TW202035444A - 用於糖蛋白工程的糖苷合成酶變體及其使用方法 - Google Patents

用於糖蛋白工程的糖苷合成酶變體及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明涉及用於糖蛋白工程及/或同質抗體重構的新穎糖苷合成酶。稱為EndoSd-D232M以及EndoSz-D234M的酶變體在一示例性抗體的Fc區的保守N297糖苷化位點處含有聚醣綴合及/或修飾活性。已經證明EndoSd-D232M以及EndoSz-D234M的糖苷合成酶活性可應用於以不同受體為標靶的各種單株抗體，包括但不限於，Globo H、SSEA-4、SSEA-3系列受體 (OBI-888；Globo H神經節苷脂)、Herceptin (Her 2受體)、Perjeta (Her 2受體)，以及Vectibix (EGFR受體)。已經發現mAb-GlcNAc以及mAb-GlucNAc(F)都是EndoSd-D232M以及EndoSz-D234M的合適基質。相關產物OBI-888-G2S2以及Herceptin-G2S2的抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)分析顯示，重構的同質抗體mAb-G2S2具有增加3至26倍的相對活性。

Description

用於糖蛋白工程的糖苷合成酶變體及其使用方法
相關申請的交互引用。本案主張於2018年6月27日提出申請的美國專利申請號62/690,669的優先權，所有這些申請的全部內容透過引用結合於本文。
本發明涉及用於同質(homogenous)抗體工程/重構的糖苷合成酶。EndoSd-D232以及EndoSz-D234突變體在Fc區的保守N297糖苷化位點含有聚醣綴合酶活性。本發明證明EndoSd以及EndoSz突變體的糖苷合成酶活性可應用於以不同受體為標靶的各種單株抗體，包括OBI-888 (Globo H神經節苷脂)、Herceptin (Her 2受體)、Perjeta (Her 2受體)、Erbitux (EGFR受體)、Rituxan (CD20受體)、OBI-898 (SSEA4神經節苷脂)、Vectibix (EGFR受體)、Humira (TNFα不活化)、Keytruda (PD-1)，以及Bavencio (PD-L1)。mAb-GlcNAc以及mAb-GlucNAc(F)都是EndoSd-D232M以及EndoSz-D234M的合適基質。相關產物的抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)分析顯示，重構的同質抗體 (mAb-G2S2)增加了數倍的相對活性。
許多表面碳水化合物在惡性腫瘤細胞中表現。例如，首先分離碳水化合物抗原Globo H (Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)作為神經醯胺連接的醣脂，並於1984年從乳腺癌MCF-7細胞中鑑定。(Bremer E G，等人 (1984年) J Biol Chem 259:14773-14777)。先前的研究還顯示Globo H以及階段特異性胚胎抗原3 (Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1) (stage-specific embryonic antigen 3，SSEA-3，也稱為Gb5)在乳腺癌細胞以及乳腺癌幹細胞上被觀察到 (WW Chang等人 (2008年) Proc Natl Acad Sci USA，105 (33):11667-11672)。此外，SSEA-4 (階段特異性胚胎抗原-4) (Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)已被普遍作為多能人類胚胎幹細胞的細胞表面標記，並已用於分離間質幹細胞並富集神經先驅細胞 (Kannagi R等人 (1983年) EMBO J，2:2355-2361)。這些發現支持Globo系列抗原 (Globo H、SSEA-3，以及SSEA-4)可成為癌症治療的獨特靶標，並可用於指導治療劑有效以癌細胞為標靶。
程序凋亡1 (Program death 1，PD-1)為在T細胞、B細胞或單核細胞上表現的抑制性受體 (Ishida等人 (1992年) EMBO J. 11:3887-2895；Agata等人 (1996年) Int. Immunol. 8:765-772)。PD-L1以及PD-L2為PD-1的配體，已被鑑定出在與PD-1結合時下調T細胞活化與細胞激素分泌(Freeman等人(2000年) J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人(2001年) Nat Immunol 2:261-8)。PD-1與PD-L1或PD-L2的結合導致免疫反應的下調。因此，已經提出阻斷PD-1/PD-L1途徑以減弱針對癌症的中樞及周圍免疫反應。以PD-1與PD-L1途徑為標靶已顯示出超過15種癌症類型的臨床療效，包括黑素瘤、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)、腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)、膀胱癌，以及霍奇金淋巴瘤 (Sharma等人(2015年) Science 348(6230):56-61)。然而，許多患者仍然沒有反應；於某些情況下，患者表現出初始反應但隨時間獲得抗藥性。因此，迫切需要確定聯合治療的抗藥性機制。
已經開發出治療性單株抗體(mAb)用於治療許多疾病，例如癌症、自體免疫，以及傳染性疾病(Adams, G. P.，以及Weiner, L. M. (2005年) Nat. Biotechnol. 23: 1147–1157；Aggarwal, S. R. (2012年) Nat. Biotechnol. 30: 1191–1197；Aggarwal, S. R. (2014年) Nat. Biotechnol. 32:323–330)。對於癌症治療，市場上已發現幾種商業單株抗體。這些單株抗體識別腫瘤細胞表面上的特定生物標記並透過不同機制增強細胞凋亡，例如開啟抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)以及補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)或阻斷訊號途徑。Her 2受體為乳腺癌中最著名的生物標記，這使得羅氏公司能夠開發出兩種相關的單株抗體，Herceptin (曲妥珠單抗)以及Perjeta (帕妥珠單抗)。EGFR受體也是單株抗體發展上著名的靶標。例如，Vectibix (帕尼單抗)以及Erbitux (西妥昔單抗)分別由Amgen公司以及Merck公司開發，以轉移性直腸癌治療為標靶。另外，設計用於識別CD20受體的Rituxan (利妥昔單抗，Roche公司)以及Arzerra (奧法木單抗，GSK公司)通常用於治療非霍奇金B細胞淋巴瘤以及慢性淋巴細胞白血病癌症。最近，台灣浩鼎生技股份有限公司(OBI Pharma, Inc.)正在開發基於神經節苷脂生物標記Globo H以及SSEA-4的OBI-888與OBI-898抗體，這些標記可用於乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌，以及小細胞肺癌(Hakomori, S. I. (2008年) Biochim. Biophys. Acta. 1780: 325–346；Hakomori, S.與Zhang, Y. (1997年) Chem. Biol. 4:97–104；Zhang, S.等人 (1997年) Int. J. Cancer 73: 42–49；Zhang, S.等人(1997年) Int. J. Cancer 73: 50–56.)，但在正常細胞中偵測不到。Erbitux、Rituxan、Arzerra、OBI-888，以及OBI-898透過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體依賴性細胞毒性(CDC)的細胞毒性殺死癌細胞。此外，幾種單株抗體以被開發用於阻斷蛋白質-蛋白質相互作用的功能。例如，Humira (阿達木單抗，AbbVie公司)阻斷TNF-α受體調節自體免疫性疾病、類風濕性關節炎的訊號通路；Keytruda (派姆單抗，Merck公司)阻斷PD-1受體以破壞治療轉移性黑素瘤的癌細胞的保護機制。相較於小分子藥物，單株抗體對標靶細胞更具特異性，對患者的副作用相對較小。這兩個重要特徵已成為對抗各種疾病的有力工具。
單株抗體(monoclonal antibodies，mAb)具有~150kDa的分子量，由兩條重鏈(~50kDa)與兩條輕鏈(~25kDa)所組成，形成由柔性鉸鏈區分開的三個結構域。兩個Fab結構域含有用於鑑定抗原的可變互補決定區(complementarity-determining region，CDR)。一個Fc結構域為具有N-聚醣的恆定區，用於調節抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體依賴性細胞毒性(CDC)兩種細胞毒性(Jefferis, R. (2009年) Nat. Rev. Drug Discoy. 8:226–234)。Fc結構域中的胺基酸N297為保守的N-糖苷化位點，其與異源聚醣類型連接，例如雙觸角(M3、G0F、G1F、G2F、G0、G1，以及G2複合型)以及三觸角(高甘露糖及雜合型)而在各種細胞系統中表現。X射線結構分析結果顯示，Fc聚醣的核心海藻糖阻礙了Fc以及FcγRIIIa之間特定的碳水化合物-碳水化合物相互作用，結果造成結合常數降低了大約100倍(Ferrara, C.等人 (2011年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:12669-12674)，結果降低了細胞殺傷效率。在該產業中最常使用的細胞系統為CHO細胞。CHO細胞通常產生含有主要以G0F、G1F，以及G2F形式的聚醣組合物的單株抗體。由於海藻糖引起的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)結合效率降低，這些聚醣形式限制了單株抗體的活性。儘管已經透過FUT8 (α-1,6-海藻糖基轉移酶8)基因敲除獲得了修飾的CHO細胞系統(Yamane-Ohnuki, N.以及Satoh, M. (2009年) MAbs, 1: 230–236；Yamane-Ohnuki, N.等人(2004) Biotechnol. Bioeng. 87: 614–622)或二等分GlcNAc (N-乙醯葡萄糖胺)轉移酶GnT-III的上調(Umana, P.等人(1999年) Nat. Biotechnol. 17: 176–180)減少單株抗體的聚醣共謀，找到更好且更通用的方法來獲得單株抗體上所需的N-聚醣仍然是很有意義的。此外，亦有報導顯示，去除Fc聚醣將導致抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性喪失 (Kurogochi, M.等人(2015年) PLoS One 10: e0132848)。根據上述觀察結果，可透過附著在Fc區上的N-聚醣類有效地控制單株抗體的細胞毒性。
Fc區的酶促修飾為建立同質單株抗體的解決方案。幾年前，Lai-Xi Wang及其同事透過去除聚醣混合物並結合同質聚醣來嘗試化學酶重構(Huang, W.等人(2012年) J. Am. Chem. Soc. 134: 12308–12318)。幾種內切-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶 (endo-β-N-acetylglycosaminidases，ENGases)已被報導可去除單株抗體上的聚醣混合物。例如，EndoD (Tai, T.等人(1975年) J. Biol. Chem. 250: 8569–8575)、EndoH (Tarentino, A. L.等人(1974年) J. Biol. Chem. 249: 818–824)、EndoLL (Kurogochi, M.等人(2015年) PLoS One 10: e0132848)，以及EndoM (Kadowaki, S.等人(1990年) Agric. Biol. Chem. 54: 97–106)能夠水解具有高甘露糖或末端甘露醣類型的聚醣。EndoS (Collin M與Olsén A. (2001年) EMBO J. 20: 3046–3055)以及EndoSd (Shadnezhad, A.等人(2016年) Future Microbiol 11: 721–736.)具有在Fc結構域上水解非海藻糖苷化以及海藻糖苷化N-聚醣的能力，但不水解高甘露醣類型。迄今，沒有一種訊號內切糖苷酶可以完全水解單株抗體上的所有聚醣類型。最近解決了EndoS晶體結構，其揭示了五個功能域(Trastoy, B.等人(2014年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: 6714–6719)，其中內切糖苷酶結構域為高度保守的，具有適用於位點突變研究的剛性β-桶結構。另一方面，抗體Fc的糖苷合成酶也被報導。EndoD-N322Q (Fan, S. Q.等人(2012年) J. Biol. Chem. 287: 11272–11281)以及EndoM-N175Q (Umekawa, M., Li, C.等人(2010年) J. Biol. Chem. 285: 511–521)僅將短鏈複合型N-聚醣轉移至Fc結構域。 Endo-F3-D165Q (Giddens, J. P.等人(2016年) J. Biol. Chem. 291: 9356–9370)僅將聚醣轉移至海藻糖苷化的Fc結構域。EndoS-D233Q (Huang, W.等人(2012年) J. Am. Chem. Soc. 134: 12308–12318)能夠綴合各種雙觸角複合型，而EndoS2-D184M (Li., T., Tong,等人(2016年) J. Biol. Chem. 291: 16508–16518)具有野生型基質，包括複合型、高甘露糖型，以及雜合型。
本發明涉及來自鏈球菌的內切糖苷酶的選定的變體，其具有/顯示用於合成糖蛋白及/或糖胜肽的改善的酶活性，該糖蛋白及/或糖胜肽包含寬廣範圍的高甘露糖、雜合以及複合型的明確定義的N-聚醣。具體而言，本發明之一個或多個具體實施例還涉及這些酶變體用於治療性抗體的有效聚醣重構，以在Fc結構域形成同質聚醣組合物，以改善其效應子功能之用途。
於本發明中，提供了兩種糖苷合成酶的酶變體，EndoSd-D232M以及EndoSz-D234M，其具有糖苷合成酶活性，能夠產生同質單株抗體重構。除了先前報導的來自壞乳鏈球菌壞乳亞種(Streptococcus dysgalactiae subsp. Dysgalactiae )(NCBI GenBank登錄號：ANI26082.1)的EndoSd之外，我們已在EndoS以及EndoSd序列上透過蛋白質BLAST數據庫鑑定並分離了新的酶。我們從馬鏈球菌獸疫亞種Sz105 (Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus Sz105 ) (NCBI GenBank登錄號：KIS14581.1)中篩選到EndoSz，以作為另一種候選物，儘管其為一種推定的蛋白質。我們根據多序列比對產生了EndoSd以及EndoSz突變體。結果顯示這兩種突變酶具有出乎意料地改善/增強的糖苷合成酶活性，以將雙觸角複合型聚醣綴合至單株抗體。適合綴合的單株抗體獲自/衍生自各種生物標記或不同IgG類型的寬廣範圍標靶。我們證明了OBI-888、Herceptin、Perjeta、Erbitux、Rituxan、OBI-898、Vectibix、Humira、Keytruda，以及Bavencio的綴合結果令人滿意。我們還證明了綴合反應中的酶效率，並比較了相關細胞系統中異質及同質單株抗體之間的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。
