CN111868235A - 水凝胶胶囊 - Google Patents

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豊田太郎
持田泰佑
田上宽
伊藤亮
木本香哉
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Kyoto University NUC
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Kyoto University NUC
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Abstract

本发明的目的是提供一种去除与经诱导分化的胰岛素分泌细胞共存的、具有高增殖性的Ki67阳性细胞的方法。一种制造包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法，所述方法包括将内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中并使其分化。

Description

水凝胶胶囊
技术领域
本发明涉及一种去除通过诱导多能干细胞分化而获得的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群中存在的、具有高增殖性的Ki67阳性细胞的方法。
背景技术
关于诱导多能干细胞(如iPS细胞和ES细胞)分化为胰岛素分泌细胞(如胰岛素产生细胞和胰腺β细胞)，以应用于治疗糖尿病的研究正在进行中。
迄今为止，已经开发/报道出多种技术来诱导多能干细胞分化为胰岛素分泌细胞。非专利文献1示出，可以使用基于藻酸基的支架培养衍生自人ES细胞的胰腺祖细胞，已经证实在所有测试的培养条件下、胰岛素/PDX1的表达稳定或减少、胰高血糖素/生长抑素的表达增加、β细胞相关联基因的表达减少。
此外，关于将胰岛素分泌细胞移植到体内的方法的研究也正在进行中，并且据报道，通过使用将胰岛用藻酸水凝胶封闭的***而将其移植到体内可以避免干扰受体的免疫***(专利文献1和2)。
然而，迄今为止，在对衍生自多能干细胞的内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群进一步诱导分化而获得的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群中混有高增殖性的细胞这一事实尚不为人所知，并且也未研究过如何去除这种细胞。
现有技术文献
专利文献
[专利文件1]WO 2010/032242
[专利文件2]WO 2011/154941
非专利文献
[非专利文献1]J Biomed Mater Res A.2015年12月；103(12)：3717-26。
发明内容
发明所要解决的技术问题
本申请的发明人发现，在从多能干细胞向胰岛素产生细胞或胰腺β细胞诱导分化的细胞群中，存在与这些胰岛素分泌细胞(胰岛素产生细胞和胰腺β细胞)一起的、以Ki67标记物阳性为特征的高增殖性的细胞(下文描述为“Ki67阳性细胞”)。
从安全性的角度出发，当将经诱导分化的胰岛素分泌细胞应用于糖尿病等的治疗时，严格控制除胰岛素分泌细胞以外的细胞极为重要。此外，具有高增殖性的细胞的污染/残留可能对受体有不利的影响或对经移植的胰岛素分泌细胞的长期生存产生影响，是不期望的。
因此，本发明的目的是提供一种去除与经诱导分化的胰岛素分泌细胞共存的具有高增殖性的Ki67阳性细胞的方法。
用于解决问题的技术手段
本申请的发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，将诱导多能干细胞分化而获得的内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中使其进行进一步分化，可减少Ki67阳性细胞的数量或抑制该细胞的增殖，并可以获得Ki67阳性细胞含量减少的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群。
本发明基于这些新知识，包括以下发明。
[1]一种制备包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法，所述方法包括：
(1)将胰岛素产生细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中的步骤；以及(2)使得所包埋的细胞群分化的步骤。
[1-1]一种制备包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法，所述方法包括：
(1)将内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群包埋于包含藻酸的凝胶的步骤；以及(2)使得所包埋的细胞群分化的步骤。
[1-2]根据[1]或[1-1]所述的方法，其中，所述方法是制造少于1％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法。
[2]根据[1]或[1-1]所述的方法，其中，(1)中所述的凝胶进一步包含纳米纤维。
[3]根据[1]至[2]中任一项所述的方法，其中，(2)中使得所包埋的细胞群分化的步骤是通过将其移植到动物中来进行的。
[4]一种减少内分泌祖细胞或处于其后的分化阶段的细胞群中存在的Ki67阳性细胞的数量的方法，或抑制所述阳性细胞增殖的方法，所述方法包括：
将所述细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中。
[4-1]一种抑制内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群中存在的Ki67阳性细胞增殖的方法，该方法包括：
将所述细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中。
[4-2]根据[4]所述的方法，其中，减少所述细胞群中存在的Ki67阳性细胞的绝对数。
[5]根据[4]至[4-2]中任一项所述的方法，其中，所述方法不减少所述细胞群中存在的内分泌祖细胞或处于其后的分化阶段的细胞的数量。
[5-1]根据[4]至[4-2]中任一项所述的方法，其中，所述方法不减少所述细胞群中存在的内分泌祖细胞或处于其后的分化阶段的细胞，以及非Ki67阳性细胞的数量。
[6]根据[4]至[5-1]中任一项所述的方法，其中，所述凝胶进一步包含纳米纤维。
[7]一种包含藻酸的凝胶，所述凝胶中包埋了包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群。
[7-1]根据[7]所述的包含藻酸的凝胶，其中，所述细胞群的Ki67阳性细胞数少于1％。
[7-2]根据[7]所述的包含藻酸的凝胶，其中，所述细胞群是多能干细胞衍生的细胞群。
[7-3]根据[7]所述的包含藻酸的凝胶，其中，所述凝胶在用于治疗糖尿病的方法中使用。
[8]根据[7]所述的包含藻酸的凝胶，其中，所述凝胶进一步包含纳米纤维。
[9]一种制造包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法，所述方法包括：
(0)包括本说明书中所描述的任何一种方法(例如，段落[0055]至[0086]中的任何一种方法)的步骤，
(1)将胰岛素产生细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中的步骤；以及
(2)使得所包埋的细胞群分化的步骤。
[10]一种通过在体内固定包含藻酸的凝胶来治疗糖尿病的方法，所述凝胶中包埋了包含少于3％的Ki67阳性细胞胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群。
[11]包含藻酸的凝胶，用于抑制内分泌祖细胞或处于其后的分化阶段的细胞群中存在的Ki67阳性细胞的增殖。
