KR20240035835A

KR20240035835A - 항-angptl3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 조성물 및 이의 응용

Info

Publication number: KR20240035835A
Application number: KR1020247004874A
Authority: KR
Inventors: 시친 양; 링샤오 게; 홍웨이 왕
Original assignee: 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드; 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2024-03-18
Also published as: AU2022314036A1; WO2023001228A1; CA3225970A1; TW202320847A; CN117545769A

Abstract

항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 조성물 및 이의 응용이 제공된다. 구체적으로, 약학적 조성물은 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 아세트산 소듐 아세테이트 완충제를 포함한다. 약학적 조성물은 또한 당 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 우수한 항체 안정성을 갖는다.

Description

항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 조성물 및 이의 응용

본 출원은 2021년 7월 21일에 출원한 중국 특허 출원 제202110822526.8호의 우선권을 주장한다.

본 개시내용은 약학적 제제 분야에 관한 것으로, 특히 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다.

안지오포이에틴-유사 단백질 3(angiopoietin-like protein 3, ANGPTL3)은 분비되는 단백질이고, 안지오포이에틴-유사 단백질 계열의 일원으로서 간에서 주로 발현된다. ANGPTL3의 아미노-말단 코일 영역은 지질단백질 리파아제(lipoprotein lipase, LPL) 활성의 억제와 관련이 있으며, 트리글리세리드(triglyceride, TG)의 카르복시-말단 피브리노겐-유사 영역의 조절은 주로 혈관신생의 조절과 관련이 있다. 따라서, 단백질은 지질 대사를 조절하고 혈관신생을 촉진하는 기능을 갖는다.

ANGPTL3은 일차적으로 지질단백질 대사를 조절하는 역할을 하며, LPL 및 내피 리파아제(endothelial lipase, EL)의 억제에 의해 지질 대사를 조절하는 역할을 한다. 현재, ANGPTL3 억제제는 2개의 카테고리로 분류되며, 그 중 하나는 ANGPTL3-ASO이고, 다른 하나는 ANGPTL3 단일클론 항체, 예컨대 에비나쿠맙(evinacumab)이다. 이들의 작용 기전 및 부위는 상이하다 - ANGPTL3-ASO는 간세포에 주로 작용하는 반면, 에비나쿠맙은 혈액 순환에 효과가 있다. 하지만, ANGPTL3의 억제는 표현형적 수준이든 유전적 수준이든 간에 현저하고 안정한 지질 저하 효과를 갖는다. ANGPTL3을 표적으로 하는 IgG4 아형의 단일클론 항체는 ANGPTL3에 결합할 수 있고, ANGPTL3의 LPL에 대한 결합을 차단함으로써, ANGPTL3의 LPL 효소 활성의 억제를 제거하고 혈장에서 트리글리세리드 분해를 촉진하여, 고지혈증(hyperlipidemia)을 치료하는 목적을 달성할 수 있다.

WO2021147984A는 더 우수하고 지속적인 지질 저하 효과를 갖는 항-ANGPTL3 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 이의 큰 분자량 및 복잡한 구조로 인해, 항체 약물은 분해, 응집, 원치 않는 화학적 변형 등이 일어나기 쉬워 불안정해진다. 항체를 투여에 더 적합하게 만들고, 항체를 저장 및 후속 사용 동안 안정하게 유지하며, 항체가 더 나은 치료 효과를 생성하게 하는 항체 약물의 안정한 제제를 개발하는 것이 특히 중요하다. 따라서, 항-ANGPTL3 항체 및 이의 항원-결합 단편의 상대적으로 안정한 제제를 개발할 필요가 있다. 본 개시내용은 충분히 안정하며, 동결건조 형태가 우수하고, 투여에 더 적합한 항-ANGPTL3 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 개시내용은 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 완충제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 개시내용은 약학적 조성물을 이용한 질환의 치료 및 예방 방법, 및 이의 약학적 용도를 제공한다.

일부 구현예에서, 전술한 완충제는 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제, 포스페이트 완충제, 숙시네이트 완충제 및 시트르산 완충제 중 임의의 것, 예를 들어 아세테이트 완충제로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 전술한 완충제는 아세트산-소듐 아세테이트, 히스티딘-염산, 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, 숙신산-소듐 숙시네이트, 및 시트르산-소듐 시트레이트 완충제 중 임의의 것, 예를 들어 아세트산-소듐 아세테이트 완충제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고/거나, 경쇄 가변 영역은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. CDR은 카바트(Kabat), IMGT, 코티아(Chothia), AbM 또는 콘택(Contact) 넘버링 체계에 따라 정의한다. 일부 특정 구현예에서, CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 정의한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: 중쇄 가변 영역은 HCDR1로서, 이의 아미노산 서열은 서열번호 14에 제시된, HCDR1; HCDR2로서, 이의 아미노산 서열은 LINPRDDSTSYAQKFQG(서열번호 23)인, HCDR2; 및 HCDR3으로서, 이의 아미노산 서열은 서열번호 16에 제시된, HCDR3을 포함하고/거나; 경쇄 가변 영역은 LCDR1로서, 이의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGYTYLD(서열번호 24)인, LCDR1; LCDR2로서, 이의 아미노산 서열은 서열번호 12에 제시된, LCDR2; 및 LCDR3으로서, 이의 아미노산 서열은 서열번호 13에 제시된 LCDR3을 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: 중쇄 가변 영역은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고/거나 경쇄 가변 영역은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. CDR은 카바트, IMGT, 코티아, AbM 또는 콘택 넘버링 체계에 따라 정의한다. 일부 특정 구현예에서, CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 정의한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: 중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 각각 제시되고/거나; 경쇄 가변 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 각각 제시된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 완전 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 특정 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화 항체이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 인간화 ANGPTL3 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 중의 경쇄 및 중쇄 FR 서열은 인간 생식계열 경쇄 및 중쇄 FR 또는 이의 돌연변이된 서열로부터 각각 유래된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되거나 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖고/거나 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10에 제시되거나 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 17에 제시되거나 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 그 초과의 서열 동일성을 갖고/거나, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 18에 제시되거나 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 그 초과의 서열 동일성을 갖는다.

본 개시내용에서, "적어도 90% 및 그 초과의 서열 동일성"은 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 그 초과의 서열 동일성을 포괄한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10에 제시된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 17에 제시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 18에 제시된다.

일부 구현예에서, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 대안적인 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로부터 유래되고, 경쇄 불변 영역은 인간 κ 및 λ 쇄 불변 영역으로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 19에 제시되거나 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 그 초과의 서열 동일성을 갖고/거나, 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 20에 제시되거나 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 그 초과의 서열 동일성을 갖는다.

일부 구현예에서, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서: 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 21에 제시되거나 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 그 초과의 서열 동일성을 갖고/거나, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되거나 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 그 초과의 서열 동일성을 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 포함하고, 여기서: 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 21에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 항원-결합 단편은: Fab, F(ab')2, Fab', Fd, Fv, dsFv, scFv, Fab 및 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 완충제는 pH가 4.0 내지 7.0, 예를 들어 4.0 내지 6.9, 4.0 내지 6.8, 4.0 내지 6.7, 4.0 내지 6.6, 4.0 내지 6.5, 4.0 내지 6.4, 4.0 내지 6.3, 4.0 내지 6.2, 4.0 내지 6.1, 4.0 내지 6.0, 4.0 내지 5.9, 4.0 내지 5.8, 4.0 내지 5.7, 4.0 내지 5.6, 4.0 내지 5.5, 4.5 내지 6.5, 4.5 내지 6.0, 4.5 내지 5.5, 5.0 내지 7.0, 5.0 내지 6.5, 5.0 내지 6.0, 5.0 내지 5.5, 4.6 내지 6.6, 4.6 내지 6.5, 4.6 내지 6.4, 4.6 내지 6.3, 4.6 내지 6.2, 4.6 내지 6.1, 4.6 내지 6.0, 4.6 내지 5.9, 4.6 내지 5.8, 4.6 내지 5.7, 4.6 내지 5.6, 4.6 내지 5.5, 4.6 내지 5.4, 4.8 내지 6.6, 4.8 내지 6.5, 4.8 내지 6.4, 4.8 내지 6.3, 4.8 내지 6.2, 4.8 내지 6.1, 4.8 내지 6.0, 4.8 내지 5.9, 4.8 내지 5.8, 4.8 내지 5.7, 4.8 내지 5.6, 4.8 내지 5.5, 4.8 내지 5.4, 4.9 내지 5.4, 또는 5.0 내지 5.4이고; 일부 특정 구현예에서, 완충제는 pH가 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 또는 약 7.0, 예를 들어 약 5.2이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 완충제의 농도는 5 mM 내지 40 mM, 예를 들어 5 mM 내지 30 mM, 5 mM 내지 20 mM, 5 mM 내지 15 mM, 5 mM 내지 10 mM, 10 mM 내지 15 mM, 또는 8 mM 내지 12 mM이고; 일부 특정 구현예에서, 완충제의 농도는 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 18 mM, 또는 약 20 mM, 예를 들어 약 10 mM이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 10 mg/mL 내지 200 mg/mL, 예를 들어 50 mg/mL 내지 200 mg/mL, 50 mg/mL 내지 150 mg/mL, 60 mg/mL 내지 150 mg/mL, 60 mg/mL 내지 120 mg/mL, 80 mg/mL 내지 150 mg/mL, 80 mg/mL 내지 120 mg/mL, 90 mg/mL 내지 120 mg/mL, 또는 90 mg/mL 내지 110 mg/mL 이고; 일부 특정 구현예에서, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 10 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 95 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 105 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 115 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 190 mg/mL, 약 200 mg/mL, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 임의의 값, 예를 들어 약 100 mg/mL이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머, 트리톤(Triton), 소듐 도데실 술포네이트, 소듐 라우릴 술포네이트, 소듐 옥틸 글리코시드, 라우릴-술포베타인, 미리스틸-술포베타인, 리놀레일-술포베타인, 스테아릴-술포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일-사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우라미도 프로필-베타인, 코카라미드 프로필-베타인, 리놀레인아미드 프로필-베타인, 미리스틸아미드 프로필-베타인, 팔미트아미드 프로필-베타인, 이소스테아르아미드 프로필-베타인, 미리스틸아미드 프로필-디메틸아민, 팔미트아미드 프로필-디메틸아민, 이소스테아르아미드 프로필-디메틸아민, 소듐 메틸 코코일, 소듐 메틸 올레일 타우레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 예를 들어 폴리소르베이트 80이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 계면활성제의 농도는 0.05 mg/mL 내지 0.6 mg/mL, 예를 들어 0.1 mg/mL 내지 0.6 mg/mL, 0.1 mg/mL 내지 0.5 mg/mL, 또는 0.1 mg/mL 내지 0.4 mg/mL, 예를 들어 0.1 mg/mL 내지 0.3 mg/mL이고; 일부 특정 구현예에서, 약학적 조성물 중 계면활성제의 농도는 약 0.1 mg/mL, 약 0.15 mg/mL, 약 0.2 mg/mL, 약 0.25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 또는 약 0.6 mg/mL, 예를 들어 약 0.2 mg/mL이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 안정화제를 추가로 포함한다. 대안적인 구현예에서, 안정화제는 당 및 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적인 구현예에서, 당은 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당 알코올, 환원당, 비환원당 등을 포함하는 일반적인 조성물(CH₂O)_n 및 이의 유도체를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 당은 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 덱스트란, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실로스, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스, 스타키오스, 말토스, 락툴로스, 말툴로스, 글루시톨, 말티톨, 락티톨, 이소-말툴로스 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 당은 비-환원성 이당류, 예컨대 수크로스이다. 일부 특정 구현예에서, 아미노산은 글리신, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 중 당의 농도는 40 mg/mL 내지 110 mg/mL, 예를 들어 40 mg/mL 내지 95 mg/mL, 60 mg/mL 내지 90 mg/mL, 60 mg/mL 내지 80 mg/mL, 70 mg/mL 내지 90 mg/mL, 또는 70 mg/mL 내지 80 mg/mL이고; 일부 특정 구현예에서, 당의 농도는 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 임의의 값, 예를 들어 약 75 mg/mL이다.

본 개시내용은 약학적 조성물로서:

(a) 10 mg/mL 내지 200 mg/mL(예를 들어 약 50 mg/mL) 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및

(b) 약 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 완충제를 포함하는, 약학적 조성물을 제공하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 6.0 내지 6.6(예를 들어 약 6.0 또는 약 6.6)이다.

본 개시내용은 약학적 조성물로서:

(b) 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제를 포함하는, 약학적 조성물을 제공하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 4.6 내지 5.0(예를 들어 약 4.6 또는 약 5.0)이다.

본 개시내용은 약학적 조성물로서:

(a) 10 mg/mL 내지 200 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및

(b) 5 mM 내지 30 mM 아세테이트 완충제(예를 들어 아세트산-소듐 아세테이트 완충제)를 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은:

(a) 10 mg/mL 내지 200 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편,

(b) 5 mM 내지 30 mM 아세테이트 완충제(예를 들어 아세트산-소듐 아세테이트 완충제),

(c) 40 mg/mL 내지 90 mg/mL 당(예를 들어 수크로스), 및

(d) 0.05 mg/mL 내지 0.6 mg/mL 계면활성제(예를 들어 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20)를 포함하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 4.5 내지 6.5, 예를 들어 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.2이다.