SEQ ID NO 1: 名稱：EndoSd-D232M胺基酸序列 生物體：壞乳鏈球菌壞乳亞種(Streptococcus dysgalactiae subsp. Dysgalactiae ) MGTILGTHHDSLISVKAEEKITQVSQTSTSIDDLHYLSENSKKEFKEELSKEKVPEKVKEILSKAQQANKQAQELAEMKVPDKIPMKPLNGPLYGGYFRTWHDKTSDPLEKDKVNSMGELPKEVDLAFVFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDASKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVMIEHDSIPKVNGEASDENLKRSIDVFEEIGKLIGPKGADKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYIDLLLVQVYGSQGEQGEFQNDTKSVTKTPEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEEKAGSGNLWYDINARKDEDTANGINDDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKQIAEKDKQSVKNNRPLISEITDNIFHSNYSVSKTLKTVMLKDKAYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRIIKLDQSVLPANMKPGKDPLETVLETYKKNGKEEPAIIPPVSLTVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGIDAATLTSLEKVDISDNKLDLAPKTENRQIFDVMLSTVNNNAGISEQSIKFDNQKPAGNYPQTYGATNLQLPVRQEKIDLQHQLLFGTITNQGTLINSEADYKTYRNQKIAGRNFVDPDYPYNNFKVSHDNYTVKVTDSTLGTTTDKMLATDKEETYKVDFFSPTDKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIKSENDENAQKVFNGIMEYNPLSFNNKSSIIFEIKDPSLAKYWRLFNDSSKDKKDYIKEAKLEVFTGQLNAEADVKTILEKPDNWVTVSTYSGEEKVFSHSLDNISAKYWRVTVDNKKDQYGYVSLPELQILGYPLPNADTIMKTVTVAKELSQQKDKFPQQLLDESTAKEAVVEASLNSKLFDTGVINTNVEALKNVVDECLAYEKNKETAFKATEDYRAAVNGVKAESVTVEEMAQLKDLIGKAAHLNSKIDAKLADREYDKDLLGLIGELTNITRTVKSFVKHHHHHH
SEQ ID NO 2: 名稱：EndoSz-D234M胺基酸序列 生物體：馬鏈球菌獸疫亞種Sz105 (Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus Sz105 ) MVAILAAQHDSLIRVKAEDKLVQTSPSVSAIDALHYLSENSKKEFKEELSKVEKAQPEKLKEIVSKAQQADKQAKTLAEMKVPEKIPMKPLKGPLYGGYFRTWHDKTSDPAEKDKVNSMGELPKEVDLAFVFHDWTKDYSLFWQELATKHVPTLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDHSGIAEDAQKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVMIERDSIPKVNKEESKEGIERSIQVFEEIGKLIGPKGADKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYIDLLLVQVYGTQGEKGGFDNANHKAVDTMEERWESYSKYIRPEQYMVGFSFYEEKANSGNLWYDVNVEDDTNPNIGSEIKGTRAERYAKWQPKTGGVKGGIFSYGIDRDGVAHPKKNGPKTPDLDKIVKSDYKVSKALKKVMENDKSYELIDQKDFPDKALREAVIAQVGSRRGNLERFNGTLRLDNPDIKSLEGLNKLKKLAKLELIGLSQITKLDSSVLPENIKPTKDTLVSVLETYKNDDRKEEAKAIPQVALTISGLTGLKELNLAGFDRDSLAGIDAASLTSLEKVDLSSNKLDLAAGTENRQILDTMLATVTKHGGVSEKTFVFDHQKPTGLYPDTYGTKSLQLPVANDTIDLQAKLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQEQEIAGHRFVDSSYDYKAFAVTYKDYKIKVTDSTLGVTDHKDLSTSKEETYKVEFFSPINSTKPVHEAKIVVGEEKTMMVNLAEGATIIGGDADPTNAKKVFDGLLNNDTTTLSTSNKASIIFELKEPGLVKHWRFFNDSKISKADYIKEAKLEAFVGHLEDSSKVKDSLEKSTEWVTVSDYSGEAQEFSQPLNNIGAKYWRITIDNKKSQYGYVSLPELQIIGHRLPEAATVMTTMAAAEELSQQKDKFSQEQLKELEVKVAALKAALDNKMFNADTINASFADVKAYIDKLLADAAGKKTLGKATKEAQPVATDAKEKAESENPKADHHHHHH
SEQ ID NO 3: 名稱：EndoSd-D232M核酸序列 生物體：壞乳鏈球菌壞乳亞種(Streptococcus dysgalactiae subsp. Dysgalactiae ) ATGGGCACCATCCTGGGTACCCACCACGACAGCCTGATCAGCGTGAAGGCGGAGGAAAAAATTACCCAAGTTAGCCAAACCAGCACCAGCATTGACGATCTGCACTACCTGAGCGAAAACAGCAAGAAAGAGTTCAAAGAGGAGCTGAGCAAGGAGAAAGTGCCGGAAAAGGTTAAAGAGATCCTGAGCAAAGCGCAGCAAGCGAACAAGCAGGCGCAAGAGCTGGCGGAAATGAAGGTGCCGGACAAAATTCCGATGAAGCCGCTGAACGGTCCGCTGTATGGTGGCTACTTTCGTACCTGGCACGACAAAACCAGCGATCCGCTGGAAAAGGACAAAGTTAACAGCATGGGCGAACTGCCGAAAGAGGTGGATCTGGCGTTCGTTTTTCACGACTGGACCAAAGATTATAGCCTGTTCTGGAAAGAGCTGGCGACCAAGCACGTGCCGAAGCTGAACAAACAGGGTACCCGTGTTATCCGTACCATTCCGTGGCGTTTTCTGGCGGGTGGCGACAACAGCGGTATTGCGGAAGATGCGAGCAAGTACCCGAACACCCCGGAGGGTAACAAAGCGCTGGCGAAGGCGATTGTGGACGAATACGTTTATAAATACAACCTGGACGGTCTGGATGTGATGATCGAGCACGATAGCATTCCGAAAGTTAACGGCGAAGCGAGCGACGAGAACCTGAAGCGTAGCATCGATGTGTTCGAGGAAATCGGTAAACTGATTGGTCCGAAAGGCGCGGACAAGAGCCGTCTGTTTATTATGGACAGCACCTATATGGCGGATAAGAACCCGCTGATCGAACGTGGCGCGCCGTATATTGACCTGCTGCTGGTGCAGGTTTACGGTAGCCAGGGCGAGCAGGGTGAATTCCAAAACGATACCAAAAGCGTTACCAAGACCCCGGAGGAACGTTGGCAGGGCTATAGCAAATACATCCGTCCGGAGCAATATATGATTGGTTTCAGCTTTTACGAGGAAAAGGCGGGTAGCGGCAACCTGTGGTACGACATCAACGCGCGTAAAGACGAAGATACCGCGAACGGCATCAACGACGATATTACCGGTACCCGTGCGGAGCGTTATGCGCGTTGGCAGCCGAAAACCGGTGGCGTGAAGGGTGGCATCTTTAGCTACGCGATTGACCGTGATGGTGTTGCGCACCAGCCGAAGCAAATCGCGGAAAAGGACAAACAAAGCGTGAAAAACAACCGTCCGCTGATCAGCGAGATTACCGATAACATTTTCCACAGCAACTATAGCGTGAGCAAGACCCTGAAAACCGTTATGCTGAAGGACAAAGCGTACGACCTGATCGATGAAAAAGACTTTCCGGATAAAGCGCTGCGTGAGGCGGTGATGGCGCAGGTTGGCACCCGTAAGGGTGACCTGGAACGTTTCAACGGCACCCTGCGTCTGGATAACCCGGCGATCCAGAGCCTGGAGGGTCTGAACAAGTTTAAGAAACTGGCGCAACTGGACCTGATTGGCCTGAGCCGTATCATTAAACTGGATCAAAGCGTGCTGCCGGCGAACATGAAGCCGGGTAAAGACCCGCTGGAAACCGTTCTGGAGACCTACAAGAAAAACGGCAAAGAGGAGCCGGCGATCATTCCGCCGGTTAGCCTGACCGTTAGCGGTCTGACCGGTCTGAAAGAACTGGACCTGAGCGGCTTCGATCGTGAGACCCTGGCGGGTATCGATGCGGCGACCCTGACCAGCCTGGAAAAGGTGGACATTAGCGATAACAAACTGGACCTGGCGCCGAAGACCGAGAACCGTCAGATCTTCGATGTGATGCTGAGCACCGTTAACAACAACGCGGGTATCAGCGAGCAGAGCATTAAATTTGACAACCAAAAGCCGGCGGGCAACTATCCGCAAACCTACGGTGCGACCAACCTGCAGCTGCCGGTTCGTCAAGAAAAAATCGACCTGCAGCACCAACTGCTGTTCGGCACCATCACCAACCAGGGTACCCTGATTAACAGCGAGGCGGATTATAAAACCTACCGTAACCAAAAGATTGCGGGTCGTAACTTCGTGGACCCGGATTATCCGTACAACAACTTTAAAGTTAGCCACGACAACTATACCGTGAAGGTTACCGATAGCACCCTGGGCACCACCACCGACAAAATGCTGGCGACCGATAAAGAGGAAACCTACAAGGTGGACTTCTTTAGCCCGACCGATAAGACCAAAGCGGTTCACACCGCGAAAGTGATCGTTGGCGACGAAAAGACCATGATGGTGAACCTGGCGGAGGGTGCGACCGTTATCAAAAGCGAGAACGATGAAAACGCGCAGAAGGTTTTCAACGGTATTATGGAATATAACCCGCTGAGCTTCAACAACAAGAGCAGCATCATTTTTGAGATCAAAGACCCGAGCCTGGCGAAGTATTGGCGTCTGTTCAACGATAGCAGCAAAGACAAGAAAGATTACATCAAGGAAGCGAAACTGGAAGTGTTTACCGGTCAGCTGAACGCGGAAGCGGACGTTAAAACCATTCTGGAGAAGCCGGATAACTGGGTGACCGTTAGCACCTATAGCGGCGAGGAAAAGGTGTTTAGCCACAGCCTGGACAACATCAGCGCGAAATACTGGCGTGTGACCGTTGACAACAAGAAAGATCAGTATGGCTACGTTAGCCTGCCGGAGCTGCAAATCCTGGGTTACCCGCTGCCGAACGCGGATACCATTATGAAAACCGTGACCGTTGCGAAGGAACTGAGCCAGCAAAAGGACAAATTCCCGCAGCAACTGCTGGATGAGAGCACCGCGAAGGAAGCGGTGGTTGAGGCGAGCCTGAACAGCAAACTGTTTGACACCGGTGTGATCAACACCAACGTTGAAGCGCTGAAGAACGTGGTTGATGAGTGCCTGGCGTATGAAAAGAACAAAGAGACCGCGTTCAAGGCGACCGAAGACTACCGTGCGGCGGTGAACGGTGTTAAAGCGGAGAGCGTGACCGTTGAGGAAATGGCGCAGCTGAAAGATCTGATCGGCAAGGCGGCGCACCTGAACAGCAAAATTGACGCGAAGCTGGCGGATCGTGAATACGACAAAGATCTGCTGGGCCTGATCGGCGAGCTGACCAACATTACCCGTACCGTGAAAAGCTTTGTTAAGTGA
SEQ ID NO 4: 名稱：EndoSz-D234M核酸序列 生物體：馬鏈球菌獸疫亞種Sz105 (Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus Sz105 ) ATGGTTGCGATCCTGGCGGCGCAACACGATAGCCTGATTCGTGTGAAGGCGGAGGACAAACTGGTGCAGACCAGCCCGAGCGTTAGCGCGATTGATGCGCTGCACTACCTGAGCGAAAACAGCAAGAAAGAATTCAAAGAGGAACTGAGCAAGGTTGAAAAAGCGCAACCGGAGAAGCTGAAAGAAATCGTGAGCAAGGCGCAGCAAGCGGACAAGCAGGCGAAAACCCTGGCGGAGATGAAGGTTCCGGAAAAAATTCCGATGAAGCCGCTGAAAGGCCCGCTGTATGGTGGCTACTTTCGTACCTGGCACGATAAAACCAGCGACCCGGCGGAGAAGGATAAAGTGAACAGCATGGGCGAGCTGCCGAAAGAAGTGGACCTGGCGTTCGTTTTTCACGATTGGACCAAGGACTATAGCCTGTTCTGGCAAGAACTGGCGACCAAACACGTTCCGACCCTGAACAAGCAGGGCACCCGTGTGATCCGTACCATTCCGTGGCGTTTTCTGGCGGGTGGCGATCACAGCGGTATCGCGGAGGACGCGCAGAAATACCCGAACACCCCGGAAGGCAACAAGGCGCTGGCGAAAGCGATTGTGGATGAGTACGTTTATAAGTACAACCTGGACGGTCTGGATGTTATGATCGAACGTGACAGCATTCCGAAGGTGAACAAAGAGGAAAGCAAAGAGGGTATCGAACGTAGCATTCAGGTTTTCGAGGAAATCGGCAAGCTGATTGGTCCGAAGGGCGCGGATAAAAGCCGTCTGTTTATCATGGATAGCACCTATATGGCGGACAAGAACCCGCTGATCGAGCGTGGTGCGCCGTATATTGACCTGCTGCTGGTGCAGGTTTACGGTACCCAGGGCGAAAAAGGTGGCTTCGATAACGCGAACCACAAGGCGGTTGACACCATGGAGGAACGTTGGGAGAGCTATAGCAAATACATCCGTCCGGAACAATATATGGTGGGTTTCAGCTTTTACGAGGAAAAGGCGAACAGCGGCAACCTGTGGTACGACGTGAACGTTGAGGACGATACCAACCCGAACATCGGTAGCGAGATTAAAGGCACCCGTGCGGAACGTTATGCGAAGTGGCAGCCGAAAACCGGTGGCGTTAAGGGTGGCATCTTTAGCTACGGTATTGACCGTGATGGCGTGGCGCACCCGAAGAAAAACGGTCCGAAAACCCCGGACCTGGATAAGATCGTGAAAAGCGATTATAAAGTTAGCAAAGCGCTGAAGAAAGTTATGGAGAACGACAAGAGCTACGAACTGATCGACCAAAAGGATTTCCCGGACAAAGCGCTGCGTGAGGCGGTGATTGCGCAGGTTGGTAGCCGTCGTGGCAACCTGGAACGTTTTAACGGTACCCTGCGTCTGGATAACCCGGACATCAAAAGCCTGGAGGGCCTGAACAAACTGAAGAAACTGGCGAAGCTGGAACTGATCGGTCTGAGCCAAATTACCAAGCTGGATAGCAGCGTTCTGCCGGAGAACATTAAGCCGACCAAAGACACCCTGGTGAGCGTTCTGGAAACCTACAAAAACGACGATCGTAAGGAAGAGGCGAAAGCGATCCCGCAGGTGGCGCTGACCATTAGCGGTCTGACCGGCCTGAAGGAGCTGAACCTGGCGGGTTTCGACCGTGATAGCCTGGCGGGTATTGATGCGGCGAGCCTGACCAGCCTGGAGAAAGTGGATCTGAGCAGCAACAAGCTGGACCTGGCGGCGGGTACCGAAAACCGTCAAATTCTGGACACCATGCTGGCGACCGTGACCAAACACGGTGGCGTTAGCGAGAAGACCTTCGTGTTTGATCACCAGAAACCGACCGGTCTGTATCCGGACACCTACGGCACCAAGAGCCTGCAGCTGCCGGTTGCGAACGATACCATCGACCTGCAAGCGAAACTGCTGTTCGGTACCGTGACCAACCAGGGCACCCTGATCAACAGCGAAGCGGACTATAAGGCGTACCAGGAGCAAGAAATTGCGGGCCACCGTTTCGTTGATAGCAGCTATGACTACAAAGCGTTTGCGGTGACCTACAAGGATTACAAGATCAAGGTTACCGACAGCACCCTGGGTGTGACCGATCACAAAGACCTGAGCACCAGCAAAGAGGAGACCTATAAAGTTGAGTTCTTTAGCCCGATCAACAGCACCAAACCGGTGCACGAAGCGAAGATTGTGGTTGGCGAGGAAAAGACCATGATGGTTAACCTGGCGGAGGGCGCGACCATCATTGGTGGCGACGCGGACCCGACCAACGCGAAGAAAGTGTTCGATGGCCTGCTGAACAACGACACCACCACCCTGAGCACCAGCAACAAAGCGAGCATCATTTTTGAGCTGAAAGAACCGGGTCTGGTGAAGCACTGGCGTTTCTTTAACGATAGCAAGATCAGCAAAGCGGACTACATTAAAGAGGCGAAACTGGAAGCGTTCGTTGGTCACCTGGAAGATAGCAGCAAGGTGAAAGACAGCCTGGAGAAAAGCACCGAATGGGTGACCGTTAGCGATTATAGCGGCGAGGCGCAGGAATTTAGCCAACCGCTGAACAACATCGGCGCGAAGTACTGGCGTATCACCATTGACAACAAGAAAAGCCAGTATGGTTACGTTAGCCTGCCGGAGCTGCAAATCATTGGTCATCGTCTGCCGGAAGCGGCGACCGTGATGACCACCATGGCGGCGGCGGAGGAACTGAGCCAGCAAAAGGATAAATTCAGCCAGGAGCAACTGAAGGAGCTGGAAGTGAAAGTTGCGGCGCTGAAGGCGGCGCTGGATAACAAAATGTTCAACGCGGACACCATCAACGCGAGCTTTGCGGACGTTAAAGCGTACATTGATAAGCTGCTGGCGGACGCGGCGGGTAAGAAAACCCTGGGCAAAGCGACCAAAGAGGCGCAGCCGGTGGCGACCGATGCGAAGGAAAAAGCGGAGAGCGAAAACCCGAAGGCGGACTAA
一方面，本發明提供了糖苷合成酶變體，其中該變體具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列及/或其結構同源性，且針對寬廣範圍的高甘露糖、雜合以及複合型的N-聚醣之海藻糖苷化以及非海藻糖苷化的GlcNAc受體表現出改善的轉糖苷化活性，其中該變體能夠在海藻糖苷化以及非海藻糖苷化的GlcNAc受體上有效轉移活化的寡糖供體，以形成新的糖胜肽或糖蛋白或治療性抗體的同質糖型。EndoSz以及EndoSd突變體列於下表中：
EndoSz突變體 EndoSd突變體
D234E D232E
D234R D232R
D234H D232H
D234M D232M
D234V D232V
D234L D232L
D234F D232F
D234S D232S
D234T D232T
D234Q D232Q
T183Q T181Q
D232Q D230Q
D280Q D278Q
S281Q S279Q
T282Q T280Q
於某些具體實施例中，該抗體為OBI-888 (抗Globo H單株抗體)。示例性OBI-888如PCT專利公開(WO2015157629A2以及WO2017062792A1)，專利申請中所述，其內容透過引用整體併入。
於某些具體實施例中，該抗體為OBI-898 (抗SSEA4單株抗體)。示例性OBI-898如PCT專利公開 (WO2017172990A1)，專利申請中所述，其內容透過引用整體併入。
於另一方面，提供了使用糖苷合成酶變體製備工程化糖蛋白之方法。
於另一方面，提供了透過使用糖苷合成酶變體製備之同質抗體群。
N-糖苷化為最複雜的轉譯後修飾之一，其經常導致聚醣結構的顯著異質性，包括高甘露糖、雜合以及複合型，這取決於重組表現系統。市售可得的治療性抗體通常以作為糖形式的混合物存在，這對於這些抗體各自的治療活性不是最好的。最近，糖苷化工程已經引起人們對控制Fc糖苷化以提高功效的關注。
典型的IgG由兩個抗原結合片段(Fab)組成，其透過柔性區連接至恆定區(Fc)。Fab結構域負責抗原識別，而Fc結構域的Asn297處的N-聚醣與效應細胞上的各Fcγ受體(例如，FcγRIIIa以及FcγRIIb)以及活化效應功能的補體的C1q組成分相互作用，包括抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體依賴性細胞毒性 (CDC)。幾乎所有治療性抗體在該保守的天冬醯胺殘基(N297)的每個同質二聚體Fc結構域上被N-糖苷化。這些N-連接的聚醣產生超過30種不同的糖形式，且為具有相當結構異質性的典型雙觸角複合型，其中核心七糖可以核心海藻糖(Fuc)、二等分N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、末端半乳糖(Gal)，以及末端唾液酸 (Sia) 差異化修飾。N-聚醣的組合物可以影響Fc結構域的構象，因此，調節抗體的穩定性、藥物代謝動力學特徵、免疫原性、效應功能、抗體調節的發炎，以及補體活化。例如，核心海藻糖的缺失以及二等分GlcNAc部分的附著顯著增強了抗體對FcγIIIa受體(FcγRIIIa)在效應細胞上的親和力，導致更有效地消除標靶。此外，末端α-2,6-唾液酸化聚醣(其為抗體與靜脈內免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)的次要組成分)為增強抗發炎特性的優化結構。
內切糖苷酶為來自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes )的至少18種糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)的家族，且最近成為治療性抗體的糖苷化工程的關注焦點。這些酶可以催化人類IgG的N-連接聚醣核心中的兩個N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)之間的β-1,4鍵的水解。另外，該酶去除IgG Fc結構域的複合型聚醣。
本發明內容之具體實施例涉及選擇的糖苷合成酶變體，其顯示出顯著的轉糖苷化活性以將高甘露糖、雜合或複合型的廣泛N-聚醣從活化的寡糖噁唑胺轉移至海藻糖苷化或非海藻糖苷化的GlcNAc-胜肽、蛋白質，或產物水解很少或可忽略不計的IgG。該新穎糖苷合成酶以驚人的效率作用以提供具有各種確定的糖型的同質糖苷化的糖胜肽、糖蛋白，以及治療性抗體及其Fc片段。更進一步地，本發明之具體實施例可提供糖基改造的抗體，其具有增強的效應功能，例如FcγIIIA結合以及抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)等，以及藥理學性質。本發明之具體實施例還允許快速研究治療性抗體的不同Fc糖苷化對其效應子功能之影響。
根據本發明之具體實施例，新穎的糖苷合成酶包含選自SEQ ID NOs: 1-2序列的一序列。這些突變體顯示出意外改善的轉糖苷化活性以及降低水解活性。因此，它們可以催化活化的寡糖供體有效轉移至核心GlcNAc-受體，其可為海藻糖苷化的或非海藻糖苷化的。
根據某些具體實施例，糖苷合成酶可與SEQ ID NOs: 1-2之一序列具有至少約80%的序列同一性(例如，80%、85%、90%、95%或98% (或在所列出的兩個數字中的任何一個之間的值)，並具有所需的轉糖苷化活性，或其具有轉糖苷化活性的片段。定義
必須注意的是，如本文以及所附之申請專利範圍中所使用的，單數形式「一」、「一個」以及「該」包括複數指代，除非上下文另有明確說明。
如本文所用，「聚醣」乙詞係指多醣、寡糖或單醣。聚醣可為糖殘基的單體或聚合物，並且可為直鏈或支鏈的。聚醣可包括天然糖殘基(例如，葡萄糖、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯神經胺酸、半乳糖、甘露糖、海藻糖、己糖、***糖、核糖、木糖等)及/或修飾的糖(例如，2'- 氟代核糖、2'-去氧核糖、磷酸甘露糖、6'磺基N-乙醯葡萄糖胺等)。
如本文所用，「海藻糖」、「核心海藻糖」，以及「核心海藻糖殘基」等詞可互換使用，係指與N-乙醯葡萄糖胺連接的α-1,6-位海藻糖。
如本文所用，「N-聚醣」、「N-連接聚醣」、「N-連接糖苷化」、「Fc聚醣」，以及「Fc糖苷化」等詞可互換使用，係指透過N-乙醯葡萄糖胺 (GlcNAc)連接的N-連接寡糖，其與含Fc多胜肽中天冬醯胺殘基的醯胺氮連接。「含Fc多胜肽」乙詞係指包含Fc區的多胜肽，例如抗體。
如本文所用，「糖苷化模式」以及「糖苷化圖譜」等詞可互換使用，係指從糖蛋白或抗體中酶促或化學釋放的N-聚醣物種的特徵「指紋」，然後進行分析。 對於其碳水化合物結構，例如，使用LC-HPLC或MALDI-TOF MS等。參見，例如，Current Analytical Chemistry，第1卷第1期(2005年)，第28-57頁；其透過引用整體併入本文。
如本文所用，「糖工程化的Fc」乙詞於本文中使用時係指Fc區上的N-聚醣已經酶促或化學改變或改造。如本文所用之「Fc糖工程化」乙詞係指用於製備糖基改造的Fc的酶促或化學過程。
在Fc區的糖苷化圖譜的上下文中，「同質的」、「均勻的」、「均勻地」以及「同源性」等詞可互換使用，並且意指由一種期望的N-聚醣物種代表的單一糖苷化模式，幾乎沒有或沒有微量的前驅物N-聚醣，包括例如少於95%、96%、97%、98%、99%的起始前驅物材料。
表1. 列出了四類胺基酸。
側鏈 胺基酸
鹼性 精胺酸(R)、離胺酸(K)，或組胺酸(H)
中性 半胱胺酸(C)、酪胺酸(Y)、甘胺酸(G)、麩醯胺酸(Q)、蘇胺酸(T)、天門冬醯胺(N)，或絲胺酸(S)
疏水性 異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、色胺酸(W)、脯胺酸(P)、纈胺酸(V)、***酸(F)，或丙胺酸(A)
酸性 天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)
如本文所用，「IgG」、「IgG分子」、「單株抗體」、「免疫球蛋白」以及「免疫球蛋白分子」等詞可互換使用。
如本文所用，「Fc受體」或「FcR」等詞描述了結合抗體Fc區的受體。較佳的FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳的FcR為結合一IgG抗體 (一γ受體)的FcR，包括FcγRI、FcγRII，以及FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體以及可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (一「活化受體」)以及FcγRIIB (一「抑制受體」)，其具有相似的胺基酸序列，主要在其細胞質結構域中不同。活化受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有一基於免疫受體酪胺酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITIM)(參閱M. in Daëron (1997年) Annu. Rev. Immunol. 15:203-234的回顧)。FcR的回顧請參閱RavetcH以及Kinet (1991年) Annu. Rev. Immunol 9:457-92；Capel等人(1994) Immunomethods 4：25-34；Haas等人(1995年) J. Lab. Clin. Med. 126:330-41)。本文之「FcR」乙詞涵蓋其他FcR，包括將來鑑定的FcR。該術語還包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人(1976年) J. Immunol. 117:587，以及Kim等人 (1994年) J. Immunol. 24:249)。
如本文所用之「效應子功能」乙詞係指由抗體Fc區與Fc受體或配體相互作用產生的生物化學事件。示例性的「效應子功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)；吞噬；下調細胞表面受體(如，B細胞受體；BCR)等。可以使用本領域已知的各種測定來評估這種效應子功能。
如本文所用，「抗體依賴性細胞調節的細胞毒性」或「ADCC」等詞係指細胞毒性的形式，其中分泌的Ig結合到存在於某些細胞毒性細胞(例如，自然殺手(Natural Killer，NK)細胞、嗜中性白血球細胞，以及巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)，使這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的標靶細胞，隨後以細胞毒素殺死該標靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞，且對於這種殺傷是絕對必需的。調節抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的原代細胞，自然殺手(NK)細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII以及FcγRIII。RavetcH與Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991年)，第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表現。為了評估目標分子的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性，進行體外抗體依賴性細胞毒性(ADCC)分析，例如可進行美國專利號5,500,362或5,821,337中所述之測定。用於此類測定的有用效應細胞包括周圍血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)以及自然殺手(NK)細胞。或者/另外，可在體內評估目標分子的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性，例如在動物模型中，例如Clynes等人(1998年)於PNAS (USA) 95:652-656所公開的動物模型。
IgG的每個CH2結構域上的複合N-連接寡糖對於Fc區的結構以及因此與Fc受體的相互作用是非常重要的(Krapp等人，2003年；Woof與Burton，2004年)。IgG-Fc結構域的寡糖鏈含有幾個N-乙醯基-葡萄糖胺(GlcNAc)以及甘露糖(Man)殘基，最終含有半乳糖(Gal)以及海藻糖(Fuc)殘基以及唾液酸(Sia或NANA用於N-乙醯神經胺酸)。含有或不含有al-6 Fuc的GlcNAc與Asn297連接。GlcNAcpi-4與第一個GlcNAc連接。然後發現一manβ1-4，其上連著兩個Manα1-6以及Manα1-3臂。兩個臂都含有另外的GlcNAcβ1-2，其可讓一Galβ1-4附著於其上或不附著。因此，碳水化合物鏈可含有0、1或2個半乳糖殘基，分別定義為G0、G1，以及G2糖型。發生進一步的變化，包括二等分GlcNAcβ1-4的存在以及一個或兩個末端半乳糖殘基與唾液酸或甚至Galɑ1-3殘基的封端。以內切糖苷酶促切割Fc-聚醣導致Fc區變形，因此IgG與Fcγ受體的結合顯著降低 (Allhorn等人，2008年)。儘管它們具有37%的序列同一性，但EndoS以及EndoS2催化人類IgG的N-連接聚醣核心中的兩個N-乙醯葡萄糖胺 (GlcNAc)之間的β-1,4鍵的水解。然而，除了複合型聚醣外，相較於EndoS，EndoS2可更大程度地水解雜交及低聚甘露糖結構 (Sjögren等人，2015年)。