[12]包含藻酸的凝胶在制造包含胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的药物中的用途，所述胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群包含少于3％的Ki67阳性细胞。
[13]一种制造包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法，所述方法包括：
(1)纯化细胞的步骤；
(2)将胰岛素产生细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中的步骤；以及
(3)使得所包埋的细胞群分化的步骤。
本说明书包含作为本申请优先权的基础的日本专利申请2018-051297的说明书和/或附图中描述的内容。
在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都按原样通过引用并入本文。
发明效果
根据本发明，可以提供一种去除与经诱导分化的胰岛素分泌细胞共存的具有高增殖性的Ki67阳性细胞的方法。
附图说明
图1是表示将内分泌祖细胞包埋于包含藻酸的凝胶中并进行移植后的移植后第69天的Ki67阳性细胞增殖抑制效果的照片。
图2是显示从移植6个月后时取出的移植物中收集的细胞的流式细胞术结果的图。示出了在移植前后作为目标细胞的胰岛素阳性/NKX6.1阳性细胞的比例(A)和在移植前后作为目标外细胞的Ki67阳性/胰岛素阴性细胞的比例(B)。
具体实施方式
1.术语
在下文中，将描述在本说明书中使用的术语。
本说明书中，示出了“约”是指相对于基准值的正负分别25％、20％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或直到1％的波动值。优选地，术语“约”或“大约”表示相对于基准值的正负分别15％、10％、5％或1％的范围。
本说明书中，短语“包括/包含(comprise(s)或comprising)”是指包括/包含但不限于该短语之后的要素。因此，建议包括/包含该短语之后要素，但不建议排除任何其他要素。
本说明书中，短语“由……组成(consist(s)of或consisting of)”是指包括且限于该短语之后的任何要素。因此，短语“由……组成”表示所列举的要素是所要求的或是必需的，而其他要素实质上是不存在的。
本说明书中，不“使用饲养细胞”是指基本上不包含饲养细胞，不使用通过对饲养细胞进行培养来预调理的培养基等。因此，培养基中不包含饲养细胞分泌的成长因子及细胞因子等物质。
另外，“饲养细胞(feeder cell)”或“饲养细胞(feeder)”是指与另一种种类的细胞共培养以支持该细胞并提供可成长的环境的细胞。饲养细胞可以与它们支持的细胞衍生自相同或不同的物种。例如，可以使用人皮肤成纤维细胞或人胚胎干细胞作为人细胞的饲养细胞(feeder)，也可以使用小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物及永生化小鼠胚胎成纤维细胞。饲养细胞可以通过辐射或丝裂霉素C处理等而失活。
本说明书中，“粘附”是指细胞附着于容器，例如，细胞在合适的培养基存在下附着于无菌塑料(或涂覆的塑料)细胞培养皿或烧瓶。除非粘附于细胞培养容器，否则某些细胞无法在培养物中维持或成长。相比之下，非粘附细胞可以在不粘附于容器的情况下在培养物中维持、增殖。
本说明书中，“培养”是指在体外环境中维持细胞、使其成长和/或使其分化。“进行培养”是指在组织中或体外，例如，在细胞培养皿或烧瓶中，使细胞维持、增殖(成长)和/或分化。
本说明书中，“富集(enrich)”和“富集(enrichment)”是指增加细胞组合物等组合物中特定组分的量；“富集的(enriched)”是指细胞组合物，例如，如果用于说明细胞群的话，是指特定组分的量与在富集之前的细胞群中的该组分的比例相比增加的细胞群。例如，可以针对靶细胞类型富集细胞群等组合物，使得靶细胞类型的比例与在富集之前细胞群内存在的靶细胞的比例相比增加。还可以通过本领域已知的细胞选择和分选方法来就靶细胞类型富集细胞群。也可以通过本说明书所描述的特定分选或选择过程来富集细胞群。在本发明的特定实施方案中，通过富集靶细胞群的方法，细胞群相对于靶细胞群为至少富集20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。
本说明书中，“耗尽(deplete)”和“耗尽(depletion)”是指减少细胞或细胞组合物等组合物中特定成分的量；“耗尽的(depleted)”是指细胞或细胞组合物，例如，如果用于说明细胞群的话，是指特定组分的量与在耗尽之前的细胞群中的该组分的比例相比减少的细胞群。例如，可以针对靶细胞类型耗尽细胞群等组合物，使得靶细胞类型的比例与在耗尽之前细胞群内存在的靶细胞的比例相比减少。还可以通过本领域已知的细胞选择和分选方法来就靶细胞类型耗尽细胞群。也可以通过本说明书所描述的特定分选或选择过程来耗尽细胞群。在本发明的特定实施方案中，通过耗尽靶细胞群的方法，使细胞群相对于靶细胞群减少(耗尽)至少50％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。
本说明书中，“不减少细胞的数量”是指由于本发明方法的实施，细胞数不会显著减少，即是指该方法实施前的细胞数和该方法实施后的细胞数之间没有显著的差异。然而，可能发生不是由于本发明方法的实施而引起的细胞数的减少(例如，在现有已知的细胞培养和分化步骤中通常可能发生的细胞的自然死亡)。因此，“不减少细胞的数量”还包括与本发明方法实施前相比实施后的细胞减少率在30％以下、20％以下、10％以下或5％以下的情况。
本说明书中，“标记物”是指“标记物蛋白”或“标记物基因”等通过规定的细胞类型特异性表达的细胞抗原或其基因。优选地，标记物为细胞表面标记物，在这种情况下，可以实施生存细胞的浓缩、分离和/或检测。标记物可以是阳性选择标记物或阴性选择标记物。
标记物蛋白的检测可以使用对该标记物蛋白具有特异性的抗体进行免疫学测定，例如ELISA、免疫染色或流式细胞术。标记物基因的检测可以使用本领域已知的核酸扩增方法和/或核酸检测方法，例如RT-PCR、微阵列、生物芯片等。在本说明书中，标记物蛋白“阳性”是指通过流式细胞术检测为阳性，而“阴性”是指通过流式细胞术检测低于检测限。此外，标记物基因“阳性”是指通过RT-PCR检测为阳性，而“阴性”是指通过RT-PCR检测低于检测限。
本说明书中，“表达(expression)”定义为由细胞内启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
本说明书中，“具有CDK8/19抑制活性的因子”是指具有CDK8/19抑制活性的任何物质。与同一CDK家族的其他蛋白相比，CDK8对细胞增殖来说不是必要的，并且在通常情况下，对CDK8的抑制对细胞增殖的效果的影响不明显。CDK19和CDK8与上述类似，并且CDK8的抑制通常伴随CDK19的抑制。
“生长因子”是促进特定细胞的分化和/或增殖的内源蛋白。“生长因子”例如，表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、***1(IGF-1)、***2(IGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、运铁蛋白、各种白细胞介素(例如IL-1至IL-18)、各种集落刺激因子(例如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、各种干扰素(例如，IFN-γ等)及对干细胞有影响的其他细胞因子，例如，干细胞因子(SCF)及***(Epo)。
