BR112021010414A2

BR112021010414A2 - Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo cd40, método para preparar uma preparação liofilizada, preparação liofilizada, uso das mesmas e produto que compreende um recipiente contendo as mesmas

Info

Publication number: BR112021010414A2
Application number: BR112021010414-3A
Authority: BR
Inventors: Jianjian Yang; Hao Li; Xun Liu; Jiahua JIANG
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2021-09-08
Also published as: AU2019388931A1; MX2021006360A; CA3121291A1; CN112839961A; WO2020108621A1; EP3939998A4; EP3939998A1; TW202021620A; KR20210097750A; JP2022513671A; CN112839961B

Abstract

composição farmacêutica compreendendo um anticorpo cd40, método para preparar uma preparação liofilizada, preparação liofilizada, uso das mesmas e produto que compreende um recipiente contendo as mesmas. a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo cd40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um tampão de ácido acético-acetato de sódio solução, e um uso do mesmo. a composição farmacêutica pode conter adicionalmente açúcar, um tensoativo não-iônico e outros excipientes. a composição farmacêutica da presente invenção mostra boa estabilidade de anticorpo.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO UM ANTICORPO CD40, MÉTODO PARA PREPARAR UMA PREPARAÇÃO LIOFILIZADA, PREPARAÇÃO LIOFILIZADA, USO DAS MESMAS E PRODUTO QUE COMPREENDE UM

RECIPIENTE CONTENDO AS MESMAS

[001] Este pedido reivindica prioridade para o pedido de patente chinês CN201811448238.5, depositado em 30 de novembro de 2018, cujos conteúdos são incorporados em sua totalidade no presente documento.

CAMPO DA TÉCNICA

[002] A presente divulgação se refere ao campo de preparações farmacêuticas, e se refere especificamente a uma composição farmacêutica contendo um anticorpo CD40 e um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e a um uso da mesma como um medicamento.

ANTECEDENTES

[003] Como uma das glicoproteínas expressas na superfície celular, CD40 é uma glicoproteína intrínseca membranar do tipo I com um peso molecular de 48 kDa que pertence à superfamília do receptor de fator de necrose tumoral (TNFR) e desempenha um papel crucial no sistema imunológico. A mesma é expressa em uma variedade de células imunes, como células B, células dendríticas, monócitos e macrófagos. Quando transduções de sinal são mediadas por CD40, células apresentadoras de antígeno especializadas serão ativadas. O ligante natural de CD40 é designado CD154 ou CD40L e é conhecido por ser predominantemente expresso em linfócitos T maduros. A transdução de sinalização mediada por CD40L pode acionar diversos eventos biológicos celulares, incluindo ativação e proliferação de células imunes, e produção de citocinas e quimiocinas. A sinalização de CD40 é extremamente crucial para respostas imunes dependentes de célula T, especialmente, no contexto de ambiente tumoral, em que células dendríticas estimuladas por CD40 são capazes de ativar células T efetoras específicas de tumor, que têm o potencial de erradicar células tumorais.

[004] A expressão de CD40 foi encontrada em uma variedade de células normais e células tumorais incluindo linfócitos B. Por exemplo, melanoma é um dos tumores com expressão de CD40, enquanto 30% a 70% de tumores sólidos também expressam CD40. A ativação de CD40 é conhecida por acionar de modo eficaz respostas antitumorais (Tong et al, Cancer Gene Therapy, 2003, 10: 1 a 13), incluindo ativação imune de respostas de célula T específicas de tumor, apoptose direta de tumores positivos de CD40 e reação humoral de ADCC causada por estimulação. Além disso, a erradicação tumoral observada é fortemente associada à ocorrência de linfócitos T citotóxicos específicos de tumor. Ademais, também não deve ser ignorado que a administração sistêmica de anticorpos CD40 se associa, em geral, a uma variedade de efeitos colaterais, como síndrome de choque e síndrome de liberação de citocinas (van Mierlo et al, Proc. Nat1. Acad. Sci. EUA, 2002, 99: 5.561 a 5.566).

[005] Atualmente, diversas empresas farmacêuticas internacionais estão desenvolvendo anticorpos monoclonais contra CD40 conforme descrito acima, o que estimula especificamente a ativação imune, maximizando a própria resposta de sistema imunológico dos pacientes a tumores, alcançando, desse modo, o propósito de exterminar células tumorais. Patentes relacionadas incluem CN1198647, CN1369015, CN1582165, CN100430419, CN101014386, CN101237882, CN101289510, CN101490086, CN103842382, CN104918957, WO2002028904, WO2011123489, WO2012149356, WO2013034904, WO2015091853, WO2016196314, WO2017040932 e WO2017004006 etc. Até o momento, anticorpos anti-CD40 da Pfizer (produtos relevantes foram licenciados para Roche), Alligator e outras empresas observaram bons efeitos de extermínio tumoral em modelos animais pré-clínicos.

[006] WO2018219327 (PCT/CN2018/089252) fornece anticorpos anti-CD40 com alta afinidade, alta seletividade e alta atividade biológica para uso ao estimular anticorpos CD40.

[007] Entretanto, fármacos de anticorpo com grandes pesos moleculares e estruturas complexas podem se tornar instáveis devido à tendência de degradação, polimerização ou sofrer modificações químicas indesejáveis. A fim de tornar os anticorpos adequados para administração e manter a estabilidade e melhor desempenho durante o armazenamento e uso subsequente, a pesquisa sobre preparações estáveis de fármacos de anticorpo é de grande importância. Um exemplo de uma patente relacionada à preparação de anticorpo CD40 é WO2005063289. Para o novo anticorpo CD40, ainda há uma necessidade de desenvolver composições (preparações) farmacêuticas que compreendem CD40 mais adequadas para administração.

CONTEÚDO DA PRESENTE INVENÇÃO

[008] A presente divulgação fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um tampão. Em algumas modalidades, o tampão é selecionado a partir de tampão de acetato, tampão de histidina, tampão de fosfato e tampão de succinato, preferencialmente, tampão de acetato, mais preferencialmente, tampão de ácido acético-acetato de sódio.

[009] Em uma modalidade alternativa, o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na composição farmacêutica tem LCDR1, LCDR2 e LCDR3 respectivamente mostrados em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Nome Sequência N° HCDR1 GYILTTYWIT SEQ ID NO: 3

HCDR2 DIHPGSGSTKYNEKFKS SEQ ID NO: 4 HCDR3 RDY SEQ ID NO: 5 LCDR1 RSSQNIVNSQGNTYLE SEQ ID NO: 6 LCDR2 KVTNRFS SEQ ID NO: 7 LCDR3 FQASLVPWT SEQ ID NO: 8

[010] Em modalidades alternativas, o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na composição farmacêutica tem uma concentração de cerca de 1 mg/ml a 120 mg/ml, que pode ser cerca de 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 12 mg/ml, 14 mg/ml, 16 mg/ml, 18 mg/ml, 20 mg/ml, 22 mg/ml, 24 mg/ml, 26 mg/ml, 28 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml, 95 mg/ml, 100 mg/ml, 105 mg/ml, 110 mg/ml, 115 mg/ml, 120 mg/ml ou qualquer valor entre quaisquer dois valores, preferencialmente, 10 mg/ml a 40 mg/ml, com máxima preferência, cerca de 25 mg/ml.

[011] Em modalidades alternativas, o tampão tem uma concentração de cerca de 5 mM a 30 mM, preferencialmente, cerca de 10 mM a 20 mM, e exemplos não limitantes compreendem cerca de 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM ou qualquer valor entre quaisquer dois valores, mais preferencialmente, cerca de 10 mM.

[012] Em modalidades alternativas, o tampão na composição farmacêutica tem um pH de cerca de 4,5 a 6,5, preferencialmente, cerca de 5,0 a 6,0 e, em uma modalidade não limitante, pode ser cerca de 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 ou qualquer valor entre quaisquer dois valores, com máxima preferência, cerca de 5,0 ou 5,5.

[013] Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica compreende adicionalmente açúcar. O "açúcar" na presente divulgação compreende composições convencionais (CH2O)n e seus derivados, incluindo monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, álcoois de açúcar, açúcares redutores, açúcares não redutores e etc. O "açúcar" na presente divulgação pode ser selecionado a partir de glicose, sacarose, trealose, lactose, frutose, maltose, dextrano, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiose, melezitose, rafinose, manotriose, estaquiose, maltose, lactulose, maltulose, sorbitol, maltitol, lactitol, iso-maltulose, etc. O açúcar preferencial é dissacarídeos não redutores, mais preferencialmente, trealose e sacarose.

[014] Em modalidades alternativas, o açúcar na composição farmacêutica tem uma concentração de cerca de 40 mg/ml a 95 mg/ml (por exemplo, 55 mg/ml), preferencialmente, cerca de 60 mg/ml a 90 mg/ml. A concentração de açúcar em exemplos não limitantes compreende 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml ou qualquer valor entre quaisquer dois valores, mais preferencialmente, cerca de 80 mg/ml.

[015] Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um tensoativo que pode ser selecionado a partir de polissorbato 20; polissorbato 80; poloxâmero; Triton; dodecil sulfato de sódio; lauril sulfonato de sódio; octil glicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil-, estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil-, estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocoamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmamidopropil-, isoestearamidopropil-betaína; miristamidopropil-, palmamidopropil-, isoestearamidopropil-dimetilamina; metilcocoílo de sódio; taurato de metiloleil de sódio; copolímeros de polietilenoglicol; copolímeros de polipropilenoglicol; copolímeros de etilenoglicol e copolímeros de propilenoglicol etc. O tensoativo preferencial é polissorbatos, como polissorbato 80 ou polissorbato 20, mais preferencialmente,

polissorbato 80.

