TW202021620A

TW202021620A - 一種cd40抗體藥物組合物及其用途

Info

Publication number: TW202021620A
Application number: TW108143617A
Authority: TW
Inventors: 楊健健; 李皓; 劉洵; 蔣家驊
Original assignee: 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恒瑞醫藥有限公司
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-06-16
Also published as: AU2019388931A1; MX2021006360A; CA3121291A1; CN112839961A; WO2020108621A1; EP3939998A4; EP3939998A1; KR20210097750A; JP2022513671A; BR112021010414A2; CN112839961B

Abstract

本公開涉及一種CD40抗體藥物組合物及其用途。具體而言，本公開涉及的CD40抗體藥物組合物其包含在醋酸-醋酸鈉緩衝液中的CD40抗體或其抗原結合片段。除此之外，該藥物組合物還可含有糖、非離子型表面活性劑和其他輔料。本公開藥物組合物在儲存數月之後展現了良好的抗體穩定性。

Description

一種CD40抗體藥物組合物及其用途

本公開屬於藥物製劑領域，具體涉及一種包含CD40抗體及其抗原結合片段的藥物組合物，以及其作為藥物的用途。

本申請要求申請日為2018/11/30的中國專利申請201811448238.5的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。

CD40是細胞表面表達的糖蛋白之一，為分子量48kDa的I型膜內在糖蛋白，屬於腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，並在免疫系統中起重要作用。其表達在多種免疫細胞中，如B細胞、樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞等。當通過CD40發生訊號傳導時，專門的抗原呈現細胞會被激活。CD40的天然配體被命名為CD154或CD40L，已知主要表達在成熟T淋巴細胞中。CD40L介導訊號的傳導會觸發一些細胞生物事件，包括免疫細胞激活、增殖，以及細胞因子和趨化因子的產生。CD40訊號傳導對於T細胞依賴性免疫應答是非常重要的，尤其在腫瘤環境背景中，CD40刺激的樹突細胞能夠激活腫瘤特異性效應T細胞，該類T細胞具有根除腫瘤細胞的潛力。

CD40表達發生在包括B淋巴細胞在內的許多正常細胞和腫瘤細胞中。例如黑色素瘤即屬於具有CD40表達的腫瘤，而30%至70%的實體腫瘤也具有CD40表達。目前已知CD40的激活可有效觸發抗腫瘤反應（Tong 等人，Cancer Gene Therapy , 2003，10: 1-13），包括腫瘤特異性T細胞反應的免疫激活、對CD40陽性腫瘤直接的細胞凋亡作用，以及剌激導致ADCC的體液反應，且觀察到的腫瘤根除與腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的出現強烈相關。同時也不應被忽視的是，全身施用CD40抗體與副作用相關，如休克綜合症和細胞因子釋放綜合症（van Mierlo 等人，Proc.Nat1.Acad. Sci. USA , 2002, 99:5561-5566）。

目前有多家國際製藥公司在研發如上述針對CD40的單克隆抗體，它通過特異性刺激免疫激活，最大限度提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，從而達到對腫瘤細胞進行殺傷的目的。相關專利如CN1198647、CN1369015、CN1582165、CN100430419、CN101014386、CN101237882、CN101289510、CN101490086、CN103842382、CN104918957、WO2002028904、WO2011123489、WO2012149356、WO2013034904、WO2015091853、WO2016196314、WO2017040932、WO2017004006等。迄今為止，輝瑞（相關產品已許可給羅氏）、Alligator等公司的抗CD40抗體均在臨床前動物模型中觀測到了良好的腫瘤殺傷效果。

WO2018219327（PCT/CN2018/089252）提供有著高親和力，高選擇性，高生物活性的抗CD40抗體，用於通過刺激CD40抗體。

但是，抗體藥物其分子量大，結構複雜，容易降解、聚合或發生不希望發生的化學修飾等而變得不穩定。為了使抗體適合於給藥，並且在儲存及隨後使用過程中能保持穩定性，發揮更好的效果，抗體藥物的穩定製劑研究顯得尤為重要。CD40抗體製劑相關專利如WO2005063289。對於新的CD40抗體，仍需要研製更適於給藥的包含CD40的藥物組合物（製劑）。

本公開提供一種藥物組合物，其包含CD40抗體或其抗原結合片段，以及緩衝液。在一些實施方案中，所述緩衝液選自醋酸鹽緩衝液或組氨酸緩衝液或磷酸鹽緩衝液或琥珀酸鹽緩衝液，優選醋酸鹽緩衝液，更優選醋酸-醋酸鈉緩衝液。

在可選的實施方案中，藥物組合物中所述CD40抗體或抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在可選的實施方案中，藥物組合物中所述CD40抗體或其抗原結合片段濃度為約1mg/ml至120mg/ml，可以約為1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、22mg/ml、24mg/ml、26mg/ml、28mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml、100mg/ml、105mg/ml、110mg/ml、115mg/ml、120 mg/ml或任意兩數值間任意值，優選10mg/ml至40mg/ml，最優選約為25mg/ml。

