单抗戈维替康施用到对用伊立替康(SN-38的母体试剂)的先前疗法没有响应的患者。令人惊讶的是，伊立替康抗性患者可以对萨希珠单抗戈维替康显示出部分或甚至完全的响应。ADC特异性靶向肿瘤组织的能力可以通过改善靶向和增强治疗剂的递送来克服肿瘤抗性。与诸如检查点抑制剂抗体的替代标准治疗性治疗相比，ADC可以显示出类似的改善的功效和/或降低的毒性。
特定优选的受试者可以是转移性结肠直肠癌患者；转移性胰腺癌患者；三阴性乳腺癌患者；HER+、ER+、孕酮+乳腺癌患者；转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者；转移性小细胞肺癌患者；转移性胃癌患者；转移性肾癌患者；转移性尿路上皮癌患者；转移性膀胱癌患者；转移性卵巢癌患者或转移性子宫癌患者。
附图说明
图1.用10mg/kg萨希珠单抗戈维替康治疗的具有检查点抑制剂抗性转移性TNBC的患者的CT扫描结果的总结。
图2.具有检查点抑制剂抗性转移性TNBC的患者的基线CT图像，显示轴向图像(顶行)和矢形图像(底行)。肿瘤用箭头指示。
图3.在用10mg/kg萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132)治疗之前和之后，对靶病变1和2进行的CT扫描的比较。顶部显示基线图像，且底部显示萨希珠单抗戈维替康疗法后的第二响应评估。清楚地观察到由IMMU-132诱导的肿瘤收缩。
图4.在用10mg/kg萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132)治疗之前和之后对靶病变3进行的CT扫描的比较。顶部显示基线图像，且底部显示萨希珠单抗戈维替康疗法后的第二响应评估。清楚地观察到由IMMU-132诱导的肿瘤收缩。
图5.用IMMU-132治疗的具有检查点抑制剂抗性肿瘤的患者的结果的总结。
具体实施方式
定义
在下面的描述中，使用了许多术语，并且提供以下定义以便于理解所要求保护的主题。本文未明确定义的术语根据其一般和普通含义使用。
除非另外指明，否则一个/种意指“一个(种)或多个(种)”。
术语约在本文中用以意指数值的加上或减去百分之十(10％)。例如，“约100”是指在90和110之间的任何数字。
如本文使用的抗体是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程来形成)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的抗原结合部分，如抗体片段。抗体或抗体片段可以在所要求保护的主题的范围内缀合或以其他方式衍生化。此类抗体包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4(和IgG4亚型)以及IgA同种型。如下所用，缩写“MAb”可以互换地用以指抗体、抗体片段、单克隆抗体或多特异性抗体。
“抗体片段”是抗体的一部分，诸如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv(单链Fv)、单结构域抗体(DAB或VHH)等，包括上文引用的IgG4的半分子(van derNeut Kolfschoten等人，(Science 2007；317(9月14日):1554-1557)。无论结构如何，使用的抗体片段都与由完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”还包括合成或基因工程化的蛋白质，其通过与特定抗原结合形成复合物而像抗体一样起作用。举例来说，抗体片段包括由可变区组成的分离片段，如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻可变区和重可变区由肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。可以以不同的方式构建片段以产生多价和/或多特异性结合形式。
裸抗体通常是没有与治疗剂缀合的完整抗体。裸抗体可以例如通过Fc依赖性功能表现出治疗和/或细胞毒性作用，例如补体结合(CDC)和ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒性)。然而，诸如细胞凋亡、抗血管生成、抗转移活性、抗粘附活性、异型或同型粘附的抑制以及信号传导途径中的干扰的其他机制也可以提供治疗作用。裸抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体、天然存在或重组的抗体，诸如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体及其片段。在一些情况下，“裸抗体”也可以指“裸”抗体片段。如本文所定义，“裸”与“未缀合”同义，并且意指未与治疗剂连接或缀合。
嵌合抗体是一种重组蛋白，其含有重抗体链和轻抗体链的可变结构域，包括来源于一种物种的抗体，优选啮齿动物抗体，更优选鼠抗体的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定结构域可来源于诸如灵长类动物、猫或狗的其他物种的恒定结构域。
人源化抗体是一种重组蛋白，其中将来自一个物种的抗体如鼠抗体的CDR从鼠抗体的可变重链和可变轻链转移到人重链和轻链可变结构域(框架区)中。抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。在一些情况下，可以修饰，例如用来自原始鼠科动物、啮齿动物、非人灵长类动物或其他抗体的相应残基置换人源化抗体的框架区的特定残基，特别是触及或接近CDR序列的那些残基。
人抗体是例如从转基因小鼠中获得的抗体，所述转基因小鼠已经被“基因工程化”以响应于抗原攻击而产生人抗体。在此技术中，将人重链基因座和轻链基因座的元件引入至来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源重链基因座和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可以合成对各种抗原有特异性的人抗体，并且小鼠可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人，NatureGenet.7:13(1994)，Lonberg等人，Nature368:856(1994)，和Taylor等人，Int.Immun.6:579(1994)描述。还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建完全人抗体，所述方法和技术在本领域中都是已知的。参见例如，McCafferty等人，Nature 348:552-553(1990)，其描述从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因库体外产生人抗体及其片段。在此技术中，将人抗体可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体粒子的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性进行选择也导致选择编码表现所述特性的抗体的基因。以此方式，噬菌体模拟B细胞的一些特性。可以在各种形式下进行噬菌体展示，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology3:5564-571(1993)。还可以由体外活化的B细胞来产生人抗体。参见，美国专利号5,567,610和5,229,275，其中每篇专利的实施例部分均以引用方式并入本文。
治疗剂是对疾病的治疗有用的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括但不限于抗体、抗体片段、免疫缀合物、药物、细胞毒性剂、促凋亡剂、毒素、核酸酶(包括DNA酶和RNA酶)、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光活性剂或染料、放射性核素、低聚核苷酸、干扰RNA、siRNA、RNAi、抗血管生成剂、化疗剂、细胞因子、趋化因子、前药、酶、结合蛋白或肽或其组合。
免疫缀合物是与治疗剂缀合的抗体、抗原结合抗体片段、抗体复合物或抗体融合蛋白。缀合可以是共价的或非共价的。优选地，缀合是共价的。当治疗剂是药物时，所得免疫缀合物是抗体-药物缀合物或ADC。
如本文所用，术语抗体融合蛋白是重组产生的抗原结合分子，其中一种或多种天然抗体、单链抗体或抗体片段与诸如蛋白质或肽、毒素、细胞因子、激素等的另一部分连接。在某些优选的实施方案中，融合蛋白可以包含融合在一起的两种或更多种相同或不同的抗体、抗体片段或单链抗体，其可以结合相同的表位、相同抗原上的不同表位或不同的抗原。
免疫调节剂是在存在时改变、抑制或刺激身体的免疫***的治疗剂。通常，使用的免疫调节剂刺激免疫细胞以在免疫应答级联中增殖或被激活，诸如巨噬细胞、树枝状细胞、B细胞和/或T细胞。然而，在一些情况下，免疫调节剂可以抑制免疫细胞的增殖或活化。如本文所述的免疫调节剂的实例是细胞因子，其是约5kDa至20kDa的可溶性小蛋白，其是在与特异性抗原接触时由一种细胞群(例如，引发的T-淋巴细胞)释放，并且其充当细胞间的细胞间介质。如技术人员将理解的，细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、白细胞介素和几种相关的信号分子，诸如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素。趋化因子是细胞因子的子集。某些白细胞介素和干扰素是刺激T细胞或其他免疫细胞增殖的细胞因子的实例。示例性的干扰素包括干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ和干扰素-λ。
CPT是喜树碱的缩写，且如本申请中所用，CPT表示喜树碱本身或喜树碱的类似物或衍生物，诸如SN-38。喜树碱和其一些类似物的结构在下文图表1中式1中给出，其中指定编号并且环用字母A-E标记。
图表1
抗Trop-2抗体
各种实施方案涉及结合Trop-2的抗体或其片段的用途。在一个特别优选的实施方案中，抗Trop-2抗体可以是人源化RS7抗体(参见例如，美国专利号7,238,785，全文以引用的方式并入本文)，其包括轻链CDR序列CDR1(KASQDVSIAVA,SEQ ID NO:1)、CDR2(SASYRYT,SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT,SEQ ID NO:3)以及重链CDR序列CDR1(NYGMN,SEQ ID NO:4)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG,SEQ ID NO:5)和CDR3(GGFGSSYWYFDV,SEQ ID NO:6)。
RS7抗体是针对人原发性鳞状细胞肺癌的粗膜制剂产生的鼠IgG1。(Stein等人，Cancer Res.50:1330,1990)RS7抗体识别46-48kDa糖蛋白，其表征为簇13。(Stein等人，Int.J.Cancer Supp.8:98-102,1994)抗原命名为EGP-1(上皮糖蛋白-1)，但也称为Trop-2。
Trop-2是I型跨膜蛋白，并且已经从人细胞(Fornaro等人，Int J Cancer 1995；62:610-8)和小鼠细胞(Sewedy等人，Int J Cancer 1998；75:324-30)克隆。人Trop-2的氨基酸序列是公知的(参见，例如，NCBI目录号P09758.3)。除了其作为肿瘤相关钙信号传导物的作用外(Ripani等人，Int J Cancer 1998；76:671-6)，人Trop-2的表达表明是肿瘤发生和结肠癌细胞的侵袭所必需的，其可以用针对Trop-2的细胞外结构域的多克隆抗体有效地降低(Wang等人，Mol Cancer Ther2008；7:280-5)。
对Trop-2作为实体癌症的治疗靶点的关注日益增加(Cubas等人，BiochimBiophys Acta 2009；1796:309-14)通过进一步的报道证实，这些报道记载了过表达的Trop-2在乳腺癌(Huang等人，Clin Cancer Res2005；11:4357-64)、结肠直肠癌(Ohmachi等人，Clin Cancer Res2006；12:3057-63；Fang等人，Int J Colorectal Dis 2009；24:875-84)和口腔鳞状细胞癌(Fong等人，Modern Pathol 2008；21:186-91)中的临床意义。表达高水平Trop-2的***基底细胞富含体外和体内干样活性的最新证据尤其值得注意(Goldstein等人，Proc Natl Acad Sci USA2008；105:20882-7)。
流式细胞术和免疫组织化学染色研究表明，RS7MAb检测多种肿瘤类型上的抗原，其中与正常人组织的结合有限(Stein等人，1990)。Trop-2主要由诸如肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌和***癌的癌瘤表达。在动物模型中使用放射性标记鼠RS7MAb进行的定位和治疗研究已经证明肿瘤靶向和治疗功效(Stein等人，1990；Stein等人，1991)。
已经在来自肺、乳腺、膀胱、卵巢、子宫、胃和***的肿瘤中证明了强RS7染色。(Stein等人，Int.J.Cancer 55:938,1993)肺癌病例包括鳞状细胞癌和腺癌。(Stein等人，Int.J.Cancer 55:938,1993)两种细胞类型都强烈染色，指示RS7抗体不区分非小细胞肺癌的组织学类别。
RS7MAb快速内化到靶细胞中(Stein等人，1993)。RS7MAb的内化率常数介于两种其他快速内化MAb的内化率常数之间，这已被证明对ADC生产有用。(同上)有充分证据表明，ADC的内化是抗肿瘤活性的必要条件。(Pastan等人，Cell 47:641,1986)药物ADC的内化已被描述为抗肿瘤功效的主要因素。(Yang等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:1189,1988)因此，RS7抗体表现出治疗应用的几种重要特性。
虽然hRS7抗体是优选的，但是其他抗Trop-2抗体是已知的和/或可以公开获得的，并且在替代实施方案中可以用于本发明的ADC中。尽管人源化或人抗体优选用于降低的免疫原性，但在替代实施方案中，可以使用嵌合抗体。如下所讨论，抗体人源化的方法是本领域熟知的，并且可以用于将可得到的鼠或嵌合抗体转化为人源化形式。
抗Trop-2抗体可从许多来源商购获得，并且包括LS-C126418、LS-C178765、LS-C126416、LS-C126417(LifeSpan BioSciences,Inc.,Seattle,WA)；10428-MM01、10428-MM02、10428-R001、10428-R030(Sino Biological Inc.,Beijing,China)；MR54(eBioscience,San Diego,CA)；sc-376181、sc-376746,Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz,CA)；MM0588-49D6,(Novus Biologicals,Littleton,CO)；ab79976和ab89928(Cambridge,MA).。
其他抗Trop-2抗体已在专利文献中公开。例如，美国公告号2013/0089872公开了抗Trop-2抗体K5-70(保藏号FERM BP-11251)、K5-107(保藏号FERM BP-11252)、K5-116-2-1(保藏号FERM BP-11253)、T6-16(保藏号FERM BP-11346)和T5-86(保藏号FERM BP-11254)，保藏于International Patent Organism Depositary,Tsukuba,Japan。美国专利号5,840,854公开了抗Trop-2单克隆抗体BR110(ATCC No.HB11698)。美国专利号7,420,040公开了由杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的抗Trop-2抗体，其以保藏号141205-05保藏于IDAC(International Depository Authority of Canada,Winnipeg,Canada)。美国专利号7,420,041公开了由杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的抗Trop-2抗体，其以保藏号141205-03保藏于IDAC。美国公告号2013/0122020公开了抗Trop-2抗体3E9、6G11、7E6、15E2、18B1。编码代表性抗体的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为PTA-12871和PTA-12872。包含连接到微管蛋白抑制剂单甲基尿嘧啶F(MMAF)的抗5T4(抗Trop-2)抗体的ADCPF06263507可从Pfizer,Inc.(Groton,CT)购得(参见，例如，Sapra等人，2013,Mol CancerTher 12:38-47)。美国专利号8,715,662公开了通过以保藏号PD 08019、PD 08020和PD08021保藏在AID-ICLC(Genoa,Italy)的由杂交瘤产生的抗Trop-2抗体。美国专利申请公告号20120237518公开了抗Trop-2抗体77220、KM4097和KM4590。美国专利号8,309,094(Wyeth)公开了通过序列表识别的抗体A1和A3。本段中上面引用的每个专利或专利申请的实施例部分都以引用的方式并入本文。非专利出版物Lipinski等人，(1981,ProcNatl.Acad Sci USA，78:5147-50)公开了抗Trop-2抗体162-25.3和162-46.2。
许多抗Trop-2抗体是本领域已知的和/或可公开获得的。如下所讨论，制备针对已知抗原的抗体的方法在本领域中是常规的。产生人源化、人或嵌合抗体的方法也是已知的。根据本领域的一般知识阅读本公开内容的普通技术人员将能够获得并使用本发明ADC中的抗Trop-2抗体的属性。
已经公开了针对与Trop-2有关的靶标的抗体用于不同于ADC的免疫治疗剂的用途。鼠抗Trop-1 IgG2a抗体依决洛单抗(edrecolomab)已被用于治疗结肠直肠癌，尽管鼠抗体并不适合人临床使用(Baeuerle和Gires，2007,Br.J Cancer 96:417-423)。据报道，低剂量皮下施用依决洛单抗诱导针对疫苗抗原的体液免疫响应(Baeuerle和Gires，2007)。阿德木单抗(Adecatumumab)(MT201)，一种完全人抗Trop-1抗体，已被用于转移性乳腺癌和早期***癌，并据报道通过ADCC和CDC活性起作用(Baeuerle和Gires，2007)。MT110，一种单链抗Trop-1/抗CD3双特异性抗体构建体，具有已报道的针对卵巢癌的功效(Baeuerle和Gires，2007)。普罗昔铵(Proxinium)，一种包含与假单胞菌外毒素融合的抗Trop-1单链抗体的免疫毒素，已经在头颈癌和膀胱癌中进行了测试(Baeuerle和Gires，2007)。这些研究均未包含任何关于抗Trop-2 ADC特别是在对用检查点抑制剂抗体治疗有抗性的患者中使用的公开内容。
喜树碱缀合物
用于制备包含连接到抗体或抗原结合抗体片段的喜树碱治疗剂的ADC的非限制性方法和组合物描述如下。在优选的实施方案中，通过在药物和抗体之间放置限定的聚乙二醇(PEG)部分(即，含有限定数量的单体单元的PEG)来增强药物的溶解度，其中所定义的PEG是低分子量PEG，其优选含有1至30个单体单元，更优选含有1至12个单体单元。
优选地，第一接头在一端连接药物，并且可以在另一端用乙炔或叠氮基团封端。该第一接头可以包含限定的PEG部分，其一端具有叠氮化物或乙炔基团，且另一端具有不同的反应性基团，诸如羧酸或羟基基团。所述双官能限定的PEG可以连接到氨基醇的胺基上，并且后者的羟基基团可以以碳酸酯的形式连接到药物上的羟基基团上。或者，所述确定的双官能PEG的非叠氮化物(或乙炔)部分任选连接到L-氨基酸或多肽的N-末端，其C-末端连接至氨基醇的氨基基团，并且后者的羟基基团分别以碳酸酯或氨基甲酸酯的形式连接到药物的羟基基团。
包含抗体偶联基团和与第一接头的叠氮化物(或乙炔)基团即乙炔(或叠氮化物)互补的反应性基团的第二接头可以通过乙炔-叠氮化物环加成反应与药物-(第一接头)缀合物反应，以提供可用于缀合到疾病靶向抗体的最终的双官能药物产物。抗体偶联基团优选为硫醇或硫醇反应性基团。
下面提供了在涉及CPT类似物如SN-38的药物-接头前体的制备中在C-20碳酸酯存在下使10-羟基基团选择性再生的方法。对于药物中的反应性羟基基团诸如SN-38中的酚羟基，也可以使用其他保护基团，例如叔丁基二甲基甲硅烷基或叔丁基二苯基甲硅烷基，并且在将衍生化药物连接到抗体偶联部分前，这些通过氟化四丁基铵去保护。或者，CPT类似物的10-羟基基团被保护为除“BOC”之外的酯或碳酸酯，使得双官能CPT与抗体缀合而无需事先将该保护基团去保护。在施用生物缀合物后，保护基团易于在生理pH条件下去保护。
在称为“点击化学”的乙炔-叠氮化物偶联中，叠氮化物部分可以在L2上，乙炔部分在L3上。或者，L2可以含有乙炔，L3含有叠氮化物。“点击化学”是指乙炔部分和叠氮化物部分之间的铜(+1)催化的环加成反应(Kolb HC和Sharpless KB，Drug Discov Today 2003；8:1128-37)，尽管已知并且可以使用替代形式的点击化学。点击化学在近中性pH条件下在水溶液中进行，因此适合于药物缀合。点击化学的优点在于它是化学选择性的，并且补充了其他众所周知的缀合化学，诸如硫醇-马来酰亚胺反应。
虽然本申请集中于使用抗体或抗体片段作为靶向部分，但本领域技术人员将认识到，在缀合物包含抗体或抗体片段的情况下，可以取代另一种类型的靶向部分，诸如适体、亲合力多聚体、亲合体或肽配体。
示例性的优选实施方案涉及药物衍生物和通式2的抗体的缀合物，
MAb-[L2]-[L1]-[AA]m-[A’]-Drug (2)
其中MAb是疾病靶向抗体；L2是包含抗体偶联部分和一个或多个乙炔(或叠氮化物)基团的交联剂的组分；L1包含在一端具有叠氮化物(或乙炔)的限定的PEG，其与L2中的乙炔(或叠氮化物)部分互补，并且在另一端具有反应性基团如羧酸或羟基基团；AA为L-氨基酸；m为值为0、1、2、3或4的整数；A’为另外的间隔基，选自乙醇胺、4-羟基苄基醇、4-氨基苄基醇或取代或未取代的乙二胺。‘AA’的L氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。如果A'基团含有羟基，则其分别以碳酸酯或氨基甲酸酯的形式连接到药物的羟基基团或氨基基团。
在式2的优选实施方案中，A'是衍生自L-氨基酸的取代的乙醇胺，其中氨基酸的羧酸基团被羟甲基部分取代。A'可以衍生自以下L-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在式2的优选实施方案的缀合物的实例中，m为0，A'为L-缬氨醇，并且药物以SN-38为例。所得结构如式3所示。
在式2的优选实施方案的缀合物的另一个实例中，m为1并且由衍生的L-赖氨酸表示，A'是L-缬氨醇，并且药物以SN-38为例。结构如式4所示。
在该实施方案中，首先使用赖氨酸氨基基团的正交保护基团在氨基酸如赖氨酸的羧酸和缬氨醇的氨基基团之间形成酰胺键。去除赖氨酸的N-末端上的保护基团，保持赖氨酸侧链上的保护基团完整，并且N-末端与限定的PEG上的羧基基团偶联，在另一端与叠氮化物(或乙炔)偶联。然后将缬氨醇的羟基基团连接到10-羟基保护的SN-38的20-氯甲酸酯衍生物上，并将该中间体与携带点击环加成化学中涉及的抗体结合部分以及互补的乙炔(或叠氮化物)基团的L2组分偶联。最后，去除赖氨酸侧链和SN-38上的保护基团得到该实施例的产物，如式3所示。
虽然不希望受理论束缚，但在细胞内蛋白水解后产生的小MW SN-38产物，即缬氨醇-SN-38碳酸酯，具有通过涉及缬氨醇的氨基基团和碳酸酯的羰基的分子内环化释放完整SN-38的另外途径。
在另一个优选的实施方案中，通式2的A’为A-OH，其中A-OH是可塌缩的部分，诸如4-氨基苄醇或在苄基位置被C1-C10烷基基团取代的取代的4-氨基苄醇，并且后者通过其氨基基团连接到L-氨基酸或包含多达4个L-氨基酸部分的多肽；其中N-末端连接到在抗体结合基团中封端的交联剂。
下面给出一个优选实施方案的实例，其中通式(2)的A'的A-OH实施方案衍生自取代的4-氨基苄醇，并且‘AA’由单个L-氨基酸组成，其中，在通式(2)中，m＝1，并且药物以SN-38为例。该结构如下表示(式5，称为MAb-CLX-SN-38)。AA的单个氨基酸选自以下L-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。4-氨基苄醇部分(A'的A-OH实施方案)上的取代基R为氢或选自C1-C10烷基基团的烷基基团。
式5的MAb-CLX-SN-38的特别优选的实施方案，其中单个氨基酸AA为L-赖氨酸并且R＝H，并且药物以SN-38为例(式6；称为MAb-CL2A-SN-38)。该结构与接头MAb-CL2-SN-38的不同之处在于单个赖氨酸残基取代CL2接头中见到的Phe-Lys二肽。将Phe-Lys二肽设计为溶酶体酶的组织蛋白酶B裂解位点，认为这对于结合药物的细胞内释放是重要的。令人惊讶的是，尽管消除了组织蛋白酶裂解位点，但包含CL2A接头的ADC至少同样有效，并且在体内可以比包含CL2接头的那些更有效。
在含10-羟基的喜树碱如SN-38的背景下，其他实施方案也是可能的。在SN-38作为药物的实例中，药物的反应性更高的10-羟基基团被衍生化，使得20-羟基基团不受影响。在通式2内，A'是取代的乙二胺。该实施方案的一个实例由下式‘7’表示，其中SN-38的酚羟基基团被衍生为具有取代的乙二胺的氨基甲酸酯，其中该二胺的另一胺衍生为具有4-氨基苄醇的氨基甲酸酯并且后者的氨基基团连接到Phe-Lys二肽。在该结构(式7)中，R和R'独立地为氢或甲基。当R＝R'＝甲基时，其被称为MAb-CL17-SN-38或MAb-CL2E-SN-38。
在某些实施方案中，AA包含多肽部分，优选二、三或四肽，其可被细胞内肽酶裂解。实例如下：Ala-Leu、Leu-Ala-Leu和Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:20)(Trouet等人，1982)。另一个示例是Phe-Lys部分，其可被溶酶体组织蛋白酶裂解。
在一个优选的实施方案中，缀合物的L1组分含有具有1-30个重复单体单元的限定的聚乙二醇(PEG)间隔基。在进一步优选的实施方案中，PEG是具有1-12个重复单体单元的限定的PEG。PEG的引入可以包括使用可以商购获得的异双官能化PEG衍生物。异双官能PEG可以含有叠氮化物或乙炔基团。含有8个重复单体单元(其中'NHS'为琥珀酰亚胺基)的异双官能限定的PEG的实例在下式8中给出：
在一个优选的实施方案中，L2具有多个乙炔(或叠氮化物)基团，范围为2-40个，但优选2-20个，更优选2-5个，以及单个抗体结合部分。
含有多个药物分子和单个抗体结合部分的抗体的代表性SN-38缀合物如下所示。该结构的‘L2’组分附加到2个乙炔基团上，引起两个叠氮基附加的SN-38分子连接。与MAb的结合表示为琥珀酰亚胺。
其中R残基为：
在优选的实施方案中，当双官能药物含有硫醇反应性部分作为抗体结合基团时，使用硫醇化试剂在抗体的赖氨酸基团上产生抗体上的硫醇。通过修饰MAb的赖氨酸基团将硫醇基团引到抗体上的方法是本领域熟知的(Wong，Chemistry of protein conjugationand cross-linking,CRC Press,Inc.,Boca Raton,FL(1991),第20-22页)。或者，使用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)轻微还原抗体上的链间二硫键(Willner等人，BioconjugateChem.4:521-527(1993))可在抗体上产生7至10个硫醇；其优点是在MAb的远离抗原结合区的链间区域中并入多个药物部分。在一个更优选的实施方案中，SN-38连接到还原的二硫化物巯基基团导致形成抗体-SN-38 ADC，其中每个抗体分子共价连接6个SN-38部分。提供用于连接药物或其他治疗剂的半胱氨酸残基的其他方法是已知的，诸如使用半胱氨酸工程化抗体(参见美国专利号7,521,541，其实施例部分通过引用并入本文)。
在替代的优选实施方案中，化疗部分选自由阿霉素(DOX)、表柔比星、吗啉代阿霉素(吗啉代-DOX)、氰基吗啉代-阿霉素(氰基吗啉代-DOX)、2-吡咯啉基-阿霉素(2-PDOX)、Pro-2PDOX、CPT、10-羟基喜树碱、SN-38、拓扑替康、勒托替康(lurtotecan)、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、紫杉烷、格尔德霉素、安莎霉素和埃坡霉素组成的组。在一个更优选的实施方案中，化疗部分是SN-38。优选地，在优选实施方案的缀合物中，抗体与至少一个化疗部分连接；优选与1个至约12个化疗部分连接；最优选与约6个至约12个化疗部分连接。
另外，在一个优选的实施方案中，接头组分‘L2’包含硫醇基团，其与在所述抗体的一个或多个赖氨酸侧链氨基基团处引入的硫醇反应性残基反应。在这类情况下，通过本领域充分描述的程序，抗体用诸如马来酰亚胺、乙烯基砜、溴乙酰胺或碘乙酰胺的硫醇反应性基团预衍生化。
在该工作的背景下，令人惊讶地发现了一种方法，通过该方法可以制备CPT药物-接头，其中CPT另外具有10-羟基基团。该方法包括但不限于将10-羟基基团保护为叔丁氧基羰基(BOC)衍生物，然后制备药物-接头缀合物的倒数第二个中间体。通常，去除BOC基团需要用诸如三氟乙酸(TFA)的强酸处理。在这些条件下，含有待去除的保护基团的CPT 20-O-接头碳酸酯也易于裂解，从而产生未改性的CPT。事实上，如本领域所阐述的，对于接头分子的赖氨酸侧链使用温和可去除的甲氧基三苯甲基(MMT)保护基团的基本原理正是为了避免这种可能性(Walker等人，2002)。发现通过进行短时间，最佳3至5分钟的反应，可以选择性去除酚类BOC保护基团。在这些条件下，主要产物是去除了10-羟基位置的‘BOC’，而‘20’位置上的碳酸酯完整的产物。
一种替代方法涉及用‘BOC’以外的基团保护CPT类似物的10-羟基位置，使得最终产物准备好与抗体缀合，而不需要使10-OH保护基团去保护。将10-OH转化为酚碳酸酯或酚酯的10-羟基保护基团易于通过生理pH条件或在体内施用缀合物后通过酯酶去保护。He等人已经描述了在生理条件下与10-羟基喜树碱的20位置上的叔碳酸酯相比更快地去除在10位置上的酚类碳酸酯。(He等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry 12:4003-4008(2004))。SN-38上的10-羟基保护基可以是‘COR’，其中R可以是取代的烷基，例如“N(CH3)2-(CH2)n-”，其中n为1-10，并且其中末端氨基基团任选地以用于增强水溶性的季盐的形式，或简单的烷基残基，诸如“CH3-(CH2)n-”，其中n为0-10，或者它可以是烷氧基部分，诸如“CH3-(CH2)n-O-”，其中n为0-10，或“N(CH3)2-(CH2)n-O-”，其中n为2-10，或“R1O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-”，其中R1为乙基或甲基，并且n是值为0-10的整数。如果最终衍生物是碳酸酯，则通过用所选试剂的氯甲酸酯处理，可以容易地制备这些10-羟基衍生物。通常，使用三乙胺作为碱用二甲基甲酰胺中的摩尔当量的氯甲酸酯处理含有10-羟基的喜树碱如S N-38。在这些条件下，20-OH位不受影响。为了形成10-O-酯，使用所选试剂的酰氯。
在制备药物衍生物和通式2的抗体的缀合物的优选方法中，其中描述符L2、L1、AA和A-X如前面部分所述，首先制备双官能药物部分[L2]-[L1]-[AA]m-[A-X]-药物，然后使双官能药物部分与抗体(本文中指示为“MAb”)缀合。
在制备药物衍生物和通式2的抗体的缀合物的优选方法中，其中描述符L2、L1、AA和A-OH如前面部分所述，通过首先通过酰胺键将A-OH连接到AA的C-末端，然后将AA的胺末端偶联到L1的羧酸基团来制备双官能药物部分。如果AA不存在(即，m＝0)，则A-OH通过酰胺键直接连接到L1上。交联剂[L1]-[AA]m-[A-OH]连接到药物的羟基或氨基基团，然后通过借助于在L1和L2中叠氮化物(或乙炔)和乙炔(或叠氮化物)基团之间经由点击化学进行的反应连接到L1部分。
在一个实施方案中，抗体为单克隆抗体(MAb)。在其他实施方案中，抗体可为单价和/或多特异性MAb。抗体可以是鼠、嵌合、人源化或人单克隆抗体，并且所述抗体可以是完整的、片段(Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2)或亚片段(单链构建体)形式，或者是IgG1、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA同种型或其子分子。
在一个优选的实施方案中，抗体结合在癌症或恶性细胞上表达的抗原或抗原的表位，最优选Trop-2。癌细胞优选是来自造血肿瘤、癌瘤、肉瘤、黑素瘤或神经胶质瘤的细胞。将要根据本发明治疗的优选恶性肿瘤是恶性实体肿瘤或造血肿瘤。
在一个优选的实施方案中，细胞内可裂解部分可以在被MAb-药物缀合物结合到其受体后内化到细胞中后而裂解。
检查点抑制剂抗体
对用于癌症疗法的检查点抑制剂抗体的研究已经在先前认为对癌症治疗有抗性的癌症中产生前所未有的响应率(参见，例如，Ott和Bhardwaj,2013,Frontiers inImmunology 4:346；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Pardoll,2012,Nature Reviews12:252-264；Mavilio和Lugli)。用针对CTLA-4、PD-1和PD-L1的拮抗性检查点阻断抗体的疗法是癌症和其他疾病的免疫疗法的最有希望的新途径之一。与大多数抗癌剂相反，检查点抑制剂不直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体，以增强免疫***的内源性抗肿瘤活性。(Pardoll,2012,Nature Reviews 12:252-264)因为这类抗体主要通过调节对患病细胞、组织或病原体的免疫响应起作用，所以它们可以与诸如抗体-药物缀合物(ADC)的其他治疗模态组合使用，以增强ADC的抗肿瘤作用。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279)编码免疫球蛋白超家族的细胞表面膜蛋白，其在B细胞和NK细胞中表达(Shinohara等人，1995,Genomics 23:704-6；Blank等人，2007,Cancer Immunol Immunother 56:739-45；Finger等人，1997,Gene 197:177-87；Pardoll,2012,Nature Reviews 12:252-264)。抗PD1抗体已被用于治疗黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、***癌、结肠直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤和肾细胞癌(Topalian等人，2012,N Engl J Med366:2443-54；Lipson等人，2013,Clin Cancer Res19:462-8；Berger等人，2008,Clin Cancer Res 14:3044-51；Gildener-Leapman等人，2013,Oral Oncol 49:1089-96；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol5:278-85)。
示例性抗PD1抗体包括帕姆单抗(MK-3475，MERCK)、纳武单抗(BMS-936558，BRISTOL-MYERS SQUIBB)和匹迪丽珠单抗(CT-011，CURETECH LTD.)。抗PD1抗体可例如从(AB137132)、(EH12.2H7、RMP1-14)和AFFYMETRIXEBIOSCIENCE(J105、J116、MIH4)商购获得。
程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274)是PD-1的配体，在活化的T细胞、B细胞、骨髓细胞和巨噬细胞上发现。PD-1和PD-L1的复合物抑制CD8+T细胞的增殖并降低免疫响应(Topalian等人，2012，N Engl J Med 366:2443-54；Brahmer等人，2012,N Eng JMed366:2455-65)。抗PDL1抗体已被用于治疗非小细胞肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和恶性血液病(Brahmer等人，N Eng J Med 366:2455-65；Ott等人，2013,Clin Cancer Res 19:5300-9；Radvanyi等人，2013,Clin Cancer Res 19:5541；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Berger等人，2008,ClinCancerRes 14:13044-51)。
示例性抗PDL1抗体包括MDX-1105(MEDAREX)、度伐鲁单抗(MEDI4736，MEDIMMUNE)、阿特珠单抗(MPDL3280A，GENENTECH)和BMS-936559(BRISTOL-MYERSSQUIBB)。抗PDL1抗体也可例如自AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)商购获得。
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152)也是仅排他性地在T细胞上表达的免疫球蛋白超家族的成员。CTLA-4用于抑制T细胞活化，并且据报道其抑制辅助性T细胞活性并增强调节性T细胞免疫抑制活性(Pardoll，2012,Nature Reviews 12:252-264)。抗CTL4A抗体已用于治疗黑素瘤、***癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌的临床试验(Robert和Ghiringhelli，2009,Oncologist 14:848-61；Ott等人，2013,Clin Cancer Res 19:5300；Weber,2007,Oncologist 12:864-72；Wada等人，2013,J Transl Med 11:89)。
示例性抗CTLA4抗体包括伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)和曲美木单抗(PFIZER)。抗PD1抗体可例如自(AB134090)，SINO BIOLOGICAL INC.(11159-H03H、11159-H08H)和THERMO SCIENTIFIC PIERCE(PA5-29572、PA5-23967、PA5-26465、MA1-12205、MA1-35914)商购获得。伊匹单抗最近获得FDA批准用于治疗转移性黑素瘤(Wada等人，2013，J Transl Med 11:89)。
这些和其他已知的检查点抑制剂抗体都可以与IMMU-132组合使用。在优选的实施方案中，单独或组合的IMMU-132有效治疗单独的检查点抑制剂抗体难治的癌症患者。
一般抗体技术
用于制备针对几乎任何靶抗原的单克隆抗体的技术在本领域中是熟知的。例如，参见和Milstein，Nature 256:495(1975)，和Coligan等人(编),CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简单地说，可通过以下方法获得单克隆抗体：将包含抗原的组合物注入小鼠，移除脾以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对抗原的抗体的克隆，并且从杂交瘤培养物中分离抗体。普通技术人员将认识到，当抗体被施用到人受试者时，抗体将结合人抗原。
MAb可通过多种已确立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。所述分离技术包括蛋白质A或蛋白质G琼脂糖亲和色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱。参见，例如Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。另外，参见Baines等人，“PurificationofImmunoglobulin G(IgG),”，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页(TheHumana Press,Inc.1992)。
初始产生了针对免疫原的抗体之后，可对抗体进行测序，随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合为本领域的技术人员所熟知，如下文所讨论。
技术人员将认识到，所要求保护的方法和组合物可利用在本领域中已知的各种抗体中的任一种。使用的抗体可从多种已知来源商购获得。例如，多种分泌抗体的杂交瘤细胞系可从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)获得。针对包括但不限于肿瘤相关抗原的各种疾病靶的大量抗体已经保藏在ATCC和/或具有公开的可变区序列并且可用于所要求保护的方法和组合物中。参见，例如美国专利号7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572；856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040,6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953，5,525,338，其实施例部分各自以引用的方式并入本文。这些只是示例性的并且多种其他抗体及其杂交瘤在本领域中是已知的。本领域技术人员将认识到针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤细胞可通过针对所关注的选定疾病相关靶标的抗体来简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库而获得。所克隆抗体的抗原结合结构域可使用本领域中熟知的标准技术进行扩增、切除、连接至表达载体中、转染至适应宿主细胞中和用于蛋白质产生。可以使用本文公开的技术将分离的抗体缀合至治疗剂，诸如喜树碱。
嵌合和人源化抗体
嵌合抗体是一种重组抗体，其中人抗体的可变区已置换为例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)。嵌合抗体在施用到受试者时表现出降低的免疫原性和增强的稳定性。构建嵌合抗体的方法在本领域中是熟知的(例如，Leung等人，1994,Hybridoma13:469)。
嵌合单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也可置换为人FR序列。为了保持人源化单克隆的稳定性和抗原特异性，可以用小鼠对应残基置换一个或多个人FR残基。人源化单克隆抗体可以用于受试者的治疗性治疗。产生人源化单克隆抗体的技术在本领域中是熟知的。(参见，例如Jones等人，1986,Nature,321:522；Riechmann等人，Nature,1988,332:323；Verhoeyen等人，1988,Science,239:1534；Carter等人，1992,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,89:4285；Sandhu,Crit.Rev.Biotech.,1992,12:437；Tempest等人，1991,Biotechnology 9:266；Singer等人，J.Immun.,1993,150:2844。)
其他实施方案可以涉及非人灵长类动物抗体。例如，在Goldenberg等人，WO 91/11465(1991)和Losman等人，Int.J.Cancer46:310(1990)中可以见到在狒狒中产生治疗上有用的抗体的一般技术。在另一个实施方案中，抗体可以是人单克隆抗体。这类抗体可以从转基因小鼠中获得，这些转基因小鼠已经被基因工程化以响应于抗原攻击而产生特异性人抗体，如下文讨论。
人抗体
使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人抗体的方法在本领域中是已知的(例如，Mancini等人，2004,NewMicrobiol.27:315-28；Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.High Throughput Screen.8:117-26；Brekke和Loset,2003,Curr.Opin.Phamacol.3:544-50；各自以引用的方式并入本文)。预期所述完全人抗体表现出比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。在某些实施方案中，所要求保护的方法和程序可以使用由此类技术产生的人抗体。
在一个替代方案中，可使用噬菌体展示技术来产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等人，2005,Genet.Mol.Res.4:126-40，以引用的方式并入本文)。人抗体可由正常人或由表现出特定疾病状态如癌症的人产生(Dantas-Barbosa等人，2005)。由患病个体构建人抗体的优势在于循环抗体库可能偏向针对疾病相关抗原的抗体。
在该方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说，从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同上)。从μ、γ和κ链抗体库克隆重组Fab并将其***噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转变成cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab cDNA文库(Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222:581-97，以引用的方式并入本文)。根据Andris-Widhopf等人(2000,Phage Display Laboratory Manual,Barbas等人(编)，第1版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY第9.1至9.22页，以引用的方式并入本文)执行文库构建。最终Fab片段用限制性核酸内切酶消化并***噬菌体基因组中以制备噬菌体展示文库。此类文库可以通过标准的噬菌体展示方法来筛选。熟练的技术人员将认识到此技术仅是示例性的，并且可以使用任何用于通过噬菌体展示而制备和筛选人抗体或抗体片段的已知方法。
在另一种替代方案中，使用如上所讨论的标准免疫实验方案，已经被基因工程化以产生人抗体的转基因动物可以用来产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人，Nature Genet.7:13(1994)，Lonberg等人，Nature 368:856(1994)，和Taylor等人，Int.Immun.6:579(1994)描述。这类***的非限制性实例是得自Abgenix(Fremont,CA)的(例如，Green等人，1999,J.Immunol.Methods 231:11-23，以引用的方式并入本文)，其中已使小鼠抗体基因失活并置换为功能性人抗体基因，而小鼠免疫***的其余部分保持完整。
用含有人IgH和Igκ基因座的部分的种系配置的YAC(酵母人工染色体)来转化转基因小鼠，所述基因座部分包括大部分的可变区序列连同附属基因和调控序列。人可变区库可以用来产生生成抗体的B细胞，所述B细胞可以通过已知的技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的将通过正常免疫响应产生人抗体，其可通过上文所讨论的标准技术进行收获和/或产生。可得到遗传工程化小鼠的多种品系，其各自能够产生不同类别的抗体。已经显示转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药物动力学特性(Green等人，1999)。熟练技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用***，而是可利用已进行遗传工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
生产抗体片段
所要求保护的方法和/或组合物的一些实施方案可以涉及抗体片段。例如，可以通过常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得此类抗体片段。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶酶促裂解抗体来产生，以提供5S片段，称为F(ab')2。该片段可使用硫醇还原剂和任选地用于由二硫键裂解产生的巯基基团的阻断基团进行进一步裂解以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行酶促裂解产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。用于产生抗体片段的示例性方法公开在美国专利号4,036,945；美国专利号4,331,647；Nisonoff等人，1960,Arch.Biochem.Biophys.,89:230；Porter,1959,Biochem.J.,73:119；Edelman等人，1967,METHODS IN ENZYMOLOGY，第422页(Academic Press)；和Coligan等人(编),1991,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,(John Wiley&Sons)中。
还可使用裂解抗体的其他方法，诸如分离重链以形成单价轻-重链片段、进一步裂解片段，或其他酶促、化学或遗传技术，只要所述片段结合由完整抗体识别的抗原即可。例如，Fv片段包含VH和VL链的缔合。这种缔合可以是非共价的，如Inbar等人，1972，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,69:2659中所述。或者，可变链可以通过分子间二硫键连接或通过诸如戊二醛的化学品交联。参见Sandhu,1992,Crit.Rev.Biotech.,12:437。
优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)通过构建包含编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备，这些DNA序列通过低聚核苷酸接头序列连接。将结构基因***表达载体中，随后将表达载体引入宿主细胞如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成单个多肽链，该多肽链具有桥接这两个V结构域的接头肽。产生scFv的方法在本领域中是熟知的。参见Whitlow等人，1991,Methods:A Companion to MethodsinEnzymology2:97；Bird等人，1988,Science,242:423；美国专利号4,946,778；Pack等人，1993,Bio/Technology,11:1271；和Sandhu,1992,Crit.Rev.Biotech.,12:437。
另一种形式的抗体片段是单结构域抗体(dAb)，有时被称为单链抗体。用于产生单结构域抗体的技术在本领域中是熟知的(参见，例如Cossins等人，Protein ExpressionandPurification,2007,51:253-59；Shuntao等人，MolecImmunol2006,43:1912-19；Tanha等人，J.Biol.Chem.2001,276:24774-780)。其他类型的抗体片段可包含一个或多个互补决定区(CDR)。可以通过构建编码所关注的抗体的CDR的基因来获得CDR肽(“最小识别单元”)。此类基因例如通过使用聚合酶链反应以合成来自产生抗体的细胞的RNA的可变区来制备。参见Larrick等人，1991,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106；Ritter等人(编),1995,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION，第166-179页(Cambridge University Press)；Birch等人(编),1995,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS，第137-185页(Wiley-Liss,Inc.)
