TW201945536A - 水凝膠膠囊 - Google Patents

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持田泰佑
田上寛
伊藤亮
木本香哉
小池悠介
上野光
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國立大學法人京都大學
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Abstract

本發明以提供除去與分化誘導之胰島素分泌細胞共存，且具有高增殖性之Ki67陽性細胞之手法為目的。
包含：於含有褐藻酸之凝膠中將內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團加以包埋分化，而製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法。

Description

水凝膠膠囊
本發明係有關除去存在於從多潛能幹細胞分化誘導獲得之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團中，具有高增殖性之Ki67陽性細胞之方法。
正在進行從iPS細胞(誘導性多潛能幹細胞)或ES細胞(胚胎幹細胞)等多潛能幹細胞將稱為胰島素產生細胞或胰臟β細胞之胰島素分泌細胞加以分化誘導，並應用於治療糖尿病的研究。
至今，有從多潛能幹細胞分化誘導為胰島素分泌細胞之種種手法之開發/報告。於非專利文獻1揭示可使用褐藻酸鹼之支架培養源自人類ES細胞之胰臟前驅細胞，於測試之所有培養條件，確認胰島素/PDX1之表現係安定或減少，升糖素(glucagon)/體抑素(somatostatin)之表現增加，β細胞關連基因之表現減少。
又，亦進行研究將胰島素分泌細胞移植到生體內之方法，有藉由使用將胰島以褐藻酸水凝膠包封之系統移植到生體內，可回避干擾接受者免疫系統之報告(專利文獻1,2)。
另一方面，至今對於將源自多潛能幹細胞之內分泌前驅細胞集團或於之後之分化階段之細胞集團再進行分化誘導而獲得之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團中有無混雜具有高增殖性之細胞則未知，又，未進行對於除去該等細胞之檢討。
[先行技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] WO2010/032242
[專利文獻2] WO2011/154941
[非專利文獻]
[非專利文獻1] J. Biomed Mater Res A. 2015 Dec; 103(12): 3717-26.
本案發明人等發現從多潛能幹細胞分化誘導為胰島素產生細胞或胰臟β細胞之細胞集團中有與該等胰島素分泌細胞(胰島素產生細胞及胰臟β細胞)同時存在之以Ki67標記陽性為特徵，增殖性高之細胞(以下，記載為「Ki67陽性細胞」)。
將經分化誘導之胰島素分泌細胞應用於治療糖尿病等時，從安全性之觀點而言，嚴密控制胰島素分泌細胞以外之細胞是非常重要。 又，具有高增殖性細胞之混入/殘存有對於接受者之惡影響或影響經移植之胰島素分泌細胞長期存活之慮，而不佳。
此處，本發明以提供除去與經分化誘導之胰島素分泌細胞共存，且具有高增殖性之Ki67陽性細胞之手法為目的。
本案發明人等為了解決上述課題，進行深入研究之結果發現藉由將從多潛能幹細胞分化誘導而獲得之內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中再進行分化，則Ki67陽性細胞之數減少或該細胞增殖受抑制，可獲得Ki67陽性細胞含量減低之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團。
本發明為以該等新知識為基礎者，包含以下之發明。
[1]一種製造方法，為製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法，該製造方法包含：(1)將胰島素產生細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中之步驟及(2)使經包埋之細胞集團分化之步驟。
[1-1]為製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法，包含：(1)將內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中之步驟及(2)使經包埋之細胞集團分化之步驟。
[1-2]如[1]或[1-1]所述之製造方法，為製造含有Ki67陽性細胞未達1%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法。
[2]如[1]或[1-1]所述之製造方法，其於(1)中，前述凝膠再含有奈米纖維。
[3]如[1]或[2]所述之方法，其於(2)中進行分化之步驟為藉由移植到動物而進行。
[4]一種減少或抑制方法，為減少存在於內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團中之Ki67陽性細胞數之方法或抑制該陽性細胞增殖之方法，包含將該細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中。
[4-1]一種抑制方法，為抑制存在於內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團中之Ki67陽性細胞增殖之方法，包含將該細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中。
[4-2]如[4]所述之減少或抑制方法，其係減少存在於前述細胞集團中之Ki67陽性細胞之絶對數。
[5]如[4]至[4-2]中任一項所述之方法，其係未減少存在於前述細胞集團中之內分泌前驅細胞或於之後分化階段之細胞之數。
[5-1]如[4]至[4-2]中任一項所述之方法，其係存在於前述細胞集團中之內分泌前驅細胞或於之後分化階段之細胞，且不減少非Ki67陽性細胞之細胞數
[6]]如[4]至[5-1]中任一項所述之方法，其中，前述凝膠再含有奈米纖維。
[7]一種含有褐藻酸之凝膠，係包埋有含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團。
[7-1]如[7]所述之含有褐藻酸之凝膠，其中，前述細胞集團之Ki67陽性細胞未達1%。
[7-2]如[7]所述之含有褐藻酸之凝膠，其中，前述細胞集團為源自多潛能幹細胞之細胞集團。
[7-3]如[7]所述之含有褐藻酸之凝膠，為於治療糖尿病之方法中使用。
[8]如[7]所述之含有褐藻酸之凝膠，其中，前述凝膠再含有奈米纖維。
[9]一種製造方法，為製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法，該製造方法包含：(0)包含本說明書中所記載之任一種方法(例如段落[0055]至[0086]中之任一種方法)之步驟，(1)將胰島素產生細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中之步驟及(2)使經包埋之細胞集團分化之步驟。
[10]一種糖尿病之治療方法，為將含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠，並固定於生體內。
[11]一種含有褐藻酸之凝膠，為用於抑制存在於內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團中之Ki67陽性細胞之增殖。
[12]一種含有褐藻酸之凝膠之使用，係用於製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之醫藥。