在可選的實施方案中，緩衝液的濃度約為5mM至30mM，優選約為10mM至20mM，非限制性實施例包括10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM或任意兩數值間任意值，最優選約為10mM。

在可選的實施方案中，藥物組合物中所述緩衝液的pH值約為4.5至6.5，優選約為5.0至6.0，在非限制性實施例中還可選約為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0或任意兩數值間任意值，最優選約為5.0或者5.5。

在可選的實施方案中，藥物組合物還包含糖。本公開的“糖”包含常規組合物 (CH₂ O)_n 及其衍生物，包括單糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、還原性糖、非還原性糖等。可選自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、***糖醇、Xyliyol、山梨糖醇、甘露醇、蜜二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水蘇糖、乳果糖、麥芽酮糖、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異-麥芽酮糖等。優選的糖為非還原性二糖，更優選海藻糖或蔗糖。

在可選的實施方案中，藥物組合物中糖的濃度約為40mg/ml至95mg/ml（例如55mg/ml），優選約為60mg/ml至90mg/ml，非限制性實施例包括60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75 mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml或任意兩數值間任意值，更優選約為80mg/ml。

在可選的實施方案中，藥物組合物還包含表面活性劑。可選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖苷鈉、月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、硬脂基-肌胺酸、亞油基-、肉豆蔻基-、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-、柯卡醯胺基丙基-、亞油醯胺基丙基-、肉豆蔻醯胺基丙基-、棕櫚醯胺基丙基-、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-、棕櫚醯胺基丙基-、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯與丙烯二醇的共聚物等等。優選的表面活性劑為聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，更優選聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，藥物組合物中表面活性劑的濃度約為0.02mg/ml至0.8mg/ml（例如0.1mg/ml），優選約為0.3mg/ml至0.6mg/ml，非限制性實施例包括0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml或任意兩數值間任意值，更優選約為0.4mg/ml。

在可選的實施方案中，所述藥物組合物包含： (a) 1至120mg/ml的CD40抗體或其抗原結合片段，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3， (b) 5至30mM的醋酸鹽緩衝液。

在可選的實施方案中，所述藥物組合物包含： (a) 1至120mg/ml的CD40抗體或其抗原結合片段，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3， (b) 5至30mM的醋酸鹽緩衝液，(c) 40至90mg/ml的蔗糖， (d) 0.02至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，優選所述藥物組合物的pH為4.5至6.5，更優選5.0至6.0，進一步優選5.5。

在可選的實施方案中，所述藥物組合物包含： (a) 1至120mg/ml的CD40抗體或其抗原結合片段，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3， (b) 5至30mM的醋酸鹽緩衝液， (c) 40至95mg/ml的海藻糖， (d) 0.02至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，優選所述藥物組合物的pH約為4.5至6.5，更優選約為5.0至6.0，進一步優選5.5。

一種藥物組合物，其包含 (a) 1至120mg/ml的CD40抗體或其抗原結合片段，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和 (b)10至20mM的醋酸鹽緩衝液，且所述藥物組合物的pH為5.0至5.5。

在可選的實施方案中，所述藥物組合物包含： (a) 10mg/ml至40mg/ml的CD40抗體或其抗原結合片段，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3， (b) 10至20mM的醋酸鹽緩衝液， (c) 60至90mg/ml的蔗糖， (d) 0.3至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，優選所述藥物組合物的pH為5.0至6.0。

在可選的實施方案中，所述藥物組合物包含： (a) 25mg/ml的CD40抗體或其抗原結合片段，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3， (b) 10至20mM的醋酸-醋酸鈉緩衝液， (c) 60至90mg/ml的蔗糖， (d) 0.3至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，優選所述藥物組合物的pH為5.0至6.0。

在具體實施方案中，所述的藥物組合物包含： 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH5.5； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH5.8； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH6.0； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH5.6； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH5.8； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH6.0； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-醋酸緩衝液，pH5.0； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-醋酸緩衝液，pH5.5； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-醋酸緩衝液，pH6.0； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-醋酸緩衝液，pH5.0； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-醋酸緩衝液，pH5.5； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM組胺酸-醋酸緩衝液，pH5.8； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-醋酸緩衝液，pH6.0； 25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH5.5；或者，25mg/ml CD40抗體、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH5.5；上述具體實施方案中所述CD40抗體具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些實施方案中，本公開所述CD40抗體或其抗原結合片段具有如SEQ ID NO: 1所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO: 2所示的輕鏈可變區。

QVQLQQPGADLVKPGASVKMSCKASGYILTTYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGSGSTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLTRLSSEDSAVYYCARRDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO：1）

DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGESPKLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASLVPWTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO：2）

在可選的實施方案中，藥物組合物中所述抗體或抗原結合片段可選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，優選人源化抗體。

在可選實施方案中，藥物組合物中所述的人源化CD40抗體輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR區序列分別來源於人種系輕鏈和重鏈或其突變序列。

進一步地，所述人源化CD40抗體重鏈序列為如SEQ ID NO: 17所示的序列或其變體，所述變體優選在重鏈可變區有0-10的胺基酸變化，更優選為胺基酸位點在6和8的突變，突變後的胺基酸優選為I、A或L；所述人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO: 18所示的序列或其變體，所述的變體優選在輕鏈可變區有0-10的胺基酸變化，更優選為胺基酸位點在2和3的突變，突變後的胺基酸優選為I、V或L。