自從1980年代引入第一種抗體治療以來，臨床試驗中有超過240種治療性抗體，該領域正在穩定擴大 (Chan與Carter 2010年)。IgG-Fc聚醣在抗體功能上的作用在治療性單株抗體的發展領域中引起了極大的關注。因此，為了提高治療性抗體的功效，主要關注的是轉向設計與選擇的Fcγ受體特異性相互作用的Fc-聚醣 (Sondermann等人2013年；Bournazos等人2014年；Monnet等人2014年；Quast與Lünemann2014年)。一些顯著影響效應功能的重要聚醣修飾包括： i)缺少與還原端GlcNAc殘基連接的核心海藻糖殘基導致對FcγRIIIa的親和力增加，進而增加抗體依賴性細胞毒性(Iidaet等人，2006年)； ii) IgG上的富含唾液酸的聚醣，據稱透過增加與樹突狀細胞以及巨噬細胞上的DC-SIGN受體的相互作用來增加IgG的抗發炎反應 (Anthony等人2008年；Anthony與Ravetch 2010年；Pincetic等人2014年)；iii) 相較於其親本對應物，具有二等分GlcNAc誘導強抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。最近用於控制IgG的Fc-糖苷化狀態的生物技術工具的改善促進了具有預定義糖形式的治療性抗體的開發。因此，本發明之糖苷合成酶在胜肽、蛋白質以及目標抗體的糖工程領域中具有很大的進步，以連接廣泛的高甘露糖、雜合以及複合型的N-聚醣用於功能及結構研究。
於一具體實施例中，合成的聚醣噁唑啉包含具有下式的高甘露糖、雜合及複合型的多種N-聚醣：
Figure 02_image001
其中，R1 為經由一β-1,4鍵聯的-H或N-乙醯葡萄糖胺，R2 與R3 相同或不同，且獨立地選自由下列所組成之群組：
Figure 02_image003
另一方面，本發明提供用於核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化GlcNAc-受體的轉糖苷化的示例性糖苷合成酶。其中該核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化的GlcNAc-受體包含核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化的GlcNAc-胜肽、蛋白質，以及IgG Fc結構域或其片段。
於另一方面，本發明提供核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化的GlcNAc-胜肽、蛋白質，以及IgG或IgG-Fc片段之重構方法，其中該方法包含：提供胜肽/蛋白質/抗體-GlcNAc受體或Fc片段，並在壞乳鏈球菌壞乳亞種(Streptococcus dysgalactiae subsp. Dysgalactiae )與馬鏈球菌獸疫亞種Sz105 (Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus Sz105 )糖苷合成酶的催化作用下與活化的寡糖供體反應，進而大體上、基本上，及/或純化預先存在的胜肽、蛋白質，以及具有異質糖苷化狀態的單株抗體的糖型。
於另一方面，本發明提供了使用糖苷合成酶進行治療性IgG或其Fc片段的聚醣重構之方法，其中該方法包含： A. 以內切糖苷酶(例如，野生型EndoS2)與或不與細菌α海藻糖苷酶一起處理攜帶異源N-聚醣的天然或重組核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化治療性IgG或IgG-Fc片段，以水解兩個還原性末端GlcNAc殘基之間的鍵，以形成核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化的GlcNAc-IgG受體； B. 將活化的寡糖供體形式的多種預定義的寡糖構建單元轉移至核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化的GlcNAc-IgG，以使用壞乳鏈球菌壞乳亞種與馬鏈球菌獸疫亞種Sz105 糖苷合成酶透過轉糖苷化作用重構天然β1,4鍵聯，進而將預定義的寡糖附著以重構核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化的IgG或其Fc片段。
於另一方面，本發明提供海藻糖苷化或非海藻糖苷化的糖工程化抗體或抗原結合片段的組合物，其包含在Fc區的每個位點具有相同N-聚醣結構的IgG分子，其中N-聚醣為高甘露糖、雜合以及複合型，並且選自由下列所組成之群組：
Figure 02_image005
其中R1 為經由一β-1,4鍵聯的-H或N-乙醯葡萄糖胺，R2 與R3 相同或不同，且獨立地選自由下列所組成之群組：
Figure 02_image007
另一方面，相較於未修飾的抗體，本發明提供了具有出乎意料地改善的效應功能的糖基改造抗體，例如與FcγIIIA結合、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，以及調節免疫反應。
本發明之另一方面的特徵在於一醫藥組合物，其包含本文所述之糖工程化抗體的組合物以及用於治療一患者的癌症的一醫藥上可接受之載體。
如本文所用，癌症的實例包括，但不限於，與Globo系列抗原相關及/或表現的癌症，包括，但不限於，Globo H、SSEA-4、SSEA-3；與Her-2相關及/或表現的癌症；與EGFR CD20、TNF-α、PD-1以及PD-L1受體相關及/或表現的癌症。
透過本文描述之方法治療的個體可為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括，但不限於，農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠，以及大鼠。需要治療的人類個體可為患有癌症、有風險或懷疑患有癌症的人類患者，包括，但不限於，肉瘤、皮膚癌、白血病、淋巴瘤、腦癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、結腸癌、腎臟癌、子宮頸癌、卵巢癌，以及***癌。可透過常規醫學檢查鑑定患有癌症的個體。具體而言，該癌症為表現癌症的Globo系列抗原。
本發明設想了選自由下列抗體所組成之群組的糖苷化工程： Herceptin (曲妥珠單抗)、Perjeta (帕妥珠單抗)、Erbitux (西妥昔單抗)、Rituxan (利妥昔單抗)、Vectibix (帕尼單抗)、Humira (阿達木單抗)、Keytruda (派姆單抗)，及Bavencio (阿維魯單抗)。醫藥配方
包含本發明抗體的治療製劑可透過將具有所需純度的抗體與一種或多種任選的生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合來製備用於儲存 (Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A. Ed. (1980年))，以水溶液、凍乾或其他乾燥製劑的形式。在所用的劑量與濃度下，可接受的載體、賦形劑或穩定劑對接受者無毒，且包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸，以及其他有機酸等緩衝劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸以及甲硫胺酸；防腐劑(如，十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁基或芐醇；對羥基苯甲酸烷酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多胜肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸，麩醯胺、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸，或離胺酸；單醣、雙醣，以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖，或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬錯合物(例如，鋅-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。
本文的製劑還可含有一種以上的活性化合物，這是所治療的具體適應症所必需的，包括但不限於，那些互補活動不會互相影響者。這些分子合適地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分也可包埋在例如透過凝聚技術或透過界面聚合製備的微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊以及聚-甲基丙烯酸酯微膠囊，在膠體藥物輸送系統中(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒，以及奈米膠囊)或在粗滴乳液中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A. Ed. (1980年)。
用於體內施用的製劑必須為無菌的。這可透過無菌過濾膜過濾而容易地完成。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有本發明免疫球蛋白的固體疏水聚合物的半透性基質，這些基質為成形製品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的實例包括，聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯 (美國專利號3,773,919)，L-麩胺酸以及γ-乙基-L-麩胺酸的共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOT™ (由乳酸-乙醇酸共聚物以及醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然例如乙烯-乙酸乙烯酯以及乳酸-乙醇酸的聚合物能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當包封的免疫球蛋白長時間保留在體內時，它們可能由於暴露於37o C的水分而變性或聚集，導致生物活性的喪失以及免疫原性的可能變化。可以根據所涉及的機制設計合理的策略以實現穩定。例如，如果發現聚集機制為透過硫代-二硫化物交換形成分子間S-S鍵，則可透過修飾巰基殘基，從酸性溶液中凍乾，控制水分含量來實現穩定化，使用適當的添加劑，開發特定的聚合物基質組合物。
預凍乾製劑中的抗體量為在考慮所需劑量體積、給藥方式等的情況下確定的。當選擇的蛋白質為完整抗體(全長抗體)時，約2 mg/mL至約50 mg/mL，較佳約5 mg/mL至約40 mg/mL，最佳約20-30 mg/mL為示例性的起始蛋白質濃度。蛋白質通常存在於溶液中。例如，蛋白質可以存在於pH緩衝溶液中，pH為約4-8，較佳約5-7。示例性緩衝劑包括組胺酸、磷酸鹽、Tris、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽，以及其他有機酸。緩衝液濃度可為約1 mM至約20 mM，或約3 mM至約15 mM，這取決於例如緩衝液以及製劑的所需等滲性(例如，重構製劑)。較佳的緩衝劑為組胺酸，如下所示，其可以具有凍乾保護性質。琥珀酸鹽被證明為另一種有用的緩衝劑。
將凍乾保護劑加入預凍乾製劑中。於較佳的具體實施例中，凍乾保護劑為非還原糖，例如蔗糖或海藻糖。預凍乾製劑中凍乾保護劑的量通常使得在重構時，所得製劑是等滲的。然而，高滲重構製劑也可能是合適的。另外，凍乾保護劑的量不能太低，使得在凍乾時發生不可接受量的蛋白質降解/聚集。當凍乾保護劑為糖(例如，蔗糖或海藻糖)且蛋白質為抗體時，預凍乾製劑中的示例性凍乾保護劑濃度為約10 mM至約400 mM，較佳約30 mM至約300 mM， 最佳約50 mM至約100 mM。
為每種蛋白質及凍乾保護劑組合選擇蛋白質與凍乾保護劑的比例。在抗體作為所選蛋白質以及糖(例如，蔗糖或海藻糖)作為用於產生具有高蛋白質濃度的等滲重構製劑的凍乾保護劑的情況下，凍乾保護劑與抗體的莫耳比可為約100至約1500莫耳凍乾保護劑比上1莫耳抗體，較佳約200至約1000莫耳凍乾保護劑比上1莫耳抗體，例如，從約200至約600莫耳凍乾保護劑比上1莫耳抗體。
在本發明之較佳具體實施例中，已發現需要將界面活性劑加入預凍乾製劑中。或者，或另外，可將界面活性劑加入凍乾製劑及/或重構製劑中。示例性界面活性劑包括非離子界面活性劑，例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆 (例如，泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；十二烷基-、肉荳蔻醯基-、亞油基-，或硬脂基-磺基甜菜鹼；十二烷基-、肉荳蔻醯基-、亞油基-或硬脂基-肌胺酸；亞油酸-、肉荳蔻基-或十六烷基-甜菜鹼；月桂醯胺丙基-、椰油醯胺丙基-、亞油醯胺丙基-、肉荳蔻醯胺丙基-、棕櫚醯丙基-，或異硬脂醯胺丙基-甜菜鹼 (例如月桂醯胺丙基)；肉荳蔻醯胺基丙基-、棕櫚醯基丙基-或異硬脂醯胺丙基-二甲基胺；甲基椰油醯基鈉，或甲基油基-牛磺酸二鈉；以及MONAQUAT™系列(Mona Industries公司，帕特森市，紐澤西州，美國)、聚乙二醇、聚丙二醇，以及乙二醇與丙二醇的共聚物 (例如泊洛沙姆(Pluronics)、PF68等)。加入的界面活性劑的量使得它減少重構蛋白質的聚集並使重構後顆粒的形成最小化。例如，界面活性劑可以以約0.001-0.5%，較佳約0.005-0.05%的量存在於預凍乾製劑中。
於本發明之某些具體實施例中，凍乾保護劑(例如，蔗糖或海藻糖)以及填充劑(例如，甘露醇或甘胺酸)的混合物用於製備預凍乾製劑。填充劑可以允許生產均勻的凍乾餅，其中沒有過多的氣泡等。
其它醫藥上可接受的載體、賦形劑或穩定劑，例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed. (1980年)所述者可以包括在預凍乾製劑(及/或凍乾製劑及/或重構製劑)中，條件是其不會不利地影響製劑的所需特性。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在使用的劑量與濃度下對接受者無毒，包括；額外的緩衝劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸以及甲硫胺酸； 螯合劑如EDTA；金屬錯合物(例如鋅-蛋白質錯合物)； 可生物降解的聚合物，如聚酯；及/或成鹽抗衡離子，如鈉。
本文所述之醫藥組合物及製劑較佳是穩定的。「穩定的」製劑/組合物為其中的抗體在儲存時基本上保持其物理及化學穩定性以及完整性的製劑/組合物。用於測量蛋白質穩定性的各種分析技術在本領域中是可獲得的，並且回顧於Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee編輯，Marcel Dekker公司，紐約市，紐約州，公開(1991年)，以及Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993年)。可以在選定的溫度下測量穩定性達選定的時間段。
用於體內施用的製劑必須為無菌的。在凍乾及重構之前或之後，透過無菌過濾膜過濾容易地實現。或者，可以透過在約120o C下，例如，約30分鐘，對除蛋白質外的成分進行高壓滅菌來完成整個混合物的滅菌。
