JP2024514683A - 部位特異的抗体コンジュゲーションのためのＦｃグリカンリモデリングプラットフォーム法及びその適用 - Google Patents

部位特異的抗体コンジュゲーションのためのＦｃグリカンリモデリングプラットフォーム法及びその適用 Download PDF

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Abstract

【課題】薬物コンジュゲートを有する抗体を容易且つ効率的に生成する方法が望まれている。【解決手段】本開示は、規定の薬物及び他のエンティティを保有する構造的に明確に定義された抗体コンジュゲートを生成するための、抗体のＦｃグリカン部位での部位特異的修飾及びコンジュゲーションのワンポット化学酵素法を提供する。この方法は、特定のエンドグリコシダーゼが抗体を脱グリコシル化する能力、及び得られる生成物を加水分解することなく抗体のトランスグリコシル化のために選択的に修飾された小さい二糖オキサゾリンを認識する能力の両方を有するという発見によって可能になった。【選択図】なし

Description

本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＧＭ０９６９７３Ｃ及びＲ０１ＡＩ１５５７１６Ａの下で政府の支援を受けてなされた。政府は発明に関して一定の権利を有する。
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１７８，７１９号；２０２１年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／２６４，０１２号；及び２０２１年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／２６４，０１３号に対する利益及び優先権を主張し、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、規定の薬物及び他のエンティティを保有する構造的に明確に定義された抗体コンジュゲートを生成するための、抗体のＦｃグリカン部位での部位特異的修飾及びコンジュゲーションのワンポット化学酵素法を提供する。この方法は、特定のエンドグリコシダーゼが抗体を脱グリコシル化する能力、及び得られる生成物を加水分解することなく抗体のトランスグリコシル化のために選択的に修飾された小さい二糖オキサゾリンを認識する能力の両方を有するという発見によって可能になった。親抗体に対する開示されたエンドグリコシダーゼの加水分解活性、及び得られるトランスグリコシル化生成物の顕著な違いにより、トランスグリコシル化前に脱グリコシル化中間体と酵素を分離する必要のない、タグ付き糖オキサゾリンによる抗体の脱グリコシル化及びグリコシル転移を組み合わせる単純な「ワンポット」手順が可能となる。アジドタグ付き抗体は、明確に定義された抗体－薬物比を有する、構造的に明確に定義された抗体－薬物コンジュゲートの生成に使用でき、また、蛍光標識及び様々なリガンドを含む他のエンティティとの抗体コンジュゲートの生成にも適用できる。
背景
治療用抗体は、癌、自己免疫障害、及び炎症性疾患などの、多くの困難な疾患の処置に使用されている重要な種類の生物製剤である。高い特異性及び親和性を特徴とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、低分子医薬品と比較してオフターゲット副作用が少ないため、治療剤として使用されるだけでなく、ｍＡｂは低分子の標的送達のための有望なプラットフォームも提供する。抗体の特異性と薬物の高い効力を組み合わせる薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む抗体により、標的細胞死滅が大いに期待できる。したがって、薬物コンジュゲートを有する前記抗体を容易且つ効率的に生成する方法が望まれている。
概要
本開示は、ＩｇＧ抗体及びそのＦｃフラグメントの合成を提供し、ここで、所望の糖鎖は、フコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ受容体を含むコアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ受容体に付加される。したがって、本開示は、インビボでの半減期の延長、免疫原性の低下、インビボ活性の増強、標的化能力及び／又は治療剤を送達する能力の増加などの特定の生物活性を提供するための治療用抗体及びそのＦｃフラグメントの合成及びリモデリングを可能にする。
一態様では、アジドタグ付き抗体を提供するために、ワンポット方式での脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方に対するワンポット化学酵素リモデリング法が提供される。提供される方法は、
（ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供するステップ；
（ｂ）脱グリコシル化活性及びトランスグリコシル化活性の両方を有する単一のエンドグリコシダーゼ、又はその変異体を導入するステップ；
（ｃ）単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供するステップ；
（ｄ）二糖コアを含むアジド修飾グリカンオキサゾリンを提供するステップ；並びに
（ｅ）単一のエンドグリコシダーゼによりアジド修飾グリカンオキサゾリンをＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、アジドタグ付き抗体を提供するステップ
を含む。
別の実施形態では、アジドタグ付き抗体を提供するために、ワンポット方式での脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方に対するワンポット化学酵素リモデリング法が提供される。提供される方法は、
（ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供するステップ；
（ｂ）脱グリコシル化活性を有する第１のエンドグリコシダーゼ、又はその変異体を導入するステップ；
（ｃ）エンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供するステップ；
（ｄ）トランスグリコシル化活性を有する第２のエンドグリコシダーゼと、二糖コアを含むアジド修飾グリカンオキサゾリンとを提供するステップ；並びに
（ｅ）第２のエンドグリコシダーゼによりアジド修飾グリカンオキサゾリンをＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、アジドタグ付き抗体を提供するステップであって、アジドタグ付き抗体が、第１のエンドグリコシダーゼによる加水分解に耐性がある、ステップ
を含む。
別の実施形態では、コンジュゲートがＭ６Ｐグリカンであり、得られる前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体がリソソーム媒介標的分解を標的とする、ワンポット化学酵素リモデリング法が提供される。前記方法は、Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供するためのワンポット内での脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方のステップを含み、この方法は、
（ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供すること；
（ｂ）脱グリコシル化能及びトランスグリコシル化能の両方を有する単一のエンドグリコシダーゼを導入すること；
（ｃ）単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供すること；
（ｄ）Ｍ６Ｐ－グリカンオキサゾリンを提供すること；並びに
（ｅ）単一のエンドグリコシダーゼによりＭ６Ｐ－グリカンオキサゾリンをＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供すること
を含む。
別の実施形態では、コンジュゲートがＭ６Ｐグリカンであり、得られる前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体がリソソーム媒介標的分解を標的とする、ワンポット化学酵素リモデリング法が提供される。前記方法は、Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供するためのワンポット内での脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方のステップを含み、この方法は、
（ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供すること；
（ｂ）脱グリコシル化能を有する第１のエンドグリコシダーゼを導入すること；
（ｃ）単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供すること；
（ｄ）第２のエンドグリコシダーゼ及びＭ６Ｐ－グリカンオキサゾリンを提供すること；並びに
（ｅ）第２のエンドグリコシダーゼによりＭ６Ｐ－グリカンオキサゾリンをＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供すること
を含む。
一実施形態では、脱グリコシル化のための抗体分子は、エンドグリコシダーゼ媒介反応を通じて脱グリコシル化活性の基質として作用できる１つ以上のグリカンの存在を特徴とする任意の抗体であり得る。このような抗体としては、例えば、目的の標的細胞上で発現される抗原に対して高い特異性及び親和性を有する抗体が挙げられる。非限定的な実施形態では、抗原は標的癌細胞上で発現される。別の実施形態では、抗体は、標的リソソーム分解における使用のための細胞外タンパク質及び膜関連タンパク質などの抗原に結合する。抗体は、標的となる病原体抗原にも結合し得る。このような抗原としては、例えば、対象のウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染に関連する抗原が挙げられる。
一実施形態では、得られたアジドタグ付き抗体は、他のリガンドとのコンジュゲーションによりさらに修飾されて、抗体コンジュゲートを提供する。一実施形態では、抗体コンジュゲートは、薬物、毒素、標識、タンパク質、小分子、チオ、ビオチン、及び蛍光標識から選択されるリガンドを含む。一実施形態では、アジドタグ付き抗体は、クリックケミストリー反応による他のリガンドとのコンジュゲーションにより修飾され得る。
提供されたリモデリング法の実践では、多くの二糖オキサゾリンがトランスグリコシル化ステップの基質として使用され得る。このような二糖オキサゾリン（ozazoline）には、例えば、図４に示され、以下の一般構造を有する、グループＩ Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ二糖のものが含まれる。
グループＩ、Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースのオキサゾリン
Figure 2024514683000002
別の実施形態では、二糖オキサゾリンには、例えば、以下の一般構造を有する、図５に示されるグループＩＩ Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ二糖のものが含まれる。
グループＩＩ、Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースのオキサゾリン
Figure 2024514683000003
別の実施形態では、二糖オキサゾリンには、例えば、図６に示され、以下の一般構造を有する、グループＩＩＩ Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃのものが含まれる。
グループＩＩＩ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースのオキサゾリン
Figure 2024514683000004
さらに、開示されたリモデリング法における使用のためのＭ６Ｐグリカンオキサゾリンとしては、例えば、図８に示されるものが挙げられる。
一実施形態では、アジド修飾グリカンオキサゾリンは、Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、及びＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ（ＬａｃＮＡｃ）を含む、合成又は天然の二糖に由来する二糖コアを含み得る。複数のポリエチレンリンカー又は他の分子リンカーを二糖コアに結合させてデンドリマーを形成してもよい。一態様では、アジド修飾グリカンオキサゾリンはスペーサーをさらに含む。このようなスペーサーとしては、例えば、ポリエチレン（ＰＥＧ）リンカーを含むオリゴエチレンスペーサーが挙げられる。
さらに別の態様では、提供されるリモデリング法の実践において、二糖オキサゾリンなどの活性化オリゴ糖部分、及び特異的タグを有するものなどのその選択的に修飾された誘導体が提供される。
定義された数及び種類の糖残基を有する所定のオリゴ糖成分を有するオリゴ糖オキサゾリン又はシアログリカンオキサゾリンは、追加の部分又はタグを含み、それにより抗体への部分又はタグのコンジュゲーションのためのクリック化学反応を行う必要性を回避できることが想定される。部分及びタグとしては、例えば、癌、ウイルス感染症を処置するためなどの治療剤又は薬物、細胞原形質膜上の受容体を活性化する物質、細胞内化学に影響を与える薬剤、細胞物理学に影響を与える薬剤、遺伝子、遺伝子類似体、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＣＣＲ５又はＣＤ４などの表面受容体のアミノ酸配列、特定の抗体に対して親和性を有する抗原構造；ｇｐ１２０、ｇｐ４１、又はｇｐ１６０などの受容体リガンドのアミノ酸配列、受容体アンタゴニスト、受容体遮断剤、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、酵素モジュレーター、治療用タンパク質、タンパク質類似体、代謝産物、代謝産物類似体、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、抗原、抗原類似体、抗体又はそのフラグメント、抗体類似体、他の受容体細菌に対して反応性を有する修飾抗体とは異なる抗体、ウイルス、無機イオン、金属イオン、金属クラスター、ポリマー、蛍光化合物、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一実施形態では、このようなタグは、当業者に周知のクリックケミストリー反応を使用してアジド修飾抗体に付加してもよい。
したがって、本開示は、状態を処置するための生物活性を有する薬物又は治療剤を送達するための送達デバイスをさらに提供し、送達デバイスは、所定の糖鎖及び末端糖残基に結合した治療剤又は薬物を有するリモデリングされたＩｇＧ又はＩｇＧ－Ｆｃフラグメントを含む。癌又は他の疾患に関連する抗体は、特定の受容体に個別に適合するようにリモデリングされ、それにより生物活性が増加し得る。
別の実施形態では、提供される送達デバイスは、診断及び予後の用途のために、検出可能な標識又はマーカーを標的抗原に送達するように設計される。前記送達デバイスは、所定の糖鎖を有するリモデリングされたＩｇＧ又はＩｇＧ－Ｆｃフラグメントと、リモデリングされた抗体に結合された検出可能な標識又はマーカーとを含む。「検出可能な標識」又は「マーカー」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、放射性又は化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用される酵素）、ビオチン－ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン、又は標的に相補的な配列を有するタンパク質若しくは核酸分子が挙げられる。検出可能な標識は、多くの場合、標的抗原に結合する検出可能部分の量を定量するために使用できる、測定可能なシグナル、例えば、放射性シグナル、色シグナル、又は蛍光シグナルを生成する。シグナルの定量は、例えば、シンチレーション計数、密度計、フローセル分析、ＥＬＩＳＡ、又は質量分析による直接分析によって達成され得る。当業者は、目的の標識化合物に関する技術及び検出手段に精通している。これらの技術及び方法は従来のものであり、当技術分野では周知である。
さらに別の態様では、本開示の実施形態は、所定のオリゴ糖部分を有するコアフコシル化抗体若しくは非フコシル化抗体又はそのＦｃフラグメントの実質的に均一な調製物を提供し、ここで、実質的に均一な調製物は、前述の方法のいずれかによって生成される。このような均一な調製物を含む組成物も提供される。
本開示は、明確に定義された抗体薬物比（ＤＡＲ）を有する均一で部位特異的な抗体－薬物コンジュゲートを生成するための効率的な方法を提供する。開示されたワンポットモデリング法は、任意の所与の抗体、リンカー、及びペイロードを使用して抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するための効率的な方法を提供する。
一実施形態では、対象を処置する方法が提供され、ここで、前記処置は、典型的には、本明細書に開示されるワンポット化学酵素リモデリング法を使用して生成された有効量のリモデリングされた抗体を対象に投与することを含む。
さらなる実施形態では、本明細書に開示されるワンポット化学酵素リモデリング法を使用して生成されたリモデリングされた抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。抗体は、例えば癌の処置において、治療剤としての使用のための特性を示す。
さらに別の実施形態では、リモデリングされた抗体を含むキットが提供される。このようなキットは、リモデリングされた抗体に加えて、本明細書に記載の疾患の処置又は疾患の診断に有用な材料を含有する。キットは、以下の構成要素：容器、及び容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書、のうちの１つ以上を含み得る。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、組成物単独、又は状態の処置、予防及び／又は診断に有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈注射溶液バッグ又は皮下注射針で突き刺し可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。
本開示の他の態様、特徴及び実施形態は、以下の開示及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
本開示の様々な実施形態が、図面を参照して本明細書で説明される。
単一酵素ワンポット法を使用した、アジドタグ付き抗体又は他のエンティティコンジュゲート抗体の代表的な調製。野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２などの単一エンドグリコシダーゼによるワンポット同時脱グリコシル化及びトランスグリコシル化は、Ｅｎｄｏ－Ｓ２が、天然抗体又は組換え抗体を効率的に加水分解することが知られている一方、Ｅｎｄｏ－Ｓ２は、トランスグリコシル化生成物に対する加水分解活性が低いか全くなく、トランスグリコシル化のための修飾二糖オキサゾリンを認識できるという観察に基づく。 ２酵素ワンポット法を使用した、アジドタグ付き抗体又は他のエンティティコンジュゲート抗体の代表的な調製。脱グリコシル化は１つのエンドグリコシダーゼによって実施され、トランスグリコシル化は別のエンドグリコシダーゼによって実行され、トランスグリコシル化のために中間体と最初のエンドグリコシダーゼを分離する必要はない。ワンポットグリカンリモデリングは、修飾グリカンを保有する抗体生成物が、使用される２つの酵素による加水分解に耐性があるという観察に基づいている。 抗体－薬物コンジュゲート又は他の抗体－リガンドコンジュゲートを提供するための、薬物又は他のエンティティ（様々なリガンド）の、アジドタグ付き抗体へのクリックコンジュゲーション。 酵素的グリカンリモデリングに使用されるＭａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースの二糖オキサゾリンの一般構造。 酵素的グリカンリモデリングに使用されるＧｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースの二糖オキサゾリンの一般構造。 酵素的グリカンリモデリングに使用されるＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースの二糖オキサゾリンの一般構造。 高親和性Ｍ６Ｐリガンドを抗体に導入するワンポット化学酵素的グリカンリモデリング法。単一酵素ワンポット法の場合、Ｅｎｄｏ－Ｓは、生成物の加水分解を行わずに切断型Ｍ６Ｐグリカンオキサオゾリンを認識してトランスグリコシル化できるため、単一のエンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｓ）によって脱グリコシル化及びトランスグリコシル化を実行できる。２酵素ワンポット法の場合、Ｅｎｄｏ－Ｓを脱グリコシル化に使用し、Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体（ＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４Ｍなど）をトランスグリコシル化に使用してもよく、これは、トランスグリコシル化についてＥｎｄｏ－Ｓよりも効率的であることが見出されている。 選択されたＭ６Ｐグリカンオキサゾリンの構造。 ２Ｎ３タグ付き二糖オキサゾリン７の合成。試薬及び条件：（ａ）ＤＤＱ、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ、０℃～ＲＴ、９０％；（ｂ）ＢＨ３・ＴＨＦ、Ｂｕ２ＢＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、９４％；（ｃ）ＡｃＳＨ、ピリジン／ＣＨＣｌ３、ＲＴ、８２％；（ｄ）Ｎ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、７８％；（ｅ）ＮａＢｒＯ３、ＮａＳ２Ｏ４、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ、室温、６５％；（ｆ）．ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ、０℃、９０％。 １Ｎ３又は３Ｎ３タグ付き二糖オキサゾリン１２及び１７の合成。試薬及び条件：（ａ）ＢＨ３・ＴＨＦ、Ｂｕ２ＢＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、９１％；（ｂ）ＡｃＳＨ、ピリジン／ＣＨＣｌ３、ＲＴ、８４％；（ｃ）Ｎ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、１０、８９％、１５、７３％；（ｄ）ＮａＢｒＯ３、ＮａＳ２Ｏ４、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ、室温、９０％；（ｅ）ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ、０℃、１２、９０％、１７、８５％；（ｆ）ＡｃＳＨ、ピリジン／ＣＨＣｌ３、６０℃、８５％；（ｇ）ＴＦＡ、ＣＨ２Ｃｌ２、－２０℃～０℃、８２％；（ｈ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２、ＨＣｌ（水溶液）、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ、次いでＴｆＮ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣｕＳＯ４、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、ＲＴ、６６％。 ４Ｎ３又は６Ｎ３タグ付き二糖オキサゾリン３０及び３１の合成。試薬及び条件：ａ）Ｎ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ；ｂ）ＴｓＯＨ、ＭｅＯＨ、６０℃、２０、２ステップで７２％、２１、２ステップで５４％；ｃ）ＴｓＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、２２、８５％、２３、７２％；ｄ）２２、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、７８％；ｅ）２３、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、７４％；ｆ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２、ＨＣｌ（水溶液）、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ、次いでＴｆＮ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣｕＳＯ４、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、ＲＴ、２８、６７％、２９、５９％；ｇ）ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ、０℃、３０、８９％、３１、８４％。 ２Ｎ３タグ付きＧｌｃ－ＧｌｃＮＡｃ二糖オキサゾリン４２の合成。試薬及び条件：ａ）ＮＩＳ、ＡｇＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、４Å ＭＳ、－２０℃、７３％；ｂ）ＭｅＯＨ、ＭｅＯＮａ、５０℃；ｃ）ＮａＨ、ＤＭＦ、ＢｎＢｒ、０℃～ＲＴ；ｄ）ＤＤＱ、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ、０℃～ＲＴ、９０％；ｅ）ＢＨ３・ＴＨＦ、Ｂｕ２ＢＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、３ステップで７４％；ｆ）ＡｃＳＨ、ピリジン／ＣＨＣｌ３、ＲＴ、８５％；ｇ）Ｎ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、８２％；ｈ）ＮａＢｒＯ３、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ、室温、６７％；ｉ）ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ、０℃、９５％。 異なるアジドタグ付き二糖オキサゾリンによるトランスグリコシル化。試薬及び条件：反応は、２５℃のＰＢＳ緩衝液中で２０当量のオキサゾリンを用いて行われた。ａ．１時間後にさらに１回オキサゾリン（１０当量）を加え；ｂ．さらに３回のオキサゾリン（１０当量）を３０分ごとに加えた。 アジドタグ付き二糖オキサゾリンによるインタクト抗体のワンポットトランスグリコシル化。 クリックケミストリーによる構造的に定義されたＡＤＣの調製。試薬及び条件：アジドタグ付き抗体（最終濃度２ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＰＢ（３：７、ｖ／ｖ）中のＤＢＣＯ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（５．０当量／アジド基）と室温で８～２４時間インキュベートした。 ＡＤＣ構造の代表的なＬＣ－ＭＳ分析。 ビオチン又は蛍光基による抗体の部位特異的標識。 ビオチン又は蛍光基による市販の抗体の１ステップ標識。 補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のためのα－Ｇａｌ三糖又はラムノースデンドリマーのコンジュゲーション。 均一なＬＹＴＡＣを作製するための高親和性Ｍ６Ｐ二糖のコンジュゲーション。 Ｍ６Ｐ修飾抗体のＳＰＲ結合研究。 ハーセプチン及びセツキシマブの化学酵素的グリカンリモデリング。 ＣＩ－ＭＰＲとＭ６Ｐ含有抗体のＳＰＲ結合データ。 インタクト抗体からのＡＤＣの単一ステップ合成の設計。 スキーム１．アジドタグ付き二糖オキサゾリンの化学合成。試薬及び条件：ａ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２、ＨＣｌ（水溶液）ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ、ＲＴ、５、９７％、１２、９３％、２２、９７％；ｂ）ＣＨ３ＯＮａ、ＣＨ３ＯＨ、５０℃；ｃ）ＢｎＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、８、２ステップで８７％、１８、３ステップで６８％；ｄ）ＢＨ３・ＴＨＦ、Ｂｕ２ＢＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、９１％；ｅ）ＡｃＳＨ、ピリジン／ＣＨＣｌ３、５０℃、１０、８９％、１９、７９％；ｆ）Ｎ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、１１、８５％、２１、８５％；ｇ）ＴｆＮ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣｕＳＯ４ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、ＲＴ、１３、８１％；２３、８５％；ｈ）ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ、０℃、１４、９４％、２４、９６％；ｉ）ＴＭＳＯＴｆ、４Å ＭＳ、ＣＨ２Ｃｌ２、－４０℃、８６％；ｊ）ＴＢＤＰＳＣｌ、イミダゾール、ＤＭＦ、ＲＴ；ｋ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、４０℃、８２％。 スキーム３．薬物－オキサゾリンコンジュゲートの合成（１～３）。試薬及び条件：ａ）Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＳＯ、ＲＴ、８２％；ｂ）Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＳＯ、ＲＴ；ｃ）ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ／ＤＭＳＯ、０℃、１、２ステップで７３％、２、２ステップで８０％、３、２ステップで７０％。 スキーム２．アジドタグ付き二糖オキサゾリンのトランスグリコシル化。反応は、２０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有するＰＢＳ緩衝液中で行われ、収率はＬＣ－ＭＳピーク強度に基づいていた。各反応部位について、ａ．２０当量のオキサゾリンを使用し；ｂ．１５当量のオキサゾリンを使用した。 インタクトＡＤＣ及びＩｄｅＳ処理によって放出されたＦｃドメインのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析。図２８Ａは、インタクトＡＤＣ３３のデコンボリューションされた質量である。 インタクトＡＤＣ及びＩｄｅＳ処理によって放出されたＦｃドメインのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析。図２８Ｂは、３３のＦｃドメインのデコンボリューションされた質量である。 インタクトＡＤＣ及びＩｄｅＳ処理によって放出されたＦｃドメインのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析。図２８Ｃは、インタクトＡＤＣ３４のデコンボリューションされた質量である。 インタクトＡＤＣ及びＩｄｅＳ処理によって放出されたＦｃドメインのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析。図２８Ｄは、３４のＦｃドメインのデコンボリューションされた質量である。 インタクトＡＤＣ及びＩｄｅＳ処理によって放出されたＦｃドメインのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析。図２８Ｅは、インタクトＡＤＣ３５のデコンボリューションされた質量である。 インタクトＡＤＣ及びＩｄｅＳ処理によって放出されたＦｃドメインのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析。図２８Ｆは、３５のＦｃドメインのデコンボリューションされた質量である。 乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２過剰発現）及びＴ４７Ｄ（ＨＥＲ２低発現）における細胞死滅研究。全てのアッセイは三重に実施された。 スキーム４．ＡＤＣを作製するための薬物－オキサゾリンコンジュゲートの１ステップトランスグリコシル化反応（３３～３５）。反応は５％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ緩衝液中で行われ、抗体濃度は２０ｍｇ／ｍＬであり、収率はプロテインＡ精製に基づいていた。各反応部位について、ａ．１５当量のオキサゾリンを使用し；ｂ．２５当量のオキサゾリンを使用した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２による同時の脱グリコシル化及びトランスグリコシル化により、ワンポットで部位特異的な抗体の標識及びコンジュゲーションが可能になった。 スキーム１．２つのアジドタグを保有する二糖オキサゾリン７の合成。試薬及び条件：（ａ）ＤＤＱ、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ、０℃～ＲＴ、及び９０％；（ｂ）ＢＨ３・ＴＨＦ、Ｂｕ２ＢＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、９４％；（ｃ）ＡｃＳＨ、ピリジン／ＣＨＣｌ３、ＲＴ、及び８２％；（ｄ）Ｎ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、及び７８％；（ｅ）ＮａＢｒＯ３、ＮａＳ２Ｏ４、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ、ＲＴ、及び６５％；並びに（ｆ）ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ、０℃、及び９０％ スキーム２．１つ又は３つのアジドタグを保有する二糖オキサゾリン１２及び１７の合成。試薬及び条件：（ａ）ＢＨ３・ＴＨＦ、Ｂｕ２ＢＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、９１％；（ｂ）ＡｃＳＨ、ピリジン／ＣＨＣｌ３、ＲＴ、及び８４％；（ｃ）Ｎ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、１０、８９％、１５、及び７３％；（ｄ）ＮａＢｒＯ３、ＮａＳ２Ｏ４、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ、室温、及び９０％；（ｅ）ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ、０℃、１２、９０％、１７、及び８５％；（ｆ）ＡｃＳＨ、ピリジン／ＣＨＣｌ３、６０℃、８５％；（ｇ）ＴＦＡ、ＣＨ２Ｃｌ２、－２０～０℃、及び８２％；（ｈ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２、ＨＣｌ（水溶液）、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ、次いで、ＴｆＮ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣｕＳＯ４、ＣＨＣｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、ＲＴ、及び６６％。 スキーム３．４つ又は６つのアジドタグを保有する二糖オキサゾリン３０及び３１の合成。