在可選實施方案中，所述人源化CD40抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區，優選包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈FR區，更優選包含人源IgG1或IgG2重鏈FR區。

在可選的實施方案中，藥物組合物中所述CD40抗體的輕鏈與hu9E5抗體輕鏈胺基酸序列具有至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性，所述CD40抗體的重鏈胺基酸序列與hu9E5抗體重鏈具有至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性，所述hu9E5抗體輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示，hu9E5抗體重鏈序列如SEQ ID NO：17所示。

hu9E5 HC： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：17）

hu9E5 LC： DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO：18）

本公開所述藥物組合物已具有足夠成藥穩定性，可以長期穩定放置。另一方面，為便於藥品運輸的方便，本公開藥物組合物可以進一步的做成凍乾製劑。

本公開還提供一種製備含CD40抗體的凍乾製劑的方法，其中包括將前述藥物組合物經冷凍乾燥的步驟。

在可選的實施方案中，製備含CD40抗體的凍乾製劑的方法中所述冷凍乾燥依次包括預凍、一次乾燥和二次乾燥的步驟。

本公開還提供一種經前述製備含CD40抗體的凍乾製劑的方法製備所得含CD40抗體的凍乾製劑。

在一些實施方案中，該凍乾製劑於2-8℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。

在一些實施方案中，該凍乾製劑於25℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。

在一些實施方案中，該凍乾製劑於40℃穩定至少7天，至少14天或至少28天。

本公開還提供製備含有CD40抗體的凍乾製劑的複溶溶液的方法，其中包括將前述凍乾製劑經複溶的步驟，其複溶所用溶液選自但不限於注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液。

本公開還提供一種經前述含有CD40抗體的凍乾製劑的複溶溶液的方法製備所得含有CD40抗體的凍乾製劑的複溶溶液。

本公開進一步提供一種製品或試劑盒，其包含裝有本文所述任何穩定的藥物組合物的容器。在一些實施方案中，該玻璃瓶為中性硼矽玻璃管制注射劑瓶。

本公開還提供前述的藥物組合物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液在製備用於治療治療CD40相關的疾病或病症的藥物中的用途，其中所述的疾病或病症優選癌症，所述的癌症選自淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、食管癌、子宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。

本公開還提供一種治療和預防CD40相關的疾病或病症的方法，包括給予所需患者治療有效量的前述的藥物組合物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液，其中所述的疾病或病症優選為癌症，所述的癌症最優選為淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、食管癌、子宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。

本公開還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有前述的藥物組合物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液。

要理解，可以組合本文所述各個實施方案的一項、一些或所有特性以形成本公開的其它實施方案。本公開的這些和其它方面對於本領域技術人員是顯而易見的。本公開的這些和其它實施方案通過下面的詳述進一步描述。

一、術語

為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

“緩衝液”指通過其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝液。將pH控制在適當範圍中的緩衝液的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝液。

“組胺酸緩衝液”是包含組胺酸離子的緩衝液。組胺酸緩衝液的實例包括組胺酸-鹽酸鹽，組胺酸-醋酸鹽，組胺酸-磷酸鹽，組胺酸-硫酸鹽等緩衝液，優選組胺酸-鹽酸鹽緩衝液。組胺酸-鹽酸鹽緩衝液是組胺酸與鹽酸或組胺酸與組胺酸鹽酸鹽配製而成。

“檸檬酸鹽緩衝液”是包括檸檬酸根離子的緩衝液。檸檬酸鹽緩衝液的實例包括檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鉀、檸檬酸-檸檬酸鈣、檸檬酸-檸檬酸鎂等。優選的檸檬酸鹽緩衝液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液。

“琥珀酸鹽緩衝液”是包括琥珀酸離子的緩衝液。琥珀酸鹽緩衝液的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。優選的琥珀酸鹽緩衝液為琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝液。

“磷酸鹽緩衝液”是包括磷酸離子的緩衝液。磷酸鹽緩衝液的實例包括磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鉀等。優選的磷酸鹽緩衝液為磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鈉緩衝液。

“醋酸鹽緩衝液”是包括醋酸根離子的緩衝液。醋酸鹽緩衝液的實例包括醋酸-醋酸鈉、醋酸-組胺酸鹽、醋酸-醋酸鉀、醋酸-醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。優選的醋酸鹽緩衝液為醋酸-醋酸鈉緩衝液。

“藥物組合物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。本文中，“藥物組合物”和“製劑”並不互相排斥。

本公開中所述藥物組合物的溶液形式，若無特殊說明，其中的溶劑均為水。

“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的藥物組合物或溶液製劑經過真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或藥物組合物。

本文所用術語“約”是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，所述數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

本公開所述的藥物組合物能夠達到一種穩定的效果：其中的抗體在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性，優選地，藥物組合物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於藥物組合物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。