[13]一種製造方法，為製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法，該製造方法包含：(1)將細胞純化之步驟、(2)將胰島素產生細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中之步驟及(3)使經包埋之細胞集團分化之步驟。
本說明書包含以本案優先權為基礎之日本專利申請第2018-051297號之說明書及/或記載於圖式之內容。
將本說明書中引用之所有刊物、專利及專利申請以原狀作為参考，編入本說明書中。
根據本發明可提供除去與經分化誘導之胰島素分泌細胞共存，且具有高增殖性之Ki67陽性細胞之手法。
第1圖為表示將內分泌前驅細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠中進行移植時，於移植後69日抑制Ki67陽性細胞增殖之效果之照片圖。
第2圖為表示從移植後6個月之時點取出之移植物回收之細胞之流式細胞術(flow cytometry)結果之曲線圖。(A)表示移植前後目的細胞之胰島素陽性/NKX6.1陽性細胞之比例，(B)表示移植前後目的外細胞之Ki67陽性/胰島素陰性細胞之比例(B)。
1.用語
以下，對於本說明書記載之用語加以說明。
於本說明書中之「約」表示相對於基準值，分別為正或負變動至25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之值。較佳「約」或「大約」之用語表示相對於基準值，分別為正或負15%、10%、5%或1%之範圍。
於本說明書，「包括(comprise(s)或comprising)」係表示包含接續於該語句之要素，惟，不只限於此。因此，雖暗示包含接續於該語句之要素，惟，未暗示其他之任意要素除外。
於本說明書，「由~構成(consist(s)of或consisting of)」係指包含接續於該語句之所有要素且只限於該等要素。因此，「由~構成」之語句表示所列舉之要素為被要求或為必須，其他之要素實質上不存在。
於本說明書中未「使用餵養細胞(Feeder cells)」係指基本上未含有餵養細胞，未使用藉由培養餵養細胞進行預處理之培養基等。因此，培養基中未含有從餵養細胞分泌之成長因子及細胞激素等物質。
又，「餵養細胞」或「餵養」係指與其他種類之細胞共培養，支持該細胞，帶來可進行成長之環境之細胞。餵養細胞與該等支持之細胞可為源自相同種，亦可為源自不同種。例如，作為餵養人類細胞，可使用人類皮膚纖維母細胞或人類胚性幹細胞，亦可使用小鼠胚纖維母細胞 之初代培養物及永生化小鼠胚纖維母細胞。餵養細胞可藉由放射線照射或絲裂黴素C(Mitomycin C)處理等使不活化。
於本說明書中，「黏著」係指細胞附著於容器，例如細胞於適當之培養基存在下附著於滅菌塑料(或經塗覆之塑料)之細胞培養皿或燒瓶。細胞中亦有非黏著於細胞培養容器，否則不能於培養物中維持或成長者。相對於此，非黏著性細胞為不黏著於容器而可於培養物中維持、增殖。
於本說明書中，「培養」係指將細胞於體外環境中維持、成長且/或使分化。「進行培養」係指於組織或體外，例如於細胞培養皿或燒瓶中使細胞持續、增殖(成長)且/或使分化。
於本說明書中，「使豐富(enrich)」及「豐富(enrichment)」係指使細胞組成物等組成物中特定之構成成分之量增加，「經富化(enriched)」係指細胞之組成物，例如用於說明細胞集團時將特定構成成分之量與富化前細胞集團中之該等構成成分之比例進行比較係增加之細胞集團。例如對於標的細胞型，細胞集團等組成物可富化，因此，標的細胞型之比例比富化前存在於細胞集團內之標的細胞之比例增加。細胞集團藉由於該技術領域為公知之細胞選擇及挑選方法，對於標的細胞型亦可使富化。細胞集團亦可藉由本說明書中記載之特定挑選或選擇步驟使富化。於本發明之特定實施形態，藉由將標的細胞集團富化之方法，細胞集團至少富化20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的標的細胞集團。
於本說明書中，「損耗(deplete)」及「耗竭(depletion)」係指使細胞或細胞組成物等組成物中之特定構成成分之量減少、「耗盡(depleted)」係指細胞或細胞之組成物用於說明例如細胞集團時，特定構成成分之量比耗盡前細胞集團中該等構成成分之比例減少之細胞集團。例如對於標的細胞型，可使細胞集團等組成物耗盡，因此，標的細胞型的比例比耗盡前存在於細胞集團內之標的細胞之比例減少。細胞集團藉由於該技術領域為公知之細胞選擇及挑選方法，對於標的細胞型亦可使耗盡。細胞集團亦可藉由本說明書中記載之特定挑選或選擇步驟使耗盡。於本發明之特定實施形態，藉由將標的細胞集團耗盡之方法，細胞集團對於標的細胞集團至少減少(耗盡)50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。
於本說明書中，「不會減少細胞數」係指由於實施本發明方法，細胞數不會顯著減少，實施該方法前之細胞數與實施該方法後之細胞數之間無顯著差別。惟，會產生不是因實施本發明方法所致之細胞數減少(例如於以往公知之細胞培養及分化步驟通常會產生之細胞自然死等)。因此，「不會減少細胞數」亦包含實施本發明方法前與實施後細胞之減少率為30%以下、20%以下、10%以下或5%以下之情況。
於本說明書中，「標記」係指「標記蛋白質」、「標記基因」等藉由規定之細胞型特異性表現之細胞抗原或其基因。較佳標記為細胞表面標記，於該情況，可實施生存細胞之濃縮、分離及/或檢出。標記可為陽性選擇標記或陰性選擇標記。
標記蛋白質之檢出可利用對該標記蛋白質使用特異性抗體之免疫學分析，例如ELISA、免疫染色、流式細胞術進行。標記基因之檢出可利用於該領域為公知之核酸增幅方法及/或核酸檢出方法，例如逆轉錄PCR(RT-PCR)、微陣列(Microarray)、生物晶片(Biochip)等進行。於本說明書中，標記蛋白質為「陽性」係指以流式細胞術檢出為陽性，「陰性」係指以流式細胞術為檢出界限以下。又，標記基因為「陽性」係指藉由RT-PCR檢出，「陰性」係指以RT-PCR為檢出限界以下。
於本說明書中，「表現(expression)」係定義為藉由細胞內之啟動子驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
於本說明書中，「具有CDK8/19阻礙活性之因子」係指具有CDK8/19阻礙活性之所有物質。與同一CDK家族之其他蛋白質對照，CDK8於細胞增殖並非必要，CDK8之阻礙於通常之條件下效果並不大。CDK19與CDK8係如上所述為類似，阻礙CDK8通常亦伴隨阻礙CDK19。
「增殖因子」為促進特定細胞分化及/或增殖之內因性蛋白質。「增殖因子」可列舉例如上皮成長因子(EGF)、酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、類胰島素生長因子1(IGF-1)、類胰島素生長因子2(IGF-2)、角質細胞生長因子(KGF)、神經生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、乙型轉形生長因子(TGF-β)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、運鐵蛋白、種種介白素(例如IL-1至IL-18)、種種集落刺激因子(例如顆粒球/巨噬細胞集落刺激因子(GM-GSF))、種種干擾素(例如IFN-γ等)及 對於幹細胞具有效果之其他細胞激素，例如幹細胞因子(SCF)及紅血球生成素(Epo)。