抗体变型
在某些实施方案中，可以改变抗体的序列如抗体的Fc部分以优化缀合物的生理特征，诸如血清中的半衰期。置换蛋白质中的氨基酸序列的方法在本领域中是广泛已知的，诸如通过定点诱变进行(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning,A laboratory manual,第2版，1989)。在优选的实施方案中，变型可以涉及在Fc序列中添加或去除一个或多个糖基化位点(例如，美国专利号6,254,868，该专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。在其他优选的实施方案中，可以进行Fc序列中的特定氨基酸取代(例如，Hornick等人，2000,JNuclMed41:355-62；Hinton等人，2006,JImmunol 176:346-56；Petkova等人，2006,IntImmunol 18:1759-69；美国专利号7,217,797，各自以引用的方式并入本文中)。
靶抗原和示例性抗体
在一个优选实施方案中，使用识别和/或结合至抗原的抗体，所述抗原以高水平表达于靶细胞上并且主要或仅表达于患病细胞上而非正常组织上。更优选地，抗体在结合后迅速内化。示例性快速内化抗体是LL1(抗CD74)抗体，内化率为每个细胞每天内化约8×106个抗体分子(例如，Hansen等人，1996,Biochem J.320:293-300)。因此，“快速内化”抗体可以是内化率为每个细胞每天内化约1×106至约1×107个抗体分子的抗体。所要求保护的组合物和方法中使用的抗体可以包括具有如上所述特性的MAb。用于治疗例如癌症的示例性抗体包括但不限于LL1(抗CD74)、LL2或RFB4(抗CD22)、维妥珠单抗(hA20，抗CD20)、利妥昔单抗(抗CD20)、阿托珠单抗(GA101，抗CD20)、兰布罗利珠单抗(抗PD-1受体)、纳武单抗(抗PD-1受体)、伊匹单抗(抗CTLA-4)、RS7(抗-上皮细胞糖蛋白-1(EGP-1，也称为TROP-2))、PAM4或KC4(均为抗粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEA，也称为CD66e或CEACAM5)、MN-15或MN-3(抗CEACAM6)、Mu-9(抗结肠-特异性抗原-p)、Immu 31(抗-α-胎蛋白)、R1(抗-IGF-1R)、A19(抗CD19)、TAG-72(例如，CC49)、Tn、J591或HuJ591(抗PSMA(***-特异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚体)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗-碳酸酐酶IXMAb)、L243(抗HLA-DR)阿仑珠单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥珠单抗(抗CD33)、伊图莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗CD20)；帕木单抗(抗EGFR)；托西莫单抗(抗CD20)；PAM4(又名司可利妥珠单抗，抗粘蛋白)和曲妥珠单抗(抗ErbB2)。这类抗体在本领域中是已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239和美国专利申请公告号20050271671；20060193865；20060210475；20070087001，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。有用的具体已知的抗体包括hPAM4(美国专利号7,282,567)、hA20(美国专利号7,251,164)、hA19(美国专利号7,109,304)、hIMMU-31(美国专利号7,300,655)、hLL1(美国专利号7,312,318)、hLL2(美国专利号7,074,403)、hMu-9(美国专利号7,387,773)、hL243(美国专利号7,612,180)、hMN-14(美国专利号6,676,924)、hMN-15(美国专利号7,541,440)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利号7,238,785)、hMN-3(美国专利号7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，其保藏为ATCC PTA-4405和PTA-4406)和D2/B(WO 2009/130575)，关于附图和实施例部分，每一个列举的专利或申请的文本都以引用的方式并入本文。在一个特别优选的实施方案中，抗体是hRS7。普通技术人员将认识到，在某些实施方案中，针对除了Trop-2之外的其他TAA的抗体可以与抗Trop-2抗体组合使用。
可被靶向的其他有用抗原包括碳酸酐酶IX、B7、CCL19、CCL21、CSAp、HER-2/neu、BrE3、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20(例如C2B8、hA20、1F5 MAb)、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、CTLA-4、α-胎蛋白(AFP)、VEGF(例如，贝伐单抗、纤连蛋白剪接变体)、ED-B纤连蛋白(例如，L19)、EGP-1(TROP-2)、EGP-2(例如17-1A)、EGF受体(ErbB1)(例如，西妥昔单抗)、ErbB2、ErbB3、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸盐受体、Ga 733、GRO-β、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、HER-2/neu、***(ILGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、IGF-1R、Ia、HM1.24、神经节苷脂、HCG、L243结合的HLA-DR抗原、CD66抗原即CD66a-d或其组合、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、胎盘生长因子(PlGF)、PSA(***-特异性抗原)、PSMA、PAM4抗原、PD-1受体、NCA-95、NCA-90、A3、A33、Ep-CAM、KS-1、Le(y)、间皮蛋白、S100、腱生蛋白、TAC、Tn抗原、托马斯-弗里登瑞奇(Thomas-Friedenreich)抗原、肿瘤坏死抗原、肿瘤血管生成抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、TROP-2、VEGFR、RANTES、T101，以及癌干细胞抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和致癌基因产物。
如通过流式细胞术展示并且可作为选择药物缀合的免疫疗法的合适抗体的指导的造血恶性细胞上的合适抗原(群集指定，或CD)靶标的综合分析是于2008年1月15日在线预公布的Craig和Foon,Blood；DOL 10.1182/blood-2007-11-120535。
CD66抗原由具有类似结构的五种不同糖蛋白CD66a-e组成，其分别由癌胚抗原(CEA)基因家族成员BCG、CGM6、NCA、CGM1和CEA编码。这些CD66抗原(例如，CEACAM6)主要表达于粒细胞、消化道的正常上皮细胞和各种组织的肿瘤细胞中。还包括作为癌症的合适靶标的癌症睾丸抗原，诸如NY-ESO-1(Theurillat等人，Int.J.Cancer 2007；120(11):2411-7)，以及骨髓瘤白血病中的CD79a(Kozlov等人，Cancer Genet.Cytogenet.2005；163(1):62-7)以及B-细胞疾病，和用于非霍奇金氏淋巴瘤的CD79b(Poison等人，Blood110(2):616-623)。许多前述抗原公开于2002年11月15日提交的题为“Use of Multi-specific,Non-covalent Complexes for Targeted Delivery of Therapeutics”的美国临时申请号60/426,379中。癌症干细胞，被认为是更具治疗抗性的前体恶性细胞群(Hill和Perris，J.Natl.Cancer Inst.2007；99:1435-40)，具有可以靶向某些癌症类型的抗原，诸如***癌(Maitland等人，Ernst Schering Found.Sympos.Proc.2006；5:155-79)、非小细胞肺癌(Donnenberg等人，J.Control Release 2007；122(3):385-91)和胶质母细胞瘤中的CD133(Beier等人，Cancer Res.2007；67(9):4010-5)；以及结肠直肠癌(Dalerba等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007；104(24)10158-63)、胰腺癌(Li等人，Cancer Res.2007；67(3):1030-7)和头颈部鳞状上皮细胞癌中的CD44(Prince等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2007；104(3)973-8)。乳腺癌疗法的另一种有用靶标是Taylor等人(Biochem.J.2003；375:51-9)描述的LIV-1抗原。CD47抗原是癌症干细胞的另一种有用靶标(参见，例如，Naujokat等人，2014,Immunotherapy 6:290-308；Goto等人，2014,Eur J Cancer50:1836-46；Unanue,2013,Proc Natl Acad Sci USA 110:10886-7)。
对于多发性骨髓瘤疗法，已经描述针对例如CD38和CD138(Stevenson,Mol Med2006；12(11-12):345-346；Tassone等人，Blood2004；104(12):3688-96)、CD74(Stein等人，同上)、CS1(Tai等人，Blood2008；112(4):1329-37)和CD40(Tai等人，2005；CancerRes.65(13):5898-5906)描述了合适的靶向抗体。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天和适应性免疫和细胞凋亡的重要调控剂。已经报道CD74是MIF的内源性受体(Leng等人，2003,J Exp Med 197:1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对于MIF介导的细胞内途径的治疗作用可用于治疗广泛范围的疾病状态，诸如膀胱、***、乳腺、肺、结肠和慢性淋巴细胞白血病的癌症(例如，Meyer-Siegler等人，2004,BMCCancer 12:34；Shachar和Haran,2011,Leuk Lymphoma 52:1446-54)；自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮(Morand和Leech,2005,Front Biosci 10:12-22；Shachar和Haran,2011,Leuk Lymphoma 52:1446-54)；肾脏疾病如肾同种异体移植物排斥(Lan,2008,Nephron ExpNephrol.109：e79-83)；和许多炎性疾病(Meyer-Siegler等人，2009，Mediators Inflamm epub 2009年3月22日；Takahashi等人，2009，Respir Res 10:33；米拉珠单抗(hLL1)是具有用于治疗MIF介导的疾病的治疗用途的示例性抗CD74抗体。
抗TNF-α抗体在本领域中是已知的，并且可以用于治疗免疫性疾病如自身免疫性疾病、免疫功能障碍(例如，移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反应)或糖尿病。已知的针对TNF-α的抗体包括人抗体CDP571(Ofei等人，2011,Diabetes 45:881-85)；鼠抗体MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B和M303(Thermo Scientific,Rockford,IL)；英利昔单抗(Centocor,Malvern,PA)；赛妥珠单抗(UCB,Brussels,Belgium)；以及阿达木单抗(Abbott,Abbott Park,IL)。这些和许多其他已知的抗TNF-α抗体可以用于所要求保护的方法和组合物中。用于治疗免疫失调或自身免疫疾病的其他抗体包括但不限于抗B细胞抗体，诸如维妥珠单抗、依帕珠单抗、米拉珠单抗或hL243；托珠单抗(抗IL-6受体)；巴利昔单抗(抗CD25)；达利珠单抗(抗CD25)；依法利珠单抗(抗CD11a)；莫罗单抗CD3(抗CD3受体)；抗CD40L(UCB,Brussels,Belgium)；那他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
在另一个优选的实施方案中，使用快速内化的抗体，然后使其在细胞表面上重新表达，加工和呈递，使得细胞能够连续摄取并增加循环缀合物。最优选的抗体/抗原对的实例是LL1，抗CD74MAb(不变链，II类特异***蛋白，Ii)(参见，例如，美国专利6,653,104；7,312,318；各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。CD74抗原在B-细胞淋巴瘤(包括多发性骨髓瘤)和白血病、某些T-细胞淋巴瘤、黑色素瘤、结肠癌、肺癌和肾癌、胶质母细胞瘤和某些其他癌症上高度表达(Ong等人，Immunology 98:296-302(1999))。在癌症中使用CD74抗体的综述包含在Stein等人，Clin Cancer Res.2007年9月15日；13(18Pt 2):5556s-5563s中，其以引用的方式并入本文。
优选地用抗CD74抗体治疗的疾病包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏疾病、黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、多形性成胶质细胞瘤、组织细胞瘤、骨髓性白血病和多发性骨髓瘤。CD74抗原在靶细胞表面上短时间连续表达，然后内化抗原并重新表达抗原，使得靶向LL1抗体能够与其携带的任何化疗部分一起内化。这允许高且治疗性浓度的LL1-化疗药物缀合物积聚在这类细胞内。内化的LL1-化疗药物缀合物循环通过溶酶体和内体，并且化疗部分以活性形式在靶细胞内释放。
双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体可用于许多生物医学应用中。例如，具有用于肿瘤细胞表面抗原和用于T细胞表面受体的结合位点的双特异性抗体可指导T细胞裂解特异性肿瘤细胞。识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特异性抗体已经成功用于治疗人患者的脑瘤(Nitta等人，Lancet.1990；355:368-371)。优选的双特异性抗体是抗CD3X抗CD19抗体。在替代实施方案中，抗CD3抗体或其片段可以连接到针对另一种B细胞相关抗原的抗体或片段，诸如抗CD3X抗Trop-2、抗CD3X抗CD20、抗CD3X抗CD22、抗CD3X抗HLA-DR或抗CD3X抗CD74。在某些实施方案中，本文公开的用于ADC疗法的技术和组合物可以与双特异性或多特异性抗体组合使用。例如，可以在抗Trop-2 ADC之前、同时或之后施用抗Trop-2x抗CD3 bsAb。
众多生产双特异性或多特异性抗体的方法是已知的，如例如美国专利号7,405,320中所公开，该专利的实施例部分以引用的方式并入本文。双特异性抗体可通过四重杂交瘤方法生产，该方法包括使各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的两种不同杂交瘤融合(Milstein和Cuello,Nature,1983；305:537-540)。
另一种产生双特异性抗体的方法是使用异双官能交联剂化学系链两种不同的单克隆抗体(Staerz等人，Nature,1985；314:628-631；Perez等人，Nature,1985；316:354-356)。双特异性抗体也可通过将两种亲本单克隆抗体中的每一种还原成相应的半分子，然后将其混合并允许再氧化以获得杂合结构来产生(Staerz和Bevan，Proc Natl Acad Sci US A.1986；83:1453-1457)。另一种替代方案涉及使用适当接头使两种或三种经单独纯化的Fab'片段化学交联。(参见，例如，欧洲专利申请0453082)。
其他方法包括通过经由逆转录病毒衍生的穿梭载体将不同的选择标记基因转移到随后融合的各亲本杂交瘤中(DeMonte等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1990,87:2941-2945)；或用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来改善产生杂交杂交瘤的效率。
可将同源VH和VL结构域与具有适当组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽接头接合以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。制造scFv的方法公开于美国专利号4,946,778和美国专利号5,132,405中，各自的实施例部分以引用的方式并入本文。将肽接头长度降低到少于12个氨基酸残基防止同一链上的VH与VL结构域配对并且迫使VH和VL结构域与其他链上的互补结构域配对，导致形成功能性多聚体。与3至12个氨基酸残基之间的接头接合的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。使用0至2个氨基酸残基之间的接头，有利于形成三聚体(称为三抗体)和四聚体(称为四抗体)，但除了接头长度外，寡聚化的确切模式似乎还取决于组成以及V-结构域取向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
生产多特异性或双特异性抗体的这些技术表现出技术产率低、需要纯化、稳定性低或耗费大量劳力方面的各种难处。最近，已利用一种称为“对接锁定”(dock and lock；DNL)的技术来生产几乎任何期望的抗体、抗体片段及其他效应分子的组合(参见，例如美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,858,070；7,871,622；7,906,121；7,906,118；8,163,291；7,901,680；7,981,398；8,003,111和8,034,352，各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。所述技术利用称为锚定结构域(AD)和二聚化与对接结构域(DDD)的互补蛋白质结合结构域，其彼此结合并且允许组装范围为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的复合结构。这些以高产率形成稳定复合物而不需要广泛纯化。DNL技术允许组装单特异性、双特异性或多特异性抗体。实施本发明所要求保护的方法时可利用本领域中已知用于制造双特异性或多特异性抗体的任何技术。
在各种实施方案中，如本文所公开的缀合物可为复合多特异性抗体的部分。这类抗体可含有两个或更多个具有不同特异性的不同抗原结合位点。多特异性复合物可结合相同抗原的不同表位，或者可结合两个不同抗原。
DOCK-AND-LOCKTM
在优选的实施方案中，二价或多价抗体形成为DOCK-AND-复合物(参见，例如，美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,858,070；7,871,622；7,906,121；7,906,118；8,163,291；7,901,680；7,981,398；8,003,111和8,034,352，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文。)通常，技术利用了在cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基的二聚化和对接结构域(DDD)序列与来源于任何各种AKAP蛋白的锚定结构域(AD)序列之间发生的特异性和高亲和性结合相互作用(Baillie等人,FEBSLetters.2005；579:3264。Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5:959)。DDD和AD肽可连接到任何蛋白质、肽或其他分子。因为DDD序列自发二聚化并结合至AD序列，所以该技术允许在可连接到DDD或AD序列的任何选定分子之间形成复合物。
虽然标准复合物包含具有连接到一个AD连接分子的两个DDD连接分子的三聚体，但是复合结构的变型允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其他多聚体。在一些实施方案中，复合物可包含结合至相同抗原决定簇或两个或更多个不同抗原的两个或更多个抗体、抗体片段或融合蛋白质。复合物还可包含一种或多种其他效应子，诸如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白介素、干扰素、结合蛋白质、肽配体、载体蛋白质、毒素、核糖核酸酶如抗肿瘤核糖核酸酶、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂或任何其他分子或聚集体。
1968年，首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在由第二信使cAMP结合R亚基而触发的最彻底研究的信号转导途径之一中起关键作用(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243:3763)。全酶的结构由两个通过R亚基保持为非活性形式的催化亚基组成(Taylor,J.Biol.Chem.1989；264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，并且各类型具有和同种型(Scott,Pharmacol.Ther.1991；50:123)。因此，PKA调节亚基的四种同种型为和R亚基仅分离为稳定的二聚体并且显示二聚化结构域由RIIα的前44个氨基末端残基组成(Newlon等人,Nat.Struct.Biol.1999,6222)。如下讨论，其他调控亚基的氨基酸序列的类似部分涉及二聚化和对接，其分别位于调控亚基的N-末端附近。cAMP结合R亚基造成用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基释放，这些活性催化亚基通过PKA的区室化经由其与AKAP对接而面向所选择的底物取向(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)
自从第一种AKAP微管相关蛋白-2于1984年表征以来(Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81:6723)，又在从酵母到人范围内的物种中鉴别出具有多种结构的超过50种AKAP，其定位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.CellBiol.2004；5:959)。AKAP中用于PKA的AD是具有14至18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem.1991；266:14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间十分不同，其中针对RII二聚体所报道的结合亲和性在2nM至90nM范围内(Alto等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100:4445)。AKAP仅结合二聚R亚基。对于人而言，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott,TrendsCell Biol.1999；6:216)。因此，人的二聚化结构域和AKAP结合结构域都位于相同的N-末端44氨基酸序列内(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6:222；Newlon等人，EMBOJ.2001；20:1651)，其在本文中被称为DDD。
我们已发展出一种平台技术，其利用人PKA调控亚基的DDD和AKAP的AD作为一对优良的接头模块用于将任何两个实体(在下文称为A与B)对接成非共价复合物，该复合物可通过在DDD与AD的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步锁定为DNLTM复合物。该途径的一般方法如下。实体A通过将DDD序列连接至A的前体进行构建，产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将由a2构成。实体B通过将AD序列连接至B的前体进行构建，产生下文称为b的第二组分。a2中所含的DDD的二聚基序将产生用于结合b中所含的AD序列的对接位点，由此促进a2与b容易地缔合形成由a2b构成的二元三聚复合物。利用通过二硫桥共价固定两个实体的后续反应使此结合事件不可逆转，基于有效局部浓度的原理，此反应极其有效地发生，因为初始结合相互作用应使安置于DDD与AD两者上的反应性硫醇基接近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98:8480)，从而位点特异性连接。通过使用接头、衔接子模块和前体的各种组合，可产生并使用不同化学定量关系的各种各样的DNLTM构建体(参见，例如，美国专利7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400)。
通过远离两个前体的官能团连接DDD和AD，还预期这类位点特异性连接保留两个前体的原始活性。此方法在性质上是模块化的并且可潜在应用于位点特异性且共价地连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其他效应子部分。利用构建以下实施例中所述的缀合AD和DDD的效应子的融合蛋白方法，可将几乎任何蛋白质或肽并入构建体中。然而，该技术并不具限制性并且可使用其他缀合方法。
已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码所关注的融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将这类双链核酸***用于生成融合蛋白的表达载体中(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning,A laboratorymanual,第2版,1989)。在这类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可连接到效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员将认识到，AD或DDD部分连接到效应子部分的位点可根据效应子部分的化学性质和效应子部分中参与其生理活性的部分而改变。多种效应子部分的位点特异性连接可使用本领域中已知的技术执行，诸如使用二价交联试剂和/或其他化学缀合技术执行。
在各种实施方案中，抗体或抗体片段可以通过例如将DDD或AD部分连接到抗体重链的C-末端部分并入DNLTM复合物中，如下文详细描述。在更优选的实施方案中，DDD或AD部分，更优选AD部分，可以连接到抗体轻链的C-末端(参见，例如，13年5月24日提交的美国专利申请序列号13/901,737，其实施例部分以引用的方式并入本文。)
AD和DDD部分中的结构功能关系
对于不同类型的DNLTM构建体，可使用不同的AD或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供于下文中。
技术人员将认识到DDD1和DDD2基于蛋白激酶A的人同种型的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD和AD部分可以基于蛋白激酶A的人形式的DDD序列和相应的AKAP序列，如下面的DDD3、DDD3C和AD3中所例示。
在其他替代实施方案中，在复合物的构建中可利用AD和/或DDD部分的其他序列变体。例如，人PKA DDD序列仅存在4个变体，与PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分相对应。RIIα DDD序列是上文公开的DDD1和DDD2的基础。四种人PKA DDD序列在下面示出。DDD序列表示RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(应注意，DDD1的序列与人PKA RIIα DDD部分相比稍有改变。)
已对AD和DDD结构域的结构功能关系进行了研究。(参见，例如Burns-Hamuro等人，2005,Protein Sci 14:2982-92；Carr等人，2001,JBiol Chem 276:17332-38；Alto等人，2003,Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50；Hundsrucker等人，2006,Biochem J396:297-306；Stokka等人，2006,Biochem J 400:493-99；Gold等人，2006,Mol Cell24:383-95；Kinderman等人，2006,Mol Cell 24:397-408，其各自的整个正文以引用的方式并入本文。)
抗体同种异型
治疗性抗体的免疫原性与输注反应风险增加和治疗性响应的持续时间减少相关(Baert等人，2003,NEnglJMed 348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫响应的程度可以部分地通过抗体的同种异型来确定(Stickler等人，2011,Genes andImmunity 12:213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置上的氨基酸序列变型相关。含有重链γ-型恒定区的IgG抗体的同种异型命名为Gm同种异型(1976,J Immunol 117:1056-59)。
对于常见的IgG1人抗体而言，最普遍的同种异型是G1m1(Stickler等人，2011,Genes andImmunity 12:213-21)。然而，G1m3同种异型也频繁地出现在白种人(Caucasians)中(同上)。已经报道了当向诸如G1m3患者的非G1m1(nG1m1)接受者施用时，G1m1抗体含有倾向于诱导免疫响应的同种异型序列(同上)。当向G1m1患者施用时，非G1m1同种异型抗体不是作为免疫原性的(同上)。
人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中的Kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型两者均包含Kabat位置357上的谷氨酸残基，并且这些同种异型有时被称为DEL和EEM同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQ IDNO:18)和维妥珠单抗(SEQ ID NO:19)，显示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。
利妥昔单抗重链可变区序列(SEQ ID NO:18)
维妥珠单抗重链可变区(SEQ ID NO:19)
Jefferis和Lefranc(2009,mAbs 1:1-7)综述了作为IgG同种异型的特征的序列变型及它们对免疫原性的影响。他们报道了与G1m17同种异型中的Kabat 214上的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征在于Kabat位置214上的精氨酸残基。nG1m1,2同种异型的特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。G1m1,2同种异型的特征在于Kabat位置356上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸以及Kabat位置431上的甘氨酸。除了重链恒定区序列变体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报道了κ轻链恒定区中的同种异型变体，其中Km1同种异型的特征在于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Km1,2同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。
对于治疗性抗体而言，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是对治疗各种各样血液恶性肿瘤有用的针对CD20的人源化和嵌合IgG1抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型序列。如表1中所示，利妥昔单抗(G1m17,1)是DEL同种异型IgG1，利妥昔单抗中的赖氨酸相对维妥珠单抗中的精氨酸在Kabat位置214(重链CH1)上具有另外的序列变型。已经报道了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见，例如Morchhauser等人，2009,JClin Oncol 27:3346-53；Goldenberg等人，2009,Blood 113:1062-70；Robak和Robak,2011,BioDrugs 25:13-25)，这种作用已经被归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM与DEL同种异型之间的同种异型差异也可以解释维妥珠单抗的更低免疫原性。
表1.利妥昔单抗对比维妥珠单抗的同种异型
为了降低治疗性抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，期望选择抗体的同种异型以对应于G1m3同种异型，其特征在于Kabat 214上的精氨酸；和nG1m1,2无效同种异型，其特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。出人意料地，发现重复皮下施用G1m3抗体经过很长一段时间并不会导致明显的免疫响应。在替代实施方案中，与G1m3同种异型一样的人IgG4重链具有Kabat 214上的精氨酸、Kabat 356上的谷氨酸、Kabat 359上的甲硫氨酸以及Kabat 431上的丙氨酸。因为免疫原性看起来似乎至少部分地与那些位置上的残基相关，所以对于治疗性抗体的人IgG4重链恒定区序列的使用也是一个优选的实施方案。G1m3 IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可以是对治疗性施用有用的。
高亲和性多聚体
在某些实施方案中，本文所述的结合部分可以包含一个或多个高亲和性多聚体序列。高亲和性多聚体是在其对各种靶标分子的亲和力和特异性方面与抗体有些类似的一类结合蛋白。它们是通过体外外显子改组和噬菌体展示自人细胞外受体结构域开发的。(Silverman等人，2005，Nat.Biotechnol.23:1493-94；Silverman等人，2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得多结构域蛋白质可包含与单一表位结合蛋白质相比可表现出改善的亲和性(在一些情况下，亚纳摩尔)和特异性的多个独立结合结构域。(同上)在各种实施方案中，可以将高亲和性多聚体连接到例如DDD和/或AD序列，以用于所要求保护的方法和组合物。关于构建和使用高亲和性多聚体的方法的另外细节公开在例如美国专利申请公告号20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384中，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
噬菌体展示
所要求保护的组合物和/或方法的某些实施方案可以涉及各种靶分子、细胞或组织的结合肽和/或肽模拟物。结合肽可以通过包括但不限于噬菌体展示技术的本领域已知的任何方法鉴定。噬菌体展示的各种方法和用于产生各种肽群的技术在本领域中是熟知的。例如，美国专利号5,223,409；5,622,699和6,068,829公开了制备噬菌体文库的方法。噬菌体展示技术涉及遗传操作噬菌体，以便可以在其表面上表达小肽(Smith和Scott，1985，Science 228:1315-1317；Smith和Scott,1993,Meth.Enzymol.21:228-257)。除了肽之外，较大的蛋白质结构域如单链抗体也可以展示在噬菌体粒子的表面上(Arap等人，1998,Science 279:377-380)。
对给定器官、组织、细胞类型或靶分子具有选择性的靶向氨基酸序列可以通过淘选分离(Pasqualini和Ruoslahti，1996,Nature380:364-366；Pasqualini,1999,TheQuart.J.Nucl.Med.43:159-162)。简言之，将含有推定的靶向肽的噬菌体文库施用于完整的生物体或分离的器官、组织、细胞类型或靶分子，并收集含有结合的噬菌体的样品。结合靶标的噬菌体可以从靶器官、组织、细胞类型或靶分子洗脱，然后通过使其在宿主细菌中生长来扩增。
在某些实施方案中，噬菌体可以在多轮淘选之间在宿主细菌中繁殖。不是通过噬菌体裂解，替代地，细菌可以分泌展示特定***物的多个噬菌体拷贝。如果需要，可以将扩增的噬菌体再次暴露于靶器官、组织、细胞类型或靶分子，并收集以进行另外轮的淘选。可以执行多轮淘选，直到获得一群选择性或特异性结合物。肽的氨基酸序列可以通过测序对应于噬菌体基因组中的靶向肽***物的DNA来确定。然后可以通过标准蛋白质化学技术(Arap等人，1998，Smith等人，1985)将鉴定的靶向肽产生为合成肽。
在一些实施方案中，可以使用消减方案以进一步降低背景噬菌体结合。消减的目的是从文库中去除与除所关注的靶标外的靶标结合的噬菌体。在替代实施方案中，噬菌体文库可以针对对照细胞、组织或器官进行预筛选。例如，可以在针对对照正常细胞系预筛选文库后鉴定肿瘤结合肽。在消减之后，可以针对所关注的分子、细胞、组织或器官筛选文库。其他消减方案的方法是已知的，并且可以用于所要求保护的方法的实践中，例如美国专利5,840,841、5,705,610、5,670,312和5,492,807中所公开。
适体
在某些实施方案中，使用的靶向部分可以是适体。构建和确定适体的结合特征的方法在本领域中是熟知的。例如，这类技术描述在美国专利号5,582,981、5,595,877和5,637,459中，各自的实施例部分以引用的方式并入本文。制备和筛选与所关注的特定靶标结合的适体的方法是熟知的，例如美国专利号5,475,096和美国专利号5,270,163，各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
适体可通过任何已知的方法制备，这些已知方法包括合成、重组和纯化方法，并且可单独或与对相同靶标具有特异性的其他适体组合使用。通常，最少约3个核苷酸，优选至少5个核苷酸是实现特异性结合所必需的。短于10个碱基的序列的适体可能是可以行的，尽管10、20、30或40个核苷酸的适体可能是优选的。
适体可以作为常规DNA或RNA分子分离、测序和/或扩增或合成。或者，所关注的适体可以包含修饰的低聚体。任何通常存在于适体中的羟基基团均可由例如膦酸基、磷酸基所置换，用标准的保护基团保护，或经过活化来制备对其他核苷酸的另外键联，或者可缀合到固相支撑物。一个或多个磷酸二酯键可以被替代的连接基团置换，例如P(O)O被P(O)S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR2置换，其中R是H或烷基(1-20C)，并且R'是烷基(1-20C)；此外，该基团可以通过O或S与相邻的核苷酸连接。并非低聚体中的所有键联都必须相同。
亲和体和Fynomer
某些替代实施方案可以使用亲和体代替抗体。亲和体可从Affibody AB(Solna，Sweden)商购获得。亲和体是作为抗体模拟物起作用的小蛋白质，并且用于结合靶分子。通过在α螺旋蛋白支架上进行组合基因工程化开发亲和体(Nord等人，1995，Protein Eng 8:601-8；Nord等人，1997,Nat Biotechnol 15:772-77)。亲和体设计基于包含蛋白A的IgG结合结构域的三螺旋束结构(Nord等人，1995；1997)。通过随机化参与细菌蛋白A的Fc结合活性的十三种氨基酸，可以产生具有广泛结合亲和力的亲和体(Nord等人，1995；1997)。随机化后，将PCR扩增的文库克隆到噬菌粒载体中，以便通过噬菌体展示突变蛋白进行筛选。可以使用标准噬菌体展示筛选技术针对任何已知的抗原筛选噬菌体展示文库(例如，Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature380:364-366；Pasqualini,1999,Quart.J.Nucl.Med.43:159-162)，以针对靶抗原鉴定一种或多种亲和体。
已经证明对HER2/neu具有特异性的177Lu标记亲和体在体内靶向表达HER2的异种移植物(Tolmachev等人，2007，Cancer Res67:2773-82)。尽管由于低分子量放射性标记化合物的积聚导致的肾毒性最初是一个问题，但是与白蛋白的可逆结合降低了肾积聚，使得能够用标记的亲和体进行基于放射性核素的疗法(同上)。