본 개시내용은 약학적 조성물로서:

(b) 5 mM 내지 20 mM 아세테이트 완충제(예를 들어 아세트산-소듐 아세테이트 완충제)를 포함하는, 약학적 조성물을 제공하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 5.0 내지 5.5이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은:

(a) 50 mg/mL 내지 150 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편,

(b) 5 mM 내지 15 mM 아세테이트 완충제(예를 들어 아세트산-소듐 아세테이트 완충제),

(c) 60 mg/mL 내지 90 mg/mL 수크로스, 및

(d) 0.05 mg/mL 내지 0.5 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 5.0 내지 6.0이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은:

(a) 40 mg/mL 내지 120 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편,

(c) 60 mg/mL 내지 90 mg/mL 수크로스, 및

(d) 0.1 mg/mL 내지 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 5.0 내지 5.8이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은:

(a) 80 mg/mL 내지 120 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편,

(c) 70 mg/mL 내지 90 mg/mL 수크로스, 및

(d) 0.1 mg/mL 내지 0.3 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 5.0 내지 5.5이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은:

(c) 70 mg/mL 내지 90 mg/mL 수크로스, 및

(d) 0.1 mg/mL 내지 0.3 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 5.0 내지 5.5이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은:

(a) 90 mg/mL 내지 110 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편,

(b) 8 mM 내지 12 mM 아세테이트 완충제(예를 들어 아세트산-소듐 아세테이트 완충제),

(c) 75 mg/mL 내지 85 mg/mL 수크로스, 및

(d) 0.15 mg/mL 내지 0.25 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 5.1 내지 5.3이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은:

(a) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편,

(b) 5 mM 내지 15 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제,

(c) 60 mg/mL 내지 90 mg/mL 수크로스, 및

(d) 0.1 mg/mL 내지 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고;

선택적으로, 약학적 조성물은 pH가 5.0 내지 5.4이다.

일부 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 다음을 포함한다:

(1) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 75 mg/mL 수크로스, 약 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(2) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 75 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(3) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 75 mg/mL 수크로스, 약 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(4) 약 80 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 75 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(5) 약 120 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 75 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(6) 약 150 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 75 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(7) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 60 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(8) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 65 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(9) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 70 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(10) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 80 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(11) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 90 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4);

(12) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 75 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 5 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4); 또는

(13) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약 75 mg/mL 수크로스, 약 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 15 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제(pH 5.0 내지 5.4, 예를 들어 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 또는 약 5.4).

위의 구현예에서, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

1) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 경쇄 가변 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 각각 제시되며; 중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 각각 제시되는, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편;

2) 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 17에 제시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 18에 제시되는, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편;

3) 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 포함하는 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 21에 제시되고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되는, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편;

4) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 경쇄 가변 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 24, 서열번호 12 및 서열번호 13에 각각 제시되며; 중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 14, 서열번호 23 및 서열번호 16에 각각 제시되는, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및

5) 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10에 제시되는, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

본 개시내용에 기재된 약학적 조성물은 이미 약물로 제조되기에 충분한 안정성을 갖고 장기간 안정하게 저장될 수 있다. 본 개시내용의 약학적 조성물은 적어도 우수한 안정성, 우수한 동결건조 형태 등을 갖는 장점이 있다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 2~8℃에서 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월 동안 안정하게 유지된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 25℃에서 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월 동안 안정하게 유지된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 40℃에서 적어도 7일, 적어도 14일, 또는 적어도 28일 동안 안정하게 유지된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 실온에서 200 rpm에서 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 또는 적어도 60시간 동안 진탕한 후 안정하게 유지된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 또는 적어도 6회의 냉동-해동(-35℃/실온) 주기 후에 안정하게 유지된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 25℃에서 적어도 1일, 적어도 2, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 또는 적어도 12일 동안 빛(5000 Lx)에 노출된 후 안정하게 유지된다.

본 개시내용은 전술한 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 스톡 용액을 완충제 교환시키는 단계를 포함하고, 여기서 완충제는 아세트산-소듐 아세테이트 완충제일 수 있는, 방법을 추가로 제공한다.

일부 구현예에서, 전술한 약학적 조성물은 액체 제제이다. 일부 다른 구현예에서, 전술한 약학적 조성물은 동결건조된 제제이다.

본 개시내용은 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제제를 제조하는 방법으로서, 전술한 약학적 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하는, 방법을 추가로 제공한다. 대안적인 구현예에서, 동결건조하는 단계는 예비-동결, 1차 건조 및 2차 건조 단계를 순차적으로 포함한다.

본 개시내용은 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제제로서, 동결건조 제제를 제조하는 전술한 방법에 의해 제조되는, 동결건조된 제제를 추가로 제공한다.

본 개시내용은 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제제의 재구성된 용액을 제조하는 방법으로서, 전술한 동결건조된 제제를 재구성하는 단계를 포함하는, 방법을 추가로 제공하고, 여기서 재구성에 사용되는 용액은 주사용수, 생리 식염수, 및 글루코스 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 개시내용은 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 재구성된 용액으로서, 재구성된 용액을 제조하는 전술한 방법에 의해 제조되는, 재구성된 용액을 추가로 제공한다.

본 개시내용은 본 개시내용의 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 전술한 약학적 조성물, 액체 제제, 동결건조된 제제 또는 재구성된 용액 중 임의의 것을 포함하는, 제조품(article of manufacture), 제품 또는 키트를 제공한다. 대안적으로, 제조품, 제품 또는 키트는 하나 이상의 용기를 추가로 포함하고, 여기서 용기는 본 개시내용의 전술한 약학적 조성물, 액체 제제, 동결건조된 제제 또는 재구성된 용액 중 임의의 것을 함유한다. 일부 구현예에서, 용기는 유리 바이알, 예를 들어 중성 붕규산 유리 튜브로 만들어진 주사 바이알이다.

본 개시내용은 용기를 포함하는 제조품으로서, 용기는 전술한 약학적 조성물 또는 동결건조된 제제, 또는 동결건조된 제제의 재구성된 용액을 함유하는, 제조품을 추가로 제공한다.

본 개시내용은 질환 또는 장애의 치료 및 예방 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물 또는 동결건조된 제제, 또는 동결건조된 제제의 재구성된 용액을 추가로 제공한다.

본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, 전술한 약학적 조성물 또는 동결건조된 제제, 또는 동결건조된 제제의 재구성된 용액의 용도를 추가로 제공한다.

본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 전술한 약학적 조성물 또는 동결건조된 제제, 또는 동결건조된 제제의 재구성된 용액의 치료적 및/또는 예방적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다.

일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 ANGPTL3-매개된 질환 또는 장애를 포함하는, ANGPTL3 활성과 관련된 임의의 질환 또는 장애이다.

일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 예는 지질 대사를 수반하는 질환 또는 장애, 예컨대 고지혈증, 고지질단백혈증(hyperlipoproteinemia) 및 이상지질혈증(dyslipidemia)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 예는 죽상경화성 이상지질혈증(atherosclerotic dyslipidemia), 당뇨병성 이상지질혈증(diabetic dyslipidemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia)(중증 고중성지방혈증, TG>1000 mg/dL를 포함함), 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia), 킬로미크론 혈증(chylomicronemia), 혼합 이상지질혈증(mixed dyslipidemia)(예를 들어 비만(obesity), 대사 증후군(metabolic syndrome) 또는 당뇨병(diabetes)), 지방이영양증(lipodystrophy), 지방위축(lipoatrophy) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 예는 감소된 LPL 활성, LPL 결핍, 감소된 LDL 수용체(LDLR) 활성, LDL 수용체 결핍(예를 들어 LDLR^-/- 동종접합 가족성 고콜레스테롤혈증), 변경된 ApoC2/ApoE 결핍, 증가된 ApoB, 초저밀도 지질단백질(very-low-density lipoprotein, VLDL)의 감소된 생성 및/또는 제거, 특정 약물(예를 들어 글루코코르티코이드 치료에 의해 발생된 이상지질혈증), 임의의 유전적 소인, 식이, 생활방식 등에 의해 발생된 이상지질혈증일 수 있다.

일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 심혈관 질환 또는 장애(cardiovascular disease or disorder), 예컨대 죽상경화증(atherosclerosis), 동맥류(aneurysm), 고혈압(hypertension), 협심증(angina pectoris), 뇌졸중(stroke), 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 관상동맥 질환(coronary artery disease), 심근경색(myocardial infarction) 및 말초혈관 질환(peripheral vascular disease); 급성 췌장염(acute pancreatitis); 비알콜성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH); 혈당 이상(blood glucose abnormality), 예컨대 당뇨병 및 비만을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 고지혈증, 고지질단백혈증 및/또는 이상지질혈증에 의해 발생되는 질환 또는 장애일 수 있다.

일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 다른 예는 암/종양 및 비-종양 혈관신생-관련 질환 또는 장애(non-tumor angiogenesis-related disease or disorder)를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 질환 또는 장애는 안구 혈관신생-관련 질환 또는 장애(ocular angiogenesis-related disease or disorder), 예컨대 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration), 중심 또는 분지 망막 정맥 폐쇄(central or branch retinal vein occlusion), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 또는 미숙아의 망막증(retinopathy of prematurity)일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 질환 또는 장애는 염증성 질환 또는 장애, 예컨대 관절염(arthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 또는 건선(psoriasis)일 수 있다.

도 1: 스프래그 다우리(Sprague Dawley, SD) 랫트에서 혈청 트리글리세리드에 대한 항체 P8BG의 효과.
도 2: 고지방 식이(high-fat-diet, HFD) 마우스에서 혈장 트리글리세리드에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과.
도 3: HFD 마우스에서 혈장 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과.
도 4: HFD 마우스에서 혈장 총 콜레스테롤에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과.
도 5: APOE 마우스(아포지질단백질 E(apolipoprotein E, ApoE) 유전자 녹아웃 마우스)에서 혈장 트리글리세리드에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과.
도 6: APOE 마우스에서 혈장 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(high-density liptein cholesterol, HDL-C)에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과.
도 7: 마우스에서 항-ANGPTL3 항체의 약동학적 결과.
도 8: 시노몰구스 원숭이에서 항-ANGPTL3 항체의 약동학적 결과.

I. 용어

본 개시내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 일부 기술 용어 및 과학 용어를 구체적으로 아래에 정의하였다. 본원에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 다른 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 당업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.

"완충제"는 이의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의한 pH 변화에 저항하는 완충제를 지칭한다. pH를 적절한 범위 내로 유지하는 완충제의 예는 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 포스페이트, 글루코네이트, 히스티딘 염, 옥살레이트, 락테이트, 포스페이트, 시트레이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글리실글리신 및 다른 유기산 완충제를 포함한다.

"히스티딘 염 완충제"는 히스티딘 이온을 포함하는 완충제이다. 히스티딘 염 완충제의 예는 히스티딘-염산 완충제, 히스티딘-아세테이트 완충제, 히스티딘-포스페이트 완충제, 히스티딘-설페이트 완충제 등, 예를 들어 히스티딘-아세테이트 완충제 또는 히스티딘-염산 완충제를 포함한다. 히스티딘-아세테이트 완충제는 히스티딘 및 아세트산으로부터 제조되고, 히스티딘 염 완충제는 히스티딘 및 염산으로부터 제조된다.

"시트레이트 완충제"는 시트레이트 이온을 포함하는 완충제이다. 시트레이트 완충제의 예는 시트르산-소듐 시트레이트, 시트르산-포타슘 시트레이트, 시트르산-칼슘 시트레이트, 시트르산-마그네슘 시트레이트 등을 포함한다. 시트레이트 완충제는 시트르산-소듐 시트레이트일 수 있다.

"숙시네이트 완충제"는 숙시네이트 이온을 포함하는 완충제이다. 숙시네이트 완충제의 예는 숙신산-소듐 숙시네이트, 숙신산-포타슘 숙시네이트, 숙신산-칼슘 숙시네이트 등을 포함한다. 숙시네이트 완충제는 숙신산-소듐 숙시네이트일 수 있다.

"포스페이트 완충제"는 포스페이트 이온을 포함하는 완충제이다. 포스페이트 완충제의 예는 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트-포타슘 디하이드로겐 포스페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트-스트르산 등을 포함한다. 포스페이트 완충제는 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트일 수 있다.

"아세테이트 완충제"는 아세테이트 이온을 포함하는 완충제이다. 아세테이트 완충제의 예는 아세트산-소듐 아세테이트, 아세트산-히스티딘 염, 아세트산-포다슘 아세테이트, 아세트산-칼슘 아세테이트, 아세트산-마그네슘 아세테이트 등을 포함한다. 아세테이트 완충제는 아세트산-소듐 아세테이트일 수 있다.

"약학적 조성물"은 본원에 기재된 화합물 또는 이의 생리학적/약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물 중 하나 이상, 및 다른 화학 성분, 예를 들어 생리학적/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 지칭한다. 약학적 조성물은 유기체에 대한 투여를 촉진하여 활성 성분의 흡수를 용이하게 함으로써 생물학적 활성을 발휘하고자 한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약학적 조성물" 및 "제제"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.

달리 명시되지 않는 한, 용액 형태로 본 개시내용에 기재된 약학적 조성물 중 용매는 물이다.

"동결건조된 제제"는 액체 또는 용액 형태의 약학적 조성물 또는 제제를 진공하에 동결건조하여 수득한 제제 또는 약학적 조성물을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 수치가 당업자가 결정한 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 해당 수치는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지에 부분적으로 의존한다(즉, 측정 시스템의 한계). 예를 들어, "약"은 당업계의 각 실시에서 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 또는, "약" 또는 "실질적으로 포함한다"는 최대 ±20%의 범위를 의미할 수 있고; 예를 들어, 약 5.5의 pH는 5.5±1.1의 pH를 의미한다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 공정의 경우, 이 용어는 최대 10배 또는 최대 5배의 수치를 의미할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본 출원 및 청구범위에서 특정 값이 제공되는 경우, "약" 또는 "실질적으로 포함하는"의 의미는 해당 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정해야 한다.