本说明书中，“ROCK抑制剂”是指抑制Rho激酶的物质(ROCK：Rho相关联、包含卷曲螺旋的蛋白激酶)，也可以是抑制ROCK I和ROCK II中任意一种的物质。ROCK抑制剂只要具有上述功能就没有特别限制，例如，N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺(在本说明书中，可以被称为Y-27632)、法舒地尔(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基]磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂(H-1152)、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯并-1甲酰胺(Wf-536)，N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-羧酰胺(Y-30141)，N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶基-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-甲酰胺(GSK429286A)。ROCK抑制剂不仅限于以上这些，也可以将针对ROCK的mRNA的反义寡核苷酸、siRNA、与ROCK结合的抗体、显性负ROCK突变体等用作ROCK抑制剂，其可商购或可根据已知方法合成。
本说明书中，“GSK3β抑制剂”是对GSK3β(糖原合酶激酶3β)具有抑制活性的物质。GSK3(糖原合酶激酶3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并参与许多与糖原产生、细胞凋亡、干细胞维持等有关的信号路径。GSK3具有α和β两个同种型。本发明中使用的“GSK3β抑制剂”只要具有GSK3β抑制活性就没有特别限制，可以是兼具GSK3β抑制活性和GSK3α抑制活性的物质。
作为GSK3β抑制剂，例示了CHIR 98014(2-[[2-[(5-硝基-6-氨基吡啶-2-基)氨基]乙基]氨基)-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑基-2-基)-2-嘧啶基)-氨基]乙基]氨基)尼古丁腈、TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮，SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚基-3-基)-1H-吡咯并-2,5-二酮)，TWS-119(3-[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氧基)酚、坎帕罗酮(Kenpaullone)、1-氮杂坎帕罗酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚基-3-基)-1H-吡咯并-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯并-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合物、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、锂等。GSK3β不限于以上这些，也可以将针对GSK3β的mRNA的反义寡核苷酸、siRNA、与GSK3β结合的抗体、显性负GSK3β突变体等用作GSK3β抑制剂，其可商购或可根据已知方法合成。
本说明书中，“血清替代物”是指例如，Knockout血清替代物(KSR：Invitrogen)，StemSure血清替代物(Wako)、B-27补充剂、N2补充剂、白蛋白(例如，富含脂质的白蛋白)、胰岛素、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、痕量元素(例如锌、硒(例如，***钠))、2-巯基乙醇、3＇硫醇甘油或其混合物(例如，ITS-G)。优选B-27补充剂、KSR、StemSure血清替代物、ITS-G作为血清替代物。将血清替代物添加到培养基中时，培养基中的浓度按重量计为0.01％至10％，优选地，按重量计为0.1％至2％。在本发明中，优选地使用“血清替代物”来代替血清。
2.抑制Ki67阳性细胞增殖的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群
本发明涉及抑制Ki67阳性细胞增殖的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群，这些细胞群可以通过将内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群嵌入包含藻酸的凝胶中并将其分化为目标细胞群而获得。
本说明书中，“Ki67阳性细胞”是指在从多能干细胞分化为胰腺β细胞的过程中，通过作为标记物的Ki67的表达而表征的细胞，是至少在内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群中共存的细胞。已知“Ki67”为细胞周期相关联核蛋白，因其在增殖中的细胞的G1期、S期、G2期、M期中被观察到有表达、在增殖停止的G0期中未被观察到有表达，而作为细胞增殖和细胞周期的标记物广为人知。
已知在从多能干细胞分化为胰腺β细胞的过程中，根据分化阶段会出现具有不同特征的细胞(WO2009/012428、WO2016/021734)。例如，该分化阶段可以按照相对未分化的顺序分为多能干细胞、定形内胚层细胞、胃肠道细胞、后前肠细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、胰岛素产生细胞和胰腺β细胞。
本说明书中，“多能(pluripotency)”是指分化为具有各种不同形态和功能的组织和细胞，以及能够分化为三种胚层中任一层的细胞的能力。“多能(pluripotency)”不能分化为胚盘，因此没有形成个体的能力，这一点与包括胚盘在内能够分化为生物的任意组织的“全能(totipotency)”有所区别。
本说明书中，“多潜能(multipotency)”是指能够分化为多个有限数量的层的细胞的能力。例如，间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞是多潜能的而非多能的。
本说明书中，“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指胚胎干细胞(ES细胞)及与之相同的分化多能、即潜在地具有分化为活体各种组织(内胚层、中胚层、外胚层全部)的能力的细胞。可以例举“诱导性多能干细胞”(在本说明书中也被称为“iPS细胞”)作为具有与ES细胞同样的分化多能的细胞。优选地，在本发明中，多能干细胞是人多能干细胞。
如果是小鼠ES细胞作为“ES细胞”，可以使用由inGenious公司、RIKEN等建立的各种小鼠ES细胞株；如果是人ES细胞作为“ES细胞”，可以使用由NIH、RIKEN、京都大学、Cellartis建立的各种人ES细胞株。例如，可以使用NIH的CHB-1至CHB-12、RUES1、RUES2、HUES1至HUES28等、WisCell Research的H1、H9、RIKEN的KhES-1、KhES-2、KhES-3、KhES-4、KhES-5、SSES1、SSES2、SSES3等作为ES细胞株。