[016] Em modalidades alternativas, o tensoativo na composição farmacêutica tem uma concentração de cerca de 0,02 mg/ml a 0,8 mg/ml (por exemplo, 0,1 mg/ml), preferencialmente, cerca de 0,3 mg/ml a 0,6 mg/ml. A concentração do tensoativo em exemplos não limitantes compreende 0,3 mg/ml, 0,35 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,45 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,55 mg/ml, 0,6 mg/ml ou qualquer valor entre quaisquer dois valores, mais preferencialmente, cerca de 0,4 mg/ml.

[017] Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica compreende:

[018] (a) 1 a 120 mg/ml de um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 LCDR3 respectivamente mostrados em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5,

[019] (b) 5 a 30 mM de tampão de acetato.

[020] Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica compreende:

[021] (a) 1 a 120 mg/ml de um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 LCDR3 respectivamente mostrados em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5,

[022] (b) 5 a 30 mM de tampão de acetato,

[023] (c) 40 a 90 mg/ml de sacarose,

[024] (d) 0,02 a 0,8 mg/ml de polissorbato 80, preferencialmente, a composição farmacêutica tem um pH de 4,5 a 6,5, mais preferencialmente, 5,0 a

6,0, ainda mais preferencialmente, 5,5.

[025] Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica compreende:

[026] (a) 1 a 120 mg/ml de um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 LCDR3 respectivamente mostrados em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5,

[027] (b) 5 a 30 mM de tampão de acetato,

[028] (c) 40 a 95 mg/ml de trealose,

[029] (d) 0,02 a 0,8 mg/ml de polissorbato 80, preferencialmente, a composição farmacêutica tem um pH de 4,5 a 6,5, mais preferencialmente, 5,0 a 6,0, ainda preferencialmente, 5,5.

[030] A composição farmacêutica compreende:

[031] (a) 1 a 120 mg/ml de um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 e LCDR3 respectivamente mostrados em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 e

[032] (b) 10 a 20 mM de tampão de acetato, e a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 5,5.

[033] Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica compreende:

[034] (a) 10 a 40 mg/ml de um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 e LCDR3 respectivamente mostrados em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5,

[035] (b) 10 a 20 mM de tampão de acetato,

[036] (c) 60 a 90 mg/ml de sacarose,

[037] (d) 0,3 a 0,8 mg/ml de polissorbato 80, preferencialmente, a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 6,0.

[038] Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica compreende:

[039] (a) 25 mg/ml de um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 e LCDR3 respectivamente mostrados em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5,

[040] (b) 10 a 20 mM de tampão de ácido acético-acetato de sódio,

[041] (c) 60 a 90 mg/ml de sacarose,

[042] (d) 0,3 a 0,8 mg/ml de polissorbato 80, preferencialmente, a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 6,0.

[043] Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica compreende:

[044] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5;

[045] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,8;

[046] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 6,0;

[047] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,6;

[048] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,8;

[049] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 6,0;

[050] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,0;

[051] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,5;

[052] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 6,0;

[053] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,0;

[054] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,5;

[055] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,8;

[056] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 6,0;

[057] 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5;

[058] ou 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5;

[059] Nas modalidades específicas conforme definido acima, o anticorpo CD40 tem LCDR1, LCDR2 e LCDR3 respectivamente mostrados em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5.

[060] Em algumas modalidades, o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente divulgação tem uma região variável de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 2

[061] QVQLQQPGADLVKPGASVKMSCKASGYILTTYWITWVKQRPGQGLEWIGD

IHPGSGSTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLTRLSSEDSAVYYCARRDYWGQGTTLTVSS

[062] SEQ ID NO: 1

[063] DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGESPKLLI

YKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASLVPWTFGGGTKLEIK

[064] SEQ ID NO: 2

[065] Em modalidades alternativas, o anticorpo do fragmento de ligação ao antígeno na composição farmacêutica pode ser selecionado a partir de anticorpo murino, anticorpo quimérico e anticorpo humanizado, preferencialmente, anticorpo humanizado.

[066] Em modalidades alternativas, FRs de cadeia leve na região variável de cadeia leve e FRs de cadeia pesada na região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado na composição farmacêutica são derivadas respectivamente de cadeia leve e cadeia pesada de linha germinativa humana ou sequências mutantes dos mesmos.

[067] Adicionalmente, a cadeia pesada do anticorpo humanizado de CD40 tem uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 17 ou uma variante da mesma, e a variante tem, preferencialmente, 0 a 10 variações de aminoácido na região variável de cadeia pesada, mais preferencialmente, mutações nas posições de aminoácido 6 e 8, em que os aminoácidos são, preferencialmente, mutados para I, A ou L; a cadeia leve do anticorpo humanizado tem uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 18 ou uma variante da mesma, e a variante tem, preferencialmente, 0 a 10 variações de aminoácido na região variável de cadeia leve, mais preferencialmente, mutações nas posições de aminoácido 2 e 3, em que os aminoácidos são, preferencialmente, mutados para I, V ou L.

[068] Em modalidades alternativas, a região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado de CD40 compreende adicionalmente FRs de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou uma variante da mesma, preferencialmente, compreende FRs de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana e, mais preferencialmente, compreende FRs de cadeia pesada de IgG1 ou IgG2 humana.

[069] Em modalidades alternativas, a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo CD40 tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de cadeia leve de anticorpo hu9E5, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de anticorpo hu9E5, a sequência de cadeia leve de anticorpo hu9E5 é mostrada em SEQ ID NO: 18, a sequência de cadeia pesada de anticorpo hu9E5 é mostrada em SEQ ID NO: 17.

[070] hu9E5 HC

[071] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEW

MGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[072] SEQ ID NO: 17

[073] hu9E5 LC

[074] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLI

YKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[075] SEQ ID NO: 18

[076] A composição farmacêutica da presente divulgação tem estabilidade de fármaco suficiente e pode ser armazenada estavelmente por um longo prazo. Por outro lado, a título de conveniência do transporte de fármaco, a composição farmacêutica da presente divulgação pode ser feita adicionalmente em uma preparação liofilizada.

[077] A presente divulgação também fornece um método para preparar uma preparação liofilizada compreendendo anticorpo CD40, que compreende a etapa de liofilização da composição farmacêutica conforme definido acima.

[078] Em modalidades alternativas, no método para preparar uma preparação que compreende anticorpo CD40, a liofilização compreende as etapas de pré-liofilização, secagem primária e secagem secundária em sequência.

[079] A presente divulgação também fornece uma preparação liofilizada compreendendo anticorpo CD40 preparado pelo método para preparar uma preparação liofilizada compreendendo anticorpo CD40 conforme definido acima.

[080] Em algumas modalidades, a preparação liofilizada é estável a 2 a 8 °C por pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses ou pelo menos 24 meses.

[081] Em algumas modalidades, a preparação liofilizada é estável a 25 °C por pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses ou pelo menos 24 meses.

[082] Em algumas modalidades, a preparação liofilizada é estável a 40 °C por pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias ou pelo menos 28 dias.

[083] A presente divulgação também fornece um método para preparar uma solução reconstituída de uma preparação liofilizada compreendendo anticorpo CD40, que compreende a etapa de reconstituir a preparação liofilizada conforme definido acima, e a solução usada para reconstituição é selecionada a partir de, porém sem limitação, água para injeção, solução salina fisiológica ou solução de glicose.

[084] A presente divulgação também fornece uma solução reconstituída de uma preparação liofilizada compreendendo anticorpo CD40 preparada pelo método para preparar uma solução reconstituída de uma preparação liofilizada contendo o anticorpo CD40 conforme definido acima.

[085] A presente divulgação fornece adicionalmente um produto ou kit que compreende um recipiente contendo qualquer composição farmacêutica estável descrita no presente documento. Em algumas modalidades, a garrafa de vidro é um frasco de injeção feito de tubo de vidro de borossilicato neutro.

[086] A presente divulgação também fornece um uso da composição farmacêutica, da preparação liofilizada ou da solução reconstituída da preparação liofilizada conforme definido acima na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças ou sintomas relacionados a CD40, em que as doenças ou sintomas são, preferencialmente, cânceres, e os cânceres são selecionados a partir de linfoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de bexiga, rabdomiossarcoma, câncer de esôfago, câncer cervical, mieloma múltiplo, leucemia, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e melanoma.

[087] A presente divulgação também fornece um método para tratar ou prevenir doenças ou sintomas relacionados a CD40, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, da preparação liofilizada ou da solução reconstituída da preparação liofilizada conforme definido acima a um paciente em necessidade, em que as doenças ou sintomas são, preferencialmente, cânceres, que são selecionados a partir de linfoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de bexiga, rabdomiossarcoma, câncer de esôfago, câncer cervical, mieloma múltiplo, leucemia, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e melanoma.

[088] A presente divulgação também fornece um produto que compreende um recipiente, que contém a composição farmacêutica, a preparação liofilizada ou a solução reconstituída da preparação liofilizada conforme definido acima.

[089] Deve ser entendido que uma, algumas ou todas as características das várias modalidades descritas no presente documento podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente divulgação. Esses e outros aspectos da presente divulgação estarão evidentes para aqueles técnicos no assunto. Essas e outras modalidades da presente divulgação são descritas adicionalmente na seguinte descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERENCIAL

1. Definições

[090] A fim de tornar mais fácil para aqueles técnicos no assunto o entendimento da presente divulgação, certos termos técnicos e científicos são definidos especificamente abaixo. Salvo se definido claramente em outro lugar nesse documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o significado comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta divulgação pertence.

[091] "Tampão" se refere a um tampão que pode resistir a alterações de pH através da ação de seus componentes conjugados de ácido-base. Exemplos de tampões que controlam o pH em uma faixa apropriada incluem tampões de acetato, tampões de succinato, tampões de gluconato, tampões de histidina, tampões de oxalato, tampões de lactato, tampões de fosfato, tampões de citrato, tampões de tartrato, tampões de fumarato, tampões de glicilglicina e outros tampões de ácido orgânico.