穩定的藥物抗體製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、優選6個月、更優選1年，且甚至更優選地最多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃保存包括1個月、3個月、6個月或在40℃保存1個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的可接受的標準如下：通過SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、優選不超過約5%的抗體單體發生降解。通過視覺分析，藥物抗體製劑是無色的，或澄清至稍微乳白色。所述製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、優選不超過約5%的截短，通常形成不超過約10%、優選不超過約5%的聚集。

如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者通過UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射（DLS）測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼所述抗體在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變化可以通過螢光光譜法（其確定蛋白三級結構）和通過FTIR光譜法（其確定蛋白二級結構）來評價。

如果抗體沒有顯示出顯著的化學改變，那麼所述抗體在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。通過檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(通過諸如尺寸排阻色譜法和SDS-PAGE等方法來評價)、氧化(通過諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(通過諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(通過測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。

如果抗體在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼所述抗體在藥物製劑中“保留它的生物活性”。抗體的生物活性可以例如通過抗原結合測定來確定。

術語“CD40”是指為TNF受體超家族成員的細胞表面受體，又稱為TNFRSF5。CD40普遍表達於樹突細胞、B細胞和巨噬細胞表面，是產生和維持T細胞免疫所需的分子。術語“CD40”包括由細胞天然表達的CD40的任何變體或同種型。本發明的抗體可與得自非人物種的CD40交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人CD40特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。CD40或其任何變體或同種型可從天然表達它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術通過重組技術產生。優選地，抗CD40抗體靶向具有正常糖基化模式的人源CD40。

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J. biol. chem, 243, p3558 (1968)中所述。

本公開所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。

在本公開中，本公開所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本公開中，本公開所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區（Fv區）；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區（HVR）和4個序列相對保守的骨架區（FR）。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區（CDR）。每條輕鏈可變區（LCVR）和重鏈可變區（HCVR）由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公開所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則（LCDR1-3，HCDR2-3），或者符合kabat和chothia的編號規則（HCDR1）。

本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，優選人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的對人CD40的單克隆抗體。製備時用CD40抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。

術語“嵌合抗體（chimeric antibody）”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中克隆可變區基因，再根據需要克隆人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後***人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個優選的實施方案中，所述的CD40嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。所述的CD40嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。

術語“人源化抗體（humanized antibody）”，也稱為CDR移植抗體（CDR-grafted antibody），是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫（在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得），以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。

本公開中術語“與CD40結合”，指能與人CD40相互作用。

術語“特異性結合”指如通過本領域可用的技術，例如競爭ELISA、BIACORE^® 測定或KINEXA^® 測定所測定的。該術語還適用於當例如本公開抗體的抗原結合結構域對許多抗原攜帶的特定表位特異的情況，在該情況下攜帶抗原結合結構域的抗體能夠特異性結合攜帶該表位的多種抗原。

本公開中所述的“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab‘片段，F（ab’）2片段，以及與人CD40結合的scFv片段及其他利用了能與人CD40結合的抗體的VH和VL區形成的可結合人CD40的片段；其包含本公開所述抗體的選自SEQ ID NO: 7、13、9、10、11和12中的一個或多個CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體（single chain antibody）或單鏈Fv（sFv）。

術語“表位”指在一個或更多個抗體的抗原結合區中能夠被抗體識別並結合的分子部分。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等）的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性（參見例如Watson等（1987）Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁，（第4版））。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。

胺基酸序列“同一性”或“同源性”是指兩個蛋白或多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同胺基酸殘基佔據時，例如如果兩個多肽的一個位置都被同一個胺基酸殘基佔據時，那麼所述分子在該位置是一致的。適於確定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的實例是BLAST和BLAST2.0算法，它們分別描述於Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 和 Altschul et al.(1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 。用於執行BLAST分析的軟件可在美國國家生物技術資訊中心公開獲取（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以通過比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以克隆並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。通過表達與人CD40特異性結合的抗體得到穩定的克隆。陽性的克隆在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指通過試劑、診斷、結合組合物或通過另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種結合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量（也稱作“治療有效量”）可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。通過醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案（例如治療方法或製品）在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗（H檢驗）、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“Tm值”是指蛋白質熱變性溫度，即一半蛋白去折疊時的溫度，此時蛋白的空間結構被破壞，所以Tm值越高，蛋白熱穩定性越高。

二、實施例與測試例

通過以下實施例進一步詳細說明本公開。這些實施例僅用於說明性目的，而並不用於限制本公開的範圍。

本公開實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

本申請中CD40抗原及抗體的製備、純化方法已在申請號為WO2018219327專利文件中記載，前述申請文件的全部內容均可引入本公開。

實施例1.免疫抗原、篩選抗原的序列及製備

帶his標簽的人CD40 (h-CD40-his)重組蛋白、帶Fc標簽的人CD40 (h-CD40-Fc)重組蛋白、帶his標簽的小鼠CD40 (m-CD40-his)重組蛋白和帶his標簽的恆河猴CD40 (rhesus-CD40-his)重組蛋白（#CD0-C52H7）均為購買自Acrobiosystems公司的純化商業蛋白實際，其各自的序列來源見表1。蛋白可用於下述各實施例實驗中。表1：重組蛋白胺基酸序列來源