最近已经证明使用放射性标记的亲和体进行体内肿瘤成像的可行性(Tolmachev等人，2011，Bioconjugate Chem 22:894-902)。将马来酰亚胺衍生的NOTA与抗HER2亲和体缀合，并用111In放射性标记(同上)。向带有表达HER2的DU-145异种移植物的小鼠施用，然后进行γ相机成像，允许异种移植物的可视化(同上)。
Fynomer也可以以与抗体相似的亲和力和特异性结合靶抗原。Fynomer基于人FynSH3结构域作为组装结合分子的支架。Fyn SH3结构域是一种完全人的63氨基酸蛋白质，其可以在细菌中以高产率产生。可以将Fynomer连接在一起以产生对两种或更多种不同抗原靶标具有亲和力的多特异性结合蛋白。Fynomer可从COVAGEN AG(Zurich,Switzerland)商购获得。
技术人员将认识到，在所要求保护的方法和组合物的实践中，亲和体或fynomer可以用作靶向分子。
免疫缀合物
在某些实施方案中，细胞毒素药物或其他治疗或诊断剂可以共价连接到抗体或抗体片段以形成免疫缀合物。在一些实施方案中，可以经由载体部分将药物或其他试剂连接到抗体或其片段。可将载体部分连接到例如还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。载体部分可经由形成二硫键连接在还原的抗体组分的铰链区。或者，这类试剂可使用异双官能交联剂如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP))连接。Yu等人，Int.J.Cancer 56:244(1994)。用于此类缀合的一般技术在本领域中是熟知的。参见，例如Wong,CHEMISTRY OFPROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等人，“Modification of Antibodies by Chemical Methods,”,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Birch等人(编)，第187-230页(Wiley-Liss,Inc.1995)；Price,“Production and Characterization of Synthetic Peptide-DerivedAntibodies,”,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION，Ritter等人(编)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)。或者，可经由抗体的Fc区中的碳水化合物部分缀合载体部分。
经由抗体碳水化合物部分将官能团与抗体缀合的方法为本领域的技术人员所熟知。参见，例如Shih等人，Int.J.Cancer 41:832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46:1101(1990)；和Shih等人，美国专利号5,057,313，其实施例部分以引用的方式并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。该反应产生初始希夫碱(Schiffbase)(亚胺)键联，其可通过还原成仲胺而稳定以形成最终缀合物。
如果ADC的抗体组分是抗体片段，则可能不存在Fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见，例如Leung等人，J.Immunol.154:5919(1995)；美国专利号5,443,953和6,254,868，其实施例部分以引用的方式并入本文。使用经工程化的碳水化合物部分来连接治疗剂或诊断剂。
连接载体部分与靶向分子的替代方法涉及使用点击化学反应。点击化学法最初构想成通过以模块化方式将小亚基接合在一起快速产生复杂物质的方法。(参见，例如Kolb等,2004,Angew Chem Int Ed40:3004-31；Evans,2007,Aust J Chem 60:384-95。)各种形式的点击化学反应在本领域中是已知的，诸如胡伊斯根(Huisgen)1,3-偶极环加成铜催化反应(Tornoe等人，2002,J Organic Chem 67:3057-64)，其通常被称为“点击反应”。其他替代方案包括环加成反应，诸如狄尔斯－阿尔德反应(Diels-Alder)、亲核取代反应(尤其对于小的张力环，如环氧和氮丙啶化合物)、尿素化合物的羰基化学形成反应和涉及碳-碳双键如巯基-炔反应中的炔烃的反应。
叠氮化物炔胡伊斯根环加成反应在还原剂存在下使用铜催化剂来催化连接到第一分子的末端炔基的反应。在包含叠氮化物部分的第二分子存在的情况下，叠氮化物与活化的炔烃反应以形成1,4-二取代的1,2,3-***。铜催化的反应在室温下进行并且具有足够特异性，从而通常不需要对反应产物进行纯化。(Rostovstev等人，2002,Angew Chem IntEd 41:2596；Tornoe等人，2002,J Org Chem 67:3057。)叠氮化物和炔官能团对水性介质中的生物分子基本上呈惰性，从而允许反应在复杂溶液中进行。形成的***在化学上是稳定的并且不经历酶促裂解，使得点击化学产物在生物***中高度稳定。尽管铜催化剂对活细胞有毒，但可在体外使用基于铜的点击化学反应以形成ADC。
已提出无铜点击反应用于生物分子的共价修饰。(参见，例如，Agard等人，2004,JAm Chem Soc126:15046-47。)无铜反应使用环应变替代铜催化剂来促进[3+2]叠氮化物-炔环加成反应(同上)。例如，环辛炔是包含内部炔键的8-碳环结构。闭合环结构诱发乙炔的实质性键角变形，其极易与叠氮基团反应形成***。因而，环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同上)。
Ning等人报道了另一种无铜点击反应。(2010,Angew Chem Int Ed 49:3065-68)，涉及张力促进的炔-硝酮环加成。为了解决原始环辛炔反应速率慢的问题，将吸电子基团与三键邻接(同上)。这类取代的环辛炔的实例包括二氟化环辛炔、4-二苯并环辛炔醇和氮杂环辛炔(同上)。替代的无铜反应涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成以得到N-烷基化的异噁唑啉(同上)。据报道该反应具有特别快的反应动力学并且用于一锅式三步方案中以供对肽和蛋白质进行位点特异性修饰(同上)。硝酮由适当的醛与N-甲基羟胺缩合制备，并且该环加成反应在乙腈和水的混合物中进行(同上)。可使用这些和其他已知点击化学反应来在体外将载体部分连接到抗体。
Agard等人(2004,J Am Chem Soc126:15046-47)证明了在全乙酰化的N-叠氮乙酰甘露糖胺存在的情况下，在CHO细胞中表达的重组糖蛋白导致相应的N-叠氮乙酰唾液酸生物并入糖蛋白的碳水化合物中。叠氮基衍生化的糖蛋白与生物素化的环辛炔进行特异性反应以形成生物素化糖蛋白，而不具有叠氮基部分的对照糖蛋白保持为未标记的(同上)。Laughlin等人(2008,Science 320:664-667)使用类似技术对与过氧乙酰化N-叠氮乙酰基半乳糖胺一起孵育的斑马鱼胚胎中的细胞表面聚糖进行代谢标记。叠氮基衍生化聚糖与二氟化环辛炔(DIFO)试剂反应，从而允许在体内观测聚糖。
狄尔斯-阿尔德反应也已经用于在体内标记分子。Rossin等人(2010,Angew ChemInt Ed 49:3375-78)报道携带反式环辛烯(TCO)反应性部分的肿瘤定位的抗TAG72(CC49)抗体与111In标记的四嗪DOTA衍生物之间在体内52％的产率。向带有结肠癌异种移植物的小鼠施用TCO标记的CC49抗体，接着在1天之后注射111In-标记的四嗪探针(同上)。如通过注射放射性标记的探针之后三小时的活小鼠的SPECT成像所证明，放射性标记的探针与肿瘤定位的抗体的反应导致肿瘤中显著的放射活性定位，其中肿瘤与肌肉的比率为13:1(同上)。结果确认TCO与四嗪标记的分子的体内化学反应。
使用标记部分的生物并入的抗体标记技术进一步公开在美国专利号6,953,675中(其实施例部分以引用的方式并入本文)。制备此类“美化的(landscaped)”抗体以在糖基化位点上具有反应性的酮基团。该方法涉及在包含糖或糖前体的酮衍生物的培养基中用表达载体转染的表达细胞，该表达载体编码在CH1或Vκ结构域中具有一个或多个N-糖基化位点的抗体。酮衍生化糖或前体包括N-乙酰丙酸基甘露糖胺和N-乙酰丙酸基岩藻糖。随后，美化的抗体与包含酮反应性部分如酰肼基团、肼基团、羟氨基团或氨基硫脲基团的试剂反应以形成标记的靶向分子。连接到美化的抗体的示例性试剂包括螯合剂，如DTPA；大药物分子，如阿霉素-葡聚糖；以及含有酰基-酰肼的肽。美化技术并不限于产生包含酮部分的抗体，而是可以作为替代用来将点击化学反应基团如硝酮、叠氮化物或环辛炔引入到抗体或其他生物分子上。
点击化学反应的修饰适合于体外或体内使用。可以通过化学缀合或通过生物并入来形成反应性靶向分子。可以用叠氮基部分、取代的环辛炔或炔烃基团、或硝酮部分来活化靶向分子，诸如抗体或抗体片段。在靶向分子包含叠氮基或硝酮基团的情况下，相应的可靶向构建体将包含取代的环辛炔或炔烃基团，反之亦然。如上所讨论，可以通过在活细胞中的代谢并入来制造此类活化分子。
或者，将此类部分化学缀合到生物分子的方法在本领域中是熟知的，并且可以使用任何此类已知的方法。ADC形成的一般方法例如公开在美国专利号4,699,784；4,824,659；5,525,338；5,677,427；5,697,902；5,716,595；6,071,490；6,187,284；6,306,393；6,548,275；6,653,104；6,962,702；7,033,572；7,147,856；和7,259,240中，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
优选的缀合方案基于硫醇-马来酰亚胺、硫醇-乙烯基砜、硫醇-溴乙酰胺或在中性或酸性pH下易于进行的硫醇-碘乙酰胺反应。这消除了对用于缀合的更高pH条件的需要，例如，在使用活性酯时将是必需高pH条件。以下在实施例部分中描述了示例性缀合方案的另外细节。
治疗性治疗
在另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的抗体-药物缀合物(ADC)，诸如IMMU-132。优选地，受试者具有Trop-2阳性癌症，其对用检查点抑制剂抗体的治疗有抗性。ADC可根据疾病状态和缀合物的耐受性给予一次或重复给予，并且最佳还可与其他治疗模态组合使用，这些其他治疗模态诸如为手术、外部辐射、放射性免疫疗法、免疫疗法、化疗、反义疗法、干扰RNA疗法、基因疗法等。各组合将适于肿瘤类型、病期、患者病状和先前疗法，和由管理医师考虑的其他因素。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(即，脊椎动物和无脊椎动物)，包括但不限于哺乳动物，包括人。并不期望该术语限于特定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿，无论为雄性(男性)还是雌性(女性)，都由该术语涵盖。本文给出的剂量用于人，但可根据体重或平方米大小调整至其他哺乳动物以及儿童的大小。
在一个优选的实施方案中，可使用包含诸如hRS7MAb的抗TROP-2抗体的治疗性缀合物以治疗癌瘤，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌和***癌，如美国专利号7,238,785、7,517,964和8,084,583中所公开，这些专利的实施例部分以引用的方式并入本文。hRS7抗体是人源化抗体，其包含轻链互补决定区(CDR)序列CDR1(KASQDVSIAVA,SEQ ID NO:1)、CDR2(SASYRYT,SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT,SEQ ID NO:3)，以及重链CDR序列CDR1(NYGMN,SEQ ID NO:4)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG,SEQ ID NO:5)和CDR3(GGFGSSYWYFDV,SEQ ID NO:6)。
在一个优选的实施方案中，用于治疗人疾病的抗体是抗体的人或人源化(CDR移植)型式；不过也可使用抗体的鼠和嵌合型式。与递送剂相同物种的IgG分子对于使免疫响应降至最低是最优选的。此情形在考虑重复治疗时特别重要。对于人而言，人或人源化IgG抗体由患者产生抗IgG免疫响应的可能性较低。诸如hLL1和hLL2的抗体在结合靶细胞上的内化抗原后快速内化，这意味着所携带的化疗性药物也快速内化至细胞中。然而，具有较慢内化率的抗体也可用于实施选择性疗法。
在一个优选的实施方案中，更有效地并入细胞中可通过使用多价、多特异性或多价、单特异性抗体实现。此类二价和双特异性抗体的实例可见于美国专利号7,387,772；7,300,655；7,238,785；和7,282,567中，这些专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。这些多价或多特异性抗体在靶向表达多个抗原靶标和甚至相同抗原靶标的多个表位，但通常因细胞和病原体上单一抗原靶标的表达或可利用性不足而避开免疫疗法的抗体靶向和充分结合的癌症和感染性生物体(病原体)时特别优选。通过靶向多个抗原或表位，所述抗体显示对靶标的较高结合和滞留时间，因此利用本发明中所靶向的药物提供较高的饱和度。
在另一个优选的实施方案中，与本发明的喜树碱缀合物组合使用的治疗剂可以包含一种或多种同位素。可用于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于-111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、227Th和211Pb。治疗性放射性核素优选具有20keV至6,000keV范围内的衰变能，优选对于俄歇发射体在60keV至200keV范围内，对于β发射体在100keV至2,500keV范围内，并且对于α发射体在4,000keV至6,000keV范围内。可用的β粒子发射核素的最大衰变能优选为20keV至5,000keV，更优选为100keV至4,000keV，并且最优选为500keV至2,500keV。随俄歇发射粒子实质上衰变的放射性核素也是优选的。例如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的发射β粒子的核素的衰变能优选<1,000keV，更优选地<100keV，并且最优选地<70keV。随着α粒子产生而实质上衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Th-227和Fm-255。有用的发射α粒子的放射性核素的衰变能优选为2,000keV至10,000keV，更优选为3,000keV至8,000keV，并且最优选为4,000keV至7,000keV。使用的另外潜在的放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。
放射性核素和其他金属可以例如使用与抗体或缀合物连接的螯合基团递送。诸如NOTA、DOTA和TETA的巨环螯合剂与各种金属和放射性金属一起使用，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用。可通过根据所关注的金属定制环的大小而使此类金属-螯合物复合物变得非常稳定。可以使用其他环型螯合物，诸如用于络合223Ra的大环聚醚。
与本文所述的喜树碱缀合物组合使用的治疗剂还包括，例如，化疗药物，诸如长春花生物碱、蒽环类药物、表鬼臼毒素(epidophyllotoxins)、紫杉烷、抗代谢物、酪氨酸激酶抑制剂、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝***剂、抗血管生成和促凋亡剂，特别是多柔比星、甲氨蝶呤、紫杉醇、其他喜树碱，以及来自这些和其他类别的抗癌剂的其他物质等。其他癌症化疗药物包括氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。合适的化疗剂描述在REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES，第19版，(MackPublishing Co.1995)以及GOODMAN AND GILMAN'S THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版，(MacMillan Publishing Co.1985)以及这些出版物的修订版中。其他合适的化疗剂如实验性药物为本领域的技术人员所已知。
有用的示例性药物包括但不限于：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立定(aplidin)、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类药物、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝(dinaciclib)、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、***受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替彼(ganetespib)、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、伊德利斯、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、乌拉莫司汀、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱以及ZD1839。此类药剂可以是本文所述的缀合物的一部分，或者可以在缀合物之前，同时或之后与所述缀合物组合施用。
可以与喜树碱缀合物一起使用的治疗剂还可以包含与靶向部分缀合的毒素。可以用于此方面的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。(参见，例如，Pastan等人，Cell(1986),47:641，以及Sharkey和Goldenberg,CACancerJClin.2006年7月-8月；56(4):226-43。)适合在本文中使用的另外毒素为本领域的技术人员所已知并且公开在U.S.6,077,499中。
另一类治疗剂可以包含一种或多种免疫调节剂。使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、群落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴毒素，诸如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子，诸如白介素(IL)；群落刺激因子，诸如粒细胞群落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ或干扰素-λ；以及干细胞生长因子，诸如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。包括在细胞因子之中的是：生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)以及促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子；***素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质；小鼠***相关的肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；***-I和***-II；红细胞生长素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β以及干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit-配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及淋巴毒素(LT)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等同物。
使用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β以及IP-10。
在某些实施方案中，与抗Trop-2 ADC组合使用的治疗剂是微管抑制剂，诸如长春花生物碱、紫杉烷、美登木素生物碱或奥瑞他汀。示例性已知的微管抑制剂包括紫杉醇、长春新碱、长春碱、美沙丁胺、埃坡霉素、多西紫杉醇、圆皮海绵内酯(discodermolide)、康博斯汀(combrestatin)、鬼臼毒素、CI-980、phenylahistins、五加前胡素、curacins、2-甲氧基***、E7010、甲氧基苯并磺酰胺、长春瑞滨、长春氟宁、长春地辛、多拉司他汀、软海绵素(spongistatin)、利索新(rhizoxin)、塔斯托定(tasidotin)、软海绵素类(halichondrins)、hemiasterlins、念珠藻素(cryptophycin)52、MMAE和甲磺酸艾瑞布林(eribulin mesylate)。
在一个替代实施方案中，将与ADC组合使用的治疗剂是PARP抑制剂，诸如奥拉帕尼、他拉帕利布(BMN-673)、鲁帕沙布、维利帕尼(veliparib)、CEP 9722、MK 4827、BGB-290、ABT-888、AG014699、BSI-201、CEP-8983或3-氨基苯甲酰胺。
在另一个替代方案中，与ADC组合使用的治疗剂是布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，诸如诸如依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、CC-292(AVL-292)、ONO-4059、GDC-0834、LFM-A13或RN486。
在另一个替代方案中，与ADC组合使用的治疗剂是PI3K抑制剂，诸如艾代拉里斯(idelalisib)、渥曼青霉素(Wortmannin)、去甲氧基甲绿胶霉素(demethoxyviridin)、哌立福新(perifosine)、PX-866、IPI-145(度维昔布(duvelisib))、BAY 80-6946、BEZ235、RP6530、TGR1202、SF1126、INK1117、GDC-0941、BKM120、XL147、XL765、帕洛米德(Palomid)529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、PI-103、GNE477、CUDC-907、AEZS-136或LY294002。
本领域普通技术人员将认识到，包含与抗体或抗体片段缀合的喜树碱的本发明ADC可以单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用，这些治疗剂诸如为第二抗体、第二抗体片段、第二免疫缀合物、放射性核素、毒素、药物、化疗剂、放射疗法、趋化因子、细胞因子、免疫调节剂、酶、激素、低聚核苷酸、RNAi或siRNA。这类另外的治疗剂可以单独地施用，与本发明抗体-药物ADC组合施用，或连接到本发明抗体-药物ADC施用。
制剂和施用
缀合物的合适施用途径包括但不限于口服、肠胃外、皮下、直肠、经粘膜、肠内施用、肌肉内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、玻璃体内、腹膜内、鼻内或眼内注射。优选的施用途径是肠胃外施用。或者，可以局部而不是以全身方式施用化合物，例如经由将化合物直接注射到实体肿瘤来施用。
ADC可以根据已知方法配制以制备药学上可用的组合物，由此将ADC与药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个实例。其他合适的赋形剂为本领域技术人员所熟知。参见，例如Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGEFORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea和Febiger1990)和Gennaro(编),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(MackPublishing Company 1990)及其修订版。
在一个优选的实施方案中，ADC使用选自由以下组成的组的缓冲剂在Good的生物缓冲液(pH 6-7)中配制：N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)；N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)；2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)；3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)；3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)；和哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)[Pipes]。更优选的缓冲剂是MES或MOPS，优选浓度范围为20mM至100mM，更优选约25mM。最优选的是25mM MES，pH 6.5。制剂还可以包含25mM海藻糖和0.01％v/v聚山梨醇酯80作为赋形剂，由于添加赋形剂，最终缓冲液浓度被修改为22.25mM。优选的储存方法是作为缀合物的冻干制剂在-20℃至2℃的温度范围内储存，最优选在2℃至8℃下储存。
ADC可配制成用于经由例如快速浓注、缓慢输注或连续输注进行静脉内施用。优选地，本发明的抗体在少于约4小时的时间段内输注，且更优选在少于约3小时的时间段内输注。例如，前25mg至50mg可以在30分钟内输注，优选甚至在15分钟内输注，并且其余的在接下来的2至3小时内输注。在需要皮下施用的情况下，可以浓缩抗体，例如如美国专利号9,180,205中所公开，其实施例部分以引用的方式并入本文。皮下注射可以1ml、2ml或3ml注射施用，其可以在单个位点或在两个或更多个位点施用。每次注射通常含有1.5mg/kg至4mg/kg的浓缩ADC。
注射制剂可以单位剂型来呈现，例如，在安瓿或多剂量容器中，其中添加了防腐剂。组合物可采用诸如于油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳液等形式，并且可含有配制剂，诸如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可呈在使用前用合适媒剂如无菌无热原质水复原的粉末形式。
可以采用另外的药学方法控制治疗缀合物的作用持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸附ADC来制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等人，Bio/Technology 10:1446(1992)。从这类基质释放ADC的速率取决于ADC的分子量、基质内ADC的量和分散粒子的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55:163(1989)；Sherwood等人，在前。其他固体剂型描述于以下文献中：Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea和Febiger 1990)和Gennaro(编),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版。
一般而言，ADC对于人的施用剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和以往病史等因素而变化。可以期望为接受者提供在约1mg/kg至24mg/kg范围内的作为单次静脉输注的ADC的剂量，但如情况需要也可以施用更低或更高的剂量。例如，对于70kg患者，剂量为1mg/kg至20mg/kg，例如，70mg至1,400mg，或者对于1.7-m的患者，剂量为41mg/m2至824mg/m2。需要时可以重复剂量，例如每周一次持续4至10周，每周一次持续8周，或每周一次持续4周。在维持疗法中需要时，其还可以较低频率给予，诸如每隔一周一次持续若干个月，或每月或每季度一次持续许多个月。优选的剂量可以包括但不限于1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg和24mg/kg。可以使用1mg/kg至24mg/kg范围内的任何量。剂量优选每周施用多次、一次或两次。可以使用4周，更优选8周，更优选16周或更久的最小剂量方案。施用方案可以包括以选自由以下组成的组的周期每周施用一次或两次：(i)每周；(ii)每隔一周；(iii)治疗一周，然后休息两周、三周或四周；(iv)治疗两周，然后休息一周、两周、三周或四周；(v)治疗三周，然后休息一周、两周、三周、四周或五周；(vi)治疗四周，然后休息一周、两周、三周、四周或五周；(vii)治疗五周，然后休息一周、两周、三周、四周或五周；(viii)每月。该周期可以重复4次、6次、8次、10次、12次、16次或20次或更多次。
或者，可以每2周或3周作为一次剂量施用ADC，总共重复至少3次剂量。或者，每周两次，持续4-6周。如果使剂量降至约200mg/m2至300mg/m2(对于1.7-m患者为每剂340mg，或者对于70kg患者为4.9mg/kg)，那么其可每周施用一次或甚至两次持续4至10周。或者，给药时程可减少，即每2或3周一次持续2至3个月。然而已经确定，甚至可通过缓慢静脉内输注施用甚至更高的剂量，诸如12mg/kg每周一次或每2至3周一次，持续重复的给药周期。给药时程可任选地以其他时间间隔重复，并且剂量可在对剂量和时程进行适当调整下通过各种胃肠外途径给予。
在优选的实施方案中，ADC对癌症的治疗是有用的。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性疾病。此类癌症的更特定实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤(Ewingsarcoma)、韦尔姆斯氏瘤(Wilms tumor)、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、***癌、阴门癌、***癌、***癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，由转移产生的肿瘤，转移为恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。
癌症或恶性肿瘤的其他实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性恶性疾病、***癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经***(原发性)淋巴瘤、中枢神经***淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、***、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、戈谢氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃部癌、胃肠道良性肿瘤、胃肠道肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性肝癌、***癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、***癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤，和除赘瘤以外位于上列器官***中的任何其他过度增生性疾病。
本文描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前病状以及用于预防发展成赘生性或恶性状态，包括但不限于上文所述的那些病症。此类用途指示在已知的或怀疑先前进展至瘤形成或癌症的病状中，具体来说，其中非瘤性细胞生长由过度增生、化生组成，或最具体来说，出现发育异常(针对此类异常生长病状的综述，参见Robbins和Angell,Basic Pathology.第2版,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,第68-79页(1976))。
发育异常常常是癌症的前兆，并且主要发现于上皮中。其是非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构定向的丧失。在存在慢性刺激或炎症的情况下，发育异常特征性地发生。可治疗的发育异常病症包括但不限于：无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育异常、骨干结构不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱褶性发育异常、纤维肌肉发育异常、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育异常(Mondini dysplasia)、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育异常、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质结构不良、多骨纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和脑室径向发育不良。
可治疗的另外赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如，良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道异常增生)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病(Bowen's disease)、农夫皮肤(Farmer's Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选实施方案中，使用本发明的方法抑制癌症，特别是上文所列癌症的生长、发展和/或转移。
其他过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性疾病和相关病症的进展和/或转移，诸如白血病(包括急性白血病；例如，急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病[包括成骨髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病])和慢性白血病(例如，慢性骨髓细胞性[粒细胞性]白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、***、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
可用ADC治疗的自身免疫性疾病包括急性和慢性免疫血小板减少症、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天包疮、青少年糖尿病、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、ANCA相关血管炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症、血管闭塞性脉管炎、干燥综合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺素症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣和纤维性肺泡炎。
药盒
各种实施方案可以涉及药盒，这些药盒含有适用于治疗患者中的患病组织的组分。示例性药盒可含有至少一种ADC或如本文所述的其他靶向部分。如果含有用于施用的组分的组合物未配制成通过消化道递送，诸如通过口服递送，那么可包括能够通过一些其他途径递送药盒组分的装置。用于诸如肠胃外递送的应用的一种类型的装置是注射器，其用于将组合物注射到受试者体内。还可使用吸入装置。
药盒组分可包装在一起或分隔到两个或多个容器中。在一些实施方案中，容器可为容纳适于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。药盒还可含有一种或多种适于复原和/或稀释其他试剂的缓冲液。可使用的其他容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。药盒组分可无菌包装和保持于容器内。可以包括的另一种组件是提供给药盒使用者的说明书。
实施例
以下实施例说明本发明的各种实施方案，而不限制其范围。
实施例1.抗Trop-2-SN-38抗体-药物缀合物的产生和使用
如美国专利号7,238,785中所述生产人源化RS7(hRS7)抗Trop-2抗体，其图和实施例部分以引用的方式并入本文。根据美国专利7,999,083，产生连接到CL2A接头的SN-38并使其与hRS7(抗Trop-2)、hPAM4(抗MUC5ac)、hA20(抗CD20)或hMN-14(抗CEACAM5)抗体缀合(该专利的实施例10和12以引用的方式并入本文)。缀合方案导致每个抗体分子连接约6个SN-38分子的比率。
带有皮下人胰腺或结肠肿瘤异种移植物的免疫受损的无胸腺裸鼠(雌性)用特异性CL2A-SN-38缀合物或对照缀合物治疗或不治疗。观察特异性缀合物的治疗功效。在Capan1胰腺肿瘤模型中，hRS7(抗Trop-2)、hPAM4(抗MUC-5ac)和hMN-14(抗CEACAM5)抗体的特异性CL2A-SN-38缀合物显示出比对照hA20-CL2A-SN-38缀合物(抗CD20)和未治疗的对照(未显示)更好的功效。类似地，在人胰腺癌的BXPC3模型中，特异性hRS7-CL2A-SN-38显示出比对照治疗(未显示)更好的治疗功效。
实施例2.抗Trop-2 ADC(萨希珠单抗戈维替康)在检查点抑制剂疗法难治的患者中的治疗用途
概述
IMMU-132(萨希珠单抗戈维替康，又名hRS7-CL2A-SN-38)在转移性三阴性乳腺癌和其他经过大量预治疗(ClinicalTrials.gov，NCT01631552)并表达高水平的Trop-2的癌症患者的II期试验中显示出有希望的治疗结果。这种新型Trop-2靶向人源化抗体通过上文讨论的CL2A接头与7.6摩尔的SN-38(伊立替康的活性形式)缀合，并且体内葡糖醛酸化程度低于伊立替康，导致在用该药剂治疗的患者中腹泻的发生率显著降低。
令人惊讶的是，IMMU-132在先前已经从许多标准抗癌疗法复发或显示对许多标准抗癌疗法有抗性的患者中高度有效，所述标准抗癌疗法包括母体化合物伊立替康。一类新的抗癌剂，称为检查点抑制剂，包括针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白(PD-1)和程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抗体或其他抑制剂。如本文所述，IMMU-132对于对检查点抑制剂和其他抗癌剂复发/难治的肿瘤显示出令人惊讶且意想不到的功效。
以下数据汇总了患者(255-029)的示例性病例研究的结果，该患者在显示出对PD-L1抑制剂的抗性后对用IMMU-132治疗有响应。
癌症：TNBC(患者在PD-L1治疗后进展)
最佳响应：部分响应，确认(收缩率54％)
IMMU-132起始剂量：10mg/kg
IMMU-132治疗数量：40+
进展时间：12.4+个月(未达到)
研究结束：继续治疗
病史-患者是一名47岁的女性，她于2007年10月首次被诊断出在右侧***具有1.8cm肿块。她接受了右侧***切除术和前哨***活检(结中无恶性肿瘤)。确定肿瘤对ER、PR和Her-2(即，TNBC)是阴性的。她继续进行4个周期的AC(多柔比星和环磷酰胺)治疗，然后是每周一次的低剂量紫杉醇治疗(×12)。2008年10月，CT研究显示先前未注意到的肺结节和乳腺增大结节；该结节是癌症。她接受了局部手术去除结节，然后在2009年3月之前接受了XRT(放射疗法)。2010年6月，CT记录了复发性肺和骨受累情况。患者入选了使用(贝伐单抗)、(onartuzumab，抗肝细胞生长因子)和(紫杉醇)的临床试验，她一直保持到2013年3月，具有完全响应，但最终进展为周围肺结节和AP(主肺动脉)窗口中的结节。2014年9月，她开始使用PD-L1抗体(MPDL3280A)持续6个周期，但在2015年1月取得了进展。然后她被转介到IMMU-132试验。
IMMU-132治疗-患者在2015年2月6日开始以10mg/kg的剂量开始治疗，并且继续接受该剂量而不减少或延迟计划时程，现在是40+剂量。
结果
患者最初呈现3处靶病变(1处在肺中，胸部有2个***)，直径总和等于60mm，另外还有非靶病变(胸部有另一个***)(图2)。在第一次评估时(2015年4月7日)，患者的靶病变直径总和减少了33％，符合RECIST 1.1部分响应。约5周后(2015年5月18日)执行的确认性随访CT显示响应改善，总体降低48％(图3、图4)。2015年7月19日，CT显示患者继续部分响应，收缩率为50％。2015年9月13日的CT显示持续PR，收缩率为52％，并且15年11月15日的CT显示收缩率为54％。2016年2月25日执行的最新CT显示继续PR，收缩率为46％。