[092] “Tampão de histidina" é um tampão contendo íons histidina. Exemplos de tampão de histidina incluem tampão de cloridrato de histidina, tampão de acetato de histidina, tampão de fosfato de histidina, sulfato de histidina, tampão e etc., preferencialmente, tampão de cloridrato de histidina. O tampão de cloridrato de histidina é preparado a partir de histidina e ácido clorídrico ou histidina e cloridrato de histidina.

[093] "Tampão de citrato" é tampão contendo íons de citrato. Exemplos de tampão de citrato incluem tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, ácido cítrico- citrato de potássio, ácido cítrico-citrato de cálcio, ácido cítrico-citrato de magnésio e etc. O tampão de citrato preferencial é tampão de ácido cítrico- citrato de sódio.

[094] "Tampão de succinato" é tampão contendo íons de succinato. Exemplos do tampão de succinato incluem tampão de succinato-succinato de sódio, tampão de succinato-succinato de potássio, tampão de succinato- succinato de cálcio e etc. O tampão de succinato preferencial é tampão de succinato-succinato de sódio.

[095] "Tampão de fosfato" é tampão contendo íons de fosfato. Exemplos do tampão de fosfato incluem tampão de hidrogenofosfato de sódio-di- hidrogenofosfato de sódio, tampão de hidrogenofosfato dissódico-di- hidrogenofosfato de potássio e etc. O tampão de fosfato preferencial é tampão de hidrogenofosfato dissódico-di-hidrogenofosfato de sódio.

[096] "Tampão de acetato" é tampão contendo íons de acetato. Exemplos de tampão de acetato incluem tampão de ácido acético-acetato de sódio, tampão de ácido acético-histidina, tampão de ácido acético-acetato de potássio, tampão de ácido acético-acetato de cálcio, tampão de ácido acético-acetato de magnésio e etc. O tampão de acetato preferencial é tampão de ácido acético- acetato de sódio.

[097] “Composição farmacêutica" significa uma mistura contendo um ou mais compostos descritos no presente documento ou seus sais ou pró-fármacos fisiológica/farmaceuticamente aceitáveis e outros componentes químicos, como carreadores ou excipientes fisiológica/farmaceuticamente aceitáveis. O propósito da composição farmacêutica consiste em promover a administração ao organismo e facilitar a absorção dos ingredientes ativos para exercer sua atividade biológica. Nesse contexto, "composição farmacêutica" e "preparação" não são mutuamente exclusivos.

[098] Na forma de solução da composição farmacêutica descrita na presente divulgação, salvo se especificado de outro modo, o solvente na mesma é água.

[099] "Preparação liofilizada" se refere a uma preparação ou a uma composição farmacêutica obtida por liofilização a vácuo de uma composição farmacêutica ou uma preparação de solução na forma líquida ou de solução.

[0100] Conforme usado no presente documento, o termo "cerca de" significa que o valor de índice está dentro da faixa de erro aceitável do valor específico determinado por um técnico no assunto, e o valor depende parcialmente de como o mesmo é medido ou determinado (isto é, o limite do sistema de medição). Por exemplo, "cerca de" pode significar desvio padrão dentro de 1 ou mais de 1 em todas as práticas na técnica. Alternativamente, "cerca de" ou "que compreende substancialmente" pode significar uma faixa de até 20%. Além disso, especialmente para sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar no máximo uma ordem de magnitude ou no máximo 5 vezes o valor. Salvo se apresentado de outro modo, quando um valor específico aparece no presente pedido e nas reivindicações, o significado de "cerca de" ou "que compreende substancialmente" deve ser considerado como estando dentro da faixa de erro aceitável do valor específico.

[0101] A composição farmacêutica descrita na presente divulgação pode alcançar um efeito estável: o anticorpo na mesma retém substancialmente sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica após o armazenamento. Preferencialmente, a composição farmacêutica retém sua estabilidade física, estabilidade química e atividade biológica após o armazenamento. O período de armazenamento é, em geral, selecionado com base na vida útil predeterminada da composição farmacêutica. Há uma variedade de técnicas analíticas disponíveis para medir estabilidade de proteína, que pode medir a estabilidade após o armazenamento em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado.

[0102] Uma preparação farmacêutica de anticorpo estável é uma preparação na qual nenhuma alteração significativa é observada sob as seguintes condições: armazenamento em temperatura de armazenamento refrigerado (2 a 8 °C) por pelo menos 3 meses, preferencialmente, 6 meses, mais preferencialmente, 1 ano e, ainda mais preferencialmente, até 2 anos. Além disso, preparações líquidas estáveis incluem preparações líquidas que exibem características desejadas após um período de tempo incluindo armazenamento a 25 °C por 1 mês, 3 meses ou 6 meses, ou armazenamento a 40 °C por 1 mês. Um critério aceitável típico de estabilidade é conforme a seguir: usualmente não mais de cerca de 10%, preferencialmente, não mais de cerca de 5% de monômeros de anticorpo são degradados e medidos por SEC-HPLC. Conforme medido por análise visual, a preparação de anticorpo farmacêutica é incolor ou clara a branco levemente leitoso. A concentração, pH e osmolalidade das preparações têm uma variação de não mais de ±10%. Os truncamentos de não mais de cerca de 10%, preferencialmente, não mais de cerca de 5% são, em geral, observados, e agregados de não mais de cerca de 10%, preferencialmente, não mais de cerca de 5% são, em geral, formados.

[0103] Após uma inspeção visual de cor e/ou clareza, ou uma medição por espalhamento de luz UV, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e espalhamento de luz dinâmica (DLS), se o anticorpo não mostrar um aumento significativo em agregação, precipitação e/ou desnaturação, então, o anticorpo "retém sua estabilidade física" na preparação farmacêutica. Alterações na conformação proteica podem ser avaliadas por espectroscopia de fluorescênciae (que determina a estrutura terciária da proteína) e por espectroscopia de FTIR (que determina a estrutura secundária da proteína).

[0104] Se o anticorpo não mostrar uma alteração química significativa, então, o anticorpo "retém sua estabilidade química" na preparação farmacêutica. A estabilidade química pode ser avaliada ao detectar e quantificar proteínas com forma quimicamente alterada. Os processos de degradação que alteram frequentemente a estrutura química de proteínas incluem hidrólise ou truncamento (avaliado por métodos, como cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE), oxidação (avaliada por métodos, como mapeamento de peptídeo combinado com espectrometria de massa ou MALDI/TOF/MS, etc.), desamidação (avaliada por métodos, como cromatografia de troca de íons, focalização isoelétrica capilar, mapeamento de peptídeos, medição de ácido isoaspártico, etc.) e isomerização (avaliada por medição do conteúdo de ácido isoaspártico, mapeamento de peptídeos, etc.).

[0105] Se a atividade biológica do anticorpo em um determinado momento estiver dentro de uma faixa predeterminada da atividade biológica exibida quando a preparação farmacêutica é preparada, então, o anticorpo "retém sua atividade biológica" na preparação farmacêutica. A atividade biológica de um anticorpo pode ser determinada, por exemplo, por um ensaio de ligação ao antígeno.

[0106] O termo "CD40" se refere ao receptor de superfície celular que é um membro da superfamília do receptor TNF, também conhecido como TNFRSF5. CD40 é ubiquamente expresso na superfície de células dendríticas, células B e macrófagos e é uma molécula exigida para a produção e manutenção de imunidade de célula T. O termo "CD40" inclui qualquer variante ou isoforma de CD40 que seja naturalmente expressa por uma célula. Os anticorpos da divulgação podem ter reatividade cruzada com CD40 de espécies não humanas. Alternativamente, o anticorpo pode ser específico de CD40 humano e pode não exibir reatividade cruzada com outras espécies. CD40 ou qualquer variante ou isoforma do mesmo pode ser isolado de células ou tecidos dos quais o mesmo é naturalmente expresso ou produzido por técnicas recombinantes usando técnicas comuns na técnica e descritas no presente documento. Preferencialmente, o anticorpo anti-CD40 alveja CD40 humano com um padrão de glicosilação normal.

[0107] O código de três letras e o código de letra única de aminoácidos usados na presente divulgação são descritos em J. Biol. Chem, 243, p3.558 (1968).

[0108] O "anticorpo" mencionado na presente divulgação se refere a uma imunoglobulina, que é uma estrutura de cadeia tetrapeptídica composta de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas conectadas por ligações dissulfeto entre cadeias.

[0109] Nesta divulgação, a cadeia leve de anticorpo pode compreender adicionalmente uma região constante de cadeia leve, que compreende uma cadeia de κ, λ humana ou murina ou variantes da mesma.

[0110] Nesta divulgação, a cadeia pesada de anticorpo pode compreender adicionalmente uma região constante de cadeia pesada, que compreende uma IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou murina ou variantes da mesma.

[0111] O fragmento variável (região Fv) composto de cerca de 110 aminoácidos próximos ao terminal N das cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpo varia consideravelmente em sua sequência de aminoácidos. A região constante composta da sequência de aminoácidos restante próxima ao terminal C é relativamente estável. A região variável compreende três regiões hipervariáveis (HVRs) e quatro regiões framework relativamente conservadas (FRs). As três regiões hipervariáveis que determinam a especificidade do anticorpo também são chamadas de região determinante de complementariedade (CDR). Cada uma dentre a região variável de cadeia leve (LCVR) e a região variável de cadeia pesada (HCVR) consiste em três CDRs e quatro FRs dispostas a partir do terminal amino até o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As três CDRs da cadeia leve se referem a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; as três CDRs da cadeia pesada se referem a HCDR1, HCDR2 e HCDR3. O número e a posição de resíduos de aminoácido de CDR da LCVR e HCVR dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da divulgação estão em conformidade com critérios de numeração de Kabat conhecidos (LCDR1-3, HCDR2-3), ou estão em conformidade com o sistema de numeração de Kabat e Chothia (HCDR1).

[0112] Os anticorpos da presente divulgação incluem anticorpos murinos, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, preferencialmente, anticorpos humanizados.