본 개시내용에 기재된 약학적 조성물은 안정한 효과를 달성할 수 있다: 약학적 조성물 중 항체는 저장 후에 이의 물리적 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 유지하며; 예를 들어, 약학적 조성물은 저장 후에 이의 물리적 및 화학적 안정성은 물론 이의 생물학적 활성을 실질적으로 유지한다. 저장 기간은 일반적으로 약학적 조성물의 미리 결정된 저장 수명을 기준으로 선택한다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 현재 이용 가능한 다양한 분석 기법이 있으며, 선택된 온도에서 선택된 기간 동안 저장한 후 안정성을 측정할 수 있다.

안정한 약학적 항체 제제는 다음 조건하에 유의한 변화가 관찰되지 않는 제제이다: 냉장 온도(2~8℃)에서 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 또는 최대 2년 동안 저장. 또한, 안정한 액체 제제는 1개월, 3개월 및 6개월을 포함하는 기간 동안 25℃에서 저장, 또는 1개월을 포함하는 기간 동안 40℃에서 저장 후 바람직한 특성을 나타내는 액체 제제를 포함한다. 안정성에 대한 전형적인 허용 가능한 기준은 다음과 같다: 전형적으로 SEC-HPLC로 측정할 때 항체 단량체의 약 10% 이하, 예를 들어 약 5% 이하가 분해된다. 약학적 항체 제제는 시각적 분석에 의해 무색, 또는 투명하거나 약간의 유백색이다. 제제의 농도, pH 및 삼투질 농도는 ±10% 이하의 변화를 갖는다. 전형적으로 약 10% 이하, 예를 들어 약 5% 이하의 클리핑(clipping)이 관찰된다. 전형적으로 약 10% 이하, 예를 들어 약 5% 이하의 응집이 형성된다.

항체는 색상 및/또는 투명도의 시각적 조사 시, 또는 UV 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC), 및 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)으로 결정된 바와 같이 응집, 침전 및/또는 변성에서 어떠한 유의한 증가도 보여주지 않는다면 약학적 조성물에서 "이의 물리적 안정성을 유지한다". 단백질 입체형태의 변화는 형광 분광법(단백질 3차 구조를 결정함) 및 FTIR 분광법(단백질 2차 구조를 결정함)으로 평가할 수 있다.

항체는 이것이 어떠한 유의한 화학적 변화도 보여주지 않는다면 약학적 제제에서 "이의 화학적 안정성을 유지한다". 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변화된 형태를 검출하고 정량화하여 평가할 수 있다. 단백질의 화학적 구조를 종종 변화시키는 분해 과정은 가수분해 또는 클리핑(크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE와 같은 방법으로 평가함), 산화(질량 분광법 또는 MALDI/TOF/MS와 조합된 펩티드 맵핑과 같은 방법으로 평가함), 탈아미드화(이온-교환 크로마토그래피, 모세관 등전 집중법(capillary isoelectric focusing), 펩티드 맵핑, 및 이소아스파르트산 결정과 같은 방법으로 평가함), 및 이성질체화(이소아스파르트산 함량 결정, 펩티드 맵핑 등으로 평가함)를 포함한다.

항체는 주어진 시간에서 항체의 생물학적 활성이 약학적 제제가 제조되는 동안 나타나는 생물학적 활성의 미리 결정된 범위 내에 있다면 약학적 제제에서 "이의 생물학적 활성을 유지한다". 항체의 생물학적 활성은, 예를 들어 항원-결합 검정에 의해 결정할 수 있다.

본원에 사용된 아미노산에 대한 3문자 코드 및 1문자 코드는 J.biol.chem, 243, p 3558 (1968)에 기재된 바와 같다.

본 개시내용에 기재된 "항체"는 면역글로불린을 지칭하며, 천연 온전한 항체는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄 사이를 사슬간 이황화 결합으로 연결함으로써 형성된 테트라펩티드 사슬 구조이다. 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 이의 아미노산 조성 및 배열이 상이하므로 이의 항원성이 상이하다. 이에 따라, 면역글로불린은 5개의 부류, 달리 면역글로불린의 동형이라고도 하는 부류, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 나눌 수 있으며, 이들의 상응하는 중쇄는 각각 μ 쇄, δ 쇄, γ 쇄, α 쇄 및 ε 쇄이다. 동일한 부류의 Ig는 힌지 영역의 아미노산 조성 및 중쇄의 이황화 결합의 수 및 위치의 차이에 따라 상이한 하위 부류로 나눌 수 있고; 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나눌 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이에 따라 κ 또는 λ 쇄로 나누어진다. Ig의 5가지 부류의 각각은 κ 쇄 또는 λ 쇄를 가질 수 있다.

항체의 중쇄 및 경쇄에서, N 말단 근처의 약 110개 아미노산의 서열은 상당히 가변적이므로 가변 영역(Fv 영역)이라고 지칭하며; C 말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하므로 불변 영역이라고 지칭한다. 가변 영역은 상대적으로 보존적인 서열을 갖는 3개의 초가변 영역(hypervariable region, HVR) 및 4개의 프레임워크 영역(framework region, FR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하므로 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로도 공지되어 있다. 각 경쇄 가변 영역(light chain variable region, LCVR) 또는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region, HCVR)은 아미노 말단에서 카르복실 말단까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 경쇄의 3개의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고, 중쇄의 3개의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다. 본 개시내용에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 LCVR 및 HCVR의 CDR 아미노산 잔기는 공지된 카바트 넘버링 체계(LCDR1-3, HCDR2-3)와 일치하거나, 정량적 및 위치적 측면에서, 카바트 및 코티아 넘버링 체계(HCDR1)와 일치한다.

본 개시내용의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체, 예를 들어 인간화 항체를 포함한다.

본 개시내용에 사용된 용어 "뮤린 항체"는 당업계의 지식 및 기술에 따라 제조된 인간 ANGPTL3에 대한 단일클론 항체를 지칭한다. 준비하는 동안 ANGPTL3 항원을 시험 대상체에게 주입한 다음, 원하는 서열 또는 기능적 특징을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리시킨다. 본 개시내용의 대안적인 일 구현예에서, 뮤린 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 κ 또는 λ 쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하거나, 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.

본원에 기재된 용어 "키메라 항체"는 이종(예를 들어 뮤린) 항체의 가변 영역과 항체(예를 들어 인간 항체)의 불변 영역을 융합시켜 수득한 항체로서, 이종 항체에 의해 유도되는 면역 반응을 완화시킬 수 있는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 인간-뮤린 키메라 항체는 먼저 뮤린 특이적 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립한 다음, 마우스 하이브리도마 세포로부터 가변 영역 유전자를 클로닝하고, 필요에 따라 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하고, 마우스 가변 영역 유전자 및 인간 불변 영역 유전자를 키메라 유전자에 연결하고, 키메라 유전자를 발현 벡터에 삽입하고, 마지막으로 키메라 항체 분자를 진핵 시스템 또는 원핵 시스템에서 발현시키는 단계에 의해 확립된다. 본 개시내용의 대안적인 일 구현예에서, 항-ANGPTL3 키메라 항체의 항체 경쇄는 인간 κ 쇄 및 λ 쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. ANGPTL3 키메라 항체의 항체 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4, 또는 아미노산 돌연변이(예를 들어 L234A 및/또는 L235A 돌연변이, 및/또는 S228P 돌연변이)를 사용하는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.

CDR-이식 항체로도 공지된 용어 "인간화 항체"는 이종(예를 들어 뮤린) CDR 서열을 인간 항체 가변 영역 프레임워크, 즉 상이한 유형의 인간 생식계열 항체 프레임워크 서열에 이식함으로써 생성된 항체를 지칭한다. 이러한 항체는 많은 양의 마우스 단백질 성분을 보유하기 때문에 키메라 항체에 의해 유도되는 불균질한 반응을 극복할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(인터넷 주소 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase에서 입수 가능함)에서 뿐만 아니라, Kabat, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition에서도 찾을 수 있다. 면역원성의 감소에 의해 유발되는 활성의 감소를 피하기 위해, 인간 항체 가변 영역의 FR 서열은 활성을 유지하기 위해 최소의 역 돌연변이 또는 복귀 돌연변이를 겪을 수 있다. 본 개시내용의 인간화 항체는 또한 효모 디스플레이에 의해 CDR 친화성 성숙 돌연변이를 추가로 겪게 되는 인간화 항체를 포함한다.

용어 "인간 항체" 및 "인간-유래 항체"는 상호교환적으로 사용되며 가변 및 불변 영역 중 하나 이상이 인간 면역글로불린 서열로부터 유래한다는 것을 의미한다. 대안적인 일 방법은 모든 가변 및 불변 영역이 인간 면역글로불린 서열, 즉 "완전 인간-유래 항체" 또는 "완전 인간 항체"로부터 유래된다는 것이다. 이들 항체는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 인간 PBMC, 비장 및 림프절 조직으로부터 B 세포를 단리하고 천연 단일-가닥 파지 인간 항체 라이브러리를 구축함으로써, 또는 인간 항체 경쇄 및 중쇄를 발현할 수 있는 형질전환 마우스를 면역화하고 스크리닝함으로써 수득되는 항체를 포함한 다양한 방식으로 수득할 수 있다. 본 개시내용의 인간 항체는 또한 관심 항원에 여전히 결합하고, 인간 항체를 기초로 한 하나 이상의 아미노산의 돌연변이에 의해 수득되는 항체를 포함한다.

전장 항체 이외에, 본원에 기재된 "항체"는 또한 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 단편을 포함한다.

용어 "항원-결합 단편" 또는 "기능적 단편"은 항원(예를 들어 ANGPTL3)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 전장 항체의 단편을 이용하여 항체의 항원-결합 기능을 실시할 수 있음이 밝혀졌다. 용어 "항원-결합 단편"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교(disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함한 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VH 및 VL 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 및 VL에 의해 이들 사이의 사슬간 이황화 결합을 통해 형성된 안정한 항원-결합 단편인 dsFv; (vi) scFv, dsFv 및 Fab와 같은 단편을 포함한 이중체, 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체를 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 분리된 유전자에 의해 암호화되더라도, 이들은 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 연결됨으로써 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬을 생성할 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv)로 지칭됨; 예를 들어 Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883을 참조). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어에 포함된다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득하며, 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 모이어티는 재조합 DNA 기법에 의해 생성되거나, 효소 촉매 작용 또는 온전한 면역글로불린의 화학적 절단(cleavage)에 의해 생성될 수 있다. 항체는 상이한 동형, 예를 들어 IgG(예를 들어 아형 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.

본 개시내용에 기재된 돌연변이된 서열의 "돌연변이"는 "역 돌연변이", "보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용에 기재된 "보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"은 단백질의 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 흔하게 변화가 만들어질 수 있도록 단백질의 아미노산을 유사한 특성(예를 들어 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 또는 백본 형태(backbone conformation) 및 강성)을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 당업자는 일반적으로 말해서 폴리펩티드의 비필수 영역에서 단일 아미노산 대체가 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는다는 것을 알고 있다(예를 들어 Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., page 224, (4th edition)를 참조). 또한, 유사한 구조 또는 기능을 갖는 아미노산의 대체는 생물학적 활성을 방해할 가능성이 없다.

본 개시내용에 기재된 "돌연변이된 서열"은 대체, 삽입 또는 결실과 같은 돌연변이 변형이 본 개시내용의 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열에 적절하게 이루어질 때 본 개시내용의 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열에 대해 상이한 정도의 백분율 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 개시내용에 기재된 서열 동일성은 적어도 85%, 90% 또는 95%, 예를 들어 적어도 95%일 수 있다. 비제한적 예는 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 포함한다. 두 서열 간의 서열의 비교 및 백분율 동일성의 결정은 국립 생명공학연구 센터(National Center for Biotechnology Institute)의 웹사이트에서 입수 가능한 BLASTN/BLASTP 알고리즘의 기본 설정치를 이용하여 실시할 수 있다.

"서열 동일성" 또는 "서열 상동성"은 아미노산 서열에 적용될 때, 2개의 단백질 또는 폴리펩티드 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 비교될 2개의 서열 둘 모두에서의 위치가 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유될 때, 예를 들어 두 폴리펩티드에서의 위치가 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 백분율 서열 동일성 및 백분율 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al.(1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학연구 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 공개적으로 입수 가능하다.

항체 및 항원-결합 단편을 생성 및 정제하는 방법은 선행 기술에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press의 5-8 및 15장에 기재된 바와 같다. 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 비인간 CDR에서 하나 이상의 인간 FR을 함유하도록 유전적으로 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은 IMGT 인간 항체 가변 영역 생식계열 유전자 데이터베이스를 MOE 소프트웨어와 비교함으로써, ImMunoGeneTics(IMGT)의 웹사이트 http://imgt.cines.fr 또는 면역글로불린 저널, 2001ISBN012441351으로부터 수득할 수 있다.