於本說明書中，「ROCK阻礙劑」係指阻礙Rho激酶(ROCK：Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase)之物質，可為阻礙ROCK I及ROCK II之任一種之物質。ROCK阻礙劑不只限於具有上述之機能，可列舉例如N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(本說明書中亦稱為Y-27632)、法舒地爾(Fasudil)(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基]磺醯基]六氫-1H-1,4-二氮呯(H-1152)、4β-[(1R)-1-胺基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1甲醯胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-胺基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-嗎啉基)乙基]-氧基}苯甲醯胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-側氧基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-1H-吡啶-5-甲醯胺(GSK429286A)。ROCK阻礙劑不只限於該等，對於ROCK之mRNA為反譯寡核苷酸或siRNA、結合於ROCK之抗體、顯性負ROCK突變體等亦可作為ROCK阻礙劑使用，可從商業上購得，亦可依照公知之方法合成。
於本說明書中，「GSK3β阻礙劑」為對於GSK3β(糖原合成酶激酶3β)具有阻礙活性之物質。GSK3(糖原合成酶激酶3)為絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶之一種，參與糖原之產生或細胞淍亡、幹細胞之維持等眾多之信號路徑。GSK3有α及β之2種異構體存在。本發明中使用之 「GSK3β阻礙劑」只要具有GSK3β阻礙活性即可，並無特別限制，亦可為與GSK3β阻礙活性組合，兼具GSK3α阻礙活性之物質。
GSK3β阻礙劑可例示CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-胺基吡啶-2-基)胺基]乙基]胺基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]菸鹼甲腈)、TDZD-8(4-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑啶-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]苯酚)、肯保隆(Kenpaullone)、1-氮雜肯保隆(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-環戊二烯釕複合體、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、鋰等。GSK3β不只限於該等例，相對於GSK3β之mRNA之反譯寡核苷酸或siRNA、結合於GSK3β之抗體、顯性負GSK3β突變體等亦可作為GSK3β阻礙劑使用，可從商業上購得或依照公知之方法合成。
於本說明書中，「血清代替物」可列舉例如剔除血清替代物(Knockout Serum Replacement)(KSR：Invitrogen)、StemSure Serum Replacement(Wako)、B-27supplement、N2-supplement、白蛋白(例如富脂質白蛋白(lipid rich albumin))、胰島素、運鐵蛋白、脂肪酸、膠原前驅體、微量元素(例如鋅、硒(例如亞硒酸鈉))、2-巰基乙醇、3’硫醇甘油或該等之混合物(例如ITS-G)。血清代替物較佳為B-27supplement、KSR、 StemSure Serum Replacement、ITS-G。於培養基中添加血清代替物時，培養基中之濃度為0.01至10重量%，較佳為0.1至2重量%。於本發明中，較佳以「血清代替物」替代血清使用。
2.抑制Ki67陽性細胞增殖之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團
本發明為有關抑制Ki67陽性細胞增殖之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團，該等細胞集團可藉由將內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中，使該等分化為目的細胞集團而獲得。
於本說明書中，「Ki67陽性細胞」係指於從多潛能幹細胞分化為胰臟β細胞之過程中，以Ki67之表現為特徵作為標記之細胞，至少為於內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團中共存之細胞。「Ki67」公知為細胞周期關連核蛋白質，於增殖中細胞之G1期、S期、G2期、M期中確認到表現，於增殖停止之G0期中則未確認到表現，因此已知係作為細胞增殖及細胞周期之標記。
於從多潛能幹細胞分化為胰臟β細胞之過程，已知對應分化階段有具有不同特徵之細胞出現(WO2009/012428、WO2016/021734)。例如，該分化階段以比較性未分化之順序分成多潛能幹細胞、胚胎內胚層細胞、原腸管細胞、後前腸細胞、胰臟前驅細胞、內分泌前驅細胞、胰島素產生細胞、胰臟β細胞大類。
於本說明書中，「多潛能(pluripotency)」係指可分化成具有種種不同形態或機能之組織或細胞，亦具有可分化為3胚層之任一系統 之細胞之能力。「多潛能(pluripotency)」於胚盤不會分化，因此於無形成個體能力之點而言，可與含有胚盤，可分化為生體之所有組織之「全能性(totipotency)」區別。
於本說明書中，「多能性(multipotency)」係指可分化為複數限定數之系統之細胞之能力。例如間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞為多分化能(multipotent)，而不是多潛能(pluripotent)。
於本說明書中，「多潛能幹細胞(pluripotent stem cell)」係指胚胎幹細胞(ES細胞)及與該細胞具有相同分化多潛能，亦即具有潛在性分化為生體之種種組織(內胚層、中胚層、外胚層之全部)之能力之細胞。作為具有與ES細胞相同之分化多潛能細胞可列舉「人工多潛能幹細胞」(於本說明書中亦稱為「iPS細胞」)。於本發明較佳之多潛能幹細胞為人類多潛能幹細胞。
「ES細胞」若為小鼠ES細胞，可利用inGenious公司、理研公司等建立之各種小鼠ES細胞株，若為人類ES細胞，可利用NIH公司、理研公司、京都大學、Cellartis公司建立之各種人類ES細胞株。例如ES細胞株可利用NIH公司之CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等，WisCell Researh公司之H1株、H9株，理研公司之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