“诱导性多能干细胞”是指通过将特定因子(核重编程因子)导入哺乳动物体细胞或未分化干细胞以对其重编程而获得的细胞。目前，存在各种类型的“诱导性多能干细胞”，也可以使用山中等人通过将四种因子Oct3/4 Sox2 Klf4 c-Myc导入小鼠成纤维细胞中而建立的iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.，Cell，(2006)126：663-676)，此外，通过将同样的四种因子导入人成纤维细胞中而建立的人细胞衍生的iPS细胞(Takahashi K，YamanakaS.等人，Cell，(2007)131：861-872.)；在导入上述四种因子后，通过将Nanog的表达作为指标进行分选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita，K.，Ichisaka，T.，及Yamanaka，S.(2007).Nature 448，313-317.)；通过不包含c-Myc的方法制备的iPS细胞(Nakagawa M，YamanakaS.，等人，Nature Biotechnology，(2008)26，101-106)；以及通过无病毒导入6种因子而建立的iPS细胞(Okita K等人，Nat.Methods，2011，5月，8(5)：409-12，Okita K等人，StemCells.31(3)：458-66.)。此外，也可以使用通过导入由Thomson等人制备的四种因子OCT3/4SOX2 NANOG LIN28而建立的诱导性多能干细胞(Yu J.，Thomson JA.等人，Science(2007)318：1917-1920.)；Daley等人制备的诱导性多能干细胞(Park IH，Daley GQ.等人，Nature(2007)451：141-146)；以及樱田等人制备的诱导性多能干细胞(日本专利特开2008-307007号)等。
此外，也可以使用所有已公开的论文(例如，Shi Y.，Ding S.等人，Cell StemCell，(2008)3卷，5号，568-574；Kim JB.，Scholer HR.等人，Nature，(2008)454，646-650；Huangfu D.，Melton，DA.等人，Nature Biotechnology，(2008)26，第7期，795-797)或专利(例如，日本专利特开2008-307007号、日本专利特开2008-283972号、US 2008/2336610、US2009/047263、WO 2007/069666、WO 2008/118220、WO 2008/124133、WO 2008/151058、WO2009/006930、WO 2009/006997、WO 2009/007852)中描述的本领域已知的任何诱导性多能干细胞。
可以使用NIH、RIKEN、京都大学等建立的各种iPS细胞株作为诱导性多能细胞株。例如，对于人iPS细胞株，可以例举RIKEN的HiPS-RIKEN-1A、HiPS-RIKEN-2A、HiPS-RIKEN-12A、Nips-B2、京都大学的Ff-WJ-18、Ff-I01s01、Ff-I01s02、Ff-I01s04株、Ff-I01s06、Ff-I14s03、Ff-I14s04、QHJI01s01、QHJI01s04、QHJI14s03、QHJI14s04、253G1、201B7、409B2、454E2、606A1、610B1、648A1、CDI公司的MyCell iPS细胞(21525.102.10A)、MyCell iPS细胞(21526.101.10A)等。
本说明书中，“内分泌祖细胞群”是指通过内分泌祖细胞而表征的细胞群。
内分泌祖细胞是指通过嗜铬粒蛋白A、NeuroD和NGN-3中的至少一种的标记物的表达、及胰腺相关联激素***(例如胰岛素等)的标记物的未表达而表征的细胞。内分泌祖细胞也可以表达PAX-4、NKX2-2、Islet-1、PDX-1、PTF-1α等的标记物。
内分泌祖细胞群是包含30％或更多、优选地50％或更多、更优选地70％或更多比例的内分泌祖细胞的细胞群。内分泌祖细胞群内除内分泌祖细胞外还可以包含其他细胞(例如，胰腺祖细胞、胰岛素产生细胞、Ki67阳性细胞等)。
可以基于能够计算细胞数的已知方法，例如流式细胞术，来确定细胞群中特定细胞的比例。
“处于其后的分化阶段的细胞群”是指通过以继续进行分化阶段而分化为胰腺β细胞而不再是内分泌祖细胞的细胞表征的细胞群。作为继续进行分化阶段而分化为胰腺β细胞而不再是内分泌祖细胞的细胞，例如，可以例举，胰岛素产生细胞。
“胰岛素产生细胞”是指通过胰岛素标记物的表达而表征的细胞。“胰岛素产生细胞”可以是表达NKX6.1的标记物的细胞，优选地，是表达胰岛素及NKX6.1两者的标记物的细胞。
“处于其后的分化阶段的细胞群”或“胰岛素产生细胞群”是包含5％或更多、优选地15％或更多、更优选地30％或更多比例的胰岛素产生细胞的细胞群。除胰岛素产生细胞外，该细胞群也可以包含其他细胞(例如，内分泌祖细胞；表达胰高血糖素、生长抑素及胰多肽中的至少一种的标记物的其他胰腺激素产生细胞；Ki67阳性细胞等))。
本说明书中，“胰腺β细胞”是指比“胰岛素产生细胞”更成熟的细胞，具体而言，是指表达作为胰腺β细胞成熟标记物的MAFA、UCN3及IAPP中的至少一个的标记物、或者是由葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌上升反应所表征的细胞。
“胰腺β细胞群”是包含胰腺β细胞的细胞群，其可以通过内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群的体内分化/成熟而获得。除胰腺β细胞外，该细胞群还可以包含其他细胞(例如，胰岛素产生细胞、Ki67阳性细胞等)。
在本发明中，对包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞(起始原料细胞)中的Ki67阳性细胞的比例没有特别限制，但也可以为80％-0.1％、70％-1％、60％-2％、50％-3％、40％-4％、30％-5％。
在本发明中，对包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞(起始原料细胞)中的MAFA基因或其蛋白的表达量没有特别限制，但可以为胰岛中MAFA基因或其蛋白的表达量的约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约1％或更少。
在本发明中，对包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞(起始原料细胞)中的胰高血糖素阳性细胞和胰岛素阴性细胞的比例没有特别限制，但可以为约2.5％或更少、约2％或更少、约1％或更少、约0.5％或更少。
在本发明中，对包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞(起始原料细胞)中的嗜铬粒蛋白A阳性细胞的比例没有特别限制，但可以为约50％或更多(例如，约55％或更多)、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多。
在本发明中，对包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞(起始原料细胞)中的碱性磷酸酶阳性细胞的比例没有特别限制，但可以为1％或更少、0.5％或更少、0.01％或更少、0.008％或更少、0.005％或更少、0.001％或更少。
在本发明中，对包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞(起始原料细胞)中，Ki67阳性细胞的比例也可以为约50％或更少、或约30％或更少；MAFA基因或其蛋白的表达量约为胰岛中MAFA基因或其蛋白的表达量的约20％或更少、或约10％或更少；胰高血糖素阳性细胞和胰岛素阴性细胞的比例为约2.5％或更少、或约1％或更少；嗜铬粒蛋白A阳性细胞的比例为约50％或更多；且碱性磷酸酶阳性细胞的比例可以是1％或更少。
内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群可以通过使用诱导多能干细胞向胰腺β细胞分化的已知方法来获得。即，可使用以下分化诱导步骤来获得各种目标细胞群：
步骤1)诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞；