實施例2.抗體雜交瘤的製備

抗人CD40單克隆抗體通過免疫小鼠產生。實驗用C57BL/6小鼠，雌性，6~8周齡[昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司，動物生產許可證號：201503259]。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1周，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60 %。將已適應環境的小鼠分成2籠，每籠5只。

免疫抗原為帶Fc標簽的人修飾過的CD40重組蛋白（h-CD40-Fc，用磷酸鹽緩衝液配製成1μg/μl）。用弗氏佐劑（Sigma，Lot No.：F5881/F5506）乳化：首次用弗氏完全佐劑(CFA)，其餘加強免疫用核酸類佐劑（CpG, Sangon Biotech）和注射用鋁（Imject Alum，Thermo，Lot No.：PH203866）。免疫注射時間為第0、14、28、42、56、70天。於第21，35，49，63，77天采血進行血檢，用ELISA方法檢測小鼠血清，確定小鼠血清中的抗體滴度。

在第4次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合，融合前3天加強免疫，腹膜內（IP）注射10 μg/只的磷酸鹽緩衝液配製的抗原溶液。採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞（ATCC® CRL-8287™）進行融合得到雜交瘤細胞，選出體外活性好的單克隆雜交瘤細胞株。

實施例3.抗CD40抗體的克隆與定序

取以上篩選鑒定出的抗體的雜交瘤亞克隆，收集對數生長期雜交瘤細胞，用Trizol（Invitrogen, 15596-018）提取RNA（按照試劑盒說明書步驟），反轉錄（PrimeScript™ Reverse Transcriptase，Takara, cat # 2680A）。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set（Novagen, TB326 Rev.B 0503）進行PCR擴增後送測序公司測序。最終得到鼠源抗體的序列。

9E5的重鏈和輕鏈可變區序列如下： 9E5 HCVR： QVQLQQPGADLVKPGASVKMSCKASGYILTTYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGSGSTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLTRLSSEDSAVYYCARRDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO：1） 9E5 LCVR： DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGESPKLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASLVPWTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO：2）其含有下表2中的CDR序列：表2

將獲得的可變區序列分別接上人的抗體IgG1恆定區序列，得到人-鼠嵌合的抗體序列，利用分子克隆技術，把嵌合抗體的序列***到pCP表達載體中（購自邁博斯生物公司）中，經過PCR後測序鑒定（該部分的分子克隆等分子生物學操作方法按常規操作條件進行，具體可以參照《分子克隆：實驗室手冊》），利用HEK293細胞表達系統，即可獲得人-鼠嵌合抗體9E5-C。對經過MabSelect SuRe (GE Lifesciences)親和力層析純化後的嵌合抗體進行各項體外活性檢測，數據見表3。表3：嵌合抗體的體外活性

實施例4.小鼠抗體人源化實驗

在所獲得的鼠源抗體9E5的VH/VLCDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與抗體Germline數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。其中人類種系輕鏈框架區來自人κ輕鏈基因，本發明抗體優選人種系輕鏈模版Vk2-28/JK4（9E5）。人類種系重鏈框架區來自人重鏈，本發明抗體優選人種系重鏈模版VH1-2/JH6（9E5），如下所示： 9E5優選人種系重鏈模版IGHV1-2（SEQ ID NO：9）: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR 9E5優選人種系輕鏈模板IGkV2-28（SEQ ID NO：10）： DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP

將鼠源抗體的CDR區移植到選擇的人源化模板上，替換人源化可變區，再與相應的人源IgG恆定區（優選重鏈為IgG1，輕鏈為κ）重組。然後以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，得到最終的人源化分子。

hu9E5-H1a（SEQ ID NO: 11）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS

hu9E5-H1b（SEQ ID NO:12）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS

hu9E5-H1c（SEQ ID NO:13）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS

hu9E5-L1a（SEQ ID NO: 14）： DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

hu9E5-L1b（SEQ ID NO: 15）： DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

hu9E5-L1c（SEQ ID NO: 16）： DVLMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

經由以上輕重鏈組合的表達測試和回復突變數量對比，選擇出最終的人源化hu9E5抗體分子（使用H1c重鏈和L1a輕鏈），其各自的完整輕重鏈序列如SEQ ID NO: 17-18所示。