[0113] O termo "anticorpo murino" na presente divulgação é um anticorpo monoclonal que alveja CD40 humano preparado de acordo com o conhecimento e habilidades na técnica. Durante a preparação, a cobaia é injetada com o antígeno de CD40 e, então, o hibridoma que expressa o anticorpo com a sequência ou características funcionais desejadas é isolado.

[0114] O termo "anticorpo quimérico" é um anticorpo formado por fusão de uma região variável de um anticorpo murino com uma região constante de um anticorpo humano, que pode aliviar a resposta imune induzida por um anticorpo murino. Para construir o anticorpo quimérico, o hibridoma que secreta anticorpo monoclonal específico de murino é primeiramente construído, então, o gene de região variável é clonado a partir da célula de hibridoma murino. Subsequentemente, o gene de região constante do anticorpo humano é clonado conforme necessário. O gene de região variável murino e o gene de região constante humano são ligados em um gene quimérico e, então, inseridos em um vetor humano e, finalmente, a molécula de anticorpo quimérico é expressa no sistema industrial eucariótico ou procariótico. Em uma modalidade preferencial da presente divulgação, a cadeia leve de anticorpo quimérico CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender adicionalmente uma região constante de cadeia leve de cadeia de κ, λ humana ou variantes da mesma. A cadeia pesada de anticorpo quimérico de CD40 compreende adicionalmente uma região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou variantes da mesma.

[0115] O termo "anticorpo humanizado", também conhecido como anticorpo enxertado com CDR, se refere a um anticorpo produzido por enxerto de sequências de CDRs murinas nas estruturas de uma região variável de anticorpo humano, isto é, as sequências estruturais de um anticorpo de tipo diferente de linha germinativa humana. O mesmo pode superar a resposta imune intensa induzida por anticorpo quimérico que carregam uma grande quantidade de componentes proteicos murinos. Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de base de dados de DNA públicas ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpo de linha germinativa. Por exemplo, as sequências de DNAs de linha germinativa de genes de região variável de cadeia pesada e cadeia leve humanas podem ser encontradas na base de dados de sequência de linhas germinativas humanas "VBase" (disponível na página da Web www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, EA, etc., Human, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição. Para evitar uma diminuição na atividade causada por redução da imunogenicidade, a região variável de anticorpo humano pode ser submetida à mutação reversa mínima para manter a atividade. Os anticorpos humanizados da presente divulgação também compreendem anticorpos humanizados que submetidos adicionalmente à maturação de afinidade para CDR por exibição de fago.

[0116] O termo "ligação a CD40" na presente divulgação se refere à capacidade de interagir com CD40 humano.

[0117] O termo "ligação específica" se refere a, conforme determinado por técnicas disponíveis na técnica, como ELISA competitivo, ensaio BIACORE® ou ensaio KINEXA®. Esse termo também é aplicável quando, por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo da presente divulgação é específico para um epítopo particular carreado por muitos antígenos, caso no qual o anticorpo que carreia o domínio de ligação ao antígeno pode se ligar especificamente a múltiplos antígenos que carreiam o epítopo.

[0118] O "fragmento de ligação ao antígeno" na presente divulgação se refere ao fragmento Fab, ao fragmento Fab', ao fragmento F(ab')2 e ao fragmento scFv que se ligam ao CD40 humano, e a outros fragmentos que podem se ligar ao CD40 humano, que são formados por utilização de regiões de VH e VL dos anticorpos que podem se ligar ao CD40 humano. O mesmo compreende uma ou mais CDRs dos anticorpos descritas na presente divulgação selecionadas a partir de SEQ ID NO: 7, 13, 9, 10, 11 e 12. Um fragmento de Fv compreende região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve do anticorpo, mas não compreende a região constante, e á o menor fragmento de anticorpo com todos os sítios de ligação ao antígeno. Em geral, um anticorpo Fv também compreende um ligante peptídico entre os domínios de VH e VL que podem formar a estrutura exigida para ligação ao antígeno. Diferentes ligantes também podem ser usados para conectar duas regiões variáveis de anticorpos em uma cadeia polipeptídica, que é denominada anticorpo de cadeia única ou Fv de cadeia única (sFv).

[0119] O termo "epítopo" se refere a uma parte de uma molécula que pode ser reconhecida e ligada por um anticorpo a uma ou mais regiões de ligação ao antígeno do anticorpo.

[0120] “Modificação conservadora" ou "substituição ou reposição conservadora" se refere à substituição de aminoácidos em proteínas com outro aminoácido que tem características similares (por exemplo, carga, tamanho de cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação de cadeia principal e rigidez etc.), de modo que alterações possam ser feitas frequentemente sem alterar a atividade biológica da proteína. É conhecido por aqueles técnicos no assunto que, em geral, uma única substituição de aminoácido em uma região não essencial de um polipeptídeo não altera substancialmente sua atividade biológica (consulte, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Página 224, (4ª edição)). Além disso, substituições de aminoácidos estrutural e funcionalmente similares são improváveis de afetar a atividade biológica da mesma.

[0121] “Identidade” ou "Homologia" de uma sequência de aminoácidos se refere à similaridade de sequência entre duas sequências de polipeptídeos. Quando ambas as posições nas duas sequências comparadas são ocupadas pelo mesmo resíduo de aminoácido, por exemplo, se a mesma posição de cada um dos dois polipeptídeos é ocupada pelo mesmo aminoácido, então, a molécula é idêntica naquela posição. Exemplos de algoritmos adequados para determinar o percentual de identidade de sequência e o percentual de similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST2.0, que são descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410 e Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3.389 a 3.402. O software para desempenhar análise de BLAST está publicamente disponível no Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[0122] Métodos para produzir e purificar anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica anterior, como os Capítulos 5 a 8 e 15, Using Antibodies: A Laboratory Manual publicado por Cold Spring Harbor. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido na divulgação, é geneticamente manipulado para adicionar uma ou mais FRs humanas em CDRs não-humanas. A sequência de linhas germinativas de FR humanas pode ser obtida por alinhamento da base de dados de gene de linha germinativa de região variável de anticorpo IMGT e software MOE da página da Web ImMunoGeneTics (I MGT) http://imgt.cines.fr, ou do Journal of Immunoglobulins, 2001ISBN012441351.

[0123] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno manipulados da presente divulgação podem ser preparados e purificados por métodos convencionais. Por exemplo, a sequência de cDNA que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve pode ser clonada e recombinada em um vetor de expressão GS. As células CHO podem ser estavelmente transfectadas pelo vetor de expressão de imunoglobulina recombinante. Como um método mais recomendado bem conhecido na técnica, sistemas de expressão de mamífero resultarão em glicosilação de anticorpos, particularmente, no terminal N altamente conservado da Fc. Os clones estáveis são obtidos por expressão de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos humanos. Os clones positivos são expandidos em meio livre de soro em um biorreator para produzir anticorpos. O meio de cultura, no qual o anticorpo é secretado, pode ser purificado e coletado por técnicas convencionais. Por exemplo, a coluna Sepharose FF A ou G com tampão ajustado é usada para purificação para remover componentes não especificamente ligados. Então, os anticorpos ligados são eluídos pelo gradiente de pH, e os fragmentos de anticorpo são detectados por SDS-PAGE e, então, coletados. Os anticorpos podem ser concentrados por filtração de uma maneira convencional. Misturas solúveis e multímeros também podem ser removidos por métodos convencionais, como peneiras moleculares e troca de íons. O produto resultante precisa ser imediatamente congelado, como a -70 °C, ou liofilizado.

[0124] Quando aplicado a um animal, ser humano, cobaia, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, "administração" e "tratamento" se referem a colocar um fármaco exógeno, agente terapêutico, agente de diagnóstico ou composição em contato com animal, ser humano, cobaia, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" podem se referir a, por exemplo, métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de pesquisa e experimentais. O tratamento das células inclui colocar reagentes em contato com as células, bem como colocar reagentes em contato com o fluido, em que os fluidos estão em contato com as células. “Administração" e "tratamento" também significam tratar, por exemplo, células in vitro e ex vivo por reagentes, diagnósticos, composições de ligação ou por outro tipo de células. "Tratamento", quando se aplica a um ser humano, à veterinária ou cobaia, se refere ao tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, para aplicações de pesquisas e diagnóstico.

[0125] “Terapia" significa a administração de um agente terapêutico para uso interno ou externo que compreende, por exemplo, qualquer composição que possa ligar compostos da presente divulgação a um paciente que tem um ou mais sintomas da doença para a qual o agente terapêutico é conhecido por ter efeito terapêutico. Em geral, o agente terapêutico é administrado em uma quantidade que alivia de modo eficaz os sintomas de uma ou mais doenças em um indivíduo ou população a ser tratada, para induzir a degeneração de tais sintomas ou inibir a progressão de tais sintomas em qualquer grau clinicamente imensurável. A quantidade de agente terapêutico (também referida como "quantidade terapeuticamente eficaz") eficaz no alívio dos sintomas de qualquer doença particular pode variar dependendo de uma variedade de fatores, como estado de doença, idade e peso do paciente, e a capacidade do fármaco de elicitar um efeito desejado no paciente. Se os sintomas da doença foram aliviados pode ser avaliado por qualquer método de teste clínico comumente usado por um médico ou outros profissionais da saúde para avaliar a gravidade ou a progressão da condição. Embora as modalidades da divulgação (por exemplo, métodos terapêuticos ou preparações) possam não ser eficazes no alívio de sintomas de doença para cada alvo, as mesmas devem aliviar sintomas de doença de alvos em um número estatisticamente significativo de pacientes conforme determinado por quaisquer métodos de teste estatístico conhecidos na técnica, como teste t de Student, teste do qui-quadrado, teste U baseado em Mann e Whitney, teste de Kruskal-Wallis (teste H), teste de Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon.

[0126] Uma "quantidade eficaz" inclui uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou condição de uma doença médica. Uma quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um paciente ou cobaia veterinária particular pode variar dependendo dos seguintes fatores: por exemplo, a condição a ser tratada, a saúde geral do paciente, a via ou dosagem da administração e a severidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a dose ou regime de dosagem máxima que evite efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos.