「人工多潛能幹細胞」係指於哺乳動物體細胞或未分化幹細胞中導入特定因子(核初期化因子)，藉由重編程獲得之細胞。現在，有種種「人工多潛能幹細胞」，除了可使用根據山中人等藉由於小鼠纖維母 細胞導入Oct3/4‧Sox2‧Klf4‧c-Myc4因子建立之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)之外，亦可使用於人類纖維母細胞導入同樣之4因子建立之源自人類細胞之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al,Cell,(2007)131：861-872)、於導入上述4因子後將Nanog之表現作為指標進行挑選建立之Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007),Nature 448,313-317.)、以未含有c-Myc之方法製作之iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al,Nature Biotechnology.(2008)26,101-106)、以無病毒(virusfree)導入6因子建立之iPS細胞(Okita K et al,Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al,Stem Cells,31(3)：458-66.)。又，亦可使用藉由湯姆森(Thomson)人等製作之導入OCT3/4‧SOX2‧NANOG‧LIN28之4因子建立之人工多潛能幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al,Science(2007)318：1917-1920.)、藉由Daley人等製作之人工多潛能幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al,Nature(2007)451：141-146)、櫻田人等製作之人工多潛能幹細胞(日本特開2008-307007號)等。
除此之外，亦可利用所有經公開之論文(例如Shi Y.,Ding S.,et al,Cell Stem Cell,(2008)Vol 3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7.795-797)或專利(例如日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/ 006997、WO2009/007852)中記載之於該領域為公知之任何一種人工多潛能幹細胞。
人工多潛能細胞株可利用NIH、理化學研究所(理研)、京都大學等建立之各種iPS細胞株。例如若為人類iPS細胞株，可使用理研公司之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、CDI公司之MyCell iPS Cells(21525‧102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。
於本說明書中，「內分泌前驅細胞集團」係指以內分泌前驅細胞為特徵之細胞集團。
內分泌前驅細胞係指以表現嗜鉻細胞分泌素A(Chromogranin A)、NeuroD及NGN-3中之至少一種標記且未表現胰關連荷爾蒙系(例如胰島素等)標記為特徵之細胞。內分泌前驅細胞亦可表現PAX-4、NKX2-2、Islet-1、PDX-1、PTF-1α等之標記。
內分泌前驅細胞集團為含有內分泌前驅細胞30%以上，較佳為50%以上，更佳為70%以上比例之細胞集團。內分泌前驅細胞集團除了內分泌前驅細胞之外亦可含有其他細胞(例如胰臟前驅細胞、胰島素產生細胞、Ki67陽性細胞等)。
細胞集團中特定細胞之比例可由以如流式細胞術算出細胞數之公知手法為基礎求得。
「於之後分化階段之細胞集團」係指以比內分泌前驅細胞更進一步分化為胰臟β細胞階段之細胞為特徵之細胞集團。比內分泌前驅細胞更進一步分化為胰臟β細胞階段之細胞可列舉例如胰島素產生細胞。
「胰島素產生細胞」係指以胰島素標記之表現為特徵之細胞。「胰島素產生細胞」可為表現NKX6.1之標記，較佳為表現胰島素及NKX6.1兩方之標記之細胞。
「於之後分化階段之細胞集團」或「胰島素產生細胞集團」為含有胰島素產生細胞5%以上，較佳為15%以上，更佳為30%以上比例之細胞集團。於該細胞集團，除了胰島素產生細胞之外亦可含有其他細胞(例如內分泌前驅細胞；表現升糖素、體抑素及胰多肽中至少一種標記之其他胰荷爾蒙產生細胞；Ki67陽性細胞等)。
於本說明書中，「胰臟β細胞」係指比「胰島素產生細胞」更成熟之細胞，具體而言係指表現為胰臟β細胞成熟標記之MAFA、UCN3及IAPP中之至少一種標記，或以藉由葡萄糖刺激使胰島素分泌上昇反應為特徵之細胞。
「胰臟β細胞集團」可藉由內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團於生體內進行分化/成熟而獲得之含有胰臟β細胞之細胞集團。該細胞集團除了胰臟β細胞之外，亦可含有其他細胞(例如胰島素產生細胞、Ki67陽性細胞等)。
於本發明中，包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞(起始原料之細胞)中之Ki67陽性細胞之比例並無特別限制，可為80%至0.1%、70%至1%、60%至2%、50%至3%、40%至4%、30%至5%。
於本發明中，包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞(起始原料之細胞)中之MAFA基因或其蛋白質之表現量並無特別限制，於胰島中MAFA基因或其蛋白質之表現量可為約20%以下、約15%以下、約10%以下、約5%以下、約1%以下。
於本發明中，包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞(起始原料之細胞)中之升糖素陽性且胰島素陰性細胞之比例並無特別限制，可為約2.5%以下、約2%以下、約1%以下、約0.5%以下。
於本發明中，包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞(起始原料之細胞)中嗜鉻細胞分泌素A陽性細胞之比例並無特別限制，可為約50%以上(例如約55%以上)、約60%以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上。
於本發明中，包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞(起始原料之細胞)中之鹼性磷酸酶陽性細胞之比例並無特別限制，可為1%以下、0.5%以下、0.01%以下、0.008%以下、0.005%以下、0.001%以下。
於本發明中，包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞(起始原料之細胞)中之Ki67陽性細胞之比例可為約50%以下或約30%以下，MAFA基因或其蛋白質之表現量可為於胰島中MAFA基因或其蛋白質表現量之約20%以下或約10%以下，升糖素陽性且胰島素陰性細胞之比例 可為約2.5%以下或約1%以下，嗜鉻細胞分泌素A陽性細胞之比例可為約50%以上且鹼性磷酸酶陽性細胞之比例可為約1%以下。
內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團可使用將多潛能幹細胞分化誘導為胰臟β細胞之公知手法獲得。亦即，可利用以下之分化誘導步驟獲得各目的之細胞集團：步驟1)從多潛能幹細胞分化誘導為胚胎內胚層細胞；步驟2)從胚胎內胚層細胞分化誘導為原腸管細胞；步驟3)從原腸管細胞分化誘導為後前腸細胞；步驟4)從後前腸細胞分化誘導為胰臟前驅細胞；步驟5)從胰臟前驅細胞分化誘導為內分泌前驅細胞；步驟6)從內分泌前驅細胞分化誘導為胰島素產生細胞。
以下，將各步驟加以說明，惟，分化誘導成為各細胞並不限於該等手法。
步驟1)分化誘導為胚胎內胚層細胞
多潛能幹細胞首先分化為胚胎內胚層細胞。從多潛能幹細胞誘導胚胎內胚層之方法為公知，可使用其中之任一種方法。多潛能幹細胞較佳以含有活化素A之培養基，更佳以含有活化素A、ROCK阻礙劑、GSK3β阻礙劑之培養基培養，分化為胚胎內胚層細胞。培養開始時之細胞數並無特別限制，為22000至150000cells/cm2，較佳為22000至100000cells/cm2，更佳為22000至80000cells/cm2。培養期間為1日至4日，較佳為1日至3日，更佳為3日。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中二氧化碳之濃度為例如約5%。