試薬及び条件：（ａ）Ｎ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、及び０℃～ＲＴ；（ｂ）ＴｓＯＨ、ＭｅＯＨ、６０℃、２０、２ステップで７２％、２１、及び２ステップで５４％；（ｃ）ＴｓＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｔｓ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、２２、８５％、２３、及び７２％；（ｄ）２４、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、及び７８％；（ｅ）２５、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃～ＲＴ、及び７４％；（ｆ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２、ＨＣｌ（水溶液）、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ、次いでＴｆＮ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣｕＳＯ４、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、ＲＴ、２８、６７％、２９、及び５９％；並びに（ｇ）ＤＭＣ、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ、０℃、３０、８９％、３１、及び８４％。 トランスグリコシル化条件のスクリーニング。ａ各グリコシル化部位に基づく。ｂこれら３つの酵素はＦｕｃａ１，６ＧｌｃＮＡｃ抗体を受容体として認識しないため、非フコシル化抗体（ＧｌｃＮＡｃ－ハーセプチン）を受容体として使用した。ｃ室温で６時間後。ｄ測定なし。 スキーム４．異なるアジドタグ付き二糖オキサゾリンによるワンポットトランスグリコシル化。試薬及び条件：反応は、２５℃のＰＢＳ緩衝液中で２０当量のオキサゾリンを用いて行われた。（ａ）１時間後にさらに１回オキサゾリン（１０当量）を加え；（ｂ）さらに３回のオキサゾリン（各１０当量）を３０分ごとに加えた。 スキーム５．試薬及び条件：反応は、ＰＢＳ緩衝液中で２０当量のオキサゾリンを用いて行われた。（ａ）ビオチンタグの場合、６０分後にオキサゾリン３９をさらに１回（１０当量）加え；（ｂ）蛍光タグの場合、オキサゾリン４０をさらに４回（各１０当量）６０分ごとに加えて、反応を完了まで促進した。 スキーム６．クリックケミストリーによる、様々なＤＡＲを用いた構造的に定義されたＡＤＣの合成。試薬及び条件：アジドタグ付き抗体（最終濃度２ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＰＢ（３：７、ｖ／ｖ）中のＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（３．３～５．０当量／アジド基）と室温で８～２４時間インキュベートした。 ＡＤＣ４６のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析。（ａ）化合物３６の全抗体分析。（ｂ）化合物４６の全抗体分析。（ｃ）化合物３６のＦｃドメイン。（ｄ）化合物４６のＦｃドメイン。アスタリスク付きのピークは、インタクト抗体（ｂ）又はＦｃドメイン（ｄ）に由来するイオンフラグメントを示す。全抗体の分子量シフト：１６１，８８０－１４８，２６２＝１３，６１８≒１７０２×８（８つのペイロードの結合に等しい）、Ｆｃフラグメントの分子量のシフト：３２，１４３－２５，３３２＝６８１１≒１７０２×４（４つのペイロードの結合に等しい）。 乳癌細胞株ＢＴ４７４（ＨＥＲ２過剰発現）及びＴ４７Ｄ（ＨＥＲ２低発現）における細胞死滅研究。全てのアッセイは三重に実施された。ａ２つの独立したアッセイの代表的な結果。ｂＢＴ４７４細胞株の２つの独立したアッセイの平均。 化学酵素的グリカンリモデリング ＣＩ－ＭＰＲを介した細胞外タンパク質のリソソームへの輸送を利用したリソソーム標的化キメラ（ＬＹＴＡＣ）戦略。ａ）Bertozzi et alによって報告されたコンジュゲーション法、１４ｂ）本研究で説明される部位特異的化学酵素法。 トランスグリコシル化条件のスクリーニング。 スキーム１．リン酸化グリカンオキサゾリンによるトラスツズマブの化学酵素的グリカンリモデリング。反応はＰＢＳ緩衝液中で行われ、収率はプロテインＡ精製に基づいていた。ａ．１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有する１０当量のオキサゾリン；ｂ．２０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有する３０当量のオキサゾリン。 スキーム２ セツキシマブの化学酵素的グリカンリモデリング。反応はＰＢＳ緩衝液中で行われ、収率はプロテインＡ精製に基づいていた。ａ．１０当量のグリカンオキサゾリン（１）及び１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を使用した。ｂ．３０当量のグリカンオキサゾリン（５）及び２０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を使用した。 市販のセツキシマブ及び糖鎖改変セツキシマブ（９）のＦｃ及びＦａｂ Ｎ－グリカンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析（陽イオンモード）。ＦａｂドメインとＦｃドメインは、ＩｄｅＳ処理とその後のプロテインＬ分離によって切断された。次に、リン酸基の喪失をもたらしたＭ６Ｐ含有グリカンを除き、ＰＮＧａｓｅＦ処理、続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ分析前の完全メチル化によってＮ－グリカンを放出した。図４６Ａは、市販のセツキシマブからのＦａｂグリカンである。 市販のセツキシマブ及び糖鎖改変セツキシマブ（９）のＦｃ及びＦａｂ Ｎ－グリカンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析（陽イオンモード）。ＦａｂドメインとＦｃドメインは、ＩｄｅＳ処理とその後のプロテインＬ分離によって切断された。次に、リン酸基の喪失をもたらしたＭ６Ｐ含有グリカンを除き、ＰＮＧａｓｅＦ処理、続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ分析前の完全メチル化によってＮ－グリカンを放出した。図４６Ｂは、市販のセツキシマブからのＦｃグリカンである。 市販のセツキシマブ及び糖鎖改変セツキシマブ（９）のＦｃ及びＦａｂ Ｎ－グリカンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析（陽イオンモード）。ＦａｂドメインとＦｃドメインは、ＩｄｅＳ処理とその後のプロテインＬ分離によって切断された。次に、リン酸基の喪失をもたらしたＭ６Ｐ含有グリカンを除き、ＰＮＧａｓｅＦ処理、続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ分析前の完全メチル化によってＮ－グリカンを放出した。図４６Ｃは、糖鎖改変されたセツキシマブ９からのＦａｂグリカンである。 市販のセツキシマブ及び糖鎖改変セツキシマブ（９）のＦｃ及びＦａｂ Ｎ－グリカンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析（陽イオンモード）。ＦａｂドメインとＦｃドメインは、ＩｄｅＳ処理とその後のプロテインＬ分離によって切断された。次に、リン酸基の喪失をもたらしたＭ６Ｐ含有グリカンを除き、ＰＮＧａｓｅＦ処理、続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ分析前の完全メチル化によってＮ－グリカンを放出した。図４６Ｄは、糖鎖改変されたセツキシマブ９からのＦｃグリカン（完全メチル化なし）である。 ＣＩ－ＭＰＲとＭ６Ｐ含有抗体のＳＰＲ結合データ。分析物を、最高濃度５００ｎＭの２倍段階希釈で固定化チップ上に流した。センサーグラムは２つの独立した実験を表す。 総ＨＥＲ２及びＥＧＦＲレベルのウエスタンブロット分析。細胞を最終濃度１０ｎＭのネイティブ抗体又はＭ６Ｐ修飾抗体で処理し、４８時間後にＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、未処理細胞を対照として設定した。ａは、トラスツズマブ又は３によるＨＥＲ２の代表的な分解である。ｂは、セツキシマブ又は９によるＥＧＦＲの代表的な分解である。ｃは、トラスツズマブ又は３による処置後のＨＥＲ２レベルである。ｄは、セツキシマブ又は９による処置後のＥＧＦＲレベルである。全てのアッセイは三重に実施された。 １０ｎＭの天然抗体又はＭ６Ｐ修飾抗体で４８時間処理した後、生細胞フローサイトメトリーによって測定された細胞表面ＨＥＲ２又はＥＧＦＲの分解。ａは、表面ＨＥＲ２レベルの代表的なＦＡＣＳ分析である。ｂは、トラスツズマブ又は３による処置後の表面ＨＥＲ２レベルである。ｃは、表面ＥＧＦＲレベルの代表的なＦＡＣＳ分析である。ｄは、セツキシマブ又は９による処置後の表面ＥＧＦＲレベルである。全てのアッセイは三重に実施された。 試験したオキサゾリン化合物。
詳細な説明
本明細書では、グリカン工学によって調製された修飾抗体が開示される。本開示は、Ｆｃ領域の有効性及び安定性を高めるオリゴ糖で特異的にグリコシル化された、抗体分子のＦｃ領域、及びＦｃ領域を含む抗体又は抗体フラグメントに関する。いくつかの実施形態では、特異的にグリコシル化されたＦｃフラグメントは、モノクローナル抗体、好ましくはヒト又はヒト化モノクローナル抗体を含む。グリカン工学によりそのようなＦｃグリコシル化抗体又は抗体フラグメントを生成する方法が本明細書に開示される。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、開示された方法及び組成物の実践又は試験に使用することができる。本明細書で特に言及されている全ての刊行物及び特許は、本開示の主題に関連して使用され得る刊行物で報告されている化学物質、細胞株、ベクター、動物、機器、統計分析及び方法論の記載及び開示を含む、あらゆる目的で参照により組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、多糖又はオリゴ糖を指す。グリカンはまた、本明細書において、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖又はプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を指すために使用される。
本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）という用語には、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントが含まれる。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」と互換的に使用される。本明細書で使用される「ヒト抗体」とは、ヒトに天然に存在する抗体、その機能的フラグメント、又はヒト化抗体、すなわち、その一部（例えば、フレーム領域又はＦｃ領域）が天然ヒト抗体に由来する遺伝子操作された抗体を指す。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然の変異を除いて同一である。
処置の目的の「哺乳動物」とは、ヒト、飼育動物及び家畜、動物園、スポーツ動物、又はイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどのペット動物を含むあらゆる哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「処置すること」又は「処置」又は「緩和」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を指し、ここで、目的は、標的の病状又は障害を予防又は遅らせる（軽減する）ことである。処置を必要とする人には、すでにその障害を有する人だけでなく、その障害を有しやすい人、又はその障害を予防すべき人も含まれる。対象又は哺乳動物は、本開示の方法に従って治療量の抗体を投与された後、特定の病状又は障害に関連する症状の１つ以上がある程度軽減され、罹患率及び死亡率が減少し、生活の質の問題が改善される場合、「処置」に成功したことになる。処置の成功及び疾患の改善を評価するための上記のパラメーターは、医師によく知られた日常的な手順によって容易に測定可能である。
「治療有効量」という用語は、対象又は哺乳動物における疾患又は障害を「処置する」ために有効な抗体又は薬物の量を指す。「処置」の前述の定義を参照されたい。「慢性」投与は、初期の治療効果（活性）を長期間維持するための、急性モードではなく連続モードでの薬剤の投与を指す。「間欠的」投与は、中断することなく連続的に行われるのではなく、本質的に周期的に行われる処置である。１つ以上のさらなる治療剤と「組み合わせた」投与には、同時（併用）及び任意の順序での連続投与が含まれる。
本明細書で使用される「担体」には、使用される用量及び濃度で曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤が含まれる。多くの場合、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はTWEEN（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
本明細書で使用される「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は防止し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素及びそのフラグメント、抗生物質、並びに小分子毒素、又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）などの毒素、並びに以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を含むことが意図される。他の細胞毒性薬剤については以下に記載する。
「増殖阻害剤」は、本明細書で使用される場合、インビトロ又はインビボのいずれかで細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を指す。増殖阻害剤の例としては、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を遮断する薬剤が挙げられる。このような阻害剤としては、例えば、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビノレルビン及びビンブラスチン）、タキサン、並びにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、ブレオマイシン、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、及びａｒａ－ＣなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が挙げられる。
本開示は、ＩｇＧ抗体又はそのＦｃフラグメントの合成を提供し、ここで、所望の糖鎖は、フコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ受容体を含むコアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ受容体に付加される。したがって、本開示は、インビボでの半減期の延長、免疫原性の低下、インビボ活性の増強、標的化能力及び／又は治療剤を送達する能力の増加などの特定の生物活性を提供するための治療用抗体又はそのＦｃフラグメントの合成及びリモデリングを可能にする。
一態様では、アジドタグ付き抗体を提供するために、ワンポット方式での脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方に対するワンポット化学酵素リモデリング法が提供される（図１）。提供される方法は、
（ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供するステップ；
（ｂ）脱グリコシル化活性及びトランスグリコシル化活性の両方を有する単一のエンドグリコシダーゼ、又はその変異体を導入するステップ；
（ｃ）単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供するステップ；並びに
（ｄ）二糖コアを含むアジド修飾グリカンオキサゾリンを提供するステップ；並びに単一のエンドグリコシダーゼによりアジド修飾グリカンオキサゾリンをＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、アジドタグ付き抗体を提供するステップ
を含む。
別の実施形態では、アジドタグ付き抗体を提供するために、ワンポット方式での脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方に対するワンポット２酵素リモデリング法が提供される（図２）。提供される方法は、
（ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供するステップ；
（ｂ）脱グリコシル化活性を有する第１のエンドグリコシダーゼ、又はその変異体を導入するステップ；
（ｃ）エンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供するステップ；並びに
（ｄ）トランスグリコシル化活性を有する第２のエンドグリコシダーゼと、二糖コアを含むアジド修飾グリカンオキサゾリンとを提供するステップ；並びに第２のエンドグリコシダーゼによりアジド修飾グリカンオキサゾリンをＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、アジドタグ付き抗体を提供するステップであって、アジドタグ付き抗体が、第１のエンドグリコシダーゼによる加水分解に耐性がある、ステップ
を含む。
別の実施形態では、上記の２つの方法は、環歪みシクロオクチン部分含有薬物又はリガンドを、環歪み付加環化反応を介してアジドタグ付き抗体へのコンジュゲートさせて、均一な抗体－薬物コンジュゲート又は抗体－リガンドコンジュゲートを提供するためのクリックケミストリーステップをさらに含み得る。（図３）。
一態様では、本開示は、提供されるワンポット法における、アジドタグ付き二糖オキサゾリンなどの活性化オリゴ糖部分、及びその選択的に修飾された誘導体の使用を提供する。このような二糖オキサゾリンは、均一なコアフコシル化又は非フコシル化ＩｇＧ抗体及びＩｇＧ－Ｆｃフラグメントの効率的な化学酵素合成のための供与体基質として利用される。
一実施形態では、上記の方法で使用するためのアジド修飾グリカンオキサゾリンは、以下のオキサゾリン構造からなる群から選択される：図４に示すＭａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ二糖構造に基づくグループＩ、図５に示すＧｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ二糖構造に基づくグループＩＩ、図６のＭａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ二糖構造に基づくグループＩＩＩ。
提供されたリモデリング法の実践では、多くの二糖オキサゾリンがトランスグリコシル化ステップの基質として使用され得る。このような二糖オキサゾリン（ozazoline）には、例えば、図４に示され、以下の一般構造を有する、グループＩ Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ二糖のものが含まれる。
グループＩ、Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースのオキサゾリン
Figure 2024514683000005
別の実施形態では、二糖オキサゾリンには、例えば、以下の一般構造を有する、図５に示されるグループＩＩ Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ二糖のものが含まれる。
グループＩＩ、Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースのオキサゾリン
Figure 2024514683000006
別の実施形態では、二糖オキサゾリンには、例えば、図６に示され、以下の一般構造を有する、グループＩＩＩ Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃのものが含まれる。
グループＩＩＩ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースのオキサゾリン
Figure 2024514683000007
二糖は、二糖骨格の異なる部位において１つ以上のアジド又はその他のエンティティで選択的に修飾される。
本明細書では、図４、５、及び６に示すグループＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのアジド修飾グリカンオキサゾリンからなる群から選択される抗体アジド修飾グリカンオキサゾリンに結合した抗体コンジュゲートが提供される。前記抗体コンジュゲートは、薬物、毒素、標識、タンパク質、小分子、チオ、ビオチン及び蛍光標識から選択されるリガンドをさらに含んでもよい。前記抗体－薬物コンジュゲートとしては、例えば、リガンドが薬物であり、薬物対抗体比が２：１２であるコンジュゲートが挙げられる。
供与体基質として利用される二糖オキサゾリンは、癌、ウイルス感染症を処置するためなどの治療剤又は薬物、細胞原形質膜上の受容体を活性化する物質、細胞内化学に影響を与える薬剤、細胞物理学に影響を与える薬剤、遺伝子、遺伝子類似体、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＣＣＲ５又はＣＤ４などの表面受容体のアミノ酸配列、特定の抗体に対して親和性を有する抗原構造；ｇｐ１２０、ｇｐ４１、又はｇｐ１６０などの受容体リガンドのアミノ酸配列、受容体アンタゴニスト、受容体遮断剤、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、酵素モジュレーター、治療用タンパク質、タンパク質類似体、代謝産物、代謝産物類似体、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、抗原、抗原類似体、抗体又はそのフラグメント、抗体類似体、他の受容体細菌に対して反応性を有する修飾抗体とは異なる抗体、ウイルス、無機イオン、金属イオン、金属クラスター、ポリマー、蛍光化合物、及びそれらの任意の組み合わせを含む、追加の部分又はタグをさらに含み得ることが想定される。
一態様では、アジド修飾オキサゾリンはスペーサーをさらに含む。このようなスペーサーとしては、例えば、ポリエチレン（ＰＥＧ）リンカーを含むオリゴエチレンスペーサーが挙げられる。一実施形態では、アジド修飾グリカンオキサゾリンは、二糖コアと、二糖コアに結合した複数のポリエチレンリンカー又はデンドリマーを形成する他の分子リンカーとを含む。
一態様では、開示されるワンポットリモデリング法について、得られるトランスグリコシル化生成物に対する加水分解活性を持たず、脱グリコシル化能及びグリコシル化能の両方を有する、エンドグリコシダーゼが利用される。非限定的な実施形態では、エンドグリコシダーゼは、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２、野生型Ｅｎｄｏ Ｆ３、及びそれらの変異体からなる群から選択され得る。場合によっては、変異型酵素の方がトランスグリコシル化について最初のエンドグリコシダーゼより効率的である場合、野生型酵素は、アジドタグ付きグリカンオキサゾリンによるトランスグリコシル化反応のために、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、及びＥｎｄｏ－Ｆ３の別の変異型酵素と結合することができる。
前記エンドグリコシダーゼには、Ｅｎｄｏ－Ｓ２及びその変異体を含む化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のエンドグリコシダーゼが含まれ、ここで、エンドグリコシダーゼは、オリゴ糖（活性化糖オキサゾリンの形態）をフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ（又はＦｃフラグメント）に一括転移して、ＩｇＧ（又はそのＦｃフラグメント）の新しいグリコフォームを形成することを可能にする。（以下の配列表を参照）
別の態様では、本開示は、トランスグリコシル化効率の向上及び生成物の加水分解活性の減少又は抑制を示すＥｎｄｏ－Ｓ変異体を提供する。変異体は、好ましくは、Ａｓｐ－２３３における変異を含む部位特異的変異を含む。変異体には、Ｅｎｄｏ－ＳＤ２３３Ｑ（配列番号２）、Ｄ２３３Ｍ及びＤ２３３Ａ（配列番号３）が含まれるが、これらに限定されない。Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体としては、例えば、Ｄ１８４Ｍ、Ｄ１８４Ｅ、Ｄ１８４Ｃ、Ｄ１８４Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｎ、Ｄ１８４Ｑ、Ｄ１８４Ｓ及びＤ１８４Ｔを含む、Ｄ１８４に置換を有する変異体が挙げられる。Ｅｎｄｏ Ｆ３変異体には、例えば、Ｄ１６５Ａが含まれる。
別の態様では、本発明の開示は、Ｄ２３３Ｑ（配列番号２）及びＤ２３３Ａ（配列番号３）からなる群から選択される少なくとも１つの化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ Ａｓｐ－２３３変異体を含む組成物を提供する。
一実施形態では、リモデリングのための抗体は、エンドグリコシダーゼ媒介反応を通じて脱グリコシル化活性の基質として作用できる１つ以上のグリカンの存在を特徴とする任意の抗体又は抗体フラグメントであり得る。このような抗体としては、例えば、標的細胞上で発現される抗原に対して高い特異性及び親和性を有する抗体が挙げられる。非限定的な実施形態では、抗原は標的癌細胞上で発現される。
一実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、両方のＩｇドメインが、単糖部分（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ）又は三糖部分（例えば、マンノース－Ｎ－アセチルグルコサミン－Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｍａｎ－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ）に結合したＦｃ領域を含むものである。本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。しかし、好ましい実施形態では、それらはモノクローナルである。特定の実施形態では、本開示の抗体はヒト抗体である。
一実施形態では、本明細書に開示される方法における使用のための抗体は、市販の治療用抗体（例えば、ReoPro（商標）（アブシキシマブ）、RITUXAN（商標）（リツキシマブ）、ZENAPAX（登録商標）（ダクリズマブ）、Simulect（登録商標）（バシリキシマブ）、SYNAGIS（商標）（パリビズマブ）、REMICADE（登録商標）（インフリキシマブ）、ハーセプチン（Herceptin）（登録商標）（トラスツズマブ）、MYLOTARG（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）、Campath（登録商標）（アレムツズマブ）、Zevalin（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）、HUMIRA（登録商標）（アダリムマブ）、XOLAIR（登録商標）（オマリズマブ）、BEXXAR（トシツモマブ）、RAPTIVA（エファリズマブ）、ERBITUX（登録商標）（セツキシマブ）、Avastin（登録商標）（ベバシズマブ）、TYSABRI（登録商標）（ナタリズマブ）、従来の方法によって生成されたヒト抗体又はヒト化抗体、好ましくは臨床試験中のものから調製することができる。
本明細書で提供される方法における使用に適した他のモノクローナル抗体としては、セツキシマブ、リツキシマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トシツモマブ、エファリズマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、エタネルセプト、IGN101（登録商標）、ボロシキシマブ、抗ＣＤ８０Ｍａｂ、抗ＣＤ２３Ｍａｂ、CAT-3888（登録商標）、CDP-791（登録商標）、エラプツズマブ、MDX-010（登録商標）、MDX-060（登録商標）、MDX-07（登録商標）マツズマブ、CP-675.degree., 206（登録商標）、CAL（登録商標）ＳＧＮ－３０、ザノリムマブ、Adecatumumab（登録商標）、アデカツムマブ、オレゴボマブ、ニモツズマブ、ABT-874（登録商標）（ブリアキヌマブ）、デノスマブ、AM 108（登録商標）、AMG 714（登録商標）、フォントリズマブ、ダカクリズマブ、ゴリムマブ、CNTO 1275（登録商標）（ウステキヌマブ）、オクレリズマブ、HumaxCD20（登録商標）（オファツムマブ）、ベリムマブ、エプラツズマブ、MLN1202（登録商標）、ビシリズマブ、トシリズマブ、オクレリズマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ペクセリズマブ、アブシキシマブ、ラニビジムマブ、メポリズマブ、TNX-355（登録商標）、及びMYO-029（登録商標）（スタムルマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、例えば、細菌、真菌、寄生虫又はウイルス感染などの病原性感染に関連するモノクローナル抗体を修飾することを想定している。特定の実施形態では、抗体は、１７ｂ、４８ｄ、Ａ３２、Ｃ１１、２Ｇ１２、Ｆ２４０、ＩｇＧ１ｂ１２、１９ｅ、Ｘ５、ＴＮＸ－３５５、及びＦ９１を含むがこれらに限定されないＨＩＶ抗体であってもよく、これらは全て市販されている。
一実施形態では、アジドタグ付き非フコシル化抗体又はフコシル化抗体は、他のリガンドとのコンジュゲーションにより修飾されて、抗体コンジュゲートを提供する。一実施形態では、抗体コンジュゲートは、薬物、毒素、標識、タンパク質、小分子、チオ、ビオチン及び蛍光標識から選択されるリガンドを含む。一実施形態では、アジドタグ付き抗体は、クリックケミストリー反応による他のリガンドとのコンジュゲーションにより修飾され得る。クリック可能なリガンドは、１つ以上の高親和性Ｍ６Ｐオリゴ糖リガンド、トリ－ＧａｌＮＡｃ又はアシアロ糖タンパク質受容体に対する他の高親和性リガンド、天然循環抗体に結合するためのラムノース又はアルファ－Ｇａｌ部分、及びシグレック又は他のグリカン結合タンパク質に結合するための高親和性グリカンリガンドを含み得る。このようなクリックケミストリー反応は当業者に周知である。
したがって、本開示は、疾患又は障害を処置するための生物活性を有する薬物又は治療剤を送達するための送達デバイスを提供し、送達デバイスは、所定の糖鎖又はシアログリカン、及び末端糖残基又はシアル酸に結合した治療剤又は薬物を有するリモデリングされたＩｇＧ又はＩｇＧ－Ｆｃフラグメントを含む。さらに、癌又は他の疾患に関連する抗体はまた、特定の受容体に個別に適合するようにリモデリングされ、それにより生物活性が増加し得る。
一実施形態では、アジドタグ付き抗体は、α－Ｇａｌ、ラムノース（Ｒｈ）、又はマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）をさらに含む。
さらに別の態様では、本開示は、所定のオリゴ糖部分を有するコアフコシル化抗体若しくは非フコシル化抗体又はそのＦｃフラグメントの実質的に均一な調製物を提供し、ここで、実質的に均一な調製物は、前述の方法のいずれかによって生成される。このような均一な調製物を含む組成物も提供される。
一実施形態では、高親和性マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）グリカンリガンドのリモデリングされた抗体分子へのコンジュゲーションを介して、細胞外タンパク質及び膜関連タンパク質の分解を標的とする方法が提供される。
したがって、コンジュゲートがＭ６Ｐグリカンであり、得られる前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体がリソソーム媒介標的分解を標的とする、ワンポット化学酵素リモデリング法が提供される。前記方法は、Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供するためのワンポット内での脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方のステップを含み、この方法は、
（ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供すること；
（ｂ）脱グリコシル化能及びトランスグリコシル化能の両方を有する、Ｅｎｄｏ－Ｓなどの単一のエンドグリコシダーゼを導入すること；
（ｃ）単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供すること；
（ｄ）Ｍ６Ｐ－グリカンオキサゾリンを提供すること；並びに
（ｅ）単一のエンドグリコシダーゼによりＭ６Ｐ－グリカンオキサゾリンをＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供すること
を含む。
別の実施形態では、コンジュゲートがＭ６Ｐグリカンであり、得られる前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体がリソソーム媒介標的分解を標的とする、ワンポット２酵素化学酵素リモデリング法が提供される。前記方法は、Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供するためのワンポット内での脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方のステップを含み、この方法は、
（ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供すること；
（ｂ）脱グリコシル化能を有する第１のエンドグリコシダーゼを導入すること；
（ｃ）単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供すること；
（ｄ）第２のエンドグリコシダーゼ及びＭ６Ｐ－グリカンオキサゾリンを提供すること；並びに
（ｅ）第２のエンドグリコシダーゼによりＭ６Ｐ－グリカンオキサゾリンをＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供すること
を含む。
一実施形態では、２酵素法は、脱グリコシル化ステップに野生型Ｅｎｄｏ Ｓを利用し、トランスグリコシル化法にＳ２変異体（Ｄ１８４Ｍ）を利用し得る。
非限定的な実施形態では、Ｍ６Ｐ－グリカンオキサゾリンは、図８に示すリン酸化グリカンオキサゾリンからなる群から選択される。
一実施形態では、前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体は、細胞外タンパク質への結合を標的とする。別の実施形態では、前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体は、膜結合タンパク質への結合を標的とする。前記膜結合タンパク質としては、例えば、ＨＥＲ２又はＥＧＦＲが挙げられる。
なおさらなる態様では、本発明は、本明細書に開示されるワンポット化学酵素リモデリング法を使用して生成され、処置対象において生物活性を調節するのに十分な量の所望のグリコシル化形態を有する、リモデリングされた抗体を投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法を提供する。
さらなる実施形態では、本明細書に開示されるワンポット化学酵素リモデリング法を使用して生成されたリモデリングされた抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。抗体は、例えば対象の癌の処置において、治療剤としての使用のための特性を示す。このような医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された治療有効量の１つ以上のリモデリングされた抗体を含む。１つ以上のリモデリングされた抗体及び任意選択により追加の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示されるように本開示に照らして、当業者には公知である。ヒトへの投与の場合、調製物は、FDA Office of Biological Standards又は他の国の対応する当局によって要求される、無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の基準を満たさなければならないことが理解される。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、あらゆる溶媒、緩衝剤、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香料、染料、当業者に公知であるような同様の材料及びそれらの組み合わせが含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp.1289-1329を参照）。従来の担体が活性成分と不適合である場合を除き、治療用組成物又は医薬組成物におけるその使用が企図される。