CT结果的汇总示于图1中。基线CT扫描示于图2中，顶行具有轴向图像，底行具有矢状图像(箭头指示肿瘤)。靶病变的直接比较见图3和图4。图3显示在同一平面中的靶病变1和2。基线(2015年1月29日)示于顶部。L1和L2的显著收缩在第二次响应评估(2015年5月19日)中显而易见，示于底部。图4示出靶病变3的等效图像，其中基线在顶部，第二响应评估在底部。在先前未通过检查点抑制剂治疗后，患者正在继续治疗并继续显示对IMMU-132的部分响应。
对患者肿瘤的Trop-2表达的免疫组织化学分析显示阳性表达，染色水平为2+(数据未显示)。
毒性-截至本报告发表之日，最严重的不良反应是G3低磷血症(无相关)，可能的相关毒性是G2中性粒细胞减少症2015年4月2日；剂量6)、疲劳(G1)、恶心(G1)、斑丘疹皮疹(G1)、脱发(G2)和鼻漏(G1)。
这些结果证明，IMMU-132在先前已经从检查点抑制剂疗法复发或对检查点抑制剂疗法有抗性的患者中非常有效。在IMMU-132的治疗剂量下，患者仅显示出可控制的毒性。这些结果显示IMMU-132对于Trop-2阳性癌症如三阴性乳腺癌(TNBC)的实用性。
实施例3.抗Trop-2 ADC的ADCC活性
与hRS7 IgG(未显示)相比较，测定各种hRS7-ADC缀合物的ADCC活性。从购买自新泽西血液中心的血液中纯化PBMC。使用Trop-2阳性人胰腺癌细胞系(BxPC-3)作为靶细胞系，效应子与靶标的比率为100:1。将hRS7 IgG介导的ADCC与hRS7-Pro-2-PDox、hRS7-CL2A-SN-38和还原并加帽的hRS7-NEM进行比较。全部在33.3nM下使用。
整体活性很低，但很显著(未显示)。hRS7 IgG具有8.5％的特异性裂解，其与hRS7-Pro-2-PDox没有显著差异。两者均显著优于hLL2对照和hRS7-NEM及萨希珠单抗戈维替康(P<0.02，双尾t检验)。在hRS7-NEM和萨希珠单抗戈维替康之间没有差异。
实施例4.抗Trop-2-SN-38 ADC在体内针对多种上皮癌的功效摘要
本研究的目的是评价SN-38-抗Trop-2(hRS7)ADC针对几种人实体肿瘤类型的功效，并评估其对小鼠和猴子的耐受性，后者具有与人相似的与hRS7的组织交叉反应性。将两种SN-38衍生物CL2-SN-38和CL2A-SN-38与抗Trop-2-人源化抗体hRS7缀合。在体外表征ADC的稳定性、结合和细胞毒性。在表达Trop-2抗原的五种不同的人实体肿瘤-异种移植模型中测试功效。在小鼠和食蟹猴中评估毒性。
两种SN-38衍生物的hRS7缀合物在药物替代(约6种)、细胞结合(Kd为约1.2nmol/L)、细胞毒性(IC50为约2.2nmol/L)和体内血清稳定性(t/1/2为约20小时)方面相当。细胞暴露于ADC证明信号传导途径导致PARP裂解，但注意到在p53和p21上调方面与游离SN-38的差异。在与非靶向对照ADC相比较时，在带有Calu-3(P≤0.05)、Capan-1(P<0.018)、BxPC-3(P<0.005)和COLO 205肿瘤(P<0.033)的小鼠中通过非毒性剂量的萨希珠单抗戈维替康产生显著的抗肿瘤作用。小鼠耐受2×12mg/kg(SN-38当量)的剂量，仅具有ALT和AST肝酶水平的短暂升高。输注2×0.96mg/kg的食蟹猴仅表现出血细胞计数的短暂下降，但重要的是，这些值不低于正常范围。
总之，抗Trop-2 hRS7-CL2A-SN-38 ADC针对一系列人实体肿瘤类型提供显著且特异性的抗肿瘤作用。在临床相关剂量下，其在猴子中具有良好的耐受性，组织Trop-2表达与人相似。
介绍
对实体肿瘤患者的成功伊立替康治疗受到限制，这在很大程度上是由于CPT-11前药转化为活性SN-38代谢物的转化率低。其他人已经检查了非靶向形式的SN-38，作为绕过这种转化需要并将SN-38被动地传递到肿瘤的手段。我们将SN-38与人源化抗Trop-2抗体hRS7共价缀合。该抗体-药物缀合物在包括非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和鳞状细胞肺癌的一系列皮下人癌症异种移植模型中具有特异性抗肿瘤作用，均在非毒性剂量(例如，≤3.2mg/kg累积SN-38当量剂量下)。Trop-2在许多上皮癌中广泛表达，但也在一些正常组织中广泛表达，因此在食蟹猴中执行剂量递增研究以评估该缀合物的临床安全性。猴子耐受24mg SN-38当量/kg，仅具有轻微的可逆毒性。鉴于其肿瘤靶向性和安全性概况，萨希珠单抗戈维替康在响应伊立替康的实体肿瘤的管理方面提供显著的改善。
材料与方法
细胞系、抗体和化学治疗剂-本研究中使用的所有人癌细胞系均购自美国典型培养物保藏中心。这些包括Calu-3(非小细胞肺癌)、SK-MES-1(鳞状细胞肺癌)、COLO 205(结肠腺癌)、Capan-1和BxPC-3(胰腺癌)和PC-3(***腺癌)。Immunomedics,Inc.制备人源化RS7 IgG和对照人源化抗CD20(hA20 IgG，维妥珠单抗)和抗CD22(hLL2 IgG，依帕珠单抗)抗体。伊立替康(20mg/mL)从Hospira,Inc.获得。
SN-38 ADC和体外方面-先前已经描述了CL2-SN-38的合成(Mo on等人，2008,JMed Chem 51:6916-26)。如所述执行其与hRS7I gG的缀合和血清稳定性(Moon等人，2008,JMed Chem 51:6916-26；Govindan等人，2009,Clin Chem Res 15:6052-61)。CL2A-SN-38(M.W.1480)及其hRS7缀合物的制备以及稳定性、结合和细胞毒性研究如前述实施例中所述进行。
体内治疗研究-对于所有动物研究，SN-38 ADC和伊立替康的剂量以SN-38当量显示。基于平均SN-38/IgG取代比为6，对20-g小鼠给予500μg ADC(25mg/kg)的剂量含有0.4mg/kg的SN-38。伊立替康剂量同样显示为SN-38当量(即，40mg伊立替康/kg相当于24mg/kg的SN-38)。
4至8周龄的NCr雌性无胸腺(nu/nu)小鼠和10周龄的雄性瑞士-韦伯斯特(Swiss-Webster)小鼠购自Taconic Farms。SNBL USA,Ltd.在食蟹猴(Macacafascicularis；2.5kg至4kg雄性和雌性)中进行耐受性研究。
用不同的人癌细胞系皮下植入动物。肿瘤体积(TV)通过使用卡尺的2维测量来确定，体积定义为：L×w2/2，其中L为肿瘤的最长尺寸且w为最短尺寸。治疗开始时，肿瘤的尺寸在0.10cm3和0.47cm3之间。每个实验中的治疗方案、剂量和动物数量描述于结果中。将冻干的萨希珠单抗戈维替康和对照ADC复原并根据需要在无菌盐水中稀释。除静脉内施用伊立替康外，所有试剂均腹膜内施用(0.1mL)。给药方案受到我们先前调查的影响，其中ADC每4天一次或每周两次给予，持续不同的时间长度(Moon等人，2008,J Med Chem51:6916-26；Govindan等人，2009,Clin Chem Res 15:6052-61)。该给药频率反映了缀合物体外血清半衰期的考虑，以允许更连续地暴露于ADC。
统计-生长曲线显示为初始TV随时间的百分比变化。肿瘤生长的统计分析基于曲线下面积(AUC)。通过线性曲线建模获得个体肿瘤生长的概况。在生长曲线的统计分析之前，采用f检验来确定组间的方差齐性。除盐水对照外，使用双尾t检验来评估各种治疗组和对照之间的统计学显著性，在盐水对照中使用单尾t检验(P≤0.05下的显著性)。AUC的统计学比较仅在组内第一只动物因进展而被安乐死的时间执行。
药代动力学和生物分布-将111In-放射性标记的萨希珠单抗戈维替康和hRS7 IgG注射到带有皮下SK-MES-1肿瘤(约0.3cm3)的裸鼠中。一组静脉内注射20μCi(250-μg蛋白质)的111In-萨希珠单抗戈维替康，而另一组接受20μCi(250-μg蛋白质)的111In-hRS7 IgG。在不同的时间点，将小鼠(每个时间点5只)麻醉，通过心内穿刺放血，然后安乐死。取出肿瘤和各种组织，称重，并通过γ闪烁计数，以确定每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。第三组在施用111In-萨希珠单抗戈维替康前3天注射250μg未标记的萨希珠单抗戈维替康并同样进行尸体剖检。在使用f检验确定方差齐性之后，使用双尾t检验来比较萨希珠单抗戈维替康和hRS7 IgG摄取。使用WinNonLin软件(Parsight Corp.)执行血液清除的药代动力学分析。
瑞士-韦伯斯特小鼠和食蟹猴的耐受性-简言之，将小鼠分成4组，每组在第0天和第3天接受2-mL腹腔注射乙酸钠缓冲液对照或3种不同剂量的萨希珠单抗戈维替康(4mg/kg、8mg/kg或12mg/kg的SN-38)，然后进行血液和血清收集，如结果中所述。对食蟹猴(3只雄性和3只雌性；2.5kg至4.0kg)施用2种不同剂量的萨希珠单抗戈维替康。结果中描述了用于评价可能的血液学毒性和血清化学的剂量、次数和猴子放血数量。
结果
hRS7-SN-38的稳定性和效力-使用两种不同的键联将SN-38与hRS7 IgG缀合(未显示)。第一键联称为CL2-SN-38，并且先前已有描述(Moon等人，2008,JMed Chem 51:6916-26；Govindan等人，2009,Clin Chem Res 15:6052-61)。使用CL2合成的变化来除去接头内的苯丙氨酸部分来产生CL2A接头。该变化简化了合成，但不影响缀合结果(例如，CL2-SN-38和CL2A-SN-38两者以每个IgG分子并入约6个SN-38)。并排比较发现血清稳定性、抗原结合或体外细胞毒性没有显著差异。该结果是令人惊讶的，因为CL2中的苯丙氨酸残基是组织蛋白酶B(溶酶体蛋白酶)的设计的裂解位点的一部分。
为了确认SN-38接头自CL2至CL2A的变化不影响体内效力，在带有COLO 205(未显示)或Capan-1肿瘤(未显示)的小鼠中分别每周两次使用0.4mg或0.2mg/kg SN-38持续4周来比较萨希珠单抗戈维替康和hRS7-CL2-SN-38，并且其中在两种研究中起始肿瘤尺寸为0.25cm3。与未治疗对照(对比COLO 205模型中的生理盐水，AU C14天，P<0.002；对比Capan-1模型中的生理盐水，AUC21天P<0.001)，以及非靶向抗CD20对照ADC，hA20-CL2A-SN-38(COLO-205模型中，AUC14天，P<0.003；Capan-1模型中，AUC35天：P<0.002)相比较，萨希珠单抗戈维替康和CL2-SN-38缀合物均显著抑制肿瘤生长。在C apan-1模型研究结束时(第140天)，用萨希珠单抗戈维替康治疗的小鼠中有50％没有肿瘤且hRS7-CL2-SN-38小鼠中有40％没有肿瘤，而只有20％的hA20-ADC治疗的动物没有明显的疾病迹象。与CL2(未显示)相比，CL2A接头产生更高的功效。
作用机制-体外细胞毒性研究证明，萨希珠单抗戈维替康针对几种不同的实体肿瘤系具有在nmol/L范围的IC50值(表2)。游离SN-38的IC50低于在所有细胞系中的缀合物。尽管Trop-2表达与对于萨希珠单抗戈维替康的敏感性之间没有明显的相关性，但是在表达较高Trop-2的细胞中ADC与游离SN-38的IC50比率较低，这很可能反映了当存在更多抗原时内化药物的能力增强。
已知SN-38激活细胞中的几种信号传导途径，导致细胞凋亡(例如，Cusack等人，2001,CancerRes 61:3535-40；Liu等人，2009,Cancer Lett 274:47-53；Lagadec等人，2008,Br J Cancer 98:335-44)。我们的初步研究在体外检查了早期信号传导事件(p21Waf1 /Cip1和p53)和1个晚期凋亡事件[聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)的裂解]中涉及的2种蛋白质的表达(未显示)。在BxPC-3中，SN-38导致p21Waf1/Cip1表达增加20倍(未显示)，而萨希珠单抗戈维替康仅导致增加10倍(未显示)，这一研究结果与该细胞系中游离SN-38的高活性一致(表2)。然而，与游离SN-38相比，萨希珠单抗戈维替康使Calu-3中的p21Waf1/Cip1表达增加多于2倍(未显示)。
在p53表达中观察到萨希珠单抗戈维替康介导和游离SN-38介导的信号传导事件之间的更大差异(未显示)。在BxPC-3和Calu-3中，p53用游离SN-38上调直到48小时才明显，而萨希珠单抗戈维替康在24小时内上调p53(未显示)。此外，与SN-38相比，暴露于ADC的细胞中的p53表达在两种细胞系中都较高(未显示)。有趣的是，尽管hRS7 IgG对p21Waf1/Cip1表达没有明显影响，但它确实诱导了BxPC-3和Calu-3中p53的上调，但仅在暴露48小时后(未显示)。就后来的细胞凋亡事件而言，当与SN-38或缀合物(未显示)一起孵育时，PARP的裂解在两种细胞系中都是明显的。在BxPC-3中24小时裂解的PARP的存在较高(未显示)，这与p21的高表达及其较低IC50相关。与ADC相比，游离SN-38的更高程度的裂解与细胞毒性研究结果一致。
hRS7-SN-38的功效-由于Trop-2在几种人癌瘤中广泛表达，因此在几种不同的人癌症模型中执行了研究，其使用hRS7-CL2-SN-38键联开始，但后来使用与CL2A-键联的缀合物。与施用等量非靶向hLL2-CL2-SN-38的动物相比，每4天给予0.04mg SN-38/kg hRS7-CL2-SN-38持续4个周期的带有Calu-3的裸鼠具有显著改善的响应(分别地，TV＝0.14±0.22cm3对比0.80±0.91cm3；AUC42天P<0.026；未显示)。当剂量增加到0.4mg/kg SN-38时，观察到剂量反应(未显示)。在该较高剂量水平下，给予特异性hRS7缀合物的所有小鼠在28天内“治愈”，并且在第147天保持无肿瘤直至研究结束，而肿瘤在用不相关的ADC治疗的动物中重新生长(特异性相对不相关而言，AUC98天：P＝0.05)。在接受hRS7 IgG和SN-38的混合物的小鼠中，肿瘤在第56天进展>4.5倍(TV＝1.10±0.88cm3；AUC56天P<0.006对比hRS7-CL2-SN-38)(未显示)。
还检查了在人结肠肿瘤异种移植物(COLO 205)和胰腺肿瘤异种移植物(Capan-1)中的功效。在带有COLO 205肿瘤的动物(未显示http:// clincancerres.aacrjournals.org/content/17/10/3157.long-F3)中，与对照抗CD20 ADC(hA20-CL2-SN-38)或hRS7 IgG相比较，hRS7-CL2-SN-38(0.4mg/kg，q4dx8)在28天治疗期内防止肿瘤生长，肿瘤明显更小(分别地，TV＝0.16±0.09cm3、1.19±0.59cm3和1.77±0.93cm3；AUC28天P<0.016)。
表2.在各种实体肿瘤系中SN-38和hRS7-SN-38的Trop-2体外细胞毒性的表达
伊立替康的MTD(24mg SN-38/kg，q2dx5)在COLO 205细胞中与hRS7-CL2-SN-38一样有效，因为与人血清相比，小鼠血清可以更高效地将伊立替康转化为SN-38(Morton等人，2000，Cancer Res60:4206-10)，但伊立替康的SN-38剂量(累积2,400μg)比缀合物(总共64μg)高37.5倍。
在以相当于hRS7-CL2-SN-38缀合物的SN-38剂量给予时，带有Capan-1的动物(未显示)对单独的伊立替康没有显示出显著响应(例如，在第35天，在给予0.4mg SN-38/kghRS7-SN-38的动物中平均肿瘤尺寸为0.04±0.05cm3，相比之下，在给予0.4mg/kg SN-38的伊立替康治疗的动物中平均肿瘤尺寸为1.78±0.62cm3；AUC35天P<0.001；未显示)。当伊立替康剂量增加10倍至4mg/kg SN-38时，响应得到改善，但仍不如0.4mg/kg SN-38剂量水平的缀合物显著(TV＝0.17±0.18cm3对比1.69±0.47cm3，AUC49天P<0.001)(未显示)。与伊立替康治疗的动物相比，等剂量的非靶向hA20-CL2-SN-38也具有显著的抗肿瘤作用，但特异性hRS7缀合物明显优于不相关的ADC(TV＝0.17±0.18cm3对比0.80±0.68cm3，AUC49天P<0.018)(未显示)。
然后将萨希珠单抗戈维替康ADC的研究扩展到其他2种人上皮癌症模型。在带有BxPC-3人胰腺肿瘤的小鼠(未显示)中，与用盐水或等量的非靶向hA20-CL2A-SN-38治疗的对照小鼠(分别地，TV＝0.24±0.11cm3对比1.17±0.45cm3和1.05±0.73cm3；AUC21天P<0.001)或用以高10倍SN-38当量剂量给予伊立替康治疗的对照小鼠(分别地，TV＝0.27±0.18cm3对比0.90±0.62cm3；AUC25天P<0.004)(未显示)相比较，萨希珠单抗戈维替康再次显著抑制肿瘤生长。有趣的是，在用0.4mg/kg ADC治疗的带有SK-MES-1人鳞状细胞肺肿瘤的小鼠(未显示)中，肿瘤生长抑制优于盐水或未缀合的hRS7 IgG(分别地，TV＝0.36±0.25cm3对比1.02±0.70cm3和1.30±1.08cm3；AUC28天，P<0.043)，但非靶向hA20-CL2A-SN-38或伊立替康的MTD提供与特异性hRS7-SN-38缀合物相同的抗肿瘤作用(未显示)。在所有鼠研究中，hRS7-SN-38 ADC在体重减轻方面具有良好的耐受性(未显示)。
萨希珠单抗戈维替康的生物分布-使用相应的111In标记的底物，在带有SK-MES-1人鳞状细胞肺癌异种移植物的小鼠中比较萨希珠单抗戈维替康或未缀合的hRS7 IgG的生物分布(未显示)。执行药代动力学分析以确定萨希珠单抗戈维替康相对于未缀合的hRS7的清除率(未显示)。ADC的清除速度快于等量的非缀合的hRS7，ADC表现出约40％的较短半衰期和平均停留时间。尽管如此，这对肿瘤摄取的影响很小(未显示)。虽然在24小时和48小时时间点存在显著差异，但到72小时(峰值摄取)时，肿瘤中两种药剂的量相似。在正常组织之中，肝和脾的差异最突出(未显示)。在注射后24小时，肝脏中的萨希珠单抗戈维替康比hRS7IgG(未显示)多>2倍。相反，在脾脏中，在峰值摄取(48小时时间点)处存在比萨希珠单抗戈维替康(未显示)多3倍的亲本hRS7 IgG。其余组织中的摄取和清除通常反映血液浓度的差异(未显示)。
因为给予每周两次的剂量用于治疗，检查在注射111In标记的抗体前3天首先接受0.2mg/kg(250μg蛋白质)的hRS7 ADC的预剂量的一组动物中的肿瘤摄取。与未接受该预剂量的动物相比，在预给药的小鼠中111In-萨希珠单抗戈维替康的肿瘤摄取在每个时间点都显著降低(例如，在72小时，预给药的肿瘤摄取为12.5％±3.8％ID/g对比在没有给予预剂量的动物中的25.4％±8.1％ID/g；P＝0.0123；未显示http:// clincancerres.aacrjournals.org/content/17/10/3157.long-F4)。预剂量对血液清除或组织摄取没有明显影响(未显示)。这些研究提示，在许多肿瘤模型中，通过先前的剂量可以降低特异性抗体的肿瘤增加，这可能解释了为什么随着ADC剂量增加可以减少治疗响应的特异性以及为什么没有指示进一步的剂量递增。
瑞士-韦伯斯特小鼠和食蟹猴中萨希珠单抗戈维替康的耐受性瑞士-韦伯斯特小鼠在3天内耐受2剂，各自为4mg、8mg和12mg SN-38/kg的萨希珠单抗戈维替康，具有最小的瞬时体重减轻(未显示)。没有发生造血毒性并且血清化学仅显示天冬氨酸转氨酶(AST，未显示)和丙氨酸转氨酶(ALT，未显示)升高。治疗后7天，在所有3个治疗组(未显示)中AST升高至正常水平以上(>298U/L)，最大比例的小鼠在2×8mg/kg组中。然而，在治疗后15天，大多数动物都在正常范围内。治疗7天内ALT水平也高于正常范围(>77U/L)(未显示)，并且在第15天有正常化的证据。来自所有这些小鼠的肝脏未显示组织损伤的组织学证据(未显示)。就肾功能而言，在治疗组中仅葡萄糖和氯化物水平略微升高。在2×8mg/kg时，7只小鼠中的5只具有略微升高的葡萄糖水平(范围为273mg/dL至320mg/dL，正常上限为263mg/dL)，其在注射后15天恢复正常。同样，氯化物水平略有升高，在2个最高剂量组中为116mmol/L至127mmol/L(正常范围的上限为115mmol/L)(2×8mg/kg组中57％的小鼠，并且2×12mg/kg组中100％的小鼠)，并在注射后保持升高至15天。这也可能表明胃肠道毒性，因为大多数氯化物是通过肠道吸收而获得；然而，在终止时，在所检查的任何器官***中没有组织损伤的组织学证据(未显示)。
因为小鼠在正常组织中不表达hRS7的Trop-2靶抗原，所以需要更合适的模型来确定hRS7缀合物用于临床用途的潜力。免疫组织学研究揭示人和食蟹猴的多种组织(乳腺、眼、胃肠道、肾、肺、卵巢、输卵管、胰腺、甲状旁腺、***、唾液腺、皮肤、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管和尿路；未显示)中的结合。基于该交叉反应性，在猴子中执行耐受性研究。
接受2×0.96mg SN-38/kg的萨希珠单抗戈维替康的组在输注后和研究结束后没有显著的临床事件。体重减轻不超过7.3％，并在第15天恢复到适应重量。在大多数血细胞计数数据中未注意到瞬时降低(未显示)，但是值不低于正常范围。在血清化学中未发现异常值。在第11天(最后一次注射后8天)尸检的动物的组织病理学显示造血器官(胸腺、下颌和肠系膜***、脾和骨髓)、胃肠器官(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)、女性生殖器官(卵巢、子宫和***)以及注射部位的微观改变。这些变化范围从最小到中等，并且除了在胸腺和胃肠道中，在所有组织中在恢复期结束(第32天)时完全逆转，在此后的时间点趋向于完全恢复(未显示)。
在2×1.92mg SN-38/kg剂量水平的缀合物中，有1例因胃肠道并发症和骨髓抑制而死亡，并且该组内的其他动物显示出与2×0.96mg/kg组相似但更严重的不良事件(未显示)。这些数据表明剂量限制毒性与伊立替康相同；即肠道和血液学。因此，萨希珠单抗戈维替康的MTD介于2×0.96mg和2×1.92mg SN-38/kg之间，其代表2×0.3至0.6mg/kg SN-38的人当量剂量。
讨论
Trop-2是在包括肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、***癌和卵巢癌的许多上皮肿瘤上表达的蛋白质，使其成为递送细胞毒性剂的潜在重要靶标(Ohmachi等人，2006,Clin Cancer Res 12:3057-63；Fong等人，2008,Br J Cancer 99:1290-95；Cubas等人，2009,Biochim Biophys Acta 1796:309-14)。当与Trop-2结合时，RS7抗体内化(Shih等人，1995,Cancer Res 55:5857s-63s)，其能够直接细胞内递送细胞毒素。
SN-38是一种有效的拓扑异构酶-I抑制剂，在几种细胞系中IC50值在纳摩尔范围内。它是前药伊立替康的活性形式，用于治疗结肠直肠癌，并且还在肺癌、乳腺癌和脑癌中具有活性。我们推断，以ADC形式的直接靶向的SN-38通过克服后者向活性SN-38的低和患者变化的生物转化而将是优于CPT-11的显著改善的治疗剂(Mathijssen等人，2001,ClinCancer Res 7:2182-94)。
***原始CL2衍生物中的Phe-Lys肽允许通过组织蛋白酶B进行可能的裂解。为了简化合成过程，在CL2A中消除了苯丙氨酸，因此去除了组织蛋白酶B裂解位点。有趣的是，与用CL2获得的宽谱(未显示)相比，该产物具有更好定义的色谱图，但更重要的是，这种变化对缀合物的结合或稳定性没有影响，并且在并排测试中令人惊讶地产生了效力的小幅增加。
hRS7 ADC对一系列实体肿瘤细胞系的体外细胞毒性始终具有在nmol/L范围内的IC50值。然而，与ADC相比，暴露于游离SN-38的细胞证明较低的IC50值。还对于ENZ-2208(Sapra等人，2008,Clin Cancer Res 14:1888-96；Zhao等人，2008,Bioconjug Chem 19:849-59)和NK012(Koizumi等人，2006,Cancer Res 66:10048-56))报道了在游离SN-38和缀合SN-38之间的该差异。ENZ-2208使用支化的PEG以每个PEG连接约3.5至4个SN-38分子，而NK012是含有20重量％SN-38的胶束纳米粒子。使用我们的ADC，随着肿瘤细胞中Trop-2表达水平增加，这种差异(即，游离SN-38相对缀合SN-38的效力比)降低，提示靶向递送药物的优势。就体外血清稳定性而言，hRS7-SN-38的CL2-SN-38和CL2A-SN-38形式均产生约20小时的t/1/2，这与对于ENZ-2208报道的12.3分钟的短t/1/2(Zhao等人，2008,Bioconjug Chem19:849-59)形成对比，但与24小时后生理条件下SN-38自NK012释放57％相似(Koizumi等人，2006,Cancer Res 66:10048-56)。
用hRS7-SN-38(用CL2-SN-38或CL2A-SN-38)治疗荷瘤小鼠显著抑制5种不同肿瘤模型中的肿瘤生长。在其中的4种中，观察到肿瘤消退，并且在Calu-3的情况下，接受最高剂量的hRS7-SN-38的所有小鼠在研究结束时都是无肿瘤的。与人不同，伊立替康通过小鼠的血浆酯酶非常高效地转化为SN-38，转化率大于50％，并且在小鼠中产生的功效高于在人中产生的功效(Morton等人，2000，Cancer Res60:4206-10；Furman等人，1999,J Clin Oncol17:1815-24)。当伊立替康以10倍以上或相当的SN-38水平施用时，hRS7-SN-38在控制肿瘤生长方面显著更好。只有当伊立替康以24mg/kg q2dx5(37.5倍以上的SN-38)的MTD施用时，其才与hRS7-SN-38的有效性相当。在患者中，我们将期望这种优势甚至更有利于萨希珠单抗戈维替康，因为伊立替康的生物转化将大大降低。
我们还在一些表达抗原的细胞系如SK-MES-1中显示，使用抗原结合ADC不能保证比非结合的不相关缀合物更好的治疗响应。这不是一个不寻常或意外的研究结果。实际上，当与伊立替康相比时，前面提到的非结合SN-38缀合物增强治疗活性，因此预期不相关的IgG-SN-38缀合物具有一些活性。这与肿瘤具有不成熟的渗漏血管的事实有关，与正常组织相比，这些血管允许大分子更好地通过(Jain,1994,Sci Am 271:58-61)。使用我们的缀合物，当pH降低至模拟溶酶体水平的水平(例如，在37℃下，pH值为5.3；数据未显示)时，在约13小时内将释放50％的SN-38，而在中性pH值的血清下，释放率降低近2倍。如果不相关的缀合物进入酸性肿瘤微环境，则预期局部释放一些SN-38。其他因素如肿瘤生理学和对药物的先天敏感性也将在定义该“基线”活性方面发挥作用。然而，只要有足以捕获特异性抗体的抗原，具有较长停留时间的特异性缀合物将具有比该基线响应增强的效力。SK-MES-1模型中的生物分布研究还显示，如果肿瘤抗原由于连续给药而变得饱和，则特异性缀合物的肿瘤摄取降低，这产生与用不相关缀合物发现的治疗结果相似的治疗结果。
尽管在我们的ADC与其他SN-38递送剂的已发表报告之间进行直接比较具有挑战性，但可以进行一些一般性观察。在我们的治疗研究中，最高个体剂量为0.4mg/kg SN-38。在Calu-3模型中，在20g小鼠中仅给予4次注射，总累积剂量为1.6mg/kg SN-38或32μg SN-38。ENZ-2208的多项研究用其10mg/kg×5的MTD进行(Sapra等人，2008,Clin Cancer Res14:1888-96；Pastorini等人，2010,Clin Cancer Res 16:4809-21)，并且NK012的临床前研究涉及其MTD为30mg/kg×3(Koizumi等人，2006,Cancer Res 66:10048-56)。因此，显著的抗肿瘤作用用hRS7-SN-38以分别比ENZ-2208和NK012中报道的剂量少30倍和55倍SN-38当量获得。即使10倍以下的hRS7ADC(0.04mg/kg)，也观察到显著的抗肿瘤作用，而未呈现较低剂量的ENZ-2208，并且当NK012剂量降低4倍至7.5mg/kg时，功效丢失(Koizumi等人，2006,CancerRes 66:10048-56)。正常小鼠没有显示急性毒性，1周的累积剂量为24mg/kg SN-38(1,500mg/kg的缀合物)，指示MTD更高。因此，用7.5至15倍低量的SN-38当量有效地治疗荷瘤动物。
生物分布研究揭示，萨希珠单抗戈维替康具有与亲本hRS7 IgG相似的肿瘤摄取，但是清除速度明显更快，肝脏摄取高2倍，这可能是由于SN-38的疏水性。随着ADC通过肝脏清除，预计肝脏和胃肠道毒性将是剂量限制性的。虽然小鼠有肝转氨酶升高的证据，但胃肠道毒性最好是温和的，只有短暂的体重减轻，并且组织病理学检查没有异常。有趣的是，没有注意到血液学毒性。然而，猴子显示出如对于伊立替康预期相同的毒性概况，其中胃肠道和血液学毒性是剂量限制性的。
因为hRS7识别的Trop-2不在小鼠中表达，所以在具有与人相似的Trop-2组织表达的猴子中执行毒性研究是重要的。猴子耐受0.96mg/kg/剂量(约12mg/m2)，具有轻微且可逆的毒性，其外推至约0.3mg/kg/剂量(约11mg/m2)的人剂量。在NK012的I期临床试验中，实体肿瘤患者每3周耐受28mg/m2的SN-38，其中4级中性粒细胞减少症作为剂量限制性毒性(DLT；Hamaguchi等人，2010,Clin Cancer Res16:5058-66)。同样，用ENZ-2208进行的I期临床试验揭示，剂量限制性发热性中性粒细胞减少症，推荐每3周施用10mg/m2，或者如果向患者施用G-CSF，则施用16mg/m2(Kurzrock等人，AACR-NCI-EORTC InternationalConference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics；2009年11月15–19；Boston,MA；Poster No C216；Patnaik等人，AACR-NCI-EORTC International Conferenceon Molecular Targets and Cancer Therapeutics；2009年11月15–19；Boston,MA；PosterNo C221)。由于猴子耐受22mg/m2的累积人等效剂量，看起来即使hRS7与许多正常组织结合，hRS7 ADC的单次治疗的MTD也可能与其他非靶向SN-38剂相似。实际上，抗Trop-2抗体的特异性似乎在限定DLT方面没有作用，因为毒性概况与伊立替康相似。更重要地，如果在人中可以实现抗肿瘤活性，就像在对仅0.03mg SN-38当量/kg/剂量的人等效剂量反应的小鼠中那样，则临床上可以实现显著的抗肿瘤响应。
总之，与小鼠中的体内人癌症异种移植模型相组合，猴子的毒理学研究指示该靶向Trop-2的ADC在不同上皮来源的几种肿瘤中是有效的治疗剂。
实施例5.抗Trop-2抗体的细胞结合测定
对于ADC缀合获得针对人Trop-2的两种不同的鼠单克隆抗体。最初162-46.2是从在滚瓶中长大的杂交瘤(ATCC，HB-187)中纯化出来的。第二抗体MAB650购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。为了比较结合，使用Trop-2阳性人胃癌NCI-N87作为靶标。在结合测定前一天将细胞(1.5×105/孔)铺板到96孔板中。次日早晨，用162-46.2，MAB650和鼠RS7(0.03nM至66nM)产生剂量/反应曲线。将这些一抗与细胞一起在4℃下孵育1.5小时。洗涤孔并在4℃下向所有孔中添加抗小鼠-HRP二抗持续1小时。再次洗涤孔，然后添加发光底物。使用Envision读板仪读板，并将值报告为相对发光单位。
所有三种抗体都具有相似的KD值，对于RS7，KD值为0.57nM，对于162-46.2，KD值为0.52nM，并且对于MAB650，KD值为0.49nM。然而，当比较162-46.2和MAB650的最大结合(Bmax)与RS7的最大结合(Bmax)时，与RS7比较，它们分别降低25％和50％(RS7的BMax为11,250，162-46.2的BMax为8,471，并且MAB650的BMax为6,018)指示不同的结合特性。
实施例6.抗Trop-2 ADC(MAB650-SN-38)的细胞毒性
用SN-38和MAB650制备新的抗Trop-2 ADC，产生6.89的平均药物与抗体取代比。使用两种不同的人胰腺癌细胞系(BxPC-3和Capan-1)和人三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-468)作为靶标执行细胞毒性测定以比较MAB650-SN-38和萨希珠单抗戈维替康ADC。
在添加ADC之前一天，从组织培养物中收获细胞并将其铺板到96孔板中。第二天将细胞暴露于药物范围为3.84×10-12至2.5×10-7M的萨希珠单抗戈维替康、MAB650-SN-38和游离SN-38。未缀合的MAB650作为MAB650-SN-38的对照以蛋白当量剂量使用。将板在37℃下孵育96小时。在该孵育期后，将MTS底物添加到所有板中，并以半小时间隔读取显色，直至未处理的细胞达到约1.0的OD492nm。使用Microsoft Excel和Prism软件测量生长抑制作为相对于未处理细胞的生长百分比(非线性回归以产生S形剂量反应曲线，这些S形剂量反应曲线产生IC50-值。
萨希珠单抗戈维替康和MAB650-SN-38具有相似的生长抑制作用，IC50-值在低nM范围内，这对于这些细胞系中的SN-38-ADC是典型的(未显示)。在人Capan-1胰腺癌细胞系(未显示)中，萨希珠单抗戈维替康ADC显示IC50为3.5nM，相比之下，对于MAB650-SN-38ADC，IC50为4.1nM，并且对于游离SN-38，IC50为1.0nM。在人BxPC-3胰腺癌细胞系(未显示)中，萨希珠单抗戈维替康ADC显示IC50为2.6nM，相比之下，对于MAB650-SN-38 ADC，IC50为3.0nM，并且对于游离SN-38，IC50为1.0nM。在人NCI-N87胃癌细胞系(未显示)中，萨希珠单抗戈维替康ADC显示IC50为3.6nM，相比之下，对于MAB650-SN-38 ADC，IC50为4.1nM，并且对于游离SN-38，IC50为4.3nM。
总之，在这些体外测定中，两种抗Trop-2抗体hRS7和MAB650的SN-38缀合物显示出针对抗几种肿瘤细胞系的相同功效，这与游离SN-38相似。因为抗Trop-2抗体的靶向功能在体内将是比在体外显著得多的因素，因此数据支持抗Trop-2-SN-38 ADC作为一类在体内将非常有效的，如在上述实施例中对于萨希珠单抗戈维替康所证明。
实施例7.抗Trop-2 ADC(162-46.2-SN-38)的细胞毒性
用SN-38和162-46.2制备新的抗Trop-2 ADC，产生6.14的药物与抗体的取代比。使用两种不同的Trop-2-阳性细胞系作为靶标在BxPC-3人胰腺癌和MDA-MB-468人三阴性乳腺癌中执行细胞毒性测定以比较162-46.2-SN-38和hRS7-SN-38 ADC。
在添加ADC之前一天，从组织培养物中收获细胞并将其以2000个细胞/孔铺板到96孔板中。第二天将细胞暴露于药物范围为3.84×10-12至2.5×10-7M的萨希珠单抗戈维替康、162-46.2-SN-38或游离SN-38。未缀合的162-46.2和hRS7分别作为162-46.2-SN-38和萨希珠单抗戈维替康的对照以相同蛋白当量剂量使用。将板在37℃下孵育96小时。在该孵育期后，将MTS底物添加到所有板中，并以半小时间隔读取显色，直至未处理的对照细胞达到约1.0的OD492nm读数。使用Microsoft Excel和Prism软件测量生长抑制作为相对于未处理细胞的生长百分比(非线性回归以产生S形剂量反应曲线，这些S形剂量反应曲线产生IC50-值)。
与萨希珠单抗戈维替康相比，162-46.2-SN-38 ADC具有相似的IC50-值(未显示)。在对于BxPC-3人胰腺癌细胞系测试(未显示)时，萨希珠单抗戈维替康的IC50为5.8nM，相比之下，对于162-46.2-SN-38，IC50为10.6nM，并且对于游离SN-38，IC50为1.6nM。在对于MDA-MB-468人乳腺癌细胞系测试(未显示)时，萨希珠单抗戈维替康的IC50为3.9nM，相比之下，对于162-46.2-SN-38，IC50为6.1nM，并且对于游离SN-38，IC50为0.8nM。单独的游离抗体对Trop-2阳性癌细胞系显示出很小的细胞毒性。
总之，比较与相同细胞毒性药物缀合的三种不同抗Trop-2抗体的体外功效，所有三种ADC针对多种Trop-2阳性癌细胞系表现出等效的细胞毒性作用。这些数据支持并入药物缀合的ADC中的一类抗Trop-2抗体是表达Trop-2的实体肿瘤的有效抗癌治疗剂。
实施例8.用包含与SN-38缀合的hRS7抗体的IMMU-132(萨希珠单抗戈维替康)抗Trop-2 ADC的临床试验
概述
本实施例报道了用IMMU-132进行的I期临床试验和正在进行的II期延长的结果，其中IMMU-132是通过pH敏感性接头与SN-38缀合(平均药物-抗体比率＝7.6)的内化人源化hRS7抗Trop-2抗体的ADC。Trop-2是I型跨膜的钙转导蛋白，由许多人癌瘤以高密度(约1×105)、频率和特异性表达，具有有限的正常组织表达。在带有Capan-1人胰腺肿瘤异种移植物的裸鼠中的临床前研究揭示，IMMU-132能够向肿瘤递送与衍生自最大耐受的伊立替康疗法的SN-38相比高达120倍以上的SN-38。
本实施例报告了25例多次既往治疗(一些包括拓扑异构酶-I/II抑制药物)失败的患者的初始I期试验，并且正在进行的II期延伸现在报告了69例患者，包括结肠直肠癌(CRC)、小细胞和非小细胞肺癌(分别为SCLC、NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌(PDC)、食道癌和其他癌症。
如下面详细讨论的，在血清中未检测到Trop-2，但在大多数存档的肿瘤中强烈表达(≥2+免疫组织化学染色)。在3+3试验设计中，IMMU-132在重复的21天周期的第1天和第8天给予，以8mg/kg/剂量开始，然后在剂量限制性中性粒细胞减少症之前以12mg/kg和18mg/kg给予。为了以最小的延迟优化累积治疗，II期集中在8mg/kg和10mg/kg(分别地，n＝30和14)。在此时报告相关AE的49名患者中，中度粒细胞减少症≥3级在28％中发生(4％4级)。最初在这些患者中最常见的非血液学毒性是疲劳(55％；≥G3＝9％)、恶心(53％；≥G3＝0％)、腹泻(47％；≥G3＝9％)、脱发(40％)和呕吐(32％；≥G3＝2％)；脱发也经常发生。在6名患者中发现了纯合子UGT1A1*28/*28，其中2名患者具有更严重的血液学和GI毒性。
在I期和延伸期，现在有48名患者(不包括PDC)可通过RECIST/CT评估以获得最佳响应。7例(15％)患者具有部分响应(PR)，包括CRC患者(N＝1)、TNBC患者(N＝2)、SCLC患者(N＝2)、NSCLC患者(N＝1)和食管癌患者(N＝1)，并且27名患者(56％)疾病稳定(SD)，总共38名患者(79％)具有疾病响应；13例CT可评估的PDC患者中有8例(62％)患有SD，中位进展时间(TTP)为12.7周，相比之下，上一次治疗中的中位进展时间为8.0周。其余48名患者的TTP为12.6+周(范围为6.0至51.4周)。血浆CEA和CA19-9与血液中这些抗原的滴度升高的响应相关。尽管给药数月，但未检测到抗hRS7或抗SN-38抗体。
缀合物在3天内从血清中清除，与体内动物研究一致，其中每天释放50％的SN-38，血清中>95％的SN-38与非葡糖醛酸化形式的IgG结合，并且浓度比给予伊立替康的患者报告的SN-38高100倍。这些结果显示，萨希珠单抗戈维替康在转移性实体癌症中具有治疗活性，具有可控的腹泻和中性粒细胞减少症。
药物动力学
使用两种ELISA方法测量IgG的清除率(用抗hRS7独特型抗体捕获)和完整缀合物的清除率(用抗-SN-38IgG捕获/用抗hRS7独特型抗体探测)。通过HPLC测量SN-38。总IMMU-132分数(完整缀合物)比IgG(未显示)更快地清除，反映了SN-38从缀合物中已知的逐渐释放。SN-38(未结合的SN-38和总SN-38)的HPLC测定显示血清中>95％的SN-38与IgG结合。低浓度的SN-38G提示与IgG结合的SN-38被保护免受葡糖醛酸化。缀合物和SN-38 HPLC的ELISA比较揭示两者重叠，提示ELISA是监测SN-38清除的替代。
表3中提供了给药方案和患者库的汇总。
表3.临床试验参数
临床试验状态
报告了总共69名患者(包括I期的25名患者)具有多种转移性癌症，其中位数为3种先前治疗。8名患者有临床进展并在CT评估前退出。分别报告了13名CT可评估的胰腺癌患者。PDC患者的中位TTP(进展时间)为11.9周(范围为2至21.4周)，相比之前前一次治疗的中位数为8周TTP。
共有48名患有不同癌症的患者进行了至少1次CT评估，从中确定了最佳响应(未显示)和进展时间(TTP；未显示)。为了汇总8名可评估的TNBC(三阴性乳腺癌)患者的最佳响应数据，对于8名中6名具有的总响应[PR+SD](75％)，2名PR(部分响应)，4名SD(疾病稳定)和2名PD(进展性疾病)。对于SCLC(小细胞肺癌)，在4名可评估的患者之中，对于4名中2名具有的总响应(50％)，2名PR，0名SD和2名PD。对于CRC(结肠直肠肺癌)，在18名可评估的患者之中，对于18名中12名具有的总响应(67％)，1名PR，11名SD和6名PD。对于食道癌，在4名可评估的患者之中，对于4名中3名具有的总响应(75％)，1名PR，2名SD和1名PD。对于NSCLC(非小细胞肺癌)，在5名可评估的患者之中，对于5名中4名具有的总响应(80％)，1名PR，3名SD和1名PD。在治疗的所有患者之中，在48名可评估的患者之中，对于48名中34名具有的总响应(71％)，7名PR，27名SD和14名PD。这些结果证明抗TROP-2 ADC(hRS7-SN-38)显示针对人患者中广泛的实体肿瘤的显著临床功效。
报告的治疗副作用(不良事件)汇总在表4中。从表4的数据显而易见，在ADC的剂量下实现了萨希珠单抗戈维替康的治疗功效，显示出可接受的低水平的不良副作用。
表4.