於本步驟使用之培養基可使用RPMI 1640培養基、MEM培養基、iMEM培養基、DMEM/F12培養基、Improved MEM Zinc Option培養基等於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。
活化素A於培養基中之濃度通常為30至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，更佳為70至120ng/mL，最佳為約100ng/mL。
作為其他之態樣，活化素A於培養基中之濃度為約0.1至100ng/mL，較佳為約1至50ng/mL，更佳為約3至10ng/mL。
GSK3β阻礙劑於培養基中之濃度可根據使用之GSK3β阻礙劑之種類適當設定，例如使用CHIR99021作為GSK3β阻礙劑時之濃度通常為1至10μM，較佳為2至5μM，更佳為2至4μM，最佳為約3μM。
ROCK阻礙劑於培養基中之濃度可根據使用之ROCK阻礙劑之種類適當設定，例如使用Y27632作為ROCK阻礙劑時之濃度通常為5至20μM，較佳為5至15μM，更佳為約10μM。
具體而言，以含有活化素A、ROCK阻礙劑、GSK3β阻礙劑之培養基培養1日後以只含有活化素A之培養基每日交換培養基並再培養2日。
步驟2)分化為原腸管細胞
將於步驟1)獲得之胚胎內胚層細胞再以含有增殖因子之培養基培養，分化誘導為原腸管細胞。培養期間為2日至8日，較佳為約4日。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中二氧化碳之濃度為例如約5%。
培養基與步驟1)相同，可使用於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。培養基除了增殖因子之外，亦可適當添加血清代替物、維生素、抗生物質等。
增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF，最佳為KGF。
增殖因子於培養基中之濃度可根據使用之增殖因子之種類適當設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。為EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。為FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF作為增殖因子時之濃度通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，更佳為約50ng/mL。
步驟3)分化為後前腸細胞
將於步驟2)獲得之原腸管細胞再以含有增殖因子、環巴胺(Cyclopamine)、Noggin等之培養基培養，分化誘導為後前腸細胞。培養期間為1日至5日，較佳為約2日。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中二氧化碳之濃度例如為約5%。
培養基與步驟1)相同，可使用培養哺乳類細胞所使用之基本培養基。培養基除了增殖因子之外亦可適當添加血清代替物、維生素、抗生物質等。
增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF，最佳為KGF。
增殖因子於培養基中之濃度可根據使用之增殖因子之種類適當設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。為EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。為FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF作為增殖因子時之濃度通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，更佳為約50ng/mL。
環巴胺於培養基中之濃度並無特別限制，通常為0.5至1.5μM，較佳為0.3至1.0μM，更佳為約0.5μM。
Noggin於培養基中之濃度並無特別限制，通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，更佳為約100ng/mL。
步驟4)分化為胰臟前驅細胞
將於步驟3)獲得之後前腸細胞再以含有具有CDK8/19阻礙活性之因子之培養基，較佳以含有具有CDK8/19阻礙活性之因子及增殖因子之培養基培養，分化誘導為胰臟前驅細胞。培養期間為2日至10日，較佳為約5日。
將於步驟3)獲得之後前腸細胞依照已記載(Toyoda et al,Stem cell Research(2015)14,185-197)，以0.25%胰蛋白酶-EDTA處理後藉由吸液使分散，將0.25%胰蛋白酶-EDTA離心分離並懸濁後再接種於步驟4之新的培養基中。
培養基與步驟1)相同，可使用於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。培養基除了增殖因子之外亦可適當添加血清代替物、維生素、抗生物質等。
作為具有CDK8/19阻礙活性之因子可使用前述之各種化合物或其其鹽，對應所使用之化合物或其鹽可適當決定於培養基中之添加量，通常為約0.00001μM-5μM，較佳為0.00001μM-1μM。具有CDK8/19阻礙活性之因子於培養基中之濃度對於CDK8/19較佳為可達到50%以上阻礙活性之濃度。
增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為KGF及/或EGF，最佳為KGF及EGF。
增殖因子於培養基中之濃度可根據使用之增殖因子之種類適當設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。為EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。為FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF及EGF作為增殖因子時之濃度，KGF通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，更佳為約50ng/mL，EGF通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，更佳為約100ng/mL。
於步驟4)中培養開始之第1日於ROCK阻礙劑存在下進行，之後可使用未含有ROCK阻礙劑之培養基培養。
於任何一個步驟，培養基除了上述成分之外亦可添加血清代替物(例如B-27supplement、ITS-G)。又，必要時亦可添加胺基酸、L-麩胺酸、Glutamax(製品名)、非必須胺基酸、維生素、抗生物質(例如Antibiotic-Antimycotic(本說明書中亦稱為AA)、盤尼西林、鏈黴素或該等之混合物)、抗菌劑(例如兩性黴素B(Amphotericin B)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。於培養基中添加抗生物質時，其培養基中之濃度通常為0.01至20重量%，較佳為0.1至10重量%。
又，細胞培養未使用餵養細胞，以黏著培養進行。培養時使用皿、燒瓶、微盤、OptiCell(商品名)(Nunc公司製造)等細胞培養片等培養容器。培養容器為了提昇與細胞之黏著性(親水性)，較佳進行表面處 理或以膠原、明膠、聚-L-賴胺酸、聚-D-賴胺酸、層黏連蛋白(laminin)、纖連蛋白(Fibronectin)、基膠質(Matrigel)(例如：BD Matrigel(日本Becton,Dickinson公司製造))、玻璃黏連蛋白(vitronectin)等細胞黏著用基質加以塗覆。培養容器較佳為以Type I膠原、基膠質、纖連蛋白、玻璃黏連蛋白或聚-D-賴胺酸等塗覆之培養容器，更佳為以基質膠或聚-D-離胺酸塗覆之培養容器。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中二氧化碳之濃度例如為約5%。