組成物は、固体、液体、エアロゾルのいずれの形態で投与されるか、及び注射などの投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含み得る。リモデリングされた抗体（及び任意の追加の治療剤）は、当業者に公知であるような任意の方法又は任意の方法の組み合わせによって投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照）。非経口投与、特に、静脈内注射は、リモデリングされた抗体などのタンパク質又はポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。
本明細書に開示されるワンポット法を使用して得られるリモデリングされた抗体はいずれも、本明細書に記載される治療方法において使用され得る。本明細書に記載の治療方法における使用のために、リモデリングされた抗体は、適正な医療行為と一致する方法で製剤化され、投薬され、投与される。これに関連して考慮すべき要素には、処置される特定の疾患、処置される特定の対象、対象の臨床状態、疾患又は状態の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与方法、投与スケジュール、及び医師又は当業者に知られている他の要因が含まれる。
処置について、リモデリングされた抗体の適切な投与量（単独で使用する場合、又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用する場合）は、処置される疾患の種類、投与経路、患者の体重、疾患の重症度及び経過、リモデリングされた抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前又は同時の治療的介入、患者の病歴及びリモデリングされた抗体に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。いずれにせよ、投与を担当する医師は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象に対する適切な用量を決定する。本明細書では、様々な時点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない、様々な投与スケジュールが企図される。
別の実施形態では、提供される送達デバイスは、診断及び予後の用途のために、検出可能な標識又はマーカーを標的抗原に送達するように設計される。前記送達デバイスは、所定の糖鎖を有するリモデリングされたＩｇＧ又はＩｇＧ－Ｆｃフラグメントと、リモデリングされた抗体に結合された検出可能な標識又はマーカーとを含む。「検出可能な標識」又は「マーカー」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、放射性又は化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用される酵素）、ビオチン－ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン、又は標的に相補的な配列を有するタンパク質若しくは核酸分子が挙げられる。検出可能な標識は、多くの場合、標的抗原に結合する検出可能部分の量を定量するために使用できる、測定可能なシグナル、例えば、放射性シグナル、色シグナル、又は蛍光シグナルを生成する。シグナルの定量は、例えば、シンチレーション計数、密度計、フローセル分析、ＥＬＩＳＡ、又は質量分析による直接分析によって達成され得る。当業者は、目的の標識化合物に関する技術及び検出手段に精通している。これらの技術及び方法は従来のものであり、当技術分野では周知である。実施形態の別の態様では、上記の疾患又は障害の処置又は診断に有用な材料を含有する製品（例えば、キット）が提供される。製品は、容器と、容器上の、又は容器に付随するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、組成物単独、又は状態の処置、予防及び／又は診断に有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈注射溶液バッグ又は皮下注射針で突き刺し可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。
ラベル又は添付文書は、その組成物が選択された状態の処置に使用されることを示す。製品は、その中に含有される組成物を有する容器を含んでもよく、ここで、組成物は、リモデリングされた抗体を含む。
特定の実施形態におけるキットは、組成物が特定の状態を処置するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。或いは、又はさらに、キットは、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む第２（又は第３）の容器をさらに含んでもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示すために挙げられる。当業者にとって、以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施形態の実施において良好に機能するように発明者によって見出された技術を表しており、従って、その実施のための好ましい形態を構成すると考えられることが理解されよう。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を加えても同様又は類似の結果を得ることができることが理解されよう。
実施例１
以下に記載するように、選択的に修飾された二糖、三糖、四糖オキサゾリンの体系的な研究が行われ、一連のエンドグリコシダーゼの供与体基質特異性と、治療用抗体のグリカンリモデリングにおけるそれらの変異体が調べられた。抗体上のトランスグリコシル化について、異なるエンドグリコシダーゼの供与体基質として機能する最小のアジド修飾二糖構造が発見された。切断及び修飾されたＮ－グリカンを保有する糖鎖改変された抗体は、エンドグリコシダーゼ及びその変異体による加水分解に耐性を持つようになるため、この発見は、脱グリコシル化中間体と酵素を分離する必要がなく、１つの反応器内で抗体の脱グリコシル化反応とトランスグリコシル化反応を組み合わせる、単純な「ワンポット」グリカンリモデリング法につながった。
データは、アジドタグ付き抗体が、明確に定義された抗体薬物比（ＤＡＲ）を有する均一で部位特異的な抗体－薬物コンジュゲートを生成するのに顕著に効率的であることを示す。この観察は、任意の所与の抗体、リンカー、及びペイロードを使用して抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成する一般的な方法を提供する。この方法は、蛍光標識、及び標的化のためのグリカンリガンドなどの特殊なリガンドの導入にも特に有用である。この部位特異的コンジュゲーション法は、標的タンパク質分解のために高親和性マンノ－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）オリゴ糖リガンドを抗体に結合させることにも適用できることが実証されている。この部位特異的コンジュゲーション法は、レクチン及び他のグリカン結合タンパク質、血清抗体を標的とするために、任意の特定のグリカンリガンドに結合させるために適用できる。
抗体のＦｃグリカンに部位選択的にアジドタグを導入する一般的な方法。単一酵素ワンポット法の場合、Ｅｎｄｏ－Ｓ２などの野生型エンドグリコシダーゼを脱グリコシル化及びトランスグリコシル化の両方に使用して、アジドタグ付き抗体を生成する（図１）。この方法は、そのようなエンドグリコシダーゼがトランスグリコシル化に修飾二糖オキサゾリンを使用できるが、トランスグリコシル化生成物に対して加水分解活性が低いか又は全くないという発見によって可能になった。２酵素ワンポット戦略では、市販の抗体を最初にＥｎｄｏ－Ｓなどの野生型エンドグリコシダーゼで処理し、次いでＥｎｄｏ－Ｓ２などの別のエンドグリコシダーゼ又は最初のエンドグリコシダーゼよりも高いトランスグリコシル化活性を有するその変異体によってトランスグリコシル化を実行する（図２）。上記のワンポット法では、オキサゾリンは、直接転移のための薬物又はリガンドを含む、アジド部分以外のエンティティで事前に修飾されていてもよい。図３は、アジドタグ付き抗体への薬物又は他のエンティティのクリックコンジュゲーションを示す。
修飾グリカンオキサゾリンの一般構造。選択的に修飾されたグリカンオキサゾリンの体系的な研究が実施され、異なるエンドグリコシダーゼによる抗体修飾の供与体基質として機能し得る最小構造としてアジド修飾二糖が決定された。このようなグリカンオキサゾリンは、例えば、図４～６の構造から選択されるものである。ここで、コアマンノースは、オリゴエチレンスペーサーで修飾して、異なる数のアジドタグを導入でき；オリゴエチレンスペーサーは、マンノース残基の異なる位置に配置でき；オリゴエチレンスペーサーの長さは、異なる重合度に応じて選択でき；直鎖状スペーサーの他に、オリゴエチレンスペーサーで伸長された分岐足場も使用でき；末端アルキン、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）、テトラジン、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）、シクロプロペンなどの他の官能基もグリカンオキサゾリンに導入でき；最大３つの異なるスペーサーを異なる位置に導入でき；コアβ－マンノースは、β－グルコースに置換して「加水分解耐性」オキサゾリンを開発することができ、上記の修飾は全てグルコース由来の構造に適用でき；グリカンは二糖に限定されず、選択的に修飾された三糖及び四糖オキサゾリンもトランスグリコシル化に含めることができる。
アジドタグ付き二糖の化学合成。アジドタグ付き二糖オキサゾリン又はその誘導体は、異なる合成経路で合成できる。以下の記載はいくつかの典型例を示すだけのものであり、これのみが調製方法であることを意味するものではない。
より小さな合成二糖オキサゾリンがトランスグリコシル化のＥｎｄｏ－Ａ及びＥｎｄｏ－Ｍの基質として機能し得ることが示されているが（Y Zeng et al.Chem Eur J 200612:3355-3364）、これらの抗体特異的エンドグリコイラーゼ（endoglycoylase）及びその変異体が、抗体を受容体として使用してトランスグリコシル化のより小さな基質を認識できるかどうかは明らかでない。これを試験するために、一連のアジドタグ付き二糖オキサゾリンを合成する試みが行われた。２０２０年に、ＰＥＧ修飾コア二糖オキサゾリンの合成、及び受容体としてモデルタンパク質を用いたそのトランスグリコシル化が報告された。（Goto et al, 2020 Tetrahedr Lett 61:151475）ＰＥＧの柔軟性及び溶解性を考慮して、ＰＥＧ由来の足場を備えたアジド基を導入することが決定された。まず、エンドグリコシダーゼによって認識され得るように、ＰＥＧリンカーが天然のグリカン分岐に似た、２つのアジド基を有する二糖を設計した（図９）。既知の二糖１（H. Ochiai et al., 2008 J Am Chem Soc 130:13790-13803）から出発して、ＤＤＱによるＰＭＢ基の選択的除去により、化合物２が収率９０％で得られ、これは位置選択的開環反応により２個の遊離ＯＨを有する化合物３に変換された。ＡｃＳＨによるアジド基のアセトアミド基への還元後、塩基としてＮａＨを用いた化合物４とＮ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔのカップリングにより、アジドタグが７８％の収率で導入された。次に、アジドの存在下でベンジル基を選択的に除去するために、二相酸化条件（ＮａＢｒＯ３／Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）が採用され（M Niemietz et al., 201147:10485-10487）、これにより、所望の遊離グリカン６が６５％の収率で得られた。最後に、水中で、過剰量の２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）及びＴＥＡで処理することにより、オキサゾリン形成が単一ステップで達成され（MNouchi et al., 2009 J Org Chem 74:2210-2212）、化合物７が９０％の収率で得られた。
次に、１つ又は３つのアジド基を有する二糖を合成した（図１０）。マンノース残基の６位が、単一のアジド末端ＰＥＧリンカーの導入のために選択された。３の位置選択的開環によりヒドロキシルがスムーズに露出されて、二糖８が得られた。アジド基をアセトアミド基に還元した後、ＰＥＧリンカーが高収率で導入されて、１０が得られた。酸化条件下での選択的脱ベンジル化は効率的であることが証明され、遊離二糖１１が９０％の収率で得られ、これは、ＤＭＣで処理した後にオキサゾリン１２に変換された。並行して、３つのアジドタグ付き二糖の合成も３から開始された。アジド基をアセトアミド基に還元すると、酸性条件下でベンジリデン基及びＰＭＢ基が同時に除去され（H. Ochiai et al., 2008 J Am Chem Soc 130:13790-13803）、これにより、３つの遊離ＯＨを有する１４が得られた。次に、ＰＥＧリンカーをマンノース残基の３、４及び６位に導入して１５を得た。同じ脱ベンジル化条件に従って、反応は非常に速く進行したが、ＥＳＩ－ＭＳでモニタリングしたところ、所望の生成物は一部の分解構造とともに低収率で単離されたことがわかった。ＰＥＧ成分の増加により水溶性が高まり、その結果、部分的に脱保護された中間体が水相に移動し、フリーラジカルと直接相互作用し（M Adinilfi et al.1999, Tetrahedr Lett 40:8439-8441）、これにより、急速な反応及び望ましくない生成物が生じた可能性がある。代わりに、２ステップの脱保護を適用した。（H. Ochiai et al., 2008 J Am Chem Soc 130:13790-13803）まず、１５のベンジル基を接触水素化により除去した。この条件下で、アジド基は同時にアミノ基に還元され、その後、銅触媒によるジアゾ転移反応によってアジド官能基に戻されて（PT Nyffeler et al., 2002 J Am Chem Soc 124:10773-10778）、２ステップで６６％の収率で１６が得られた。最後に、標準的なオキサゾリン形成により、１７が優れた収率で得られた。
以前の研究では、より高いＤＡＲを有するＡＤＣは効力が増加する傾向があることが示されている。（RP Lyon et al., 2015 Nat Biotechnol 33 :733-735）少数のケースでは、臨床的に承認されたEnhertu（登録商標）及びTrodelvy（登録商標）で例示されるように、親水性リンカーペイロードの使用によって８という高いＤＡＲが安全に達成されている。（A Bardia et al, 2019 N Engl J Med 380:741-75；W Viricel et al., 2019 Chem Sci 10:4084-4053）。双直交性のタグを抗体に備えるために、４つ又は６つのアジド基を保有する二糖が設計された。合成は、分岐した足場から開始した（図１１）。まず、ジオール１８（B Linclau et al., 2012 Angew Chem Int Ed 51:1232-1235）及びトリオール１９（2008, Chem Lett 31:440-441）をアジド末端リンカーによって伸長し、トリチル基を除去した後、それぞれ化合物２２及び２３が得られた。２２及び２３の露出したＯＨをビストシルリンカーでさらに伸長して、それぞれコンジュゲーションの準備ができた化合物２４及び２５を得た。次に、同じ前駆体から出発して、化合物２６及び２７は、それぞれ６と足場２４及び２５のカップリングによって容易に得られ、全体の収率は両方とも十分なものであった。最後に、２ステップの脱保護及びオキサゾリン形成の後、それぞれ４個及び６個のアジド基を有する化合物３０及び３１が中程度の収率で得られた。
以前の研究では、オキサゾリン供与体の修飾がエンドグリコシダーゼのトランスグリコシル化活性に影響を及ぼさない可能性があることが示されている。困難なβ１，４－マンノシド結合の構築を回避するために、β－Ｄ－Ｍａｎ部分をβ－Ｄ－Ｇｌｃで置換して、Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ二糖を合成した（図１２）。したがって、既知のビルディングブロック３２及び３３から出発して、従来のグリコシル化条件（ＮＩＳ／ＡｇＯＴｆ）により、β異性体のみの所望の二糖３４が７３％の収率で得られた。特に、このステップは立体選択性を失うことなくグラムスケールで実施できた。次いで、標準的な脱ベンジル化及びベンジル化、続いてＰＭＢの除去により、３ステップにわたって化合物３７を７４％の収率で得た。最後に、７の合成について記載したのと同じ手順に従って、Ｇｌｃ－ＧｌｃＮＡｃオキサゾリン４２が得られた。
合成アジドタグ付き糖オキサゾリンに対する異なるエンドグリコシダーゼの基質特異性の評価。オキサゾリンを利用して、異なるエンドグリコシダーゼによるトランスグリコシル化条件をスクリーニングした。化合物７をグリコシル供与体として選択し、抗Ｈｅｒ２抗体（ハーセプチン）であるトラスツズマブをモデルｍＡｂとして使用して、抗体のグリカンリモデリングに関する合成二糖の可能性を調べた（表１）。この反応は、高活性であり、インタクトＩｇＧ抗体のＦｃ脱グリコシル化に特異的であることが見出された野生型Ｅｎｄｏ Ｓから開始された。（W Huang et al, 2012 J Am Chem Soc 134:12308-12318；M Collin et al., 2001 EMBO J 20:3046-3055）触媒量の酵素（０．２％ｗ／ｗ）でトランスグリコシル化は観察されなかった。酵素の量を増やすと（１％、ｗ／ｗ）、この手順が加速されることが判明したが、過剰な糖オキサゾリンの添加により促進した後であっても、収率は中程度にすぎなかった。それにもかかわらず、生成物は一旦形成されると、おそらくその非天然構造のため、野生型Ｅｎｄｏ Ｓによっても加水分解されなかった。大きい二分岐グリカンオキサゾリンを抗体に効率的に転移できる変異体であるＥｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑ（W Huang et al, 2012 J Am Chem Soc 134:12308-12318）も効率的ではなく、比較的大量の酵素（１０％、ｗ／ｗ）を使用した場合でも収率は１５％であった。驚くべきことに、血清型Ｍ４９の化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来の別のエンドグリコシダーゼ、すなわちＥｎｄｏ Ｓ２（J Sjogren et al., 2013 Biochem J 455:107-118）は、触媒量の酵素（０．１％～０．２％ｗ／ｗ）により、このアジドタグ付き二糖に対して優れた活性を示し、反応は１時間以内に完了することができた。この条件下では、生成物のわずかな加水分解が観察され、これにより生成物の蓄積が可能となった。強力なトランスグリコシル化活性と、市販の抗体からの複合型Ｎ－グリカンの効率的な加水分解を共に考慮すると、Ｅｎｄｏ Ｓ２は、抗体の不均一なグリコフォームをリモデリングして均一な構造を生成するための実用的な「ワンポット」戦略を提供した。幅広い基質特異性及び低下した加水分解活性を有するグリコシンターゼであるＥｎｄｏ Ｓ２変異体（Ｄ１８４Ｍ）も試験され（Y Zeng et al, 2006 Chem Eur J 12:3355-3364）、野生型Ｅｎｄｏ Ｓと比較して同様の活性を示すが、効率的なトランスグリコシル化には比較的大量の酵素（３％～５％）が必要であることが見出された。４つの酵素に加えて、他のいくつかのエンドグリコシダーゼも試験した。コアフコシル化された複合型Ｎ－グリカンを優先的に認識し、治療用抗体のＦａｂ及びＦｃグリカンの両方のリモデリングに使用されているＥｎｄｏ Ｆ３（JP Giddens et al., 2018 Proc Natl Acad Sci USA 115:12023-12027）は、このアジドタグ付き二糖に対しては活性を示さなかった。非フコシル化基質を好むＥｎｄｏ Ａ、Ｅｎｄｏ Ｄ及びＥｎｄｏ ＣＣについては、ＧＮＦ－ハーセプチンをフコシダーゼ（ＢｆＦｕｃＨ）で処理して、脱フコシル化Ｆｃグリコフォームを生成した。結果は、Ｅｎｄｏ Ｄがある程度のトランスグリコシル化活性を示したものの、遷移生成物のみが観察されたことを示した。Ｅｎｄｏ Ａ又はＥｎｄｏ ＣＣでは、大量の酵素（１０％、ｗ／ｗ）を使用しても生成物は得られなかった。
Figure 2024514683000008
最適化された条件で、他の二糖を使用してトランスグリコシル化を試みた（図１３）。結果は、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２が全てのグリコシル供与体に対して良好に機能することを示した。触媒量の酵素（０．１％～１．０％）により、反応は対応する生成物をスムーズに生成する。特に、化合物７及び１２は、トランスグリコシル化を１時間以内に完了することができる非常に優れた基質であったため、１～３個のアジド基を保有する二糖を完全に変換するには、１部分のオキサゾリンで十分であった一方、化合物１７及び４２は加水分解に耐性があったため、その結果、比較的大量の酵素が必要であったが、追加のオキサゾリンは必要でなかった。ただし、４つ（２８）又は６つ（２９）のアジド基を保有する二糖の場合、オキサゾリン供与体に対するＥｎｄｏ Ｓ２の加水分解活性により、反応を完了させるために追加のオキサゾリンが必要であったが、過剰のグリカンオキサゾリンは、プロテインＡの精製中に遊離オリゴ糖の形態で回収でき、これは、ＤＭＣ／Ｅｔ３Ｎを用いて１ステップでグリカンオキサゾリンに容易に変換され、トランスグリコシル化のためのグリカンオキサゾリンのリサイクルが可能になった。
次に、ワンポット方式で抗体のグリコシル化をリモデリングする可能性を調べた。したがって、市販のハーセプチン、グリカンオキサゾリン７、及び野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２の混合物をＰＢＳ緩衝液中、室温でインキュベートし、反応をＬＣ－ＭＳ分析でモニタリングした。予想通り、Ｅｎｄｏ Ｓ２触媒によるハーセプチンの脱グリコシル化は急速に起こり、反応条件下で５分以内に完了した。次いで、トランスグリコシル化生成物は、明らかな加水分解なしに経時的に着実に形成され、２時間以内に９５％を超える収率に達した（図１４）。特に、ここで説明するワンポットアプローチは、脱グリコシル化中間体の分離又は酵素の変更を必要とせずに、不均一なグリコフォームを均一で機能化されたグリカンに変換することができた。さらに、固定化された野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２（T Li et al., 2018 Carbohydr Res 458-459, 77-84）を触媒として使用すると、トランスグリコシル化の完了時に、所望の抗体を濾過及び緩衝液交換によって容易に得ることができることが確認された。これは、工業的製造には実用的であろう。
アジドタグ付き抗体との部位特異的コンジュゲーション。これらのアジドタグ付き抗体を利用して、クリックケミストリーを使用してＡＤＣを作製し、モデル弾頭としてモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を使用した。これはＦＤＡに承認されたＡＤＣの作製に使用されている（図１５）。切断可能なジペプチドリンカーを有するジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）末端ＭＭＡＥ誘導体をアジドタグ付き抗体とインキュベートし、反応をＬＣ－ＭＳでモニタリングした。クリックケミストリーにより、徐々に所望の化合物が得られることが見出された。６Ｎ３修飾ハーセプチンとＤＢＣＯ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥの反応を例に挙げる。ＬＣ－ＭＳによって示されるように、６つの部位全てが２０時間以内に薬物とコンジュゲートした（図１６）。薬物がＦｃドメインに特異的にコンジュゲートしていることをさらに検証するために、生成物をプロテアーゼＩｄｅＳで消化し、続いてＬＣ－ＭＳ分析を行った。結果は、分子量のシフトが結合したリンカー（２９２０５－２４９７２＝４２３３＝１４１１×３）と一致することを示し、生成物の構造を確認した。
最後に、ＡＤＣの癌細胞死滅能力を異なる薬物抗体比（ＤＡＲ）で調べた。高レベル（ＢＴ４７４）及び低レベル（Ｔ４７Ｄ）のＨＥＲ２を発現する２つの乳癌細胞株を使用した。結果は、ＨＥＲ２過剰発現細胞株（ＢＴ４７４）におけるＤＡＲの増加に伴い、ＡＤＣの細胞毒性が劇的に増加したことを示した。しかし、抗原陰性細胞株（Ｔ４７Ｄ）では細胞死滅の顕著な傾向は観察されず、標的細胞に対するＡＤＣの高い選択性が示された。
ビオチン又は蛍光基による抗体の部位特異的標識。機能化抗体は、診断、インビボイメージング、治療及び分子生物学のツールとして広く使用されており、インタクト抗体を正確に操作する方法の開発を刺激している。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを用いた全体的なリジン標識（aa Wakankar et al., 2010 Bioconjug Chem 21:1588-1595）、又はジスルフィド結合の還元及びマレイミドとの反応を介したシステインコンジュゲーション（SO Doronina et al., 2003 Nat Biotechnol 21:778-784）によるものなどの従来法は、結合部位及び化学量論の制御が欠如しているため、不均一なコンジュゲートが生成される。アジドタグ付き抗体をユニバーサルプラットフォームとして使用すると、インタクト抗体の部位特異的標識が簡単であることが判明した。ビオチン及びローダミンを含む異なる官能基を保有する多くのジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）末端プローブをアジドタグ付き抗体とインキュベートし、反応をＬＣ－ＭＳでモニタリングした。クリックケミストリーにより、徐々に所望の化合物が得られることが見出された（図１７）。
アジドタグ付き二糖によるインタクト抗体のワンポットリモデリング（図１４）及び野生型ＥｎｄｏＳ２の緩和された基質特異性によって後押しされ、次に、ビオチン又はフルオロフォアでタグ付けされた二糖オキサゾリンなどのより複雑な構造を、Ｅｎｄｏ Ｓ２を使用してインタクト抗体に直接転写できるかどうかが調べられた。この方法では、市販の抗体をワンステップで標識できる。この目的のために、アミンカップリング反応又はクリックケミストリーのいずれかを介してビオチン又はＴＡＭＲＡが二糖に導入され、修飾された二糖が依然としてＥｎｄｏ Ｓ２の良好な基質として機能できることが見出された。ビオチン化二糖は、触媒量の酵素（０．１％、ｗ／ｗ）を使用して１．５時間以内に９５％の収率でインタクト抗体に転写され、追加のオキサゾリンを加えると、ＴＡＭＲＡタグ付き二糖は生成物の約８５％を得ることができた（図１８）。まとめると、本明細書で説明した化学酵素的リモデリング法は、インタクト抗体のワンステップ標識に大きな可能性を示した。
補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関するα－Ｇａｌとラムノースの部位特異的コンジュゲーション。補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）は、抗体を介した標的細胞死滅の主要なメカニズムの１つである（s Andrighetto et al., 2019 Int J Mol Sci 20）。それにもかかわらず、多くの治療用抗体は、強力な補体依存性の細胞毒性を刺激する能力が低いため制限されている。次に、化学酵素的アプローチを適用してα－Ｇａｌ又はラムノース（Ｒｈａ）抗原抗体コンジュゲートを作成し、天然の抗α－Ｇａｌ及び抗Ｒｈａ ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体を動員して、標的細胞（癌、細菌、ウイルス）を死滅指せる強力なＣＤＣ応答を引き起こすことができるかどうかを試験した。以前の研究では、α－Ｇａｌエピトープの複数のコピー（多価性）の提示が効率的な癌細胞の死滅に重要であることが示されており（J Sianturi et al., 2019 Angew Chem Int Ed 58:4526-4530）、α－Ｇａｌ三糖又はＲｈａの複数のコピーを有するポリリジンベースのデンドリマーをコンジュゲーションに使用し、調整された数のグリカンリガンドを有するα－Ｇａｌ／Ｒｈａ抗体コンジュゲートが得られた（図１９）。細胞死滅研究により、コンジュゲートが抗原陽性細胞株において補体依存性の細胞毒性を示し、その効力は原子価の増加とともに増加することが示された。
標的化のための抗体への特定のグリカン又はペプチドリガンドの部位特異的コンジュゲーション。この方法は、治療薬の標的化及び強化のための他のグリカンリガンド又は他のペプチド／タンパク質リガンドの部位特異的コンジュゲーションもカバーする。これらには、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体を肝臓に標的化するためのＧａｌＮＡｃ多価リガンドのコンジュゲーション；マクロファージ及び樹状細胞を標的とする高マンノース型グリカンリガンドのコンジュゲーション；Ｔ細胞及び腫瘍細胞上のシグレックへのシアリルグリカンのコンジュゲーションが含まれる。
リソソームの標的タンパク質分解のための抗体への高親和性マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）リガンドの部位特異的導入。従来の薬物開発の取り組みは主に、酵素及び受容体などの創薬可能なタンパク質を標的とする小分子に焦点を当てている（AL Hopkin et al., 2002 Nat Rev Drug Disc 1:727-730）。しかし、転写因子、タンパク質複合体、ＲＡＳファミリータンパク質、調節／足場タンパク質（CM Crews 2010 Chem Biol 17:551-555；MJ Bond 2021 doi:10.1039/D1031CB00011J）などの小分子によって調節できない創薬不可能な標的は、ヒトプロテオームの８５％以上を占め（JN Spradlin et al., 2021 Acc Chem Res doi 10.1021/acs.accounts.1021c00065）、したがって、標的タンパク質の制御可能な分解は、創薬不可能に取り組むための新しい戦略を表す。ユビキチン－プロテアソーム系を介して目的のタンパク質（ＰＯＩ）を分解するタンパク質分解標的化キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）（J Lu et al., 2015 Chem Biol 22:755-763）は、癌（M Schapira et al., 2019 Nat rev Drug Disc 18:949-963；Y Zou et al., 2019 Cell Bichem Funct 37:21-30；AD Cottonet al., 2022 J Am Chem Soc 143:593-598）、ウイルス感染（K Montrose et al., 2014 Biochem Biophys Res Commun 453:735-740）、免疫障害（R Kolb et al., 2021 Nat Commun 12:1281）及び神経変性疾患（S TOMISHIGE ET AL., 2021 Ange Chem Int Edd 60:3346-3354）を含む様々な疾患に関連する、異なる種類の標的タンパク質の分解に利用され、成功している。しかし、この戦略は、ユビキチン化のための細胞内での標的関与に限定されており（PM Cromm et al., 2017 Cell Chem Biol 24:1181-1190）、膜タンパク質及び細胞外タンパク質は標的化できないままであるため、細胞質結合ドメインを有しないタンパク質を含む相補的戦略の開発が大いに必要とされている。
リソソームは、オートファジー及びエンドサイトーシスを介したタンパク質分解のもう一つの主要な行き先である（CA Lamb et al., 2013 Bioessays 35:34-45）。プロテアソーム経路とは異なり、タンパク質分解のためのリソソーム経路は細胞内ドメインを有するタンパク質に限定されない。２０２０年に、動員用の抗体と送達用のリソソーム標的受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）のリガンドからなるリソソーム標的化キメラ（ＬＹＴＡＣ）が開発された（SM Banik et al, 2020 Nature 584:291-297）。ここで、ＣＩ－ＭＰＲによって認識され、リソソーム酵素の細胞内輸送において重要な役割を果たすことができる、重要なグリカンリガンドであるマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）（S Kornfield 1987 FASEB 1:462-468；K Von Figura et al., 1986 Annu Rev Biochem 198655:167-193）は、抗体に導入されるとキメラの内部移行を誘導する。この方法で、分泌タンパク質及び膜関連タンパク質の除去の達成に成功した。しかし、これらの有望な結果にも関わらず、ＣＩ－ＭＰＲ駆動のＬＹＴＡＣは、Ｍ６Ｐｎポリマーの不均一性を抱えており（SM Banik et al, Nature 584:291-297）、ランダムなコンジュゲーションも潜在的な不安定性及び急速なクリアランスを引き起こし得る。予備実験では、Ｍａｎ６Ｐ α－１，２Ｍａｎ二糖部分がＣＩ－ＭＰＲ結合の最小構造であり、アジドタグ付き抗体プラットフォームを部位特異的に使用して均一なＬＹＴＡＣを構築できることが示された（図２０）。ＳＰＲ結合研究は、２つ又は４つのＭａｎ６Ｐ α－１，２Ｍａｎ二糖部分を有する抗体が、それぞれ１７．０ｎＭ及び４２．６ｎＭのＫＤ値で、受容体との強い結合親和性を示し（図２１）、これは、生化学研究及び治療に幅広い示唆を提供するものである。
非天然構造の導入はヒトにおいて免疫原性であり得ることを考慮して、天然結合を介して必須のＭ６Ｐ二糖を導入できるかどうかが調査され、したがって、Ｍａｎ６Ｐα１，２Ｍａｎ二糖部分を含有する四糖オキサゾリンが、Ｍ６Ｐ修飾抗体を作製するための異なるエンドグリコシダーゼのトランスグリコシル化活性を調べるための供与体基質として選択された。この目的のために、抗Ｈｅｒ２抗体（ハーセプチン）であるトラスツズマブをモデルｍＡｂとして使用した（表２）。実験は、高活性であり、インタクトＩｇＧ抗体のＦｃ脱グリコシル化に特異的であることが見出された野生型Ｅｎｄｏ Ｓから開始された（W Huang et al, 2012 J Am Chem Soc 134:12308-12318；M Collin et al., 2001 EMBO J.20:3046-3055）。
触媒量の酵素（０．２％ｗ／ｗ）を使用すると、野生型Ｅｎｄｏ Ｓがトランスグリコシル化に非常に効率的であり、出発物質の７０％超が１時間以内に目的の生成物に変換され、別のバッチのオキサゾリン（１０当量）を加えると、反応を完了させることができことが見出された。この条件下では、結合したグリカンのわずかな限界加水分解が観察され、これにより生成物の蓄積が可能となった。強力なトランスグリコシル化活性と、市販の抗体からの複合型Ｎ－グリカンの効率的な加水分解を共に考慮すると、野生型Ｅｎｄｏ Ｓは、抗体の不均一なグリコフォームをリモデリングして均一な構造を生成するための実用的な「ワンポット」戦略を提供した。次に、大きい二分岐グリカンオキサゾリンを抗体に効率的に転移できる、その変異体であるＥｎｄｏ Ｓ Ｄ２３３Ｑを試験したが（W Huang et al, 2012 J Am Chem Soc 134:12308-12318）、しかし、野生型Ｅｎｄｏ Ｓと比較してはるかに遅いトランスグリコシル化を示すことが見出された。反応を完了させるために、比較的大量の酵素及びオキサゾリンと、より長いインキュベーション時間が必要であった。比較すると、血清型Ｍ４９の化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来の別のエンドグリコシダーゼ、すなわちＥｎｄｏ Ｓ２（J Sjogren et al., 2013 Biochem J 455:107-118）も、触媒量の酵素（０．１％、ｗ／ｗ）により、良好なトランスグリコシル化活性及び生成物のゆっくりとした加水分解を示すことが見出された。しかし、この酵素はグリカンオキサゾリンを急速に加水分解するため、この反応を促進するには過剰量のオキサゾリンが必要であった。