在將蛋白質、凍乾保護劑，以及其他任選組成分混合在一起後，將製劑凍乾。許多不同的冷凍乾燥器可用於此目的，例如Hull50® (Hull公司，美國)或GT20® (Leybold-Heraeus公司，德國)冷凍乾燥器。透過冷凍製劑並隨後在適於初步乾燥的溫度下從冰凍內容物中昇華冰來完成冷凍乾燥。在這種條件下，產品溫度低於配方的共晶點或塌陷溫度。通常，初級乾燥的擱板溫度在約-30至25o C的範圍內(假設產品在初級乾燥期間保持冷凍)在合適的壓力下，通常為約50至250毫托(mTorr)。保持樣品的容器(例如，玻璃小瓶)的配方、尺寸，以及類型以及液體體積將主要決定乾燥所需的時間，其可為幾小時至幾天 (例如40-60小時)。二級乾燥階段可在約0-40o C下進行，主要取決於容器的類型與大小以及所用蛋白質的類型。然而，在此發現可能不需要二次乾燥步驟。例如，凍乾的整個除水階段的擱板溫度可為約15-30o C (例如，約20o C)。二次乾燥所需的時間及壓力將是產生合適的凍乾餅的時間及壓力，這取決於例如溫度與其它參數。二次乾燥時間取決於產品中所需的殘留水分含量，通常需要至少約5小時 (例如，10-15小時)。壓力可以與初級乾燥步驟中使用的壓力相同。冷凍乾燥條件可根據配方與小瓶尺寸而變化。
於某些情況下，可能需要將容器中的蛋白質製劑凍乾，其中要進行蛋白質的重構以避免轉移步驟。在這種情況下，容器可為例如3、5、10、20、50或100 cc的小瓶。作為一般提議，凍乾將產生凍乾製劑，其中其水分含量小於約5%，較佳小於約3%。
在期望的階段，通常當需要將蛋白質給予患者時，可以稀釋劑重構凍乾製劑，使得重構製劑中的蛋白質濃度為至少50 mg/mL，例如，約50 mg/mL至約400 mg/mL，更佳約80 mg/mL至約300 mg/mL，最佳約90 mg/mL至約150 mg/mL。重構製劑中的這種高蛋白質濃度被認為在預期皮下遞送重構製劑時特別有用。然而，對於其他給藥途徑，例如靜脈內給藥，可能需要較低濃度的重構製劑中的蛋白質 (例如，重構製劑中約5-50 mg/mL，或約10-40 mg/mL蛋白質)。於某些具體實施例中，重構製劑中的蛋白質濃度顯著高於預凍乾製劑中的蛋白質濃度。例如，重構製劑中的蛋白質濃度可為約2-40倍，較佳為凍乾前製劑的3-10倍，最佳為3-6倍 (例如，至少3倍或至少4倍)。
重構通常在約25o C的溫度下進行。確保完全水合，儘管可以根據需要使用其他溫度。重構所需的時間取決於例如稀釋劑的類型、賦形劑以及蛋白質的量。示例性稀釋劑包括無菌水、抑菌性注射用水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、pH緩衝溶液(例如，磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液，或右旋糖溶液。稀釋劑任選含有防腐劑。上文已經描述了示例性防腐劑，其中芳族醇如苯甲醇或酚醇為較佳的防腐劑。透過評估不同的防腐劑濃度與蛋白質的相容性以及防腐功效測試來確定所用防腐劑的量。例如，若防腐劑為芳族醇(例如，苯甲醇)，它可以約0.1-2.0%，較佳約0.5-1.5%，但最佳約1.0-1.2%的量存在。較佳地，重構的製劑每個小瓶具有少於6000個顆粒，其尺寸 > 10 μm。治療應用
本文描述的糖基改造的抗體可用於治療患有癌症的患者。治療方法包含對患者施用有效量的本文所述之糖基改造的抗體或醫藥組合物。癌症的實例包括，但不限於，與Globo系列抗原相關及/或表現的癌症，該系列包括，但不限於，Globo H、SSEA-4、SSEA-3；與Her-2相關及/或表現的癌症；與EGFR受體相關及/或表現的癌症。
於某些具體實施例中，該癌症為乳腺癌。
此外，本文所述之糖基改造的抗體可用於治療患有自體免疫疾病或發炎性疾病的患者。治療方法包含對一患者施用一有效量的本文所述之糖基改造的抗體或醫藥組合物。自體免疫疾病或炎性疾病的實例包括，但不限於，類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、韋格納病、發炎症性腸病、特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)、自體免疫性血小板減少症、多發性硬化症、牛皮癬、IgA腎病、IgM多發性神經病、重症肌無力、血管炎、糖尿病、雷諾症候群、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、胃炎、橋本氏甲狀腺炎、僵直性脊椎炎、C型肝炎相關的冷球蛋白血管炎、慢性局灶性腦炎、大皰性類天皰瘡、血友病A、膜增生性腎小球腎炎、成人與青少年皮肌炎、成人多發性肌炎、慢性蕁麻疹、原發性膽汁性肝硬化、視神經脊髓炎、葛瑞夫茲甲氏狀腺功能亢進症、大皰性類天皰瘡、膜增生性腎小球腎炎、查格-施特勞斯症候群、氣喘、銀屑病關節炎、皮炎、呼吸窘迫症候群、腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、濕疹、動脈粥樣硬化、白血球黏附缺陷、青少年發病型糖尿病、萊特氏症候群、畢賽氏症候群、溶血性貧血、特應性皮炎、韋格納肉芽腫病、歐門氏症候群、慢性腎功能衰竭、急性傳染性單核細胞增多症、愛滋病，以及皰疹相關疾病、全身性硬化症、乾燥症候群與腎小球腎炎、皮肌炎、ANCA、再生障礙性貧血、自體免疫性溶血性貧血 (autoimmune hemolytic anemia，AIHA)、因子VIII缺乏症、血友病A、自體免疫性嗜中性白血球細胞減少症、Castleman氏症候群、古巴斯捷氏症候群、實體器官移植排斥、移植物抗宿主病 (graft versus host disease，GVHD)、自體免疫性肝炎、淋巴間質性肺炎(HIV)、閉塞性細支氣管炎(非移植)、格林-巴利症候群、大血管炎、巨細胞(Takayasu's)動脈炎、中血管血管炎、川崎病，以及結節性多動脈炎。
於某些具體實施例中，自體免疫疾病或炎性疾病為類風濕性關節炎。
在這些治療方法中，原代糖基改造抗體可單獨給藥或與第二種治療劑如第二種抗體，或化學治療劑或免疫抑制劑聯合給藥。實施例
將透過以下具體實施例進一步說明本發明之具體實施例。本領域技術人員將理解，這些具體實例僅用於說明，並且在不脫離本發明範圍的情況下可以進行其他修改及變化。例如，本發明之酶變體可用於糖苷化工程化任何糖蛋白或糖胜肽，包括抗體。本文描述的具體實例使用抗CD20抗體。然而，本領域技術人員將理解，也可以類似方式使用其他糖蛋白或抗體。材料
根據PCT專利公開(WO2015157629A2以及WO2017062792A1)中公開的先前方法製備抗Globo H的單株抗體OBI-888。根據我們在PCT專利公開 (WO2017172990A1)中公開的先前方法製備抗SSEA4的單株抗體OBI-898。商業抗體Herceptin (曲妥珠單抗)、Perjeta (帕妥珠單抗)、Erbitux (西妥昔單抗)、Rituxan (利妥昔單抗)、Vectibix (帕尼單抗)、Humira (阿達木單抗)、Keytruda (派姆單抗)，或Bavencio (阿維魯單抗)購自：
Herceptin Perjeta Erbitux Rituxan Vectibix Humira Keytruda Bavencio
品牌 羅氏 羅氏 MerckSerono 羅氏 Amgen AbbVie MSD Ireland 默克
批號 N7208B06 B3066 H0239B09 245011 H0229B13 1080265 83347XH04 7302614A13 04150132280583
雙天線聚醣、唾液酸化複合型N-聚醣 (NSCT)，購自Tokyo Chemical Industry公司(東京，日本，D4065)，NSCT-噁唑啉根據先前報導合成 (Noguchi, M.等人(2012年) Helvetica chimica acta 95:1928-1936)。根據以前的論文製備了其他聚醣 (M3、G0，以及G2)以及Bf-α-海藻糖苷酶(Tsai, T.I.等人 (2017年) ACS Chem. Biol. 12:63-72； Fairbanks, A. J. (2013年) Pure Appl. Chem. 85, 1847-1863)。實施例 1 ： EndoSd-D232M 以及 EndoSz-D234M 及突變體的選殖、過度表現，以及純化
來自壞乳鏈球菌壞乳亞種(ANI26082.1)以及馬鏈球菌獸疫亞種Sz105 (KIS14581.1)的EndoSd以及EndoSz基因用於本研究。這兩種酶在N端缺少訊號胜肽。為了增強轉糖苷化活性，我們將EndoSd以及EndoSz蛋白質序列與EndoS-D233Q比對 (Huang, W.等人 (2012年) J. Am. Chem. Soc. 134:12308-12318)並且發現EndoSd以及EndoSz的相對位置分別為D232以及D234。我們決定改變相對位置D為M。因此，合成編碼EndoSd-D232M的第20-1067個胺基酸以及EndoSz-D234M的第20-1011個胺基酸的基因，並以5'-BamHI與3'-XhoI限制性位點次選殖到pGEX-4T-1中。為了純化目的，我們在EndoSd-D232M以及EndoSz-D234M的C端***額外的六個組胺酸用於Ni-NTA親和性管柱。透過定點誘變產生本研究中使用的其他突變體。基於突變位點設計相關引子。以EndoSd-D232M以及EndoSz-D234M作為模板載體，透過Pfu DNA聚合酶 (Protech公司)擴增突變的載體。然後，以DpnI (Promega公司)消化模板載體(甲基化DNA)2小時 (37o C)。將突變的載體轉化到DH5α勝任細胞中進行選擇。透過DNA測序確認所有突變體。
將所有載體轉化到BL21 (DE3)中，並在含有胺芐青黴素抗生素 (50 μg/mL)的TB培養基中於37o C培養。透過0.2 mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導蛋白質，同時細胞密度OD600達到0.6。5小時後，透過離心 (BACKMAN公司/JLA-8.1, 9000g) 15分鐘，於25o C收穫細胞。以含有50 mM MOPS pH 7.0，300 mM NaCl以及10 mM咪唑(100 mL緩衝液/1L細胞沉澱)的洗滌緩衝液重新懸浮細胞，以用於均質器(NanoLyzer N-10)以破碎細胞。於4o C下離心60分鐘/12,000 g (BACKMAN/JA-10)並去除沉澱後，將上清液與Ni-NTA樹脂(羅氏公司)混合，並於4o C溫和搖動整夜以完全結合蛋白質。將樹脂加載到開口管柱上並以洗滌緩衝液洗滌未結合的蛋白質直至未結合的蛋白質的濃度小於1 mg/mL(由Bradford測定法定義，Thermo公司)。以含有50 mM MOPS pH 7.0，300 mMNaCl以及250 mM咪唑的流洗緩衝液流洗結合的蛋白質。將流洗的級分透析至含有50 mM MOPS pH 6.7的儲存緩衝液，並使用TFF (Millipore實驗室規模)透過30kDa截留匣濃縮。透過SDS-PAGE以及Braford分別測定最終樣品用於檢測分子量(MW)與濃縮物。實施例 2 ：透過 EndoS-WT 與 Bf-α- 海藻糖苷酶對 OBI-888 進行去糖苷化以產生 mAb-GlcNAc 以及 mAb-GlcNAc(F)
將OBI-888與Herceptin單株抗體(10 mg)與EndoS (10 μg)在25 mM檸檬酸鈉緩衝液 (pH6.5)以及100 mM NaCl中於37o C作用4小時。透過4-12%梯度SDS-PAGE分析Fc N-聚醣的完全切割。
透過在Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)中在37o C下與EndoS-WT (10 μg)以及Bf-α-海藻糖苷酶(10 mg)一起作用16小時以消化OBI-888 (10 mg)的N-聚醣以生成OBI-888-GlcNAc。商業抗體Herceptin (曲妥珠單抗)、Perjeta (帕妥珠單抗)、Erbitux (西妥昔單抗)、Rituxan (利妥昔單抗)、Vectibix (帕尼單抗)、Humira (阿達木單抗)、Keytruda (派姆單抗)，以及Bavencio (阿維魯單抗) (10 mg)使用與OBI-888相同的程序，除了溫度在30o C之外。透過4-12%梯度SDS-PAGE分析Fc N-聚醣的完全切割。 海藻糖苷化的mAb-GlcNAc (mAbs-GlcNAc-F)僅在類似條件下透過EndoSz野生型產生，作用時間為4小時。實施例 3 ：聚醣對 mAb-GlcNAc 以及 mAb-GlcNAc-F 的甘胺酸糖苷化
在一般程序中，分別透過EndoSz-D234M (167 μg)或EndoSd-D232M (1002 μg)，將mAb-GlcNAc/mAb-GlucNAc-F (5 mg)與聚醣-氧雜以莫耳比1:20以及1:150 (mAb-GlcNAc:NSCT-氧雜)，在MOPS緩衝液(50mM，pH 6.7)，至終體積為500 μL，於30o C作用20分鐘。根據實驗目的及設計進行了一些細微的修改 (參見結果部分)。HLPC用於監測轉糖苷化效率。實施例 4 ：去糖苷化以及均質單株抗體的純化
將反應混合物應用於以PBS緩衝液預平衡的HiTrap Protein-A HP (5 mL，GE公司)預包裝管柱。透過兩步pH梯度，PBS (pH 7.4)緩衝液以及甘胺酸-HCl (pH 5.0)緩衝液洗滌未結合的污染物，每個步驟具有五倍的管柱體積。 使用檸檬酸鈉 (pH3.0)流洗結合的抗體。將流洗的級分立即以Tris-HCl緩衝液 (1M，pH9.0)中和至pH7.4，並透析至含有50 mM MOPS (pH6.7)的mAb-GlcNAc(F)以及5 mM組胺酸與150 mM Nac1的mAb-G2S2的儲存緩衝液中，分別與30kDa截止透析匣(Thermo公司)在4o C下過夜。透過Amicon離心膜(30 kDa截止值，Millipore公司)濃縮所有樣品，並在4o C [mAb-GlcNAc(F)]或-80o C [mAb-G2S2 (F)]下儲存。實施例 5 ：糖胜肽的 LC/MS/MS 分析
首先透過10 kDa截留的Amicon Ultra-0.5裝置處理樣品用於緩衝液交換為ddH2 O。將樣品在0.1% RapiGest SF溶液/50 mM三乙基碳酸氫銨 (triethylammonium bicarbonate，TEABC)中變性，以5 mM二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)於60o C還原30分鐘，然後在室溫下以15 mM碘乙醯胺在黑暗中進行烷基化30分鐘。將得到的樣品以胰蛋白酶 (胰蛋白酶：樣品蛋白= 1:30)在50 mM TEABC中於37o C下進行溶液內消化整夜。消化後，將樣品以0.5% (v/v)三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)酸化，並在37o C下作用45分鐘。將酸處理的樣品於4o C、14000 rpm下離心30分鐘以沉澱水解RapiGest SF副產物。以Thermo Q-Exactive質譜儀 (Thermo Scientific公司)以及Ultimate 3000 RSLC系統 (Dionex公司)分析樣品。使用C18管柱 (Acclaim PepMap RSLC，75 μm x 150 mm，Thermo公司)進行LC分離，流動相A：0.1%FA (甲酸)以及流動相B：95% ACN (乙腈)/0.1% FA (甲酸)，且表2列出了分析溶劑梯度。
表2. LC的溶劑梯度
時間(分鐘) 流動相A% 流動相B% 流速(µL/分鐘)
0 99 1 0.25
5.5 99 1 0.25
45 75 25 0.25
48 40 60 0.25
50 20 80 0.25
60 20 80 0.25
65 99 1 0.25
70 99 1 0.25
在m/z範圍為300至2000的條件下進行全MS掃描，並選擇來自MS掃描的十個最強離子用於MS/MS掃描。實施例 6 ：透過 HPLC 的酶促綴合測定
透過HPLC (Waters e2695)使用2.1 x 150 mm UPLC糖蛋白醯胺管柱(Waters公司)在兩種不同緩衝液 (緩衝液A，ddH2 O/0.3% v/v HFIP (1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇)，0.1% v/v TFA；緩衝液B，乙腈，0.3% v/v HFIP，0.1%v/v TFA)下分析糖苷合成酶活性，梯度如表3所示。
表3. HPLC的溶劑梯度
時間 流速(mL/分鐘) A (%) B (%)
0.00 0.20 15 85
0.50 0.20 15 85
1.00 0.20 33 67
17.0 0.20 38.6 61.4
20.0 0.20 38.6 61.4
21.0 0.20 15 85
30.0 0.20 15 85
在實驗之前，將管柱以50%乙腈以及50% ddH2 O洗滌30分鐘，並以15%緩衝液A以及85%緩衝液B平衡，直至系統壓力穩定。在透過注入水空白確保基線穩定性之後，透過2 μL樣品注射開始該過程。在處理持續時間(29分鐘)中，在65o C的管柱溫度和5o C的樣品盤溫度下，流速為0.2 mL/分鐘。實施例 7 ：工程化抗體的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 分析