步骤2)诱导定形内胚层细胞分化为胃肠道细胞；
步骤3)诱导胃肠道细胞分化为后前肠细胞；
步骤4)诱导后前肠细胞分化为胰腺祖细胞；
步骤5)诱导胰腺祖细胞分化为内分泌祖细胞；以及
步骤6)诱导内分泌祖细胞分化为胰岛素产生细胞。
在下文中，将说明每个步骤，但对各细胞的诱导分化不仅限于这些方法。步骤1)分化为定形内胚层细胞
多能干细胞首先使其分化为定形内胚层细胞。将多能干细胞诱导为定形内胚层的方法是已知的，可以使用这些方法中的任何一种。优选地，将多能干细胞在包含激活素A的培养基中培养，更优选在包含激活素A、ROCK抑制剂、GSK3β抑制剂的培养基中培养，以使其分化为定形内胚层细胞。培养开始时的细胞数没有特别限制，为22000个细胞/cm2-150000个细胞/cm2、优选地为22000个细胞/cm2-100000个细胞/cm2、更优选地为22000个细胞/cm2-80000个细胞/cm2。培养时间为1至4天、优选地为1至3天、特别优选地为3天。
培养温度没有特别限制，为30℃-40℃(例如，37℃)。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
作为用于本步骤的培养基，可以使用RPMI 1640培养基、MEM培养基、iMEM培养基、DMEM/F12培养基和改良的MEM Zinc Option培养基等用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。
培养基中激活素A的浓度通常为30ng/mL-200ng/mL、优选为50ng/mL-150ng/mL、更优选为70ng/mL-120ng/mL、特别优选地为约100ng/mL。
在另一个实施例中，培养基中激活素A的浓度为约0.1ng/ml-100ng/ml、优选地为约1ng/ml-50ng/ml、更优选地为约3ng/ml-10ng/ml。
培养基中GSK3β抑制剂的浓度根据所使用的GSK3β抑制剂的种类适当设定，例如，在将CHIR99021用作GSK3β抑制剂时，通常为1μM-10μM、优选地为2μM-5μM、更优选地为2μM-4μM、特别优选地为约3μM。
培养基中ROCK抑制剂的浓度根据所使用的ROCK抑制剂的种类适当设定，例如，在将Y27632作为ROCK抑制剂时的浓度通常为5μM-20μM，优选地为5μM-15μM，特别优选地为10μM。
具体地，在包含激活素A、ROCK抑制剂、GSK3β抑制剂的培养基中培养1天后、在每天更换培养基的同时，在仅包含激活素A的培养基中继续培养2天。
步骤2)分化为胃肠道细胞
进一步地，在包含生长因子的培养基中培养步骤1)中获得的定形内胚层细胞，以诱导其分化为胃肠道细胞。培养时间为2至8天，优选地为约4天。
培养温度没有特别限制，为30℃-40℃(例如，37℃)。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
可以如步骤1)中那样使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基来作为培养基。除生长因子外，还可适当地将血清替代物、维生素、抗生素等添加到培养基中。
优选地将EGF、KGF和FGF10作为生长因子、更优选地将EGF和/或KGF作为生长因子、进一步优选地将KGF作为生长因子。
培养基中生长因子的浓度根据所使用的生长因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM-1000μM，优选地为约0.1nM-100μM。在使用EGF的情况下，其浓度为约5ng/ml-2000ng/ml(即，约0.8nM-320nM)、优选地为约5ng/ml-1000ng/ml(即，约0.8nM-160nM)、更优选为约10ng/ml-1000ng/ml(即，约1.6nM-160nM)。在使用FGF10的情况下，其浓度为约5ng/ml-2000ng/ml(即，约0.3nM-116nM)，优选地为约10ng/ml-1000ng/ml(即约0.6nM-58nM)，更优选地为约10ng/ml-1000ng/ml(即约0.6nM-58nM)。例如，当使用KGF作为生长因子时，其浓度通常为5ng/mL-150ng/mL，优选地为30ng/mL-100ng/mL，特别优选地为约50ng/mL。
步骤3)分化为后前肠细胞
进一步地，在包含生长因子、环巴胺、头蛋白等的培养基中培养步骤2)中获得的胃肠道细胞，以诱导其分化为后前肠细胞。培养时间为1至5天，优选地为约2天。
培养温度没有特别限制，为30℃-40℃(例如，37℃)。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
可以如步骤1)中那样使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基来作为培养基。除生长因子外，还可适当地将血清替代物、维生素、抗生素等添加到培养基中。
优选地将EGF、KGF和FGF10作为生长因子、更优选地将EGF和/或KGF作为生长因子、进一步优选地将KGF作为生长因子。
培养基中生长因子的浓度根据所使用的生长因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM-1000μM，优选地为约0.1nM-100μM。在使用EGF的情况下，其浓度为约5ng/ml-2000ng/ml(即，约0.8nM-320nM)、优选地为约5ng/ml-1000ng/ml(即，约0.8nM-160nM)、更优选为约10ng/ml-1000ng/ml(即，约1.6nM-160nM)。在使用FGF10的情况下，其浓度为约5ng/ml-2000ng/ml(即，约0.3nM-116nM)，优选地为约10ng/ml-1000ng/ml(即约0.6nM-58nM)，更优选地为约10ng/ml-1000ng/ml(即约0.6nM-58nM)。例如，当使用KGF作为生长因子时，其浓度通常为5ng/mL-150ng/mL，优选地为30ng/mL-100ng/mL，特别优选地为约50ng/mL。
培养基中环巴胺的浓度没有特别限制，但通常为0.5μM-1.5μM、优选地为0.3μM-1.0μM，特别优选地为约0.5μM。
培养基中头蛋白的浓度没有特别限制，但通常为10ng/mL-200ng/mL、优选为50ng/mL-150ng/mL，特别优选地为约100ng/mL。
步骤4)分化为胰腺祖细胞
进一步地，在包含具有CDK8/19抑制活性的因子的培养基中培养步骤3)中获得的后前肠细胞，优选地在包含具有CDK8/19抑制活性的因子和生长因子的培养基中培养，以诱导其分化为胰腺祖细胞。培养时间为2至10天，优选地为约5天。
步骤3)中获得的后前肠细胞是根据先前的报道制备的(Toyoda等人，Stem cellResearch(2015)14，185-197)，在经0.25％的胰蛋白酶EDTA处理后，通过移液分散将0.25％的胰蛋白酶EDTA离心分离并悬浮，再重新将其接种到步骤4的新鲜培养基中。
可以如步骤1)中那样使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基来作为培养基。除生长因子外，还可适当地将血清替代物、维生素、抗生素等添加到培养基中。
可以使用前述各种化合物或其盐作为具有CDK8/19抑制活性的因子，根据所使用的化合物或其盐适当确定对培养基的添加量，通常为约0.00001μM-5μM、优选地为0.00001μM-1μM。培养基中具有CDK8/19抑制活性的因子的浓度优选地为对CDK8/19的抑制活性达到50％以上的浓度。
优选地将EGF、KGF和FGF10作为生长因子、更优选地将KGF和/或EGF作为生长因子、进一步优选地将KGF和EGF作为生长因子。