オキサゾリン基質の加水分解を低減するために、幅広い基質特異性及び低下した加水分解活性を有するグリコシンターゼである変異体Ｅｎｄｏ Ｓ２－Ｄ１８４Ｍが試験され（T Li et al., 2016 J Biol Chem 291:16508-16518）、これは優れたトランスグリコシル化活性を示すことが見出された。触媒量の酵素（０．１％～０．２％ｗ／ｗ）と当量を減らしたオキサゾリン（１０当量）により、反応は１時間以内に生成物をスムーズに生成した。予想通り、追加のオキサゾリンは必要なく、生成物のわずかな加水分解が観察されたため、Ｍ６Ｐ含有抗体を生成する別の実用的な方法が提供された。４つの酵素に加えて、他のいくつかのエンドグリコシダーゼも試験した。コアフコシル化された複合型Ｎ－グリカンを優先的に加水分解するＥｎｄｏ Ｆ３（JP Giddens et a 2016 J Biol Chem 291:9356-9370）は、大量の酵素（１０％、ｗ／ｗ）を加えた場合、ゆっくりとしたトランスグリコシル化を示した。そして、治療用抗体のＦａｂ及びＦｃグリカンの両方のリモデリングに使用されているグリコシンターゼ変異体であるＥｎｄｏ Ｆ３－Ｄ１６５Ａ（JP Giddens et al., 2018 PNAS USA 115:12023-12027）は、このアジドタグ付き二糖に対して有意な活性を示さず、微量の遷移生成物のみが観察された。非フコシル化基質を好むＥｎｄｏ Ａ、Ｅｎｄｏ Ｄ及びＥｎｄｏ ＣＣについては、ＧＮＦ－ハーセプチンをフコシダーゼ（ＢｆＦｕｃＨ）で処理して、脱フコシル化Ｆｃグリコフォームを生成した。結果は、これら３つの酵素全てが、大量の酵素（１０％、ｗ／ｗ）を使用しても、いかなる生成物も生成しないことを示した。
Figure 2024514683000009
最適化された条件を利用して、実験規模でトランスグリコシル化を試みた。結果は、Ｅｎｄｏ Ｓ２－Ｄ１８４ＭがＧＮＦ－ハーセプチンとうまく機能し、プロテインＡ精製後に２つのリン酸化グリカンを保有する所望の生成物が９５％の収率で単離され、過剰のグリカンオキサゾリンは遊離オリゴ糖の形態で回収できることを示し、これは、ＤＭＣ／Ｅｔ３Ｎ（n Noguchi et al., 2009 J Org Chem 74:2210-2212）を用いて１ステップでグリカンオキサゾリンに容易に変換され、トランスグリコシル化のためのグリカンオキサゾリンのリサイクルが可能になった。ハーセプチンの他に、結腸直腸癌及び扁平上皮癌の処置のために上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）を標的とするセツキシマブと呼ばれる別の治療用抗体（CH Chung et al., 2008 N Engl J Med 358:1109-1117）も、この化学酵素法によってリモデリングされる。セツキシマブは、Ｆａｂ染め員及びＦｃドメインの両方でグリコシル化されており、Ｎ－グリカン構造において非常に不均一性がある（J Qian et al., 2007364:8-18）。以前の研究では、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２がＦｃグリカンの加水分解に非常に特異的であることが示されている（JP Giddens et al., 2018 Proc Natl Acad Sci USA 115:12023-12027）。したがって、市販のセツキシマブは、まずＥｎｄｏ Ｓ２－ＷＴで処理されて、脱グリコシル化されたＦｃグリコフォームが生成され、得られたＧＮＦ－Ｃｔｘは、ＬＣ－ＭＳでモニタリングされる同じ化学酵素法に従ってリン酸化生成物を生成し、収率９０％で単離された。最後に、グリカンがＦｃドメインに特異的にコンジュゲートしていることをさらに検証するために、生成物をプロテアーゼＩｄｅＳで消化し、続いてＬＣ－ＭＳ分析を行った（G Chevreux et al., Anal Biochem 2011415:212-214）。結果は、分子量のシフトが結合したグリカンと一致し、したがって生成物の構造が確認されることを示した（図２１）。
図２２は、ハーセプチン及びセツキシマブの化学酵素的（hemoenzymatic）グリカンリモデリングを示す。反応は、ＰＢＳ緩衝液中の１０当量のオキサゾリンを用いて実施した。ａ、分離された収率。リソソーム標的受容体に対するＭ６Ｐ修飾抗体の結合親和性を評価するために、本発明者らは、固定化ＣＩ－ＭＰＲによるＳＰＲ実験を実施した。結果は、Ｍ６Ｐ含有抗体が、Ｍ６Ｐ－Ｈｅｒ及びＭ６Ｐ－ＣｔｘのＫＤ値がそれぞれ３０．２ｎＭ及び７２．４ｎＭで、ＣＩ－ＭＰＲの優れたリガンドとして作用することを示した一方、天然抗体では有意な結合は観察されなかった（図２３）。図２３は、ＣＩ－ＭＰＲとＭ６Ｐ含有抗体のＳＰＲ結合データを示す。分析物を、最高濃度５００ｎＭの２倍段階希釈で固定化チップ上に流した。
実施例２
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）により標的癌細胞死滅が大いに期待できる。部位特異的な抗体－薬物のコンジュゲーションは、最適な安全性プロファイル及び高い有効性を有する均一なＡＤＣを合成するために非常に望ましい。部位特異的コンジュゲーションの範囲を調べるための酵素基質としての新しい二糖オキサゾリンの合成及び評価が本明細書に記載される。具体的には、Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、及びＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ（ＬａｃＮＡｃ）にそれぞれ由来するアジド官能化二糖オキサゾリンを合成した。酵素評価により、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２は高度に緩和された基質特異性を示し、トランスグリコシル化のための３種類の二糖誘導体全てに対応して部位特異的なアジドタグ付き抗体を提供でき、これはペイロードと容易にクリックして均一なＡＤＣを生成することが明らかになった。さらに、Ｅｎｄｏ－Ｓ２は、グリカン転移の供与体基質として薬物があらかじめロードされた最小二糖オキサゾリンに対応できるため、クリック反応を必要とせずに効率的で単一ステップの部位特異的な抗体－薬剤コンジュゲーションが可能になることがわかった。Ｆｃグリカンリモデリングのために、より単純で容易に合成される二糖オキサゾリン誘導体に対応するＥｎｄｏ－Ｓ２の能力により、均一な抗体－薬物コンジュゲートを単一ステップで構築するためのこのバイオコンジュゲーション法の範囲がさらに拡大された。最後に、細胞ベースのアッセイにより、合成均一ＡＤＣが強力な標的癌細胞死滅を実証したことが示された。
本明細書では、抗体の酵素的Ｆｃ－グリカンリモデリングの基質として、Ｇｌｃ－β１，４－ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌ－β１，４－ＧｌｃＮＡｃ（ＬａｃＮＡｃ）二糖を含む、選択的に修飾された新しい二糖オキサゾリンの合成及び評価について説明する。野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２は、アジド官能化抗体を提供するトランスグリコシル化のための「非天然コア二糖」に適応する顕著な柔軟性を備えていることが見出された。さらに、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２は、薬物がロードされた二糖オキサゾリン基質による抗体の脱グリコシル化及びグリコシル化を同時に実施して、単一ステップで均一なＡＤＣを得ることができることが発見された。細胞毒性研究で示されるように、得られたＡＤＣは標的細胞に対して高い選択性を示した。
最近の研究では、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２が、生成物の加水分解を伴わずに天然二糖（Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）コアに対応する選択的に修飾された二糖オキサゾリンをトランスグリコシル化に適応できることが示された。しかし、この酵素が非天然コア二糖構造を認識して抗体に転移できるかはまだ試験されていない。本明細書に記載されるように、Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃコアよりも合成がはるかに容易な、Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ（ＬａｃＮＡｃ）オキサゾリンなどのより単純な二糖誘導体を試験した。Ｅｎｄｏ－Ｓ２の基質特異性を調べ、抗体グリカンリモデリングのための単純な官能化二糖オキサゾリン基質を同定するために、３つの選択的に修飾された二糖コア（Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、及びＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を設計し、さらなる誘導体化のために、６’位のアナミン又はアジド官能基を用いて合成した（図２５）。まず、既知の化合物（４）（Zhang et al., 2021 ACS Chem Biol DOI 10.1021 aschembio.1c00597）の全体的な脱保護により、Ｍａｎ－ＧｌｃＮＡｃ二糖（５）がほぼ定量的収率で得られた。この条件下では、アジド基は同時にアミノ基に還元され、これは官能基の導入に使用され得る。グルコースベースの二糖（Ｇｌｃ－ＧｌｃＮＡｃ）の合成では、２ステップの操作を行って、７（Yamauchi et al., 2016 138:12472-85）のベンゾイル基を永久ベンジル基に変換し、全体収率８７％で８を得た。次に、位置選択的開環反応により、ＡｃＳＨによる２－アジド基の２－アセトアミド基への変換後、９のＣ６位に遊離ＯＨが提供され（Wang et al., 2013 Science 341:379-83）、１０をＮａＨ及びＮ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔｓで処理することにより、この位置にアジドタグ付きポリエチレン鎖を導入して、１１を収率８５％で得た。接触水素化により全ての保護基が除去され、遊離グリカン１２が優れた収率で得られた。Ｅｎｄｏ－Ｓ２の基質特異性を試験するために、銅触媒ジアゾ転移反応により１２のアミン基をアジド基に戻し（Zhang et al., 2021 ACS Chem Biol 16:2502-2514）、８１％の収率で１３を得、これは、水中でのＤＭＣ及びＥｔ３Ｎの処理によってさらにオキサゾリン１４に変換された。最後に、ガラクトースベースの二糖は、標準的なグリコシル化条件下で、１５（Lossouarn et al., 2020 Org Biomol Chem 18:3874-3887）と１６（Zhang et al., 2021 ACS Chem Biol 16:2502-2514）をカップリングすることによって構築された。Ｇａｌ残基のＴＢＤＰＳ基によるＣ６－ＯＨの選択的保護、続いて脱アセチル化後のパーベンジル化により、全体収率６８％で１８が得られ、これは、２－アジド基の２－アセタミドへ基の変換により、１９に変換された。ＴＢＤＰＳの脱保護により、アジドタグ付きポリエチレン鎖が導入されて２１が得られ、全体的な脱保護の後、定量的に２２が得られた。続くジアゾ転移反応及びオキサゾリン形成により、２４が優れた収率で得られた（図２５）。
Ｇｌｃ又はＧａｌ含有二糖オキサゾリン（１４及び２４）が抗体のＦｃグリカンリモデリングに関して野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２によって依然として認識されるかどうかを試験するために、モデル抗体としてトラスツズマブ（ハーセプチン）を使用してワンポットトランスグリコシル化を試験した（図２７；スキーム２）。二糖オキサゾリン１４及び２４はいずれも、Ｅｎｄｏ－Ｓ２触媒によるトランスグリコシル化の供与体基質として機能し得るが、酵素反応は天然二糖コアに対応するＭａｎ－β１，４－ＧｌｃＮＡｃオキサゾリン（６）の反応よりも遅いことが見出された。この結果は、「天然」β－Ｄ－Ｍａｎ部分をβ－Ｄ－Ｇｌｃ又はβ－Ｄ－Ｇａｌ残基で置換すると、Ｅｎｄｏ－Ｓ２に対する基質活性がある程度低下したが、Ｅｎｄｏ－Ｓ２は依然としてそれらを供与体基質として認識できることを示唆している。それにもかかわらず、天然β－Ｍａｎ部分をβ－Ｇｌｃ及びβ－Ｇａｌ部分で置換すると、糖オキサゾリンのＥｎｄｏ－Ｓ２触媒による加水分解に対する耐性が高まり得ることも見出された。したがって、より多くの酵素及びより少ない当量の糖オキサゾリンを使用して、トランスグリコシル化を完了させることができる可能性がある。これらの二糖誘導体の合成は、以前に報告されているように、Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃ誘導体よりも効率的且つ簡単であるため、Ｅｎｄｏ－Ｓ２がトランスグリコシル化のためにＧｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ及びＬａｃＮＡｃオキサゾリンを受容する能力は重要である。（Zhang et al., 2021 ACS Chem Biol 16:2502-2514）。トランスグリコシル化生成物２６及び２７は、それぞれプロテインＡアフィニティーカラムによって精製され、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析によってその同一性が確認された。
アジドタグ付き二糖オキサゾリンの優れたトランスグリコシル化活性に後押しされて、二糖オキサゾリンに細胞毒性薬剤を前導入し、ＡＤＣを構築するための１ステップのグリカンリモデリングの実現可能性を試験することが試みられた。この戦略を達成するには、いくつかの要素を考慮する必要があった。まず、薬物は糖オキサゾリン形成のためのＤＭＣ／Ｅｔ３Ｎ処理に耐えられなければならない。次に、アルカリ条件下で安定である必要がある。最後に、薬物－二糖オキサゾリンは、水溶液中で十分な溶解度を有していなければならない。戦略を試験するための細胞毒性薬剤としてモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が選択された。したがって、切断可能なジペプチドリンカー（バリン－シトルリン）を有する化合物２８（Ou et al., 2021 Bioconjug Chem 32;1888-1897）をビス－ＮＨＳ－ＰＥＧ５と反応させて、ＮＨＳ活性化ペイロード２９を得、これをアミンカップリング反応により二糖とさらにコンジュゲートし、続いてワンポットでのオキサゾリン形成により、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製後に薬物－オキサゾリンコンジュゲート１～３が良好な収率で得られた（図２６；スキーム３）。
薬物－糖オキサゾリンコンジュゲートを利用して、Ｅｎｄｏ－Ｓ２触媒によるトランスグリコシル化を介したＡＤＣの１ステップ合成を調べた（図３０；スキーム４）。特に、オキサゾリン１～３は、ＭＭＡＥ及び切断可能なリンカーの疎水性により水性緩衝液に完全に溶解できなかったため、緩衝液へのオキサゾリンの溶解を助けるために５％ＤＭＳＯを加えた。Ｍａｎ由来薬物－オキサゾリンコンジュゲート（１）が野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２の優れた基質として機能し、触媒量の酵素（０．２％、酵素対抗体、ｗ／ｗ）及び１５当量の糖オキサゾリン供与体（１）により、反応は１時間以内に完了に達することが見出された。一旦形成されると、生成物は反応条件下で加水分解に対して大いに耐性があるため、ＤＡＲを正確に制御して均一なＡＤＣを調製するための実用的なワンステップ法が提供される。Ｇｌｃ及びＧａｌ由来の薬物オキサゾリン（それぞれ２及び３）に関しては、反応を完了まで進めるために比較的大量の酵素及びオキサゾリン供与体が必要であった。全ての場合において、対応する抗体－薬物コンジュゲート（それぞれ３３、３４、及び３５）が得られた。薬物がＦｃドメインに特異的にコンジュゲートしていることを検証するために、ＡＤＣ（３３、３４、及び３５）をプロテアーゼＩｄｅＳで消化し、抗体を切断して、単量体Ｆｃドメインを得、続いてＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析を行った。結果は、生成物の高い均一性及び分子量のシフトが結合したペイロードと一致していることを示し（薬物コンジュゲートＦｃドメインについて計算、Ｍ＝２６０５６；観測値、２６０５７、デコンボリューションデータ）、したがって、生成物の構造がさらに確認された（図２８）。Ｅｎｄｏ－Ｓ２が抗体の脱グリコシル化とペイロードコンジュゲート二糖オキサゾリンの転移を同時に実施できるという発見により、均一な抗体－薬物コンジュゲートを合成するための化学酵素的Ｆｃグリカンリモデリング法の範囲がさらに拡大される。
最後に、合成ＡＤＣ（３３、３４、及び３５）の細胞毒性を、乳癌細胞株、高レベルのＨＥＲ２発現を有するＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ４７４細胞株、及び低レベルのＨＥＲ２抗原発現を有するＴ４７Ｄで試験した。２ステップアプローチ１８を使用して以前に合成されたトラスツズマブ－ＭＭＡＥコンジュゲート（３６）（ＤＡＲ２）を比較の参照として使用した。これら全てのＡＤＣは、半数効果濃度（ＥＣ５０）値で示されるように、ほぼ同じ効力で高抗原発現細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ４７４）の有意な細胞死滅を達成することが見出された。一方、試験した濃度下で低レベルのＨＥＲ２を発現するＴ４７Ｄ細胞株では明らかな死滅は観察されず、標的細胞に対する合成ＡＤＣの選択性が高いことを示している。
本明細書に記載されるように、均一な抗体－薬物コンジュゲートの単一ステップ及び部位特異的化学酵素合成のための非常に効率的な方法が確立される。Ｅｎｄｏ－Ｓ２が、Ｆｃグリカンリモデリングのためのより単純で容易に合成されるセロビオース及びＮ－アセチルラクトサミン誘導体を含む、異なる二糖オキサゾリンを受容できるという発見により、抗体バイオコンジュゲーションのための化学酵素法の範囲がさらに拡大される。さらに、天然抗体の脱グリコシル化を実施し、同時に薬物が事前にロードされた二糖オキサゾリンを転移できるＥｎｄｏ－Ｓ２の能力により、均一な抗体－薬物コンジュゲートを構築するための真に単一ステップのプロトコルが可能となる。
材料及び方法
一般的な手順。全ての化学物質、試薬、及び溶媒はSigma-Aldrich及びＴＣＩから購入し、特に記載がない限り、さらに精製することなく反応に適用した。ＴＬＣはガラスプレート上のシリカゲル（Sigma-Aldrich）を使用して実施し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）でスポットを検出し、次いで５％（ｖ／ｖ）硫酸のＥｔＯＨ溶液で炭化又はモリブデン酸セリウム染色（ＣＡＭ）し、その後１５０℃で加熱した。フラッシュクロマトグラフィー用のシリカゲル（２００～４２５メッシュ）はSigma-Aldrichから購入した。ＮＭＲスペクトルは、溶媒としてＣＤＣｌ３又はＤ２Ｏを使用して４００ＭＨｚ分光計（Bruker，東京，日本）で記録された。化学シフトはｐｐｍで指定され、多重度はｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、及びｍ（多重項）で示される。結合定数（Ｊ）は、ヘルツ単位で報告される。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦは、マトリックスとしてＤＨＢ（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ＝１：１）を使用し、ポジティブリフレクトロンモードで、Bruker Autoflex Speed Mass Spectrometerで実施された。ＨＲＭＳは、C18カラムを備えたExactive Plus Orbitrap Mass Spectrometer（Thermo Scientific）で実施した。分取ＨＰＬＣは、Waters 600ＨＰＬＣ装置及びWaters C18カラム（５．０μｍ、１０×２５０ｍｍ）を用いて実施した。カラムは、流速４ｍＬ／分で、０．１％のＴＦＡ又はＦＡを含有するＭｅＣＮ－Ｈ２Ｏの適切な勾配で溶出した。ＬＣ－ＭＳ分析は、Ｃ４（全抗体、勾配、０．１％ＦＡを含有する５～９５％ＭｅＣＮ水溶液で６分間、０．４ｍＬ／分）又はＣ８（ＩｄｅＳ消化、勾配、０．１％ＦＡを含有する２５～３５％ＭｅＣＮ水溶液で６分間、０．４ｍＬ／分）カラムを備えたExactive Plus Orbitrap質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に接続されたUltimate 3000 HPLCで実施した。デコンボリューションデータはMagTranソフトウェアによって変換された。
６－Ｏ－２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－マンノピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（５）。
４（Zhang et al., 2021 ACS Chem Biol 16:2502-2514）（１５．０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）及びＰｄ／Ｃ（１０ｗｔ％ローディング、１０ｍｇ）の、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）中の混合物に、３Ｍ ＨＣｌ（水溶液、９μＬ、２当量）を加え、Ｈ２雰囲気下で一晩撹拌した。ＬＣ－ＭＳ分析が遊離アミンへの完全な変換を示した後、反応混合物を、Celiteパッドを通して濾過し、次いで濃縮し、Sephadex LH-20（Ｈ２Ｏ）でよって精製して、５（７．２ｍｇ、９７％）を塩酸塩として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５．０７（０．７７Ｈ，ｍ），４．６１－４．５９（１．３１Ｈ，ｍ），３．９６－３．９５（１．００Ｈ，ｍ），３．８５－３．８０（０．８１Ｈ，ｍ），３．７８－３．７６（１．９０Ｈ，ｍ），３．７５－３．７３（１．０４Ｈ，ｍ），３．６９－３．６７（０．９９Ｈ，ｍ），３．６６－３．６３（３．３４Ｈ，ｍ），３．６３－３．５６（１１．１Ｈ，ｍ），３．５４－３．４９（１．９０Ｈ，ｍ），３．４８－３．４３（２．３９Ｈ，ｍ），３．１０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），１．９２（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １７４．４７，１７４．１７，１００．１９，９４．８１，９０．５０，７９．５４，７９．２５，７４．６８，７４．４９，７２．６４，７２．３６，７０．４４，７０．４０，６９．９２，６９．８８，６９．７３，６９．５８，６９．４０，６９．１６，６６．５８，６６．２９，６３．８１，６０．１６，６０．０３，５６．０６，５３．６３，３９．０６，２２．１３，２１．８４；ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ３９Ｎ２Ｏ１３ ＋に対する計算値，５１５．２４４７；実測値，５１５．２４４２．
ベンジル２－Ｏ－ベンジル－４，６－Ｏ－ベンジリデン－３－Ｏ－ｐ－メトキシベンジル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２－アジド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（８）。
７（Yamaguchiet al., 2016 J Am Chem Soc 138:12472-85）（２９０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２．０ｍＬ）溶液に、ナトリウムメトキシドを加えてｐＨ１０を維持し、溶液を５０℃まで加熱し、一晩撹拌した。出発物質が完全に消失した後、溶液をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、Ｈ２Ｏ及びブラインで連続的に洗浄し、次いで濃縮乾固した。残渣を乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、水素化ナトリウム（２４ｍｇ）及び臭化ベンジル（１００μＬ）を連続的に加え、混合物をゆっくりと室温まで加温した。ＴＬＣにより反応が完了したことが示された後、ＭｅＯＨを加えて過剰の水素化ナトリウムをクエンチした。反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、Ｈ２Ｏ及びブラインで連続的に洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝１０：１～５：１）で精製して、８（２ステップで２４８ｍｇ、８７％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．４５（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝５：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．５３－７．５１，７．４５－７．２６（２７Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），６．８５－６．８３（２Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．５２（１Ｈ，ｓ，ＰｈＣＨ），４．９７－４．９３（２Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ２），４．８８－４．８３（２Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ２），４．７８－４．６８（４Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ２），４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），４．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），３．８２（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７０－３．５８（３Ｈ，ｍ），３．５４－３．４５（２Ｈ，ｍ），３．４０－３．３３（２Ｈ，ｍ），３．３０－３．２６（１Ｈ，ｍ），３．２２－３．１５（１Ｈ，ｍ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １５９．２６，１３８．３７，１３８．３１，１３８．０５，１３７．４２，１３６．８９，１３０．６２，１２９．７０，１２９．００，１２８．４８，１２８．４５，１２８．３２，１２８．２７，１２８．２５，１２８．０７，１２７．９７，１２７．９５，１２７．８２，１２７．７３，１２７．６８，１２６．０７，１１３．７５，１０２．７９，１０１．１４，１００．３８，８２．５４，８１．７８，８１．３３，８０．８３，７６．４６，７５．５１，７５．２５，７５．１８，７４．７５，７３．３０，７０．７９，６８．７１，６７．６２，６５．８５，６５．７３，５５．２９；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ５５Ｈ５７Ｎ３ＮａＯ１１ ＋に対する計算値，９５８．３９；実測値，９５８．０５．
ベンジル２，４－ジ－Ｏ－ベンジル－３－Ｏ－ｐ－メトキシベンジル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２－アジド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（９）。
８（１１０ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）のＢＨ３・ＴＨＦ（１Ｍ、２．０ｍＬ）溶液に、Ｂｕ２ＢＯＴｆのＣＨ２Ｃｌ２（１Ｍ、２００μＬ）溶液をアルゴン雰囲気下、０℃で加え、混合物を０℃で４０分間撹拌すると、ＴＬＣは反応の完了を示した。Ｅｔ３Ｎ（１５０μＬ）を混合物に加え、続いてＭｅＯＨ（５００μＬ）を注意深く加えた。混合物をＭｅＯＨで３回共蒸発させ、残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝６：１～２：１）で精製して、９（１００ｍｇ、９１％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝ ０．３０（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝３：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４５－７．３２，７．２５－７．２３（２７Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），６．８８－６．８６（２Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．００－４．９６（２Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ２），４．８８－４．８４（３Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ２），４．８３－４．７８（３Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ２），４．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．６７－４．６２（２Ｈ，ｍ），４．５１－４．４８（２Ｈ，ｍ），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），３．８３（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７３－３．６６（２Ｈ，ｍ），３．６０－３．５２（２Ｈ，ｍ），３．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），３．４１－３．３１（４Ｈ，ｍ），３．２２－３．１７（１Ｈ，ｍ），１．６８（１Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １５９．２８，１３８．４２，１３８．３６，１３８．１３，１３７．９６，１３６．９１，１３０．６５，１２９．５６，１２８．５１，１２８．４２，１２７．９９，１２７．９１，１２７．８９，１２７．８１，１２７．７４，１２７．７１，１２７．４１，１１３．８７，１０２．５１，１００．４１，８４．４８，８２．８６，８１．３５，７７．９７，７６．４６，７５．５０，７５．１９，７５．１６，７５．０８，７５．０４，７４．８７，７３．４０，７０．８１，６７．６０，６５．９１，６１．８４，５５．３２；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ５５Ｈ５９Ｎ３ＮａＯ１１ ＋に対する計算値，９６０．４０；実測値，９５９．９９．
ベンジル２，４－ジ－Ｏ－ベンジル－３－Ｏ－ｐ－メトキシベンジル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（１０）。
９（３５．０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）のＡｃＳＨ／ピリジン／ＣＨＣｌ３（０．６ｍＬ／０．４ｍＬ／０．６ｍＬ）混合物中の溶液を５０℃で１５時間撹拌した。ＴＬＣでモニタリングして反応が完了した後、得られた混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトン＝４：１～２：１）に供して、１０（３１．６ｍｇ、８９％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝ ０．２０（ヘキサン／アセトン＝ ３：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４０－７．２８，７．２３－７．２１（２７Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），６．８６－６．８４（２Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．９４－４．９２（２Ｈ，ｍ），４．８９－４．８７（１Ｈ，ｍ），４．８６（１Ｈ，ｍ），４．８４－４．７５（３Ｈ，ｍ），４．６７－４．５８（４Ｈ，ｍ），４．５３－４．４６（２Ｈ，ｍ），４．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），３．８２（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７５－３．６９（２Ｈ，ｍ），３．５９－３．５４（２Ｈ，ｍ），３．４８－３．３４（４Ｈ，ｍ），３．２３－３．２０（１Ｈ，ｍ），１．８５（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １７０．４７，１５９．２３，１３８．８３，１３８．３７，１３８．１２，１３８．０８，１３７．５８，１３０．６８，１２９．５１，１２８．４７，１２８．４４，１２８．４１，１２８．４０，１２７．９８，１２７．９０，１２７．８７，１２７．８１，１２７．７８，１２７．７０，１２７．５１，１１３．８３，１０２．６３，９８．９１，８４．４１，８２．８１，７７．９５，７７．７６，７７．３４，７５．４３，７４．９９，７４．８５，７４．２８，７３．３２，７０．８６，６８．１１，６１．９６，５６．８７，５５．２９，２３．６１；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ５７Ｈ６３ＮＮａＯ１２ ＋に対する計算値，９７６．４２；実測値，９７６．２５．
ベンジル２，４－ジ－Ｏ－ベンジル－３－Ｏ－ｐ－メトキシベンジル－６－Ｏ－２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（１１）。
１０（２３．０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）及びトシレートリンカー（Orgueira et al., Chem Eur J 20039:140-69）（２３．８ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（０．６ｍＬ）溶液に、６０％水素化ナトリウム（５．０ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で０．５時間、次いで室温で６時間撹拌した後、ＭｅＯＨ（５０μＬ）及びＡｃＯＨ（１０μＬ）を０℃で反応混合物に加えた。反応混合物を濃縮乾固した。次いで、残渣をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトン＝５：１～３：２）で精製して、１１（２２．７ｍｇ、８５％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．３０（ヘキサン／アセトン＝ ２：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３９－７．２６７．２２－７．２０（２７Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），６．８５－６．８３（２Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．６７（１Ｈ，ｄ，ＮＨ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．９４－４．８２（６Ｈ，ｍ），４．７９－４．７４（２Ｈ，ｍ），４．６８－４．６３（２Ｈ，ｍ），４．６１－４．５６（２Ｈ，ｍ），４．５１－４．４５（２Ｈ，ｍ），４．０５－４．０３（２Ｈ，ｍ），３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），３．８１（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７７－３．６５（３Ｈ，ｍ），３．６１－３．４８（１４Ｈ，ｍ），３．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），３．３４－３．２８（３Ｈ，ｍ），１．８２（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １７０．１４，１５９．１９，１３９．０９，１３８．４３，１３８．４０，１３８．１７，１３７．６６，１３０．７７，１２９．４９，１２８．４３，１２８．４１，１２８．４０，１２８．３３，１２８．２６，１２８．１３，１２８．０６，１２７．９６，１２７．８８，１２７．８５，１２７．８０，１２７．７４，１２７．６９，１２７．６６，１２７．６３，１２７．４７，１１３．８０，１０２．８２，９９．１３，８４．５０，８２．７６，７７．８６，７７．７３，７６．９２，７５．３９，７５．０６，７５．０２，７４．９９，７４．８１，７３．６１，７３．２５，７０．８７，７０．６９，７０．５９，７０．５５，６９．９３，６９．８５，６８．３８，５５．５０，５５．２９，５０．６０，２３．５０；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ６３Ｈ７４Ｎ４ＮａＯ１４ ＋に対する計算値，１１３３．５１；実測値，１１３３．２７．