於步驟4)獲得之胰臟前驅細胞可利用為公知之表面標記之糖蛋白質2(GP2)等再純化。上述純化可使用本體公知之方法，例如使用將抗GP2抗體固定化之珠進行。
步驟5)分化為內分泌前驅細胞
將於步驟4)獲得之胰臟前驅細胞再以含有增殖因子之培養基培養，分化誘導內分泌前驅細胞。培養期間為2日至3日，較佳為約2日。
培養基與步驟1)相同，可使用於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。培養基可依照已記載(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)添加SANT1、視網酸(retinoic acid)、ALK5抑制劑II、T3、LDN，再者，亦可適當添加Wnt阻礙薬、ROCK阻礙劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生物質等。
又，細胞培養未使用餵養細胞，以非黏著培養進行。培養時使用皿、燒瓶、微盤、多孔盤(Nunc公司製造)等或生物反應器。培養容器為了降低與細胞之黏著性，以進行表面處理較佳。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中二氧化碳之濃度例如為約5%。
步驟6)分化為胰島素產生細胞
將於步驟5)獲得之內分泌前驅細胞再以含有增殖因子之培養基培養，分化誘導為胰島素產生細胞。培養期間為7日至15日，較佳為約7至10日。
增殖因子使用論文(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)中記載之因子，除此之外，亦有添加γ-分泌酶(secretase)阻礙薬、Wnt阻礙薬、ROCK阻礙劑、FGF者，較佳為FGF2。
培養基與步驟1)相同，可使用於培養哺乳類細胞中使用之基本培養基。培養基可依照已記載(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶阻礙劑XX，再者，亦可適當添加Wnt阻礙薬、ROCK阻礙劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生物質等。
又，細胞培養未使用餵養細胞，以非黏著培養進行。培養時使用皿、燒瓶、微盤、多孔盤(Nunc公司製造)等或生物反應器。培養容器為了降低與細胞之黏著性，以進行表面處理較佳。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中二氧化碳之濃度例如為約5%。
於本發明中之「含有褐藻酸之凝膠」可以公知之手法(WO2010/032242、WO2011/154941)為基準製作，可藉由於褐藻酸鹽、褐藻酸酯或褐藻酸修飾物之溶液中添加交聯劑使凝膠化而獲得。
褐藻酸鹽只要是水溶性之鹽即可，可利用金屬鹽、銨鹽等。例如可適當使用褐藻酸鈉、褐藻酸鈣、褐藻酸銨等。
褐藻酸酯(亦稱為褐藻酸丙二醇)為於褐藻酸之羧基與丙二醇進行酯鍵結之衍生物。褐藻酸修飾物為例如以細胞黏著活性序列(精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸)修飾之RGD修飾褐藻酸。
褐藻酸鹽中含有之甘露糖醛酸與葡萄糖醛酸(guluronic acid)之比例(M/G比)(於本說明書中將該比例亦稱為「等級(grade)」)為任意，通常於M>G時，可形成柔軟性豐富之凝膠，於M<G時，可形成強固之凝膠。於本發明，可利用以10至90%、20至80%、30至70%或、40至60%之比例含有葡萄糖醛酸者。
褐藻酸鹽、褐藻酸酯或褐藻酸修飾物於溶劑中含有之量為0.05至10重量%，較佳為0.1至5重量%，更佳為0.5至3重量%。溶劑只要可將褐藻酸鹽、褐藻酸酯或褐藻酸修飾物溶解者即可，可利用水、生理食鹽水等。
交聯劑只要可將褐藻酸鹽、褐藻酸酯或褐藻酸修飾物之溶液凝膠化者即可，並無特別限制，可利用多價之金屬陽離子。多價之金屬陽離子較佳為2價之金屬陽離子，更佳為鈣離子、鍶離子、鋇離子。交聯 劑可利用鹽之形態，於本發明可利用至少一種選自氯化鈣、氯化鍶、氯化鋇作為交聯劑。Hystem之交聯亦可使用聚乙二醇二丙烯酸酯。
含有褐藻酸之凝膠亦可含有奈米纖維。奈米纖維為具有奈米領域之直徑之天然或合成之纖維。天然奈米纖維可列舉含有一種或多種之膠原、纖維素、絲蛋白、角蛋白、明膠、殼聚糖等多糖類者。合成奈米纖維可列舉聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺基甲酸酯(PU)、聚(乳酸-甘醇酸共聚物)(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物)(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)(PEVA)等。奈米纖維於含有褐藻酸之凝膠中可含有未達1重量%，例如0.9重量%、0.8重量%、0.7重量%、0.6重量%、0.5重量%或未達該等之量。於含有褐藻酸之凝膠中含有之奈米纖維量之下限並無特別限制，可作成0.05重量%以上，較佳為0.1重量%以上。
於本發明中，「包埋」係指將內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團分散。並收容於含有褐藻酸之凝膠中。
細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠可藉由將細胞集團於褐藻酸鹽、褐藻酸酯或褐藻酸修飾物之溶液中混合使凝膠化而進行。
細胞集團於褐藻酸鹽、褐藻酸酯或褐藻酸修飾物之溶液中可含有選自1×104細胞至1×109細胞/mL，較佳為1×107細胞至1×108細胞/mL之量。
含有細胞集團之褐藻酸鹽、褐藻酸酯或褐藻酸修飾物之溶液之凝膠化可以於該溶液中添加交聯劑而進行。添加之交聯劑之量對於該溶液可為選自0.1至5重量%，例如0.1至1重量%之量。凝膠化可於具 有用於細胞培養或細胞移植規定之構成及/或形狀之容器內，或設計成於該容器中可獲得適合之凝膠之模具內進行。
亦可以公知之手法(WO2010/010902)為基準，藉由形成含有褐藻酸之凝膠膠囊進行。亦即，對於交聯劑之溶液滴下含有細胞集團之褐藻酸鹽、褐藻酸酯或褐藻酸修飾物之溶液進行。可對應滴下時噴嘴之形狀或滴下方法調整液滴的大小，進一步可規定含有褐藻酸之凝膠膠囊之大小。滴下方法並無特別限制，可藉由空氣噴霧、無氣噴霧方式、靜電噴霧法等手法進行。含有褐藻酸之凝膠膠囊之大小並無特別限制，可作成直徑為5mm以下、1mm以下、500μm以下。交聯劑溶液可含有選自0.1至10重量%，例如0.1至5重量%之量之交聯劑。含有褐藻酸之凝膠膠囊可以具有0.1μm至50μm孔之薄膜將周圍包覆。
包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞集團可於分化為目的細胞集團之步驟中進行。使分化之步驟亦可藉由將該細胞集團提供給上述之培養方法進行，亦可藉由移植於動物生體內進行。尤其是分化為胰臟β細胞集團之步驟，可藉由將包埋於含有褐藻酸之凝膠中之內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團移植於動物生體內進行。
「動物」較佳為哺乳動物，可列舉例如人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、綿羊、山羊、大羊駝、狗、貓、兔子、小鼠、天竺鼠等，較佳為人類。