培养基中生长因子的浓度根据所使用的生长因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM-1000μM，优选地为约0.1nM-100μM。在使用EGF的情况下，其浓度为约5ng/ml-2000ng/ml(即，约0.8nM-320nM)、优选地为约5ng/ml-1000ng/ml(即，约0.8nM-160nM)、更优选为约10ng/ml-1000ng/ml(即，约1.6nM-160nM)。在使用FGF10的情况下，其浓度为约5ng/ml-2000ng/ml(即，约0.3nM-116nM)，优选地为约10ng/ml-1000ng/ml(即约0.6nM-58nM)，更优选地为约10ng/ml-1000ng/ml(即约0.6nM-58nM)。例如，当使用KGF和EGF作为生长因子时，KGF的浓度通常为5ng/mL-150ng/mL、优选地为30ng/mL-100ng/mL、特别优选地为约50ng/mL；EGF的浓度通常为10ng/mL-200ng/mL、优选地为50ng/mL-150ng/mL、特别优选地为约100ng/mL。
对于步骤4)中的培养，第一天可以在ROCK抑制剂的存在的情况下进行，此后，可以在不含ROCK抑制剂的培养基中进行培养。
在任何步骤中，除了上述成分外，还可以将血清替代物(例如，B-27补充剂、ITS-G)添加到培养基中。此外，如果需要，也可以添加氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(产品名称)、非必需氨基酸、维生素、抗生素(例如，抗生素-抗真菌剂(在本说明书中称为AA)、青霉素、链霉素、或其混合物)、抗菌剂(例如，两性霉素B)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。当将抗生素添加到培养基中时，其在培养基中的浓度按重量计通常为0.01％至20％，优选地，按重量计为0.1％至10％。
此外，不使用饲养细胞，而通过粘附培养进行细胞培养。培养时，使用培养皿、烧瓶、微孔板、OptiCell(产品名称)(Nunc公司)等的细胞培养片等培养容器。优选地对培养容器进行表面处理，以改善其对细胞的粘附性(亲水性)，将胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶(例如，BD基质胶(日本贝克顿迪金森公司)、玻连蛋白等用于细胞粘附的基质涂覆其上。优选地将涂覆有I型胶原、基质胶、纤连蛋白、玻连蛋白或聚-D-赖氨酸等的培养容器作为培养容器、更优选地将涂覆有基质胶或聚-D-赖氨酸的培养容器作为培养容器。
培养温度没有特别限制，为30℃-40℃(例如，37℃)。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
可以使用已知的表面标记物，例如糖蛋白2(GP2)，进一步纯化步骤4)中获得的胰腺祖细胞。可以通过本身已知的方法进行上述纯化，例如，使用固定有抗GP2抗体的珠子。
步骤5)分化为内分泌祖细胞
进一步地，在包含生长因子的培养基中培养步骤4)中获得的胰腺祖细胞，以诱导其分化为内分泌祖细胞。培养时间为2至3天，优选地为约2天。
可以如步骤1)中那样使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基来作为培养基。根据先前的报道(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，将SANT1、视黄酸、ALK5抑制剂II、T3和LDN添加到培养基中，进一步地，可以将Wnt抑制剂、ROCK抑制剂、FGF(优选地FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等适量添加到培养基中。
此外，不使用饲养细胞，而通过非粘附培养进行细胞培养。培养时，使用培养皿、烧瓶、微孔板、多孔板(Nunc公司)等或生物反应器。优选地对培养容器进行表面处理以减少其对细胞的粘附性。
培养温度没有特别限制，为30℃-40℃(例如，37℃)。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
步骤6)分化为胰岛素产生细胞
进一步地，在包含生长因子的培养基中培养步骤5)中获得的内分泌祖细胞，以诱导其分化为胰岛素产生细胞。培养时间为7至15天，优选地为约7至10天。
使用论文(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)中描述的因子作为生长因子，此外，还可以添加γ-分泌酶抑制剂、Wnt抑制剂、ROCK抑制剂、FGF(优选地FGF2)。
可以如步骤1)中那样使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基来作为培养基。根据先前的报道(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，将ALK5抑制剂II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制剂XX添加到培养基中，进一步地，可以适当添加Wnt抑制剂、ROCK抑制剂、FGF(优选地FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等。
此外，不使用饲养细胞，而通过非粘附培养进行细胞培养。培养时，使用培养皿、烧瓶、微孔板、多孔板(Nunc公司)等或生物反应器。优选地对培养容器进行表面处理以减少其对细胞的粘附性。
培养温度没有特别限制，为30℃-40℃(例如，37℃)。此外，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
在本发明中，可以根据已知方法(WO2010/032242、WO2011/154941)制备“包含藻酸的凝胶”，可以通过将交联剂添加到藻酸盐、藻酸酯或改性藻酸的溶液中使其胶凝化来获得。
藻酸盐只要是水溶性的盐即可，并且可以使用金属盐、铵盐等。例如，可以优选使用藻酸钠、藻酸钙、藻酸铵等。
藻酸酯(也被称为藻酸丙二醇)是一种将丙二醇与藻酸的羧基结合的衍生物。改性藻酸是例如经细胞粘附活性序列改性的RGD改性藻酸(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)。
藻酸盐中包含的甘露糖醛酸与古洛糖醛酸之比(M/G比)(本说明书中，该比例有时被称为“等级”)是任意的，一般地说，当M>G时，可以形成具有高柔韧性的凝胶，而在M<G的时，可以形成坚固的凝胶。在本发明中，可以使用包含古洛糖醛酸的比例为10％至90％、20％至80％、30％至70％或40％至60％的藻酸盐。
藻酸盐、藻酸酯或改性藻酸在溶剂中包含的量按重量计可以为0.05％至10％，优选地，按重量计为0.1％至5％，更优选地，按重量计为为0.5％至3％。溶剂只要可以溶解藻酸盐、藻酸酯或改性藻酸即可，并且可以使用水、生理盐水等。
交联剂没有特别限制，只要其可以使藻酸盐、藻酸酯或改性藻酸的溶液凝胶化即可，并且可以使用多价金属阳离子。多价金属阳离子优选地为二价金属阳离子、更优选地为钙离子、锶离子或钡离子。交联剂可以以盐的形式使用，在本发明中，可以使用选自氯化钙、氯化锶和氯化钡中的至少一种作为交联剂。聚乙二醇丙烯酸酯可用于交联Hystem。
包含藻酸的凝胶可以包含纳米纤维。纳米纤维是直径在纳米范围内的天然或合成纤维。包含一种或多种多糖的物质，如胶原蛋白、纤维素、丝素蛋白、角蛋白、明胶和壳聚糖等作为天然纳米纤维。聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PHBV)、聚乙烯—醋酸乙烯酯(PEVA)等作为合成纳米纤维。纳米纤维可以以按重量计为少于1％的量，例如，按重量计为0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或更少的量包含在包含藻酸的凝胶中。包含藻酸的凝胶中所包含的纳米纤维的量的下限没有特别限制，可以按重量计为0.05％或更多、优选地，按重量计为0.1％或更多。