６－Ｏ－２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（１２）。
１１（２０．０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）及びＰｄ／Ｃ（１０ｗｔ％ローディング、１０ｍｇ）の、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）中の混合物に、３Ｍ ＨＣｌ（水溶液、１２μＬ、２当量）を加え、Ｈ２雰囲気下で一晩撹拌した。ＬＣ－ＭＳ分析が完全な脱保護及びアジドの遊離アミンへの変換を示した後、反応混合物を、Celiteパッドを通して濾過した。濾液を濃縮し、残渣をSephadex LH-20（Ｈ２Ｏ）で精製して、１２（９．２ｍｇ、９３％）を塩酸塩として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５．０９（０．５２Ｈ，ｍ），４．６２（０．４３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．４３－４．３９（１．０４Ｈ，ｍ），４．２６－４．２２（０．２２Ｈ，ｍ），４．０４－４．０１（０．２６Ｈ，ｍ），３．８９－３．８２（１．４０Ｈ，ｍ），３．８０－３．７３（３．７３Ｈ，ｍ），３．６７－３．５５（１３．８Ｈ，ｍ），３．５５－３．５１（２．３４Ｈ，ｍ），３．４３－３．３８（１．５７Ｈ，ｍ），３．３６－３．３１（１．２６Ｈ，ｍ），３．２４－３．１８（１．３１Ｈ，ｍ），３．１１（１．１８，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），１．９４（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １７４．５３，１７４．２９，１０２．５９，９４．７８，９０．５１，７９．４５，７９．１１，７５．３５，７４．６９，７４．４８，７３．０５，７２．４２，７０．１０，７０．０２，６９．６３，６９．５８，６９．４６，６９．２０，６９．１５，６６．５６，６０．３４，５９．９９，５９．８５，５６．２２，５３．７４，３９．１１，２２．１６，２１．８７；ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ３９Ｎ２Ｏ１３ ＋に対する計算値，５１５．２４４７；実測値，５１５．２４４０．
６－Ｏ－２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（１３）。
１２（９．０ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１．０ｍＬ）溶液に、新たに調製したＫ２ＣＯ３（６．８ｍｇ）及びＣｕＳＯ４（０．８ｍｇ）を含有するＴｆＮ３（Orgueira et al.2003, Chem Eur J 9）のＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ、約０．１６ｍｍｏｌ）溶液を０℃で加えた。次いで、ＭｅＯＨを加えて溶液を均一にし、混合物を室温で３６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をSephadex LH-20カラム上で、Ｈ２Ｏで溶出して精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥し、次いで分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（勾配、０．１％ＦＡを含有する５～１５％ＭｅＣＮ水溶液で３０分間；流速、４ｍＬ／分）でさらに精製して、凍結乾燥後に１３（７．２ｍｇ、８１％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５．０９（０．５８Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），４．６１（０．４７Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），４．４２－４．４０（０．９７Ｈ，ｍ），３．８８－３．８３（１．２３Ｈ，ｍ），３．８０－３．７５（２．８９Ｈ，ｍ），３．７５－３．７３（１．０１Ｈ，ｍ），３．６５－３．５６（１２．９Ｈ，ｍ），３．５３－３．４９（１．７５Ｈ，ｍ），３．４３－３．３８（２．８３Ｈ，ｍ），３．３６－３．３１（１．１８Ｈ，ｍ），３．２４－３．１９（１．２０Ｈ，ｍ），１．９４（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １７４．５１，１７４．２７，１０２．６１，９４．７９，９０．４８，７９．５７，７９．３０，７５．３４，７４．７０，７４．５０，７３．０５，７２．４０，７０．１１，６９．５８，６９．５３，６９．４９，６９．１９，６９．１４，６０．０５，５９．９０，５６．２０，５３．７４，５０．１０，２２．１４，２１．８４；ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ３７Ｎ４Ｏ１３ ＋に対する計算値，５４１．２３５２；実測値，５４１．２３４４．
２－メチル－｛６－Ｏ－２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－１，２－ジデオキシ－α－Ｄ－グルコピラノ｝－［２、１－ｄ］－２－オキサゾリン（１４）。
１３（３．３ｍｇ、６．１μｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１５０μＬ）溶液に、Ｅｔ３Ｎ（３０モル当量）及び塩化２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウム（ＤＭＣ、２０モル当量）を０℃で加えた。反応混合物をこの温度で８時間維持し、次いで、０．１％Ｅｔ３Ｎ水溶液で溶出するSephadex G-10カラムでのゲル濾過によって精製して、ＮａＯＨ水溶液（０．０５モル当量、生成物を塩基性状態に保つため）とともに凍結乾燥した後、１４（３．０ｍｇ、９４％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．２６－４．２３（１Ｈ，ｍ），４．０８－４．０６（１Ｈ，ｍ），３．７８－３．７５（１Ｈ，ｍ），３．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），３．６４－３．５７（１２Ｈ，ｍ），３．５４－３．５２（１Ｈ，ｍ），３．４７－３．４３（１Ｈ，ｍ），３．４０－３．３７（２Ｈ，ｍ），３．３４－３．２９（２Ｈ，ｍ），３．１８－３．１４（１Ｈ，ｍ），２．８８－２．８６（１Ｈ，ｍ），１．９４（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １６８．２９，１０４．１４，９９．７２，７８．３５，７５．３５，７４．７４，７２．９８，７０．７９，７０．２２，６９．５８，６９．４８，６９．１８，６５．１２，６１．５２，５０．０７，１２．８５；ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ３５Ｎ４Ｏ１２ ＋に対する計算値，５２３．２２４６；実測値，５２３．２２３３．
ベンジル２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－２－アジド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（１７）。
トリクロロアセトイミデート供与体１５（Wu et al., ACS Chem Biol 2014 9:468-750）（８１０ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）、受容体１６（５７０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、及び活性化４Åモレキュラーシーブ（１．５ｇ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１５．０ｍＬ）中の混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で１．５時間撹拌した。次に、－４０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（２７μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。－４０℃で５０分間撹拌した後、混合物をトリエチルアミン（５０μＬ）でクエンチした。混合物を濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝１０：１～３：２）で精製して、１７（８３２ｍｇ、８６％）を白色泡状物として得た。Ｒｆ＝０．３０（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝２：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４６－７．３０（１５Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ），４．９９－４．９３（２Ｈ，ｍ），４．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ），４．８１－４．７４（２Ｈ，ｍ），４．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，ＰｈＣＨ），４．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，ＰｈＣＨ），４．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．０７－４．０１（２Ｈ，ｍ），３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），３．７９－３．７２（２Ｈ，ｍ），３．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），３．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），３．３２－３．３０（１Ｈ，ｍ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．０１（３Ｈ，ｓ），２．００（３Ｈ，ｓ），１．９９（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １７０．１９，１７０．０７，１６９．１８，１３８．２１，１３７．７３，１３６．７６，１２８．６３，１２８．４９，１２８．２３，１２８．１３，１２８．０４，１２８．００，１２７．９５，１２７．９３，１２７．７２，１００．５１，１００．０７，８０．９５，７６．０５，７５．１４，７４．８５，７３．７０，７０．９５，７０．９３，７０．５２，６９．５８，６７．４４，６６．８０，６５．７８，６０．６０，２０．７８，２０．６６，２０．６４，２０．５９；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ４１Ｈ４７Ｎ３ＮａＯ１４ ＋に対する計算値，８２８．２９；実測値，８２８．０５．
ベンジル２，３，４－トリ－Ｏ－ベンジル－６－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－２－アジド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（１８）。
１７（３４０ｍｇ、０．４２２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４．０ｍＬ）溶液に、ｐＨ＝１０になるまでナトリウムメトキシドを加え、溶液を５０℃に加熱し、一晩撹拌した。出発物質が完全に消失した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、Ｈ２Ｏ及びブラインで連続的に洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮乾固して、粗製の脱アシル化中間体を得た。次いで、残渣を乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解し、イミダゾール（１４４ｍｇ、２．１１ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（３１２μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を連続的に加え、得られた混合物を、ＴＬＣによって示される反応の完了まで室温で撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、Ｈ２Ｏ及びブラインで連続的に洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮乾固した。次に、残渣を乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、水素化ナトリウム（１３５ｍｇ、３．３８ｍｍｏｌ）及び臭化ベンジル（３００μＬ、２．５３ｍｍｏｌ）を連続的に加え、混合物をゆっくりと室温まで加温した。ＴＬＣによりモニタリングして反応が完了した後、ＭｅＯＨを加えて過剰の水素化ナトリウムをクエンチした。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、Ｈ２Ｏ及びブラインで連続的に洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝１５：１～８：１）で精製して、１８（３ステップで３２８ｍｇ、６８％）を無色のシロップとして得た。Ｒｆ＝０．４０（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝４：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．５９－７．５５，７．４６－７．２５（４０Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），５．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．８６－４．７６（４Ｈ，ｍ），４．７１－４．６２（３Ｈ，ｍ），４．６０－４．５８（２Ｈ，ｍ），４．４４－４．３７（２Ｈ，ｍ），４．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．８９－３．８４（２Ｈ，ｍ），３．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），３．７３－３．７０（１Ｈ，ｍ），３．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．４８－３．４２（２Ｈ，ｍ），３．３３－３．２３（３Ｈ，ｍ），１．０８（９Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １３９．２７，１３８．８８，１３８．６８，１３８．３１，１３８．０１，１３６．９９，１３５．５７，１３４．８６，１３３．２５，１３３．１９，１２９．８５，１２９．７３，１２８．５４，１２８．４８，１２８．３７，１２８．２９，１２８．１７，１２８．１０，１２８．０４，１２７．９７，１２７．９２，１２７．８８，１２７．８１，１２７．７７，１２７．７１，１２７．６４，１２７．５８，１２７．５１，１２７．３８，１２７．２１，１０２．７５，１００．４５，８２．４４，８１．３８，８０．２２，７６．１１，７５．５０，７５．４０，７５．３２，７４．７９，７４．３３，７３．７６，７３．２６，７２．８４，７０．７６，６７．８５，６５．６７，６１．１６，２７．０２，２６．９６，２６．６２，１９．２３；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ７０Ｈ７５Ｎ３ＮａＯ１０Ｓｉ＋に対する計算値，１１６８．５１；実測値，１１６８．２２．
ベンジル２，３，４－トリ－Ｏ－ベンジル－６－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（１９）。
１８（３００ｍｇ、０．２６２ｍｍｏｌ）のＡｃＳＨ／ピリジン／ＣＨＣｌ３（０．８ｍＬ／０．６ｍＬ／０．８ｍＬ）混合物中の溶液を５０℃で１４時間撹拌した。ＴＬＣでモニタリングして反応が完了した後、得られた混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝４：１～１：１）に供して、１９（２４０ｍｇ、７９％）を無色のシロップとして得た。Ｒｆ＝０．３０（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝２：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．６０－７．５６，７．４４－７．２３，７．２０－７．１８（４０Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），４．８６－４．７７（５Ｈ，ｍ），４．６３－４．５１（４Ｈ，ｍ），４．４２－４．３９（２Ｈ，ｍ），４．０６－４．０２（２Ｈ，ｍ），３．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．８９－３．７６（４Ｈ，ｍ），３．６８－３．６４（２Ｈ，ｍ），３．５５－３．４９（１Ｈ，ｍ），３．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），３．３０－３．２６（１Ｈ，ｍ），１．８１（３Ｈ，ｓ），１．０７（９Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １７０．１２，１３９．１２，１３８．７０，１３８．６２，１３８．５０，１３８．３７，１３７．６８，１３５．５３，１３３．１４，１２９．８７，１２９．７５，１２８．４４，１２８．３２，１２８．３０，１２８．２２，１２８．１２，１２８．１０，１２７．９９，１２７．８９，１２７．８２，１２７．７９，１２７．７６，１２７．６８，１２７．６６，１２７．５６，１２７．５３，１２７．３７，１２７．１９，１０３．１３，９９．０６，８２．２６，８０．０８，７７．１３，７６．６６，７５．３２，７５．２４，７４．６５，７４．３１，７３．８４，７３．６８，７３．１６，７２．８９，７０．７４，６８．７３，６１．３８，５５．０２，２６．９５，２３．４７，１９．１９；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ７２Ｈ７９ＮＮａＯ１１Ｓｉ＋に対する計算値，１１８４．５３；実測値，１１８４．０７．
ベンジル２，３，４－トリ－Ｏ－ベンジル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（２０）。
１９（２１５ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２．０ｍＬ）溶液にＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、９００μＬ）を加え、混合物を４０℃で２時間撹拌した。ＴＬＣでモニタリングして反応が完了した後、得られた混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝５：１～１：１）に供して、２０（１４０ｍｇ、８２％）を無色のシロップとして得た。Ｒｆ＝０．２５（ヘキサン／アセトン＝ ２：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３８－７．２４（３０Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．９９－４．９３（３Ｈ，ｍ），４．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．８５－４．７３（４Ｈ，ｍ），４．６４－４．５４（４Ｈ，ｍ），４．４４－４．４１（２Ｈ，ｍ），４．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．８８－３．７８（３Ｈ，ｍ），３．７４－３．７３（１Ｈ，ｍ），３．６９－３．６２（２Ｈ，ｍ），３．５５－３．４９（１Ｈ，ｍ），３．４５－３．３６（２Ｈ，ｍ），３．２６－３．２３（１Ｈ，ｍ），１．８５（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １７０．４２，１３８．６７，１３８．６２，１３８．４９，１３８．３９，１３８．２９，１３７．６１，１２８．４７，１２８．３８，１２８．３６，１２８．３２，１２８．２５，１２８．１９，１２８．１０，１２７．９２，１２７．７７，１２７．７４，１２７．５７，１２７．５４，１２７．５０，１０３．１９，９８．９５，８２．４８，７９．９２，７７．４８，７５．３４，７５．１３，７５．００，７４．４１，７４．３８，７３．７１，７３．１７，７３．１１，７０．７２，６８．６４，６２．００，５５．７１，２３．５７；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ５６Ｈ６１ＮＮａＯ１１ ＋に対する計算値，９４６．４１；実測値，９４６．０４．
ベンジル２，３，４－トリ－Ｏ－ベンジル－６－Ｏ－２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ベンジル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（２１）。
２０（１２０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びトシレートリンカー（１２８ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液に、６０％水素化ナトリウム（２６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で０．５時間、次いで室温で６時間撹拌した後、反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、Ｈ２Ｏ及びブラインで連続的に洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトン＝６：１～２：１）で精製して、２１（１２０ｍｇ、８５％）を無色のシロップとして得た。Ｒｆ＝０．３０（ヘキサン／アセトン＝ ２：１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３７－７．２３（３０Ｈ，ｍ，Ａｒ－Ｈ），５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），４．９６－４．８９（３Ｈ，ｍ），４．８７－４．８０（２Ｈ，ｍ），４．７６－４．７４（２Ｈ，ｍ），４．６４－４．５４（４Ｈ，ｍ），４．４７－４．４１（２Ｈ，ｍ），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），４．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），３．８８－３．８４（１Ｈ，ｍ），３．８１－３．７７（２Ｈ，ｍ），３．６９－３．６０（８Ｈ，ｍ），３．５７－３．５１（４Ｈ，ｍ），３．４８－３．４０（４Ｈ，ｍ），３．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），１．８６（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １７０．１２，１３８．９８，１３８．８８，１３８．６６，１３８．５０，１３８．３４，１３７．６８，１２８．３９，１２８．３４，１２８．３１，１２８．２１，１２８．１６，１２７．９９，１２７．９０，１２７．８４，１２７．６９，１２７．５９，１２７．５５，１２７．４９，１２７．４６，１０３．１５，９９．１２，８２．２６，７９．９２，７５．３４，７５．２２，７４．６２，７３．７６，７３．６０，７３．１３，７２．７２，７０．７０，７０．６１，７０．５５，７０．３９，７０．０４，６９．０５，６８．７２，５５．１２，５０．６５，２３．５３；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ：［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ６２Ｈ７２Ｎ４ＮａＯ１３ ＋に対する計算値，１１０３．５０；実測値，１１０３．１０．
６－Ｏ－２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（２２）。
２１（７５．０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）及びＰｄ／Ｃ（１０ｗｔ％ローディング、４０ｍｇ）のＴＨＦ（４．５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１．５ｍＬ）中の混合物に、３Ｍ ＨＣｌ（水溶液、４６μＬ、２当量）を加え、次いで混合物をＨ２雰囲気下で一晩撹拌した。ＬＣ－ＭＳが脱保護の完了及びアジドのアミンへの変換を示した後、反応混合物を、Celiteパッドを通して濾過した。濾液を濃縮し、残渣をSephadex LH-20（Ｈ２Ｏ）で精製して、２２（３７．２ｍｇ、９７％）を塩酸塩として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５．１０（０．５６Ｈ，ｍ），４．６２（０．４２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．３７（１．０５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），３．９０－３．８２（２．２２Ｈ，ｍ），３．８１－３．７６（３．４６Ｈ，ｍ），３．７４－３．７０（０．７１Ｈ，ｍ），３．６５－３．５５（１５．６１Ｈ，ｍ），３．４７－３．４２（１．２８Ｈ，ｍ），３．００－２．９８（１．６１Ｈ，ｍ），１．９４（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １７４．５１，１７４．２６，１０２．９８，９４．８３，９０．５１，７９．４０，７９．０７，７４．６９，７３．３３，７２．４８，７２．４０，７１．６７，７０．８０，７０．０９，７０．００，６９．８７，６９．６２，６９．５５，６９．４９，６９．４２，６９．２１，６８．６７，６７．９５，６７．９１，６０．３５，６０．０８，５９．９３，５６．１２，５３．７０，３９．３０，２２．１８，２１．８９；ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ３９Ｎ２Ｏ１３ ＋に対する計算値，５１５．２４４７；実測値，５１５．２４４０．
６－Ｏ－２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド（２３）。
２２（９．０ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１．０ｍＬ）溶液に、新たに調製したＫ２ＣＯ３（６．８ｍｇ）及びＣｕＳＯ４（０．８ｍｇ）を含有するＴｆＮ３（Orgueira et al.2003 Chem eu J 20039:140-69）のＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ、約０．１６ｍｍｏｌ）溶液を０℃で加え、次いで、ＭｅＯＨを加えて溶液を均一にした。混合物を室温で３６時間撹拌し、次いで、反応混合物を濾過した。濾液を濃縮乾固し、残渣をSephadex LH-20カラム上で、Ｈ２Ｏで溶出して精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥し、次いで分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（勾配、０．１％ＦＡを含有する５～１５％ＭｅＣＮ水溶液で３０分間；流速、４ｍＬ／分）でさらに精製して、２３（７．５ｍｇ、８５％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５．０９（０．６４Ｈ，ｍ），４．６１（０．４３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．３７（１．０１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），３．８８－３．８２（２．２８Ｈ，ｍ），３．７９－３．７５（３．５９Ｈ，ｍ），３．７４－３．７０（０．６２Ｈ，ｍ），３．６７－３．５４（１５．６７Ｈ，ｍ），３．５１－３．５０（０．４１Ｈ，ｍ），３．４７－３．３８（２．９７Ｈ，ｍ），３．１２－３．０９（０．２３Ｈ，ｍ），１．９４（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １７４．５０，１７４．２５，１０２．９８，９４．８２，９０．４７，７９．４４，７９．１７，７４．７２，７３．３６，７２．４６，７２．４０，７０．７９，７０．１２，６９．９４，６９．５７，６９．５５，６９．４９，６９．１８，６８．６４，６０．１１，５９．９６，５６．１２，５３．７１，５０．１１，２２．１４，２１．８４；ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ３７Ｎ４Ｏ１３ ＋に対する計算値，５４１．２３５２；実測値，５４１．２３３６．
２－メチル－｛６－Ｏ－２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－１，２－ジデオキシ－α－Ｄ－グルコピラノ｝－［２、１－ｄ］－２－オキサゾリン（２４）。
化合物２３（５．３ｍｇ、９．８μｍｏｌ）のＨ２Ｏ（２００μＬ）溶液に、Ｅｔ３Ｎ（３０モル当量）及び塩化２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウム（ＤＭＣ、２０モル当量）を０℃で加えた。反応混合物をこの温度で７時間維持し、次いで、０．１％Ｅｔ３Ｎ水溶液で溶出するSephadex G-10カラムでのゲル濾過によって精製して、ＮａＯＨ水溶液（０．０５モル当量）とともに凍結乾燥した後、２４（４．９ｍｇ、９６％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．２９－４．２７（１Ｈ，ｍ），３．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ），３．７４－３．６９（２Ｈ，ｍ），３．６７－３．５７（１４Ｈ，ｍ），３．５６－３．５０（２Ｈ，ｍ），３．４２－３．３８（３Ｈ，ｍ），３．３６－３．３２（１Ｈ，ｍ），１．９６（３Ｈ，ｓ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １６８．２２，１０４．６８，９９．８６，７８．５２，７３．５０，７２．４９，７１．０２，７０．７９，７０．２３，７０．０７，６９．５７，６９．５５，６９．５１，６９．３７，６９．２０，６８．８５，６５．２９，６１．６７，５０．１２，１２．９０；ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ３５Ｎ４Ｏ１２ ＋に対する計算値，５２３．２２４６；実測値，５２３．２２３６．
化合物（２５）。市販のトラスツズマブ（１００μｇ）及びオキサゾリン６（１４μｇ、グリコシル化部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（０．１μｇ）とともに１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）４μＬ中、２８℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。３０分以内に、ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率９５％超でトランスグリコシル化が完了したことが示された。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４６９０９Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４６９１２（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２４６５６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４６５６（デコンボリューションデータ）。
化合物（２６）。市販のトラスツズマブ（１００μｇ）及びオキサゾリン１４（１０．５μｇ、反応部位あたり１５当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（０．３μｇ）とともに１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）４μＬ中、２８℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。ＬＣ－ＭＳ分析により、２時間以内に変換収率９５％超でトランスグリコシル化が完了したことが示された。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４６９０９Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４６９１１（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２４６５６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４６５６（デコンボリューションデータ）。
化合物（２７）。市販のトラスツズマブ（１００μｇ）及びオキサゾリン２４（１０．５μｇ、反応部位あたり１５当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（０．５μｇ）とともに１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）４μＬ中、２８℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率９５％超で２時間以内にトランスグリコシル化が完了したことが示された。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４６９０９Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４６９１２（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２４６５６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４６５７（デコンボリューションデータ）。
化合物（２９）。
ビス－ＰＥＧ５－ＮＨＳ（６．０ｍｇ、１１．３μｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（１００μＬ）溶液に、２８（３．２ｍｇ、２．８μｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（１００μＬ）溶液を１０分ごとに５回に分けて加え、ｐＨ＝８．５を維持するためにＥｔ３Ｎを加えた。ＬＣ－ＭＳでモニタリングして反応が完了した後、１０％ＴＦＡ水溶液を加え（６０μＬ）、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（勾配、０．１％ＴＦＡを含有する３０～７０％ＭｅＣＮ水溶液で４０分間、４ｍＬ／分）で直接精製して、２９（３．６ｍｇ、８２％）を白色泡状物として得た。ＲＰ－ＨＰＬＣ保持時間、ｔＲ＝２２．５分（勾配、０．１％ＦＡを含有する２０－７０％ＭｅＣＮ水溶液で３０分間；流速、０．４ｍＬ／分）。ＥＳＩ－ＭＳ ［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ７６Ｈ１２２Ｎ１１Ｏ２２ ＋に対する計算値，１５４０．８８；実測値，１５４１．２９；［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ７６Ｈ１２１Ｎ１１ＮａＯ２２ ＋に対する計算値，１５６２．８６；実測値，１５６３．２８．