[0127] “Valor de Tm" se refere à temperatura de desnaturação térmica proteica, ou seja, a temperatura na qual metade da proteína é desdobrada, quando a estrutura espacial da proteína é destruída. Portanto, quanto maior o valor de Tm, maior a estabilidade térmica da proteína.

2. Exemplos e Exemplos de Teste

[0128] A presente divulgação é explicada adicionalmente em detalhe pelos seguintes exemplos. Esses exemplos são apenas para propósitos ilustrativos e não se pretende que limitem o escopo da presente divulgação.

[0129] Os métodos experimentais para os quais condições específicas não são indicadas nos exemplos da presente divulgação são usualmente de acordo com as condições convencionais; ou de acordo com as condições sugeridas pelos fabricantes de matéria-prima ou produto. Os reagentes para os quais fontes específicas não são indicadas são reagentes convencionais comercialmente adquiridos.

[0130] Os métodos de preparação e purificação do antígeno e anticorpo CD40 neste pedido foram descritos no documento de patente com o número de pedido WO2018219327, cujos conteúdos podem ser incorporados em sua totalidade no presente documento. Exemplo 1. Antígenos imunes, sequências de antígenos para triagem e preparação dos mesmos

[0131] Proteína recombinante de CD40 humano marcada com his (h-CD40- his), proteína recombinante de CD40 humana marcada com Fc (h-CD40-Fc), proteína recombinante de CD40 murino marcada com his (m-CD40-his) e proteína recombinante de CD40 de rhesus marcada com his (rhesus-CD40-his) (#CD0-C52H7) foram purificadas com reagentes proteicos comerciais adquiridos da Acrobiosystems. A fonte de cada sequência é mostrada na Tabela 1. A proteína pode ser usada em cada experimento dos seguintes exemplos. Tabela 1. Fonte de sequências de aminoácidos de proteínas recombinantes Nome Início e fim de sequências de Número de acesso aminoácidos Genbank h-CD40-his Glu21-Arg193 AAH12419.1 h-CD40-Fc Glu21-Arg193 NP_001241.1 m-CD40-his Val24-Arg193 P27512 rhesus-CD40-his Glu21-Arg193 NP_001252791.1 Exemplo 2. Preparação de hibridoma de anticorpo

[0132] Anticorpos CD40 monoclonais anti-humanos foram produzidos por imunização de camundongos, que são camundongos C57BL/6 experimentais fêmeas de 6 a 8 semanas de idade [Zhao Yan (Suzhou) New Drug Research Center Co., Ltd., número de licença de produção animal: 201503259]. Ambiente de alimentação: nível de SPF. Os camundongos foram adquiridos e alimentados em um ambiente de laboratório por 1 semana com ajuste de ciclo de claro/escuro de 12/12 horas em uma temperatura de 20 a 25 °C, e umidade de 40 a 60%. Os camundongos que se adaptaram ao ambiente foram divididos em 2 gaiolas com 5 camundongos em cada gaiola.

[0133] O antígeno imune foi uma proteína recombinante de CD40 modificada humana marcada com Fc (h-CD40-Fc, formulada em tampão de fosfato na concentração de 1 μg/μl). O adjuvante de Freund (Sigma, n° de lote: F5881/F5506) foi usado para emulsificação, em que o adjuvante completo de Freund (CFA) foi usado para imunização primária, e adjuvante de ácido nucleico (CpG, Sangon Biotech) e alumínio para injeção (Imject Alum), Thermo, n° de lote: PH203866) para imunização de reforço remanescente. A imunização foi desempenhada nos Dia 0, Dia 14, Dia 28, Dia 42, Dia 56, e Dia 70. Sangue foi coletado nos Dia 21, Dia 35, Dia 49, Dia 63 e Dia 77 para exame de sangue, e o soro dos camundongos foi detectado por ELISA para determinar o título de anticorpos no soro dos camundongos.

[0134] Após a quarta imunização, a fusão de células do baço foi desempenhada em camundongos, nos quais o título de anticorpos é alto e tende a se estabilizar em soro. A imunização de reforço foi desempenhada 3 dias antes da fusão, e 10 μg de solução de antígeno formulada com tampão de fosfato foram injetados intraperitonealmente (IP) em cada camundongo. Os linfócitos de baço foram fusionados com células Sp2/0 de célula de mieloma (ATCC® CRL- 8287TM) usando uma etapa de fusão mediada por PEG otimizado para obter células de hibridoma, e linhagens celulares de hibridoma monoclonal com boa atividade in vitro foram selecionadas. Exemplo 3. Clonagem e sequenciamento de anticorpo anti-CD40

[0135] Os subclones de hibridoma do anticorpo triados e identificados acima foram selecionados, e células de hibridoma das quais em fase de crescimento logarítmica foram coletadas. RNA foi extraído usando Trizol (Invitrogen, 15596-018) de acordo com as instruções do kit, e transcritos reversamente (PrimeScriptTM Reverse Transcriptase, Takara, nº de catálogo 2680A). Então, o cDNA resultante foi amplificado por PCR usando Conjunto de Iniciadores de Ig murina (Novagen, TB326 Rev. B 0503), e enviado para a empresa de sequenciamento para sequenciamento. A sequência do anticorpo murino foi finalmente obtida.

[0136] As sequências de região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve de 9E5 são conforme a seguir:

[0137] 9E5 HCVR

[0138] QVQLQQPGADLVKPGASVKMSCKASGYILTTYWITWVKQRPGQGLEWIG

DIHPGSGSTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLTRLSSEDSAVYYCARRDYWGQGTTLTVS S

[0139] SEQ ID NO: 1

[0140] 9E5 LCVR

[0141] DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGESPKLL

IYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASLVPWTFGGGTKLEIK

[0142] SEQ ID NO: 2

[0143] Sequências de CDR de 9E5 são mostradas na Tabela 2 abaixo: Tabela 2 Nome Sequência Número HCDR1 GYILTTYWIT SEQID NO: 3 HCDR2 DIHPGSGSTKYNEKFKS SEQID NO: 4 HCDR3 RDY SEQID NO: 5 LCDR1 RSSQNIVNSQGNTYLE SEQID NO: 6 LCDR2 KVTNRFS SEQID NO: 7 LCDR3 FQASLVPWT SEQID NO: 8

[0144] As sequências de região variável obtidas foram enxertadas respectivamente na sequência de região constante de IgG1 de anticorpo humano para obter uma sequência de anticorpos quiméricos murinos humanos, e a sequência do anticorpo quimérico foi inserida no vetor de expressão pCP (adquirido da MabSpace biology Co., Ltd) por técnica de clonagem molecular. Essas sequências foram sequenciadas e identificadas após a amplificação por PCR (os métodos de operação biológica molecular, como clonagem molecular são executados de acordo com as condições de operação convencionais, e podem ser referidas ao "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" especificamente), e o sistema de expressão de célula HEK293 pode ser usado para obter anticorpo quimérico murino humano 9E5-C. Vários ensaios de atividade in vitro foram desempenhados para caracterizar anticorpos quiméricos purificados por cromatografia de afinidade MabSelect SuRe (GE Lifesciences). Os dados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3: Atividade in vitro do anticorpo quimérico EC50 de EC50 de Bloqueio de ligação de ELISA de Afinidade de Anticorpo IC50 de ELISA de células CD40- Biacore KD quimérico hCD40 CD40- hishumano (nM) /hCD40L(μg/ml) HEK293 (ng/ml) (μg/ml) 9E5-C 1,346 0,1218 0,03333 2,68 Referência da 5,628 0,2583 0,01638 20,35 Pfizer (hIgG4) Referência da Alligator 3,288 0,7233 0,39650 65,9 (hIgG1) Exemplo 4. Humanização de anticorpo murino

[0145] Com base na estrutura típica de CDR de VH/VL do anticorpo murino 9E5 obtida, as sequências de região variável de cadeia pesada e leve foram comparadas com a base de dados de Linha Germinativa de anticorpo para obter modelos de linha germinativa humana com alta homologia. Dentre as mesmas, a região estrutural de cadeia leve de linha germinativa humana é derivada de um gene de cadeia leve κ humano, e a região estrutural de cadeia leve do anticorpo da presente invenção é, preferencialmente, um modelo de cadeia leve de linha germinativa humana Vk2-28/JK4 (9E5). A região framework de cadeia pesada de linha germinativa humana é derivada de uma cadeia pesada humana, e a região framework de cadeia pesada do anticorpo da presente invenção é, preferencialmente, um modelo de cadeia pesada de linha germinativa humana VH1-2/JH6 (9E5), conforme mostrado abaixo:

[0146] A região framework de cadeia pesada de 9E5 é, preferencialmente,

um modelo de cadeia pesada de linha germinativa humana IGHV1-2 (SEQ ID NO: 9):

[0147] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEW

MGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR

[0148] A região estrutural de cadeia leve de 9E5 é, preferencialmente, um modelo de cadeia leve de linha germinativa humana IGkV2-28 (SEQ ID NO: 10):

[0149] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLL

IYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP

[0150] As CDRs do anticorpo murino foram enxertados nos modelos humanizados selecionados para substituir as regiões variáveis humanizadas e, então, recombinados com a região constante de IgG humana correspondente (preferencialmente, a cadeia pesada é IgG1 e a cadeia leve é κ). Então, com base nessa estrutura tridimensional do anticorpo murino, os resíduos incorporados, os resíduos que têm uma interação direta com as CDRs e os resíduos que têm uma influência importante sobre a conformação de VL e VH, foram submetidos à mutação reversa, e os resíduos de aminoácido quimicamente lábeis de CDRs foram otimizados para obter as moléculas humanizadas finais.