實施例5.人源化抗體測試數據

本發明人源化抗體hu9E5與人，恆河猴CD40的結合活性、阻斷活性等，見表4。表4：人源化hu2H6和hu9E5抗體的體外活性

實施例6.抗CD40抗體對小鼠腫瘤生長的抑制

取正常人外周血，用密度梯度離心法分離健康人PBMC。用CD14⁺ microbeads試劑盒分選單核細胞，按照試劑盒所提供的protocol進行CD14⁺ 單核細胞的分離，即每10⁷ 個細胞加入20 μl Anti-CD14 microbeads，4℃孵育15分鐘。然後，將細胞加入磁柱中，洗三次後，收集磁柱中的細胞，即CD14⁺ 單核細胞。CD14⁺ 單核細胞中加入含10 ng/ml IL4和100 ng/ml GM-CSF的RPMI 1640培養液培養6天（培養方法為本領域常規方法），進行MoDC細胞的誘導培養，剩餘的細胞加入含IL-2 的RPMI 1640，培養後收集懸浮的細胞（培養方法以及收集細胞的方法均為本領域的常規方法），使用CD3⁺ microbeads試劑盒分選T細胞。六天后收集並分取MoDC細胞和 CD3⁺ T細胞，將他們與Raji細胞（上海生科院細胞庫，培養於含10% 胎牛血清的RPMI1640培養液中）按1 : 5 : 20的比例混合，接種於每只NOG小鼠（南京銀河生物，適應性飼養5天）皮下。實驗動物均飼養於恆溫恆濕的獨立通風盒內，飼養室溫度18.0-26.0 ℃，濕度40-70%，10-20次/小時換氣，晝夜明暗交替時間12h/12h。

實驗分為人IgG1抗體對照組，hu9E5和參照抗體G12，給藥劑量均為3 mg/kg。每組5只小鼠，每週一次，六周注射給藥，連續給藥3次。整個實驗過程中，用遊標卡尺每週測量2次腫瘤長徑和寬徑，腫瘤體積（mm³ ）= 0.5 ×（腫瘤長徑 × 腫瘤短徑² ）計算。相對腫瘤抑制率TGI（%）：TGI%=（1-T/C）× 100%。T/C % 為相對腫瘤增殖率，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和IgG1對照組在某一特定時間點的腫瘤體積（TV）或瘤重（TW）。

結果顯示，人源化的抗CD40抗體hu9E5相對IgG1對照均有非常顯著的抑瘤作用，給藥21天后腫瘤接近完全消除。

示例性抗體藥物組合物（製劑）製備工藝

第一步：CD40抗體（如hu9E5）與穩定製劑配製成含CD40抗體的製劑原液，經過濾後中控取樣檢測無菌。將原液過0.22μm PVDF濾芯，收集濾液。

第二步：調節裝量至1.1ml，將濾液灌裝於2ml西林瓶中，加塞，分別於灌裝開始、灌裝中間、灌裝結束時取樣中控檢測裝量差異。

第三步：開啟軋蓋機，加鋁蓋，進行軋蓋。

第四步：目檢，確認產品無裝量不準等缺陷。打印、粘貼西林瓶標簽；打印紙盒標簽，折疊紙盒，裝盒，貼紙盒標簽。

實施例7. 抗CD40抗體製劑緩衝體系pH值的篩選

配製下列緩衝液，製備抗CD40抗體濃度為50mg/ml的抗體製劑，取樣品進行高溫(40℃)穩定性研究。 1）10mM 醋酸-醋酸鈉，pH5.0 2）10mM 醋酸-醋酸鈉，pH5.5 3）10mM 琥珀酸-琥珀酸鈉，pH5.0 4）10mM 琥珀酸-琥珀酸鈉，pH5.5 5）10mM 琥珀酸-琥珀酸鈉，pH6.0 6）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸，pH5.5 7）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸，pH6.0 8）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸，pH6.5 表5：抗CD40抗體pH值篩選結果

註：M表示月

結果表明：抗CD40抗體較適pH範圍為5.0~6.0，在此pH範圍3個緩衝體系SEC和CE的差別不大，ICE的變化在14.0%~24.1%區間內，相對pH6.5的緩衝體系（buffer）穩定。

實施例8. 抗CD40抗體製劑中表面活性劑種類的篩選

選擇10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5和10mM醋酸-醋酸鈉pH5.5的緩衝體系，製備含50mg/ml蛋白，75mg/ml蔗糖，不同表面活性劑種類的抗CD40抗體製劑，考察25℃的外觀穩定性： 1）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5，0.4mg/ml 聚山梨酯80； 2）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5，0.4mg/ml 聚山梨酯20； 3）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，0.4mg/ml 聚山梨酯80； 4）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，0.4mg/ml 聚山梨酯20；表6：抗CD40抗體表面活性劑種類篩選25℃穩定性結果

結果表明：表面活性劑種類優選聚山梨酯80。

實施例9. 抗CD40抗體製劑中表面活性劑濃度的篩選

選擇10mM醋酸-醋酸鈉pH5.5的緩衝體系，製備含50mg/ml蛋白，75mg/ml蔗糖，不同聚山梨酯80濃度的抗CD40抗體製劑： 1）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，0.1mg/ml 聚山梨酯80； 2）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，0.2mg/ml 聚山梨酯80； 3）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，0.4mg/ml 聚山梨酯80； 4）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，0.6mg/ml 聚山梨酯80； 5）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，0.8mg/ml 聚山梨酯80；取樣品用0.9%氯化鈉注射液分別稀釋到0.5mg/ml的蛋白濃度，不溶性微粒結果表明（見表3），當聚山梨酯80濃度在0.1mg/ml~0.8mg/ml時，抗CD40抗體蛋白與氯化鈉均有較好的相容性，說明上述聚山梨酯80濃度的穩定作用均較好；再將上述樣品置於振盪培養箱（25℃，300rpm）振搖5天，根據外觀結果，將聚山梨酯80的濃度選定為0.4~0.8mg/ml，優選為0.4mg/ml。表7：抗CD40抗體聚山梨酯80濃度篩選結果