表4中报告的研究仍在继续，迄今已有261名患者入选。结果(未显示)通常沿着表4中所示的线进行，仅中性粒细胞减少症显示超过10％的所测试患者发生3级或更高级别的不良事件。对于所有其他不良事件，3级或更高级别响应的发生率低于10％。这将本发明的ADC与绝大多数ADC加以区分，并且在某些实施方案中，所要求保护的方法和组合物涉及在多种实体肿瘤中显示功效的抗Trop-2 ADC，对于除中性粒细胞减少症外的所有不良事件，小于10％的患者发生3级或更高级别的不良事件。在一项后续研究中，在总共来自121名基线患者的421份样品和至少一种可得到的随访样品中，尽管重复多个治疗周期，仍未检测到抗hRS7或抗SN-38抗体响应。
CT数据确认了对抗Trop-2 ADC的示例性部分响应(未显示)。作为CRC中的示例性PR，首先被诊断患有CRC的62岁女性进行了原发性半切除术。四个月后，她进行了肝转移的肝切除术，并接受了7个月用FOLFOX的治疗和1个月5FU治疗。她主要在肝脏中呈现多种病变(根据免疫组织学，3+Trop-2)，在初始诊断后以8mg/kg的起始剂量进入萨希珠单抗戈维替康试验，持续约1年。在她的第一次CT评估中，实现了PR，靶病变减少了37％(未显示)。患者继续治疗，治疗10个月后(未显示)最大程度减少65％，CEA从781ng/mL降至26.5ng/mL)，然后在3个月后进展。
作为NSCLC中的示例性PR，65岁男性被诊断患有IIIB期NSCLC(鳞状细胞)。与7000cGy XRT一起进行卡铂/依托泊苷的初步治疗(3个月)导致持续10个月的响应。然后他开始接受特罗凯(Tarceva)维持治疗，除了接受腰椎椎板切除术之外，他一直在考虑进行IMMU-132试验。他在特罗凯治疗5个月后接受了第一剂IMMU-132，当时右肺呈现5.6cm的病变，胸腔积液丰富。两个月后，当第一次CT显示主要靶病变减小到3.2cm时，他刚刚完成了第6次剂量(未显示)。
作为SCLC中的示例性PR，一名65岁女性被诊断为分化差的SCLC。在接受2个月后以没有响应结束的卡铂/依托泊苷(拓扑异构酶-II抑制剂)后，接着接受拓扑替康(拓扑异构酶-I抑制剂)，其同样在2个月后以没有响应而结束，她接受局部XRT(3000cGy),在1个月后结束。然而，到了接下来的一个月，进展仍在继续。患者下个月开始使用IMMU-132(12mg/kg；降至6.8mg/kg；Trop-2表达3+)，并且在IMMU-132治疗2个月后，靶病变减少38％，包括主要肺部病变发生显著减少(未显示)。患者在接受12次剂量后3个月后进展。
这些结果是显著的，因为它们证明抗Trop-2 ADC是有效的，甚至在多次先前治疗后失败或进展的患者中也是如此。总之，在使用的剂量下，主要毒性是可控的中性粒细胞减少症，很少具有3级毒性。IMMU-132显示患有三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌和食道癌的复发/难治性患者的活性(PR和耐久性SD)的证据，包括既往有过拓扑异构酶-I抑制剂治疗复发史的患者。这些结果显示抗Trop-2 ADC在广泛的对现有疗法有抗性的癌症中的功效。
实施例9.不同抗Trop-2 ADC的比较功效
在带有人胃癌异种移植物(NCI-N87)的小鼠中进行与SN-38缀合的鼠抗Trop-2单克隆抗体(162-46.2)的治疗功效与萨希珠单抗戈维替康抗体-药物缀合物(ADC)的治疗功效的比较。NCI-N87细胞在组织培养物中扩增，并用胰蛋白酶/EDTA收获。对雌性无胸腺裸鼠皮下注射200μl的与基质胶1:1混合的NCI-N87细胞悬浮液，使每只小鼠施用1×107个细胞。肿瘤尺寸一旦达到约0.25cm3(6天后)，则将动物分成7个不同的治疗组，每组9只小鼠。对于SN-38 ADC，小鼠每周一次接受500μg静脉注射，持续两周。对照小鼠以相同的剂量/时间表接受非肿瘤靶向hA20-SN-38ADC。最后一组小鼠仅接受盐水并用作未处理的对照。测量肿瘤并且每周将小鼠称重两次。如果小鼠的肿瘤体积超过1.0cm3的尺寸，则将小鼠安乐死以用于疾病进展。
测定SN-38-ADC治疗的小鼠的平均肿瘤体积(未显示)。如通过曲线下面积(AUC)所确定，当与盐水和hA20-SN-38对照小鼠相比时，萨希珠单抗戈维替康和162-46.2-SN-38均显著抑制肿瘤生长(P<0.001)。用萨希珠单抗戈维替康治疗在9只小鼠中的7只中实现疾病稳定，平均肿瘤进展时间(TTP)为18.4±3.3天。用162-46.2-SN-38治疗的小鼠在9只小鼠中的6只中获得阳性响应，其余3只实现疾病稳定。平均TTP为24.2±6.0天，显著久于萨希珠单抗戈维替康治疗的动物(P＝0.0382)。
这些结果确认不同的抗Trop-2 ADC用于治疗人胃癌的体内功效。
实施例10.用抗Trop-2 ADC治疗患有晚期转移性胰腺癌的患者概述
IMMU-132(萨希珠单抗戈维替康)是一种抗Trop-2 ADC，其包含通过pH敏感性接头与伊立替康的活性代谢物SN-38缀合的癌细胞内化人源化抗Trop-2hRS7抗体，平均药物-抗体比率为7.6。Trop-2是在包括胰腺导管腺癌的许多上皮癌中以高密度、频率和特异性表达的I型跨膜钙转导蛋白，其具有有限的正常组织表达。通过免疫组织化学测试的所有29个胰腺肿瘤微阵列样本均为Trop-2阳性，并且发现人胰腺癌细胞系在细胞膜上表达115k-891kTrop-2拷贝。
我们上面报道了IMMU-132I期研究的结果，该研究使用3+3设计招募了13种不同肿瘤类型的患者。I期剂量限制性毒性是中性粒细胞减少症。本研究中24名可评估患者中超过80％具有长期稳定的疾病，在结直肠癌(CRC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、小细胞和非小细胞肺癌(SCLC、NSCLC)和食道(EAC)癌症的患者中观察到部分响应(RECIST)。本实施例报告了具有转移性PDC的患者的IMMU-132I/II期研究队列的结果。中位数为2的先前治疗失败(范围1至5)的PDC患者以重复的21天周期中的第1天和第8天给予IMMU-132。
在PDC患者亚组(N＝15)中，14例接受了先前含吉西他滨的治疗方案。来自9例患者的初始毒性数据发现中性粒细胞减少症[9例中有3例≥G3，33％；且1例具有G4发热性中性粒细胞减少症]，导致剂量延迟或剂量减少。2例患者具有3级腹泻；没有患者出现3至4级恶心或呕吐。9例患者中有5例发生脱发(1至2级)。14例患者中有13例评估了最佳响应，其中8例疾病稳定，持续8至21.4周(中位数为12.7周；所有14例患者为11.9周)。一名正在继续治疗的患者尚未进行首次CT评估。其中根据RECIST，五人具有进展性疾病；由于临床进展，1剂量后1例退出，无法评估。3例疾病稳定的患者的血清CA19-9滴度下降23％至72％。尽管多次施用，但没有患者对IMMU-132或SN-38产生抗体响应。峰值和谷值血清样品显示IMMU-132比IgG更快地清除，这是基于SN-38在肿瘤细胞内的已知局部释放而预期的。来自给予12mg/kg的IMMU-132的一名患者的峰值样品中与IgG结合的SN-38浓度显示约4000ng/mL的水平，其比给予伊立替康治疗的患者报告的SN-38滴度高40倍。
我们得出结论，IMMU-132在62％(8/13)的在多次先前治疗中失败的PDC患者中是活性的(长期稳定的疾病)，具有可控的中性粒细胞减少症和很少的GI毒性。在21天周期的第1天和第8天，可以给予晚期PDC患者8至10mg/kg IMMU-132的重复治疗周期(>6)，在后续治疗周期中对嗜中性粒细胞减少症进行一些剂量调整或生长因子支持。这些研究结果与晚期CRC、TNBC、SCLC、NSCLC、EAC患者的结果一致，这些患者在IMMU-132施用时显示出部分响应和长期稳定的疾病。总之，单一疗法IMMU-132对于PDC患者是一种新颖有效的治疗方案，PDC患者包括患有先前对PDC的其他治疗方案有抗性的肿瘤的患者。
方法和结果
Trop-2表达-通过流式细胞术使用PE珠粒测定Trop-2在各种癌细胞系的表面上的表达。在不同细胞系中检测到的Trop-2分子的数量的结果是：BxPC-3胰腺癌(891,000)；NCI-N87胃癌(383,000)；MDA-MB-468乳腺癌(341,000)；SK-MES-1鳞状细胞肺癌(27,000)；Capan-1胰腺癌(115,000)；AGS胃癌(78,000)COLO 205结肠癌(52,000)。在29名胰腺癌组织微阵列中的29名(100％)中也观察到Trop-2表达(未显示)。
SN-38积聚-在带有Capan-1人胰腺癌异种移植物(约0.06至0.27g)的裸鼠中测定SN-38积聚。用伊立替康40mg/kg静脉内注射小鼠(773μg；总SN-38当量＝448μg)。该剂量是小鼠的MTD。人剂量当量＝3.25mg/kg或约126mg/m2。或者用IMMU-1321.0mg静脉注射小鼠(SN-38:抗体比＝7.6；Sn-38当量＝20μg)。该剂量远低于小鼠的MTD。人等效剂量为约4mg/kg IMMU-132(约80μg/kg SN-38当量)。在以下每个时间间隔对3只动物执行尸检，在注射伊立替康的小鼠中在5分钟、1小时、2小时、6小时和24小时或在注射IMMU-132的小鼠中在1小时、6小时、24小时、48小时和72小时执行尸检。提取组织并通过对SN-38、SN-38G和伊立替康的反相HPLC分析执行分析。来自IMMU-132治疗的动物的提取物也被酸水解以从缀合物释放SN-38(即，SN-38(总])。结果证明，与伊立替康相比，IMMU-132ADC有可能向肿瘤递送120倍以上的SN-38，尽管在用ADC的情况下施用22倍以下的SN-38当量(未显示)。
IMMU-132临床方案-用于I/II期研究的方案如下表5指示。
根据以上概述的方案对患者施用IMMU-132。示例性案例研究如下。最初诊断为转移性胰腺癌(肝脏)的34岁白人男性在引入IMMU-132(8mg/kg剂量，在21天周期的第1天和第8天给予)之前在包括吉西他滨/厄洛替尼/FG-3019、FOLFIRINOX和GTX的多种化疗方案中取得了进展。患者接受药物治疗4个月，症状耐受性良好，疼痛改善，CA19-9最大下降72％(从15885U/mL降至4418U/mL)，并且根据CT RECIST标准疾病稳定，还有肿瘤坏死的证据。治疗由于肝脓肿而必须暂停；患者随后停止约6周，接着开始6个月治疗。
结论
临床前研究指示，与给予伊立替康时相比，IMMU-132向人胰腺肿瘤异种移植物递送120倍量的SN-38。作为招募患有多种转移性实体癌症的患者的大型研究的一部分，基于作为主要副作用的可控的中性粒细胞减少症和腹泻，确定IMMU-132的2期剂量为8mg/kg至10mg/kg。迄今未检测到抗-抗体或抗SN-38抗体，即使在重复的治疗周期中也是如此。
一项对14名在中位数为2的先前治疗后复发的晚期PDC患者的研究显示，CT确认的抗肿瘤活性由8/13(62％)疾病稳定的患者组成。13名CT可评估患者的TTP的中位持续时间为12.7周，相比之下，上一次先前治疗估计为8.0周。通过在肿瘤部位提供裂解的接头与在许多上皮癌上普遍存在的抗体靶向Trop-2缀合的具有纳摩尔毒性的已知药物ADC代表用ADC进行胰腺癌治疗的新的有效策略。与目前胰腺癌患者的护理标准相比，胰腺癌患者，特别是对多种先前治疗有抗性的患者的进展时间延长是令人惊讶的并且无法预测。
实施例11.组合抗体靶向的放射(放射免疫疗法)与抗Trop-2-SN-38 ADC改善胰腺癌治疗
我们先前报道了90Y人源化PAM4 IgG(hPAM4；90Y-司可利妥珠单抗tetraxetan)在带有人胰腺肿瘤的裸鼠中的有效抗肿瘤活性，在与吉西他滨(GEM)组合时增强(Gold等人，Int J.Cancer 109:618-26,2004；Clin Cancer Res 9:3929S-37S,2003)。这些研究导致了与GEM组合的分级90Y-hPAM4 IgG的临床测试，其显示出令人鼓舞的客观响应。尽管GEM以其放射增敏能力而闻名，但它本身并不是一种非常有效的胰腺癌治疗剂，并且其剂量受血液毒性限制，这也对于90Y-hPAM4 IgG也是限制性的。
如上文实施例中所讨论，由与SN-38连接的hRS7 IgG组成的抗Trop-2 ADC在各种实体肿瘤中显示出抗肿瘤活性。该ADC在小鼠中具有非常好的耐受性(例如，≥60mg)，但仅4.0mg(0.5mg，每周两次×4)是显著治疗性的。Trop-2也在大多数胰腺癌中表达。
本研究检查了在带有人胰腺癌细胞系Capan-1的0.35cm3皮下异种移植物的裸鼠中90Y-hPAM4 IgG与萨希珠单抗戈维替康的组合。小鼠(n＝10)单独用单剂量的90Y-hPAM4IgG(130μCi，即最大耐受剂量(MTD)或75μCi)治疗，单独用萨希珠单抗戈维替康(如上所述)治疗，或用以两种90Y-hPAM4剂量水平的2剂与在与90Y-hPAM4同一天给予的第一ADC注射剂组合治疗。所有治疗都是耐受的，体重减轻≤15％。在大多数动物中发生客观响应，但与单独给予的每种药剂相比，它们在两个组合组中都更稳健。0.13-mCi90Y-hPAM4 IgG+萨希珠单抗戈维替康组中的所有动物在4周内达到无肿瘤状态，而其他动物继续具有持续疾病的证据。这些研究提供了第一个证据，即组合放射免疫疗法，并且ADC可以在安全剂量下增强疗效。
在正在执行的PAM4临床试验中，执行为期四周的临床治疗周期。在第1周，对受试者施用111In-hPAM4的剂量，然后至少2天后施用吉西他滨剂量。在第2、3和4周，对受试者施用90Y-hPAM4剂量，然后至少2天后施用吉西他滨(200mg/m2)。升级在3×6.5mCi/m2下开始。前线胰腺癌患者的最大耐受剂量为3×15mCi/m2(血液学毒性是剂量限制性的)。在22名CT可评估的患者中，疾病控制率(CR+PR+SD)为68％，其中根据RECIST标准，5名(23％)患者具有部分响应并且10名(45％)患者具有稳定的最佳响应。
抗体-药物缀合物(ADC)的制备
SN-38缀合的hRS7抗体如上所述并根据先前描述的方案制备(Moon等人，J MedChem 2008,51:6916-6926；Govindan等人，Clin Cancer Res 2009.15:6052-6061)。制备SN-38的反应性双官能衍生物(CL2A-SN-38)。CL2A-SN-38的式是(马来酰亚胺基-[x]-Lys-PABOCO-20-O-SN-38，其中PAB是对氨基苄基并且‘x’含有短PEG)。在用TCEP还原抗体中的二硫键后，使CL2A-SN-38与还原的抗体响应以产生SN-38缀合的RS7。
如先前所述制备90Y-hPAM4(Gold等人，Clin Cancer Res 2003,9:3929S-37S；Gold等人，Int J Cancer 2004,109:618-26)。
组合RAIT+ADC
Trop-2抗原在大多数上皮癌(肺癌、乳腺癌、***癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌)中表达，并且在各种人癌症-小鼠异种移植模型中检查萨希珠单抗戈维替康缀合物。用90Y-hPAM4 IgG加放射增敏量的GEM进行的初步临床试验令人鼓舞，具有肿瘤收缩或疾病稳定的证据。然而，胰腺癌的治疗非常具有挑战性。因此，检查组合疗法以确定它是否会诱导更好的响应。具体地讲，以有效但无毒的剂量施用萨希珠单抗戈维替康与具有90Y-hPAM4IgG的RAIT组合。
结果证明，萨希珠单抗戈维替康与90Y-hPAM4的组合比单独的任一种治疗或单独治疗的总和(未显示)更有效。在75μCi90Y-hPAM4的剂量下，治疗20周后10只小鼠中只有1只无肿瘤(未显示)，与单独用萨希珠单抗戈维替康观察到的相同(未显示)。然而，萨希珠单抗戈维替康与90Y-hPAM4的组合导致20周后10只小鼠中有4只无肿瘤(未显示)，并且剩余的受试者与单独的任一种治疗相比显示肿瘤体积显著减小(未显示)。在130μCi90Y-hPAM4下，差异甚至更显著，与单独RAIT组中的10只中有5只无肿瘤(未显示)相比，组合治疗组中的10只动物中有9只无肿瘤。这些数据证明萨希珠单抗戈维替康与90Y-hPAM4的组合的协同作用。RAIT+ADC显著改善了进展时间并增加了无肿瘤治疗的频率。添加到具有90Y-hPAM4的RAIT的MTD的ADC与萨希珠单抗戈维替康的组合具有最小的另外毒性，这由响应于治疗的动物的重量减轻％指示(未显示)。
不同顺序的治疗对肿瘤存活的作用指示，在首先施用RAIT，然后施用ADC获得最佳作用(未显示)。相反，当首先施用ADC，然后施用RAIT时，无肿瘤动物的出现率降低(未显示)。当单独给予时，未缀合的hPAM4和hRS7抗体都不具有抗肿瘤活性(未显示)。
实施例12.使用萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132)来治疗疗法难治的转移性乳腺癌
患者为一名57岁女性，其患有IV期三阴性乳腺癌(ER/PR阴性，HER-neu阴性)，最初于2005年确诊。她于2005年接受了左***肿瘤切除术，然后在2005年9月接受了剂量密集的ACT辅助治疗。然后，她接受了放射疗法，该疗法于11月完成。当患者在2012年初触诊确定对侧(右)***肿块时，鉴定该疾病的局部复发，然后用CMF(环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶)化疗进行治疗。她的疾病在同一年复发，胸壁皮肤有转移性病变。然后，她接受了卡铂+化疗方案，在此期间产生血小板减少症。她的疾病进展并且开始每周使用多柔比星，持续6个剂量。皮肤病也在不断进展。在09/26/12的FDG-PET扫描显示胸壁上的疾病进展和扩大的实体腋窝***。对患者给予羟考酮用于控制疼痛。
在胸壁病变打开并出血时，从2012年10月直至2013年2月对她给予(每2周一次，持续4个月)。然后对她给予由于手脚神经病变以及便秘而不能很好地耐受。皮肤病变是进展性的，然后在给予知情同意后入选IMMU-132试验。该患者还有甲状腺功能亢进和视力障碍的病史，CNS疾病的风险很高(然而，脑MRI对CNS疾病呈阴性)。在入选该试验时，右***的皮肤病变(靶标)测量为最大直径为4.4厘米和2.0厘米。她右***有另一个非靶病变，并且右腋窝和左腋窝各有一个肿大的***。
第一次IMMU-132输注(12mg/kg)于2013年3月12日开始，耐受良好。第二次输注由于在输注的预定日3级绝对中性粒细胞计数(ANC)减少(0.9)而延迟到一周后。在延迟一周后并在接受后，对她第二次施用IMMU-132，剂量降低25％至9mg/kg。此后，她按照协议按计划表接收IMMU-132，每周一次，持续2周，然后休息一周。在3个治疗周期后，她在2013年5月17日的第一次响应评估显示靶病变的长直径的总和减小43％，构成根据RECIST标准的部分响应。她正在以9mg/kg剂量水平继续治疗。自从她开始用IMMU-132治疗以来，她的整体健康和临床症状得到显著改善。
实施例13.使用萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132)来治疗难治的转移性小细胞肺癌
这是一名诊断为小细胞肺癌的65岁女性，涉及左肺、纵隔***和左顶叶脑转移的MRI证据。先前化疗包括卡铂、依托泊苷和拓扑替康，但没有注意到响应。放射疗法也无法控制她的疾病。然后每三周一次以18mg/kg的剂量给予IMMU-132，总共输注5次。在第二次给药后，她出现低血压和2级中性粒细胞减少症，在下次输注前有所改善。在第五次输注后，CT研究显示她的靶标左肺肿块收缩13％。脑部MRI也显示该转移降低10％。她继续她的IMMU-132给药，每3周给药，再持续3个月，并继续显示其病状的客观和主观改善，左肺肿块降低25％并且脑转移降低21％。
实施例14.用萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132)治疗患有IV期转移性疾病的胃癌患者
这名患者是一名60岁的男性，他有超过40年的吸烟和过量酒精摄入史。他经历了体重减轻、饮食不适和无法用抗酸剂减轻的疼痛、频繁腹痛、下背痛以及最近在两个腋窝处有可触及的***。他寻求医疗建议，基于经由胃镜的活检，进行检查后显示在胃食管交界处有腺癌，包括一些鳞状特征。放射学研究(CT和FDG-PET)也揭示在左右腋窝、纵隔区域、腰椎和肝脏有转移性疾病(右叶2个肿瘤，左叶1个肿瘤，所有测量的直径为2cm至4cm)。切除他的胃肿瘤，然后用表阿霉素、顺铂和5-氟尿嘧啶进行化疗疗程。在4个月和6周的休息期后，他转换为多西紫杉醇化疗，基于通过转移性肿瘤和一些一般恶化的CT测量确认的进展，这也未能控制他的疾病。
然后对患者给予用IMMU-132(hRS7-SN-38)的治疗，每隔一周输注10mg/kg的剂量，总共6个剂量，之后进行CT研究以评估其疾病状态。这些输注耐受性良好，伴有轻度恶心和腹泻，并采用对症药物进行控制。CT研究揭示，他的指数转移性病变的总和减少了28％，因此他继续接受该疗法另外5个疗程。随访CT研究显示，根据RECIST标准，该疾病在IMMU-132治疗前自基线测量结果保持降低约35％，并且他的一般情况似乎也有所改善，患者恢复了对他的疾病处于控制之下的乐观态度。
实施例15.IMMU-132在多种Trop-2阳性癌症中的临床试验
摘要
萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132，也称为hRS7-CL2A-SN-38)是一种抗体-药物缀合物(ADC)，其靶向在许多上皮肿瘤上表达的表面糖蛋白Trop-2，用于递送伊立替康的活性代谢物SN-38。与使用超毒性药物和稳定接头的大多数ADC不同，IMMU-132使用在SN-38和接头之间具有中等稳定的碳酸酯键的中等毒性药物。流式细胞术和免疫组织化学公开Trop-2在包括胃癌、胰腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、结肠癌、***癌和肺癌的多种肿瘤类型中表达。虽然细胞结合实验揭示在IMMU-132和亲本hRS7抗体之间没有显著差异，但使用Trop-2CM5芯片的表面等离子体共振分析显示IMMU-132具有优于hRS7的显著结合优势。缀合物保留与新生儿受体的结合，但与hRS7相比，损失了大于60％的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性。
肿瘤细胞暴露于游离SN-38或IMMU-132证明相同的信号传导途径：pJNK1/2和p21WAF1/Cip1上调，随后裂解半胱天冬酶9、7和3，最终导致聚-ADP-核糖聚合酶裂解和双链DNA断裂。完整ADC在小鼠中的药代动力学揭示平均停留时间(MRT)为15.4小时，而载体hRS7抗体以与未缀合的抗体相似的速率清除(MRT＝约300小时)。与用非特异性对照处理的小鼠相比，IMMU-132治疗带有人胃癌异种移植物的小鼠(17.5mg/kg；每周两次×4周)导致显著的抗肿瘤作用。在带有人胰腺癌或胃癌的小鼠中每隔一周一次、每周一次或每周两次施用IMMU-132的临床相关给药方案。
目前的I期试验将该ADC评价为具有多种转移性实体肿癌的预治疗患者的潜在治疗剂。在特定的实施方案中，该疗法用于治疗先前已发现对标准抗癌治疗有抗性或已经自标准抗癌治疗复发的患者，这些标准抗癌治疗包括但不限于用伊立替康(SN-38的母体化合物)治疗。这些结果令人惊讶且出乎预料，并且无法预测。
在21天周期的第1天和第8天施用萨希珠单抗戈维替康，重复周期直至剂量限制性毒性或进展。剂量递增遵循标准3+3方案，允许4种计划剂量水平并剂量延迟或降低。25名患者(52-60岁，先前化疗方案中位数为3)用8mg/kg(N＝7)、10mg/kg(N＝6)、12mg/kg(N＝9)和18mg/kg(N＝3)的剂量水平治疗。中性粒细胞减少症是剂量限制性的，第1个周期最大耐受剂量为12mg/kg，但重复周期毒性太大。较低剂量为延伸治疗所接受，其中没有治疗相关的4级毒性，并且3级毒性限于疲劳(N＝3)、中性粒细胞减少症(N＝2)、腹泻(N＝1)和白细胞减少症(N＝1)。使用基于CT的RECIST 1.1标准，3名患者实现部分响应(三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、结肠癌)，另外15名患者具有作为最佳响应的疾病稳定；其中持续治疗16至36周，12名患者维持疾病控制。没有基于肿瘤Trop-2表达对患者进行预选择。
结论是，萨希珠单抗戈维替康是一种有前景的ADC缀合物，其具有可接受的毒性并且对患有难治的癌症的患者具有令人鼓舞的治疗活性。选择8mg/kg和10mg/kg剂量用于II期研究。
介绍
已经批准了两种并入不同超毒性(皮摩尔效力)药物的新抗体-药物缀合物(ADC)，导致基于类似原理的其他ADC的进一步发展，包括使用超毒性药物(Younes等人，2011，NatRev Drug Discov 11:19-20；Sievers和Senter，2013，Ann Rev Med 64:15-29；Krop和Winer，2014，Clin Cancer Res 20:15-20)。或者，Moon等人，(2008,J Med Chem51:6916-26)和Govindan等人，(2009,Clin Cancer Res 15:6052-61)选择了SN-38，SN-38是作为伊立替康的活性代谢物的一种拓扑异构酶I抑制剂，伊立替康是一种众所周知但药理学复杂的批准药物(Mathijssen等人，2001,Clin CancerRes 7:2182-94)。评价了用于缀合SN-38的几种接头以不同的速率经几小时到几天从IgG释放(Moon等人，2008,J Med Chem 51:6916-26；Govindan等人，2009,Clin Cancer Res 15:6052-61；Cardillo等人，2011,ClinCancer Res 17:3157-69)。所选择的命名为CL2A的在血清中表现出中间缀合物稳定性的最佳接头与SN-38内酯环上的羟基基团连接，从而保护该环在与接头结合并且含有短聚乙二醇部分以增强溶解性时免于暴露于毒性较低的羧酸酯形式(Cardillo等人，2011,ClinCancer Res 17:3157-69)。当接头和SN-38之间的碳酸酯键裂解时，释放SN-38的活性形式，这在诸如在溶酶体中见到的低pH下以及肿瘤微环境中或可能通过酶降解发生。
选择用于该ADC的抗体靶向肿瘤相关抗原Trop-2(滋养层细胞表面抗原)(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)，其使用显示先前内化的人源化RS7单克隆抗体(Stein等人，1993,Int J Cancer55:938-46。Trop-2是ADC的重要肿瘤靶标，因为它在特别是更具侵袭性的类型的许多上皮肿瘤上过表达(Ambrogi等人，2014,PLoSOne9:e96993；Cubas等人，2009,Biochim Biophys Act 1796:309-14；Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33)。Trop-2也存在于许多正常组织上，但表达该抗原的猴子的临床前研究仅观察到这种新ADC的剂量限制性中性粒细胞减少症和腹泻，没有证据表明对表达Trop-2的正常组织具有明显的毒性(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res17:3157-69)。因此，临床前数据表明在几种人肿瘤异种移植模型中的活性并显示高治疗窗(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res17:3157-69)，开始I期临床试验以确定这种新型ADC在具有多种复发/难治性转移性上皮肿瘤的重度预治疗患者中的最大耐受性和最佳剂量。该试验在ClinicalTrials.gov(NCT01631552)上注册。
材料和方法
入选标准-主要目标是确定萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132)作为单一药剂的安全性和耐受性。该试验设计为标准的3+3 I期设计，从每次注射8mg/kg的剂量开始，在3周的治疗周期中每周给药一次持续2周。
如果被诊断为十三种不同类型的上皮肿瘤之一，那么≥18岁的男性和非怀孕非哺乳期女性都是合格的。尽管不需要基于Trop-2表达进行预选择，但基于对存档样本的免疫组织学研究，预期这些肿瘤在>75％的病例中具有Trop-2表达。要求患者具有可测量的转移性疾病(没有≥5cm的单个病变)并且已经复发或者对于该适应症的至少一种批准的标准化疗方案是难治的。其他关键标准包括足够的(≤1级)血液学、肝和肾功能，以及没有已知的伊立替康过敏反应史，或对先前伊立替康或其他拓扑异构酶-I治疗的≥3级胃肠道毒性。由于允许患有这种多种疾病的患者，所以先前的伊立替康治疗不是先决条件。患有吉尔伯特病的患者或不耐受先前施用的伊立替康或患有已知CNS转移性疾病的患者被排除在外。
研究设计-基线评价在治疗开始后4周内执行，定期监测血细胞计数、血清化学、生命体征和任何不良事件。通过ELISA测量抗-抗体和抗-SN-38抗体响应，在基线处采集样品，然后在每个偶数治疗周期开始之前采集样品。第一次CT检查从治疗开始后6至8周获得，然后以8至12周的间隔继续进行直至进展。需要另外的随访才能监测任何正在进行的与治疗相关的毒性。使用NCI CTCAE 4.0版对毒性进行分级，并通过RECIST 1.1评估功效。
开发了用以检测血清中Trop-2的ELISA，其具有2ng/mL的敏感性，但是在测试12名患者并且没有发现循环Trop-2的证据之后，没有执行进一步的筛选。尽管不是资格标准，但是由于ADC的抗体hRS7识别的表位并未保存在***固定的石蜡包埋切片中(Stein等人，1993,Int J Cancer 55:938-46)，因此需要先前存档的肿瘤样本以通过免疫组织学使用山羊多克隆抗体抗人Trop-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)进行Trop-2测定。如下所述执行染色。
治疗方案-冻干的萨希珠单抗戈维替康在盐水中复原并输注2至3小时(100mg抗体含有约1.6mg的SN-38，平均药物:抗体比[DAR]为7.6:1)。在开始每次输注之前，大多数患者接受对乙酰氨基酚、抗组胺药(H1和H2阻断剂)和***。禁止预防性使用止吐药或止泻药。治疗由在3周治疗周期的第1天和第8天给予2次连续剂量组成，这旨在允许患者继续治疗长达8个周期(即，16次治疗)，除非存在不可接受的毒性或进展。在8个周期后显示疾病稳定或响应的患者可以继续治疗。
剂量限制性毒性(DLT)被认为是任何持续时间的≥3级发热性中性粒细胞减少症；3级血小板减少伴有明显出血或4级血小板减少≥5天；尽管有最佳医疗管理但仍持续>48小时的任何的3级恶心、呕吐或腹泻；或任何持续时间的4级(威胁生命)恶心、呕吐或腹泻；或至少可能由研究药物引起的任何其他的≥3级非血液学毒性；以及任何3级输注相关反应的发生。
根据患者对第一个治疗周期的耐受性判断最大耐受剂量(MTD)。在预定的治疗日，除秃发外，≥2级治疗相关毒性的任何患者的治疗以每周增量延迟，持续最多2周。一旦毒性消除至≤1级，则重新开始治疗。该方案最初还要求降低所有后续治疗剂量(如果在1周内恢复，则降至25％，如果在2周内恢复，则降至50％)，但在试验后期，当修改方案以允许在第一个周期后进行支持治疗时，这一点被放宽。然而，如果毒性在3周内没有恢复或恶化，则治疗终止。重要的是，降低的剂量延迟不构成DLT，因此这允许治疗继续，但剂量较低。因此，能够继续治疗的需要剂量延迟/降低的患者不视为可评估DLT，然后替代。
由于DLT事件导致所有进一步治疗的终止，因此次要目标是评估在多个治疗周期内可以在最低程度的剂量延迟或降低下耐受的剂量水平。该剂量水平被指定为最大可接受剂量，并且要求患者在第一个周期中耐受给定剂量水平而在该周期期间没有延迟或降低并且导致第二个周期的开始。
药代动力学和免疫原性-在输注结束之后(例如，峰)约30分钟内，且在每次后续注射之前(例如，谷)采集血液样品。分离样品并通过ELISA冷冻血清以确定总IgG和萨希珠单抗戈维替康浓度。还测定来自7名患者的血清样品的SN-38含量，总SN-38(代表与IgG结合的SN-38和游离SN-38)和游离SN-38(即，未结合的SN-38)。
结果
患者特征-招募了25名患者(表6)。中位数年龄范围为52至60岁，其中76％具有ECOG1体能状态，其余ECOG为0。大多数患者患有转移性胰腺癌(PDC)(N＝7)，其次是三阴性乳腺癌(TNBC)(N＝4)、结直肠癌(CRC)(N＝3)、小细胞肺癌(SCLC)(N＝2)、胃癌(GC)(N＝2)以及单例食管腺癌(EAC)、激素难治性***癌(HRPC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌(EOC)、肾癌、扁桃体癌和膀胱癌(UBC)。
对来自17名患者的存档组织执行免疫组织学分析，其中13名(76.4％)在样本中>10％的肿瘤细胞上具有2+至3+膜和细胞质染色；3个样本(17.6％)为阴性。以下公开了几个代表性案例。
在原发性癌症典型部位具有转移性疾病的所有患者都进入试验。CT确定所有患者的最大肿瘤直径的中位数总和为9.7cm(范围为2.9cm至29.8cm)，14名患者在他们的基线研究中鉴定出3处或更多处靶病变(所有患者中位数＝4，范围为1至10处病变)和中位数为2的非靶病变(范围为0至7处病变)。先前全身治疗的中位数为3，其中7名患者(PDC和GC为2名，CRC、TNBC、扁桃体各自为1名)接受过一种先前治疗，7名患者接受过5种或更多种先前治疗；11名患者接受过放射治疗。对9名患者给予先前的拓扑异构酶I治疗，其中2/3CRC，4/7PDC，1名EAC患接受伊立替康，并且2/2名SCLC患者接受拓扑替康，其中3名患者(2名患有SCLC并且1名患有CRC)未对抗拓扑异构酶1疗法作出响应。另外，23名患者中有7名(2名未确定)对其最后一次治疗有响应，中位持续时间为3个月(范围为1至11个月)。
几乎所有患者都接受了多次萨希珠单抗戈维替康治疗(中位数，10剂)，直到通过CT使用RECIST 1.1有确定的疾病进展的证据；一名患者因全身恶化而退出，并且1名患者在第一次随访中在观察新病变时没有测量的靶病变。
剂量评估-以8.0mg/kg的起始剂量水平入选的3名患者(1名CRC，2名PDC)中没有剂量延迟或降低，也没有DLT事件。在12mg/kg的下一个剂量水平时，因为在施用第二剂量时遇到方案所需的延迟，招募了9名患者。5名患者在第一个周期中经历延迟(4名患者延迟1周，其中2名患者给予骨髓生长因子支持，并且1名患者在给予第二剂量前延迟2周)。除了1名患者外，所有患者均接受12mg/kg作为其第二剂量。在12mg/kg剂量水平的9名患者中，4名患者具有第3剂量，他们开始第二个周期，减至9mg/kg，并且在3名患者中第二个周期再延迟1周。尽管这些方案需要延迟/降低，但在第一个周期期间9名患者中没有一个具有剂量限制性事件(例如，1名患者在第一剂量后具有与疾病相关的3级血红蛋白，对在第一剂量后具有3级中性粒细胞减少症的2名患者给予髓样生长因子，1名患者在无支持恢复的第一剂量后具有3级中性粒细胞减少症，2名患者在第二剂量后具有3级中性粒细胞减少症，2名患者在第一剂量或第二剂量后具有2级中性粒细胞减少症，并且1名患者没有不良事件)，因此允许增加到18mg/kg剂量水平。在这里，所有三名患者在第一次治疗后都有剂量延迟，只有1名患者接受第二次治疗，剂量为18mg/kg。两名患者具有剂量限制的4级中性粒细胞减少症，1名患者是在第一剂量后，另一名患者是在第二18mg/kg剂量后，后一患者在该剂量后也经历2级腹泻。因此，0/9患者在以12mg/kg的第一个周期中具有DLT，该水平被宣布为MTD。