[0151] hu9E5-H1a (SEQ ID NO: 11):

[0152] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEW

MGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTT VTVSS

[0153] hu9E5-H1b (SEQ ID NO: 12):

[0154] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEW

MGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTV TVSS

[0155] hu9E5-H1c (SEQ ID NO: 13):

[0156] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEW

MGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTV TVSS

[0157] hu9E5-L1a (SEQ ID NO: 14):

[0158] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLL

IYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

[0159] hu9E5-L1b (SEQ ID NO: 15):

[0160] DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQL

LIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

[0161] hu9E5-L1c (SEQ ID NO: 16):

[0162] DVLMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQL

LIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

[0163] As moléculas de anticorpo hu9E5 humanizadas finais (que compreendem cadeia pesada de H1c e cadeia leve de L1a) foram selecionadas através dos testes de expressão acima e comparação do número de mutações reversas de combinações de cadeias leves e cadeias pesadas, e cujas sequências de cadeias leves e cadeias pesadas completas são apresentadas em SEQ ID NOs: 17 a 18, respectivamente,

[0164] hu9E5 HC

[0165] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEW

[0166] SEQ ID NO: 17

[0167] hu9E5 LC

[0168] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLL

IYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0169] SEQ ID NO: 18 Exemplo 5. Dados de teste de anticorpo humanizado

[0170] A atividade de ligação, atividade de bloqueio e similares dos anticorpos humanizados hu9E5 da presente invenção ao CD40 humano e de rhesus CD40 são mostradas na Tabela 4. Tabela 4: Atividade in vitro de anticorpo hu9E5 humanizado EC50 de IC50 de EC50 de EC50 de ELISA bloqueio de ligação de KD de ELISA de de ELISA de células afinidade CD40- CD40- hCD40/hCD40L CD40- de Biacore hishumano his de humano HEK293 (M) (ng/ml) rhesus (μg/ml) (μg/ml) (ng/ml) Hu9E5-25 1,650 1,661 0,3084 0,13970 5.301E-9 Referência 1,293 1,243 0,6471 1,36200 1.66E-7 da Alligator (hIgG1) Referência 3,976 3,561 0,3106 0,01907 2.035E-8 da Pfizer (hIgG4) Exemplo 6. Inibição de anticorpo anti-CD40 em crescimento tumoral em camundongos

[0171] O sangue periférico humano normal foi coletado e as PBMCs humanas saudáveis foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade.

Monócitos foram classificados usando o kit de microesferas de CD14+, e monócitos de CD14+ foram isolados de acordo com o protocolo dotado do kit, isto é, 20 μl de microesferas de Anti-CD14 foram adicionados para cada 107 células e incubados a 4 °C por 15 minutos. Então, as células foram adicionadas a uma coluna magnética, e lavadas três vezes. As células na coluna magnética, isto é, monócitos CD14+ foram coletados. O meio RPMI 1.640 contendo 10 ng/ml de IL4 e 100 ng/ml de GM-CSF foi adicionado aos monócitos CD14+, cultivando, desse modo, os monócitos por 6 dias (método de cultura é um método comum na técnica) para realizar cultura de indução de células MoDC. RPMI 1.640 contendo IL-2 foi adicionado às células remanescente, as células suspensas foram coletadas após a cultura (o método de cultura e o método de coleta das células são todos os métodos convencionais na técnica). As células T foram classificadas usando o kit de microesferas de CD3+. Seis dias depois, as células MoDC e células T CD3+ foram respectivamente coletadas e misturadas com células Raji (Shanghai Institute of Biotechnology Cell Bank, cultivadas em meio RPMI1640 contendo 10% de soro bovino fetal) em uma razão de 1:5:20, e inoculadas subcutaneamente em cada camundongo NOG (Nanjing Galaxy Biopharma, alimentação adaptativa por 5 dias). Os animais experimentais foram mantidos em uma caixa ventilada independente com temperatura e umidade constantes. A temperatura da sala de reprodução foi 18,0 a 26,0 °C, a umidade foi 40 a 70%, a ventilação foi desempenhada por 10 a 20 vezes/hora, e o dia e a noite foram comutados de 12h/12h.

[0172] Os grupos experimentais incluem grupo de controle de IgG1 humana, hu9E5 e anticorpo de referência G12, todos administrados em uma dose de 3 mg/kg. Cinco camundongos em cada grupo foram administrados uma vez por semana por seis semanas com três administrações consecutivas. Durante todo o experimento, o diâmetro geométrico longo e o diâmetro de eixo geométrico amplo do tumor foram medidos duas vezes por semana usando um paquímetro, e o volume tumoral (mm3) = 0,5 × (diâmetro de eixo geométrico longo tumoral × diâmetro de eixo geométrico amplo tumoral 2) foi calculado. A taxa de inibição tumoral relativa TGI (%) foi calculada pela seguinte equação: TGI% = (1-T/C) × 100%. T/C % é a taxa de crescimento tumoral relativa, ou seja, a porcentagem de volume tumoral ou peso tumoral relativa do grupo de tratamento e do grupo de controle em um certo ponto de tempo. T e C são respectivamente o volume tumoral (TV) ou peso tumoral (TW) do grupo de tratamento e o grupo de controle de IgG1 em um ponto de tempo específico.

[0173] Os resultados mostraram que o anticorpo anti-CD40 hu9E5 humanizado teve um efeito antitumoral muito significativo em comparação ao controle de IgG1, com eliminação tumoral quase completa após 21 dias de administração. Processo de preparação exemplificativa de composição farmacêutica (preparação) de anticorpo

[0174] A primeira etapa: O anticorpo CD40 (como hu9E5) e uma preparação estável foram preparados em um volume de preparação compreendendo anticorpo CD40.

[0175] Após a filtração, o volume foi amostrado para teste de esterilidade. O volume foi, então, filtrado com um elemento de filtro PVDF de 0,22 μm, e o filtrado foi coletado.

[0176] A segunda etapa: o volume de preenchimento foi ajustado para 1,1 ml, e o filtrado foi preenchido em um frasco de 2 ml com rolhas. Amostras foram coletadas no começo, meio e fim para medir a diferença de volume de preenchimento.

[0177] A terceira etapa: a máquina de nivelamento foi ligada para desempenhar nivelamento com tampa de alumínio.

[0178] A quarta etapa: confirmou-se que o produto não tem defeitos, como preenchimento impreciso por inspeção visual. A seguir, a etiqueta de frasco foi impressa e colada. Então, a etiqueta de embalagem foi impressa enquanto a caixa da embalagem é dobrada. O produto foi embalado. Finalmente, a etiqueta de caixa foi colada na caixa. Exemplo 7. Triagem de valor de pH de sistema tampão para preparação de anticorpo anti-CD40

[0179] Os seguintes tampões foram formulados para preparar uma preparação de anticorpo com a concentração de anticorpo anti-CD40 de 50 mg/ml, e amostras foram coletadas para estudo de estabilidade em alta temperatura (40 °C). 1) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,0 2) 10 mM ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5 3) 10 mM de ácido succínico-succinato de sódio, pH 5,0 4) 10 mM ácido succínico-succinato de sódio, pH 5,5 5) 10 mM ácido succínico-succinato de sódio, pH 6,0 6) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5 7) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 6,0 8) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 6,5 Tabela 5. Resultados de triagem de pH para anticorpo anti-CD40 % de % de ICE pico SEC% n° Condição principal monômeros Pico ácido Pico neutro de NR CE-SDS 1 M0 97,2 95,2 34,8 60,5 40 °C M1 95,8 92,4 55,7 39,1 2 M0 97,2 95,2 36,6 58,6 40 °C M1 96,1 92,8 54,1 41,8

3 M0 97,2 95,6 35,0 60,6 40 °C M1 95,6 91,5 58,7 36,5 4 M0 97,2 95,6 35,2 60,7 40 °C M1 96,1 92,0 56,8 38,3 5 M0 97,2 95,5 34,5 61,3 40 °C M1 96,2 91,6 54,8 40,4 6 M0 97,1 95,8 34,6 60,8 40 °C M1 96,4 92,5 49,2 46,8 7 M0 97,1 95,6 34,7 61,0 40 °C M1 96,6 92,1 54,5 43,0 8 M0 97,1 95,6 34,7 60,7 40 °C M1 95,9 90,6 74,0 26,0 Nota: M significa mês

[0180] Os resultados mostram que a faixa de pH ideal para anticorpo anti- CD40 é 5,0 a 6,0. Nessa faixa de pH, as diferenças em cada um dentre SEC e CE entre os três sistemas tampão não é grande, e a variação de ICE está dentro da faixa de 14,0% a 24,1%, que é mais estável que o sistema tampão (Tampão) com pH 6,5. Exemplo 8. Triagem de tensoativos para preparações de anticorpo anti- CD40

[0181] Os sistemas tampão de 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5 e 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5 foram selecionados para preparar preparações de anticorpo anti-CD40 contendo 50 mg/ml de proteína, 75 mg/ml de sacarose e diferentes tipos de tensoativos. A estabilidade de suas aparências a 25 °C foi investigada: 1) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5, contendo 0,4 mg/ml de polissorbato 80; 2) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5, contendo 0,4 mg/ml de polissorbato 20; 3) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 0,4 mg/ml de polissorbato 80; 4) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 0,4 mg/ml de polissorbato 20; Tabela 6. Resultados de triagem de tensoativos de anticorpo anti-CD40 a 25 °C n° Condição Aparência M0 Clara e incolor M1 Ocasionalmente partículas pequenas 1 M3 Ocasionalmente partículas pequenas M6 Ocasionalmente partículas pequenas M0 Clara e incolor M1 Poucas partículas pequenas 2 M3 Turva M6 Turva M0 Clara e incolor M1 Ocasionalmente partículas pequenas 3 M3 Ocasionalmente partículas pequenas M6 Poucas partículas pequenas M0 Clara e incolor M1 Poucas partículas pequenas 4 M3 Turva M6 Turva

[0182] Os resultados mostram que o polissorbato 80 é o tensoativo preferencial. Exemplo 9. Triagem de concentração de tensoativo para preparações de anticorpo anti-CD40