實施例10. 抗CD40抗體製劑中糖濃度的篩選

選擇10mM醋酸-醋酸鈉pH5.5的緩衝體系，製備含50mg/ml蛋白，0.4mg/ml聚山梨酯80，不同蔗糖濃度的抗CD40抗體製劑： 1）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，55mg/ml 蔗糖； 2）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，65mg/ml 蔗糖； 3）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，70mg/ml 蔗糖； 4）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，75mg/ml 蔗糖； 5）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5，80mg/ml 蔗糖；各樣品滲透壓結果表明（見表8），蔗糖濃度為80mg/ml時製劑等滲。表8：抗CD40抗體不同蔗糖濃度滲透壓結果

實施例11. 抗CD40抗體不同緩衝體系穩定性

用下列緩衝體系，製備含50mg/ml蛋白，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80的抗CD40製劑，並考察25℃及2~8℃穩定性。 1）10mM醋酸-醋酸鈉 pH5.5 2）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5 3）10mM組胺酸-醋酸 pH5.5 表9：不同緩衝體系25℃穩定性結果

表10：不同緩衝體系2~8℃穩定性結果

結果表明：25℃ 6個月後，10mM醋酸-醋酸鈉的緩衝體系稍顯出優勢，10mM組胺酸-鹽酸組胺酸和10mM組胺酸-醋酸緩衝體系差異不明顯；2~8℃ 6個月後，三個體系的質量無明顯差異。

實施例12. 製劑蛋白濃度對穩定性影響

選擇10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5的緩衝體系，製備含80mg/ml蔗糖，0.4 mg/ml聚山梨酯80，蛋白濃度分別為50mg/ml、25mg/ml、1mg/ml的抗CD40抗體製劑，考察40℃高溫穩定性。 1）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5，蛋白濃度50mg/ml 2）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5，蛋白濃度25mg/ml 3）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5，蛋白濃度1mg/ml 表11：不同蛋白濃度樣品40℃高溫穩定性實驗結果

結果表明：製劑的蛋白濃度會對純度值產生影響，50mg/ml與25mg/ml的蛋白濃度對純度值影響不大，而1mg/ml蛋白濃度的製劑穩定性明顯較差。

實施例13. 製劑成分的綜合篩選

為了進一步對蛋白濃度、聚山梨酯80濃度、pH進行優化，運用JMP軟件進行DOE設計，應用RSM模型得到一系列處方（如下）。由於緩衝體系組胺酸-鹽酸組胺酸（His-HCl）和組胺酸-醋酸（His-AA）的穩定性數據沒有特別明顯的差別，而His-HCl的pH緩衝範圍是在5.5以上，故選擇His-AA為緩衝液做DOE篩選實驗。在10mM組胺酸-醋酸（His-AA）的緩衝體系中，製備不同蛋白濃度，不同聚山梨酯80濃度，含80mg/ml蔗糖的抗CD40抗體製劑，將樣品保存於40℃條件下進行穩定性分析：（1）0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.0，40mg/mlCD40 （2）0.2mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，10mg/mlCD40 （3）0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，25mg/mlCD40 （4）0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，25mg/mlCD40 （5）0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.0，10mg/mlCD40 （6）0.6mg/ml聚山梨酯80，pH6.0，40mg/mlCD40 （7）0.2mg/ml聚山梨酯80，pH5.0，25mg/mlCD40 （8）0.2mg/ml聚山梨酯80，pH6.0，40mg/mlCD40 （9）0.6mg/ml聚山梨酯80，pH5.0，25mg/mlCD40 （10）0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，40mg/mlCD40 （11）0.6mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，10mg/mlCD40 （12）0.4mg/ml聚山梨酯80，pH6.0，10mg/mlCD40 表12：DOE篩選40℃M1實驗結果

結果表明：pH值（5.0~6.0），聚山梨酯80（0.2~0.6mg/ml）和蛋白濃度（10~40mg/ml）對於穩定性數據的影響不是很大，所以處方的pH範圍為5.0~6.0，取中值5.5作為最終pH值，聚山梨酯80的濃度結合之前的篩選結果將0.4mg/ml作為最終濃度值，蛋白濃度定為25mg/ml。

實施例14. 抗CD40抗體不同緩衝體系凍乾穩定性

由於醋酸（鈉）緩衝體系在凍乾時可能由於揮發會導致複溶後pH值偏移，不宜作為凍乾製劑的緩衝體系。選擇10mM組胺酸-鹽酸組胺酸(His-HCl)pH5.5和10mM組胺酸-醋酸(His-AA) pH5.5兩種buffer，製備含50mg/ml蛋白，80mg/ml蔗糖和0.4mg/ml聚山梨酯80的抗CD40抗體製劑，灌裝量為1.2ml/瓶，凍乾工藝如下表13： 1）10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5 2）10mM組胺酸-醋酸 pH5.5 表13：凍乾工藝