본 개시내용의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 통상적인 방법으로 제조 및 정제할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열은 클로닝되어 GS 발현 벡터로 재조합할 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포 로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 더 권장되는 선행 기술로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N 말단 부위에서 항체의 글리코실화를 발생시킬 수 있다. 안정한 클론은 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 항체의 발현에 의해 수득한다. 양성 클론은 생물반응기의 무혈청 배지에서 확장되어 항체를 생성한다. 분비된 항체를 갖는 배양 배지는 통상적인 기법으로 정제할 수 있다. 예를 들어, 정제는 조정된 완충제를 함유하는 A 또는 G 세파로오스(Sepharose) FF 컬럼을 사용하여 실시한다. 비특이적으로 결합된 분획을 세척한다. 결합된 항체는 pH 구배법으로 용출하고, 항체 단편은 SDS-PAGE로 검출하고 수집한다. 항체는 통상적인 방법으로 여과 및 농축할 수 있다. 가용성 혼합물 및 중합체는 또한 분자체 및 이온 교환과 같은 통상적인 방법으로 제거할 수 있다. 결과로서 생성된 생성물은, 예컨대 -70℃에서 즉시 동결하거나 동결건조해야 한다.

"제공하는" 및 "치료하는"은 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 외인성 약물, 치료제, 진단제 또는 조성물과 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체와의 접촉을 지칭한다. "제공하는" 및 "치료하는"은, 예를 들어 치료 방법, 약동학적 방법, 진단 방법, 연구 방법 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 처리는 시약을 세포와 접촉하게 만들고 시약을 유체와 접촉하게 만드는 것을 포함하며, 여기서 유체는 세포와 접촉한다. "제공하는" 및 "치료하는"은 또한 시험관내 및 생체외에서 예컨대 세포를 시약, 진단, 결합 조성물에 의한, 또는 다른 세포에 의한 처리를 지칭한다. "치료하는"은 인간, 수의학 또는 연구 대상체에 적용될 때, 치료적 처리, 방지적 또는 예방적 조치, 및 연구 및 진단 적용을 지칭한다.

"치료"는 치료제, 예를 들어 치료제가 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 하나 이상의 질환 증상을 갖는 대상체에게 내부적으로 또는 외부적으로 본 개시내용의 결합 조성물 중 임의의 것을 포함하는 조성물의 투여를 지칭한다. 전형적으로, 치료제는 치료 대상체 또는 집단에서 질환의 하나 이상의 증상을 완화시켜 이러한 증상의 퇴행을 유도하거나 이러한 증상의 발달을 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정 질환 증상을 완화시키는 데 효과적인 치료제의 양("치료적 유효량"이라고도 함)은 질환 상태, 대상체의 연령 및 체중, 및 대상체에서 원하는 치료 효과를 생성하는 약물의 능력과 같은 인자에 따라 가변될 수 있다. 질환의 증상이 완화되었는지 여부는 증상의 중증도 또는 진행을 평가하기 위해 의사 또는 다은 의료 전문가가 일반적으로 사용하는 임의의 임상 시험법을 사용하여 평가할 수 있다. 본 개시내용의 구현예(예를 들어 치료 방법 또는 제조품)는 각각의 관심이 되는 질환의 증상을 완화하는 데 비효과적일 수 있지만, 당업계에 공지된 임의의 통계적인 시험 방법, 예컨대 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-제곱 검정(chi-square test), 만 휘트니에 의한 U-검정(U-test by Mann and Whitney), 크러스칼-왈리스 검정(H-검정)(Kruskal-Wallis test (H-test)), 존키어-테르프스트라 검정(Jonckheere-Terpstra test) 및 윌콕슨 검정(Wilcoxon test)에 의해 결정된 통계적으로 유의한 수의 대상체에서 관심 질환의 증상을 완화해야 한다.

"유효량"은 의학적 질환의 증상 또는 장애를 개선하거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 지칭한다. 특정 대상체 또는 수의학적 대상체에 대한 유효량은 치료할 장애, 대상체의 일반적인 건강, 투여 방법과 경로 및 투여량, 및 부작용의 중증도와 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 유효량은 유의한 부작용 또는 독성 효과를 피하기 위한 최대 용량 또는 투여 요법일 수 있다.

"Tm 값"은 단백질의 열변성 온도, 즉 단백질의 절반이 펼쳐지고 단백질의 공간 구조가 파괴되는 온도를 지칭한다. 따라서, Tm 값이 높을수록 단백질의 열적 안정성이 높다.

실시예

본 개시내용은 실시예를 참조하여 아래에 추가로 설명되지만, 이는 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 특정 조건이 명시되지 않은 본 개시내용의 실시예에서의 실험 방법은 일반적으로 콜드 스프링 하버 연구소(Cold Spring Harbor Laboratory)의 Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual과 같은 통상적인 조건하에서, 또는 원료나 상품의 제조업체가 권장하는 조건하에서 실시한다. 특정 출처가 표시되지 않은 시약은 시중에서 입수 가능한 통상적인 시약이다.

실시예 1: ANGPTL3 항원의 설계 및 발현

인간 ANGPTL3 단백질(유니프롯(Uniprot) 번호 Q9Y5C1), 마우스 ANGPTL3 단백질(유니프롯 번호 Q9R182), 시노몰구스 원숭이 ANGPTL3 단백질(유니프롯 번호 A0A2K5UDC5) 및 랫트 ANGPTL3 단백질(유니프롯 번호 F7FHP0)을 본 개시내용에 관련된 검출용 항원 및 단백질을 설계하기 위해 본 개시내용에서 ANGPTL3의 주형으로서 사용하였다. ANGPTL3 단백질을 상이한 태그와 융합시켜 pTT5 벡터(바이오벡터(Biovector), Cat#: 102762)에 클로닝하고, 293개의 세포를 생성된 벡터로 일시적으로 형질감염시켜 발현을 진행하였다. 그런 다음, 발현 생성물을 정제하여 본 개시내용의 검출을 위한 암호화된 항원 및 단백질을 수득하였다.

1. 전장 인간 ANGPTL3: 인간-ANGPTL3(17-460)-His, 면역화 및 검출에 사용되고, 다음의 아미노산 서열을 가짐:

서열번호 1

참고: 한 줄로 밑줄친 부분은 신호 펩티드 서열을 나타내고, 이탤릭체 부분은 His 서열을 나타내며, 굵게 표시된 부분은 전장 인간 ANGPTL3 단백질의 위치 17 내지 460의 아미노산을 나타낸다.

2. 인간 ANGPTL3의 세포외 영역: 인간-ANGPTL3(17-170)-Flag-His, 면역화 및 검출에 사용되고, 다음의 아미노산 서열을 가짐:

서열번호 2

참고: 한 줄로 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 두 줄로 밑줄친 부분은 연결 펩티드를 나타내고, 이탤릭체 부분은 Flag 및 His를 나타내며, 굵게 표시된 부분은 전장 인간 ANGPTL3 단백질의 위치 17 내지 170의 아미노산을 나타낸다.

3. 인간 ANGPTL3(인간 ANGPTL3(17-170))의 세포외 영역 및 마우스 IgG2aFc 분절(mFc로 축약됨)의 융합 단백질: 인간 ANGPTL3(17-170)-mFc, 검출에 사용되고, 다음의 아미노산 서열을 가짐:

서열번호 3

참고: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체 부분은 마우스 IgG2aFc를 나타내며, 굵게 표시된 부분은 전장 인간 ANGPTL3 단백질의 위치 17 내지 170의 아미노산을 나타낸다.

4. 인간 ANGPTL3(인간 ANGPTL3(17-220))의 세포외 영역 및 마우스 IgG2aFc 분절의 융합 단백질: 인간 ANGPTL3(17-220)-mFc, 면역화 및 검출에 사용되고, 다음의 아미노산 서열을 가짐:

서열번호 4

참고: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체 부분은 마우스 IgG2aFc를 나타내며, 굵게 표시된 부분은 전장 인간 ANGPTL3 단백질의 위치 17 내지 220의 아미노산을 나타낸다.

5. 전장 마우스 ANGPTL3: 마우스 ANGPTL3(17-455)-His, 면역화 및 검출에 사용되고, 다음의 아미노산 서열을 가짐:

서열번호 5

참고: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체 부분은 His 서열을 나타내며, 굵게 표시된 부분은 전장 마우스 ANGPTL3 단백질의 위치 17 내지 455의 아미노산을 나타낸다.

6. 마우스 ANGPTL3(마우스 ANGPTL3(17-220))의 세포외 영역 및 마우스 IgG2aFc 분절의 융합 단백질: 마우스 ANGPTL3(17-220)-mFc, 면역화에 사용되고, 다음의 아미노산 서열을 가짐:

서열번호 6

참고: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체 부분은 마우스 IgG2aFc를 나타내며, 굵게 표시된 부분은 전장 마우스 ANGPTL3 단백질의 위치 17 내지 220의 아미노산을 나타낸다.

7. 전장 시노몰구스 원숭이 ANGPTL3: 시노몰구스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His, 검출에 사용되고, 다음의 아미노산 서열을 가짐:

서열번호 7

참고: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체 부분은 His 서열을 나타내며, 굵게 표시된 부분은 전장 시노몰구스 원숭이 ANGPTL3 단백질의 위치 17 내지 460의 아미노산을 나타낸다.

8. 전장 랫트 ANGPTL3: 랫트 ANGPTL3(17-455)-His, 검출에 사용되고, 다음의 아미노산 서열을 가짐:

서열번호 8

참고: 밑줄친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이탤릭체 부분은 His 서열을 나타내며, 굵게 표시된 부분은 전장 랫트 ANGPTL3 단백질의 위치 17 내지 455의 아미노산을 나타낸다.

실시예 2: ANGPTL3 항원 단백질, 하이브리도마 항체 및 재조합 항체의 정제

2.1. His-태그를 갖는 재조합 단백질 또는 Flag-his 태그를 갖는 재조합 단백질의 정제

세포 발현 샘플을 고속으로 원심분리하여 세포 및 불용성 불순물을 제거하고, 상층액을 수집하고, 최종 농도가 5 mM가 될 때까지 이미다졸을 첨가하였다. 니켈 컬럼을 5 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 용액으로 평형화하고, 2-5 컬럼 부피로 세척하였다. 세포 상층액을 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 5 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 용액으로 세척하였다. 이어서, 크로마토그래피 컬럼을 PBS + 10 mM 이미다졸로 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질 불순물을 제거하고, 통과액을 수집하였다. 표적 단백질은 300 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 용액으로 용출시키고, 용출 피크를 수집하였다.

수집된 용출액을 슈퍼덱스(Superdex) 겔 여과 컬럼을 사용하여 추가로 정제한 다음, 튜브로 수집하였다. 수득된 샘플은 SDS-PAGE, 펩티드 맵핑 및 LC-MS로 확인한 다음, 추후 사용을 위해 분취하였다. 따라서, His 태그를 갖는 재조합 단백질 또는 Flag-his 태그를 갖는 재조합 단백질을 수득하였다.

2.2. 하이브리도마 항체 또는 mFc 태그를 갖는 재조합 단백질의 정제

샘플을 고속으로 원심분리하여 세포 및 불용성 불순물을 제거하고, 상층액을 수집하였다. 단백질 A 친화성 컬럼을 1× PBS로 평형화하고 2-5 컬럼 부피로 세척하였다. 원심분리하여 수득한 세포 발현 상층액 샘플을 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 1× PBS 용액으로 세척하였다. 컬럼을 1× PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 0.1 M 아세트산(pH 3.5-4.0)으로 용출시키고, 용출된 단백질을 수집하여 즉시 1 M Tris-HCl(pH 7.0)로 중성화시키고, 투석 또는 농축하여 최종적으로 1× PBS 완충액으로 교환하였다. 샘플을 수집하고, 전기영동, 펩티드 맵핑 및 LC-MS에 의해 확인한 다음, 추후 사용을 위해 분취하였다. 따라서, mFc 태그를 갖는 재조합 단백질 또는 하이브리도마 항체를 수득하였다.

2.3. 항체 및 mFc 태그를 갖는 재조합 단백질의 정제

샘플을 고속으로 원심분리하여 세포 및 불용성 불순물을 제거하고, 상층액을 수집하였다. 단백질 G 친화성 컬럼을 1× PBS로 평형화하고 2-5 컬럼 부피로 세척하였다. 원심분리하여 수득한 세포 발현 상층액 샘플을 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 1× PBS 용액으로 세척하였다. 컬럼을 1× PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 아세트산(pH 3.0)으로 용출시키고, 용출된 단백질을 수집하여 즉시 1 M Tris-HCl(pH 7.0)로 중성화시키고, 투석 또는 농축하여 최종적으로 1× PBS 완충액으로 교환하였다. 샘플을 수집하고, 전기영동, 펩티드 맵핑 및 LC-MS에 의해 확인한 다음, 추후 사용을 위해 분취하였다. 따라서, 항체 또는 hFc 태그를 갖는 재조합 단백질을 수득하였다.