在本发明中，“包埋”是指将内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群分散容纳在包含藻酸的凝胶中。
可以通过将细胞群混合在藻酸盐、藻酸酯或改性藻酸的溶液中并使之胶凝化来将细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中。
细胞群可以以选自1×104个细胞/ml-1×109个细胞/ml、优选地1×107个细胞/ml-1×108个细胞/ml的量包含在藻酸盐、藻酸酯或改性藻酸的溶液中。
包含细胞群的藻酸盐、藻酸酯或改性藻酸的溶液的凝胶化可以通过在该溶液中添加交联剂来进行。所添加的交联剂的量可以是相对于该溶液选自按重量计为0.1％至5％，例如，按重量计为0.1％至1％的量。凝胶化可以在用于细胞培养或细胞移植的具有规定构造和/或形状的容器内进行，或者在设计成能够获得符合该容器的凝胶的模具内进行。
或者，可以根据已知方法(WO 2010/010902)通过形成包含藻酸的凝胶胶囊来进行。即，可以将包含细胞群的藻酸盐、藻酸酯或改性藻酸的溶液滴加至交联剂溶液中。液滴的大小可以根据滴加时的喷嘴的形状和滴加方法来调节，进而可以确定包含藻酸的凝胶胶囊的大小。滴加方法没有特别限制，但可以是空气喷雾法、无气喷雾法、静电喷雾法等。包含藻酸的凝胶胶囊的大小没有特别限制，其直径可以为5mm或更小、1mm或更小、500μm或更小。交联剂溶液中可以包含选自按重量计为0.1％-10％的量，例如，按重量计为0.1％-5％的量的交联剂。包含藻酸的凝胶胶囊可以用具有0.1μm-50μm的孔的膜覆盖周围。
包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞群可以经历分化为目标细胞群的步骤。使其分化的步骤可以通过使该细胞群经历上述培养方法来进行，或者可以通过将其移植到动物体内来进行。特别地，使其分化为胰腺β细胞群的步骤可以通过将包埋于包含藻酸的凝胶中的内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群移植到动物体内来进行。
“动物”优选地是哺乳动物，例如，人、非人灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、美洲驼、狗、猫、兔、小鼠和豚鼠等，但其中优选地为人。
移植优选在体内区域进行，在该区域中包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞群可以固定在一定位置，例如，可以在动物的皮下、腹腔内、腹膜上皮、大网膜、脂肪组织、肌肉组织、胰脏、肾脏等各脏器的膜下等进行。可以将包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞群封闭在胶囊、袋或室等装置中，然后将其移植到体内。被移植的细胞数可以根据被移植细胞的分化阶段、移植对象疾病的严重程度、年龄、体重、移植部位的大小等因素而变化，但其没有特别限制，例如，可以是10×104个细胞-10×1011个细胞左右。可以诱导被移植的细胞群在体内环境中分化并分化为目标细胞群，优选地为胰腺β细胞群，然后可以将其原样收集或留在体内。
之后，通过将内分泌祖细胞群或处于其后的分化阶段的细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中并使其进行分化，可以抑制该细胞群中的Ki67阳性细胞的增殖。
本方法不抑制畸胎瘤的增殖，但是可以减少或抑制胰腺谱系中所包含的增殖性细胞的残留数。
本方法不抑制iPS细胞的增殖，但是可以减少或抑制胰腺谱系中所包含的增殖性细胞的残留数。
根据本方法，与未包埋于包含藻酸的凝胶中进行分化的情况相比，可以减少诱导分化后获得的细胞群中的Ki67阳性细胞的绝对数。由此，这使得有可能耗尽诱导分化后获得的细胞群中的Ki67阳性细胞。即，与未包埋于包含藻酸的凝胶中进行分化的情况相比，诱导分化后获得的细胞群中的Ki67阳性细胞的比例可以减少，该比例可以是少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％，优选地少于3％、少于2％或少于1％。
另一方面，在本方法中，对内分泌祖细胞或处于其后的分化阶段的细胞的增殖和/或分化没有影响，或者影响很小，在诱导分化后获得的细胞群中，目标胰岛素产生细胞或胰腺β细胞的绝对数与未包埋于包含藻酸的凝胶进行分化的情况相比，不会产生显著的差异。由此，这使得有可能富集分化诱导后获得的细胞群中的目标胰岛素产生细胞或胰腺β细胞。即，诱导分化后获得的细胞群中的目标胰岛素产生细胞或胰腺β细胞的比例，与未包埋于包含藻酸的凝胶中进行分化的情况相比，可以增加40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多。
将通过本方法获得的胰岛素产生细胞或胰腺β细胞移植到动物体内并在动物体内分化时直接留在体内，可以用作胰岛素分泌细胞。
通过本方法获得的胰岛素产生细胞、胰腺β细胞或本发明的包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞群被移植到动物体内，作为糖尿病(1型糖尿病、2型糖尿病)、低血糖抑制剂等药物来使用。
此外，移植包埋于包含藻酸的凝胶中的细胞群可以避免或减少对宿主免疫***的干扰，并且可以实现宿主体内该细胞群的分化、增殖和/或维持。
在下文中，通过实施例对本发明进行说明，但是本发明并非仅限于这些实施例。
实施例
实施例I：通过移植包埋于包含藻酸的凝胶中的内分泌祖细胞，减少/增殖抑制移植片中目标外细胞(Ki67阳性细胞)(I)
1.方法
(1)将内分泌祖细胞包埋于包含藻酸的凝胶中
将通过诱导人iPS细胞分化为内分泌祖细胞而制备的内分泌祖细胞与按重量计3％的藻酸(PRONOVA SLG100)溶液混合，将该细胞分散液填充于内径为1cm2且厚度约为500μm的圆形模具中，与锶交联，以制备细胞被分散包埋于其中的、包含藻酸的凝胶片。
(2)内分泌祖细胞的体内移植
使用有免疫缺陷NOD/SCID的小鼠，通过已知方法在移植部位经bFGF处理以诱导血管生成，然后将上述(1)中获得的包埋有内分泌祖细胞的凝胶片移植到其背部皮下。作为比较例，将未包埋于包含藻酸的凝胶中的胰腺内分泌祖细胞移植到肾被膜下。移植后第69天和移植6个月后一一取出移植片。
(3)评估移植片中目标外细胞
将在移植后第69天取出的移植片固定并脱水后，制备冷冻切片，并进行免疫组织学染色以评估目标外细胞。能够期待成熟为胰岛素分泌细胞的目标细胞是以嗜铬粒蛋白A(CHGA)阳性/NKX6.1阳性作为指标进行评估；可能对目标细胞的长期生存产生不良影响的目标外细胞以PDX1弱阳性或阴性/Ki67阳性作为指标进行评估。
此外，移植6个月后取出的移植片，通过100mM柠檬酸钠水溶液将藻酸解交联来收集细胞。收集的细胞经0.25％的胰蛋白酶EDTA处理分散后固定，并进行流式细胞术分析。目标外细胞以Ki67阳性/胰岛素阴性作为指标、目标细胞以胰岛素阳性/NKX6.1阳性和胰高血糖素阳性/胰岛素阴性作为指标，一一进行评估。此外，在本说明书中，“Ki67阳性/胰岛素阴性”、“胰岛素阳性/NKX6.1阳性”和“胰高血糖素阳性/胰岛素阴性”等表述中所使用“/”表示“和”。
2.结果
移植后第69天取出的移植片的免疫组织化学染色结果在图1中示出。将内分泌祖细胞包埋于包含藻酸的凝胶中并移植到皮下，与其未包埋于凝胶中而移植到肾被膜下的情况相比，证实前种情况移植片中包含的Ki67阳性细胞数为后种情况的1/10左右。这结果表明，通过将上述细胞包埋于包含藻酸的凝胶中并进行移植，可以减少Ki67阳性细胞，或者抑制其增殖。
从移植6个月后取出的移植片中收集的细胞的流式细胞术分析结果在图2中示出。通过将内分泌祖细胞包埋于包含藻酸的凝胶中并移植到皮下，证实了产生分化为是目标细胞的胰岛素阳性/NKX6.1阳性细胞(图2(A)、移植前1.0％(n＝1)、移植后10.8±3.6％(n＝4))，还证实了目标外细胞的Ki67阳性/胰岛素阴性细胞急剧减少(图2(B)、移植前33.0％(n＝1)、移植后1.2±0.3％(n＝4))。