化合物（１）。５（１．４ｍｇ、２．５５μｍｏｌ）及び２９（２．１ｍｇ、１．３６μｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（４０μＬ）溶液にＥｔ３Ｎ（０．６μＬ）を加えてｐＨ＝８．５に調整した。２９が完全に消費されるまで混合物を室温に維持して、ＤＭＳＯ中の粗生成物３０を得、これをさらに精製することなく次のステップで直接使用した。３０のＲＰ－ＨＰＬＣ保持時間、ｔＲ＝１６．９分（勾配、０．１％ＦＡを含有する２０－７０％ＭｅＣＮ水溶液で３０分間；流速、０．４ｍＬ／分）。ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ９２Ｈ１５５Ｎ１２Ｏ３２ ＋に対する計算値，１９４１．０８９８；実測値，１９４１．０８４７．第１のステップで得られた残渣に、Ｈ２Ｏ（８０μＬ）及びＥｔ３Ｎ（４０モル当量）を加え、混合物を０℃に冷却し、２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ、３０モル当量）を加えた。０℃で１２時間後、反応物を分取ＨＰＬＣ（勾配、０．１％ＮＨ３・Ｈ２Ｏを含有する２５～６０％ＭｅＣＮ水溶液で４０分間、４ｍＬ／分）で精製して、オキサゾリン１（２ステップで１．９ｍｇ、７３％）を白色泡状物として得た。ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ９２Ｈ１５３Ｎ１２Ｏ３１ ＋に対する計算値，１９２２．０７５９；実測値，１９２２．０７０３．
化合物（２）。１２（１．４ｍｇ、２．６０μｍｏｌ）及び２９（２．０ｍｇ、１．３０μｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（４０μＬ）溶液にＥｔ３Ｎ（０．６μＬ）を加えてｐＨ＝８．５に調整した。２９が完全に消費されるまで混合物を室温に維持して粗生成物（３１）を得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。３１のＲＰ－ＨＰＬＣ保持時間、ｔＲ＝１７．１分（勾配、０．１％ＦＡを含有する２０－７０％ＭｅＣＮ水溶液で３０分間；流速、０．４ｍＬ／分）。ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ９２Ｈ１５５Ｎ１２Ｏ３２ ＋に対する計算値，１９４１．０８９８；実測値，１９４１．０８５１．第１のステップで得られた残渣に、Ｈ２Ｏ（８０μＬ）及びＥｔ３Ｎ（４０モル当量）を加えた。混合物を０℃に冷却し、２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ、３０モル当量）を加えた。０℃で１２時間後、反応物を分取ＨＰＬＣ（勾配、０．１％ＮＨ３・Ｈ２Ｏを含有する２５～６０％ＭｅＣＮ水溶液で４０分間、４ｍＬ／分）で精製して、オキサゾリン２（２ステップで２．０ｍｇ、８０％）を白色泡状物として得た。ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ９２Ｈ１５３Ｎ１２Ｏ３１ ＋に対する計算値，１９２２．０７５９；実測値，１９２２．０８００．
化合物（３）。２２（２．３ｍｇ、４．１４μｍｏｌ）及び２９（３．２ｍｇ、２．０７μｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（６０μＬ）溶液にＥｔ３Ｎ（０．８μＬ）を加えてｐＨ＝８．５に調整した。２９が完全に消費されるまで混合物を室温に維持して粗生成物（３２）を得、これをさらに精製することなくオキサゾリン形成に直接使用した。３２のＲＰ－ＨＰＬＣ保持時間、ｔＲ＝１７．１分（勾配、０．１％ＦＡを含有する２０－７０％ＭｅＣＮ水溶液で３０分間；流速、０．４ｍＬ／分）。ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ９２Ｈ１５５Ｎ１２Ｏ３２ ＋に対する計算値，１９４１．０８９８；実測値，１９４１．０８３６．第１のステップで得られた残渣に、Ｈ２Ｏ（１００μＬ）及びＥｔ３Ｎ（４０モル当量）を加え、混合物を０℃に冷却し、２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ、３０モル当量）を加えた。０℃で１２時間後、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（勾配、０．１％ＮＨ３・Ｈ２Ｏを含有する２５～６０％ＭｅＣＮ水溶液で４０分間、４ｍＬ／分）に供して、オキサゾリン３（２ステップで２．８ｍｇ、７０％）を白色泡状物として得た。ＨＲＭＳ：［Ｍ ＋Ｈ］＋ Ｃ９２Ｈ１５３Ｎ１２Ｏ３１ ＋に対する計算値，１９２２．０７５９；実測値，１９２２．０７３１．
化合物（３３）。市販のトラスツズマブ（５００μｇ）及びオキサゾリン１（２００μｇ、グリコシル化部位あたり１５当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（１．０μｇ）とともに、５％のＤＭＳＯを含有する１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）２５μＬ中、２８℃でインキュベートした。ＬＣ－ＭＳモニタリングにより、１時間後の完全なトランスグリコシル化が示された。反応混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターで濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去し、残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、抗体－薬物コンジュゲート（３３）（４７０μｇ、９５％）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全ＡＤＣについて計算、Ｍ＝１４９７０９Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４９７０９（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳで薬物コンジュゲートＦｃモノマーを計算、Ｍ＝２６０５６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２６０５７（デコンボリューションデータ）。
化合物（３４）。市販のトラスツズマブ（５００μｇ）及びオキサゾリン２（２５０μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（１０μｇ）とともに、５％のＤＭＳＯを含有する１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）２５μＬ中、２８℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。１時間後、さらにオキサゾリン２（６０μｇ、反応部位あたり５当量）を加えて反応を促進した。１．５時間以内に、ＬＣ－ＭＳ分析により、９５％超の変換収率でトランスグリコシル化が完了したことが示された。反応混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターで濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去し、残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３４（４６０μｇ、９３％）を得た。ＬＣ－ＭＳ：ＡＤＣについて計算、Ｍ＝１４９７０９Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４９７０８（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳで薬物コンジュゲートＦｃモノマーを計算、Ｍ＝２６０５６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２６０５７（デコンボリューションデータ）。
化合物（３５）。市販のトラスツズマブ（５００μｇ）及びオキサゾリン３（２５０μｇ、グリコシル化部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（５μｇ）とともに、５％のＤＭＳＯを含有する１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）２５μＬ中、２８℃でインキュベートし、反応はＬＣ－ＭＳ分析によってモニタリングした。１時間後、さらにオキサゾリン３（６０μｇ、グリコシル化部位あたり５当量）を加えて反応を促進した。２時間以内に、ＬＣ－ＭＳ分析により、９５％超の変換収率でトランスグリコシル化が完了したことが示された。反応混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターで濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去した。残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３５（４３０μｇ、８６％）を得た。ＬＣ－ＭＳ：ＡＤＣについて計算、Ｍ＝１４９７０９Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４９７１０（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳで薬物コンジュゲートＦｃモノマーを計算、Ｍ＝２６０５６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２６０５７（デコンボリューションデータ）。
培養条件。ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ATCC（登録商標）HTB-30（商標））は、Ｔ－７５フラスコ（CELLTREAT）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、非加熱）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するマッコイ５ａ培地（ATCC（登録商標）30-2007）に懸濁して維持された。ＢＴ４７４細胞（ATCC（登録商標）HTB-20（商標））は、Ｔ－７５フラスコ（CELLTREAT）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するHybri-Care培地（ATCC（登録商標）46-X）に懸濁して維持された。Ｔ４７Ｄ細胞（ATCC（登録商標）HTB-133（商標））は、Ｔ－７５フラスコ（CELLTREAT）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍｇ／ｍＬインスリン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するRPMI-1640培地（ATCC（登録商標）30-2001）に懸濁して維持された。
細胞毒性アッセイ。ＳＫ－ＢＲ－３及びＴ４７Ｄ細胞株について、細胞を１ウェルあたり１０，０００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。５０００ｎｇ／ｍＬ～０．０８５ｎｇ／ｍＬの対応する培地によって、ＡＤＣサンプルに連続３倍希釈を適用した。サンプルを３つのウェル（ウェルあたり１５０μＬ）に全ての単一濃度で加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した後、Cell Counting Kit-8（Sigma）を添加した。生細胞によって放出されたホルマザンの吸光度は、３７℃、５％ＣＯ２で２～３時間インキュベートした後、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。最後に、ＥＣ５０値及び細胞生存率曲線をGraphPad Prismソフトウェアによって計算した。ＢＴ４７４細胞株について、細胞を１ウェルあたり４，０００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。５０００ｎｇ／ｍＬ～０．０８５ｎｇ／ｍＬの対応する培地によって、ＡＤＣサンプルに連続３倍希釈を適用した。サンプルを３つのウェル（ウェルあたり２００μＬ）に全ての単一濃度で加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６日間培養した後、Cell Counting Kit-8（Sigma）を添加した。生細胞によって放出されたホルマザンの吸光度は、３７℃、５％ＣＯ２で２～３時間インキュベートした後、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。最後に、ＥＣ５０値及び細胞生存率曲線をGraphPad Prismソフトウェアによって計算した。
実施例３
この実施例では、異なる官能基で修飾された一連の単純な二糖オキサゾリン誘導体の設計、合成、評価、及び抗体糖鎖工学のための供与体基質としてのそれらの評価について説明する。トラスツズマブ（ハーセプチン）をモデルとして使用した、治療用抗体のグリカンリモデリングにおけるこれらの合成基質に対する異なるエンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、Ｅｎｄｏ－Ｆ３、Ｅｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ、及びそれらの変異体）の基質特異性が研究された。野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２は、部位選択的に修飾されたアジド、ビオチン、又は蛍光タグを有する官能化二糖を抗体に転移する際に最高の活性を示すが、トランスグリコシル化生成物は、一度形成されると、切断された修飾により、野生型酵素による加水分解に対して耐性を有することが見出された。Ｅｎｄｏ－Ｓ２の優れたＦｃ脱グリコシル化活性と組み合わせて、単純なワンポット脱グリコシル化及びトランスグリコシル化法が、構造的に明確に定義され、均一にタグ付けされた抗体を与える直接標識及び機能化のために考案された（図３１）。様々な数のアジド基を部位特異的に導入することで、銅を含まないひずみ促進型クリック反応による、ＤＡＲの正確な制御による均一なＡＤＣの高効率合成が可能になった。細胞毒性アッセイにより、より高いＤＡＲを有するＡＤＣは、より低いＤＡＲを有するＡＤＣよりも抗原過剰発現細胞を死滅させる効果がより高いことが示された。
結果
アジドタグ付き二糖の化学合成。より小さな合成二糖オキサゾリンがトランスグリコシル化のエンドグリコシダーゼＥｎｄｏ－Ａ及びＥｎｄｏ－Ｍの基質として機能し得ることが示されているが（Zeng et al, 2006 Eu J 12:3355-3364）、これらの抗体特異的ＥＮＧａｓｅ及びその変異体が、抗体を受容体として使用してトランスグリコシル化のより小さな基質を認識できるかどうかは明らかでない。この仮説を試験するために、一連のアジドタグ付き二糖オキサゾリンが合成された。ＰＥＧの柔軟性及び溶解性を考慮して、ＰＥＧ由来の足場を備えたアジド基を導入することが決定された。近年、Mizunoらは、ＰＥＧ化糖オキサゾリンがトランスグリコシル化のためのＥｎｄｏ－Ｍの供与体基質として機能し得ることを示した（Goto K et al., 2020 Tetrahedron Lett.61:151475）。したがって、エンドグリコシダーゼによって有利に認識され得るように、ＰＥＧリンカーが天然のグリカン分岐に似た、２つのアジド基を保有するＭａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃオキサゾリンを第１の標的として設計した（図３２；スキーム１）。合成は、ＤＤＱによるＰＭＢ基の選択的除去を通じて既知の二糖１（Ochiai et al., 2008 J Am Chem Soc 130:13790-13803）から開始され、９０％の収率で２が得られた。２のベンジリデンアセタールに対する位置選択的な還元的開環反応により、ジオール３が得られた。ＡｃＳＨでアジド基をアセトアミド基に変換して４を得た後、４をＮａＨ及びＮ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｔｓで処理することにより、二糖の３’及び６’位に２つのアジドタグ付きポリエチレン鎖が導入され、５を収率７８％で得た。アジドの存在下でベンジル基を選択的に除去するために、二相酸化条件（ＮａＢｒＯ３／Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）が採用され（Niemietz M et al., 201147:10485-10487）、これにより、所望の遊離二糖誘導体６が６５％の収率で得られた。最後に、水中で、過剰量の２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）及びＴＥＡで６を処理することにより、オキサゾリン形成が単一ステップで達成され（MNouchi et al., 2009 J Org Chem 74:2210-2212）、２つのアジド基を保有する所望の二糖オキサゾリン７が９０％の単離収率で得られた。
次に、１つ又は３つのアジド基を有する二糖を合成した（図３３；スキーム２）。マンノース残基の６位が、単一のアジド末端ＰＥＧリンカーの導入のために選択された。３の位置選択的開環によりヒドロキシル基がスムーズに露出されて、二糖８が得られた。アジド基をアセトアミド基に還元した後、ＰＥＧで離隔されたアジド基が高収率で導入されて、１０が得られた。酸化条件下での選択的脱ベンジル化は効率的であることが証明され、遊離二糖１１が９０％の収率で得られ、これは、水中ＤＭＣ／ＴＥＡで処理した後にオキサゾリン１２に変換された。並行して、３つのアジドタグ付き二糖の合成も３から開始された。アジド基をアセトアミド基に還元すると、酸性条件下でベンジリデン基及びＰＭＢ基が同時に除去され（Ochiai et al., 2008 J Am Chem Soc 130:13790-13803）、３’、４’、及び６’位に遊離ヒドロキシル基を有する１４が得られた。次に、アジド末端ＰＥＧ鎖を３つの遊離ヒドロキシル基に導入して、１５を得た。同じ脱ベンジル化条件に従って、反応は非常に速く進行したが、ＥＳＩ－ＭＳでモニタリングしたところ、所望の生成物は一部の分解副生成物とともに低収率で単離されたことがわかった。ＰＥＧ成分の増加により水溶性が高まり、その結果、部分的に脱保護された中間体が水相に移動し、フリーラジカルと直接相互作用し（Adinofi et al.1999 Tetrahedron Lett 40:8439-8441）、これにより、急速な反応をもたらしたが、望ましくない生成物が生じたと推測される。この問題に対処するために、本発明者らは２ステップの脱保護法を試みた（Ochiaia et al., 2008 J Am Chem Soc 130:13790-13803）。まず、１５のベンジル基を接触水素化により除去した。これらの条件下で、アジド基は同時にアミノ基に還元され、その後、銅触媒によるジアゾ転移反応によってアジド官能基に戻されて、５２は、２ステップで６６％の収率で１６を生じた。最後に、水中のＤＭＣ／ＴＥＡによる１６の処理による標準的なオキサゾリン形成により、３つのアジド基を保有する二糖１７が優れた収率で得られた（図３３；スキーム２）。
アジド基のクラスターを保有する二糖誘導体の化学合成。以前の研究では、より高いＤＡＲを有するＡＤＣは標的細胞死滅能力を増加させる傾向があることが実証されている（Strop et al., 2015 Nat.Biotechno 33:694-696; Lyon et al., 2015 Nat Biotechnol 33:733-735）。少数のケースでは、臨床的に承認されたEnhertu及びTrodelvyで例示されるように、親水性リンカーペイロードの使用によって８という高いＤＡＲが達成されている（Lyon et al., 2015 Nat Biotechnol 33:733-735；Barida et al., 2019 N Eng J Med 380:741-751；Viricel et al., 2019 Chem Sci 10:4048-4053）。双直交性のタグを抗体に備えるために、本発明者らは、４つ又は６つのアジド基を保有する二糖を設計した。合成は分岐した足場から開始した（図２８；スキーム３）。まず、ジオール１８（Linclau et al., 2012 Ange Chem Int Ed 51:1232-1235）及びトリオール１９（Tanaka et al., 2008 Chem Lett 37:440-441）をアジド末端リンカーによって伸長し、トリチル基を除去した後、それぞれ２２及び２３が得られた。２２及び２３の露出したＯＨをビストシルリンカーでさらに伸長して、それぞれコンジュゲーションの準備ができた２４及び２５を得た。次に、４’及び６’位に遊離ヒドロキシル基を保有する二糖４を、ＮａＨの存在下でトシル誘導体（２４及び２５）と反応させ、それぞれ２６及び２７を得た。最後に、２ステップの脱保護とそれに続くオキサゾリン形成により、それぞれ４個及び６個のアジド基を保有する二糖オキサゾリン３０及び３１が得られた（図２８；スキーム３）。
酵素抗体グリカンリモデリングの供与体基質としての合成二糖オキサゾリンの評価。二糖オキサゾリンを利用して、抗体グリカンリモデリングの供与体基質としてのその適合性を、異なるエンドグリコシダーゼの触媒作用によって試験した。この目的のために、典型的なモノクローナル抗体としてトラスツズマブ、抗Ｈｅｒ２抗体（ハーセプチン）、及び酵素反応を調べるための供与体基質として２つのＰＥＧで離隔されたアジド基を保有する合成二糖オキサゾリン（７）が選択された。結果を図２９にまとめる。トラスツズマブ（ハーセプチン）は、最初に野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２で脱グリコシル化されて、受容体としてハーセプチンのＦｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃグリコフォームが提供された（３２）。（Li et al., 2016 J Biol Chem 291:16508-165518）
試験したエンドグリコシダーゼの中で、基質特異性が緩和された血清型Ｍ４９（Ｅｎｄｏ－Ｓ２）の化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のエンドグリコシダーゼであるＥｎｄｏ－Ｓ２，５８が、アジドタグ付き二糖オキサゾリン７に対するトランスグリコシル化について顕著な活性を示すことが見出された。触媒量のみの酵素（０．１％、ｗ／ｗ、酵素／抗体）及び２０モル当量のアジド二糖オキサゾリンにより、反応は、穏やかな条件下［室温、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、及びｐＨ７．０］で１時間以内に完了し得る。トランスグリコシル化生成物（３３）は、一度形成されると、主に切断された修飾により、野生型酵素による加水分解に対して大いに耐性があることが見出された。Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体（Ｄ１８４Ｍ）は、幅広い基質特異性及び低下した加水分解活性を有するグリコシンターゼである（Li et al., 2016 J Biol Chem 291:16508-165518）。
Ｄ１８４Ｍ変異体がトランスグリコシル化にアジド二糖オキサゾリンを使用できることも試験で見出されたが、その活性は野生型酵素よりも低く、反応を駆動するために比較的多量の変異型酵素（１％、ｗ／ｗ）が必要であった。ここでも、トランスグリコシル化生成物は変異体によって加水分解されず、生成物の蓄積が可能となった。次に、Ｆｃ特異的脱グリコシル化活性を示す化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来の最初のエンドグリコシダーゼである野生型Ｅｎｄｏ－Ｓを試験した。（Goodfellow et al., 2012 J Am Chem Soc 134:8030-8033；Collinet al., 2001 EMBO J 20:3046-3055）Ｅｎｄｏ－Ｓは、修飾二糖オキサゾリンを転移させることができたが（７）、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２とは対照的に、反応を促進するには少なくとも１０倍多くの酵素が必要であった。同様に、ＦｃグリカンリモデリングのＮ－グリカンコアに対応する複合型Ｎ－グリカンオキサゾリン及びアジド－Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃオキサゾリンに効率的に作用できるグリコシンターゼであった、Ｅｎｄｏ－ＳＤ２３３Ｑ変異体（Huang et al., 2012 J Am Chem Soc 134:12308-12318）は、７について非常に低い活性を示したが、これはおそらく最小限の構造及び修飾により、酵素の基質として不良となったためと考えられる。
Ｅｎｄｏ－Ｓ２及びＥｎｄｏ－Ｓに加えて、他のいくつかのエンドグリコシダーゼも試験した。Ｅｎｄｏ－Ｆ３は、コアフコシル化された複合型Ｎ－グリカンを効率的に加水分解する、エリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Elizabethkingia meningoseptica）由来のエンドグリコシダーゼである（Tarentino et al., 1995 Glycobiology 5:599-601）。野生型Ｅｎｄｏ－Ｆ３及びその変異体Ｅｎｄｏ－Ｆ３Ｄ１６５Ａは、Ｎ－糖ペプチド合成及び抗体グリカンリモデリングのために複合型グリカンオキサゾリン及びコアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃオキサゾリンを転移できることが以前に報告されている（Huang et al., 2011 Chem Bio Chem 12:932-941:Giddens et al., 2018 Proc Natl Acad USA 115:12023-12027:Giddens et al., 2016 J Biol Chem 291:9356-9370）。しかし、野生型Ｅｎｄｏ－Ｆ３もそのグリコシンターゼ変異体（Ｄ１６５Ａ）も、アジドタグ付き二糖オキサゾリンに対してトランスグリコシル化において効率的に作用できないことが見出された。エンドグリコシダーゼＥｎｄｏ－Ａ（アルスロバクター・プロトフォルミアエ（Arthrobacter protophormiae）由来）（Takegawa et al., 1997 ArchBiochem Biophys 338:22-28；Ochiai et al., J Am Chem Soc 130:13790-13803）、Ｅｎｄｏ－Ｄ（Fan et al., 2012 J Biol Chem 287:11272-11281）及びＥｎｄｏ－ＣＣ（Eshima et al, 2015 PLoS One 10 No e0132859）については、これらはアジド二糖オキサゾリン（７）をＦｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ－ハーセプチンに転移できないことが見出された。これら３つのエンドグリコシダーゼはコアフコシル化ＧｌｃＮＡｃを受容体として受け入れることができないため、これは予想される。非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ハーセプチンが受容体として機能するかを試験するために、α－フコシダーゼ（ＢｆＦｕｃＨ）での処理によってコアフコースをＦｕｃα１，６Ｇｌｃ－ＮＡｃ－ハーセプチン（３２）から除去し、非フコシル化Ｆｃグリコフォームを生成した。しかし、Ｅｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｄ、及びＥｎｄｏ－ＣＣは、大量の酵素（１０％、ｗ／ｗ）を使用した場合でも、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析でモニタリングしたように、トランスグリコシル化生成物を示すことができなかった（図３５）。これらの研究により、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２が、生成物の加水分解を伴わずに、トランスグリコシル化のためにアジドタグ付き二糖オキサゾリンに作用する、顕著に効率的なエンドグリコシダーゼであることが確立された。
野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２を使用した、異なるアジドタグ付き二糖オキサゾリンによるワンポット化学酵素的Ｆｃグリカンリモデリング。生成物の加水分解を伴わない効率的なトランスグリコシル化のために、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２が最小限のアジド二糖オキサゾリンに作用し得るという観察と、Ｅｎｄｏ－Ｓ２が抗体Ｆｃの脱グリコシル化に対して非常に活性であるという事実を考慮すると、抗体の「ワンポット」及び部位特異的Ｆｃグリカンリモデリングにより、均一なアジドタグ付き抗体グリコフォームを生成することが可能となると想定された。実際、市販のハーセプチンを、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、室温でアジド二糖オキサゾリン（７）とともにＥｎｄｏ－Ｓ２で処理すると、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳモニタリングにより、ハーセプチンの脱グリコシル化が１０分以内に完了したことが示された。トランスグリコシル化生成物の出現と蓄積によるものである（３３）。トランスグリコシル化は、記載された条件下で１時間以内に完了して（図３６；スキーム４）、中間体を単離する必要なく本質的に定量的な変換が得られた。次に、様々な数のアジド官能基を保有する他の合成二糖オキサゾリンを用いてワンポット反応を試験した。これらのアジド官能化二糖誘導体は、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２に対して異なる活性を示し、高度に官能化された二糖の活性は低かったものの、それらは全てＥｎｄｏ－Ｓ２触媒によるトランスグリコシル化の供与体基質として機能し、酵素量を調整すると（０．１～１．０％、ｗ／ｗ）、ワンポット方式で１～３時間以内に優れた収率が得られることが見出された（図３６；スキーム４）。特に、７及び１２は、トランスグリコシル化を１時間以内に完了することができる非常に優れた基質であったため、１～３個のアジド基を保有する二糖を完全に変換するには、１部分のオキサゾリンで十分であった一方、１７は加水分解に耐性があったため、その結果、比較的大量の酵素が必要であったが、追加のオキサゾリンは必要でなかった。ただし、４つ（３０）又は６つ（３１）のアジド基を保有する二糖の場合、これらのオキサゾリン供与体に対するＥｎｄｏ Ｓ２の中程度の加水分解活性により、反応を完了させるために追加のオキサゾリンが必要であった。最終生成物はプロテインＡアフィニティーカラムで単離され、その同一性及び均一性は、ＦａｂドメインとＦｃドメインを切断するためのＩｄｅＳ処理後のインタクト全抗体とＦｃドメイングリコフォームのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析によって確認された。反応を促進するために大過剰のグリカンオキサゾリンが使用された場合、過剰のグリカンオキサゾリンはプロテインＡ精製中に遊離オリゴ糖の形態で回収でき、これは、ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣでさらに精製し、次いでＤＭＣ／ＴＥＡにより単一ステップでグリカンオキサゾリンに変換できるため、トランスグリコシル化のためのグリカンオキサゾリンのリサイクルが可能になる。
ビオチン及びフルオロフォアタグ付き二糖オキサゾリンによるワンポット化学酵素的Ｆｃグリカンリモデリング。アジド官能基のワンポット導入によって後押しされて、ビオチン又はフルオロフォアでタグ付けされた二糖などのより複雑な構造を、Ｅｎｄｏ Ｓ２を使用してインタクト抗体に直接転写できるかどうかが調べられた。この方法では、抗体をワンステップで標識でき、これは、診断及びインビボイメージング、並びに分子生物学のツールとして魅力的であろう（Freise et al., 2015 Mol Immunol 67:142-152；Zhou et al., 2017 Biomedicines 5:64；Boeggeman et al., 200920:1228-1236）。この目的のために、アミンカップリング反応（３９）又はクリックケミストリー（４０）のいずれかを介してビオチン又はＴＡＭＲＡが二糖に導入され、修飾された二糖オキサゾリンが依然としてＥｎｄｏ－Ｓ２の良好な基質として機能できることが見出された。ビオチン化二糖は、触媒量の酵素（０．１％、ｗ／ｗ）を使用して１．５時間以内にインタクト抗体に転写されて、９５％の収率で４１を生じ、追加のオキサゾリンを加えると、ＴＡＭＲＡタグ付き二糖オキサゾリンは生成物（４２）の約８５％を得ることができた（図３７；スキーム５）。まとめると、本明細書で説明した化学酵素的リモデリング法は、インタクト抗体のワンステップ標識に大きな可能性を示した。
銅を含まないひずみ促進型クリック反応による、構造的に明確に定義された均一なＡＤＣの合成。これらのアジドタグ付き抗体を利用して、次に、モデル弾頭として、ＦＤＡに承認されたＡＤＣの作製に使用されている微小管破壊剤であるモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を使用して、クリックケミストリーによるＡＤＣの作製を試みた（図３８；スキーム６）（Walsh et al., 2021 Chem Soc Rev 50:1305-1353；do Pazo et al., 2021 Nat Rev Drug Discovery 20:853584）。切断可能なジペプチドリンカーを有するジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）末端ＭＭＡＥ誘導体をアジドタグ付き抗体とインキュベートし、反応をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳでモニタリングした。クリックケミストリーにより、徐々に所望の化合物が得られることが見出された（４３～４７）。８Ｎ３修飾ハーセプチン（３６）とＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥの反応を例に挙げる。ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによって示されるように、８つの部位全てが２０時間以内に薬物とコンジュゲートした（図３９）。薬物がＦｃドメインに特異的にコンジュゲートしていることをさらに検証するために、生成物をプロテアーゼＩｄｅＳで消化し、続いてＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析を行った（Anami et al., 2018 Nat Commun 9:2512）。結果は、分子量のシフトが結合したペイロードと一致することを示し（Ｆｃドメイングリコフォームについて計算、Ｍ＝３２，１４０；観測値、３２，１４３、デコンボリューションデータ）、生成物の構造がさらに確認された。特に、全抗体又はＦｃドメインに由来するイオンフラグメント（図３９のアスタリスク付きのピーク）がＥＳＩ－ＭＳ分析で検出され、これは以前の研究で報告されている薬物フラグメント（約７６２Ｄａ）の損失に対応していた（Anami et al., 2018 Nat Commun 9:2512；Anami et al, 2017 Org Biomol Chem 15:5635-5642）。最後に、４つのアジド基を保有するＭａｎ３由来抗体もペイロードとコンジュゲートし、異なる成分の影響を調査できる別のＤＡＲ４－ＡＤＣ（４８）が得られた（図３８；スキーム６）。