실시예 3: 항-ANGPTL3 항체의 제조

3.1. 파지 라이브러리에 의한 항-ANGPTL3 인간-유래 항체의 스크리닝

인간 파지 단일 사슬 항체 라이브러리를 패키징하여 농축한 다음, 파지 라이브러리(10¹²-10¹³/pfu)를 1 mL의 2% MPBS(2% 탈지유 분말을 함유하는 PBS)에 현탁하고, 100 μL의 Dynabeads® M-280 스트렙타비딘(streptavidin)(Invitrogen, Cat No. 11206D)을 첨가하였다. 튜브를 회전판 상에 놓고 반복적으로 뒤집은 다음, 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다(blocked). 튜브를 마그네틱 랙 상에 2분 동안 방치하고, 다이나비즈를 제거하고, 파지 라이브러리를 새로운 튜브로 옮겼다. 2 μg/mL 비오틴-표지된 인간 ANGPTL3(17-460)-His를 차단된 파지 라이브러리에 첨가하고, 튜브를 회전 플레이트 상에 놓고 1시간 동안 반복적으로 뒤집었다. 한편, 100 μL의 다이나비즈를 측정하여 1 mL의 2% MPBS에 현탁시키고, 튜브를 회전판 상에 놓고 반복적으로 뒤집은 다음, 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 튜브를 마그네틱 랙 상에 2분 동안 방치하고, 차단 용액을 피펫으로 제거하였다. 차단된 다이나비즈를 파지 라이브러리 및 인간 ANGPTL3(17-460)-His의 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 함유하는 튜브를 회전 플레이트 상에 놓고 15분 동안 반복적으로 뒤집었다. 튜브를 마그네틱 랙 상에 2분 동안 방치하고, 혼합물을 피펫으로 제거하였다. 다이나비즈를 1 mL의 PBST(0.1% Tween-20을 함유하는 PBS)로 10회 세척하고, 0.5 mL의 1 mg/mL 트립신(Sigma, Cat No. T1426-250MG)을 첨가하였다. 튜브를 회전판 상에 놓고 15분 동안 인큐베이션한 후, 반복적으로 뒤집어 용출시켰다. 용출된 파지를 사용하여 TG1 대장균(E. Coli)을 감염시키고, TG1 대장균을 분주하였다. 단일 클론을 파지 ELISA를 위해 무작위로 선택하였다.

클론을 96-웰 딥-웰 플레이트(Nunc Cat No. 260251)에 접종하고 37℃에서 16~18시간 동안 인큐베이션하였다. 소수의 인큐베이션된 클론을 취하고 다른 96-웰 딥웰 플레이트에 접종하였다. OD600이 약 0.5에 도달하였을 때, M13K07 헬퍼 파지(NEB, Cat No. N0315S)를 패키징을 위해 첨가하였다. 혼합물을 4000 g에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 제거하고, 배양액을 피펫을 이용하여 수집하고 ANGPTL3 결합 ELISA 검정에 적용하였다. 양성 클론 균주를 동결보존하고 서열분석을 위해 서열분석 회사에 보냈다. 양성 클론 P8에 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:

> P8의 중쇄 가변 영역 서열:

서열번호 9

> P8의 경쇄 가변 영역 서열:

서열번호 10

참고: 서열에서 밑줄 친 부분은 카바트 넘버링 시스템에 따라 결정된 CDR 서열을 나타내고, 이탤릭체 부분은 FR 서열을 나타낸다.

3.2. 항-ANGPTL3 항체의 돌연변이

P8 항체의 3차원 구조에 기초하여, P8의 중쇄 가변 영역 중 55번(자연적으로 순차적으로 넘버링됨) 위치의 아미노산 잔기를 D로부터 E로 돌연변이시키고, P8의 경쇄 가변 영역 중 34번(자연적으로 순차적으로 넘버링됨) 위치의 아미노산 잔기를 G로부터 V로 돌연변이시켜, 신규의 항체 분자 P8B를 수득하였으며, 여기서 P8B의 아미노산 서열은 다음과 같다:

> P8B의 중쇄 가변 영역 서열:

서열번호 17

> P8B의 경쇄 가변 영역 서열:

서열번호 18

표 1. P8B 항체 분자의 CDR 서열

3.3. 항-ANGPTL3 항체의 구축 및 발현

프라이머를 설계하고, 항체의 VH/VK 유전자 단편을 PCR을 이용하여 구축하고, 발현 벡터 pHr(시그널 펩티드 및 불변 영역 유전자(CH1-FC/CL) 단편)과 동종 재조합하였다. 따라서, 항체 전장 발현벡터 VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr을 구축하였다. 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 이들의 변이체의 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 κ 및 λ 쇄의 경쇄 불변 영역 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예시적으로, 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG4-YTE 변이체로부터 선택되며, 이의 서열은 서열번호 19에 제시되고, 경쇄 불변 영역은 인간 κ 쇄의 불변 영역으로부터 선택되며, 이의 서열은 서열번호 20에 제시된다.

> 인간 IgG4-YTE 변이체의 중쇄 불변 영역 서열:

서열번호 19

> 인간 κ 쇄의 경쇄 불변 영역 서열:

서열번호 20

예시적으로, 위에 기재된 경쇄/중쇄 불변 영역은 P8B의 전술한 가변 영역과 조합되어 완전한 항-ANGPTL3 항체를 형성하였다: P8BG. 항체의 경쇄/중쇄 서열은 다음과 같다:

> P8BG의 중쇄 서열:

서열번호 21

> P8BG의 경쇄 서열:

서열번호 22

실시예 4: 항-ANGPTL3 항체의 시험관내 평가

4.1: ANGPTL3 단백질에 대한 항-ANGPTL 항체의 결합에 대한 ELISA 검정

항-ANGPTL3 항체는 ANGPTL3 단백질에 결합함으로써 ANGPTL3 단백질의 적어도 하나의 활성을 억제하거나 방해한다. ANGPTL3 항원에 대한 항-ANGPTL3 항체의 결합 활성을 ELISA 검정으로 측정하였다. 마이크로플레이트가 코팅된 염소 항-마우스 ΙgG에 결합함으로써 ANGPTL3 단백질(인간 ANGPTL3(17-170)-mFc)을 96-웰 마이크로플레이트에 고정시키고, 항체를 첨가한 후 신호의 세기에 따라 ANGPTL3에 대한 항체의 결합 활성을 결정하였다. 한편, 비오틴 표지 키트(Dojindo China, LK03)로 표지된 HIS 태그(마우스 ANGPTL3(17-455)-His, 시노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His, 및 랫트 ANGPTL3(17-455)-His)을 갖는 ANGPTL3 단백질을 마이크로플레이트가 코팅된 스트렙타비딘에 결합시켜 96-웰 마이크로플레이트에 고정하고, 항체를 첨가한 후 신호의 세기에 따라 ANGPTL3에 대한 항체의 결합능을 결정하였다.

염소 항-마우스 IgG(Sigma, M3534-1ML)를 pH 7.4 PBS 완충액(Shanghai BasalMedia, B320)을 사용하여 2 μg/mL의 농도로 희석하고, 50 μL/웰로 96-웰 마이크로플레이트(Corning, CLS3590-100EA)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 3시간 동안 방치하거나 4℃에서 밤새(16~18시간) 방치하였다. 액체를 버린 후, PBS로 희석된 5% 탈지유(BD, 232100) 차단 용액을 250 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션하거나 블로킹을 위해 4℃에서 밤새(16~18시간) 방치하였다. 블로킹이 끝난 후, 차단 용액은 버리고, 플레이트를 PBST 완충액(0.05% Tween-20을 함유하는 pH 7.4 PBS)으로 3회 세척한 후, 샘플 희석액(1% BSA를 함유하는 pH 7.4 PBS)을 사용하여 0.5 μg/mL로 희석한 인간 ANGPTL3(17-170)-mFc(이의 서열은 서열번호 3에 제시됨)를 50 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 마이크로플레이트의 반응 용액을 버렸다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, 샘플 희석액을 이용하여 상이한 농도로 희석한 시험 항체를 50 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 샘플 희석액으로 희석된 염소 항-인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, 109-035-003)를 50 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, TMB 발색 기질(KPL, 52-00-03)을 50 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2~5분 동안 인큐베이션하고, MH₂SO₄를 50 μL/웰로 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 VersaMax 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 기록하고, ANGPTL3 항원 단백질에 대한 항-ANGPTL3 항체의 결합에 대한 EC₅₀ 값을 계산하였다. 실험 결과를 표 3에 나타내었다.

스트렙타비딘(Sigma, S4762-5MG)을 pH 7.4 PBS 완충액(Shanghai BasalMedia, B320)을 사용하여 3 μg/mL의 농도로 희석하고, 50 μL/웰로 96-웰 마이크로플레이트(Corning, CLS3590-100EA)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 3시간 동안 방치하거나 4℃에서 밤새(16~18시간) 방치하였다. 액체를 버린 후, PBS로 희석된 5% 탈지유(BD, 232100) 차단 용액을 250 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션하거나, 블로킹을 위해 4℃에서 밤새(16~18시간) 방치하였다. 블로킹이 끝난 후, 차단 용액은 버리고, 플레이트를 PBST 완충액(0.05% Tween-20을 함유하는 pH 7.4 PBS)으로 3회 세척한 후, 샘플 희석액(1% BSA를 함유하는 pH 7.4 PBS)을 사용하여 0.5 μg/mL로 희석한 비오틴-표지된 마우스 ANGPTL3(17-455)-His(이의 서열은 서열번호 5에 제시됨), 시노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His(이의 서열은 서열번호 7에 제시됨), 및 랫트 ANGPTL3(17-455)-His(이의 서열은 서열번호 8에 제시됨)를 50 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 마이크로플레이트의 반응 용액을 버렸다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, 샘플 희석액을 사용하여 상이한 농도로 희석한 시험 항체를 50 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 샘플 희석액으로 희석된 HRP-표지된 염소 항-마우스 2차 항체(Jackson Immuno Research, 115-035-003) 또는 염소 항-인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, 109-035-003) 또는 마우스 HRP/항-M13-접합된 2차 항체(Sino Biological, Cat. No. 11973-MM05-100, 파지 스크리닝에 사용됨)를 50 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, TMB 발색 기질(KPL, 52-00-03)을 50 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2~5분 동안 인큐베이션하고, MH₂SO₄를 50 μL/웰로 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 VersaMax 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 기록하고, ANGPTL3 항원 단백질에 대한 항-ANGPTL3 항체의 결합에 대한 EC₅₀ 값을 계산하였다. 실험 결과를 표 2에 나타내었다. 결과는 본 개시내용의 항-ANGPTL3 항체가 상이한 종의 ANGPTL3 단백질에 결합할 수 있음을 나타낸다.

표 2. 상이한 종의 ANGPTL3 단백질에 대한 항-ANGPTL3 항체의 결합에 대한 ELISA 검정

4.2. ANGPTL3 항원 단백질에 대한 항-ANGPTL3 항체의 결합에 대한 HTRF 검정

항원에 대한 항-ANGPTL3 항체의 결합 활성을 측정하기 위해 HTRF 검정을 또한 사용하였다. HTRF 시약 스트렙타비딘-Tb 크립타타(cryptata)(Cisbio, 610SATLA)에 비오틴 표지 키트(Dojindo China, LK03)로 표지된 HIS 태그(인간 ANGPTL3(17-460)-His, 마우스 ANGPTL3(17-455)-His, 시노몰구스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His, 및 랫트 ANGPTL3(17-455)-His)을 갖는 ANGPTL3 항원을 결합시키고, 항체를 첨가한 후, 항체를 HTRF 시약 Pab 항-마우스 IgG-XL665(Cisbio, 61PAMXLA) 및 안지오포이에틴-유사 단백질 3에 결합시켰다. 신호의 강도는 안지오포이에틴-유사 단백질 3에 대한 항체의 결합 활성을 결정하기 위해 사용하였다.

4 μg/mL 비오틴-표지된 인간 ANGPTL3(17-460)-His(이의 서열은 서열번호 1에 제시됨), 마우스 ANGPTL3(17-455)-His(이의 서열은 서열번호 5에 제시됨), 시노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His(이의 서열은 서열번호 7에 제시됨), 및 랫트 ANGPTL3(17-455)-His(이의 서열은 서열번호 8에 제시됨)를 희석제(1% BSA를 함유하는 pH 7.4 PBS)를 사용하여 제조하고, 384-웰 플레이트(PerkinElmer, optiplatte-384)에 5 μL/웰로 첨가한 다음, HTRF 시약 스트렙타비딘-Tb 크립타타 및 Pab 항-마우스 IgG-XL665의 혼합물을 5 μL/웰로 첨가하고, 마지막으로 샘플 희석제를 이용하여 상이한 농도로 희석시킨 시험 항체를 10 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. HTRF 모듈에서 PHERAstar FS(BMG LabTECH)를 이용하여 값을 기록하였고, 안지오포이에틴-유사 단백질 3에 대한 항-ANGPTL3 항체의 결합에 대한 EC50 값을 계산하였다. 실험 결과를 표 3에 나타내었다. 결과는 본 개시내용의 항체가 모두 인간, 마우스, 시노몰구스 원숭이, 랫트 및 다른 종의 ANGPTL3 항원에 대해 양호한 결합 활성을 갖는다는 것을 보여준다.

표 3. ANGPTL3 단백질에 대한 항-ANGPTL3 항체의 결합에 대한 HTRF 검정

4.3. 항-ANGPTL3 항체에 의한 LPL 억제에 대한 효소 활성 검정

LPL의 효소 활성 검출 실험은 ANGPTL3 단백질에 의한 LPL 효소의 억제를 차단하는데 있어서 항-ANGPTL3 항체의 활성을 측정하기 위해 사용하였다.