[0183] Um sistema tampão contendo 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5 foi selecionado para preparar preparações de anticorpo anti-CD40 contendo 50 mg/ml de proteína, 75 mg/ml de sacarose e polissorbato 80 com diferentes concentrações:

[0184] 1) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 0,1 mg/ml de polissorbato 80;

[0185] 2) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 0,2 mg/ml de polissorbato 80;

[0186] 3) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 0,4 mg/ml de polissorbato 80;

[0187] 4) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 0,6 mg/ml de polissorbato 80;

[0188] 5) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 0,8 mg/ml de polissorbato 80;

[0189] As amostras foram diluídas com injeção de cloreto de sódio a 0,9% em uma concentração proteica de 0,5 mg/ml, respectivamente. Os resultados de partículas insolúveis mostraram (consulte a Tabela 3) que, quando a concentração de polissorbato 80 foi 0,1 mg/ml~0,8 mg/ml, a proteína de anticorpo anti-CD40 tem boa compatibilidade com cloreto de sódio, indicando que a concentração de polissorbato 80 descrita acima tem bom efeito de estabilização; então, a amostra descrita acima foi colocada em um incubador de agitação (25 °C, 300 rpm) por 5 dias. De acordo com a aparência, a concentração de polissorbato 80 é selecionada como sendo 0,4 a 0,8 mg/ml, preferencialmente, 0,4 mg/ml. Tabela 7. Resultados de triagem de concentração de polissorbato 80 para anticorpo anti-CD40 Partículas insolúveis após a diluição Aparência após n° Tempo (pcs/ml) agitação 2 μm 10 μm 25 μm 0h 122 5 0 N/A 1 2~8 °C 22 h 287 11 0 Turva 0h 112 4 0 N/A 2 2~8 °C 22 h 315 6 0 Turva 0h 112 3 0 N/A 3 2~8 °C 22 h 37 1 0 Clara 4 0h 747 53 2 N/A

2~8 °C 22 h 206 20 0 Clara 0h 363 13 0 N/A 5 2~8 °C 22 h 258 10 0 Clara Exemplo 10. Triagem de concentração de açúcar para preparações de anticorpo anti-CD40

[0190] Um sistema tampão contendo 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5 foi selecionado para preparar preparações de anticorpo anti-CD40 contendo 50 mg/ml de proteína, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e sacarose com diferentes concentrações:

[0191] 1) 10 mM de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 55 mg/ml de sacarose;

[0192] 2) 10 mM ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 65 mg/ml de sacarose;

[0193] 3) 10 mM ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 70 mg/ml de sacarose;

[0194] 4) 10 mM ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 75 mg/ml de sacarose;

[0195] 5) 10 mM ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5, contendo 80 mg/ml de sacarose;

[0196] Os resultados de pressão osmótica de cada amostra mostram (consulte a Tabela 8) que a preparação é isotônica quando a concentração de sacarose é 80 mg/ml. Tabela 8. Pressão osmótica de preparação de anticorpo anti-CD40 com diferentes concentrações de sacarose n° Concentração de sacarose Pressão osmótica (mOsm) 1 55 mg/ml 208 2 65 mg/ml 250 3 70 mg/ml 269 4 75 mg/ml 283 5 80 mg/ml 294

Exemplo 11. Estabilidade de diferentes sistemas tampão para anticorpo anti-CD40

[0197] Os seguintes sistemas tampão foram usados para preparar preparações de anti-CD40 contendo 50 mg/ml de proteína, 80 mg/ml de sacarose e 0,4 mg/ml de polissorbato 80, e a estabilidade a 25 °C e a 2 a 8 °C foi investigada.

[0198] 1) 10 mM ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5

[0199] 2) 10 mM de histidina- cloridrato de histidina, pH 5,5

[0200] 3) 10 mM de histidina-ácido acético, pH 5,5 Tabela 9. Estabilidade de diferentes sistemas tampão a 25 °C n Período de Aparência % de SEC % de ICE ° armazenamen Polímer Monômer Pico Pico to os os ácido principal 1 M0 Clara e 0,0 97,5 32,8 64,1 incolor M3 Clara e 0,5 96,8 41,3 56,7 incolor M6 Clara e 1,1 96,1 47,8 49,1 incolor 2 M0 Clara e 0,0 97,5 32,5 64,3 incolor M3 Clara e 0,4 96,8 40,5 57,8 incolor M6 Clara e 0,8 95,6 50,5 46,2 incolor 3 M0 Clara e 0,0 97,6 31,2 65,0 incolor M3 Clara e 0,4 96,7 38,9 59,2 incolor M6 Clara e 0,8 95,7 52,1 44,9 incolor Tabela 10. Estabilidade de diferentes sistemas tampão a 2 a 8 °C n Período de Aparência % de SEC % de ICE ° armazename Polímer Monôme Pico Pico nto os ros ácido principal

1 M0 Clara e 0,0 97,5 32,8 64,1 incolor M6 Clara e 0,6 97,9 35,2 61,3 incolor 2 M0 Clara e 0,0 97,5 32,5 64,3 incolor M6 Clara e 0,5 97,9 34,8 62,1 incolor 3 M0 Clara e 0,0 97,6 31,2 65,0 incolor M6 Clara e 0,5 98,1 34,8 62,0 incolor

[0201] Os resultados mostraram que, após 6 meses de armazenamento a 25 °C, o sistema tampão de 10 mM de ácido acético-acetato de sódio foi levemente superior a outros sistemas tampão, enquanto a diferença entre o sistema tampão de 10 mM de histidina-cloridrato de histidina e 10 mM de histidina-ácido acético não foi significativa; após 6 meses de armazenamento a 2 a 8 °C, não houve nenhuma diferença significativa na qualidade dos três sistemas. Exemplo 12. A influência da concentração proteica da preparação sobre a estabilidade

[0202] Um sistema tampão que tem 10 mM de cloridrato de histidina, pH 5,5 foi selecionado para preparar preparações de anticorpo CD40 contendo 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e concentrações proteicas de 50 mg/ml, 25 mg/ml e 1 mg/ml. A estabilidade em alta temperatura a 40 °C foi investigada.

[0203] 1) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5, com uma concentração proteica de 50 mg/ml

[0204] 2) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5, com uma concentração proteica de 25 mg/ml

[0205] 3) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5, com uma concentração proteica de 1 mg/ml

Tabela 11. Estabilidade em alta temperatura de amostras com diferentes concentrações proteicas a 40 °C SEC% n° Concentração NR CE Condi Aparê Polí Frag de proteica Monô Pico principal ção ncia mer ment lote (mg/ml) meros de % de -SDS os os Clara e 0h 0,0 97,2 2,8 97,8 incolor 1 50 40 °C Clara e 0,5 96,1 3,4 92,5 M1 incolor Clara e 0h 0,0 97,2 2,8 97,8 incolor 2 25 40 °C Clara e 0,4 96,0 3,7 92,9 M1 incolor Clara e 0h 0,0 95,3 4,7 98,1 incolor 3 1 40 °C Clara e 0,6 92,6 6,8 87,4 M1 incolor

[0206] Os resultados mostram que a concentração proteica das preparações afetará a pureza, as concentrações proteicas de 50 mg/ml e 25 mg/ml têm pouco efeito sobre a pureza, e a estabilidade da preparação com concentração proteica de 1 mg/ml é obviamente baixa. Exemplo 13. Triagem abrangente de ingredientes de preparação

[0207] A fim de otimizar adicionalmente a concentração proteica, a concentração de polissorbato 80 e o pH, software JMP foi usada para o projeto DOE, e o modelo RSM foi aplicado para obter uma série de prescrições (consulte abaixo). Uma vez que nenhuma diferença particularmente significativa entre os dados de estabilidade dos sistemas tampão histidina-cloridrato de histidina (His- HCl) e histidina-ácido acético (His-AA) e a faixa de tampão de pH de His-HCl está acima de 5,5, His-AA foi escolhido como o tampão para experimento de triagem de DOE. Em um sistema tampão que tem 10 mM de histidina-ácido acético (His- AA), preparações de anticorpo anti-CD40 com diferentes concentrações proteicas, diferentes concentrações de polissorbato 80 e 80 mg/ml de sacarose foram preparadas, e as amostras foram armazenadas a 40 °C para análise de estabilidade:

[0208] (1) 0,4 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,0, contendo 40 mg/ml de CD40

[0209] (2) 0,2 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,5, contendo 10 mg/ml de CD40

[0210] (3) 0,4 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,5, contendo 25 mg/ml de CD40

[0211] (4) 0,4 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,5, contendo 25 mg/ml de CD40

[0212] (5) 0,4 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,0, contendo 10 mg/ml de CD40

[0213] (6) 0,6 mg/ml de polissorbato 80, pH 6,0, contendo 40 mg/ml de CD40

[0214] (7) 0,2 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,0, contendo 25 mg/ml de CD40

[0215] (8) 0,2 mg/ml de polissorbato 80, pH 6,0, contendo 40 mg/ml de CD40

[0216] (9) 0,6 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,0, contendo 25 mg/ml de CD40

[0217] (10) 0,4 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,5, contendo 40 mg/ml de CD40

[0218] (11) 0,6 mg/ml de polissorbato 80, pH 5,5, contendo 10 mg/ml de CD40

[0219] (12) 0,4 mg/ml de Polissorbato 80, pH 6,0, contendo 10 mg/ml de CD40

Tabela 12. Resultados experimentais de triagem de DOE a 40 °C M1 % de NRCE-SDS pico n° de Condiç % de monômeros Aparência % de pico neut lote ão de SEC- principal ro de