另外的剂量发现研究继续改进剂量水平，这将允许在治疗/周期之间的最小延迟的情况下给予多个周期。因此，以8mg/kg剂量水平招募另外4名患者，并且打开10mg/kg的新中间水平。在以8mg/kg入选的最初3名患者之中，两名CRC患者继续以8mg/kg进行治疗，共治疗31次和11次，而PDC患者在因第四剂量的2级中性粒细胞减少症而将剂量降低至6mg/kg之前接受3次8mg/kg的剂量，然后在该水平下完成3次以上的治疗，随后由于疾病进展而退出。另外4名患者接受3至9剂的8mg/kg，随后因疾病进展而退出。这些患者中有两名仅接受1次剂量，随后由于2级皮疹和2级中性粒细胞减少症而方案需要降低至6mg/kg。
以10mg/kg入选的6名患者中的5名接受6至30次剂量而没有降低，随后由于疾病进展而退出。一名GC患者(#9)在接受1次剂量后发展为3级发热性中性粒细胞减少症和4级血红蛋白。虽然发热性中性粒细胞减少症被认为可能与治疗有关，但由于它在第一剂量后不久发生，因此发现胃内壁穿孔可能促进4级血红蛋白，并被认为是无关的。最终，患者迅速恶化并在第一剂量后4周死亡。
因此，尽管总体结果支持12mg/kg作为MTD，但由于8mg/kg至10mg/kg在第一个周期中耐受性更好并允许在最小毒性下重复周期，因此正在进行II期临床研究以评价这2个剂量水平。
不良事件-在2至3小时内给予297次萨希珠单抗戈维替康输注，大多数研究者在每次输注前选择预先给药。没有输注相关的不良事件。虽然超过一半的患者经历疲劳、恶心、脱发、腹泻和中性粒细胞减少症，这些被认为是至少可能与萨希珠单抗戈维替康治疗有关；这些主要是1级和2级(未显示)。报告最多的3级或4级毒性是中性粒细胞减少症(N＝8)，但这些患者中的6名最初以12mg/kg和18mg/kg进行治疗。发热性中性粒细胞减少症发生在2名患者中，一名是GC患者#9，已经提到其仅接受一次10mg/kg剂量，并且另一名是PDC患者(#19)，其接受了4次12mg/kg剂量。大多数患者腹泻是轻微的，只有3例(12％)经历3级腹泻。两例发生在12mg/kg剂量水平下，1例发生在接受4次剂量后，并且另一次发生在第一次剂量后，但该患者再接受6次以上12mg/kg剂量，仅报告2级腹泻。随后，两名患者都开了非处方止泻药，并继续治疗。没有其他与萨希珠单抗戈维替康相关的显著毒性，但有两名患者报告有2级皮疹，并且3名患者有1级瘙痒症。
功效-通过靶病变的变化和来自具有靶病变的至少一次治疗后CT测量的患者的时间-进展数据来测量最佳响应(未显示)。图表中未显示4名具有疾病进展的患者，因为他们没有进行随访CT评估(N＝1)或者他们有新的病变，因此无论其靶病变状态如何都会进展(N＝3)。总体而言，3名患者的靶病变降低多于30％(部分响应，PR)。这些患者中两名(#3和#15)有确认的随访CT，而第三名患者(#22)在12周后的下一次CT检查中进展。15名患者疾病稳定(SD)，7名患者疾病进展(PD)作为RECIST 1.1的最佳响应。24名患者(排除1名仅接受1次治疗并退出的患者)从开始治疗到进展的中位时间为3.6个月[范围为1至12.8个月]；所有具有SD或PR的患者(N＝18)从开始治疗到进展的中位时间为4.1个月(范围为2.6至12.8个月)。在接受含有拓扑异构酶-I抑制剂的先前治疗的9名患者中，2名患者的靶病变显著减少(28％和38％)，5名患者疾病稳定，其中2名处于持续期(分别为4.1个月和6.9个月)，而2名患者在他们的第一次评估时有进展。
这些患者的TTP与存活率的比较指示，16名患者在治疗开始后存活15至20个月，其中两名患者具有PR(15名患者(TNBC)和3名患者(CRC)，另外4名患者具有SD(2名CRC、1名HRPC、1名TNBC)(未显示)。放射学响应包括2名患者的靶病变减少大于30％(PR)(未显示)。
除了3名患者具有作为最佳响应的PR外，还有几个明显的病例具有延长的稳定疾病。一名50岁的TNBC患者(患者18；免疫组织学Trop-2表达＝3+)在仅3次剂量后经历13％的减少，在16次剂量后在4处靶病变中累积19％的减少(SLD从7.5厘米减小到6.1厘米)，随后在开始治疗并且接受26次剂量后进展45周。一名63岁的CRC女性(患者10；免疫组织学2+)，其进行了7次先前治疗，包括3次含伊立替康方案的单独疗程，在接受5次10mg/kg剂量的萨希珠单抗戈维替康后，5处靶病变总体减少23％，在18次剂后累积最多28％的减少。她的血浆CEA从38.5ng/mL的基线水平降至1.6ng/mL。在接受25次剂量(27周)后，她具有PD，与SLD最低点相比增加了20％。有趣的是，治疗结束时的血浆CEA仅为4.5ng/mL。一名68岁的HRPC患者(患者20；无免疫组织学)出现5处靶病变(13.3cm)和5处非靶病变(3处骨转移)。他在12.7个月的时间段内接受了34次治疗直至进展，PSA水平在此期间逐渐增加。另一个值得注意的病例是一名患有食道癌的52岁男性(患者25；免疫组织学3+)，他们接受过6次先前治疗，其中包括6个月的FOLFIRI作为他的第3疗程。以18mg/kg的萨希珠单抗戈维替康开始治疗，由于中性粒细胞减少症而降至13.5mg/kg。他在接受15次剂量的30周内具有SD，随后进展。患有肝脏转移的60岁PDC女性(#11)以10mg/kg进行治疗。在8次剂量后，她的基线CA19-9血清滴度从5880单位/mL降至2840单位/毫升，并且在发现新病变之前一段时间或15周(11次剂量)疾病稳定(12％收缩作为最佳响应)。然而，由于CA19-9仍然降低(2814单位/mL)，所述患者接受以10mg/kg的另外8次治疗(3个月)，随后因其靶病变进展而脱离研究。
此时，测试来自16名患有不同癌症的患者的小样品的存档样品中Trop-2表达的潜在效用不足以进行确定性评估，主要是因为大多数表现出升高的表达。
PK和免疫原性-表7中提供30分钟血清样品中萨希珠单抗戈维替康和IgG的浓度，其显示值随着剂量增加而增加的一般趋势。在代表性病例中，TNBC患者(#15)接受多次剂量，从12mg/kg开始，随后在疗程中降低。根据ELISA在30分钟血清中经过多次剂量IgG和萨希珠单抗戈维替康的浓度随时间而相似(未显示)，当剂量降低时调低。虽然在下一次剂量之前立即抽取的血清中可以发现残留的IgG(谷样品)，但是没有检测到萨希珠单抗戈维替康(未显示)。
在第1个周期第一剂量(C1D1)后，患者15的30分钟血清样品中的总SN-38浓度为3,930ng/mL，但当萨希珠单抗戈维替康治疗对于第一个周期的第二剂量(C1D2)降低至9.0mg/kg时，水平减至2,947ng/mL(未显示)。当剂量进一步降低至6.0mg/kg时，在第6个周期中观察到进一步降低至2,381ng/mL。这些样品中游离SN-38的量范围为88ng/mL至102ng/mL(总SN-38的2.4％至3.6％)，指示这些峰样品中血清中的>96％的SN-38结合到IgG。通过HPLC分析来自7名患者的28个30分钟血清样品，游离SN-38平均为这些样品中总SN-38的2.91±0.91％。在4名患者中测量的游离SN-38G浓度从未超过SN-38水平，并且通常低几倍。例如，患者#25经过8个治疗周期的12次注射具有在30分钟样品中评估的测定。在18mg/kg的起始剂量下，他在酸水解样品中具有5,089ng/mL的SN-38(总SN-38)，在非水解样品中仅具有155.2ng/mL(游离SN-38；3.0％)。该样品中的游离SN-38G(葡糖醛酸化形式)为26.2ng/mL，或仅为样品中未结合的SN-38+SN-38G总量的14.4％。患者继续以13.5mg/kg进行治疗，其中SN-38在剩余的11个酸性水解样品中平均为3309.8±601.8ng/mL，而游离SN-38平均为105.4±47.7ng/mL(即，96.8％结合到IgG)，并且游离SN-38G平均为13.9±4.1ng/mL(占SN-38+SN-38G总量的11.6％)。重要的是，在几乎所有患者中，酸水解样品和非水解样品中SN-38G的浓度相似，指示与缀合物结合的SN-38均未被葡糖醛酸化。
表7.根据ELISA，完整的萨希珠单抗戈维替康(ADC)和hRS7
IgG的血清浓度(μg/mL)。在第一次剂量后0.5小时取样的样品中执行测定。
这些患者在其治疗过程中均未具有阳性基线水平(即，>50ng/mL)或对IgG或SN-38的阳性抗体响应。
讨论
Trop-2在许多上皮肿瘤中大量表达，使其成为靶向治疗的所关注的抗原(Cubas等人，2009,Biochim Biophys Acta 1796:309-14)，特别是因为它被认为是几种癌症类型的预后标志物和致癌基因(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69；Ambrogi等人，2014,PLoS One 9:e96993；Cubas等人，2009,BiochimBiophys Acta 1796:309-14；Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33)。尽管其在正常组织中的表达以及与另一种充分研究的肿瘤相关抗原EpCam的关系，但对于对Trop-2开发免疫治疗剂的安全性提出了一些初步的警告(Trerotola等人，2009,Biochim Biophys Acta 1805:119-20)，我们在与人相似的组织中表达Trop-2的食蟹猴的研究指示，在约40mg/kg的人当量剂量下，萨希珠单抗戈维替康的耐受性非常好(Cardillo等人，2011,Clin CancerRes 17:3157-69)。在较高剂量下，动物经历中性粒细胞减少症和腹泻，这是已知与源自伊立替康治疗的SN-38相关的副作用，但缺乏表达Trop-2的正常组织中的显著组织病理学变化的证据(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。因此，在其他临床前研究中发现，萨希珠单抗戈维替康在低纳摩尔浓度下有效并且在无毒剂量下在各种人上皮肿瘤异种移植物中有效，对于用一种或多种标准疗法未能治疗其多种转移性上皮肿瘤的患者进行I期试验。
该研究的一项主要研究结果是，尽管使用一种未被视为超毒性的更常规药物(活性在皮摩尔范围的药物，而SN-38具有低纳摩尔范围内的效力)，但是萨希珠单抗戈维替康抗-Trop-2-SN-38缀合物在临床上证明在多种实体癌中在具有中等且可控的毒性的剂量下具有治疗活性，因此表现出高治疗指数。对没有发生事故的25名患者共给予297剂萨希珠单抗戈维替康；4名患者接受了>25次注射。重要的是，即使在长达12个月的多个治疗周期的患者中，也未检测到对hRS7IgG或SN-38的抗体响应。尽管Trop-2在各种正常组织中以低量表达(Cardillo等人，2011,Clin CancerRes 17:3157-69)，但中性粒细胞减少症是唯一的剂量限制性毒性，其中在给予≥12mg/kg萨希珠单抗戈维替康的2名患者中使用髓样生长因子支持加快康复并允许对已经用尽其他治疗方法选择的患者继续治疗。虽然宣布MTD为12mg/kg，但选择8.0mg/kg和10.0mg/kg剂量水平进行进一步扩展，因为患者在最低程度的支持护理下更可能在这些水平上耐受另外的周期，并且在这些水平上观察到响应。13名患者中只有2名(15.4％)在这些剂量水平下经历3级中性粒细胞减少症。对前线或二线设置中每周一次或每三周一次给予的伊立替康单药治疗的3级和4级中性粒细胞减少症发生率为14％至26％(Camptosar-伊立替康盐酸盐注射液(处方信息，包装说明书)Pfizer，2012)。使用萨希珠单抗戈维替康时，只有1名以10mg/kg剂量水平的患者具有3级腹泻。该发病率低于经历3级和4级晚期腹泻的每周给予4剂量伊立替康的患者的31％(Camptosar-伊立替康盐酸盐注射液(处方信息，包装说明书)Pfizer，2012)。归因于萨希珠单抗戈维替康的其他常见毒性包括疲劳、恶心和呕吐，大多数是1级和2级，以及脱发。在10mg/kg和12mg/kg剂量水平下，也发生了两例发热性中性粒细胞减少症和一例3级深静脉血栓形成。UGT1A1监测直到剂量探测完成后才开始，因此目前无法报告其对毒性的贡献的评估。
入选该试验中的患者并未对于Trop-2表达进行预先选择，这主要是因为对各种癌症(诸如***癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和肺癌)的组织微阵列的免疫组织学评估指示抗原在>90％的样本中存在(未显示)。此外，在12名患有各种转移性癌症的患者的血清中未发现Trop-2，进一步提示血清测定无法用于患者选择。虽然我们试图从入选试验的患者中收集肿瘤的档案样本，但目前没有足够的证据提示基于免疫组织学染色的患者选择将与抗肿瘤活性相关，因此没有基于Trop-2表达进行患者富集。
作为单一疗法，萨希珠单抗戈维替康在患有多种转移性、复发性/难治性上皮肿瘤的患者中具有良好的抗肿瘤活性，通过CT使用RECIST1.1标准显示靶病变明显减少，包括持续的疾病稳定。25名患者中的3名(12％)(SCLC[在用托泊替康进展后]、TNBC和结肠癌各1名)的靶病变减少>30％，然后分别从治疗开始进展2.9个月、4.3个月和7.1个月。15名患者(60％)具有SD，其中9名患者从治疗开始大于4个月后进展。在使用含拓扑异构酶I抑制剂的药物或方案的先前疗法的9名患者中，有7名发生了响应或疾病稳定。这些患者中有三名未能对其先前的拓扑异构酶I抑制剂治疗(伊立替康或托泊替康)作出响应，但萨希珠单抗戈维替康能够诱导他们中的两者的肿瘤收缩：结肠癌患者中的13％并且SCLC患者中的38％。因此，萨希珠单抗戈维替康在那些对于先前的拓扑异构酶I方案失败或复发的患者中可能具有治疗活性，这将在II期扩展研究中进一步检查。
虽然入选该试验的最大数量的患者患有晚期胰腺导管癌(N＝7；中位时间进展2.9个月)；范围为1.0至4.0个月)，即使在这种难治的疾病中，也存在靶病变和提示活性的CA19-9血清浓度的令人鼓舞减少(Picozzi等人，2014，在AACR Special Conference“Pancreatic Cancer:Innovations in Research and Treatment,New Orleans,LA USA,第B99页上提出)。然而，鉴于在这些适应症中对于靶向治疗的需要，TNBC和SCLC患者的响应特别令人感兴趣。实际上，在该试验的正在进行的扩展期观察到的患有TNBC(Goldenberg等人，2014，在AACR San Antonio Breast cancer Symposium,San Antonio,TX上提出)和SCLC(Goldenberg等人，2014，Sci Transl Med)的患者中的另外部分响应中观察到的其他部分响应提示进一步强调这些癌症，但也正在关注NSCLC、EAC、UBC和CRC中的令人鼓舞的响应。事实上，在正在进行的萨希珠单抗戈维替康试验的最近更新中，早迄今研究的17名TNBC患者中，观察到总体响应率(PR)为29％，临床受益率为46％(PR+SD≥6个月)。对于近25％(6/25)的研究的患者观察到长期存活(15至20个月)，并且包括2例PR和4例SD，包括TNBC患者(N＝2)、CRC患者(N＝3)和HRPC患者(N＝1)。
输注结束后30分钟的血清样品分析显示>96％的SN-38与IgG结合。当试验的II期部分完成时，将提供更详细的药代动力学。HPLC分析也在血清中仅检测到痕量的游离SN-38G，而用伊立替康治疗，活性较低的SN-38G的AUC比SN-38高>4.5倍(Xie等人，2002,J ClinOncol 20:3293-301)。在给予萨希珠单抗戈维替康和伊立替康的荷瘤动物中SN-38递送的比较指示与IgG结合的SN-38不是葡糖醛酸化的，而在给予伊立替康的动物中，血清中总SN-38的>50％是葡糖醛酸化的(Goldenberg等人，2014,J Clin Oncol 32:Abstract 3107)。更重要的是，给予萨希珠单抗戈维替康的Capan-1人胰腺癌异种移植物中SN-38浓度的分析比给予伊立替康的情况高约135倍(Goldenberg等人，2014,Sci Transl Med)。因此，与非靶向形式的拓扑异构酶-I抑制剂相比，萨希珠单抗戈维替康具有几个明显的优势：(i)选择性地保留肿瘤中的缀合物的机制(抗Trop-2结合)，和(ii)靶向的SN-38似乎也被完全保护(即，不是葡糖醛酸化的且以内酯形式)，因此通过缀合物的直接内化或通过其从与肿瘤结合的缀合物释放到肿瘤微环境中的肿瘤细胞共生的任何SN-38将是其最有效的形式。这些结果提示，中等毒性但全面理解的细胞毒性剂SN-38可有效作为肿瘤靶向ADC如萨希珠单抗戈维替康的一部分。但是，通过与以高药物:抗体比(7.6:1)缀合的中等毒性药物一起施用ADC，可以将更高浓度的SN-38递送至靶向的癌症，如与从伊立替康释放的SN-38相比，用萨希珠单抗戈维替康实现改善的SN-38浓度。
总之，该I期经验显示，萨希珠单抗戈维替康耐受中度且可控制的毒性，这都与SN-38的活性有关，没有证据表明已知含有Trop-2的正常组织受损。重要的是，即使在用拓扑异构酶-I抑制剂预先治疗失败后，萨希珠单抗戈维替康在患有多种转移性实体肿瘤的患者中也具有活性。因此，从最初的经验可以看出，萨希珠单抗戈维替康具有高治疗指数，即使在肿瘤未知对拓扑异构酶I抑制剂是否有响应的肿瘤如SCLC和TNBC的患者中也是如此。该临床试验正在继续，集中在患有TNBC、SCLC和其他Trop-2+癌症的患者中起始剂量为8mg/kg和10mg/kg。
实施例16.IMMU-132在三阴性乳腺癌(TNBC)中的用途
已经克隆了Trop-2/TACSTD2基因(Fornaro等人，1995,Int J Cancer 62:610-18)并且发现其编码与细胞迁移和不依赖贴壁的生长功能性关联的跨膜Ca++-信号传导物(Basu等人，1995,Int J Cancer62:472-72；Ripani等人，1998,Int J Cancer 76:671-76)，与正常组织相比，其包括在乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、***癌、***、头颈癌和卵巢癌的多种人上皮癌中具有更高的表达(Cardillo等人，2011,Clin CancerRes 17:3157-69；Stein等人，1994；Int J Cancer Suppl 8:98-102；Cubas等人，2009,BiochimBiophys Acta 196:309-14；Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33)。据报道，Trop-2的表达增加对于刺激癌症生长是必要且充分的(Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33)，而双顺反子细胞周期蛋白D1-Trop-2mRNA嵌合体是癌基因(Guerra等人，2008,CancerRes 68:8113-21)。重要的是，升高的表达与更具侵袭性的疾病和几种癌症类型的预后不良相关(Cubas等人，2009,Biochim Biophys Acta 196:309-14；Guerra等人，2008,Cancer Res 68:8113-21；Bignotti等人，2010,Eur J Cancer46:944-53；Fang等人，2009,Int J Colorectal Dis 24:875-84；Muhlmann等人，2009,J Clin Pathol 62:152-58)，这些癌症类型包括乳腺癌(Ambrogi等人，2014,PLoS One 9:e96993；Lin等人，2013,Exp MolPathol 94:73-8)。Trop-2mRNA的增加是浸润性导管乳腺癌患者的存活率低和***转移的强预测因子，并且Kaplan-Meier生存曲线显示具有高Trop-2表达的乳腺癌患者具有显著较短的存活率(Lin等人，2013,Exp Mol Pathol 94:73-8)。
方法
通过HIC测定DAR-通过疏水相互作用色谱(HIC)使用丁基-NPR HPLC柱(TosohBioscience，King of Prussia，PA)分析临床批次的IMMU-132。IMMU-132注射(100μg)用15分钟线性梯度的2.25-1.5M在25mM磷酸钠中的NaCl(pH 7.4)以1mL/min和室温进行解析。
通过LC-MS测定DAR-因为链间二硫化物被还原并且所得巯基基团用于药物缀合(或阻断)，重链和轻链在LC-MS分析期间在不添加还原剂的情况下解析，并且被独立地分析。在Agilent 1200系列HPLC上使用Aeris Widepore C4反相HPLC柱(3.6μM，50×2.1mm)注射不同批次的IMMU-132，并通过反相HPLC解析，其中14分钟线性梯度为在0.1％甲酸中的30％至80％的乙腈。用具有分别设定为5000V、300V和80V的Vcap、裂解电压(fragmentor)和离子挑选器的在线Agilent 6210ESI-TOF质谱仪完成电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)质谱。代表所有κ或重链物质的整个RP-HPLC峰用于产生解卷积质谱。
细胞系-除非另有说明，否则本研究中使用的所有人癌细胞系均购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，并且所有细胞系均通过ATCC的短串联重复(STR)测定进行鉴定。
在各种人乳腺癌细胞系上的Trop-2表面表达-Trop-2在细胞表面上的表达基于流式细胞术。简言之，用Accutase细胞分离溶液(Becton Dickinson(BD)；Franklin Lakes，NJ；目录号561527)收获细胞并使用QuantiBRITE PE珠粒(BD目录号340495)和PE缀合的抗Trop-2抗体(eBiosciences，目录号12-6024)遵循制造商的说明测定Trop-2表达。在FACSCalibur流式细胞仪(BD)上使用CellQuestPro软件获取数据，使用Flowjo软件(TreeStar；Ashland OR)进行分析。
体外细胞毒性测试-使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓染料还原测定(MTS染料还原测定；Promega,Madison,WI)来测定对SN-38的敏感性。简言之，如上所述将细胞铺板到96孔透明平底板中。将溶解在DMSO中的SN-38用培养基稀释至最终浓度为0.004nM至250nM。将板在潮湿腔室中在37℃/5％CO2下孵育96小时，然后添加MTS染料并放置回孵育箱中直至未处理的对照细胞具有大于1.0的吸光度。生长抑制测量为相对于未处理细胞的生长百分比。从一式三份测定的平均值产生剂量-反应曲线，并使用Prism GraphPad软件计算IC50值。
通过流式细胞术用rH2AX染色的细胞进行体外特异性测试-对于药物活性测试，将HCC1806和HCC1395TNBC细胞系细胞在6孔板中以5×105个细胞/孔接种并在37℃下保持过夜。在冰上冷却细胞10分钟后，将细胞用约20μg/ml的IMMU-132或hA20抗CD20-SN38(两种试剂具有相等的SN38/孔)在冰上孵育30分钟，用新鲜培养基洗涤三次，然后回到37℃过夜。将细胞短暂胰蛋白酶化，通过离心制粒，在4％***中固定15分钟，然后洗涤并在PBS中的0.15％Triton-X100中渗透另外15分钟。在用1％牛血清白蛋白-PBS洗涤两次后，将细胞用小鼠抗-rH2AX-AF488(EMD Millipore Corporation,Temecula,CA)在4℃下孵育45分钟。通过流式细胞术使用BD FACSCalibur(BD Biosciences,San Jose,CA)测量rH2AX的信号强度。
肿瘤微阵列和患者样本中Trop-2的IHC-这涉及组织和微阵列切片上的标准IHC方法。评分基于样本内>10％的肿瘤细胞中的染色强度，包括阴性、1+(弱)、2+(中度)和3+(强)。
异种移植模型中的体内治疗研究-对20克小鼠给予250μg ADC产生的SN-38等效物(12.5mg/kg)等于0.2mg SN-38/kg。对于伊立替康(伊立替康-HCl注射剂；AREVAPharmaceuticals,Inc.,Elizabethtown,KY)，10mg伊立替康/kg基于质量转化为5.8mg SN-38/kg。
免疫印迹-将细胞(2×106)铺板在6孔板中过夜。第二天，将他们用SN-38或IMMU-132以0.4μg/mL(1μM)的SN-38浓度当量治疗24小时和48小时。亲本hRS7用作ADC的对照。
在具有人肿瘤异种移植物的小鼠中定量SN-38-对两组施用伊立替康或IMMU-132，每组具有15只带有人胰腺癌细胞系的皮下植入物的动物。以5种不同的时间间隔，对每组3只动物实施安乐死。取出Capan-1肿瘤(0.131±0.054g；N＝30)并在去离子水(DI)(1份组织+10份DI水)中均化；用等份的DI水稀释血清。提取血清和组织匀浆并通过反相HPLC(RP-HPLC)分析。虽然提取的样品足以检测来自伊立替康治疗的动物的产物，但是将来自给予IMMU-132的动物的样品分成2份，其中一份进行酸水解步骤以释放与IgG结合的所有SN-38，否则，在提取的样品中将无法检测到。
统计学-使用用于Windows的GraphPad Prism版本5.00，GraphPad Software，LaJolla California USA执行统计分析。每项研究都鉴定了所执行的具体测试。
结果
SN-18结构和特性-IMMU-132利用拓扑异构酶I抑制剂SN-38，抗癌喜树碱的水溶性代谢物，伊立替康(7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]羰氧基喜树碱，其在结肠直肠癌、肺癌、***和卵巢癌中具有治疗活性(Garcia-Carbonero等人，2002,Clin CancerRes8:641061)。选择SN-38的一个重要优势是药物的体内药理学是众所周知的。伊立替康必须被酯酶裂解以形成SN-38，其比伊立替康的效力强2-3个数量级，活性在低纳摩尔范围内(Kawato等人，1991,Cancer Res 51:4187-91)。在生理pH下，喜树碱以包含更具活性的内酯形式和活性较低(10％效力)的开放羧酸形式的平衡存在(Burke和Mi，1994,J Med Chem37:40-46)。
IMMU-132中使用的SN-38衍生物CL2A-SN-38的设计解决了以ADC格式使用该药物的多重挑战，并涉及以下特征：(i)将短聚乙二醇(PEG)部分置于交联剂中以赋予该高度不溶性药物水溶性；(ii)将马来酰亚胺基团并入用于与轻度还原的抗体的快速硫醇-马来酰亚胺缀合，采用特别设计的合成程序能够在组装碳酸酯键的情况下高收率地并入马来酰亚胺；(iii)苄基碳酸酯位点提供pH介导的裂解位点以从接头释放药物；和(iv)重要的是，交联剂连接到SN-38的20-羟基位置，这使得药物的内酯环在生理条件下不会开环成为活性较低的羧酸形式(Giovanella等人，2000,Ann NY Acad Sci 922:27-35)。上文已经描述了SN-38衍生物的合成和CL2A-SN-38与轻度还原的hRS7IgG的缀合。有限的还原程序仅破坏重链-重链和重链-轻链之间的链间二硫桥，而不破坏结构域内的二硫键，每个抗体分子产生8个位点特异性硫醇。然后将其与CL2A-SN-38缀合，通过渗滤纯化，并冻干以便储存。在制造期间，调节条件以使来自IMMU-132的SN-38的任何损失最小化，最终冻干产品在复原时始终具有<1％的游离SN-38。然而，当置于血清中并保持在37℃下时，SN-38从缀合物中释放，半衰期为约1天(未显示)。
SN-38的释放似乎是IMMU-132的一项重要特征，该类型的接头基于功效研究选择，该功效研究测试SN-38与自10小时释放半衰期至高度稳定具有不同SN-38释放速率的各种接头缀合(Moon等，2008(30,31)。发现在约2天的血清中具有中间释放速率的缀合物的最佳治疗活性。我们随后通过去除苯丙氨酸残基改善了该类型接头(命名为CL2A)的制造方法(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res17:3157-64，然后再次将功效与另一种稳定连接的抗Trop-2缀合物(CL2)的功效相比较，该稳定连接的抗Trop-2缀合物(CL2)设计成仅在溶酶体条件下(即，在组织蛋白酶B和pH 5.0的存在下)释放SN-38。在动物模型中，用CL2A接头制备的抗Trop-2缀合物比SN-38稳定连接时产生更好的治疗响应，指示即使快速内化的抗体在允许SN-38在血清中以约1天的半衰期释放时也受益(Govidan等人，2013,Mol CancerTher 12:968-78)。由于放射性标记抗体的临床研究发现抗体在几小时内定位在肿瘤中，在1天内达到峰值浓度(Sharkey等人，1995，Cancer Res 55：5935s-45s)，选择性增强的SN-38浓度通过完整缀合物的内化、游离药物的细胞外释放或两种机制共同作用而在肿瘤中局部递送。
药物-抗体比(DAR)测定。通过疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)评价五个临床批次的IMMU-132，其解析了代表DAR为6、7和8的物种的三个峰，最大分数包含DAR＝8(未显示)。IMMU-132通过该制造方法一致地产生，在这五个临床批次中的总DAR(DARAVE)为7.60±0.03(未显示)。HIC-HPLC结果通过液相色谱-质谱(LC-MS)(未显示)确认。分析显示8种可用的巯基基团中>99％与有或没有SN-38的CL2A接头偶联。没有检测到未取代的(或N-乙基马来酰亚胺加帽的)重链或轻链。因此，物种之间DAR的差异由制造期间SN-38从接头释放产生，而不是由较低的初始取代比产生。一旦制备并冻干，IMMU-132则稳定数年。
DAR对小鼠的药代动力学和抗肿瘤功效的作用。带有Trop-2+人胃癌异种移植物(NCI-N87)的小鼠间隔7天进行2次治疗，每次治疗用相等蛋白质(0.5mg)剂量的IMMU-132，其DAR为6.89、3.28或1.64(未显示)。与给予DAR为3.38或1.64的ADC的小鼠相比，用DAR为6.89的ADC治疗的动物具有显著改善的中值存活时间(MST)(分别地，MST＝39天对比25天和21天；P<0.0014)。在用3.28或1.64DAR缀合物治疗的组和盐水对照组之间没有差异。
为了进一步阐明更高DAR的重要性，对带有NCI-N87胃肿瘤的小鼠每周施用两次0.5mg的DAR为6.89的IMMU-132，持续两周(未显示)。另一组接受两次蛋白质(1mg)剂量的DAR为3.28的IMMU-132缀合物。虽然在每个给药方案中两组都接受相同总量的SN-38(36μg)，但用6.89DAR缀合物治疗的组比用3.28DAR缀合物治疗的荷瘤动物显著更大程度地抑制肿瘤生长(P＝0.0227；AUC)。另外，用较低DAR的治疗与未治疗的对照没有显著差异。总体来讲，这些研究指示较低的DAR会降低功效。
在非荷瘤小鼠中执行以这些不同比率制备的缀合物的药代动力学行为的检查，这些小鼠被给予了0.2mg的每种缀合物、未缀合的hRS7 IgG或被还原然后用N-乙基马来酰亚胺加帽的hRS7IgG。从0.5小时至168小时以5个时间间隔取得血清，并通过ELISA测定hRS7IgG。与未缀合的IgG相比，这些缀合物的清除率没有显著差异(未显示)。因此，取代水平不影响缀合物的药代动力学，同样重要的是，链间二硫键的减少似乎不会使抗体不稳定。
Trop-2在TNBC中的表达和SN-38敏感性。在人肿瘤样本的几个组织微阵列中通过免疫组织化学(IHC)确定Trop-2表达。在一个含有31个TNBC样本以及15个激素受体或HER-2阳性乳腺癌的微阵列中，超过95％的肿瘤发生阳性染色，65％的病例指示3+染色。
表8列出了6种人乳腺癌细胞系，包括4种TNBC，显示他们的
Trop-2表面表达和对SN-38的敏感性。6种细胞系中的5种中的Trop-2表面表达超过每种细胞90,000个拷贝。在6种细胞系中的5种中，SN-38效力范围为2nM至6nM，MCF-7具有33nM的最低敏感性。没有提供IMMU-132的体外效力，因为几乎所有与IMMU-132相关的SN-38都在4天的孵育期内被释放到培养基中，因此其效力将与SN-38的效力相似。因此，需要一种不同的策略来说明抗体靶向作为递送SN-38的机制的重要性。
抗原阳性(HCC1806)或阴性(HCC1395)TNBC细胞系，其在4℃下与IMMU-132或非结合抗CD20SN-38缀合物一起孵育30分钟。然后洗涤细胞以除去未结合的缀合物，然后在37℃下孵育过夜。将细胞固定并渗透，然后用荧光抗-磷酸化组蛋白H2A.X抗体染色以通过流式细胞术检测dsDNA断裂(Bonner等人，2008,Nat Rev Cancer8:957-67)(表9)。当与IMMU-132一起孵育时，Trop-2+乳腺癌细胞系HCC1806的中值荧光强度(MFI)从168(未处理的基线)增加到546，指示dsDNA断裂的存在增加，而与非结合缀合物一起孵育的细胞的MFI保持在基线水平。相反，在用IMMU-132或非结合对照缀合物处理后，Trop-2抗原阴性细胞系HCC1395的MFI保持在基线水平。因此，通过仅在与抗Trop-2结合缀合物一起孵育的表达Trop-2的细胞中dsDNA断裂的证据最终揭示IMMU-132相对于无关ADC的特异性。
萨希珠单抗戈维替康在TNBC异种移植物中的体内功效。在带有MDA-MB-468TNBC肿瘤的裸鼠中评估IMMU-132的功效(未显示)。与盐水、伊立替康(10mg/kg；约5.8mg/kg SN-38当量重量)或以相同的2种剂量水平给予的对照抗CD20 ADC，hA20-CL2A-SN-38相比，剂量为0.12或0.20mg/kg SN-38当量(0.15mg和0.25mg IMMU-132/剂量)的IMMU-132诱导显著的肿瘤消退(P<0.0017，曲线下面积，AUC)。由于小鼠比人更有效地将伊立替康转化为SN-38(38)(在我们的研究中，平均为约25％，见下文)，在此伊立替康剂量下将产生约145μg至174μg的SN-38，而IMMU-132的施用剂量仅含9.6μg的SN-38。然而，因为IMMU-132选择性地将SN-38靶向肿瘤，所以它更有效。这些结果证实在其他实体肿瘤模型中的研究结果(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)，显示用IMMU-132将少量SN-38特异性靶向肿瘤比用更大剂量的伊立替康或就此而言hRS7IgG与等量的游离SN-38的混合物更有效(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。即使在每只动物1mg的重复剂量下，未缀合的RS7抗体也未显示任何抗肿瘤作用(Cardillo等人，2011，Clin CancerRes 17：3157-69)。然而，表达Trop-2的妇科癌症的体外研究已经指示用RS7mAb通过抗体依赖性细胞毒性进行细胞杀死(Bignotti等人，2010,Eur J Cancer46:944-53；Raji等人，2011,J Exp Clin CancerRes 30:106；Varughese等人，2011,Gynecol Oncol 122:171-7；Varughese等人，2011,Am JObstet Gyneol 205:567)。此外，据报道，另一种抗Trop-2抗体的单价Fab在体外和动物研究中具有治疗活性。