소 LPL(Sigma, L2254-5KU)을 희석 완충액(pH 7.4 PBS + 2 mg/mL BSA)을 이용하여 12.5 단위로 희석하고 96-웰 플레이트(Corning, 3603)에 25 μL/웰로 첨가한 다음, 샘플 희석액을 이용하여 상이한 농도로 희석한 시험 항체를 25 μL/웰로 첨가한 다음, 27.6 μg/mL ANGPTL3 단백질(인간 ANGPTL3(17-170)-Flag-His(이의 서열은 서열번호 2에 제시됨), 마우스 ANGPTL3(17-455)-His(이의 서열은 서열번호 5에 제시됨), 시노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His(이의 서열은 서열번호 7에 제시됨), 및 랫트 ANGPTL3(17-455)-His(이의 서열은 서열번호 8에 제시됨)를 25 μL/웰로 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 진탕기 상에서 잘 진탕하고 37℃ 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 희석 완충액을 이용하여 희석된 20 μΜ 기질(Sigma, 30058-10MG-F)을 25 μL/웰로 첨가하고, 96-웰 플레이트를 진탕기에서 잘 진탕시키고, 37℃ 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 판독은 Flexstation3 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 Ex535/Em612에서 실시하였다. 농도 및 상응하는 형광 데이터를 Graphpad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 처리하고, IC₅₀을 계산하였다. 실험 결과를 표 4에 나타내었다. 결과는 본 개시내용의 항체가 LPL 효소에 대한 우수한 억제 효과를 가짐을 보여준다.

표 4. 상이한 종의 ANGPTL3에 의한 LPL의 억제를 차단하는 항-ANGPTL3 항체의 활성

4.4. 항-ANGPTL3 항체 및 ANGPTL3 단백질의 비아코어 검정

인간, 원숭이, 랫트 및 마우스 ANGPTL3에 대한 시험 항-ANGPTL3 항체의 친화도를 측정하기 위해 비아코어를 사용하였다. 방법은 다음과 같다:

단백질 A 바이오센서 칩(Cat. # 29127556, GE)을 사용하여 특정 양의 시험 항체를 친화도-포획한 다음, 특정 농도의 인간, 원숭이, 랫트 및 마우스 ANGPTL3 항원(인간-ANGPTL3(R&D, 3829-AN), 마우스 ANGPTL3(17-455)-His(이의 서열은 서열번호 5에 제시됨), 시노몰거스 원숭이 ANGPTL3(17-460)-His(이의 서열은 서열번호 7에 제시됨), 및 랫트 ANGPTL3(17-455)-His(이의 서열은 서열번호 8에 제시됨)을 칩의 표면 위로 흐르도록 하였다. 반응 신호를 비아코어 T200 기기를 사용하여 실시간으로 검출하여 결합 및 해리 곡선을 수득하였다. 각 주기에서 해리가 완료된 후, 바이오칩을 세척하여 pH가 1.5인 글리신-염산 재생 용액(Cat. # BR-1003-54, GE)을 이용하여 재생시켰다. 실험을 위한 러닝 완충액은 1× HBS-EP 완충액(Cat. # BR-1001-88, GE)이었다. 친화성 값을 수득하기 위해 (1:1)Langmuir 모델과 함께 GE 비아코어 T200 평가 소프트웨어(버전 3.0)를 사용하여 실험으로부터 수득한 데이터에 대해 맞춤을 실시하였다. 실험 결과를 표 5에 나타내었다. 결과는 본 개시내용의 항-ANGPTL3 항체가 인간, 시노몰구스 원숭이, 랫트 및 마우스 ANGPTL3 항원에 높은 친화도로 결합할 수 있음을 보여준다.

표 5. 항-ANGPTL3 항체 및 ANGPTL3 단백질에 대한 비아코어 검정의 결과

실시예 5: 랫트에서의 항-ANGPTL3 항체의 약력학적 평가

5.1. 랫트에서의 항체 P8BG의 지질 저하 실험

실험용 SD 랫트(4주령 SD 랫트, SPF, 약 100 g, 수컷, Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 구입함; 인증 번호 20170005013017, SCXK(Shanghai) 2017-0005)를 1주 동안 실험실 조건(12/12시간 명/암 주기, 온도 23±1℃, 습도 40~50%)에 적응시키고, 동물에게 모두 표준 멸균 마우스 사료를 먹이고 먹이 및 물에 대해 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 실험 시작 7일 전, 동물을 4시간 동안 금식시킨 후, 혈액을 안와(orbit)에서 수집하고, 3500 RPM에서 15분 동안 원심분리하고, 혈청을 수집하였다. 혈청 중 지질 농도(트리글리세리드)는 ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 결정하였다. 랫트를 트리글리세리드 수준(음성 대조군으로서 비-관련 동형 인간 IgG 단백질(이하 hIgG), 에비나쿠맙(이의 서열 구조에 대해서, WHO 약물 정보의 에비나쿠맙 서열, Vol. 29, No. 3, 2015를 참조) 3.5 mpk 군, 에비나쿠맙 7 mpk 군, P8BG 3.5 mpk 군, P8BG 1.75 mpk 군, 및 P8BG 7 mpk 군)에 의해 6개의 군으로 나누고, 한 번 피하 주사하였다. 주사 후 1, 5, 9, 13 및 16일차에, 이들 군의 랫트를 4시간 동안 금식시킨 후, 혈액을 수집하고 혈청을 분리하였다. 혈청 중 지질 농도(트리글리세리드)는 ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 결정하였다. 실험 데이터는 평균±표준편차(평균±SEM)로 표현하고 Graphpad Prism5 소프트웨어를 이용하여 플롯팅하였으며, 통계분석은 TTEST를 이용하여 실시하였다.

실험 결과를 도 1 및 표 6에 나타내었다. 음성 대조군과 비교하여, 투여 1일 후 각 처리군의 트리글리세리드 수준이 감소하였으며, 에비나쿠맙 3.5 mpk 군을 제외한 군에서 통계적 차이가 관찰되었다. 실험 동안, P8BG 7 mpk 군의 트리글리세리드 수준은 최대 83.7% 감소하였고, P8BG 3.5 mpk 군의 트리글리세리드 수준은 최대 81.8% 감소하였으며, P8BG 1.75 mpk 군의 트리글리세리드 수준은 최대 68.7% 감소하였고; 투여 5일 후, P8BG 3.5 mpk 군, P8BG 1.75 mpk 군, 및 P8BG 7 mpk 군의 트리글리세리드 수준의 감소 사이에는 여전히 통계적 차이가 있는 반면, 에비나쿠맙 3.5 mpk 군 및 에비나쿠맙 7 mpk 군의 감소 사이에는 통계적 차이가 없었고; 투여 9일 후, P8BG 7 mpk 군 및 P8BG 3.5 mpk 군의 감소 사이에는 통계적 차이가 여전히 있었다. 이는 동일한 용량에서 P8BG가 에비나쿠맙 보다 더 우수하고 더 지속적인 트리글리세리드 저하 효과를 가짐을 나타낸다. 또한, 각 군의 동물의 체중은 실험하는 동안 정상이었다.

표 6. 랫트에서 혈청 트리글리세리드에 대한 항체 P8BG의 효과

(참고: 최대 Inh%는 음성 대조군의 TG에 대한 지질 수준의 최대 백분율 감소를 나타내며; mpk는 mg/kg를 나타낸다.)

5.2. 고지방 고콜레스테롤 섭취 c57bl/6 마우스에서 혈장 지질 농도에 대한 항-ANGPTL3 항체의 생체내 효과의 결정

c57bl/6 마우스를 케이지 내에 케이지당 마우스 다섯마리씩(4주령 c57bl/6 마우스, SPF, 약 16~18 g, 수컷, Shanghai Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 구입함; 인증 번호 201913812, SCXK(Jiangsu) 2016-0010) 보관하였다. 마우스를 실험실 조건(12/12시간 명암 주기, 온도 23±1℃, 습도 40~50%)에 4주 동안 적응시키고, 동물에게 모두 일반 사료를 먹이고 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 사전 혈액 수집 5일 후, 일반 사료를 고지방 고콜레스테롤 사료(D12079B, Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.로부터 구입함)로 변경하여 실험이 끝날 때까지 마우스에 사료를 공급하였다. 실험 시작 8일 전, 동물을 4시간 동안 금식시킨 후, 혈액을 안와에서 수집하고, 8000 RPM에서 2분 동안 원심분리하고, 혈장을 수집하였다. 혈장 중 지질 농도는 ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 결정하였다. 마우스를 트리글리세리드 수준별로 11마리로 구성된 4개 군(hIgG 음성 대조군, 에비나쿠맙 25 mpk 군, P8BG 25 mpk 군, 및 P8BG 5 mpk 군)으로 나누어 주 1회 피하주사하여 총 8회 투여를 실시하였다. 실험 시작 후 2, 3, 5, 7, 9, 10 및 11주차에, 각 군의 마우스를 4시간 동안 금식시킨 후, 안와에서 혈액을 수집하고, 혈장을 수집하였다. 혈장 내의 지질 농도(트리글리세리드(TG), 총 콜레스테롤(TC) 및 LDL 콜레스테롤(LDL-C))를 ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 결정하였다. 실험 데이터는 평균 ± 표준편차(평균±SEM)로 표현하고 Graphpad Prism5 소프트웨어를 이용하여 플롯팅하였으며, 통계분석은 TTEST를 이용하여 실시하였다.

결과는 표 7-9 및 도 2-4에 나타내었다. hIgG 음성 대조군과 비교하여, P8BG 25 mpk 군은 실험 시작 후 2, 3, 5 및 7주에 TG, TC 및 LDL-C 수준에서 유의적으로 감소하였고; 에비나쿠맙 25 mpk 군 및 P8BG 5 mpk 군은 실험 시작 3, 5 및 7주 후에 TG, TC 및 LDL-C 수준에서 감소하였다. 실험 시작 9주 후, 2개 군인 P8BG 25 mpk 군 및 P8BG 5 mpk 군만이 hIgG 음성 대조군에 비해 트리글리세리드 수준의 유의한 감소를 보였다. 에비나쿠맙 25 mpk 군과 비교하여, P8BG 25 mpk 군은 실험의 2, 3 및 9주 차에 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준에서 유의하게 감소하였고; 에비나쿠맙 25 mpk 군과 비교하여, P8BG 25 mpk 군은 실험의 2 및 9주 차에 LDL-C 수준에서 유의하게 감소하였다. 1주부터 11주까지의 전체 실험 주기에 걸쳐, 에비나쿠맙 25 mpk 군의 TG 수준은 초기 TG와 비교하여 최소 40.5±2.3 - 32.60% 감소하였고; P8BG 25 mpk 군의 TG는 초기 TG와 비교하여 최소 21.1±1.3 - 64.90% 감소하였다. 이는 항체 P8BG가 에비나쿠맙보다 더 우수하고 더 지속적인 지질 저하 효과를 가짐을 나타낸다.

표 7. c57bl/6 마우스에서 혈장 TG에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과

(참고: 최대 Inh%는 초기 TG에 비해 지질 수준의 최대 백분율 감소를 나타냄)

표 8. c57bl/6 마우스에서 혈장 LDL에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과

(참고: 최대 Inh%는 음성 대조군의 LDL에 비해 지질 수준의 최대 백분율 감소를 나타냄)

표 9. c57bl/6 마우스에서 혈장 TC에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과

(참고: 최대 Inh%는 음성 대조군의 TC에 비해 지질 수준의 최대 백분율 감소를 나타냄)

5.3. APOE 마우스에서 혈장 지질 농도에 대한 항-ANGPTL3 항체의 생체내 효과의 결정

APOE 마우스를 케이지 내에 케이지당 마우스 두마리씩(8주령 APOE 마우스, SPF, 약 22 g, 수컷, Shanghai Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 구입함; 인증 번호 201917260, SCXK(Jiangsu) 2016-0010) 보관하였다. 마우스를 실험실 조건(12/12시간 명암 주기, 온도 23±1℃, 습도 40~50%)에 4주 동안 적응시키고, 동물에게 모두 고지방 사료(D12108C)를 먹이고 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 실험 시작 7일 전, 동물을 4시간 동안 금식시킨 후, 혈액을 안와에서 수집하고, 8000 RPM에서 2분 동안 원심분리하고, 혈장을 수집하였다. 혈장 중 지질 농도는 ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 결정하였다. 마우스를 트리글리세리드 수준별로 8마리로 구성된 5개 군(hIgG 음성 대조군, 에비나쿠맙 10 mpk 군, 에비나쿠맙 5 mpk 군, P8BG 10 mpk 군, 및 P8BG 5 mpk 군)으로 나누어 1회 피하주사하였다(각 군에 대한 용량은 표 6을 참조). 투여 후 1, 7 및 11일차에, 이들 군의 랫트를 4시간 동안 금식시킨 후, 혈액을 안와에서 수집하고 혈장을 수집하였다. 혈장의 지질 농도(트리글리세리드 및 HDL 콜레스테롤)를 ADVIA 2400 화학 시스템(Siemens)을 사용하여 결정하였다. 실험 데이터는 평균 ± 표준편차(평균±SEM)로 표현하고 Graphpad Prism5 소프트웨어를 이용하여 플롯팅하였으며, 통계분석은 TTEST를 이용하여 실시하였다.

실험 결과를 도 5 및 도 6 및 표 10에 나타내었다. hIgG 음성 대조군과 비교하여, 투여 1일 후, 각각의 처리군은 트리글리세리드 수준의 감소를 보였다. 에비나쿠맙(10 mpk) 군의 트리글리세리드 수준은 초기 TG 값 대비 최소 65.6±5.4 mg/dL - 46.2% 감소하였고; 에비나쿠맙(5 mpk) 군의 트리글리세리드 수준은 초기 TG 값 대비 최소 71.8±3.3 mg/dL - 42.1% 감소하였고; P8BG(10 mpk) 군의 트리글리세리드 수준은 초기 TG 값 대비 최소 33.3±2.2 mg/dL - 72.9% 감소하였으며; P8BG(5 mpk) 군의 트리글리세리드 수준은 초기 TG 값 대비 최소 37.0±1.7 mg/dL - 70.2% 감소하였다. 또한, 실험 결과는 투여 1일 후 P8BG 10 mpk군의 혈장 HDL-C 수준이 증가하고, 에비나쿠맙 10 mpk군의 혈장 HDL-C 수준이 감소하는 것으로 나타났다. 하지만, 지질 저하 실험에서, HDL-C 수준의 감소는 지질 수준이 감소되었을 때 정상적으로 바람직하지 않다.