移植較佳為於可將包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞集團固定於一定位置之生體內領域進行，例如可於動物之皮下、腹腔內、腹膜上皮、大網、脂肪組織、肌肉組織或胰臓、腎臓等各臓器之被膜下等進 行。可將包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞集團包封於膠囊、袋子、室等裝置中，移植到生體內。移植之細胞數可依據移植細胞之分化階段、移植對象之疾病嚴重度、年齡、體重、移植部位之大小等要因變化，並無特別限制，可作成例如約10×104細胞至10×1011個。移植之細胞集團可於生體內環境分化誘導，分化為目的之細胞集團，較佳分化為胰臟β細胞集團，之後可回收，亦可以原狀留置在生體內。
藉由將內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中使分化，可抑制Ki67陽性細胞於該細胞集團中增殖。
於本手法不是抑制畸胎瘤增殖，而是可減少或抑制胰系譜中含有之增殖性細胞之殘存數。
於本手法，不是抑制iPS細胞之增殖，而是可減少或抑制胰系譜中含有之增殖性細胞之殘存數。
根據本手法，與未包埋於含有褐藻酸之凝膠中使分化之情況比較，可減低於分化誘導後獲得之細胞集團中Ki67陽性細胞之絶對數。藉由此，可使於分化誘導後獲得之細胞集團中之Ki67陽性細胞耗竭。亦即，分化誘導後獲得之細胞集團中Ki67陽性細胞之比例有可能比未包埋於含有褐藻酸之凝膠中進行分化之情況低，該比例可作成未達10%、未達9%、未達8%、未達7%、未達6%、未達5%、未達4%、未達3%、未達2%或未達1%，較佳可作成未達3%、未達2%或未達1%。
另一方面，於本手法，對於內分泌前驅細胞或於之後分化階段之細胞之增殖及/或分化無影響或影響小，於分化誘導後獲得之細胞集團中，目的之胰島素產生細胞或胰臟β細胞之絶對數與未包埋於含有褐藻酸之凝膠中進行分化之情況比較，未產生顯著差。藉由此，可使於分化誘導後獲得之細胞集團中目的胰島素產生細胞或胰臟β細胞富化。亦即，分化誘導後獲得之細胞集團中目的胰島素產生細胞或胰臟β細胞之比例有可能比未包埋於含有褐藻酸之凝膠中使分化之情況增加，該比例可作成40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
將藉由本手法獲得之胰島素產生細胞或胰臟β細胞移植到動物生體內，於動物生體內進行分化時，可以原狀留置，利用作為胰島素分泌細胞。
將藉由本手法獲得之胰島素產生細胞、胰臟β細胞或本發明之包埋於含有褐藻酸之凝膠中之細胞集團移植到動物生體內，可利用作為糖尿病(1型糖尿病、2型糖尿病)、低血糖抑制劑等之醫藥。
又，包埋於含有褐藻酸之凝膠中移植之細胞集團可回避或降低干擾宿主之免疫系統，可達成該細胞集團於宿主生體內之分化、增殖及/或維持。
以下，藉由實施例對本發明加以說明，惟，本發明不只限於該等實施例。
[實施例]
實施例I：經由移植包埋於含有褐藻酸之凝膠的內分泌前驅細胞，移植物中目的外細胞(Ki67陽性細胞)之減少/增殖抑制(I)
1.方法
(1)將內分泌前驅細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠
從人類iPS細胞將內分泌前驅細胞分化誘導製作之內分泌前驅細胞與3重量%之褐藻酸(PRONOVA SLG100)溶液混合，將該細胞分散液填充於內徑1cm2、厚約500μm之圓形模型中，使用鍶進行交聯，製作將細胞分散包埋之含有褐藻酸之凝膠片。
(2)內分泌前驅細胞之生體內移植
使用免疫不全NOD/SCID小鼠，以已知之方法將於移植部位以bFGF處置誘導血管新生後，將於上述(1)獲得之內分泌前驅細胞包埋凝膠片移植到背部皮下。比較例為將未包埋於含有褐藻酸之凝膠之胰內分泌前細胞移植到腎被膜下。於移植後69日之時點及移植後6個月之時點取出各個之移植物。
(3)移植物中目的外細胞之評估
將於移植後69日之時點取出之移植物固定、脫水後製作凍結切片，為了評估目的外細胞，實施免疫組織染色。於可期待於胰島素分泌細胞中成熟之目的細胞以嗜鉻細胞分泌素A(CHGA)陽性/NKX6.1陽性作為指標，於有可能對於目的細胞之長期存活帶來惡影響之目的外細胞以PDX1弱陽性或陰性/Ki67陽性作為指標進行評估。
又，將於移植後6個月之時點取出之移植物藉由100mM檸檬酸鈉水溶液將褐藻酸進行脫交聯，回收細胞。回收之細胞藉由0.25%胰蛋白酶-EDTA處理，使分散後固定，進行流式細胞術。目的外細胞以Ki67陽性/胰島素陰性作為指標，目的細胞以胰島素陽性/NKX6.1陽性及升糖素陽性/胰島素陰性作為指標，各個進行評估。又，本說明書中，「Ki67陽性/胰島素陰性」、「胰島素陽性/NKX6.1陽性」、「升糖素陽性/胰島素陰性」等之表記中使用之「/」係指「及」。
2.結果
第1圖表示於移植後69日之時點取出之移植物免疫組織染色之結果。將內分泌前驅細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠並移植到皮下之情況與未包埋於凝膠並移植到腎被膜下之情況進行比較，確認移植物中含有之Ki67陽性細胞數為約1/10。藉由該結果顯示藉由包埋於含有褐藻酸之凝膠再進行移植，Ki67陽性細胞係減少或抑制其增殖。
第2圖表示從移植後6個之時點取出之移植物回收之細胞之流式細胞術分析結果。藉由將內分泌前驅細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠移植到皮下，產生分化為目的細胞之胰島素陽性/NKX6.1陽性細胞(第2圖(A)、移植前1.0%(n=1)、移植後10.8±3‧6%(n=4))同時確認為目的外細胞之Ki67陽性/胰島素陰性細胞急劇的減少(第2圖(B)、移植前33.0%(n=1)、移植後1.2±0.3%(n=4))。
實施例II：將含有增殖性細胞之胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠並移植後，目的外增殖性細胞之減少
1.方法
(1)將胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠
從人類iPS細胞將胰島素產生細胞分化誘導製作之胰島素產生細胞與3重量%之褐藻酸(PRONOVA SLG100)溶液混合，將該細胞分散液填充於內徑1cm2、厚約500μm之圓形模型中，使用鍶進行交聯，製作將細胞分散包埋之含有褐藻酸之凝膠片。
(2)胰島素產生細胞之生體內移植
使用免疫不全NOD/SCID小鼠，將於上述(1)獲得之胰島素產生細胞包埋凝膠片移植到背部皮下。於移植後6個月之時點取出各個之移植物。
(3)移植物中目的外細胞之評估
於移植後6個月之時點取出之移植物藉由100mM檸檬酸鈉水溶液將褐藻酸進行脫交聯，將細胞回收。回收之細胞藉由0.25%胰蛋白酶-EDTA處理，使分散後固定，進行流式細胞術。目的外之增殖性細胞以Ki67陽性/胰島素陰性作為指標，目的細胞以胰島素陽性/NKX6.1陽性及升糖素陽性/胰島素陰性作為指標，各個進行評估。
2.結果
於移植後6個月之時點取出之移植物維持與移植前相同之外觀。表1表示從取出之移植物回收之細胞流式細胞術分析之結果。藉由將含有增殖性細胞之胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠，移植到皮下，確認移植前含有之目的外之增殖性細胞顯著減少。同時確認升糖素陽性/胰島素陰性細胞率上昇，確認分化為胰島樣細胞。
實施例III：藉由將胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠，於體外培養之目的外細胞(Ki67陽性細胞)減少(I)
1.方法
(1)將胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠
將從人類iPS細胞將胰島素產生細胞分化誘導所製作之胰島素產生細胞，如表2所示之處方，與濃度(0.5-3重量%)及等級(PRONOVA SLG100(G/M比：≧1.5)，NOVATACH MVG GRGDSP(G/M比：≧1.5)，PRONOVA UP VLVM(G/M比：≦1))不同之褐藻酸溶液混合，將該細胞分散液填充於內徑1cm2、厚約500μm之圓形模型中，使用 鍶水溶液或鈣水溶液進行交聯，製作將細胞分散包埋之含有褐藻酸之凝膠片。彈性(Pa)以流變計(黏彈性測定裝置)測定。
(2)胰島素產生細胞之體外培養
將包埋於水凝膠之胰島素產生細胞及未包埋之胰島素產生細胞(比較例)於含有用於分化胰島素產生細胞之增殖因子之培養基中培養，於培養7日後回收。
(3)目的外細胞之評估
藉由100mM檸檬酸鈉水溶液將褐藻酸脫交聯，將包埋於含有褐藻酸之凝膠之內分泌前驅細胞從凝膠中回收。將回收之內分泌前驅細胞藉由0.25%胰蛋白酶-EDTA處理，使分散後固定，使用流式細胞術，評估Ki67陽性細胞數，比較培養前後細胞數之變化率。
2.結果
表3表示於培養前後Ki67陽性細胞數之變化率。
比較例之變化率增加約20%，相對的，於實施例幾乎看不到變化。
實施例IV：藉由將胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠，於體外培養目的外細胞(Ki67陽性細胞)之減少(II)
1.方法
(1)將胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸之凝膠
從人類iPS細胞將胰島素產生細胞分化誘導製作之胰島素產生細胞與PRONOVA SLG100(G/M比：≧1.5)之褐藻酸溶液以表4指定之細胞密度混合，將該細胞分散液填充於內徑1cm2、厚約500μm之圓形模型中，使用鍶水溶液進行交聯，製作將細胞分散包埋之含有褐藻酸之凝膠片。
(2)胰島素產生細胞之體外培養
將包埋於水凝膠之胰島素產生細胞及未包埋之胰島素產生細胞(比較例)於含有用於分化胰島素產生細胞之增殖因子之培養基中，以表4指定之氧條件進行培養，於培養6日後回收。
(3)目的外細胞之評估
藉由100mM檸檬酸鈉水溶液將褐藻酸脫交聯，將包埋於含有褐藻酸之凝膠之內分泌前驅細胞從凝膠中回收。將回收之內分泌前驅細胞藉由0.25%胰蛋白酶-EDTA處理，使分散後固定，使用流式細胞術，評估Ki67陽性細胞數，比較培養前後細胞數之變化率。
2.結果
表5表示培養前後Ki67陽性細胞數之變化率。
比較例之變化率增加約5%，相對的，於實施例全都減少。
實施例V：將胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸及細胞外基質之凝膠，於體外培養之目的外細胞(Ki67陽性細胞)之減少
1.方法
(1)將胰島素產生細胞包埋於含有褐藻酸及細胞外基質之凝膠
從人類iPS細胞將胰島素產生細胞分化誘導製作之胰島素產生細胞如表6指定之處方，與等級(PRONOVA SLG100(G/M比：≧1.5)、NOVATACH MVG GRGDSP(G/M比：≧1.5)、NOVATACH M REDV(G/M比：≦1)、NOVATACH G VAPG(G/M比：≧1.5))不同之褐藻酸溶液及Hystem、Hystem-C、Hystem-HP或明膠混合，將該細胞分散液填充於內徑1cm2、厚約500μm之圓形模型中，使用鍶水溶液或除此之外再使用聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液進行交聯，製作將細胞分散包埋之含有褐藻酸及細胞外基質之凝膠片。
(2)胰島素產生細胞之體外培養
將包埋於水凝膠之胰島素產生細胞及未包埋之胰島素產生細胞(比較例)於含有分化胰島素產生細胞用增殖因子之培養基中培養7日後回收。
(3)目的外細胞之評估
藉由100mM檸檬酸鈉水溶液將褐藻酸脫交聯，將包埋於含有褐藻酸及細胞外基質之凝膠之胰島素產生細胞從凝膠中回收。將回收之胰島素產生細胞藉由0.25%胰蛋白酶-EDTA處理，使分散後固定，使用流式細胞術，評估Ki67陽性細胞數，比較培養前後細胞數之變化率。
2.結果
表7表示培養前後Ki67陽性細胞數之變化率。
比較例之變化率增加約5.2%，相對的，於實施例幾乎未看到變化或減少。於凝膠中添加可成為細胞支架之細胞外基質之情況，亦確認可抑制Ki67陽性細胞之增殖。
實施例VI：評估於含有奈米纖維之褐藻酸膠囊中iPS細胞之增殖性
將人類iPS細胞與添加1重量%奈米纖維(「必菲斯(BiNFi-s)」(sugino)；等級AFo-100，平均纖維徑10-50nm)及3重量%褐藻酸(PRONOVA SLG100)之溶液混合，將獲得之混合液滴入氯化鋇溶液中，製作包埋有iPS細胞之含有奈米纖維之褐藻酸凝膠膠囊。
將獲得之凝膠膠囊加入培養基中，於確認經包埋之iPS細胞之增殖性時，與未含有奈米纖維之褐藻酸膠囊比較，確認抑制因增殖引起之細胞漏出而形成安定之細胞塊。

Claims (15)

  1. 一種製造方法，為製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法，該製造方法包含：(1)將胰島素產生細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中之步驟及(2)使經包埋之細胞集團分化之步驟。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其於(1)中該凝膠再含有奈米纖維。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之製造方法，其於(2)中進行分化之步驟為藉由移植到動物而進行。
  4. 一種減少或抑制方法，為減少存在於內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團中之Ki67陽性細胞數之方法或抑制該陽性細胞增殖之方法，包含將該細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其係不減少存在於該細胞集團中之內分泌前驅細胞或於之後分化階段之細胞數。
  6. 如申請專利範圍第4項或第5項所述之方法，其中，該凝膠再含有奈米纖維。
  7. 一種含有褐藻酸之凝膠，係包埋有含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之凝膠，其中，該細胞集團之Ki67陽性細胞未達1%。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之凝膠，其中，該細胞集團為源自多潛能幹細胞之細胞集團。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之凝膠，其中，該凝膠係為了糖尿病之治療方法而使用者。
  11. 一種糖尿病之治療方法，為將含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠，並固定於生體內。
  12. 一種含有褐藻酸之凝膠，為用於抑制存在於內分泌前驅細胞集團或於之後分化階段之細胞集團中之Ki67陽性細胞之增殖。
  13. 一種含有褐藻酸之凝膠之使用，係用於製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之醫藥。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，該製造方法為製造含有Ki67陽性細胞未達1%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法。
  15. 一種製造方法，為製造含有Ki67陽性細胞未達3%之胰島素產生細胞集團或胰臟β細胞集團之方法，該製造方法包含：(1)將細胞純化之步驟、(2)將胰島素產生細胞集團包埋於含有褐藻酸之凝膠中之步驟及(3)使經包埋之細胞集團分化之步驟。
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