在治疗第56天，给予0.12mg/kg hA20-CL2A-SN-38对照ADC的小鼠中的七个肿瘤中的四个已经进展至1.0cm3的终点(未显示)。此时，用IMMU-132治疗这些动物，选择使用0.2mg/kg的较高剂量以试图影响这些大得多的肿瘤的进展。尽管几只动物的肿瘤尺寸很大，但所有小鼠均证明治疗响应，五周后肿瘤体积明显收缩(分别地，总体积[TV]＝0.14±0.14cm3比对0.74±0.41cm3；P＝0.0031，双尾t检验)。类似地，我们在伊立替康治疗组中选择了两只肿瘤进展至约0.7cm3的动物，并且一只用伊立替康再次治疗，另一只用IMMU-132治疗(未显示)。在结束治疗的2周内，伊立替康治疗的动物中的肿瘤减小23％，然后开始进展，而用IMMU-132治疗的肿瘤稳定，肿瘤尺寸减小60％。这些结果证明，即使在通过非特异性ADC暴露于SN-38后继续生长的肿瘤中，当用Trop-2特异性IMMU-132治疗时，可以实现显著增强的治疗响应。然而，在MDA-MB-231中未实现IMMU-132的特定治疗作用(未显示)。该细胞系具有最低的Trop-2水平，但对SN-38也最不敏感。
IMMU-132在TNBC中的作用机制-在TNBC细胞系MDA-MB-468和HER2+SK-BR-3细胞系中检测IMMU-132使用的凋亡途径，以确认ADC基于其并入的SN-38起作用(未显示)。单独的SN-38和IMMU-132在MDA-MB-468中在24小时内介导p21WAF1/Cip1的大于2倍上调，并且到48小时，这些细胞中p21WAF1/Cip1的量开始减小(在用SN-38或IMMU-132的情况下分别为31％和43％)。有趣的是，在HER2+SK-BR-3肿瘤系中，SN-38和IMMU-132在最初24小时内均未介导p21WAF1/Cip1上调至组成水平以上，但如在MDA-MB-468细胞中可见，在暴露于SN-38或IMMU-13248小时后，p21WAF1/Cip1的量减小>57％。SN-38和IMMU-132均在24小时内导致前半胱天冬酶-3裂解成其活性片段，但在暴露48小时后观察到更大程度的活性片段。值得注意的是，在两种细胞系中，IMMU-132介导更大程度的前半胱天冬酶-3裂解，与暴露于SN-38的细胞相比，48小时后观察到最高水平。最后，SN-38和IMMU-132均在24小时开始介导聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解，48小时后几乎完全裂解。总之，这些结果确认IMMU-132在体外施用时具有与游离SN-38相似的作用机制。
在人肿瘤异种移植模型中由IMMU-132比对伊立替康递送的SN-38-在施用伊立替康(773μg；SN-38当量＝448μg)和IMMU-132(1.0mg；SN-38当量＝16μg)的皮下植入人胰腺癌异种移植物(Capan-1)的小鼠的血清和肿瘤中确定源自伊立替康或IMMU-132的组成产物。
伊立替康从血清中迅速清除，在5分钟内转化为SN-38和SN-38G。24小时内未检测到任何产物。对于伊立替康、SN-38和SN-38G，经6小时的AUC分别为21.0μg/mL·h、2.5μg/mL·h和2.8μg/mL·h(小鼠的SN-38转化率＝[2.5+2.8)/21＝25.2％])。给予IMMU-132的动物在血清中具有低得多的游离SN-38浓度，但是在48小时内检测到游离SN-38(未显示)。仅在1小时和6小时检测到游离SN-38G，并且比游离SN-38低3至7倍。
在从伊立替康治疗的动物切除的Capan-1肿瘤中，伊立替康水平在6小时内高，但在24小时内检测不到(AUC5分钟-6小时＝48.4μg/g·h)。SN-38低得多并且仅在2小时内检测到(即，AUC5分钟-2小时＝0.4μg/g·h)，SN-38G值几乎高3倍(AUC＝1.1μg/g·h)(未显示)。取自给予IMMU-132的动物的肿瘤没有任何可检测的游离SN-38或SN-38G，而是肿瘤中的所有SN-38都与IMMU-132结合。重要的是，由于在肿瘤中未检测到SN-38G，这提示与IMMU-132结合的SN-38不是葡糖醛酸化的。在这些肿瘤中与IMMU-132结合的SN-38的AUC为54.3μg/g·h，比可检测到SN-38的用伊立替康治疗2小时时间段的动物的肿瘤中的SN-38的量高135倍，即使与施用IMMU-132相比，给予伊立替康的小鼠给出高28倍的SN-38当量(即，分别为448μg SN-38当量对比16μg SN-38当量)
讨论
我们描述了一种靶向Trop-2的新ADC，并且早期临床结果提示它在TNBC以及其他Trop-2+癌症患者中具有良好的耐受性和有效性(Bardia等人，2014,San Antonio BreastCancer Symposium,P5-19-27)。由于其独特的性能，IMMU-132代表第二代ADC。通常，ADC需要4种最佳有效的广泛属性：(i)选择性靶向/活性；(ii)ADC中使用的抗体的结合、亲和力、内化和免疫原性；(iii)药物、其效力、代谢和药理学处置，以及(iv)药物如何与抗体结合。靶标选择性是所有ADC的最常见要求，因为这将在限定治疗指数(毒性与肿瘤相对正常细胞的比率)中起主要作用。Trop-2似乎在许多上皮癌中具有高流行率，但它也由几种正常组织表达(Cubas等人，2009,Biochim Biophys Acta1796:309-14；Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33；Stepan等人，2011,59:701-10)，这可能会影响特异性。然而，正常组织中的表达似乎低于癌症中的表达(Bignotti等人，2010,Eur J Cancer 46:944-53)，并且Trop-2似乎被限制抗体可及性的正常组织结构屏蔽，而在癌症中，这些组织屏障受到入侵肿瘤连累。从猴子的初步毒理学研究中可以看出关于此的证据，其中尽管IMMU-132剂量升高至导致伊立替康样中性粒细胞减少症和腹泻的水平，但未发生表达Trop-2的正常组织的组织病理学损伤(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res17:3157-69)。这些结果似乎已在临床上得到确认，迄今为止尚未在患者中注意到特异性器官毒性，除了亲本化合物伊立替康的已知毒性之外(Bardia等人，2014,San Antonio Breast Cancer Symposium,P5-19-27)，用IMMU-132更易于控制这些毒性。
ADC治疗的普遍接受并且重要的标准是抗体应该内化，在细胞内递送其化学治疗剂，该化学治疗剂通常在溶酶体中代谢。尽管IMMU-132内化，但我们认为提供可能可以诱导对癌细胞的旁观者作用的SN-38的局部释放的该ADC中的接头是使该平台与使用超抗毒药物的平台区别开的另一特征。实际上，具有与IgG稳定连接的超毒性剂是能够保持这些类型的化合物的有用治疗窗口的唯一构造。然而，使用更中等毒性的药物并没有给出一旦在循环中就会过早释放药物的接头的自由度。我们小组探索了从血清中以约10小时至高度稳定的接头的不同半衰期从缀合物释放SN-38的接头，但是其是具有中间稳定性的接头，其在小鼠-人肿瘤异种移植模型中提供最佳的治疗响应(Moon等人，2008,J Med Chem 51:6916-26；Govindan等人，2009,Clin Chem Res 15:6052-61)。自该初步工作以来，我们发现SN-38的高度稳定的键联显著不如在血清中具有更中等稳定性的CL2A接头有效(Govindan等人，2013,Mol Cancer Ther 12:968-78)。
ADC设计的另一个目前原则是使用超细胞毒性药物来补偿肿瘤中低水平的抗体增加，通常为每克0.003％至0.08％注射剂量(Sharkey等人，1995,Cancer Res 55:5935s-45s)。已经发现目前这一代超毒性药物缀合物的药物:抗体取代≤4:1是最佳的，因为较高的比率会对其药代动力学产生不利影响，并且通过附带毒性减小治疗指数(Hamblett等人，2004,Clin CancerRes 10:7063-70)。在该第二代ADC平台中，我们选择使用IgG偶联方法，该方法通过轻微还原IgG将药物与链间二硫化物位点特异性连接，从而暴露8个结合位点。在用CL2A-SN-38接头的情况下，我们实现了7.6:1的DAR，LC-MS数据显示8个偶联位点中的每一个都带有CL2A接头，但显然一些SN-38在制造程序期间丢失。然而，95％的CL2A接头具有7-8个SN-38分子。我们随后发现(a)与这些位点的偶联不会使抗体不稳定，并且(b)用更高水平取代的这些位点制备的缀合物不损害抗体结合，也不影响药代动力学特性。实际上，我们证明以最大取代水平制备的缀合物在小鼠-人肿瘤异种移植模型中具有最佳治疗响应。
从耐受性的角度来看，IMMU-132的更显著特征之一是与IgG结合的SN-38不是葡糖醛酸化的，这是伊立替康解毒的一个关键步骤。在用伊立替康治疗的情况下，产生的大部分SN-38很容易在肝脏中转化为无活性的SN-38G形式。对SN-38G的AUC的估计显示它通常比SN-38高4.5至32倍(Gupta等人，1994,Cancer Res 54:3723-25；Xie等人，2002,J ClinOncol 20:3293-301)。SN-38G分泌到胆汁中并且随后由肠道菌群产生的β-葡糖醛酸酶解缀合与SN-38的肠肝再循环和用伊立替康的情况下观察到的延迟性严重腹泻密切相关(Stein等人，2010,Ther Adv Med Oncol 2:51-63)。施用IMMU-132后，SN-38G的浓度在我们的动物和临床研究中非常低(例如，在给予IMU-132的患者的血清中，仅20％至40％的游离SN-38水平为SN-38G的形式)，提供即使SN-38的10-羟基位置可用，与IgG结合的SN-38在很大程度上也不受葡糖醛酸化的影响的强有力的证据。我们推测，与伊立替康治疗相比，IMMU-132产生的低水平SN-38G有助于降低接受该ADC的患者的腹泻的发病率和强度。
防止与抗体结合的SN-38的葡糖醛酸化也可以有助于改善递送至肿瘤的SN-38的治疗作用。来自给予伊立替康的动物的肿瘤提取物发现高水平的伊立替康，其中SN-38和SN-38G浓度低10倍。相反，在给予IMMU-132的动物肿瘤中发现的唯一SN-38是与IgG结合的SN-38。我们假设保留在肿瘤中的缀合物最终将被内化，从而释放其SN-38有效载荷，或者SN-38可以释放到肿瘤细胞外；然而，它会以完全活性的形式释放，转化成SN-38G的可能性较低，这主要发生在肝脏中。同样重要的是强调通过将接头偶联到SN-38的20-羟基位置，SN-38以活性内酯形式保持(Zhao等人，2000,J Org Chem 65:4601-6)。总体来讲，这些结果提示，与源自非靶向伊立替康的SN-38相比，IMMU-132能够以选择性方式将SN-38递送并浓缩至Trop-2+肿瘤，其中由IMMU-132递送的SN-38可能以完全活性的非葡糖醛酸化内酯形式在肿瘤中释放。
伊立替康通常不用于治疗乳腺癌患者。然而，这里用TNBC细胞系显示的实验指示，将更高量的SN-38浓缩到肿瘤中可增强其活性。在MDA-MB-468TNBC和HER2+SK-BR-3肿瘤系中，IMMU-132介导内在凋亡途径的激活，其中前半胱天冬酶裂解成其活性片段并且PARP裂解。与无关的SN-38 ADC相比，用IMMU-132(Bardia等人，2014，San Antonio Breast CancerSymposium,P5-19-27)治疗的癌细胞的双链DNA断裂的证明确认SN-38选择性递送至靶细胞。最重要的是，这些实验室研究结果通过治疗经过大量预治疗的转移性TNBC的患者证实，其中已观察到持久的客观响应(Bardia等人，2014,San Antonio Breast CancerSymposium,P5-19-27)。还似乎是IMMU-132在患有其他癌症并且对于包含拓扑异构酶I抑制剂的先前治疗方案已经失败的患者中是具有活性(Starodub等人，2015,Clin CancerRes21:3870-78)。
总之，使用中等稳定的接头以非常高的药物与抗体比率缀合的SN-38在动物模型中也是有效的，并且在临床上也构成第二代ADC平台。我们的研究结果指示，Trop-2是Trop-2+实体肿瘤，特别是TNBC的临床相关且新型的靶标。
实施例17.IMMU-132的作用机制的研究
萨希珠单抗戈维替康(IMMU-132，也称为hRS7-CL2A-SN-38)是一种抗体-药物缀合物(ADC)，其靶向在许多上皮肿瘤上表达的表面糖蛋白Trop-2，用于递送伊立替康的活性代谢物SN-38。与使用超毒性药物和稳定接头的大多数ADC不同，IMMU-132使用在SN-38和接头之间具有中等稳定的碳酸酯键的中等毒性的药物。流式细胞术和免疫组织化学公开Trop-2在包括胃癌、胰腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、结肠癌、***癌和肺癌的多种肿瘤类型中表达。虽然细胞结合实验揭示在IMMU-132和亲本hRS7抗体之间没有显著差异，但使用Trop-2CM5芯片的表面等离子体共振分析显示IMMU-132具有优于hRS7的显著结合优势。缀合物保留与新生儿受体的结合，但与hRS7相比，损失了大于60％的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性。
肿瘤细胞暴露于游离SN-38或IMMU-132证明相同的信号传导途径：pJNK1/2和p21WAF1/Cip1上调，随后裂解半胱天冬酶9、7和3，最终导致聚-ADP-核糖聚合酶裂解和双链DNA断裂。
完整ADC在小鼠中的药代动力学揭示平均停留时间(MRT)为15.4小时，而载体hRS7抗体以与未缀合的抗体相似的速率清除(MRT＝约300小时)。与用非特异性对照处理的小鼠相比，IMMU-132治疗带有人胃癌异种移植物的小鼠(17.5mg/kg；每周两次×4周)导致显著的抗肿瘤作用。在带有人胰腺癌或胃癌异种移植物的小鼠中每隔一周一次、每周一次或每周两次施用IMMU-132的临床相关给药方案证明在两种模型中相似的显著抗肿瘤作用。目前的I/II期临床试验(ClinicalTrials.gov，NCT01631552)确认IMMU-132在包括胃癌和胰腺癌患者的表达Trop-2的癌症中的抗癌活性。
介绍
今年在美国将有估计22,220例确诊的胃癌新病例，另有10,990例死于该疾病(Siegel等人，2014,CA Cancer J Clin 64:9-29)。虽然5年存活率呈上升趋势(目前为29％)，但与包括结肠癌、乳腺癌和***癌(分别为65％、90％和100％)的大多数其他患者相比，其仍然相当低。事实上，在人癌症之中，只有食道癌、肝癌、肺癌和胰腺癌的5年存活率更差。胰腺癌仍然是美国所有癌症死亡的第四主要原因，其5年存活率仅为6％(Siegel等人，2014,CA Cancer J Clin 64:9-29)。从胃癌和胰腺癌的这种严峻统计数据可以清楚地看出，需要新的治疗方法。
Trop-2是45-kDa糖蛋白，其属于TACSTD基因家族，特别是TACSTD22。该跨膜蛋白在许多不同的上皮癌中的过表达与总体预后不良有关。Trop-2对于不依赖贴壁的细胞生长和肿瘤发生是必需的(Wang等人，2008,Mol Cancer Ther 7:280-85；Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33)。其充当需要被蛋白激酶C12-14磷酸化的完整细胞质尾的钙信号传导剂。与Trop-2相关的促生长信号传导包括NF-κB、细胞周期蛋白D1和ERK(Guerra等人，2013,Oncogene32:1594-1600；Cubas等人，2010,Mol Cancer 9:253)。
在胰腺癌中，在55％的所研究的患者中观察到Trop-2过表达，与接受治疗意图的手术的患者的转移、肿瘤分级和不良无进展存活正相关(Fong等人，2008,Br J Cancer 99:1290-95)。同样，在胃癌中，56％的患者在其肿瘤上表现出Trop-2过表达，这又与Trop-2阳性肿瘤细胞的***受累的患者的无病生存期较短和预后较差有关(Muhlmann等人，2009,J Clin Pathol 63:152-58)。鉴于这些特征以及Trop-2与许多难治性癌症相关的事实，Trop-2是用抗体-药物缀合物(ADC)进行治疗性干预的有吸引力的靶标。
使用抗体将药物靶向肿瘤的一般范例包括几个关键特征，其中包括：(a)相对于正常组织，优先在肿瘤上表达的抗原靶标，(b)具有良好亲和力并被肿瘤细胞内化的抗体，和(c)与抗体稳定偶联的超毒性药物(Panowski等人，2014,mAbs 6:34-45)。沿着这些方向，我们开发了一种命名为RS7-3G11(RS7)的抗体，其在许多实体肿瘤中与Trop-2结合(Stein等人，1993,Int J Cancer 55:938-46；Basu等人，1995,Int J Cancer 62:472-79)，具有纳摩尔亲和力(Cardillo等人，2011k,Clin Cancer Res 17:3157-69)，并且一旦与Trop-2结合，就被细胞内化(Shih等人，1995,Cancer Res 55:5857s-63s)。
通过免疫组织化学，Trop-2在一些正常组织中表达，但与肿瘤组织相比通常强度低得多，并且通常存在于血管通路受限的组织区域(Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33)。基于这些特征，RS7被人源化并与伊立替康的活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)缀合。许多细胞系的体外细胞毒性已发现SN-38的IC50值在单位数纳摩尔范围内，相比之下，目前在ADC中使用的许多超毒性药物的IC50值在皮摩尔范围内(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。虽然流行的观点是使用超毒剂，诸如阿里他汀(auristatin)或美登木素(maytansines)，使ADC对于每种抗体仅有2至4种药物与抗体稳定连接，但这些药剂的治疗窗口很窄，导致重新努力来再次设计ADC以扩大其治疗指数(Junutula等人，2010,Clin CancerRes 16:4769-78)。
作为偏离这种做法的一种方法，我们使用在人血清中释放具有约1天半衰期的SN-38的接头，每个抗体缀合7至8个SN-38分子。假设使用较不稳定的接头允许在ADC靶向细胞后SN-38在肿瘤部位释放，使得药物可触及周围的肿瘤细胞，而不仅仅触及由ADC直接靶向的细胞。所得ADC，hRS7-CL2A-SN-38(萨希珠单抗戈维替康或IMMU-132)已经显示出针对多种肿瘤类型的抗肿瘤活性(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。最近，IMMU-132已经证明针对三阴性乳腺癌(TNBC)的临床前模型的显著抗肿瘤活性(Goldenberg等人，2014，在圣安东尼奥乳腺癌研讨会上发表的海报，12月9日至13日，摘要P5-19-08)。最重要的是，在目前的I/II期临床试验中，IMMU-132在TNBC患者中显示出活性(Bardia等人，2014，在圣安东尼奥乳腺癌研讨会上发表的海报，12月9日至13日，摘要P5-19-2)，因此使用毒性较小的药物和随时间释放SN-38而不是完全依赖于ADC的内化来实现活性的接头验证ADC化学的这种范式转变。
SN-38是一种已知的拓扑异构酶-I抑制剂，其诱导细胞DNA的显著损伤。它介导早期促凋亡蛋白p53和p21WAF1/Cip1的上调，导致半胱天冬酶激活和聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)裂解。p21WAF1/Cip1的表达与细胞周期的G1停滞相关，因此是内在细胞凋亡途径的标志。我们先前证明IMMU-132同样可以介导早期促凋亡信号传导事件(p53和p21WAF1/Cip1)的上调，导致在NSCLC细胞系(Calu-3)和胰腺细胞系(BxPC-3)中的PARP裂解与内在的促凋亡信号传导途径一致(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。
在此，我们进一步表征IMMU-132，特别注意治疗实体癌，尤其是人胃癌和胰腺癌。检查一系列实体肿瘤类型中的Trop-2表面表达，并与肿瘤异种移植物中的体内表达相关联。机制研究进一步阐明了由IMMU-132介导的内在促凋亡信号传导事件，包括增加的双链DNA(dsDNA)断裂和后来的半胱天冬酶激活的证据。最后，在胃癌和胰腺癌疾病模型中比较临床相关且无毒的给药方案，以每周两次、每周一次和每隔一周一次的时间表测试，以确定哪种治疗周期可以最佳地应用于临床环境而不丧失功效。
实验程序
细胞系和化学治疗剂-使用的所有人癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)。每种人癌细胞系都根据ATCC的推荐保存并常规地测试支原体，所有这些都通过ATCC的短串联重复(STR)测定验证。如前所述制备IMMU-132(hRS7-SN-38)和对照ADC(抗CD20 hA20-SN-38和抗CD22 hLL2-SN-38)并储存在-20℃下(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。购买SN-38(Biddle SawyerPharma,LLC,New York,NY)并在-20℃下在DMSO中以1mM等分试样储存。
Trop-2ELISA-将具有His标签的重组人Trop-2(Sino Biological，Inc.，Bejing，China，目录号10428-H09H)和具有His标签的重组小鼠Trop-2(Sino Biological，Inc.，目录号50922-M08H)在室温下以1μg铺板到Ni-NTA Hissorb条(Qiagen GmbH，目录号35023)上持续1小时。将板用PBS-Tween(0.05％)洗涤缓冲液洗涤四次。在1％BSA-PBS稀释缓冲液中制备hRS7的系列稀释液，得到0.1ng/mL至10μg/mL的测试范围。然后将板在室温下孵育2小时，然后洗涤4次，接着添加过氧化物酶缀合的二抗(山羊抗人Fc片段特异性的；JacksonImmunoresearch，目录号109-036-098)。孵育45分钟后，洗涤板，并向所有孔中添加底物溶液(邻苯二胺二盐酸盐(OPD)；Sigma，目录号P828)。将板在黑暗中孵育15分钟，然后用4N硫酸停止反应。在Biotek ELX808读板器上在450nm下读板。使用Prism GraphPad软件(v4.03)(Advanced Graphics Software，Inc.；Encinitas，CA)分析和绘制数据。
体外细胞结合-LumiGLO化学发光底物***(KPL，Gaithersberg，MD)用于检测与细胞结合的抗体。简言之，将细胞铺板到96孔黑色平底透明板中过夜。将抗体以1:2连续稀释并一式三份地添加，产生浓度范围为0.03nM至66.7nM。在4℃下孵育1小时后，除去培养基，用新鲜的冷培养基洗涤细胞，然后在4℃下添加1:20,000稀释的山羊-抗人辣根过氧化物酶-缀合的二抗(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)1小时。在添加LumiGLO试剂之前再次洗涤板。使用Envision读板仪(Perkin Elmer，Boston MA)读取板的发光。通过非线性回归分析数据以确定平衡解离常数(KD)。使用Prism GraphPad软件(v4.03)(AdvancedGraphics Software，Inc.；Encinitas，CA)使用F-检验对数据的最佳拟合曲线进行KD值的统计比较。显著性设定为P<0.05。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)-执行4小时LDH释放测定以评价由IMMU-132、hRS7 IgG、hLL2-SN-38和hLL2 IgG引发的ADCC活性(hLL2是用于实体肿瘤细胞系的非结合抗CD22缀合物)。简言之，将靶细胞(MDA-MB-468，NIH:OVCAR-3或BxPC-3)以1×104个细胞/孔铺板在96孔黑色平底板中并孵育过夜。第二天，从供体中新鲜分离外周血单核效应细胞(PBMC)，并以50:1的E:T比率添加到反应板上的指定孔中。在新英格兰机构审查委员会(Newton，MA)的批准下，进行了人PBMC的采集。将测试试剂添加到其指定的孔中，终浓度为33.3nM。一组孔仅接受ADCC测定培养基用于背景对照，另一组孔仅接受细胞加TritonX100用于最大细胞裂解控制。将板在37℃下孵育4小时。4小时后，通过均相荧光LDH释放测定评估靶细胞裂解(Cyto Tox-One Homogenous Membrane Integrity Assay；Promega，Cat.G7891)。
使用Envision读板仪(PerkinElmer LAS，Inc.；Shelton，CT)读板(544nm至590nm)。数据通过Microsoft Excel分析。特异性裂解百分比计算如下：
其中：
实验：效应子+靶细胞+抗体
效应子+靶标对照：效应子+靶细胞
最大裂解：靶细胞+Triton-X100
靶标对照：仅靶细胞
表面等离子体共振结合(BIACORE)-简言之，如所述产生(Wang等人，2011,DrugMetab Dispos 39:1469-77)的rhTrop-2/TACSTD2(Sino Biological,Inc.)或重组人新生儿受体(FcRn)用胺偶联试剂盒(GE Healthcare；目录号BR-1000-50)在CM5传感器芯片(GEHealthcare；目录号BR-1000-12)上遵循制造商关于低密度芯片的说明固定化。在运行缓冲液(400nM、200nM、100nM、50nM和25nM)中制备三组独立的hRS7IgG和IMMU-132稀释液。每组将在BIACORE(BIACORE-X；Biacore Inc.，Piscataway，NJ)上进行单独的运行，并使用BIAevaluation软件(Biacore Inc.，v4.1)分析数据。使用1:1(Langmuir)结合模型和拟合执行分析，使用每个样品运行的所有五个浓度点来确定最佳拟合(最低χ2值)。使用公式KD＝kd1/ka1计算KD值，其中kd1是解离速率常数，ka1是缔合速率常数。
Trop-2在***固定的石蜡包埋组织中的分布的免疫组织学评估-从小鼠中取出肿瘤异种移植物，固定在10％缓冲***中并石蜡包埋。去石蜡后，将5μm切片用Tris/EDTA缓冲液(DaKo Target Retrieval Solution，pH 9.0；Dako，Denmark)在NxGen显现室(Biocare Medical，Concord，CA)中在95℃下孵育30分钟。用山羊多克隆抗人Trop-2抗体以10μg/mL(R&D Systems，Minneapolis，MN)检测Trop-2，并用Vector VECTASTAINR ABC试剂盒(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)染色。将正常山羊抗体用作阴性对照(R&DSystems，Minneapolis，MN)。将组织用苏木精复染6秒。
在人癌细胞系上的Trop-2表面表达-Trop-2在细胞表面上的表达基于流式细胞术。简言之，用Accutase细胞分离溶液(Becton Dickinson(BD)，Franklin Lakes，NJ；目录号561527)收获细胞并使用QuantiBRITE PE珠粒(BD目录号340495)和PE缀合的抗Trop-2抗体(eBiosciences，目录号12-6024)遵循制造商的说明测定Trop-2表达。在FACSCalibur流式细胞仪(BD)上使用CellQuestPro软件获取数据。用Flowjo软件(Tree Star，Ashland OR)分析染色。
药代动力学-8至10周龄的幼稚雌性NCr裸(nu/nu)小鼠购自Taconic Farms(Germantown，NY)。用200μg IMMU-132(亲本hRS7)或修饰的hRS7-NEM(用TCEP处理并与N-乙基马来酰亚胺缀合的hRS7)静脉内注射小鼠(N＝5)。在注射后30分钟、4小时、24小时、72小时和168小时通过眶后丛将动物放血。利用ELISA确定因与hRS7的辣根过氧化物酶缀合物竞争结合抗hRS7 IgG独特型抗体产生的总hRS7 IgG的血清浓度。使用针对捕获的抗SN-38抗体和用于检测的辣根过氧化物酶缀合的抗hRS7 IgG抗体确定完整IMMU-132的血清浓度。使用Phoenix WinNonlin软件(版本6.3；Pharsight Corp.，Mountainview，CA)通过非房室分析计算药代动力学(PK)参数。
体外评估双链DNA断裂-对于药物活性测试，将BxPC-3细胞以5×105个细胞/孔接种在6孔板中并在37℃下保持过夜。在冰上冷却10分钟后，将细胞与终浓度为20μg/ml的IMMU-132、hA20-SN-38或hRS7-IgG一起在冰上孵育30分钟，用新鲜培养基洗涤三次，然后返回到37℃继续培养过夜。第二天早晨，将细胞短暂胰蛋白酶消化，离心，用FixableViability Stain 450(BD Biosciences，San Jose，CA)染色，用1％BSA-PBS洗涤，然后在4％***中固定15分钟，再次洗涤，并且在PBS中的0.15％Triton-X100中渗透另外15分钟。用1％BSA-PBS洗涤两次后，将细胞与小鼠抗-γH2AX-AF488(EMD MilliporeCorporation，Temecula，CA)一起在4℃下孵育45分钟。通过流式细胞术使用BD FACSCanto(BD Biosciences，San Jose，CA)测量γH2AX的信号强度。
体内治疗研究-4至8周龄的NCr雌性无胸腺裸(nu/nu)小鼠购自Taconic Farms(Germantown，NY)。通过从组织培养物中收获细胞并在基质胶(BD Bioscience；San Jose,CA)中以1:1制成最终细胞悬浮液来建立NCI-N87胃肿瘤异种移植物，在右侧腹每只小鼠皮下接受总共1×107个细胞。对于BxPC-3，收获1g的异种移植物，并在HBSS中制成肿瘤悬浮液，浓度为40％肿瘤w/v。将该悬浮液与基质胶1:1混合，得到20％w/v的最终肿瘤悬浮液。然后用300μL皮下注射小鼠。使用卡尺通过二维测量确定肿瘤体积(TV)，体积定义为：L x w2/2，其中L是肿瘤的最长尺寸，w是肿瘤的最短尺寸。对于IHC，允许肿瘤生长至约0.5cm3，然后对小鼠实施安乐死并取出肿瘤，将其***固定并石蜡包埋。对于治疗研究，将小鼠随机分入治疗组，当肿瘤体积为约0.25cm3时开始治疗。每个实验中的治疗方案、剂量和动物数量在结果和图例中描述。将冻干的IMMU-132和对照ADC(hA20-SN-38)复原并根据需要在无菌盐水中稀释。
对小鼠实施安乐死并且一旦肿瘤生长至大于1.0cm3的尺寸，就认为已经死于疾病。对治疗的最佳响应定义为：部分响应，从起始尺寸收缩>30％；疾病稳定，肿瘤体积收缩至29％或增加不超过初始尺寸的20％；进展，肿瘤从起始尺寸或最低点开始增加≥20％。进展时间(TTP)被确定为治疗开始后肿瘤从其最低点尺寸生长超过20％的时间。
肿瘤生长的统计分析基于曲线下面积(AUC)。通过线性曲线建模获得个体肿瘤生长的概况。在生长曲线的统计分析之前，采用f检验来确定组间方差的相等性。双尾t检验用于评估各种治疗组和除盐水对照外的对照之间的统计学显著性，其中使用单尾t检验(显著性，P≤0.05)。使用Prism GraphPad软件(v4.03)软件包(Advanced Graphics Software，Inc.，Encinitas，CA)，使用Kaplan-Meier图(对数秩分析)分析存活研究。
免疫印迹-将细胞(2×106)铺板在6孔板中过夜。第二天，将它们用SN-38浓度相当于0.4μg/mL(1μM)的游离SN-38(溶解于DMSO)或IMMU-132处理。亲本hRS7用作ADC的对照。在含有10mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(2mM Na2PO4，10mMNaF)的缓冲液中裂解细胞。在4-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶中解析总共20μg蛋白质，将其转移到硝酸纤维素膜上并用1×TBS-T(Tris缓冲盐水，0.1％Tween-20)中的5％脱脂牛奶在室温下阻断1小时。将膜在4oC下用一抗探测过夜，然后在室温下与抗兔二抗(1:2500)一起孵育1小时。使用化学发光试剂盒(Supersignal West Dura，Thermo Scientific；Rockford，IL)进行信号检测，其中膜在Kodak Image Station 40000R上可视化。一抗p21Waf1/Cip1(目录号2947)、半胱天冬酶-3(目录号9665)、半胱天冬酶-7(目录号9492)、半胱天冬酶-9(目录号9502)、PARP(目录号9542)、β-肌动蛋白(目录号4967)、pJNK1/2(目录号4668)、JNK(目录号9258)和山羊抗兔-HRP二抗(目录号7074)自Cell Signal Technology(Danvers，MA)获得。
结果
多个实体肿瘤细胞系中的Trop-2表达水平-Trop-2的表面表达在包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌的多种人实体肿瘤系中是明显的(表10)。没有一种肿瘤类型具有高于任何其他类型的表达，在给定的肿瘤细胞类型内观察到可变性。例如，在胃腺癌中，Trop-2水平范围从每个细胞非常低的494±19(Hs 746T)到高246,857±64,651(NCI-N87)表面分子。
针对Trop-2表达染色的胃肠道肿瘤异种移植物显示细胞质和膜染色(未显示)。染色强度与通过FACS分析确定的表面Trop-2表达的结果很好地相关。对于胰腺癌，所有三种都具有均质染色，BxPC-3代表2+至3+染色。NCI-N87胃腺癌具有更异质的染色模式，腺体顶端衬里染色3+并且周围肿瘤细胞染色较不明显。COLO 205仅证明非常局灶性的1+至2+染色，而HT-29显示出少数细胞非常罕见的1+染色。
表10.通过FACS分析各种实体肿瘤系中的Trop-2表面表达水平。a
a执行三次单独的测定，提供平均值和标准偏差。
IMMU-132结合特征-为了进一步证明hRS7不与鼠Trop-2交叉反应，在用重组鼠Trop-2或人Trop-2涂布的板上执行ELISA(未显示)。人源化RS7仅特异性结合人Trop-2(KD＝0.3nM)；与小鼠Trop-2没有交叉反应性。对照多克隆兔抗鼠Trop-2和抗人Trop-2抗体确实与两种形式的Trop-2交叉反应并结合(数据未显示)。
检查IMMU-132与多种细胞系的结合，与亲本hRS7以及修饰的hRS7，hRS7-NEM(用TCEP处理并与N-乙基马来酰亚胺缀合的hRS7)进行比较(未显示)。在所有情况下，计算的KD值均在亚纳摩尔范围内，在给定细胞系内在hRS7、IMMU-132和hRS7-NEM之间没有显著差异。
使用表面等离振子共振(BIACORE)分析进一步研究IMMU-132和hRS7的结合的比较(未显示)。使用低密度Trop-2生物传感器芯片(密度＝1110RU)与重组人Trop-2。三个独立的结合运行不仅证明IMMU-132不受SN-38-缀合过程不利地影响，而且证明对Trop-2的结合亲和力高于hRS7对Trop-2的结合亲和力(分别地，0.26±0.14nM对比0.51±0.04nM；P＝0.0398)。