표 10. APOE 마우스에서 혈장 트리글리세리드에 대한 항-ANGPTL3 항체의 효과

실시예 6: 항-ANGPTL3 항체의 약동학적 평가

6.1. 마우스에서 항-ANGPTL3 항체의 약동학적 실험

무게가 18~24 g인 C57BL/6 마우스(Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로부터 구입)를 3일 이상 실험 조건(12/12시간 명암 주기, 온도 16~26℃, 상대습도 40~70%)에 적응시켰다. 적응 동안, 마우스는 사료와 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 실험 시작 전날, C57BL/6 마우스에 번호를 매기고 3마리의 군으로 무작위 배정하였다. 실험 당일, 이들 마우스 군에 시험 약물 P8BG 및 에비나쿠맙을 정맥내 주사하였다. 투여 용량은 10 mg/kg이었고, 주입 부피는 5 mL/kg이었다.

투여 전 및 투여 후 5분, 8시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일 및 28일에 투여군으로부터 0.1 mL의 전혈 샘플을 수집하고, 항응고제를 첨가하지 않았다. 채취된 혈액 샘플을 4℃에서 30분 동안 방치하고 1000 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액(혈청)을 EP 튜브에 옮겨 -80℃에서 보관하였다.

혈청 내 항체 농도를 ELISA로 측정하고, Winnolin 소프트웨어에 의해 시험 약물에 대한 약동학적 매개변수를 계산하였다. 수득한 주요 약동학적 결과를 표 11 및 도 7에 나타내었다. 실험 결과는 본 개시내용의 항체 P8BG가 양성 대조군 에비나쿠맙보다 마우스에서 더 높은 반감기를 가짐을 나타낸다.

표 11. 마우스에서 항-ANGPTL3 항체의 약동학

(참고: AUC0-∞: 혈장 약물 농도-시간 곡선 아래 면적; t_1/2(h): 반감기(시간); t_1/2(d): 반감기(일); i.v.: 정맥내 주사.)

6.2. 시노몰구스 원숭이에서 항-ANGPTL3 항체의 약동학적 평가

3~4 kg 무게의 시노몰구스 원숭이(Guangdong Qianyan Biological Science and Technology Co., Ltd.로부터 구입함)를 사용하였다. 동물은 실험에 사용하기 전에 적어도 14일간 격리하고 적응을 위한 먹이를 공급 받았다. 동물은 스테인레스 스틸 케이지에 유지하고, 케이지 당 2마리 이하의 동물을 두었다. 동물실의 실온은 18℃~26℃로 조절하고, 상대 습도는 40%~70%로 하였다. 동물은 12시간 명암 주기하에 유지하였다. 실험 동안 동물은 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 6마리의 시노몰구스 원숭이를 생화학적 지표에 따라 3마리의 2개 군으로 무작위화 배정하였다. 이들 군에 시험 약물 P8BG 및 에비나쿠맙을 피하 주사하였다. 투여 용량은 10 mg/kg이었고, 주입 부피는 2 mL/kg이었다.

군 분리 후에, 동물은 밤새 금식하였다. 투여 전 및 투여 시작 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 1일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일 및 56일에 하지 정맥으로부터 약 2 mL의 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플을 분리 겔을 함유하는 혈액 수집 튜브에 넣고, 실온에서 30분 동안 방치하고, 1000 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 수집하고, 2개의 깨끗한 EP 튜브에 분취하고, -70℃에서 일시적으로 보관하였다(위의 절차는 혈액을 채취한 후 2시간 이내에 완료하였다). 혈청 내 항체 농도를 ELISA로 측정하고, Winnolin 소프트웨어에 의해 시험 약물에 대한 약동학적 매개변수를 계산하였다. 수득한 주요 약동학적 결과를 표 12 및 도 8에 나타내었다. 실험 결과는 본 개시내용의 항체 P8BG가 양성 대조군 에비나쿠맙보다 시노몰구스 원숭이에서 더 높은 반감기를 가짐을 나타낸다.

표 12. 시노몰구스 원숭이에서 항-ANGPTL3 항체의 약동학

(참고: AUC 0-∞: 혈장 약물 농도-시간 곡선 아래 면적; t_1/2(h): 반감기(시간); t_1/2(d): 반감기(일); sc.: 피하 주사.)

실시예 7: 항체의 예시적인 약학적 조성물(제제)의 제조 방법

단계 1: 항-ANGPTL3 항체를 함유하는 스톡 용액을 항-ANGPTL3 항체 및 안정화제를 사용하여 제조하였다. 여과 후, 공정 중 대조군 샘플을 취하고 분석하였다. 분석은 스톡 용액이 무균인 것으로 나타났다. 스톡 용액을 0.22 μm PVDF 필터에 통과시키고, 여과액을 수집하였다.

단계 2: 충전량을 조정하고, 충전(충전량 및 포장재를 결정하도록 함)을 실시하고 마개로 막았다. 공정 중 대조군 샘플은 충전 시작 시, 충전 동안 및 충전 종료 시에 채취하여 충전량의 차이에 대해 검출하였다.

단계 3: 캐핑(capping) 기계를 시작하고, 알루미늄 뚜껑을 씌우고, 캐핑을 실시하였다.

단계 4: 부정확한 충진량과 같이 제품에 불량이 없음을 확인하기 위해 육안 검사를 실시하였다. 바이알 표지를 인쇄하여 바이알에 붙이고; 상자 표지를 인쇄하고, 상자를 접고, 포장을 실시하고, 상자 표지를 상자에 붙였다.

실시예 7-13에서 사용된 항-ANGPTL3 항체는 항체 P8BG 였으며, 이의 중쇄 서열은 서열번호 21에 제시되고 경쇄 서열은 서열번호 22에 제시된다.

실시예 8: 항-ANGPTL3 항체 제제에 대한 pH 값의 스크리닝

다음의 완충액을 제제화하고, 항-ANGPTL3 항체 농도가 1.0 mg/mL인 항체 제제를 제조하였다. 샘플의 용융 온도(Tm) 및 열분해 개시 온도(T개시)를 측정함으로써, 상이한 pH 조건하에서의 항-ANGPTL3 항체의 열 안정성을 조사하였다. 샘플의 응집 온도(T응집) 및 입자 크기(반지름)를 측정함으로써, 상이한 pH 조건하에서의 항-ANGPTL3 항체의 콜로이드 안정성을 조사하였다.

1) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 4.2

2) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 4.6

3) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 5.0

4) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 5.4

5) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 5.8

6) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 6.2

7) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 6.6

8) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 7.0

9) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 7.4

10) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 7.8

11) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 8.2

12) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 8.6

표 13. 항-ANGPTL3 항체의 pH 값 스크리닝 결과

(참고: %PD는 분산 계수(dispersion coefficient)를 나타내고, 값이 작을수록 입자 크기 분포가 더 균일해짐; N/A는 해당 없음을 나타냄)

결과는: 5.0±0.4의 pH에서 항-ANGPTL3 항체의 T응집 및 T개시 값이 상대적으로 높고; 6.2±0.4의 pH에서 입자 크기가 상대적으로 작았으며, 이는 분포가 더 균일함을 시사하고; 상대적으로 높은 Tm1 값은 항체가 5.0±0.4 및 6.2±0.4의 pH에서 상대적으로 우수한 열 안정성 및 콜로이드 안정성을 가짐을 나타낸다.

실시예 9: 항-ANGPTL3 항체 제제에 대한 완충제 시스템의 스크리닝 및 확인

9.1. pH 6.0 완충제 시스템의 스크리닝

10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트 pH 6.0 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.0 완충제 시스템를 선택하여 50 mg/mL 항-ANGPTL3 항체를 함유하는 제제를 제조하고, 고온(40℃) 및 실온(25℃) 안정성 연구를 위해 샘플을 취하였다:

1) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트 pH 6.0

2) 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.0

표 14. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 6.0) 스크리닝의 안정성 결과 1

(참고: 이 표는 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 6.0) 스크리닝의 시간-0 안정성 결과를 나타냄)

표 15. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 6.0) 스크리닝의 안정성 결과 2

(참고: 1W는 1주를 나타내고; 입자 크기는 콜로이드 안정성을 반영하며; %PD는 분산 계수를 나타냄)

표 16. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 6.0) 스크리닝의 안정성 결과 3

(참고: 1W는 1주를 나타냄)

결과는: 동일한 조사 조건하에서, 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트 pH 6.0 완충제 시스템에서보다 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.0 완충제 시스템에서 더 높은 T응집 값, 더 작은 입자 크기 및 더 낮은 응집체 함량을 가짐을 보여주며, 이는 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.0 완충제 시스템에서 더 우수한 안정성을 가짐을 나타낸다.

9.2. pH 6.6 완충제 시스템의 스크리닝

10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트 pH 6.6 및 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.6 완충제 시스템를 선택하여 50 mg/mL 항-ANGPTL3 항체를 함유하는 제제를 제조하고, 고온(40℃) 및 실온(25℃) 안정성 연구를 위해 샘플을 취하였다:

1) 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트 pH 6.6

2) 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.6

표 17. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 6.6) 스크리닝의 안정성 결과 1

(참고: 이 표는 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 6.6) 스크리닝의 시간-0 안정성 결과를 나타냄)

표 18. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 6.6) 스크리닝의 안정성 결과 2

표 19. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 6.6) 스크리닝의 안정성 결과 3

(참고: 1W는 1주를 나타냄)

결과는: 동일한 조사 조건하에서, 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트 pH 6.6 완충제 시스템에서보다 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.6 완충제 시스템에서 더 낮은 T개시 값, 더 높은 T응집 값, 및 더 큰 입자 크기를 갖지만, 상대적으로 더 낮은 응집체 함량, 상대적으로 더 높은 단량체 함량, 및 상대적으로 더 높은 주요 피크 함량을 갖는다는 것을 보여준다. 전반적으로, 항-ANGPTL3 항체는 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.6 완충제 시스템에서 더 우수한 안정성을 갖는 것으로 간주된다.

9.3. pH 4.6 완충제 시스템의 스크리닝

10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 4.6 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 4.6 완충제 시스템를 선택하여 50 mg/mL의 단백질을 함유하는 항체 제제를 제조하고, 샘플을 고온(40℃) 및 실온(25℃) 안정성 연구를 위해 취하였다:

1) 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 4.6

2) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 4.6

표 20. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 4.6) 스크리닝의 안정성 결과 1

(참고: 이 표는 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 4.6) 스크리닝의 시간-0 안정성 결과를 나타내며; N/A는 해당 없음을 나타냄)

표 21. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 4.6) 스크리닝의 안정성 결과 2

(참고: 1W는 1주를 나타내고; 입자 크기는 콜로이드 안정성을 반영하고; %PD는 분산 계수를 나타내며; N/A는 해당 없음을 나타냄)

표 22. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 4.6) 스크리닝의 안정성 결과 3

(참고: 1W는 1주를 나타냄)

결과는: 동일한 조사 조건하에서, 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 4.6 완충제 시스템에서보다 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 4.6 완충제 시스템에서 더 낮은 Tm₁ 값을 갖지만, 더 높은 T개시 값, 더 작은 입자 크기, 및 더 낮은 응집체 함량을 갖는다는 것을 보여주며, 이는 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 4.6 완충제 시스템에서 더 우수한 안정성을 가짐을 나타낸다.

9.4. pH 5.0 완충제 시스템의 스크리닝

10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 완충제 시스템를 선택하여 50 mg/mL 항-ANGPTL3 항체를 함유하는 제제를 제조하고, 샘플을 고온(40℃) 및 실온(25℃) 안정성 연구를 위해 취하였다:

1) 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0

2) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0

표 23. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 5.0) 스크리닝의 안정성 결과 1

(참고: 이 표는 완충제 시스템(pH 5.0) 스크리닝의 시간-0 안정성 결과를 나타내며; N/A는 해당 없음을 나타냄)

표 24. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 5.0) 스크리닝의 안정성 결과 2

표 25. 항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템(pH 5.0) 스크리닝의 안정성 결과 3

(참고: 1W는 1주를 나타냄)

결과는: 동일한 조사 조건하에서, 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0 완충제 시스템에서보다 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 완충제 시스템에서 더 높은 Tm₁ 값, 더 높은 T개시 값, 더 높은 T응집 값, 더 작은 입자 크기, 더 낮은 응집체 함량, 더 높은 단량체 함량, 및 더 높은 주요 피크 함량을 가짐을 보여주며, 이는 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 완충제 시스템에서 더 우수한 안정성을 가짐을 나타낸다.

항-ANGPTL3 항체 완충제 시스템 스크리닝의 결과는: 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 4.6, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 4.6 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 완충제 시스템에서 더 양호한 외관, 상대적으로 높은 Tm₁ 값, 상대적으로 높은 T응집 값, 및 상대적으로 높은 T개시 값을 갖지만, 40℃의 고온에서는 응집체 함량이 유의하게 증가하였고; 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.0 완충제 시스템에서 상대적으로 불량한 외관, 상대적으로 높은 Tm₁ 값, 상대적으로 높은 T응집 값, 및 상대적으로 높은 T개시 값을 가지며, 고온 조건하에서 응집체 함량의 유의한 증가가 없었음을 나타낸다. 완충제 시스템 스크리닝에 사용된 샘플이 혼합 샘플인 것을 감안하여, 단일클론 항체 샘플을 사용하여 완충제 시스템 확인을 실시하여 최종 pH 및 완충제 시스템를 추가로 확인하였다.