凍乾製品餅狀良好，複溶後外觀澄清，pH和純度項也無明顯變化，說明該凍乾工藝良好。並放置25℃及2~8℃穩定性，結果表明：10mM組胺酸-鹽酸組胺酸 pH5.5和10mM組胺酸-醋酸 pH5.5均適合作為抗CD40抗體製劑的緩衝體系。表14：凍乾前後對比

表15：凍乾樣品25℃穩定性結果

表16：凍乾樣品2~8℃穩定性結果

實施例15. 其它可選擇製劑配方

此外，本發明還提供其它製劑配方的抗CD40抗體藥物製劑，包含但不限於：（1）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液 pH5.5；（2）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液 pH5.8；（3）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液 pH6.0；（4）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液 pH5.6；（5）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液 pH5.8；（6）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液 pH6.0；（7）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-醋酸緩衝液 pH5.0；（8）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-醋酸緩衝液 pH5.5；（9）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-醋酸緩衝液 pH6.0；（10）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-醋酸緩衝液 pH5.0；（11）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-醋酸緩衝液 pH5.5；（12）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-醋酸緩衝液 pH5.8；（13）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM組胺酸-醋酸緩衝液 pH6.0；（14）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液 pH5.5；（15）25mg/ml CD40抗體，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液 pH5.5；實驗結果表明，上述製劑配方的CD40抗體製劑均具有良好的穩定性，可應用於CD40抗體藥物的配製。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

無

Claims

一種藥物組合物，其包含CD40抗體或其抗原結合片段，以及緩衝液，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述緩衝液優選自醋酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液或琥珀酸鹽緩衝液，更優選醋酸鹽緩衝液，最優選醋酸-醋酸鈉緩衝液。
如請求項1所述的藥物組合物，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段濃度為1mg/ml至120mg/ml，優選10mg/ml至40mg/ml。
如請求項1或2所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物的pH為4.5至6.5，優選5.0至6.0。
如請求項1至3任一項所述的藥物組合物，其中所述緩衝液濃度為5mM至30mM，優選10mM至20mM。
如請求項1至4任一項所述的藥物組合物，其中還包括二糖，所述二糖選自海藻糖或蔗糖。
如請求項5所述的藥物組合物，其中所述糖濃度為40mg/ml至95mg/ml，優選60mg/ml至90 mg/ml。
如請求項1至6任一項所述的藥物組合物，其中還包括表面活性劑，所述表面活性劑為聚山梨醇酯，更優選聚山梨醇酯80。
如請求項7所述的藥物組合物，其中表面活性劑的濃度為0.02mg/ml至0.8mg/ml，優選0.3mg/ml至0.8mg/ml。
一種藥物組合物，其包含： (a) 1至120mg/ml的CD40抗體或其抗原結合片段，所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3， (b) 5至30mM的醋酸鹽緩衝液， (c) 40至90mg/ml的蔗糖， (d) 0.02至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，優選所述藥物組合物的pH為4.5至6.5，更優選5.0至6.0，進一步優選5.5。
一種藥物組合物，其包含 (a) 1至120mg/ml的CD40抗體或其抗原結合片段，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和 (b)10至20mM的醋酸鹽緩衝液，且所述藥物組合物的pH為5.0至5.5。
如請求項1-10任一項所述的藥物組合物，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段具有如SEQ ID NO: 1所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO: 2所示的輕鏈可變區。
如請求項11所述的藥物組合物，其中所述CD40抗體或其抗原結合片段為人源化抗體。
如請求項12所述的藥物組合物，其中所述的人源化抗體輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR區序列分別來源於人種系輕鏈和重鏈或其突變序列。
如請求項12或13所述的藥物組合物，其中所述人源化抗體重鏈序列為如SEQ ID NO: 17所示的序列或其變體，所述變體優選在重鏈可變區有0-10的胺基酸變化，更優選為胺基酸位點在6和8的突變，突變後的胺基酸優選為I、A或L；所述人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO: 18所示的序列或其變體，所述的變體優選在輕鏈可變區有0-10的胺基酸變化，更優選為胺基酸位點在2和3的突變，突變後的胺基酸優選為I、V或L。
如請求項12~14任一項所述的藥物組合物，其中所述人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區，優選包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈FR區，更優選包含人源IgG1或IgG2重鏈FR區。
如請求項1至10任一項所述的藥物組合物，其中所述CD40抗體的輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 18所示的序列具有至少90%的序列同一性，所述CD40抗體的重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 17所示的序列具有至少90%的序列同一性。
一種製備含CD40抗體的凍乾製劑的方法，其中包括將請求項1至16任一項所述的藥物組合物冷凍乾燥的步驟。
一種由請求項17所述的方法製備所得含CD40抗體的凍乾製劑。
一種請求項1至16任一項所述的藥物組合物或請求項18所述的凍乾製劑在製備用於治療CD40相關的疾病或病症的藥物中的用途，其中所述的疾病或病症優選癌症，所述的癌症選自淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、食管癌、子宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
一種製品，其包括容器，該容器中裝有請求項1至16任一項所述的藥物組合物或請求項18所述的凍乾製劑。