異なるＤＡＲによるＡＤＣの癌細胞死滅能力の比較研究。異なるＤＡＲによるＡＤＣの効力を実証するために、高レベル又は低レベルのＨＥＲ２を発現する乳癌細胞株における細胞毒性アッセイが行われた。結果は、半数効果濃度（ＥＣ５０）値によって示されるように、全てのＡＤＣが高標的（ＨＥＲ２）発現細胞株ＢＴ４７４の有意な細胞死滅を達成し、より高いＤＡＲを有するＡＤＣがより強力であることを示した（図４０）。ＡＤＣの細胞死滅能力はＡＤＣのＤＡＲに比例することが見出された。例えば、ＤＡＲが２から４に増加すると、４４（０．１０４ｎＭ）のＥＣ５０は４３（０．１７０ｎＭ）の約半分に減少し；ＤＡＲが２から８に増加すると、４６（０．０８０ｎＭ）のＥＣ５０は４３の約３倍に減少した（図４０）。これらの結果は、様々なＤＡＲ（２～８）を有する部位特異的にコンジュゲートしたＡＤＣを比較する、以前に報告された観察と一致している。１３さらに、マウス異種移植モデルでは、部位特異的な高負荷ＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ８）は、低負荷ＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ２）よりもかなり効果的である。１３一方、試験した濃度下で低レベルのＨＥＲ２を発現するＴ４７Ｄ細胞株では、ＤＡＲ２～６を有するＡＤＣによる実質的な死滅は観察されず、標的細胞に対するＡＤＣの選択性が高いことを示している。しかし、より高いＤＡＲを有するＡＤＣでは、特にＤＡＲ１２を有するＡＤＣ（４７）について高濃度下で非特異的な細胞死滅が観察されたが、これは驚くべきことではない。複数の疎水性リンカーを保有するＡＤＣは細胞表面に非特異的に結合する傾向があり、その結果、特異的抗原の発現とは無関係に正常細胞に対して細胞毒性を引き起こすからである。親水性ペイロードとの交換は、非特異的な細胞死滅を克服する解決策となり得る。まとめると、結果は、抗体あたり６～８個のペイロードを保有するこの方法で作製されたＡＤＣが最適な効力及び安全性プロファイルをもたらし得ることを示す。ＡＤＣに加えて、ここで説明するアジドタグ付き抗体は、抗体－酵素コンジュゲートの部位選択的構築（Gray et al., 2020 Nat Chem Biol 16:1376-13840；Xiao et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2016113:10304-10309）、抗体－細胞コンジュゲート（Wang et al., 2021 ACS Chem Bio 16:724-730；Li et al., 2018 ACS Cent Sci 4:1633-1641）、抗体－抗生物質コンジュゲート（Lehar et al., Nature 2015527:323-328）、及び標的タンパク質分解のためのリソソーム標的化キメラ（Ahn et al., Nat Chem Biol 17:937-946；Banik et al., 2020 Nature 584:291-297；Zhou et al., 2021 ACS Cent Sci 7:499-506；Powell et al., 2021 ACS Infect Dis 7:2050-2067）などの、他の抗体コンジュゲーションにも使用できる。
したがって、Ｆｃグリカン媒介抗体標識及びコンジュゲーションのための一般的且つロバストな化学酵素法が確立される。この方法は、Ｆｃ特異的エンドグリコシダーゼ触媒によるトランスグリコシル化の供与体基質としての様々な官能化二糖オキサゾリンの設計、合成、及び評価によって可能になる。野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２が、様々な選択的に修飾された二糖オキサゾリンのトランスグリコシル化に対して優れた活性を示し、さらに得られた修飾抗体は修飾により酵素加水分解に耐性があるという発見は、部位特異的抗体の標識及びコンジュゲーションのための一般的なプラットフォームにつながった。特に、Ｅｎｄｏ－Ｓ２の緩和された基質特異性により、アジドタグ、ビオチンタグ、又は蛍光タグによる抗体の直接標識が可能になり、部位選択的な方法でインタクトな抗体の単一ステップ標識を達成することが可能になる。様々な数のアジド官能基を導入できる柔軟性により、２～１２の範囲の明確に定義されたＤＡＲを有する均一なＡＤＣを生成するための一般的且つロバストな戦略が提供される。全てのＩｇＧ抗体は高度に保存されたＦｃ－Ｎ－グリカンを保有しているため、この一般的なＦｃ－グリカンを介した標識及びコンジュゲーション方法は、抗体－薬物コンジュゲーションだけでなく、細胞の標識、イメージング、及び診断にも広く適用できると期待されている。
材料及び方法
グリカン基質の化学合成。一般。全ての化学物質、試薬、及び溶媒はSigma-Aldrich及びＴＣＩから購入し、特に記載がない限り、さらに精製することなく反応に適用した。薄層クロマトグラフィーはガラスプレート上のシリカゲル（Sigma-Aldrich）を使用して実施し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）でスポットを検出し、次いで５％（ｖ／ｖ）硫酸のＥｔＯＨ溶液で炭化又はモリブデン酸セリウム染色し、その後１５０℃で加熱した。フラッシュクロマトグラフィー用のシリカゲル（２００～４２５メッシュ）はSigma-Aldrichから購入した。ＮＭＲスペクトルは、溶媒としてＣＤＣｌ３又はＤ２Ｏを使用して４００ＭＨｚ分光計（Bruker，東京，日本）で記録された。化学シフトはｐｐｍで指定され、多重度はｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、及びｍ（多重項）で示される。結合定数（Ｊ）は、ヘルツ単位で報告される。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦは、マトリックスとしてＤＨＢ（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ＝１：１）を使用し、ポジティブリフレクトロンモードで、Bruker Autoflexスピード質量分析計で実施された。ＨＲＭＳは、C18カラムを備えたExactive Plus Orbitrap質量分析計（Thermo Scientific）で実施した。分取ＨＰＬＣは、Waters 600ＨＰＬＣ装置及びWaters C18カラム（７．０μｍ、１９×３００ｍｍ）を用いて実施した。カラムは、流速１０ｍＬ／分で、０．１％ＦＡを含有するＭｅＣＮ－Ｈ２Ｏの適切な勾配で溶出した。二糖誘導体及び他の低分子化合物（１～３１、３９、及び４０）の化学合成の詳細な手順は、その全体が本明細書に組み込まれる（ACS Chem Biol 2021 Nov 19;16(11)のSupporting Informationに提供されている。抗体コンジュゲートの合成については以下に記載する。
アジド、ビオチン、又はＴＡＭＲＡ官能化抗体の調製。
一般。ＬＣ－ＭＳ分析は、Ｃ４（全抗体、勾配、０．１％ＦＡを含有する５～９５％ＭｅＣＮ水溶液で６分間、０．４ｍＬ／分）又はＣ８（ＩｄｅＳ消化、勾配、０．１％ＦＡを含有する２５～３５％ＭｅＣＮ水溶液で６分間、０．４ｍＬ／分、又は０．１％ＦＡを含有する５～９５％水性ＭｅＣＮで６分間、０．４ｍＬ／分）カラムを備えたExactive Plus Orbitrap質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に接続されたUltimate 3000 HPLCで実施した。デコンボリューションデータはMagTranソフトウェアを使用して変換された。
３３の合成（図３６）。市販のハーセプチン（１．０ｍｇ）及びオキサゾリン７（１８６μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（１．０μｇ）とともに４０μＬの１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。１時間以内に、ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率９５％超でトランスグリコシル化が完了したことが示された。生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３３（Nanodropを使用した測定で９２０μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４７，２２４Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４７，２２４（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２４，８１３Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４，８１４（デコンボリューションデータ）。
３４の合成（図３６）。市販のハーセプチン（１．０ｍｇ）及びオキサゾリン１２（１４３μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（１．０μｇ）とともに４０μＬの１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。３０分以内に、ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率９５％超でトランスグリコシル化が完了したことが示された。生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３４（Nanodropを使用した測定で９００μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４６，９０９Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４６，９１２（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２４，６５６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４，６５６（デコンボリューションデータ）。
３５の合成（図３６）。市販のハーセプチン（１．０ｍｇ）及びオキサゾリン１７（２３０μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（１０μｇ）とともに４０μＬの１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。２時間後、ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率９５％超でトランスグリコシル化が完了したことが示された。生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３５（Nanodropを使用した測定で９００μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４７，５３８Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４７，５３９（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２４，９７０Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４，９７２（デコンボリューションデータ）。
３６の合成（図３６）。市販のハーセプチン（１．０ｍｇ）及びオキサゾリン３０（３２８μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（２．０μｇ）とともに４０μＬの１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。１時間後、さらにオキサゾリン（１６４μｇ、反応部位あたり１０当量）を加え、反応物をさらに３０分間インキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率９５％超でトランスグリコシル化が完了したことが示されたとき、生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３６（Nanodropを使用した測定で９００μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４８，２６０Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４８，２６２（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２５，３３２Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２５，３３２（デコンボリューションデータ）。
３７の合成（図３６）。市販のハーセプチン（１．０ｍｇ）及びオキサゾリン３１（４００μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（１０μｇ）とともに４０μＬの１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。３０分後、さらにオキサゾリン（２００μｇ、反応部位あたり１０当量）を加え、反応物をさらに３０分間インキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析で９０％超の変換収率が示されるまでこの手順を２～３回繰り返し、生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３７（Nanodropを使用した測定で９００μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４８，７７６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４８，７７８（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２５，５９０Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２５，５９０（デコンボリューションデータ）。
３８の合成（図３８）。脱グリコシル化ハーセプチン３２（１．０ｍｇ）及びＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ四糖オキサゾリン３５（２００μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ（１０μｇ）とともに、１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）１００μＬ中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。３０分以内に、ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率９５％超でトランスグリコシル化が完了したことが示された。生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３８（Nanodropを使用した測定で９１０μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４７，３４４Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４７，３４６（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２４，８７３Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４，８７４（デコンボリューションデータ）。
４１の合成（図３７）。市販のハーセプチン（１００μｇ）及びビオチンタグ付きオキサゾリン３９（３８．４μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（０．１μｇ）とともに５μＬの１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによって反応をモニタリングした。１時間後、さらにオキサゾリン（１９．２μｇ、反応部位あたり１０当量）を加え、反応物をさらに３０分間インキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率９５％超でトランスグリコシル化が完了したことが示された。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４８，６６０Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４８，６６３（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２５，５３２Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２５，５３３（デコンボリューションデータ）。
４２の合成（図３７）。市販のハーセプチン（１００μｇ）及びＴＡＭＲＡタグ付きオキサゾリン４０（７０μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２（１．０μｇ）とともに５μＬの１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＭＳによって反応をモニタリングした。６０分後、さらにオキサゾリン（３５μｇ、反応部位あたり１０当量）を加え、反応物をさらに６０分間インキュベートした。この手順を４～５回繰り返し、ＬＣ－ＭＳ分析により、変換収率が約８５％であることが示された。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１５０，９６８Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１５０，９６７（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２６，６８７Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２６，６８５（デコンボリューションデータ）。
４３の合成（図３８）。５０ｍＭ ＰＢ／ＤＭＳＯ（７０μＬ／２５μＬ）の混合物中の３４（２００μｇ）の溶液に薬物ペイロード（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）４３（５．０ｍｇ／ｍＬ、４．６μＬ、１０当量）を加え、反応物を室温でインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去し、残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、４３（Nanodropを使用した測定で１５０μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１５０，３１３Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１５０，３１４（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２６，３５８Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２６，３５９（デコンボリューションデータ）。
４４の合成（図３８）。５０ｍＭ ＰＢ／ＤＭＳＯ（７０μＬ／２０μＬ）の混合物中の３３（２００μｇ）の溶液に薬物ペイロード（５．０ｍｇ／ｍＬ、９．２μＬ、２０当量）を加え、反応物を室温でインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去し、残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、４４（Nanodropを使用した測定で１４２μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１５４，０３２Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１５４，０３４（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２８，２１７Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２８，２１９（デコンボリューションデータ）。
４５の合成（図３８）。５０ｍＭ ＰＢ／ＤＭＳＯ（７０μＬ／１９μＬ）の混合物中の３５（２００μｇ）の溶液に薬物ペイロード（５．０ｍｇ／ｍＬ、１１．３μＬ、２５当量）を加え、反応物を室温でインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去し、残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、４５（Nanodropを使用した測定で１２０μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１５７，７５０Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１５７，７５３（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝３０，０７６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、３０，０７９（デコンボリューションデータ）。
４６の合成（図３８）。５０ｍＭ ＰＢ／ＤＭＳＯ（７０μＬ／１５μＬ）の混合物中の３６（２００μｇ）の溶液に薬物ペイロード（５．０ｍｇ／ｍＬ、１３．６μＬ、３０当量）を加え、反応物を室温でインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去し、残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、４６（Nanodropを使用した測定で１２０μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１６１，８７６Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１６１，８８０（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝３２，１４０Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、３２，１４３（デコンボリューションデータ）。
４７の合成（図３８）。５０ｍＭ ＰＢ／ＤＭＳＯ（７０μＬ／１０μＬ）の混合物中の３７（２００μｇ）の溶液に薬物ペイロード（５．０ｍｇ／ｍＬ、１８．５μＬ、４０当量）を加え、反応物を室温でインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去し、残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、４７（Nanodropを使用した測定で１００μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１６９，２００Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１６９，２０５（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝３５，８０２Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、３５，８０５（デコンボリューションデータ）。
４８の合成（図３８）。５０ｍＭ ＰＢ／ＤＭＳＯ（７０μＬ／２０μＬ）の混合物中の３８（２００μｇ）の溶液に薬物ペイロード（５．０ｍｇ／ｍＬ、９．２μＬ、２０当量）を加え、反応物を室温でインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、混合物を５０ｍＭ ＰＢ（３ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過して、疎水性ペイロードの大部分を除去し、残渣を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、４８（Nanodropを使用した測定で１３０μｇ）を得た。ＬＣ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１５４，１５１Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１５４，１５４（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後、ＬＣ－ＭＳでＦｃ部分を計算、Ｍ＝２８，２７７Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２８，２７９（デコンボリューションデータ）。
乳癌細胞株による細胞死滅研究。ＢＴ４７４細胞（ATCC HTB-20）は、Ｔ－７５フラスコ（CELLTREAT）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するHybri-Care培地（ATCC 46-X）に懸濁して維持された。Ｔ４７Ｄ細胞（ATCC HTB-133）は、Ｔ－７５フラスコ（CELLTREAT）中のＦＢＳ、４ｍｇ／ｍＬインスリン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するRPMI-1640培地（ATCC 30-2001）に懸濁して維持された。細胞毒性アッセイでは、細胞を１ウェルあたり１０，０００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。５０００～０．０８５ｎｇ／ｍＬの対応する培地によって、ＡＤＣサンプルに連続３倍希釈を適用した。サンプルを３つのウェル（ウェルあたり１５０μＬ）に全ての単一濃度で加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した後、Cell Counting Kit-8（Sigma）を添加した。生細胞によって放出されたホルマザンの吸光度は、３７℃、５％ＣＯ２で２～３時間インキュベートした後、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。最後に、GraphPad Prismソフトウェアを使用してＥＣ５０値及び細胞生存率曲線を計算した。
実施例４
リソソーム標的化キメラ（ＬＹＴＡＣ）は、目的の細胞外タンパク質及び膜関連タンパク質を分解する機会を提供する。本明細書では、「非天然」部分を導入するタンパク質工学及び従来のクリック反応を必要とせずに、高親和性マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）グリカンリガンドの抗体への単一ステップで部位特異的なコンジュゲーションを可能にし、膜関連タンパク質の標的分解のための均一な抗体－Ｍ６Ｐグリカンコンジュゲートを生成する、効率的な化学酵素法について説明する。トラスツズマブ及びセツキシマブをモデル抗体として使用すると、野生型エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ－Ｓ）が抗体の脱グリコシル化と、合成Ｍ６Ｐグリカンオキサゾリンから脱グリコシル化抗体へのＭ６Ｐグリカンの同時転移を、ワンポット方式で効率的に実行でき、構造的に明確に定義された抗体－Ｍ６Ｐグリカンコンジュゲートが得られることが示された。野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２を使用して脱グリコシル化し、続いてＥｎｄｏ－Ｓ２変異体（Ｄ１８４Ｍ）を用いてトランスグリコシル化する２ステップの手順も、Ｍ６Ｐグリカン－抗体コンジュゲートを得るのに効率的であった。化学酵素的アプローチは、セツキシマブの選択的Ｆｃグリカンリモデリングによって例示されるように、ＦｃドメインとＦａｂドメインの両方がグリコシル化された場合、Ｆｃグリカンリモデリングに対し高度に特異的であった。ＳＰＲ結合分析により、Ｍ６Ｐコンジュゲートは、カチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）に対してナノモル範囲の結合親和性を保有することが示された。予備的な細胞ベースのアッセイでは、Ｍ６Ｐ－トラスツズマブ及びＭ６Ｐ－セツキシマブコンジュゲートが、それぞれ膜結合性ＨＥＲ２及びＥＧＦＲを選択的に分解できることが示された。このモジュール式グリカンリモデリング戦略は、細胞外タンパク質及び膜タンパク質の抗体ベースのリソソーム標的分解に広範な用途が見出されることが期待されている。
結果
リン酸化グリカンの抗体への部位特異的酵素的転移のためのエンドグリコシダーゼのスクリーニング。Ｎ－グリカンのα－１，３－分岐に対応するリン酸化四糖オキサゾリン（１）は、ＣＩ－ＭＰＲに対する高親和性リガンドを得るための、野生型Ｅｎｄｏ－Ａ及びＥｎｄｏ－Ｆ３のトランスグリコシル化の優れた基質として最近同定された（Zhang et al., Chem Sci 202112:12451-12462）。このＭ６Ｐグリカンオキサゾリンが酵素によってインタクト抗体に効率的に転移できるかどうかを試験するために、脱グリコシル化トラスツズマブ（ハーセプチン）を受容体として、リン酸化四糖オキサゾリン（１）を供与体基質として使用して、エンドグリコシダーゼのパネルをスクリーニングした。結果を図４３にまとめた。インタクトＩｇＧ抗体のＦｃ脱グリコシル化及び切断型Ｎ－グリカンの酵素的転移に対して活性且つ特異的であることが以前に判明している野生型ＥｎｄｏＳ（Haung et al., J Am Chem Soc.2012134:12308-18；Tong et al., Bioorg Med Chem 201826:1347-1355；Collin et al., EMBO J 200120:3046-55）から出発して、触媒量の酵素（０．２％ｗ／ｗ）を使用すると、合計３０モル当量のＭ６Ｐ四糖オキサゾリン（１）を２回に分けて加えたとき、ＥｎｄｏＳ－ＷＴがトランスグリコシル化に非常に効率的であり、反応が２時間以内に完了することが判明した。この条件下では、結合したグリカンのわずかな（１％未満）加水分解のみが観察され、これにより生成物の蓄積が可能となった。強力なトランスグリコシル化活性と、市販の抗体からの複合型Ｎ－グリカンの効率的な加水分解を共に考慮すると、脱グリコシル化及びトランスグリコシル化は、野生型酵素と脱グリコシル化抗体中間体を単離する必要なく、ワンポット方式で実施できるため、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓは、抗体の不均一なグリコフォームをリモデリングして均一なＭ６Ｐ－抗体コンジュゲートを生成するための実用的なワンポット戦略を提供した。次に、大きい二分岐グリカンオキサゾリンを抗体に効率的に転移できる、その変異体であるＥｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑを試験した（Huang et al., J Am Chem Soc 2012134:12308-18）。Ｄ２３３Ｑ変異体との酵素反応は野生型Ｅｎｄｏ－Ｓのものよりもはるかに遅く、反応を完了させるにはより大量の酵素及び糖オキサゾリンが必要であることが見出された。血清型Ｍ４９の化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来の別のエンドグリコシダーゼであるＥｎｄｏ－Ｓ２（Sjogren et al., Biochem J 2013455:107-18）も、触媒量の酵素（０．１％、ｗ／ｗ）を使用した場合、リン酸化グリカン（１）の抗体への急速なトランスグリコシル化を示した。しかし、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２もグリカンオキサゾリン（１）を急速に加水分解するが、結果として生じる「基底状態」のトランスグリコシル化生成物の加水分解は比較的ゆっくりであることが見出された。したがって、この場合、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２はＥｎｄｏ－Ｓ酵素よりも効率が低かった。グリカンオキサゾリン基質の加水分解を低減するために、幅広い基質特異性及び低下した加水分解活性を有するグリコシンターゼであるＥｎｄｏ－Ｓ２のＤ１８４Ｍ変異体を試験した。（Li et al., J Biol Chem 2016291:16508-18）。Ｄ１８４Ｍ変異体は優れたトランスグリコシル化活性を示すことが見出された。触媒量の酵素（０．１％～０．２％ｗ／ｗ）と、さらに当量を減らしたオキサゾリン（１）（１０当量）により、反応はスムーズに進行し、１時間以内にトランスグリコシル化生成物が得られた。予想通り、追加のオキサゾリンは必要なく、トランスグリコシル化生成物は変異体による加水分解に対して耐性があった。したがって、Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ変異体は、Ｍ６Ｐ含有抗体を産生する別の実用的な方法を提供した。Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、及びそれらの変異体に加えて、他のいくつかのエンドグリコシダーゼも試験した。コアフコシル化された複合型Ｎ－グリカンを優先的に加水分解し（Giddens et al., J Biol Chem 2016291:9356-9370）、多重グリコシル化タンパク質のＭ６Ｐ－グリカンリモデリングに使用することに成功している（Zhang et al., Chem Sci 202112:12451-12462）Ｅｎｄｏ－Ｆ３は、大量の酵素（１０％、ｗ／ｗ）を加えても、遅いトランスグリコシル化しか示さなかった。治療用抗体のＦａｂ及びＦｃグリカンの両方のリモデリングに使用されているグリコシンターゼ変異体（Giddens et al., Proc Natl Acad Sci USA 2018115:12023-12027）であるＥｎｄｏ－Ｆ３ Ｄ１６５Ａ変異体は、微量のトランスグリコシル化生成物のみが検出されたため、このリン酸化四糖に対する明らかな活性は示されなかった（図３７）。非フコシル化基質を好むＥｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｄ及びＥｎｄｏ－ＣＣについては、ＧＮＦ－トラスツズマブ（２）をフコシダーゼ（ＢｆＦｕｃＨ）で処理して、脱フコシル化Ｆｃグリコフォームを生成した。しかし、これら３つの酵素は全て、大量の酵素（１０％、ｗ／ｗ）を使用しても生成物が得られなかった（図３７）。まとめると、結果は、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ、及びＥｎｄｏ－Ｓ２のグリコシンターゼ変異体（Ｄ１８４Ｍ）が、供与体基質として合成リン酸化Ｎ－グリカンオキサゾリン（１）を使用する抗体バイオコンジュゲーションに最適な酵素であり、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓは脱グリコシル化とグリコシル化を同時に実施ことができ、これにより、均一な抗体－Ｍ６Ｐグリカンコンジュゲートを生成するためのＭ６Ｐグリカンリガンドとのワンポットバイオコンジュゲーションが可能となっていることを示唆している。
抗体グリカンリモデリングのための供与体基質としての追加のＭ６Ｐグリカンオキサゾリンの評価。Ｅｎｄｏ－Ｓ２のＤ１８４Ｍ変異体が、合成Ｍ６Ｐ四糖オキサゾリン（１）によるトラスツズマブのグリコシル化に効率的な変異体であると同定された後、以前に本発明者らが合成した２つの追加のリン酸化Ｎ－グリカンオキサゾリンによる脱グリコシル化トラスツズマブのグリコシル化（４及び５）を調べ、比較した（Yamaguchi et al., J Am Chem Soc 2016138:12472-85）。予想通り、Ｅｎｄｏ－Ｓ２のＤ１８４Ｍ変異体は、グリカンオキサゾリン１に効率的に作用して、Ｆｃドメインに、対応するＭ６Ｐ含有Ｎ－グリカンを保有するグリコフォーム（３）を生成することができた（図２８；スキーム１）。Ｄ１８４Ｍ変異体は、より大きなビスリン酸化グリカン（４及び５）を転移用の供与体基質として使用して、それぞれ２つのＭ６Ｐ抗体グリコフォーム（６及び７）を与えることもできるが、反応を完了させるために、比較的大量の酵素と、より高濃度の抗体が必要であった。これらの結果は、２つのＭ６Ｐ部分を保有するグリカンオキサゾリンが供与体基質としてＭ６Ｐ四糖オキサゾリン（１）ほど優れていないことを示す。それにもかかわらず、データは、Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体がグリカン上の修飾を許容して、異なるリン酸化のパターンを有する抗体グリコフォームが得られることを示している。抗体生成物はプロテインＡカラムで精製され、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析によってその同一性が確認された。最後に、過剰のグリカンオキサゾリンは精製中に遊離オリゴ糖の形態で回収され、これは、ＤＭＣ／Ｅｔ３Ｎ（Noguchi et al.J Org Chem 200974:2210-2212）を用いて１ステップでグリカンオキサゾリンに容易に変換され、トランスグリコシル化のためのグリカンオキサゾリンのリサイクルが可能になった。