ICE Clara e 0h 95,7 97,8 71,3 incolor 1 40 °C Clara e 94,2 92,1 40,5 M1 incolor Clara e 0h 96,2 97,9 71,5 incolor 2 40 °C Clara e 94,5 92,4 41,2 M1 incolor Clara e 0h 96,1 97,9 70,9 incolor 3 40 °C Clara e 94,6 91,7 41,2 M1 incolor Clara e 0h 96,1 98,0 72,8 incolor 4 40 °C Clara e 94,5 91,0 40,3 M1 incolor Clara e 0h 96,5 97,9 70,4 incolor 5 40 °C Clara e 94,5 91,2 37,3 M1 incolor Clara e 0h 96,2 98,0 71,3 incolor 6 40 °C Clara e 95,0 91,0 40,7 M1 incolor Clara e 0h 96,4 97,9 72,6 incolor 7 40 °C Clara e 94,8 91,1 40,6 M1 incolor Clara e 0h 96,2 98,0 72,3 incolor 8 40 °C Poucas 93,7 90,9 42,7 M1 partículas Clara e 9 0h 96,4 98,1 72,3 incolor

40 °C Clara e 94,8 90,5 40,7 M1 incolor Clara e 0h 96,2 98,0 70,5 incolor 10 40 °C Clara 95,2 90,8 42,0 M1 Clara e 0h 96,2 98,0 73,1 incolor 11 40 °C Clara e 95,3 91,3 41,0 M1 incolor Clara e 0h 96,3 97,9 70,1 incolor 12 40 °C Clara e 95,0 91,2 37,8 M1 incolor

[0220] Os resultados mostram que: quando o valor de pH foi entre 5,0 e 6,0, o polissorbato 80 foi entre 0,2 e 0,6 mg/ml e a concentração proteica foi entre 10 e 40 mg/ml, a flutuação dos parâmetros acima não teve uma grande influência sobre a estabilidade. A faixa de pH da prescrição foi 5,0 ~6,0, assim, o valor médio de 5,5 foi considerado como o valor de pH final, e 0,4 mg/ml foi considerado como a concentração final de polissorbato 80 com a consideração geral de resultados de triagem anteriores, e a concentração proteica foi definida como 25 mg/ml. Exemplo 14. Estabilidade de liofilização de anticorpo anti-CD40 em diferentes sistemas tampão

[0221] Uma vez que o sistema tampão de ácido acético (acetato de sódio) pode mudar o valor de pH após a reconstituição devido à volatilização durante a liofilização, o mesmo não é adequado para uso como um sistema tampão para preparações liofilizadas. Dois tipos de tampões, como 10 mM de histidina- cloridrato de histidina (His-HCl), pH 5,5 e 10 mM de histidina-ácido acético (His- AA), pH 5,5 foram selecionados para preparar preparações de anticorpo anti- CD40 contendo 50 mg/ml de proteína, 80 mg/ml de sacarose e 0,4 mg/ml de polissorbato 80. O volume de preenchimento foi 1,2 ml/garrafa, e o processo de liofilização é conforme mostrado na Tabela 13: 1) 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5 2) 10 mM de histidina-ácido acético, pH 5,5 Tabela 13: Processo de Liofilização Temperatura Tempo de Tempo de Vácuo configuração retenção Pré- 5 °C 10 min 1h / liofilização -45 °C 60 min 2h / secagem -27 °C 90 min 40 h 10 Pa (0,1 primária mbar) secagem 25 °C 60 min 6h 1 Pa (0,01 secundária mbar)

[0222] O produto liofilizado tem formato de torta satisfatório, a aparência estava clara após a reconstituição, e nenhuma alteração óbvia em pH e pureza foi observada, indicando que o processo de liofilização foi bom. Os resultados mostram que: dois tipos de tampões, como 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5 e 10 mM de histidina-ácido acético, pH 5,5 foram adequados para uso como sistemas tampão para preparações de anticorpo anti-CD40. Tabela 14. Comparação antes e após a liofilização % de SEC % % de ICE de Tempo pico n° Tempo de de prin Aparê p Polí Pico Pico de amostrage recons Monô cipa ncia H mer ácid neutr lote m tituiçã meros l de os o o o NRC E-

SDS 5 Antes da Clara e 95, , 0,1 99,7 35,9 61,2 liofilização incolor 3 7 1 5 Após a ＜1 Clara e 95, , 0,0 99,7 36,0 60,4 liofilização min incolor 3 8

Antes da Clara e 95, , 0,1 99,7 36,9 60,4 liofilização incolor 0 8 2 5 Após a ＜1 Clara e 95, , 0,1 99,9 36,4 60,5 liofilização min incolor 0 9 Tabela 15. Estabilidade de amostras de liofilização a 25 °C

SEC ICE Tempo de n° de Polí Frag Pico Pico Pico amostrage Aparência Monô lote mero ment ácido neutr alcalin m meros s os o o T0 Clara 0,0 98,0 1,9 36,0 60,4 3,6 1 Partículas M3 0,1 94,4 5,5 36,1 60,7 3,3 pequenas T0 Clara 0,1 98,0 1,9 36,4 60,5 3,1 2 Partículas M3 0,1 95,1 4,8 36,0 61,1 2,9 pequenas Tabela 16. Estabilidade de amostras de liofilização a 2 a 8 °C

SEC ICE Tempo de n° de Polí Frag Pico Pico Pico amostrage Aparência Monô lote mero ment ácido neutr alcalin m meros s os o o T0 Clara 0,0 98,0 1,9 36,0 60,4 3,6 1 M3 Clara 0,1 94,6 5,3 38,0 59,0 3,0 T0 Clara 0,1 98,0 1,9 36,4 60,5 3,1 2 Partículas M3 0,3 95,1 4,6 35,6 61,0 3,5 pequenas Exemplo 15. Outras preparações alternativas

[0223] Além disso, a presente invenção também fornece preparações farmacêuticas de anticorpo anti-CD40 com outras preparações, incluindo, mas sem limitação a: (1) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,5; (2) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,8; (3) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 6,0; (4) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,6; (5) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 5,8; (6) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de histidina-cloridrato de histidina, pH 6,0; (7) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,0; (8) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,5; (9) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 6,0; (10) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,0; (11) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,5; (12) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 5,8; (13) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de histidina-ácido acético, pH 6,0; (14) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5; (15) 25 mg/ml de anticorpo CD40, 80 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de sódio, pH 5,5;

[0224] Os resultados experimentais mostram que as preparações de anticorpo CD40 com as preparações conforme definido acima tiveram boa estabilidade e poderiam ser aplicadas à preparação de medicamentos com anticorpo CD40.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um tampão, em que o anticorpo CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 e LCDR3 respectivamente mostradas em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostradas respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente; o tampão é, preferencialmente, selecionado a partir de tampão de acetato, tampão de histidina, tampão de fosfato e tampão de succinato, mais preferencialmente, tampão de acetato, mais preferencialmente, tampão de ácido acético-acetato de sódio.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma concentração de 1 mg/ml a 120 mg/ml, preferencialmente, 10 mg/ml a 40 mg/ml.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica tem um pH de 4,5 a 6,5, preferencialmente, 5,0 a 6,0.

4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o tampão tem uma concentração de 5 mM a 30 mM, preferencialmente, 10 mM a 20 mM.

5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um dissacarídeo selecionado a partir de trealose e sacarose.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o dissacarídeo tem uma concentração de 40 mg/ml a 95 mg/ml, preferencialmente, 60 mg/ml a 90 mg/ml.

7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um tensoativo que é polissorbato, mais preferencialmente, polissorbato 80.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o tensoativo tem uma concentração de 0,02 mg/ml a 0,8 mg/ml, preferencialmente, 0,3 mg/ml a 0,8 mg/ml.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 1 a 120 mg/ml de um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostradas em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostradas em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente, (b) 5 a 30 mM de tampão de acetato, (c) 40 a 90 mg/ml de sacarose, (d) 0,02 a 0,8 mg/ml de polissorbato 80, preferencialmente, a composição farmacêutica tem um pH de 4,5 a 6,5, mais preferencialmente, 5,0 a 6,0, ainda preferencialmente, 5,5.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 1 a 120 mg/ml de um anticorpo CD40 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem LCDR1, LCDR2 e LCDR3 respectivamente mostradas em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostradas respectivamente em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 e (b) 10 a 20 mM de tampão de acetato, e a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 5,5.

11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma região variável de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 2.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o anticorpo CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que as sequências de FRs de cadeia leve na região variável de cadeia leve e as sequências de FRs de cadeia pesada na região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado são derivadas respectivamente de cadeia leve e cadeia pesada de linha germinativa humana ou sequências mutantes das mesmas.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a cadeia pesada do anticorpo humanizado tem uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 17 ou uma variante da mesma, e a variante tem, preferencialmente, 0 a 10 variações de aminoácido na região variável de cadeia pesada, mais preferencialmente, mutações nas posições de aminoácido 6 e 8, em que os aminoácidos são, preferencialmente, mutados para I, A ou L; a cadeia leve do anticorpo humanizado tem uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 18 ou uma variante da mesma, e a variante tem, preferencialmente, 0 a 10 variações de aminoácido na região variável de cadeia leve, mais preferencialmente, mutações nas posições de aminoácido 2 e 3, em que os aminoácidos são, preferencialmente, mutados para I, V ou L.

15. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende adicionalmente FRs de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou uma variante da mesma,

preferencialmente, compreende FRs de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana e, mais preferencialmente, compreende FRs de cadeia pesada de IgG1 ou IgG2 humana.

16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo CD40 tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência mostrada em SEQ ID NO: 18, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência mostrada em SEQ ID NO: 17.

17. Método para preparar uma preparação liofilizada que compreende anticorpo CD40, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de liofilização da composição farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

18. Preparação liofilizada, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpo CD40 preparado pelo método definido na reivindicação 17.

19. Uso da composição farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou da preparação liofilizada definida na reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar doenças ou sintomas relacionados a CD40, em que as doenças ou sintomas são, preferencialmente, cânceres, em que os cânceres são selecionados a partir de linfoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de bexiga, rabdomiossarcoma, câncer de esôfago, câncer cervical, mieloma múltiplo, leucemia, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e melanoma.

20. Produto que compreende um recipiente, caracterizado pelo fato de que contém a composição farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou a preparação liofilizada definida na reivindicação 18.