作用机制：ADCC和内在凋亡信号传导途径-将IMMU-132的ADCC活性与hRS7的ADCC活性在三种不同细胞系TNBC(MDAMB-468)、卵巢(NIH:OVCAR-3)和胰腺(BxPC-3)中进行比较(未显示)。在所有三种中，与包括IMMU-132的所有其他治疗相比，hRS7显著地介导细胞裂解(P<0.0054)。与hRS7相比，当IMMU-132用于靶向细胞时，ADCC减小超过60％。例如，在MDA-MB-468中，hRS7介导的特异性裂解为29.8±2.6％，对比之下，IMMU-132介导的特异性裂解为8.6±2.6％(未显示；P<0.0001)。在NIH:OVCAR-3和BxPC-3中也观察到类似的ADCC活性丧失(未显示；分别地，P<0.0001和P<0.0054)。这种减小的ADCC活性似乎是在缀合过程期间抗体变化的结果，因为特异性细胞裂解的该相同损失在用hRS7-NEM的情况下是明显的，hRS7-NEM缺乏CL2A-SN-38接头，具有作为替代用N-乙基马来酰亚胺阻断的半胱氨酸(未显示)。没有与hRS7或IMMU-132相关的CDC活性(数据未显示)。
先前已显示IMMU-132介导早期促凋亡信号传导事件(p53和p21WAF1/Cip1)的上调，最终导致PARP20的裂解。为了更好地限定由IMMU-132使用的凋亡途径，将NCI-N87人胃癌和BxPC-3胰腺癌细胞系暴露于1μM游离SN-38或等量IMMU-132(未显示))。游离SN-38和IMMU-132均介导p21WAF1/Cip1的上调，但直到48小时，暴露于游离SN-38的NCI-N87细胞对比暴露于IMMU-132的NCI-N87细胞之间的上调才是相同的(未示出)，而在BxPC-3中，最大上调在24小时内显而易见(未示出)。游离SN-38和IMMU-132均证明在暴露48小时内前半胱天冬酶-9和-7裂解。前半胱天冬酶-3在两种细胞系中都被裂解，48小时后观察到最高程度的裂解。最后，游离SN-38和IMMU-132均介导PARP裂解。这首先在24小时变得明显，在48小时裂解增加。总之，这些数据确认IMMU-132中包含的SN-38具有与游离SN-38相同的活性。
除了这些后来的凋亡信号传导事件之外，与该途径相关的早期事件，即JNK的磷酸化(pJNK)，在短时间暴露于游离SN-38或IMMU-132但不是裸hRS7(未显示)的BxPC-3细胞中也是明显的。pJNK的量增加在4小时明显，在6小时没有明显变化。与IMMU-132相比，在暴露于游离SN-38的细胞中磷酸化强度更高，但两者都显著高于对照。作为IMMU-132作用机制的终点，在BxPC-3细胞中进行dsDNA断裂的测量。与非靶向对照ADC相比，BxPC-3暴露于IMMU-132仅30分钟导致γH2AX的诱导大于2倍(表11)。约70％的细胞对于γH2AX染色是阳性的，对比之下，对于裸hRS7、与ADC无关的hA20-SN-38和未处理的对照而言<20％(P<0.0002)。
表11.在BxPC-3:γH2AX诱导中IMMU-132介导的dsDNA断裂。a
a IMMU-132对比所有3种对照处理，P<0.0002(单尾t检验；N＝3)。
IMMU-132的药代动力学-通过BIACORE分析确定与人新生儿受体(FcRn)的结合(未显示)。使用低密度FcRn生物传感器芯片(密度＝1302RU)，对每种试剂在三种不同浓度(400nM至25nM)下进行三种独立的结合。总体而言，hRS7和IMMU-132均证明纳摩尔范围内的KD值(分别为92.4±5.7nM和191.9±47.6nM)，这两者之间无显著差异。给小鼠注射IMMU-132，使用两种ELISA将IMMU-132比对hRS7 IgG的清除率与亲本hRS7相比较(未显示)。用hRS7注射的小鼠证明与IMMU-132的hRS7靶向部分(未显示)观察到的相似的双相清除模式(未显示)，其中α和β半衰期分别为约3小时和约200小时。相反，观察到完整IMMU-132的快速清除，半衰期为11小时并且平均停留时间(MRT)为15.4小时(未显示)。
为了进一步确认链间二硫键的破坏不改变靶向抗体的PK，将亲本hRS7的PK与修饰的hRS7(hRS7-NEM)进行比较。在半衰期、Cmax、AUC、清除率或MRT方面，两种药剂没有显著差异(未显示)。
IMMU-132在人胃癌异种移植物中的功效-IMMU-132的功效先前已在非小细胞肺癌、结肠癌、TNBC和胰腺癌异种移植模型中得到证明(Cardillo等人，2011,Clin CancerRes17:3157-69；Goldenberg等人，在圣安东尼奥乳腺癌研讨会上发表的海报，12月9日至13日，摘要P5-19-08)。为了进一步将这些研究结果扩展到其他胃肠癌，在带有人胃癌异种移植物NCI-N87的小鼠中测试了IMMU-132(未显示)。与盐水和非靶向hA20(抗CD20)-SN-38 ADC对照相比，用IMMU-132治疗实现显著的肿瘤消退(未显示；P<0.001)。IMMU-132组中的7只小鼠中有6只是部分响应者，在对动物施用最后一次治疗剂量后持续超过18天。这导致平均进展时间(TTP)为41.7±4.2天，相比之下，对照ADC组中的无响应者的TTP为4.1±2.0天(P<0.0001)。总体而言，IMMU-132治疗的小鼠的中位存活时间(MST)为66天，相比之下，对照ADC的中位存活时间(MST)为24天，并且盐水对照对照动物的中位存活时间(MST)为14天(未显示；P<0.0001)。
临床相关的给药方案-临床上目前正在测试的IMMU-132耐受的最高重复剂量是在21天周期的第1天和第8天给予8mg/kg和10mg/kg。8mg/kg的人剂量转换成98.4mg/kg的鼠剂量，或对于20g小鼠而言约2mg。在人胰腺癌异种移植模型(BxPC-3)中检查了分次的2mgIMMU-132的三种不同剂量方案。使用三种不同给药方案中的一种对该总剂量进行分级：一组接受两次1mg的IMMU-132剂量(治疗第1天和第15天)，一组接受4次0.5mg的剂量(治疗第1天、第8天、第22天和第29天)，最后一组8次0.25mg的剂量(治疗第1天、第4天、第8天、第11天、第22天、第25天、第29天和第32天)。与未治疗的对照动物相比，所有三种给药方案在肿瘤生长抑制和总体存活方面均提供显著的抗肿瘤作用(未显示；分别地，P<0.0009和P<0.0001)。三种不同治疗组之间的TTP无显著差异，1-mg给药组的TTP为22.4±10.1天，0.25-mg给药组的TTP为31.7±14.5天(未治疗对照组为TTP＝5.0±2.3天)。
在带有NCI-N87人胃肿瘤异种移植物的小鼠中执行相似的剂量方案实验(未显示)。当与未治疗的对照小鼠相比时，所有三种剂量方案都具有显著的抗肿瘤作用，但彼此没有差异(AUC；P<0.0001)。同样，就总体存活率而言，与未治疗的对照相比，所有三种剂量方案都提供了显著的存活益处(P<0.0001)，这三种不同方案中的任何一种都没有差异。
为了进一步区分可能的给药方案，对带有NCI-N87肿瘤的小鼠进行慢性IMMU-132给药，其中小鼠每周一次接受0.5mg IMMU-132注射，持续两周，然后停止一周，之后开始另一个周期(未显示)，如在目前的临床试验方案中。总之，对动物施用四个治疗周期。
该给药方案减慢了肿瘤生长，TTP为15.7±11.1天，对比之下，对照ADC治疗的小鼠的TTP为4.7±2.2天(P＝0.0122)。总体而言，慢性给药使中位数为19的存活率从对于对照ADC治疗的小鼠而言的21天增加到对于施用IMMU-132的那些动物而言的63天，增加3倍(P＝0.0001)。重要的是，在所有这些不同的给药方案评价中，如通过体重没有显著减轻所证明，在小鼠中没有观察到与治疗相关的毒性(数据未显示)。
讨论
在目前的I/II期临床试验(ClinicalTrials.gov，NCT01631552)中，IMMU-132(萨希珠单抗戈维替康)表明在患有多种实体肿瘤的患者中的客观响应(Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-78)。随着这项I/II期临床试验的继续，IMMU-132的功效需要在不断扩展的Trop-2阳性癌症列表中进一步探索。另外，与使用超抗毒性药物的其他临床相关的ADC相比，IMMU-132的独特性需要在我们向前推进临床开发时进一步阐明。
这里提供的工作进一步表征IMMU-132，并证明其在临床相关的给药方案中对胃和胰腺癌的功效。成功ADC的主流观点是它应该使用识别相对于正常组织具有高肿瘤表达水平的抗原的抗体以及与肿瘤细胞结合时优选内化的抗体(Panowski等人，2014,mAbs 6:34-45)。所有目前批准的ADC使用通过高稳定接头以高取代比(每种抗体2至4种药物)与抗体偶联的超毒性药物(pMIC50)。IMMU-132在三个主要方面偏离了这种范式：(i)SN-38，一种中等细胞毒性药物(nMIC50)，其用作化疗剂，(ii)SN-38与抗体的8个链间硫醇位点特异性缀合，每个抗体产生7.6个药物的取代物，和(iii)使用在低pH下可裂解但也将释放具有约24小时的血清半衰期的药物的碳酸酯接头(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。如我们所示，IMMU-132由与表位结合后内化的抗体组成，其对人Trop-2具有特异性，其在许多不同类型的上皮肿瘤中高度表达，并且在它们的相应正常组织中以低浓度存在(Shih等人，1995,Cancer Res 55:5857s-63s)。尽管存在于正常组织中，但在猴子中进行的先前研究(也在相似组织中表达Trop-2)指示，即使在发生剂量限制性中性粒细胞减少症和腹泻的非常高的剂量下也存在相对轻微且可逆的组织病理学变化，提示正常组织中的抗原以某种方式隔离，或者使用毒性较小的药物使这些正常组织免于严重损坏(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。
在本文中，我们扩展了对多种人实体肿瘤系上Trop-2表达的评估，以比先前报道的更定量的方式但重要的是在异种移植物中检查体外表达，说明Trop-2表达范围从均匀(例如，NCIN87)到非常局灶(例如，COLO 205)。总之，体外测定的Trop-2的表面表达水平与异种移植物的IHC分析时的染色强度相关。特别令人感兴趣的是，即使在像COLO 205这样的肿瘤中，通过免疫组织学揭示仅存在Trop-2表达细胞的局灶性口袋，IMMU-132仍然能够引发特异性肿瘤消退，这提示旁观者效应可以由于SN-38从与抗原呈递细胞结合的缀合物中释放的结果而发生(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。实际上，SN-38容易地穿透细胞膜，因此其在肿瘤微环境中的局部释放为其进入细胞提供了另一种机制，而不需要内化完整的缀合物。重要的是，与缀合物结合的SN-38保持完全活性状态；即，它并未葡糖醛酸化并且在释放时将呈内酯环形式(Sharkey等人，2015,Clin Cancer Res,21:5131-8)。该特性是独特的，区别于IMMU-132以比迄今研究的任何其他缓释SN-38或伊立替康药剂更具选择性的方式定位完全活性形式的SN-38的能力。
用IMMU-132的I期临床试验鉴定在21天周期中每周给予8mg/kg至10mg/kg，持续两周，以在II期进一步研究(Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-78)。患有包括胰腺癌和胃癌的多种转移性实体肿瘤的患者在自多种先前疗法复发后显示出延长的疾病稳定期(Starodub等人，2015,Clin CancerRes 21:3870-78；Starodub等人，2014,J ClinOncol 32:5s(增刊摘要3032))。在异种移植模型中进行了另外的研究以确定不同的给药方案是否可以更有效。为此，相当于8mg/kg的人剂量(98.4mg/kg的小鼠剂量)在三个不同的给药方案中分级，包括在21天周期中，每隔一周一次，每周一次或每周两次。在胰腺和胃肿瘤模型中，对于所有三种方案，未观察到治疗响应的显著差异，其中肿瘤仅在停止治疗后才进展。因此，这些数据支持继续使用临床上目前正在进行的每周一次的给药方案。
随着临床试验推荐IMMU-132的每个治疗剂量为8mg/kg至10mg/kg(Starodub等人，2015,Clin CancerRes 21:3870-78)，重要的是检查单独的抗体是否可能有助于IMMU-132的活性。在裸鼠-人异种移植模型中的先前研究包括单独的未缀合的hRS7 IgG(例如，重复剂量为25mg/kg至50mg/kg)，没有治疗活性的证据(Cardillo等人，2011,Clin CancerRes17:3157-69)；然而，小鼠中的研究并不总能预测免疫功能。已报道在Trop-2阳性卵巢癌和子宫癌中hRS7的体外ADCC活性(Raji等人，2011,J Exp Clin Cancer Res 30:106；Bignotti等人，2011,Int J Gynecol Cnacer 21:1613-21；Varughese等人，2011,Am JObstet Gynecol 205:567；Varughese等人，2011,Cancer 117:3163-72)。我们在三种不同的细胞系中确认了未缀合的hRS7ADCC活性，但发现IMMU-132损失了其效应子功能的60％至70％。由于还原/NEM阻断的IgG具有类似的ADCC活性损失，因此看起来CL2A-SN-38组分的连接本身并不负责任。
抗体还可以通过作用于各种凋亡信号传导途径来引发细胞死亡。然而，我们没有观察到未缀合的抗体在许多凋亡信号传导途径中的任何作用，而是注意到IMMU-132引起与SN-38相似的内在凋亡事件。早期事件包括JNK1/2的磷酸化以及p21WAF1/Cip1的上调，导致半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-7和半胱天冬酶-3的激活，最终结果是PARP裂解和显著水平的dsDNA断裂，如通过增加的磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)41的量来测量。这些数据提示，IMMU-132的主要作用机制与SN-38有关。
表面等离子共振(BIACORE)分析未检测到IMMU-132与人新生儿受体(FcRn)结合的显著差异，尽管IMMU-132的平均结合水平低约2倍。FcRn结合与血清中延长的IgG半衰期相关(Junghans和Anderson，1996,Proc Natl Acad Sci USA 93:5512-16)，但因为抗体对FcRn的体外亲和力可能与体内清除率无关(Datta-Mannan等人，2007,JBiol Chem 282:1709-17)，该研究结果的总体重要性尚不清楚。在荷瘤小鼠中使用111In-DTPA-IMMU-132的先前实验揭示，与111In-DTPA-hRS7相比，缀合物自血清的清除速度略快，尽管两者具有相似的肿瘤摄取(Cardillo等人，2011,Clin CancerRes 17:3157-69)。在目前的研究中，另外测量IgG组分的清除率的ELISA测定，发现IMMU-132和还原和NEM阻断的IgG以与未缀合的hRS7相似的速率清除，提示与链间二硫化物的偶联不会使抗体不稳定。如所预期，当使用监测完整缀合物清除的ELISA(使用抗SN-38抗体和具有抗独特型抗体的探针捕获)时，其清除率比仅监测IgG组分时更快。这种差异仅仅反映了SN-38以约1天的半衰期从缀合物中释放。我们还通过ELISA检查以不同取代水平制备的萨希珠单抗戈维替康缀合物的清除率，并再次发现它们的清除率没有显著差异(Goldenberg等人，2015,Oncotarget 8:22496-512)。总体而言，这些数据提示，抗体的轻度还原以及随后对一些或全部链间二硫化物的位点特异性修饰对IgG的血清清除率的影响(如果有的话)最小，但IMMU-132的整体清除率将主要由SN-38从接头释放的速率限定。
另外，广泛的细胞结合实验证明IMMU-132、未缀合的抗体或NEM修饰的抗体的结合没有显著差异，提示与链间二硫化物的位点特异性连接保护抗体的抗原结合特性。有趣的是，当通过BIACORE分析时，除了整体亲和力之外，它还能更准确地测量缔合速率和解离速率，当与裸hRS7相比时，IMMU-132在Trop-2结合的计算KD值方面显著改善了2倍。
我们推测，当SN-38与抗体缀合时，这种改善可能是由于疏水性增加。已经显示疏水性残基以及蛋白质结合位点的封闭区域的疏水性赋予表位更强的亲和力(Park等人，2000,Nat Biotechnol 18:194-98；Berezov等人，2001,J Med Chem 44:2565-74；Young等人，2007,Proc Natl Acad Sci USA 104:808013)。这些区域不必位于蛋白质-蛋白质界面，而是可以位于周围的能量较少的接触残基中(Li等人，2005，Structure 13:297-307)。虽然在hRS7的补体决定区(CDR)中不存在SN-38缀合位点，但是抗体上的SN-38可以取代表位周围的一些水分子，导致IMMU-132相对于裸hRS7观察到结合亲和力改善的前景不会打折。
ADC开发的大部分工作已经涉及使用稳定的接头和超毒性药物，临床前研究指示这些结合物的特定最佳要求(Panowski等人，2014,mAbs 6:34-45；Phillips等人，2008,Cancer Res 68:9280-90)。例如，T-DM1与另一种不太稳定的衍生物T-SSPDM1的比较揭示，在非荷瘤小鼠中，完整的T-SSP-DM1以比TDM-1快约2倍的速率清除(Phillips等人，2008,Cancer Res 68:9280-90；Erickson等人，2012,Mol Cancer Ther 11:1133-42)，与肿瘤中的T-SSPDM1相比，T-DM1水平高1.5倍。出乎意料并且最有趣的是靶向肿瘤中游离的活性美登木素生物碱分解代谢物的量在两种ADC之间非常相似(Erickson等人，2012,Mol CancerTher 11:1133-42)。
换句话说，T-SSP-DM1能够克服其在接头稳定性方面的缺陷，因为与更稳定的T-DM1相比，较低的稳定性的事实导致药物在肿瘤中更高效地释放。毫不奇怪，肿瘤中这两种ADC之间的活性药物-代谢物的等效性导致在荷瘤动物中具有相似的抗肿瘤作用。最终，基于使用超毒性药物和较不稳定的接头时出现的毒性问题选择T-DM1(Phillips等人，2008,CancerRes 68:9280-90)。由于SN-38的毒性比这些美登木素低至少一个对数倍数，因此预计其从ADC释放的毒性较小。然而，即使其在血清中释放，定位于人胃癌或胰腺肿瘤异种移植物中的SN-38的量也比注射剂量比SN-38等效物高>20倍的伊立替康的荷瘤小鼠高136倍(Sharkey等人，2015,Clin Cancer Res,21:5131-8)。虽然我们在IMMU-132的开发中测试了更稳定的接头，但它们在异种移植肿瘤模型中明显不如IMMU-132有效(Govindan等人，2013,Mol Cancer Ther 12:968-78)。
类似地，更快地释放SN-38的接头(例如，血清半衰期为约10小时)在异种移植模型中也不太有效(Moon等人，2008,J Med Chem51:6916-26；Govindan等人，2009,Clin ChemRes 15:6052-61)，提示存在SN-38释放导致功效改善的最佳窗口。因此，目前的数据证明IMMU-132是在肿瘤处比伊立替康更高效地靶向和释放药物的方法。
早期临床研究已经显示在各种实体肿瘤中令人鼓舞的客观响应，并且重要地指示具有比伊立替康治疗好的安全性概况，其中腹泻发生率较低(Starodub等人，2015,ClinCancerRes 21:3870-78)。
总之，IMMU-132(萨希珠单抗戈维替康)是ADC开发的范式转变。它使用中等稳定的接头将7-8个伊可替康的更耐受的活性代谢物SN-38的分子与抗Trop-2抗体缀合。尽管这些看似与超毒性ADC相比具有违反直觉的特征，但非临床研究已经证明IMMU-132非常有效地靶向表达Trop-2的肿瘤，具有显著的功效并且没有明显的毒性。在针对包括胰腺癌、胃癌、TNBC、小细胞和非小细胞肺癌的多种实体肿瘤的早期I/II临床试验中，IMMU-132同样表现出抗肿瘤作用，在这些患者中具有可控的毒性，即使在给药数月后也没有检测到对IgG或SN-38的免疫响应(Starodub等人，2015,Clin Cancer Res21:3870-78)。鉴于Trop-2在如此多种多样的实体肿瘤中的表达升高，IMMU-132继续在临床上进行研究，特别是在对大多数当前治疗策略难以治愈的晚期癌症中继续进行研究。
实施例18.I/II期临床研究的进一步结果
三阴性乳腺癌(TNBC)
继续进行在上述实施例中讨论的I/II期临床试验(NCT01631552)，累计有56名TNBC患者接受10mg/kg治疗。在开始IMMU-132治疗之前，患者群体先前已被广泛治疗，其中用包括紫杉烷治疗的至少2种先验治疗。先前的治疗包括环磷酰胺、阿霉素、卡铂、吉西他滨、卡培他滨、艾日布林、顺铂、阿那曲唑、长春瑞滨、贝伐单抗和他莫昔芬。尽管有该广泛的治疗史，但TNBC患者对IMMU-132响应良好，2名确认有完全响应(CR)，13名有部分响应(PR)且25名疾病稳定(SD)，客观响应率为29％(15/52)(未示出)。使CR的发生率与PR的发生率以及SD的发生率相加，TNBC的治疗导致IMMU-132治疗患者的有利响应率为71％(未显示)。在这个经过大量预治疗的TNBC患者群体中的中位进展时间为9.4个月，迄今为止为2.9至14.2个月。然而，该研究中72％的患者仍在进行治疗。转移性NSCLC
临床试验也正对于患有转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者进行，迄今为止累计有29名可评估的患者，他们接受了8mg/kg或10mg/kg IMMU-132治疗。根据RECIST 1.1标准确定最佳响应(未显示)。在29名患者中，有8名PR和13名SD。NSCLC患者的进展时间显示，21/33(64％)的NSCLC患者表现出PR或SD(未显示)。中位进展时间为9/4个月，范围为1.8至15.5+个月，并且47％的患者仍在接受治疗。确定用8mg/kg或10mg/kg IMMU-132治疗的NSCLC患者的无进展存活(未显示)。中位PFS在8mg/kg下为3.4个月，在10mg/kg下为3.8个月。然而，研究仍在进行，中位无进展存活数可能会有所改善。
转移性SCLC
观察到转移性SCLC患者的可比较结果(未显示)。进展时间(未显示)显示中位数为4.9个月，范围为1.8至15.7+个月，并且7名患者仍在接受IMMU-132治疗。无进展存活(未显示)显示8mg/kg下的中位PFS为2.0个月，并且10mg/kg下的中位PFS为3.6个月。中位OS在8mg/kg下为8.1个月，并且10mg/kg的中位OS尚无法确定。
尿路上皮癌
用8mg/kg或10mg/kg IMMU-132治疗的尿路上皮癌患者获得了相似的结果。对11名可评估患者的最佳响应数据显示6名PR和2名SD(未显示)。进展时间(未显示)显示中位数为8.1个月，范围为3.6个月至9.7+个月。
总之，持续的I/II期临床试验显示，当以所述剂量的ADC施用时，IMMU-132在至少TNBC、NSCLC、SCLC和尿路上皮癌中具有优异的功效。在这些严重预处理且抗性的转移性癌症中出现了优异的治疗作用，而没有诱发可能妨碍临床使用的严重毒性。IMMU-132在患有多种实体癌的严重预治疗患者中显示出可接受的安全概况，并且中位数为2至5次先前治疗。对于3级或更高级别的不良反应，只有中性粒细胞减少症的发病率超过患者人群的20％。该研究进一步证明，可以以治疗剂量向人患者施用重复剂量的IMMU-132，而不会引起干扰宿主抗IMMU-132抗体。这些结果证明IMMU-132用于治疗人患者中各种Trop-2阳性癌症的安全性和实用性。
***
根据以上描述，本领域的技术人员可容易地确定本发明的基本特征，并且在不悖离本发明的精神和范围的情况下，无需进行过度实验即可对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用法和条件。本文引用的所有专利、专利申请和公布以引用的方式并入本文。

Claims (28)

1.一种治疗Trop-2阳性癌症的方法，其包括向患有Trop-2阳性癌症的人患者施用包含SN-38的ADC，所述SN-38与连接到抗TROP-2抗体或其抗原结合片段的接头部分缀合，其中所述患者已经从用检查点抑制剂治疗复发或对用检查点抑制剂治疗难治。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检查点抑制剂是PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述检查点抑制剂选自由MPDL3280A、帕姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗、匹迪丽珠单抗、MDX-1105、度伐鲁单抗、BMS-936559和曲美木单抗组成的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述检查点抑制剂为MPDL3280A。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗Trop-2抗体是hRS7抗体，其包含轻链CDR序列CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO:1)、CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT, SEQ ID NO:3)以及重链CDR序列CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:4)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO:5)和CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:6)。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗Trop-2抗体与包含以下序列的抗体竞争结合Trop-2：轻链CDR序列CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO:1)、CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:2)和CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO:3)以及重链CDR序列CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:4)、CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO:5)和CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:6)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述接头是CL2A并且所述ADC的结构为MAb-CL2A-SN-38
MAb-CL2A-SN-38。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述抗Trop-2抗体是hRS7抗体，其包含轻链CDR序列CDR1(KASQDVSIAVA, SEQ ID NO:1)、CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT, SEQ ID NO:3)以及重链CDR序列CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:4)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO:5)和CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:6)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由结肠直肠癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、食道癌和***癌组成的组。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由三阴性乳腺癌、HER+,ER+,孕酮+乳腺癌、转移性非小细胞肺癌、转移性小细胞肺癌、转移性子宫内膜癌、转移性尿路上皮癌和转移性胰腺癌组成的组。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述ADC以3 mg/kg和18 mg/kg之间的剂量施用。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述剂量选自由3 mg/kg、4 mg/kg、6 mg/kg、7mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、16 mg/kg和18 mg/kg组成的组。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述ADC以8 mg/kg和12 mg/kg之间的剂量施用。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述ADC以8 mg/kg和10 mg/kg之间的剂量施用。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述ADC以10 mg/kg的剂量施用。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤尺寸减小至少15%、至少20%、至少30%或至少40%。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述ADC包含4个或更多个与所述抗体或其抗原结合片段缀合的SN-38分子。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述ADC包含6至8个与所述抗体或其抗原结合片段缀合的SN-38分子。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症为转移性的。
21.根据权利要求20所述的方法，其还包括减小尺寸或消除转移。
22. 根据权利要求7所述的方法，其中在MAb-CL2A-SN-38中SN-38的10-羟基位置是使用‘COR’部分的10-O-酯或10-O-碳酸酯衍生物，其中“CO”是羰基且“R”基团选自(i) N,N-二取代的氨基烷基基团“N(CH3)2-(CH2)n-”，其中n为1-10，并且其中末端氨基基团任选地为季盐形式；(ii) 烷基残基“CH3-(CH2)n-”，其中n为0-10；(iii) 烷氧基部分“CH3-(CH2)n-O-”，其中n为0-10；(iv) “N(CH3)2-(CH2)n-O-”，其中n为2-10；或(v) “R1O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-”，其中R1是乙基或甲基，并且n是值为0-10的整数。
23.根据权利要求1所述的方法，其还包括向所述患者施用至少一种选自由外科手术、外部放射、放射免疫疗法、免疫疗法、化学疗法、反义疗法、干扰RNA疗法、用治疗剂治疗和基因疗法组成的组的其他抗癌疗法。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述治疗剂是药物、毒素、免疫调节剂、第二抗体、第二抗体的抗原结合片段、促凋亡剂、毒素、RNA酶、激素、放射性核素、抗血管生成剂、siRNA、RNAi、化疗剂、细胞因子、趋化因子、前药或酶。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述药物选自由5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类药物、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、***受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR (FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替彼、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、伊德利斯、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、乌拉莫司汀、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱以及ZD1839组成的组。
26. 根据权利要求24所述的方法，其中所述其中所述免疫调节剂选自由细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、***素、成纤维细胞生长因子、促乳激素、胎盘催乳素、OB蛋白、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、***(IGF)、***、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠***相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、白介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、S1因子、IL-1、IL-1 cc、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-25、LIF、kit-配体、FLT-3、血管抑制素、血小板反应蛋白和内皮细胞抑制素组成的组。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述放射性核素选自由11C、13N、15O、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、67Cu、67Ga、67Ga、75Br、75Se、75Se、76Br、77As、77Br、80mBr、89Sr、90Y、95Ru、97Ru、99Mo、99mTc、103mRh、103Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、109Pt、111Ag、111In、113mIn、119Sb、121mTe、122mTe、125I、125mTe、126I、131I、133I、142Pr、143Pr、149Pm、152Dy、153Sm、161Ho、161Tb、165Tm、166Dy、166Ho、167Tm、168Tm、169Er、169Yb、177Lu、186Re、188Re、189mOs、189Re、192Ir、194Ir、197Pt、198Au、199Au、199Au、201Tl、203Hg、211At、211Bi、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、215Po、217At、219Rn、221Fr、223Ra、225Ac、227Th和255Fm组成的组。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述毒素选自由蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素组成的组。
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