使用螢光素酶報告細胞透過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)報導生物測定完整套組(Promega公司，G7015)分析抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。選擇相關細胞株MCF7W (OBI-888)、SKBR-3 (Herceptin、Perjeta)、BxPC3 (Erbitux)以及Raji (Rituxan)進行分析。細胞株使用一樣的程序。將標靶細胞接種在96孔細胞培養盤上，並於37o C下在潮濕的5% CO2 培養箱中作用整夜。以連續稀釋的同質抗體以及相應的抗體標準品替換培養基，並進行三重複實驗。在每個孔中，添加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)生物測定效應細胞。效應細胞與標靶細胞的比例為3：1。我們進行誘導6小時，然後加入Bio-Glo螢光素酶測定緩衝液。15分鐘後，使用微量盤式分析儀 (SpectraMax L，Molecular Devices公司，Sunnyvale，加州)測定發光(相對光單位，relative light unit，RLU)。透過相對光單位 (RLU) (誘導)與RLU (無抗體對照)的比率計算發光誘導的倍數變化。透過繪製x (濃度，μg/mL) -y (誘導倍數變化)並將數據擬合到PRISM 6軟體的4PL非線性回歸模型中以確定EC50 。使用Gen5微量盤式分析儀以及Imager軟體(BioTek Instruments公司)透過平行線分析估計相對效力。實施例 8 ： Herceptin 的切割及綴合
由CHO細胞產生的抗體總是在Fc的N297位置上含有異源聚醣。為了產生同質單株抗體並增強抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、聚醣切割，以及轉糖苷化的酶促修飾為均質平台中必不可少的步驟 (圖1)。對於聚醣切割，據報導EndoSd-WT水解雙觸角聚醣，但它不是一般的幾丁質酶 (Shadnezhad, A.等人 (2016年) Future Microbiol 11:721-736)。為了說明EndoSz-WT的能力，它用於水解天然Herceptin並檢測N-聚醣譜。結果顯示EndoSz-WT可以水解雙觸角雜合體以及高甘露糖聚醣。透過EndoSz-WT以及α-海藻糖苷酶在N297上產生 > 99% Herceptin，僅有一個N-乙醯葡萄糖胺(Herceptin-GlcNAc) (圖2)。然而，對於含有糖苷化Fab的單株抗體，我們組合了另外的酶EndoH或EndoM (Shadnezhad, A.等人 (2016年) Future Microbiol 11:721-736；Kadowaki, S.等人 (1990年) Agric. Biol. Chem. 54:97-106)，在完全除去聚醣的裂解步驟中。
ENGases還具有帶有適當突變的聚醣綴合功能 (Huang, W.等人 (2012年) J. Am. Chem. Soc. 134: 12308–12318； Li, T., Tong等人 (2016年) J. Biol. Chem. 291: 16508–16518)。我們已經建立了具有醯胺管柱的HPLC方法，用於精確監測轉糖苷化過程。如圖3中所示的實施例，天然Herceptin的保留時間為12.5分鐘。在EndoSz-WT和α-海藻糖苷酶切割後，將Herceptin與一種GlcNAc (Herceptin-GlcNAc)的保留時間轉移至11.4分鐘，並透過完整質量分析計算分子量MW = 145,572Da。在噁唑啉唾液酸化複合型N-聚醣 (NSCT-氧雜)與Herceptin-GlcNAc (由EndoSz-D234M證實)的轉糖苷化步驟中，值得注意的是該管柱可以清楚地識別半糖苷化Herceptin (Herceptin-1N-G2S2)以及完全糖苷化的Herceptin (Herceptin-2N-G2S2)，而這在SDS-PAGE中是無法區分的。發現Herceptin-1N-G2S2的保留時間為12.6分鐘，分子量 = 147,574 Da，而Herceptin-2N-G2S2的保留時間為13.9分鐘，分子量 = 149,576 Da。HPLC方法能夠應用於所有單株抗體。因此，我們使用HPLC測定進一步研究。實施例 9 ： EndoSz-D234M 以及 EndoSd-D232M 的轉糖苷化研究
轉糖苷化為均質平台中決定同質單株抗體質量的最重要步驟。根據先前的報導 (Li, T., Tong等人 (2016年) J. Biol. Chem. 291: 16508–16518)，EndoS2使用的D184M突變具有高轉糖苷化活性。我們首先透過多序列比對產生EndoSz-D234M以及EndoSd-D232M用於轉糖苷化研究(圖4)。通常，較高的糖比率將產生較高的綴合效率。然而，在產業使用中，降低糖量以節省成本並在合理的時間範圍內進行處理是優化該過程的目標。我們使用Herceptin-GlcNAc以及NSCT-氧雜作為研究模型以評估EndoSz-D234M以及EndoSd-D232M在60分鐘內的轉糖苷化活性，並預期形成 > 90% Herceptin-2N-G2S2。
從NSCT-氧雜/Herceptin莫耳比為40：1開始，以EndoSz-D234M獲得 > 90% Herceptin-2N-G2S2。降低NSCT-氧雜/Herceptin莫耳比為30：1，在10分鐘內達到 > 90% Herceptin-2N-G2S2。使用20：1的NSCT-氧雜/Herceptin比例，Herceptin-2N-G2S2在5分鐘時達到89.31%，在10分鐘時達到91.85%，且在去糖苷化之前保持20分鐘(圖5A)。使用10：1的NSCT-氧雜/Herceptin (莫耳比)，在5分鐘時獲得62.61%的Herceptin-2N-G2S2，在10分鐘時獲得61.48%並開始去糖苷化。為了確定NSCT-氧雜使用完全，將NSCT-氧雜/Herceptin的量增加至15：1 (莫耳比)。在5分鐘時獲得80.8%的Herceptin-2N-G2S2，並在10分鐘時開始去糖苷化。因此，以EndoSz-D234M酶進行轉糖苷化的最終條件是NSCT-氧雜：抗體 = 20：1 (莫耳比)，反應時間為20分鐘。
EndoSz-D234M的時間依賴圖(圖5A)清楚地說明了酶的行為。其為一種效率酶，它快速結合Fc以及綴合的聚醣到Fc的N297位置，因為我們看到在5分鐘內Herceptin-GlcNAc幾乎降低至0%並且發現了大部分完全糖苷化的抗體。然而，高效轉糖苷化酶也有助於水解活性。在所有小徑中，發生去糖苷化，同時反應達到轉糖苷化裂合的峰值效率並停留一段時間 (20分鐘)，這顯示控制該過程中的時間框架的重要性。值得注意的是，數據顯示Herceptin-2N-G2S2的百分比降低，伴隨著Herceptin-1N-G2S2的主要百分比增加以及Herceptin-GlcNAc的較小百分比，這表示酶優先選擇水解反應中的標靶。
相較之下，將EndoSz-D234M的最終轉糖苷化條件應用於EndoSd-D232M酶則顯示出不一致的結果。EndoSd-D232M以20：1的莫耳比 (NSCT-氧雜/抗體)僅產生46.06% Herceptin-2N-G2S2，其表現出更好的EndoSz-D234M的糖苷合成酶活性。為了獲得更高的完全糖苷化抗體，增加量的EndoSd-D232M以及NSCT-氧雜是增強轉糖苷化效率的策略。透過增加酶量五倍，結果太差而不能滿足我們預期的效率 (> 90%)，僅產生60% Herceptin-2N-G2S2。因此，我們嘗試將NSCT-氧雜量增加至80：1 (莫耳比)，並得到在80-90% Herceptin-2N-G2S2的範圍內不穩定的結果。最後，以150：1 (莫耳比)的NSCT-氧雜得到穩定且可重複的數據。時間依賴圖 (圖5B)顯示EndoSd-D232M緩慢地將NSCT-氧雜轉移至N297 (Fc區)，儘管使用了更大量的基質。在5分鐘內，Herceptin-1N-G2S2 (~50%)的量大於Herceptin-2N-G2S2 (~40%)。Herceptin-2N-G2S2在10分鐘時達到80%，在20分鐘時達到94%。在60分鐘內未發現去糖苷化。
除了使用Herceptin-GlcNAc作為受體，我們還研究了海藻糖苷化Herceptin-GlcNAc (Herceptin-GlcNAc-F)的轉糖苷化活性，其可能適用於抗體-藥物偶聯(Antibody-Drug-Conjugation，ADC)。使用前述的最佳轉糖苷化條件，分別透過EndoSz-D234M以及EndoSd-D232M獲得94.29%以及94.75% Herceptin-2N-G2S2F (表4)。已經證明兩種酶在海藻糖苷化基質上具有轉糖苷化活性。
表4. EndoSz-D234M以及EndoSd-D232M在不同受體中的轉糖苷化結果。
酶 受體 GlcNAc(F) 1N-G2S2 2N-G2S2
EndoSz-D234M Herceptin-GlcNAc Herceptin-GlcNAc-F 3.35% 1.72% 4.8% 4.00% 91.85% 94.29%
EndoSz-D232M Herceptin-GlcNAc Herceptin-GlcNAc-F 0% 0% 2.11% 3.17% 97.88% 94.75%
總之，EndoSz-D234M具有比EndoSd-D232M更好的轉糖苷化活性。EndoSz-D234M穩定產生> 90% Herceptin-2N-G2S2 (Herceptin-2N-G2S2F)，莫耳比僅為20：1 (NSCT-氧雜：抗體)，而EndoSd-D232M需要7.5倍的基質。實施例 10 ： EndoSz 以及 EndoSd 突變的轉糖苷化研究
先前報導的幾個突變位點，如EndoS-D233Q以及EndoS2-D184M可增加聚醣的轉糖苷化活性 (Huang, W.等人(2012年) J. Am. Chem. Soc. 134: 12308–12318； Li, T., Tong等人(2016年) J. Biol. Chem. 291: 16508–16518)。最近，Shivatare等人報導了EndoS2-T138Q的突變比EndoS2-D184M提高活性 (Shivatare, S.S.等人(2018年) Chem. Commun. 54, 6161-6164)。根據多序列比對(圖4)，選擇EndoSz的等效位置T183、D232、D234、D280、S281，以及T282，以及EndoSd的T181、D230、D232、D278、S279，以及T280作為定點誘變調查的標靶，其中EndoSz D234與EndoSd D232位點由幾種不同類型產生，包括正/負電荷以及極/非極性。使用先前描述的最佳條件測定轉糖苷化活性。
EndoSz突變體的活性測定結果 (圖6A)顯示，EndoSz-D234M具有最高活性 (設定為100%)，且EndoSz-D234Q (99.9%)、EndoSz-D234S (98.8%)，以及D234F (98.6%)具有競爭性高活性。相較之下，EndoSz-D234R (4.9%)以及EndoSz-D234H (4.5%)活性較低。EndoSz野生型也具有些微的轉糖苷化活性 (24.3%)。除D234位置外，相較於EndoSz-D234M，EndoSz-T183Q (89.1%)、EnodSz-D232Q (31.4%)、EndoSz-D280Q (34.0%)、EndoSz-S281Q (12.9%)，以及EndoSz-T282Q (16.3%)沒有顯著增加的轉糖苷化活性。
在EndoSd突變體中 (圖6B)，EndoSd-D232M (設定為100%)、EndoSd-D232S (100.8%)，以及EndoSd-D278Q (108.0%)具有同樣高的轉糖苷化活性，而EndoSd-D232R (9.2%)以及EndoSd-D232H (8.1%)活性低。EndoSd野生型具有相對高的轉糖苷化活性 (84%)。
總之，顯示EndoSz-D234M以及EndoSd-D278Q對Herceptin-GlcNAc表現出相對更好的轉糖苷化活性，以在Fc區產生具有NSCT-氧雜的同質Herceptin。實施例 11 ： EndoSz-D234M 對各種糖的綴合研究
設計均質平台以綴合Herceptin的Fc區上的各種聚醣。透過更有效的酶EndoSz-D234M將聚醣，M3、G0以及G2用於研究。結果顯示所有聚醣成功綴合到Fc區上，莫耳比為20：1 (NSCT-氧雜：抗體)。除M3以外，G0與G2達到> 90%完全糖苷化的Herceptin (表5)。
表5.EndoSz-D234M在具有不同聚醣的不同受體中的轉糖苷化結果。
受體 糖苷類型 GlcNAc(F) 1N- 聚醣 2N- 聚醣
Herceptin-GlcNAc M3 (40eq) G0 G2 1.11% 0.91% 0.61% 6.51% 2.58% 4.52% 92.37% 96.50% 94.87%
Herceptin-GlcNAc-F M3F G0F G2F 0.62% 0.00% 0.21% 4.95% 2.45% 2.64% 94.44% 97.55% 97.14%
M3在5分鐘時能夠獲得78%完全糖苷化的Herceptin並且開始去糖苷化。為了優化綴合速率，將M3增加至30：1 (莫耳比)以在去糖苷化之前的第10分鐘獲得86.3%的結果，並且對於90%的完全糖苷化的Herceptin嘗試增加至40：1 (莫耳比)。與M3綴合的最終條件為40：1，反應時間為10分鐘，得到92.37%完全糖苷化的Herceptin。均質平台不僅可以應用於Herceptin-GlcNAc，還可以應用於Herceptin-GlcNAc-F以綴合Fc區上的各種聚醣並具有高於90%綴合效率的結果。實施例 12 ：各種抗體的轉糖苷化作用
均質平台為建立同質單株抗體的強大過程。選擇幾種其他單株抗體用於EndoSz-D234M的綴合研究，包括OBI-888、Perjeta、Erbitux、Rituxan、OBI-898、Vectibix、Humira、Keytruda、Bavencio。在NSCT-氧雜與抗體的條件為20：1 (莫耳比)的條件下，結果證明了均質平台的有效性 (圖7)。完全糖苷化的單株抗體的百分比為OBI-888-G2S2：87.57%，Perjeta-G2S2：92.49%，Erbitux-G2S2：87.92%，Rituxan-G2S2：97.57%，OBI-898-G2S2：89.73%，Vectibix-G2S2：86.12%，Humira-G2S2：93.68%，Keytruda-G2S2：75.81%，Bavercio-G2S2：90.73%。
為了評估同質聚醣對不同單株抗體的影響，我們選擇了五種抗體用於抗體依賴性細胞毒性(ADCC)生物測定 (圖7B)。顯然，透過與原始單株抗體比較，增加了同質單株抗體的EC50 。特別是OBI-888增加了26倍，具有最佳的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)改善。
本發明公開了選擇的糖苷合成酶變體，其顯示出優異的轉糖苷化活性，具有廣泛的N-聚醣，包括高甘露糖、雜合以及複合型。
於較佳的具體實施例中，高甘露糖、雜合以及複合型的N-聚醣為活性噁唑啉形式。
於一些具體實施例中，本文所述之高甘露糖型N-聚醣選自Man3 GlcNAc、Man5 GlcNAc、Man6 GlcNAc、Man7 GlcNAc、Man8 GlcNAc，以及MangGlcNAc所組成之群組。於較佳的具體實施例中，該高甘露糖型N-聚醣為Man5 GlcNAc。
於一些具體實施例中，本文所述之雜合型N-聚醣在α-1,3臂上包含至少一個α-2,6-或α-2,3末端唾液酸，其中該α-1,6臂含有三甘露糖殘基。
於一些具體實施例中，本文所述之雜合型N-聚醣在α-1,3臂上包含至少一個末端半乳糖，其中該α-1,6臂含有三甘露糖殘基。
於一些具體實施例中，本文所述之雜合型N-聚醣包含α-1,3臂上的至少一個末端GlcNAc，其中該α-1,6臂含有三甘露糖殘基。
於一些具體實施例中，複合型聚醣具有雙觸角、三觸角，以及四觸角複合型。
於一些具體實施例中，本文所述之雙觸角複合型N-聚醣包含至少一種α-2,6或α-2,3末端唾液酸。於較佳的具體實施例中，該N-聚醣包含兩個α-2,6及/或α-2,3末端唾液酸。
於一些具體實施例中，本文所述之雙觸角複合型N-聚醣包含至少一個末端半乳糖或GlcNAc。於較佳的具體實施例中，該N-聚醣包含兩個末端半乳糖及/或GlcNAc。