トラスツズマブに加えて、結腸直腸癌及び扁平上皮癌の処置のために上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする治療用抗体であるセツキシマブのＭ６Ｐ－グリカンリモデリングも実施された（Chung et al., N Engl J Med 2008358:1109-1117）。セツキシマブは、Ｆａｂ染め員及びＦｃドメインの両方でグリコシル化されており、Ｎ－グリカン構造において非常に不均一性がある（Qian et al., Anal Biochem 2007364:8-18）。以前の研究では、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２がＦｃグリカンの加水分解に非常に特異的であることが示されている（Giddens et al., Proc Natl Acad Sci USA 2018115:12023-12027）。したがって、市販のセツキシマブは、まず野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２で処理され、脱グリコシル化されたＦｃグリコフォームが生成された。次に、得られたＧＮＦ－セツキシマブ（８）を、Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ触媒によるグリカンオキサゾリン１及び５とのトランスグリコシル化の受容体として使用し、それぞれＭ６Ｐグリカンリモデリングセツキシマブ９及び１０を得た。セツキシマブのＭ６Ｐグリカンリモデリングは、トラスツズマブと同様に効率的であり、プロテインＡ精製後に生成物（９及び１０）が９０％超の収率で単離されることが見出された。Ｍ６ＰグリカンがＦｃドメインに特異的にコンジュゲートしていることをさらに検証するために、抗体生成物（９及び１０）をプロテアーゼＩｄｅＳで消化し、続いてＦａｂ及びＦｃドメインのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析を行った（Chevreux et al., Anal Biochem 2011415:22-4）。ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析により、Ｆｃドメインモノマーの分子量の変化は、それぞれ抗体９及び１０の対応するＭ６Ｐグリカンの結合と一致していたが、Ｆａｂドメインは、酵素的糖鎖工学手順の前後で変化しないグリコフォームの混合物として現れたことが示された。これらの結果は、化学酵素的グリカンリモデリングアプローチが、Ｆａｂドメインを修飾することなくＦｃドメインで高度に選択的であることを裏付けている。さらに、抗体９のＦｃ及びＦａｂドメインから放出されたＮ－グリカンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ分析により、９のＦｃドメインが単一のＭ６Ｐグリカンを保有している一方、Ｆａｂグリカンはグリカンリモデリングの前後でインタクトであることがさらに確認された（図４６）。
ＳＰＲ結合研究。次に、ＳＰＲ技術を使用して、Ｍ６Ｐ修飾抗体のリソソーム標的化受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）に対する結合親和性を評価した。α－１，３－分岐（３及び９）に対応するＭ６Ｐ四糖部分及び二リン酸化七糖部分（７及び１０）を保有する抗体は、Ｍ６Ｐ受容体、ＣＩ－ＭＰＲに対して高い親和性を示すことが見出された（図４７）。トラスツズマブの場合、結合のＫＤ値は、グリコフォーム３及び７についてそれぞれ２８．６ｎＭ及び５．４ｎＭであると測定された。データは、二リン酸化七糖部分を保有するグリコフォーム（７）の親和性が、Ｍ６Ｐ四糖部分を保有するグリコフォーム（３）のものよりも約４倍高かったことを示している。一方、２つのセツキシマブグリコフォーム（９及び１０）のＫＤ値は、それぞれ７０．３ｎＭ及び２９．６ｎＭであった。したがって、大きいビスリン酸化Ｎ－グリカンを保持するグリコフォーム（１０）の親和性は、小さいＭ６Ｐ四糖部分を保持するもの（９）の親和性の約２倍であった。これらのデータは、抗体コンテキストの性質も、結合したＭ６ＰグリカンのＭ６Ｐ受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）に対する親和性に対し中程度の影響を与えることを示す。興味深いことに、Ｍ６Ｐ－Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカン（６）を保有する抗体のグリコフォームは、ＳＰＲ測定条件下でＣＩ－ＭＰＲに対して弱い親和性のみを示した。ラングミュア結合モデルを使用したグローバルフィッティングでは、グリコフォーム６の信頼できる動的データは得られなかったが、定常状態のフィッティングでは約０．７０μＭの推定ＫＤ値が得られた。この結果は、ＣＩ－ＭＰＲに対する異なるＭ６Ｐグリカンリガンドの親和性に関する以前の観察と一致している。（Zhang et al., Chem Sci 202112:12451-12462）。Ｍ６Ｐ糖ペプチドの以前の構造親和性関係の研究では、Ｍａｎ６Ｐ－α１，２－Ｍａｎ二糖部分がＣＩ－ＭＰＲ受容体に対する強い結合親和性を保持する必須の構造モチーフを構成することが示されている。Ｍ６Ｐ－Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃグリカンを保持する糖ペプチドはこのモチーフを欠いており、ＣＩ－ＭＰＲに対して約０．８４μＭのＫＤの弱い結合しか示さず、その親和性は、Ｍａｎ６Ｐ－α１，２－Ｍａｎ二糖部分を有するグリカンを保有する糖ペプチドの親和性よりもはるかに低い。（Zhang et al., Chem Sci 202112:12451-12462）。したがって、必須の高親和性Ｍａｎ６Ｐ－α１，２－Ｍａｎモチーフを保有し、より大きいビスＭ６Ｐグリカンオキサゾリン（５）よりも合成がはるかに簡単な、最小のＭ６Ｐ四糖オキサゾリン（１）が、ＣＩ－ＭＰＲに対して高い親和性を有する抗体－Ｍ６Ｐ－グリカンコンジュゲートを構築するための直接的なＦｃグリカンリモデリングに適した供与体基質として同定された。
Ｍ６Ｐグリカンリモデリング抗体による膜関連抗原の分解。細胞ベースのアッセイにおいてそれぞれの抗原の標的分解の可能性を調べるために、ＨＥＲ２を認識するＭ６Ｐ修飾トラスツズマブ（３）、及びＥＧＦＲを標的とするＭ６Ｐ修飾セツキシマブ（９）の２つの抗体が選択された。したがって、ＢＴ４７４（内因性ＨＥＲ２発現）及びＨｅｐＧ２（内因性ＥＧＦＲ発現）細胞株を、それぞれ３及び９と４８時間インキュベートし、総抗原レベルをウエスタンブロットで測定した。Ｍ６Ｐ修飾トラスツズマブ（３）は、１０ｎＭという低濃度でＨＥＲ２の５５％を分解できるが、トラスツズマブ単独ではＨＥＲ２を１８％分解することが見出された（図４８）。ＥＧＦＲの同様の分解が、Ｍ６Ｐ修飾セツキシマブ（９）によって観察された（５７％）（図４８）。
本方法で生成されたセツキシマブ－Ｍ６Ｐグリカンコンジュゲート（９）による標的分解ＥＧＦＲは、ポリマーＭ６Ｐｎ－糖ペプチドを保有するセツキシマブコンジュゲートと同等であり、約７０％のＥＧＦＲ分解が観察された。（Banik et al., Nature 584:291-297）。次に、細胞を天然抗体又はＭ６Ｐ修飾抗体で処理した後、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲの表面レベルをフローサイトメトリーによって測定した（図４９）。結果は、ＥＧＦＲ結合シグナルの有意な減少によって実証されるように、セツキシマブ及びＭ６Ｐ修飾セツキシマブの両方が細胞表面ＥＧＦＲを効率的に内部移行できることを示した（図４９）。しかし、Ｍ６Ｐ修飾セツキシマブは、総ＥＧＦＲの減少に関して未修飾セツキシマブよりもはるかに優れた効果を示した（図４８）。このデータは、Ｍ６Ｐ修飾抗体が抗原を分解のために効率的にリソソームに移動できることを示す。この結果は、構造的に明確に定義されたＭ６Ｐグリカンリモデリング抗体の、メンバー関連タンパク質の分解の実現可能性を裏付けている。
高親和性Ｍ６Ｐグリカンリガンドの抗体への部位特異的バイオコンジュゲーションのための非常に効率的な化学酵素法が本明細書で確立される。この方法は、ＣＩ－ＭＰＲに対して高い親和性を示す、構造的に明確に定義された均一なＭ６Ｐグリカン－抗体コンジュゲートを提供する。細胞ベースのアッセイは、Ｍ６Ｐ－トラスツズマブ及びＭ６Ｐ－セツキシマブコンジュゲートが、それぞれ膜結合性ＨＥＲ２及びＥＧＦＲを選択的に分解できることを示す。この研究は、エンドグリコシダーゼ触媒による合成リン酸化Ｎ－グリカンの抗体への転移の最初の例を提供する。このモジュール式グリカンリモデリング戦略により、「非天然」部分を導入するタンパク質工学及び従来のクリック反応を必要とせずに、単一ステップの部位特異的な方法で均一な抗体－Ｍ６Ｐ－グリカンコンジュゲートの構築が可能になる。この方法は、目的の細胞外タンパク質及び膜タンパク質の標的分解のためのＭ６Ｐ抗体コンジュゲートを生成する他の抗体にも等しく適用され得ると予想される。
方法及び方法
リン酸化グリカンオキサゾリンを供与体基質として用いた、脱グリコシル化抗体の酵素的グリコシル化。一般。ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析は、Ｃ４（全抗体、勾配、０．１％ＦＡを含有する５～９５％ＭｅＣＮ水溶液で６分間、０．４ｍＬ／分）又はＣ８（ＩｄｅＳ消化、勾配、０．１％ＦＡを含有する２５～３５％ＭｅＣＮ水溶液で６分間、０．４ｍＬ／分）カラムを備えたExactive Plus Orbitrap質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に接続されたUltimate 3000 HPLCで実施した。デコンボリューションデータはMagTranソフトウェアによって変換された。
トラスツズマブＭ６Ｐグリコフォーム３の合成。脱グリコシル化トラスツズマブ（２）（２．１ｍｇ）及びオキサゾリン１（２２０μｇ、反応部位あたり１０当量）の溶液を、Ｅｎｄｏ Ｓ２－Ｄ１８４Ｍ（２．１μｇ）とともに１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２）２１０μＬ中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによってモニタリングした。２時間以内に、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析により、トランスグリコシル化の完了が示された。生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、３（２．０ｍｇ、９５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４７４０３Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４７４０６（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後のＦｃモノマーの計算値、Ｍ＝２４９０３Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４９０４（デコンボリューションデータ）。
トラスツズマブＭ６Ｐグリコフォーム６の合成。脱グリコシル化トラスツズマブ（２）（３００μｇ）及びオキサゾリン４（７０μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、Ｅｎｄｏ Ｓ２－Ｄ１８４Ｍ（１５μｇ）とともに１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２）１５μＬ中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによってモニタリングした。１時間後、さらにオキサゾリン４（３５μｇ、反応部位あたり１０当量）を加え、反応をさらに３０分間行い、そこでＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳはトランスグリコシル化の完了を示した。生成物をプロテインＡカラムで精製して、６（２８５μｇ、９５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４７５６３Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４７５６４（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後のＦｃモノマーの計算値、Ｍ＝２４９８３Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４９８４（デコンボリューションデータ）。
トラスツズマブＭ６Ｐグリコフォーム７の合成。脱グリコシル化トラスツズマブ（２）（３００μｇ）及びオキサゾリン５（１１０μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、Ｅｎｄｏ Ｓ２－Ｄ１８４Ｍ（１５μｇ）とともに１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２）１５μＬ中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによってモニタリングした。１時間後、さらにオキサゾリン５（５５μｇ、反応部位あたり１０当量）を加え、反応をさらに３０分間実行し、そこでＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳはトランスグリコシル化反応の完了を示した。生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、７（２７０μｇ、９０％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ：全抗体について計算、Ｍ＝１４８５３５Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、１４８５３７（デコンボリューションデータ）；ＩｄｅＳ消化後のＦｃモノマーの計算値、Ｍ＝２５４７０Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２５４７０（デコンボリューションデータ）。
セツキシマブＭ６Ｐグリコフォーム９の合成。脱グリコシル化セツキシマブ（８）（２．１ｍｇ）及びＭ６Ｐ四糖オキサゾリン（１）（２２０μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、Ｅｎｄｏ Ｓ２－Ｄ１８４Ｍ（３．０μｇ）とともに１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２）２１０μＬ中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによってモニタリングした。反応は２時間後に完了し、生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、９（１．９ｍｇ、９０％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ、ＩｄｅＳ消化後のＦｃモノマーについて計算、Ｍ＝２４９０３Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２４９０４（デコンボリューションデータ）。
セツキシマブＭ６Ｐグリコフォーム１０の合成。脱グリコシル化セツキシマブ（cutuximab）（８）（３００μｇ）及びグリカンオキサゾリン（５）（１１０μｇ、反応部位あたり２０当量）の溶液を、Ｅｎｄｏ Ｓ２－Ｄ１８４Ｍ（１５μｇ）とともに１５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２）１５μＬ中、２５℃でインキュベートし、反応はアリコートのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによってモニタリングした。１時間後、さらにオキサゾリン５（５５μｇ、反応部位あたり１０当量）を加え、混合物をさらに３０分間インキュベートし、そこでＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳは反応の完了を示した。生成物を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、１０（２７０μｇ、９０％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ：ＩｄｅＳ消化後のＦｃモノマーについて計算、Ｍ＝２５４７０Ｄａ；測定値（ｍ／ｚ）、２５４７０（デコンボリューションデータ）。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定。ＳＰＲ実験は、Biacore T200装置（GE Healthcare）で実施した。組換えヒトＩＧＦ－ＩＩ Ｒ（ＣＩ－ＭＰＲ）はR&D Systemsから購入した。メーカーが提供するアミンカップリングキットを使用して、およそ６０００レゾナンスユニット（ＲＵ）のＣＩ－ＭＰＲを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０）中、２５℃でＣＭ５センサーチップ上に固定化した。Ｍ６Ｐ修飾抗体は、２５℃、流速１０μＬ／ｍｉｎで測定した。ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）をサンプル緩衝液及び泳動緩衝液として使用した。同じ流速（１０μＬ／分）で会合を３分間測定し、解離を１０分間測定した。表面再生は、２Ｍ ＭｇＣｌ２により流速１０μＬ／分で６０秒間実施された。抗体分析物を、最高濃度５００ｎＭの２倍段階希釈で固定化チップ上に流した。動態解析は、BIAcore T200評価ソフトウェアを使用して、結合データを１：１ラングミュア結合モデルにグローバルフィッティングすることによって実施した。
ウエスタンブロット。ＢＴ４７４（ATCC（登録商標）HTB-20（商標））又はＨｅｐＧ２（ATCC（登録商標）HB-8065（商標））細胞を、最終濃度１０ｎＭの天然抗体又はＭ６Ｐ修飾抗体で処理し、Laemmliサンプルバッファー中の全細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングに供した。この研究で使用された一次抗体は、ＥＧＦＲ（Cell signaling technology）、ＨＥＲ２（Cell signaling technology）、及びベータアクチン（Life technology）に対するものであった。この研究では、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギＩｇＧを二次抗体として使用した。特異的反応は化学発光基質で検出され、信号はChemiDoc MP Imaging System（Bio-Rad）を使用してデジタル記録された。相対バンド強度は、ImageJソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して計算された。
フローサイトメトリー。標的細胞表面上のＨＥＲ２又はＥＧＦＲの発現をフローサイトメトリーで検査した。ＢＴ４７４又はＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いでＰＢＳで洗浄し、細胞を、ＰＢＳ中、４℃で３０分間、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ３４０（ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ２）抗体（BioLegend）又はＰＥコンジュゲート抗ヒトＥＧＦＲ（BioLegend）又はＰＥコンジュゲートアイソタイプ対照抗体で染色した。染色後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで２．５％ホルマリンで固定した。FACSCanto IIセルソーター（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリーを実施し、FlowJoソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを分析した。
以下に列挙され、本明細書で参照される文書は、本明細書の明示的な開示と矛盾する記述、主題の否定又は否認を除き、また、組み込まれた資料が本明細書の明示的な開示と一致しない場合を除き（その場合、この開示の文言が優先される）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の参照による組み込みは、組み込まれた材料が本開示に対する先行技術であることを出願人が認めたものとはみなされず、またいかなる文書も本開示の特許性にとって問題となるとはみなされない。
配列表
アミノ酸配列：
Ｅｎｄｏ－Ｓ２野生型
Ｅｎｄｏ－Ｓ野生型
Ｅｎｄｏ－Ｆ３野生型
Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４及び変異体（Ｄ１８４Ｍ、Ｄ１８４Ｅ、Ｄ１８４Ｃ、Ｄ１８４Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｎ、Ｄ１８４Ｑ、Ｄ１８４Ｓ、Ｄ１８４Ｔ）
Ｅｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ａ、Ｄ２３３Ｑ、Ｄ２３３Ｍ変異体
Ｅｎｄｏ－Ｆ３ Ｄ１６５Ａ変異体
●シグナルペプチドは灰色でマークされている。
ＥｎｄｏＳ２（３７～８１９）
Figure 2024514683000010
Ｅｎｄｏ－Ｓ配列：（３７～９９５）
Figure 2024514683000011
Ｅｎｄｏ－Ｆ３配列：（４０～３２９）
Figure 2024514683000012
ＥｎｄｏＳ２変異配列：Ｄ１８４Ａ（Ｘ＝Ａ）；Ｄ１８４Ｃ（Ｘ＝Ｃ）；Ｄ１８４Ｅ（Ｘ＝Ｅ）；
Ｄ１８４Ｇ（Ｘ＝Ｇ）；Ｄ１８４Ｍ（Ｘ＝Ｍ）；Ｄ１８４Ｎ（Ｘ＝Ｎ）；Ｄ１８４Ｑ（Ｘ＝Ｑ）
Ｄ１８４Ｓ（Ｘ＝Ｓ）；Ｄ１８４Ｔ（Ｘ＝Ｔ）
Figure 2024514683000013
Ｅｎｄｏ－Ｓ変異配列：Ｄ２３３Ａ（Ｘ＝Ａ）；Ｄ２３３Ｑ（Ｘ＝Ｑ）；Ｄ２３３Ｍ（Ｘ＝Ｍ）
Figure 2024514683000014
Figure 2024514683000015
Figure 2024514683000016
Ｅｎｄｏ－Ｆ３変異配列：Ｅｎｄｏ－Ｆ３ Ｄ１６５Ａ
Figure 2024514683000017

Claims (44)

  1. 脱グリコシル化及びトランスグリコシル化の両方に単一の酵素を使用してアジドタグ付き抗体を提供するワンポットＦｃグリカンリモデリング法であって、
    （ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供するステップ；
    （ｂ）脱グリコシル化活性及びトランスグリコシル化活性の両方を有する単一のエンドグリコシダーゼ、又はその変異体を導入するステップ；
    （ｃ）前記単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供するステップ；
    （ｄ）二糖コアを含むアジド修飾グリカンオキサゾリンを提供するステップ；並びに
    （ｅ）前記単一のエンドグリコシダーゼにより前記アジド修飾グリカンオキサゾリンを前記Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、前記アジドタグ付き抗体を提供するステップ
    を含む、方法。
  2. 脱グリコシル化及びトランスグリコシル化反応に２つの異なる酵素を使用するワンポットＦｃグリカンリモデリング法であって、
    （ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供するステップ；
    （ｂ）脱グリコシル化活性を有する第１のエンドグリコシダーゼ、又はその変異体を導入するステップ；
    （ｃ）前記エンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供するステップ；
    （ｄ）トランスグリコシル化活性を有する第２のエンドグリコシダーゼと、二糖コアを含むアジド修飾グリカンオキサゾリンとを提供するステップ；並びに
    （ｅ）前記第２のエンドグリコシダーゼにより前記アジド修飾グリカンオキサゾリンを前記Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、アジドタグ付き抗体を提供するステップであって、前記アジドタグ付き抗体が、前記第１及び第２のエンドグリコシダーゼによる加水分解に耐性がある、ステップ
    を含む、方法。
  3. 前記アジド修飾グリカンオキサゾリンが、図４のグループＩ Ｍａｎβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースの二糖から選択される、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  4. 前記アジド修飾グリカンオキサゾリンが、図５のグループＩＩ Ｇｌｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースの二糖から選択される、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  5. 前記アジド修飾グリカンオキサゾリンが、図６のグループＩＩＩ Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃベースの二糖から選択される、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  6. 前記エンドグリコシダーゼが、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２、野生型Ｅｎｄｏ Ｆ３、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  7. 前記野生型エンドグリコシダーゼの使用が、アジドタグ付きグリカンオキサゾリンによるトランスグリコシル化のために、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、及びＥｎｄｏ－Ｆ３の別の変異型エンドグリコシダーゼと組み合わせられる、請求項２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  8. 前記エンドグリコシダーゼが、親和性融合ペプチド又はタンパク質ドメインを含む、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  9. 前記親和性融合ペプチド又はタンパク質ドメインが、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、セルロース結合モチーフ（ＣＢＭ）、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、システインプロテアーゼドメイン（ＣＰＤ）又はＨｉｓタグからなる群から選択される、請求項８に記載のワンポット法。
  10. 前記アジド修飾グリカンオキサゾリンが、オリゴエチレンスペーサーをさらに含む、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  11. 前記スペーサーが、ポリエチレン（ＰＥＧ）リンカーを含む、請求項１０に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  12. 前記アジド修飾グリカンオキサゾリンが、二糖コアと、前記二糖コアに結合してデンドリマーを形成する複数の分子リンカーとを含む、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  13. 前記アジドタグ付き抗体が、α－Ｇａｌ、ラムノース（Ｒｈａ）、又はマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）をさらに含む、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  14. 前記アジドタグ付き抗体が、他のリガンドとのクリックコンジュゲーションによりさらに修飾されて、抗体コンジュゲートを提供する、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  15. 前記抗体コンジュゲートが、１つ以上の薬物、毒素、検出可能な標識、グリカンリガンド、タンパク質、小分子、チオ標識、ビオチン標識、及び蛍光標識からなる群から選択されるリガンドを含む、請求項１４に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  16. 前記クリック可能なグリカンリガンドが、１つ以上の高親和性Ｍ６Ｐオリゴ糖リガンド、トリ－ＧａｌＮＡｃ又はアシアロ糖タンパク質受容体に対する関連高親和性リガンド、天然循環抗体に結合するためのラムノース又はアルファ－Ｇａｌ部分、及びシグレック又は他のグリカン結合タンパク質に結合するための高親和性グリカンリガンドからなる群から選択される、請求項１４に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  17. 前記抗体が癌細胞に結合し、前記リガンドが細胞毒素である、請求項１６に記載のワンポット化学酵素リモデリング。
  18. 前記アジドタグ付き抗体が、クリックケミストリー反応による他のリガンドとのコンジュゲーションによりさらに修飾される、請求項１又は２に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  19. 治療剤を送達するための送達デバイスであって、前記送達デバイスが、請求項１又は２に記載のアジドタグ付き抗体を含み、治療剤が周辺アジド末端の少なくとも１つに結合している、送達デバイス。
  20. 前記治療剤が、抗生物質、鎮痛剤、抗体；抗癌剤、抗ウイルス剤、金属キレート、タンパク質、ホルモン、及び核酸からなる群から選択される、請求項１９に記載の送達デバイス。
  21. 治療剤又は診断剤に結合された、請求項１又は２に記載のアジドタグ付き抗体に由来する抗体を含む、抗体－薬物コンジュゲート。
  22. 前記治療剤が、抗生物質、鎮痛剤、抗体；抗癌剤、抗ウイルス剤、金属キレート、タンパク質、ホルモン、及び核酸からなる群から選択される、請求項２１に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  23. 請求項２１に記載の抗体－薬物コンジュゲートの投与を含む、病気、疾患、又は障害に罹患している対象を処置する方法。
  24. 前記病気、疾患、又は障害が癌である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記病気、疾患、又は障害が感染性疾患である、請求項２３に記載の方法。
  26. 請求項２１に記載の抗体－薬物コンジュゲートを含む、キット。
  27. Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供するためのワンポット化学酵素リモデリング法であって、前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体が、リソソーム媒介分解を標的とし、ワンポットでの脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応の両方のための単一のエンドグリコシダーゼを含み、前記方法が、
    （ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供すること；
    （ｂ）脱グリコシル化能及びトランスグリコシル化能の両方を有する単一のエンドグリコシダーゼを導入すること；
    （ｃ）前記単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供すること；
    （ｄ）Ｍ６Ｐ－グリカンオキサゾリンを提供すること；並びに
    （ｅ）前記単一のエンドグリコシダーゼにより前記Ｍ６Ｐ－グリカンオキサゾリンを前記Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供すること
    を含む、方法。
  28. Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供するためのワンポット化学酵素リモデリング法であって、前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体が、リソソーム媒介分解を標的とし、ワンポットでの脱グリコシル化反応及びトランスグリコシル化反応のための２つの異なるエンドグリコシダーゼを含み、前記方法が、
    （ａ）単一の反応器、容器、カラム、又はポットを提供すること；
    （ｂ）脱グリコシル化能を有する第１のエンドグリコシダーゼを導入すること；
    （ｃ）前記単一のエンドグリコシダーゼによる脱グリコシル化のための抗体を導入し、それにより少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体を含有する脱グリコシル化中間体を提供すること；
    （ｄ）第２のエンドグリコシダーゼ及びＭ６Ｐ－グリカンオキサゾリンを提供すること；並びに
    （ｅ）前記第２のエンドグリコシダーゼにより前記Ｍ６Ｐ－グリカンオキサゾリンを前記Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）受容体にトランスグリコシル化して、前記Ｍ６Ｐタグ付き抗体を提供すること
    を含む、方法。
  29. 前記Ｍ６Ｐ－グリカンオキサゾリンが、式Ｉ：
    Figure 2024514683000018
    のオキサゾリンである、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 前記Ｍ６Ｐ－グリカンオキサゾリンが、図８のＭ６Ｐ－グリカンである、請求項２７又は２８に記載の方法。
  31. 前記エンドグリコシダーゼが、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２、野生型Ｅｎｄｏ Ｆ３、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  32. 前記野生型エンドグリコシダーゼの使用が、トランスグリコシル化のために、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、及びＥｎｄｏ－Ｆ３の別の変異型エンドグリコシダーゼと組み合わせられる、請求項３１に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  33. 前記エンドグリコシダーゼが、親和性融合ペプチド又はタンパク質ドメインを含む、請求項２７又は２８に記載のワンポット化学酵素リモデリング法。
  34. 前記親和性融合ペプチド又はタンパク質ドメインが、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、セルロース結合モチーフ（ＣＢＭ）、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、システインプロテアーゼドメイン（ＣＰＤ）又はＨｉｓタグからなる群から選択される、請求項３３に記載のワンポット法。
  35. 請求項２７又は２８に記載のＭ６Ｐタグ付き抗体を含む、送達デバイス。
  36. 請求項２７又は２８に記載の方法に従って得られたＭ６Ｐタグ付き抗体。
  37. 前記抗体が、リソソーム標的分解を標的とする、請求項３６に記載のＭ６Ｐタグ付き抗体。
  38. 前記抗体が、細胞外タンパク質への結合を標的とする、請求項３６に記載のＭ６Ｐタグ付き抗体。
  39. 前記抗体が、膜結合タンパク質への結合を標的とする、請求項３６に記載のＭ６Ｐタグ付き抗体。
  40. 前記膜結合タンパク質がＨＥＲ２である、請求項３９に記載のＭ６Ｐタグ付き抗体。
  41. 前記膜結合タンパク質がＥＧＦＲである、請求項３９に記載のＭ６Ｐタグ付き抗体。
  42. 請求項３７に記載のＭ６Ｐタグ付き抗体の投与を含む、病気、疾患、又は障害に罹患している対象を処置する方法。
  43. 前記病気、疾患、又は障害が感染性疾患である、請求項４２に記載の方法。
  44. 請求項３７に記載のＭ６Ｐタグ付き抗体を含む、キット。
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