9.5. 항-ANGPTL3 항체 제제를 위한 완충제 시스템의 확인

10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.0, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 4.6, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 4.6, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 완충제 시스템를 선택하여 50 mg/mL 항-ANGPTL3 항체를 함유하는 제제를 제조하고, 샘플을 고온(60℃ 및 40℃) 안정성 연구를 위해 취하였다:

1) 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산, pH 6.0;

2) 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 4.6;

3) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, pH 4.6; 및

4) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, pH 5.0.

표 26. 항-ANGPTL3 항체 제제 완충제 시스템 확인의 결과 1.

(참고: h는 시간(들)을 나타내고, d는 일(들)을 나타내고, 입자 크기는 콜로이드 안정성을 반영하고; %PD는 분산 계수를 나타내고; NT는 시험되지 않음을 나타내며; 미완료는 불량한 샘플로 인한 기계적 검출 실패를 나타냄)

표 27. 항-ANGPTL3 항체 제제 완충제 시스템 확인의 결과 2.

(참고: h는 시간(들)을 나타내고; d는 일(들)을 나타내며; NT는 시험되지 않음을 나타냄)

결과는: 항-ANGPTL3 항체가 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 4.6 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 4.6 완충제 시스템에서보다 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.0 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 완충제 시스템에서 더 우수한 안정성을 가진다는 것을 보여주고; 여기서 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산 pH 6.0 완충제 시스템를 사용하고, 제제는 유백색이고, 폴리소르베이트 80을 첨가한 후, 외관은 개선되지 않았다.

실시예 10: 항-ANGPTL3 항체 제제에 대한 당 농도의 스크리닝

상이한 당 농도를 갖는 완충제 시스템 또는 항-ANGPTL3 항체 제제를 제조하기 위해 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 완충제 시스템를 선택하였다:

1) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, pH 5.0;

2) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 60 mg/mL 수크로스, pH 5.0;

3) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 70 mg/mL 수크로스, pH 5.0;

4) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 75 mg/mL 수크로스, pH 5.0;

5) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 80 mg/mL 수크로스, pH 5.0;

6) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 90 mg/mL 수크로스, pH 5.0; 및

7) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 80 mg/mL 수크로스, pH 5.0.

위의 1) 내지 7)은 모두 100 mg/mL의 항-ANGPTL3 항체를 함유하였다.

이들 샘플에 대한 삼투압 결과는 다음의 표에 나타나 있다:

표 28. 항-ANGPTL3 항체의 상이한 수크로스 농도에 대한 삼투압 결과

삼투압 결과에 따르면, 수크로스의 사용 가능한 농도는 60-90 mg/mL이고; 예를 들어, 75 mg/mL의 수크로스 농도를 사용하여 등장성 항-ANGPTL3 항체 제제를 제조하였다.

실시예 11: 항-ANGPTL3 항체 제제에 대한 당 농도의 스크리닝

100 mg/mL의 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL의 수크로스 및 상이한 농도의 폴리소르베이트 80을 함유하는 제제를 제조하기 위해 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트를 선택하고, 진탕, 동결-해동, 조명 및 고온 조건하에서 항체의 안정성을 조사하였다.

1) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80, 75 mg/mL 수크로스, 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, pH 5.0

2) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80, 75 mg/mL 수크로스, 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, pH 5.0

표 29. 상이한 계면활성제 농도를 갖는 제제에 대한 안정성 결과 1

(참고: h는 시간(들)을 나타내고; W는 주(들)을 나타내고; RT는 실온을 나타내고; 입자 크기는 콜로이드 안정성을 반영하고; %PD는 분산 계수를 나타내며; NT는 시험되지 않음을 나타냄)

표 30. 상이한 계면활성제 농도를 갖는 제제에 대한 안정성 결과 2

(참고: h는 시간(들)을 나타내고; W는 주(들)을 나타내며; RT는 실온을 나타냄)

결과는: 0.1 mg/mL 또는 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 함유하는 항-ANGPTL3 항체 제제에서, 진탕, 동결-해동, 조명 및 고온 조건하에서 안정성에서 유의한 차이가 없었음을 보여준다. 따라서, 항-ANGPTL3 항체 제제 중 폴리소르베이트 80에 대해 사용 가능한 농도 범위는 0.1 mg/mL 내지 0.4 mg/mL이다.

실시예 12: 제제의 pH가 안정성에 미치는 영향

75 mg/mL 수크로스, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체를 함유하는 제제를 제조하기 위해 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트를 선택하였고, 각각 5.0 및 5.4의 pH 값을 가지며, 진탕, 냉동-해동, 조명 및 고온 조건하에서 항체 제제의 안정성을 조사하였다.

1) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 75 mg/mL 수크로스, 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, pH 5.0

2) 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 75 mg/mL 수크로스, 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, pH 5.4

표 31. 제제의 pH가 안정성에 미치는 영향을 조사한 결과 1

(참고: h는 시간(들)을 나타내고; W는 주(들)을 나타내고; RT는 실온을 나타내고; 입자 크기는 콜로이드 안정성을 반영하며; %PD는 분산 계수를 나타냄)

표 32. 제제의 pH가 안정성에 미치는 영향을 조사한 결과 2

(참고: h는 시간(들)을 나타내고; W는 주(들)을 나타내고; RT는 실온을 나타냄)

결과는: 시간 0과 비교하여, pH 5.0 및 pH 5.4 제제가 진탕, 동결-해동, 조명 및 고온 조건하에서 단백질의 유사한 변화 경향을 나타냄을 보여준다. 따라서, 항-ANGPTL3 항체 제제에 대한 pH 범위는 5.0 내지 5.4인 것으로 결정되었다.

0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80은 항체의 안정성에 거의 영향을 미치지 않았으므로, 제제에서 폴리소르베이트 80에 대한 사용 가능한 농도 범위는 0.1 내지 0.4 mg/mL이고; 5.0 및 5.4의 pH 값은 항체의 안정성에 거의 영향을 미치지 않았으므로, 제제에서 사용 가능한 pH 범위는 5.0 내지 5.4이고; 항-ANGPTL3 항체의 농도는 100 mg/mL에서 결정되었다.

실시예 13: 대안적인 제조법

또한, 본 개시내용은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 제조법의 항-ANGPTL3 항체의 약학적 제제를 추가로 제공한다:

(1) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.0;

(2) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.0;

(3) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.0;

(4) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.2;

(5) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.2;

(6) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.2;

(7) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.4;

(8) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.4;

(9) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제 pH 5.4;

(10) 80 mg/mL, 100 mg/mL, 120 mg/mL 또는 150 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 75 mg/mL 수크로스, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제, pH 5.0 내지 5.4; 및

(11) 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 75 mg/mL, 80 mg/mL, 85 mg/mL 또는 90 mg/mL 수크로스, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제, pH 5.0 내지 5.4.

실험 결과는 위의 제조법의 항-ANGPTL3 항체 제제가 우수한 안정성을 가짐을 보여주며, 위의 제조법은 항-ANGPTL3 항체 약물의 제조에 적용될 수 있다.

Claims

항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 완충제를 포함하는 약학적 조성물로서,
완충제는 아세트산-소듐 아세테이트, 숙신산-소듐 숙시네이트, 히스티딘-염산, 및 시트르산-소듐 시트레이트 완충제 중 임의의 것으로부터 선택되고, 바람직하게는 아세트산-소듐 아세테이트 또는 숙신산-소듐 숙시네이트 완충제이고; 여기서 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 각각 제시되며; 경쇄 가변 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 각각 제시되는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
완충제는 pH가 4.0 내지 7.0, 바람직하게는 5.0 내지 5.4, 및 가장 바람직하게는 약 5.2인, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
완충제의 농도는 5 mM 내지 40 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 20 mM, 및 가장 바람직하게는 약 10 mM인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 10 mg/mL 내지 200 mg/mL, 바람직하게는 80 mg/mL 내지 120 mg, 및 가장 바람직하게는 약 100 mg/mL인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
계면활성제를 추가로 포함하고, 여기서 계면활성제는 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 더 바람직하게는 폴리소르베이트 80인, 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
계면활성제의 농도는 0.05 mg/mL 내지 0.6 mg/mL, 바람직하게는 0.1 mg/mL 내지 0.4 mg/mL, 및 더 바람직하게는 약 0.2 mg/mL인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
안정화제를 추가로 포함하고, 여기서 안정화제는 당이고; 바람직하게는 당은 수크로스, 트레할로즈, 만니톨 및 소르비톨로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더 바람직하게는 당은 수크로스인, 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
당의 농도는 60 mg/mL 내지 90 mg/mL, 바람직하게는 70 mg/mL 내지 80 mg/mL, 및 가장 바람직하게는 약 75 mg/mL인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 10 mg/mL 내지 200 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
(b) 5 mM 내지 30 mM 아세테이트 완충제,
(c) 60 mg/mL 내지 90 mg/mL 수크로스, 및
(d) 0.05 mg/mL 내지 0.6 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고,
여기서 약학적 조성물은 바람직하게는 pH가 4.5 내지 6.5이고, 더 바람직하게는 pH가 5.0 내지 5.4인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 약 100 mg/mL 항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
(b) 5 mM 내지 15 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제,
(c) 60 mg/mL 내지 90 mg/mL 수크로스, 및
(d) 0.1 mg/mL 내지 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고,
여기서 약학적 조성물은 바람직하게는 pH가 5.0 내지 5.4이고, 더 바람직하게는 pH가 약 5.2인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린, 키메라 또는 인간화 항체이고; 바람직하게는 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 FR 서열은 인간 생식계열 경쇄 및 중쇄 FR로부터 각각 유래되는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 17에 제시되거나 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 18에 제시되거나 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 포함하고, 여기서: 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 21에 제시되거나 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되거나 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 스톡 용액을 완충제 교환시키는 단계를 포함하고, 여기서 완충제는 바람직하게는 아세트산-소듐 아세테이트 완충제인, 방법.
항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제제로서,
동결건조된 제제는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 동결건조하여 수득하고; 바람직하게는 동결건조는 예비-동결, 1차 건조 및 2차 건조 단계를 순차적으로 포함하는, 동결건조된 제제.
항-ANGPTL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 재구성된 용액으로서,
재구성된 용액은 제15항에 따른 동결건조된 제제를 재구성하여 수득하는, 재구성된 용액.
용기를 포함하는 제조품(article of manufacture)으로서,
용기는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 또는 제15항에 따른 동결건조된 제제, 또는 제16항에 따른 재구성된 용액을 함유하는, 제조품.
질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서,
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 또는 제15항에 따른 동결건조된 제제, 또는 제16항에 따른 재구성된 용액의 용도로서;
바람직하게는, 질환 또는 장애는 고지혈증(hyperlipidemia), 고지질단백혈증(hyperlipoproteinemia), 이상지질혈증(dyslipidemia), 심혈관 질환 또는 장애(cardiovascular disease or disorder), 암 또는 종양, 비-신생물성 혈관신생-관련 질환 또는 장애(non-neoplastic angiogenesis-related disease or disorder), 및 염증성 질환 또는 장애 중 하나 이상으로부터 선택되고;
더 바람직하게는, 질환 또는 장애는 죽상경화성 이상지질혈증(atherosclerotic dyslipidemia), 당뇨병성 이상지질혈증(diabetic dyslipidemia), 고중성 지질혈증(hypertriglyceridemia), 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia), 킬로미크론 혈증(chylomicronemia), 혼합 이상지질혈증(mixed dyslipidemia), 지방이영양증(lipodystrophy), 지방위축(lipoatrophy), 죽상경화증(atherosclerosis), 동맥류(aneurysm), 고혈압(hypertension), 협심증(angina pectoris), 뇌졸중(stroke), 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 관상동맥 질환(coronary artery disease), 심근경색(myocardial infarction), 말초혈관 질환(peripheral vascular disease), 급성 췌장염(acute pancreatitis), 비알콜성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 혈당 이상(blood glucose abnormality), 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration), 중심 또는 분지 망막 정맥 폐쇄(central or branch retinal vein occlusion), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity), 관절염(arthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 및 건선(psoriasis) 중 하나 이상으로부터 선택되는, 용도.
질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서,
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 또는 제16항에 따른 재구성된 용액을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고;
바람직하게는, 질환 또는 장애는 고지혈증, 고지질단백혈증, 이상지질혈증, 심혈관 질환 또는 장애, 암 또는 종양, 비-신생물성 혈관신생-관련 질환 또는 장애, 및 염증성 질환 또는 장애 중 하나 이상으로부터 선택되고;
더 바람직하게는, 질환 또는 장애는 죽상경화성 이상지질혈증, 당뇨병성 이상지질혈증, 고중성 지질혈증, 고콜레스테롤 혈증, 킬로미크론 혈증, 혼합 이상지질혈증, 지방이영양증, 지방위축, 죽상경화증, 동맥류, 고혈압, 협심증, 뇌졸중, 뇌혈관 질환, 울혈성 심부전, 관상동맥 질환, 심근경색, 말초혈관 질환, 급성 췌장염, 비알콜성 지방간염(NASH), 혈당 이상, 연령-관련 황반 변성, 중심 또는 분지 망막 정맥 폐쇄, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 관절염, 류마티스 관절염(RA), 및 건선 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.