於一些具體實施例中，本文所述之雙觸角複合型N-聚醣包含至少一種α-1,2-海藻糖。於較佳的具體實施例中，該N-聚醣包含兩個α-1,2-糖。
於一些具體實施例中，本文所述之雙觸角複合型N-聚醣包含至少一種α-1,3-海藻糖。於較佳的具體實施例中，該N-聚醣包含兩個α-1,3-海藻糖。
於一些具體實施例中，本文所述之雙觸角複合型N-聚醣包括二等分GlcNAc。
於一些具體實施例中，本文所述之雙觸角複合型N-聚醣包含至少一個LacNAc重複單元。於較佳的具體實施例中，該N-聚醣包含兩個LacNAc重複單元。
於一些具體實施例中，本文所述之三觸角複合型N-聚醣包含至少一種α-2,6或α-2,3末端唾液酸。於較佳的具體實施例中，該N-聚醣包含三個α-2-6及/或α-2,3末端唾液酸。
於一些具體實施例中，本文所述之三觸角複合型N-聚醣包含至少一個末端半乳糖或GlcNAc。於較佳的具體實施例中，該N-聚醣包含三個末端半乳糖及/或GlcNAc。
於一些具體實施例中，該複合型聚醣為雙-以及三觸角複合型，包含α-1,3或α-1,6臂上的不對稱天線。
於一些具體實施例中，本文所述之雜合與雙-以及三觸角複合型N-聚醣包含α-2,6或α-2,3末端唾液酸。於其他具體實施例中，該雜合與雙-以及三觸角複合型N-聚醣包含α-2,6末端唾液酸。
雖然已經關於有限數量的具體實施例描述了本發明，但是受益於本發明之本領域技術人員將理解，可以設計出不脫離本文所公開的本發明之範圍的其他具體實施例。因此，本發明之範圍應僅由所附之申請專利範圍限制。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同之含義。儘管與本文描述的那些類似或等同的任何方法及材料可用於本發明之實施或測試，但現在描述為較佳的方法及材料。本文具體提及的所有出版物及專利均出於所有目的透過引用併入，包括描述以及公開可能與本發明結合使用的出版物中報導的化學品、細胞株、載體、動物、儀器、統計分析，以及方法。本說明書中引用的所有參考文獻都被視為本領域技術水準之指示。本文中的任何內容均不應被解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而先於此類公開內容。
在描述本發明之材料及方法之前，應理解本發明不限於所述之特定方法、方案、材料以及試劑，因為它們可以變化。還應理解的是，本文使用之術語僅用於描述特定具體實施例之目的，並非意圖限制本發明之範圍，本發明之範圍僅受所附之申請專利範圍的限制。SEQ ID NO 1: 名稱：EndoSd-D232M胺基酸序列 生物體：壞乳鏈球菌壞乳亞種(Streptococcus dysgalactiae subsp. Dysgalactiae ) MGTILGTHHDSLISVKAEEKITQVSQTSTSIDDLHYLSENSKKEFKEELSKEKVPEKVKEILSKAQQANKQAQELAEMKVPDKIPMKPLNGPLYGGYFRTWHDKTSDPLEKDKVNSMGELPKEVDLAFVFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDASKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVMIEHDSIPKVNGEASDENLKRSIDVFEEIGKLIGPKGADKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYIDLLLVQVYGSQGEQGEFQNDTKSVTKTPEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEEKAGSGNLWYDINARKDEDTANGINDDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKQIAEKDKQSVKNNRPLISEITDNIFHSNYSVSKTLKTVMLKDKAYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRIIKLDQSVLPANMKPGKDPLETVLETYKKNGKEEPAIIPPVSLTVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGIDAATLTSLEKVDISDNKLDLAPKTENRQIFDVMLSTVNNNAGISEQSIKFDNQKPAGNYPQTYGATNLQLPVRQEKIDLQHQLLFGTITNQGTLINSEADYKTYRNQKIAGRNFVDPDYPYNNFKVSHDNYTVKVTDSTLGTTTDKMLATDKEETYKVDFFSPTDKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIKSENDENAQKVFNGIMEYNPLSFNNKSSIIFEIKDPSLAKYWRLFNDSSKDKKDYIKEAKLEVFTGQLNAEADVKTILEKPDNWVTVSTYSGEEKVFSHSLDNISAKYWRVTVDNKKDQYGYVSLPELQILGYPLPNADTIMKTVTVAKELSQQKDKFPQQLLDESTAKEAVVEASLNSKLFDTGVINTNVEALKNVVDECLAYEKNKETAFKATEDYRAAVNGVKAESVTVEEMAQLKDLIGKAAHLNSKIDAKLADREYDKDLLGLIGELTNITRTVKSFVKHHHHHHSEQ ID NO 2: 名稱：EndoSz-D234M胺基酸序列 生物體：馬鏈球菌獸疫亞種Sz105 (Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus Sz105 ) MVAILAAQHDSLIRVKAEDKLVQTSPSVSAIDALHYLSENSKKEFKEELSKVEKAQPEKLKEIVSKAQQADKQAKTLAEMKVPEKIPMKPLKGPLYGGYFRTWHDKTSDPAEKDKVNSMGELPKEVDLAFVFHDWTKDYSLFWQELATKHVPTLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDHSGIAEDAQKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVMIERDSIPKVNKEESKEGIERSIQVFEEIGKLIGPKGADKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYIDLLLVQVYGTQGEKGGFDNANHKAVDTMEERWESYSKYIRPEQYMVGFSFYEEKANSGNLWYDVNVEDDTNPNIGSEIKGTRAERYAKWQPKTGGVKGGIFSYGIDRDGVAHPKKNGPKTPDLDKIVKSDYKVSKALKKVMENDKSYELIDQKDFPDKALREAVIAQVGSRRGNLERFNGTLRLDNPDIKSLEGLNKLKKLAKLELIGLSQITKLDSSVLPENIKPTKDTLVSVLETYKNDDRKEEAKAIPQVALTISGLTGLKELNLAGFDRDSLAGIDAASLTSLEKVDLSSNKLDLAAGTENRQILDTMLATVTKHGGVSEKTFVFDHQKPTGLYPDTYGTKSLQLPVANDTIDLQAKLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQEQEIAGHRFVDSSYDYKAFAVTYKDYKIKVTDSTLGVTDHKDLSTSKEETYKVEFFSPINSTKPVHEAKIVVGEEKTMMVNLAEGATIIGGDADPTNAKKVFDGLLNNDTTTLSTSNKASIIFELKEPGLVKHWRFFNDSKISKADYIKEAKLEAFVGHLEDSSKVKDSLEKSTEWVTVSDYSGEAQEFSQPLNNIGAKYWRITIDNKKSQYGYVSLPELQIIGHRLPEAATVMTTMAAAEELSQQKDKFSQEQLKELEVKVAALKAALDNKMFNADTINASFADVKAYIDKLLADAAGKKTLGKATKEAQPVATDAKEKAESENPKADHHHHHHSEQ ID NO 3: 名稱：EndoSd-D232M核酸序列 生物體：壞乳鏈球菌壞乳亞種(Streptococcus dysgalactiae subsp. Dysgalactiae ) ATGGGCACCATCCTGGGTACCCACCACGACAGCCTGATCAGCGTGAAGGCGGAGGAAAAAATTACCCAAGTTAGCCAAACCAGCACCAGCATTGACGATCTGCACTACCTGAGCGAAAACAGCAAGAAAGAGTTCAAAGAGGAGCTGAGCAAGGAGAAAGTGCCGGAAAAGGTTAAAGAGATCCTGAGCAAAGCGCAGCAAGCGAACAAGCAGGCGCAAGAGCTGGCGGAAATGAAGGTGCCGGACAAAATTCCGATGAAGCCGCTGAACGGTCCGCTGTATGGTGGCTACTTTCGTACCTGGCACGACAAAACCAGCGATCCGCTGGAAAAGGACAAAGTTAACAGCATGGGCGAACTGCCGAAAGAGGTGGATCTGGCGTTCGTTTTTCACGACTGGACCAAAGATTATAGCCTGTTCTGGAAAGAGCTGGCGACCAAGCACGTGCCGAAGCTGAACAAACAGGGTACCCGTGTTATCCGTACCATTCCGTGGCGTTTTCTGGCGGGTGGCGACAACAGCGGTATTGCGGAAGATGCGAGCAAGTACCCGAACACCCCGGAGGGTAACAAAGCGCTGGCGAAGGCGATTGTGGACGAATACGTTTATAAATACAACCTGGACGGTCTGGATGTGATGATCGAGCACGATAGCATTCCGAAAGTTAACGGCGAAGCGAGCGACGAGAACCTGAAGCGTAGCATCGATGTGTTCGAGGAAATCGGTAAACTGATTGGTCCGAAAGGCGCGGACAAGAGCCGTCTGTTTATTATGGACAGCACCTATATGGCGGATAAGAACCCGCTGATCGAACGTGGCGCGCCGTATATTGACCTGCTGCTGGTGCAGGTTTACGGTAGCCAGGGCGAGCAGGGTGAATTCCAAAACGATACCAAAAGCGTTACCAAGACCCCGGAGGAACGTTGGCAGGGCTATAGCAAATACATCCGTCCGGAGCAATATATGATTGGTTTCAGCTTTTACGAGGAAAAGGCGGGTAGCGGCAACCTGTGGTACGACATCAACGCGCGTAAAGACGAAGATACCGCGAACGGCATCAACGACGATATTACCGGTACCCGTGCGGAGCGTTATGCGCGTTGGCAGCCGAAAACCGGTGGCGTGAAGGGTGGCATCTTTAGCTACGCGATTGACCGTGATGGTGTTGCGCACCAGCCGAAGCAAATCGCGGAAAAGGACAAACAAAGCGTGAAAAACAACCGTCCGCTGATCAGCGAGATTACCGATAACATTTTCCACAGCAACTATAGCGTGAGCAAGACCCTGAAAACCGTTATGCTGAAGGACAAAGCGTACGACCTGATCGATGAAAAAGACTTTCCGGATAAAGCGCTGCGTGAGGCGGTGATGGCGCAGGTTGGCACCCGTAAGGGTGACCTGGAACGTTTCAACGGCACCCTGCGTCTGGATAACCCGGCGATCCAGAGCCTGGAGGGTCTGAACAAGTTTAAGAAACTGGCGCAACTGGACCTGATTGGCCTGAGCCGTATCATTAAACTGGATCAAAGCGTGCTGCCGGCGAACATGAAGCCGGGTAAAGACCCGCTGGAAACCGTTCTGGAGACCTACAAGAAAAACGGCAAAGAGGAGCCGGCGATCATTCCGCCGGTTAGCCTGACCGTTAGCGGTCTGACCGGTCTGAAAGAACTGGACCTGAGCGGCTTCGATCGTGAGACCCTGGCGGGTATCGATGCGGCGACCCTGACCAGCCTGGAAAAGGTGGACATTAGCGATAACAAACTGGACCTGGCGCCGAAGACCGAGAACCGTCAGATCTTCGATGTGATGCTGAGCACCGTTAACAACAACGCGGGTATCAGCGAGCAGAGCATTAAATTTGACAACCAAAAGCCGGCGGGCAACTATCCGCAAACCTACGGTGCGACCAACCTGCAGCTGCCGGTTCGTCAAGAAAAAATCGACCTGCAGCACCAACTGCTGTTCGGCACCATCACCAACCAGGGTACCCTGATTAACAGCGAGGCGGATTATAAAACCTACCGTAACCAAAAGATTGCGGGTCGTAACTTCGTGGACCCGGATTATCCGTACAACAACTTTAAAGTTAGCCACGACAACTATACCGTGAAGGTTACCGATAGCACCCTGGGCACCACCACCGACAAAATGCTGGCGACCGATAAAGAGGAAACCTACAAGGTGGACTTCTTTAGCCCGACCGATAAGACCAAAGCGGTTCACACCGCGAAAGTGATCGTTGGCGACGAAAAGACCATGATGGTGAACCTGGCGGAGGGTGCGACCGTTATCAAAAGCGAGAACGATGAAAACGCGCAGAAGGTTTTCAACGGTATTATGGAATATAACCCGCTGAGCTTCAACAACAAGAGCAGCATCATTTTTGAGATCAAAGACCCGAGCCTGGCGAAGTATTGGCGTCTGTTCAACGATAGCAGCAAAGACAAGAAAGATTACATCAAGGAAGCGAAACTGGAAGTGTTTACCGGTCAGCTGAACGCGGAAGCGGACGTTAAAACCATTCTGGAGAAGCCGGATAACTGGGTGACCGTTAGCACCTATAGCGGCGAGGAAAAGGTGTTTAGCCACAGCCTGGACAACATCAGCGCGAAATACTGGCGTGTGACCGTTGACAACAAGAAAGATCAGTATGGCTACGTTAGCCTGCCGGAGCTGCAAATCCTGGGTTACCCGCTGCCGAACGCGGATACCATTATGAAAACCGTGACCGTTGCGAAGGAACTGAGCCAGCAAAAGGACAAATTCCCGCAGCAACTGCTGGATGAGAGCACCGCGAAGGAAGCGGTGGTTGAGGCGAGCCTGAACAGCAAACTGTTTGACACCGGTGTGATCAACACCAACGTTGAAGCGCTGAAGAACGTGGTTGATGAGTGCCTGGCGTATGAAAAGAACAAAGAGACCGCGTTCAAGGCGACCGAAGACTACCGTGCGGCGGTGAACGGTGTTAAAGCGGAGAGCGTGACCGTTGAGGAAATGGCGCAGCTGAAAGATCTGATCGGCAAGGCGGCGCACCTGAACAGCAAAATTGACGCGAAGCTGGCGGATCGTGAATACGACAAAGATCTGCTGGGCCTGATCGGCGAGCTGACCAACATTACCCGTACCGTGAAAAGCTTTGTTAAGTGASEQ ID NO 4: 名稱：EndoSz-D234M核酸序列 生物體：馬鏈球菌獸疫亞種Sz105 (Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus Sz105 ) ATGGTTGCGATCCTGGCGGCGCAACACGATAGCCTGATTCGTGTGAAGGCGGAGGACAAACTGGTGCAGACCAGCCCGAGCGTTAGCGCGATTGATGCGCTGCACTACCTGAGCGAAAACAGCAAGAAAGAATTCAAAGAGGAACTGAGCAAGGTTGAAAAAGCGCAACCGGAGAAGCTGAAAGAAATCGTGAGCAAGGCGCAGCAAGCGGACAAGCAGGCGAAAACCCTGGCGGAGATGAAGGTTCCGGAAAAAATTCCGATGAAGCCGCTGAAAGGCCCGCTGTATGGTGGCTACTTTCGTACCTGGCACGATAAAACCAGCGACCCGGCGGAGAAGGATAAAGTGAACAGCATGGGCGAGCTGCCGAAAGAAGTGGACCTGGCGTTCGTTTTTCACGATTGGACCAAGGACTATAGCCTGTTCTGGCAAGAACTGGCGACCAAACACGTTCCGACCCTGAACAAGCAGGGCACCCGTGTGATCCGTACCATTCCGTGGCGTTTTCTGGCGGGTGGCGATCACAGCGGTATCGCGGAGGACGCGCAGAAATACCCGAACACCCCGGAAGGCAACAAGGCGCTGGCGAAAGCGATTGTGGATGAGTACGTTTATAAGTACAACCTGGACGGTCTGGATGTTATGATCGAACGTGACAGCATTCCGAAGGTGAACAAAGAGGAAAGCAAAGAGGGTATCGAACGTAGCATTCAGGTTTTCGAGGAAATCGGCAAGCTGATTGGTCCGAAGGGCGCGGATAAAAGCCGTCTGTTTATCATGGATAGCACCTATATGGCGGACAAGAACCCGCTGATCGAGCGTGGTGCGCCGTATATTGACCTGCTGCTGGTGCAGGTTTACGGTACCCAGGGCGAAAAAGGTGGCTTCGATAACGCGAACCACAAGGCGGTTGACACCATGGAGGAACGTTGGGAGAGCTATAGCAAATACATCCGTCCGGAACAATATATGGTGGGTTTCAGCTTTTACGAGGAAAAGGCGAACAGCGGCAACCTGTGGTACGACGTGAACGTTGAGGACGATACCAACCCGAACATCGGTAGCGAGATTAAAGGCACCCGTGCGGAACGTTATGCGAAGTGGCAGCCGAAAACCGGTGGCGTTAAGGGTGGCATCTTTAGCTACGGTATTGACCGTGATGGCGTGGCGCACCCGAAGAAAAACGGTCCGAAAACCCCGGACCTGGATAAGATCGTGAAAAGCGATTATAAAGTTAGCAAAGCGCTGAAGAAAGTTATGGAGAACGACAAGAGCTACGAACTGATCGACCAAAAGGATTTCCCGGACAAAGCGCTGCGTGAGGCGGTGATTGCGCAGGTTGGTAGCCGTCGTGGCAACCTGGAACGTTTTAACGGTACCCTGCGTCTGGATAACCCGGACATCAAAAGCCTGGAGGGCCTGAACAAACTGAAGAAACTGGCGAAGCTGGAACTGATCGGTCTGAGCCAAATTACCAAGCTGGATAGCAGCGTTCTGCCGGAGAACATTAAGCCGACCAAAGACACCCTGGTGAGCGTTCTGGAAACCTACAAAAACGACGATCGTAAGGAAGAGGCGAAAGCGATCCCGCAGGTGGCGCTGACCATTAGCGGTCTGACCGGCCTGAAGGAGCTGAACCTGGCGGGTTTCGACCGTGATAGCCTGGCGGGTATTGATGCGGCGAGCCTGACCAGCCTGGAGAAAGTGGATCTGAGCAGCAACAAGCTGGACCTGGCGGCGGGTACCGAAAACCGTCAAATTCTGGACACCATGCTGGCGACCGTGACCAAACACGGTGGCGTTAGCGAGAAGACCTTCGTGTTTGATCACCAGAAACCGACCGGTCTGTATCCGGACACCTACGGCACCAAGAGCCTGCAGCTGCCGGTTGCGAACGATACCATCGACCTGCAAGCGAAACTGCTGTTCGGTACCGTGACCAACCAGGGCACCCTGATCAACAGCGAAGCGGACTATAAGGCGTACCAGGAGCAAGAAATTGCGGGCCACCGTTTCGTTGATAGCAGCTATGACTACAAAGCGTTTGCGGTGACCTACAAGGATTACAAGATCAAGGTTACCGACAGCACCCTGGGTGTGACCGATCACAAAGACCTGAGCACCAGCAAAGAGGAGACCTATAAAGTTGAGTTCTTTAGCCCGATCAACAGCACCAAACCGGTGCACGAAGCGAAGATTGTGGTTGGCGAGGAAAAGACCATGATGGTTAACCTGGCGGAGGGCGCGACCATCATTGGTGGCGACGCGGACCCGACCAACGCGAAGAAAGTGTTCGATGGCCTGCTGAACAACGACACCACCACCCTGAGCACCAGCAACAAAGCGAGCATCATTTTTGAGCTGAAAGAACCGGGTCTGGTGAAGCACTGGCGTTTCTTTAACGATAGCAAGATCAGCAAAGCGGACTACATTAAAGAGGCGAAACTGGAAGCGTTCGTTGGTCACCTGGAAGATAGCAGCAAGGTGAAAGACAGCCTGGAGAAAAGCACCGAATGGGTGACCGTTAGCGATTATAGCGGCGAGGCGCAGGAATTTAGCCAACCGCTGAACAACATCGGCGCGAAGTACTGGCGTATCACCATTGACAACAAGAAAAGCCAGTATGGTTACGTTAGCCTGCCGGAGCTGCAAATCATTGGTCATCGTCTGCCGGAAGCGGCGACCGTGATGACCACCATGGCGGCGGCGGAGGAACTGAGCCAGCAAAAGGATAAATTCAGCCAGGAGCAACTGAAGGAGCTGGAAGTGAAAGTTGCGGCGCTGAAGGCGGCGCTGGATAACAAAATGTTCAACGCGGACACCATCAACGCGAGCTTTGCGGACGTTAAAGCGTACATTGATAAGCTGCTGGCGGACGCGGCGGGTAAGAAAACCCTGGGCAAAGCGACCAAAGAGGCGCAGCCGGTGGCGACCGATGCGAAGGAAAAAGCGGAGAGCGAAAACCCGAAGGCGGACTAA
無
圖 1 . 總結了同質平台整個過程的各個方面。(A)表現單株抗體的細胞與聚醣混合物為異質的，其透過野生型EndoSz以及α-海藻糖苷酶除去以產生mAb-GlcNAc。然後使用EnodSd-D232M以及EnodSz-D234M綴合聚醣-噁唑啉並產生同質的單株抗體。(B)在聚醣切割步驟中，僅使用EndoSz酶產生mAb-GlcNAc-F，且綴合後產物將為均質-單株抗體-聚醣-F。(C)雙觸角聚醣的示例性圖片。
圖 2 . Herceptin-GlcNAc糖胜肽的LC/MS/MS結果。將Herceptin野生型與EndoSz野生型以及α-海藻糖苷酶混合以除去Fc區上的聚醣。結果顯示除去所有聚醣並產生> 99% Herceptin-GlcNAc。
圖 3 . 同質平台的示例性檢測方法(由EndoSz-D234M證明)。 (A) HPLC分析方法。原始Herceptin (綠色)的保留時間為12.5分鐘，Herceptin-GlcNAc (洋紅色)的保留時間為11.4分鐘。在NSCT-氧雜的轉糖苷化中，Herceptin-G2S2 (藍色)可透過1N-G2S2 (半糖苷化)以及2N-G2S2 (完全糖苷化)清楚地區分，保留時間分別為12.6以及13.9分鐘。在轉糖苷化過程中，峰值從Herceptin-GlcNAc依序轉移到Herceptin-1N-G2S2以及Herceptin-2N-G2S2，這使我們能夠監測該過程。 (B) SDS-PAGE結果用於比較。半糖苷化以及完全糖苷化的Herceptin-G2S2不易被鑑定。
圖 4 . 示例性EndoS2、EndoS、EndoSz，以及EndoSd的多序列比對。藍色三角形表示在EndoSz以及EndoSd酶中進行位點直接誘變研究的選定位點。
圖 5 . 時間依賴性轉糖苷化結果 (A) 由EndoSz-D234M的NSCT-氧雜以及Herceptin-GlcNAc的轉糖苷化的莫耳比為20：1。(B) EndoSd-D232M使用更高莫耳比150：1 (NSCT-氧雜：Herceptin-GlcNAc)。以100%Herceptin-GlcNAc表示反應。根據效率，形成Herceptin-1N-G2S2以及Herceptin-2N-G2S2的百分比。兩種酶均可達到> 90% Herceptin-2N-G2S2的轉糖苷化效率。
圖 6 . 不同示例性突變體中的相對轉糖苷化活性。(A) EndoSz (B) EndoSd。
圖 7 . 功效證明：抗體依賴性細胞毒性(ADCC)分析結果。 (A) Herceptin以及Herceptin-G2S2的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)結果。數據顯示Herceptin具有更高的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。Herceptin以及Herceptin-G2S2的EC50 分別為15.29 (μg/mL)以及5.10 (μg/mL)。 (B) 各種單株抗體中轉糖苷化效率以及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的總結。縮寫
ACN：乙腈；ADCC：抗體依賴性細胞毒性；CDC：補體依賴性細胞毒性；CDR：互補決定區；FA：甲酸；FUT8：α-1,6-海藻糖基轉移酶8；GlcNAc：N-乙醯葡萄糖胺；HFIP：1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇；IPTG：異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；TFA：三氟乙酸。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (32)

  1. 一種糖苷合成酶的突變體，包含： 與SEQ ID NO: 1的序列中所示的胺基酸序列具有至少約80%序列同源性的胺基酸序列；或 與SEQ ID NO: 2的序列中所示的胺基酸序列具有至少約80%序列同源性的胺基酸序列。
  2. 如請求項1之糖苷合成酶的突變體，其中該一個或多個突變在位於SEQ ID NO: 1的序列中殘基176-186、殘基225-237、殘基273-289之間的胜肽區中；或 在位於SEQ ID NO: 2的序列中殘基178-188、殘基227-239、殘基275-291之間的胜肽區中。
  3. 如請求項2之糖苷合成酶的突變體，其中該殘基被中性胺基酸、疏水胺基酸、酸性胺基酸，或鹼性胺基酸取代。
  4. 一種使用如請求項1至3中任一項之糖苷合成酶的突變體製備工程化糖蛋白之方法，包含將活化的寡糖偶聯至糖蛋白受體。
  5. 如請求項4之方法，其中該活化的寡糖為聚醣噁唑啉。
  6. 如請求項5之方法，其中該聚醣噁唑啉包含具有下式的N-聚醣：
    Figure 03_image009
    其中R1 為經由β-1,4鍵聯的-H或N-乙醯葡萄糖胺，R2 與R3 相同或不同，且獨立地選自由下列所組成之群組：
    Figure 03_image011
    。
  7. 如請求項4之方法，其中該糖蛋白受體含有GlcNAc單醣。
  8. 如請求項4之方法，其中該糖蛋白受體為非海藻糖苷化的GlcNAc-受體。
  9. 如請求項4之方法，其中該糖蛋白受體為糖胜肽、糖蛋白、抗體，或其片段。
  10. 如請求項4之方法，其中該糖蛋白受體為核心海藻糖苷化或非海藻糖苷化的GlcNAC-IgG受體或其片段。
  11. 如請求項10之方法，其中該GlcNAC-IgG受體衍生自以Globo系列抗原、Her-2、CD20、TNF-α、PD-1、PD-L1，及/或EGFR受體為標靶的單株抗體。
  12. 如請求項11之方法，其中該Globo系列抗原為Globo H、SSEA-4，及/或SSEA-3。
  13. 如請求項11之方法，其中該單株抗體為Herceptin (曲妥珠單抗)、Perjeta (帕妥珠單抗)、Erbitux (西妥昔單抗)、Rituxan (利妥昔單抗)、Vectibix (帕尼單抗)、Humira (阿達木單抗)、Keytruda (派姆單抗)，或Bavencio (阿維魯單抗)。
  14. 如請求項11之方法，其中該單株抗體為OBI-888或OBI-898。
  15. 一種透過如請求項4至14中任一項之方法製備之糖蛋白。
  16. 一種醫藥組合物，包含如請求項15之糖蛋白以及醫藥上可接受之載體或賦形劑。
  17. 一種治療癌症之方法，包含對有此需要之個體施用有效量的請求項16之醫藥組合物。
  18. 如請求項17之方法，其中該個體為人類。
  19. 如請求項17之方法，其中該癌症為表現Globo系列抗原的癌症。
  20. 如請求項19之方法，其中該表現Globo系列抗原的癌症選自由下列所組成之群組：肉瘤、皮膚癌、白血病、淋巴瘤、腦癌，神經膠質母細胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、頭頸癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、胰腺癌、腸癌、直腸癌、腎臟癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、睾丸癌、頰癌 、口咽癌、喉癌，以及***癌。
  21. 一種包含一個或多個功能域的聚醣工程酶，包含： SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
  22. 如請求項21之酶，其中該胺基酸序列選自馬鏈球菌(Streptococcus equi )或壞乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae )。
  23. 一種監測轉糖苷化過程之方法，包含： (a) 將樣品加入UPLC糖蛋白醯胺管柱； (b) 以流動相流洗該高效液相色層分析(high performance liquid chromatography，HPLC)管柱以獲得流洗液； (c) 獲得該流洗液的色層分析圖； (d) 測量並比較該測試樣品中的吸光度；以及 (e) 確定轉糖苷化的階段及/或狀態； 其中該流動相包含三氟乙酸-1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇-水溶液以及三氟乙酸-1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇-乙腈溶液。
  24. 如請求項23之方法，其中該流洗以0.1至10 mL/分鐘的流速進行。
  25. 如請求項23之方法，其中該樣品為透過如請求項4至14中任一項之方法製備之糖蛋白。
  26. 一種鑑定半糖苷化單株抗體 (mAb-1N-G2S2)或完全糖苷化單株抗體 (mAb-2N-G2S2)之方法，包含： (a) 將樣品加入UPLC糖蛋白醯胺管柱； (b) 以流動相流洗該高效液相色層分析(HPLC)管柱以獲得流洗液； (c) 獲得該流洗液的色層分析圖； (d) 測量並比較該測試樣品中的吸光度；以及 (e)確定糖苷化的階段及/或狀態； 其中該流動相包含三氟乙酸-1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇-水溶液以及三氟乙酸-1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇-乙腈溶液。
  27. 如請求項26之方法，其中該流洗以0.1至10 mL/分鐘的流速進行。
  28. 如請求項26之方法，其中該樣品為Herceptin (曲妥珠單抗)、Perjeta (帕妥珠單抗)、Erbitux (西妥昔單抗)、Rituxan (利妥昔單抗)、Vectibix (帕尼單抗)、Humira (阿達木單抗)、Keytruda (派姆單抗)，或Bavencio (阿維魯單抗)。
  29. 如請求項26之方法，其中該樣品為OBI-888或OBI-898。
  30. 如請求項26之方法，其中該樣品為透過如請求項4至14中任一項之方法製備之糖蛋白。
  31. 一種透過如請求項4之方法製備之同質乙二醇-抗體。
  32. 一種醫藥組合物，包含如請求項31之同質乙二醇-抗體群。
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