实施例II：将包含增殖性细胞的胰岛素产生细胞包埋于包含藻酸的凝胶中并进行移植后，目标外增殖性细胞减少
1.方法
(1)将胰岛素产生细胞包埋于包含藻酸的凝胶中
将通过诱导人iPS细胞分化为胰岛素产生细胞而制备的胰岛素产生细胞与按重量计3％的藻酸(PRONOVA SLG100)溶液混合，将该细胞分散液填充于内径为1cm2且厚度约为500μm的圆形模具中，用锶交联，以制备细胞被分散包埋于其中的、包含藻酸的凝胶片。
(2)胰岛素产生细胞的体内移植
使用有免疫缺陷NOD/SCID的小鼠，将上述(1)中获得的包埋有胰岛素产生细胞的凝胶片移植到其背部皮下。移植6个月后，取出移植片。
(3)评估移植片中目标外细胞
移植6个月后取出的移植片，通过100mM柠檬酸钠水溶液将藻酸解交联来收集细胞。收集的细胞经0.25％的胰蛋白酶EDTA处理分散后固定，并进行流式细胞术分析。目标外增殖性细胞以Ki67阳性/胰岛素阴性为指标、目标细胞以胰岛素阳性/NKX6.1阳性和胰高血糖素阳性/胰岛素阴性为指标，一一进行评估。
2.结果
移植6个月后取出的移植片维持与移植前相同的外观。表1示出了从取出的移植片中收集的细胞的流式细胞术分析的结果。证实了通过将包含增殖性细胞的胰岛素产生细胞包埋于包含藻酸的凝胶中并移植到皮下，可以显着减少移植前已包含的目标外增殖性细胞。同时，证实了胰高血糖素阳性/胰岛素阴性细胞率的上升，并且证实了这些细胞已分化为胰岛样细胞。
[表1]
移植前 移植6个月后(N＝2)
Ki67阳性/胰岛素阴性细胞率 18.6％ 1.8％，1.3％
胰岛素阳性/NKX6.1阳性细胞率 27.8％ 6.7％.5.0％
胰高血糖素阳性/胰岛素阴性细胞率 0％ 59.2％，48.6％
实施例III：通过将胰岛素产生细胞包埋于含藻酸的凝胶中来减少体外培养中的目标外细胞(Ki67阳性细胞)(I)
1.方法
(1)将胰岛素产生细胞包埋于包含藻酸的凝胶中
将通过诱导人iPS细胞分化为胰岛素产生细胞而制备的胰岛素产生细胞与根据表2所示配比的不同浓度(按重量计0.5％-3％)和等级(PRONOVA SLG100(G/M比：≥1.5)、NOVATACH MVG GRGDSP(G/M比：≥1.5)、PRONOVA UP VLVM(G/M比：≤1))的藻酸溶液混合，将该细胞分散液填充到内径为1cm2、厚度约为500μm的圆形模具中，并与锶水溶液或钙水溶液交联，以制备细胞被分散包埋于其中的、包含藻酸的凝胶片。用流变仪(粘弹性测量设备)测量弹性(Pa)。
[表2]
Figure BDA0002687556090000241
(2)胰岛素产生细胞的体外培养
将包埋于水凝胶中的胰岛素产生细胞和未经包埋的胰岛素产生细胞(比较例)在包含用于分化胰岛素产生细胞的生长因子的培养基中培养，并在培养7天后进行收集。
(3)评估目标外细胞
通过100mM柠檬酸钠水溶液将藻酸解交联来从凝胶中收集包埋于包含藻酸的凝胶中的内分泌祖细胞。收集的内分泌祖细胞经0.25％的胰蛋白酶EDTA处理分散后固定，使用流式细胞术评估Ki67阳性细胞数，并比较培养前后的变化率。
2.结果
表3示出了培养前后Ki67阳性细胞数的变化率。
比较例的变化率增加了约20％，而在实例中几乎没有观察到变化。
[表3]
Figure BDA0002687556090000251
实施例IV：通过将胰岛素产生细胞包埋于含藻酸的凝胶中来减少体外培养中的目标外细胞(Ki67阳性细胞)(II)
1.方法
(1)将胰岛素产生细胞包埋于包含藻酸的凝胶中
将通过诱导人iPS细胞分化为胰岛素产生细胞而制备的胰岛素产生细胞与PRONOVA SLG100(G/M比：≥1.5)的藻酸溶液按表4中指定的细胞密度混合，将该细胞分散液填充到内径为1cm2、厚度约为500μm的圆形模具中，并与锶水溶液交联，以制备细胞被分散包埋于其中的、包含藻酸的凝胶片。
(2)胰岛素产生细胞的体外培养
将包埋于水凝胶中的胰岛素产生细胞和未经包埋的胰岛素产生细胞(比较例)在包含用于分化胰岛素产生细胞的生长因子的培养基中、在表4中指定的氧气条件下培养，并在培养6天后进行收集。
[表4]
Figure BDA0002687556090000252
Figure BDA0002687556090000261
(3)评估目标外细胞
通过100mM柠檬酸钠水溶液将藻酸解交联来从凝胶中收集包埋于包含藻酸的凝胶中的内分泌祖细胞。收集的内分泌祖细胞经0.25％的胰蛋白酶EDTA处理分散后固定，使用流式细胞术评估Ki67阳性细胞数，并比较培养前后的变化率。
2.结果
表5示出了培养前后Ki67阳性细胞数的变化率。
比较例中的变化率增加了约5％，而实施例中全部降低。
[表5]
Figure BDA0002687556090000262
实施例V：通过将胰岛素产生细胞包埋于包含藻酸和细胞外基质的凝胶中来减少体外培养中的目标外细胞(Ki67阳性细胞)
1.方法
(1)将胰岛素产生细胞包埋于包含藻酸和细胞外基质的凝胶中
将通过诱导人iPS细胞分化为胰岛素产生细胞而制备的胰岛素产生细胞与根据表6中所指定配比的不同等级(PRONOVA SLG100(G/M比：≧1.5)、NOVATACH MVG GRGDSP(G/M比：≥1.5)、NOVATACH M REDV(G/M比：≤1)、NOVATACH G VAPG(G/M比：≥1.5))的藻酸溶液以及Hystem、Hystem-C、Hystem-HP或明胶混合，将该细胞分散液填充到内径为1cm2、厚度约为500μm的圆形模具中，并与锶水溶液或进一步地加上聚乙二醇丙烯酸酯水溶液交联，以制备细胞被分散包埋于其中的、包含藻酸和细胞外基质的凝胶片。
[表6]
Figure BDA0002687556090000271
(2)胰岛素产生细胞的体外培养
将包埋于水凝胶中的胰岛素产生细胞和未经包埋的胰岛素产生细胞(比较例)在包含用于分化胰岛素产生细胞的生长因子的培养基中培养，并在培养7天后进行收集。
(3)评估目标外细胞
通过100mM柠檬酸钠水溶液将藻酸解交联来从凝胶中收集包埋于包含藻酸和细胞外基质的凝胶中的胰岛素产生细胞。收集的胰岛素产生细胞经0.25％的胰蛋白酶EDTA处理分散后固定，使用流式细胞术评估Ki67阳性细胞数，并比较培养前后的变化率。
2.结果
表7示出了培养前后Ki67阳性细胞数的变化率。
比较例的变化率增加了约5.2％，而在实例中几乎没有观察到变化，或者是减少了。证实了即使将可以用作细胞支架的细胞外基质添加到凝胶中，也可以抑制Ki67阳性细胞的增殖。
[表7]
Figure BDA0002687556090000281
实施例VI：评估包含纳米纤维的藻酸胶囊中iPS细胞增殖性
将人iPS细胞与其中添加了按重量计1％的纳米纤维(“BiNFi-s”(sugino)；AFo-100级，平均纤维直径10nm-50nm)和按重量计3％的藻酸(PRONOVA SLG100)的溶液混合，将获得的混合溶液滴加到氯化钡溶液中以制备包含包埋有iPS细胞的纳米纤维的藻酸凝胶胶囊。
当将获得的凝胶胶囊添加到培养基中，证实了包埋的iPS细胞的增殖性后，与不包含纳米纤维的藻酸胶囊相比，抑制了由于增殖引起的细胞渗漏，并且形成了稳定的细胞团。

Claims (15)

1.一种制造包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法，该方法包括：
(1)将胰岛素产生细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中的步骤；以及(2)使得所包埋的细胞群分化的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中的所述凝胶进一步包含纳米纤维。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(2)中的使得所包埋的细胞群分化的步骤是通过将其移植到动物中来进行的。
4.一种减少内分泌祖细胞或处于其后的分化阶段的细胞群中存在的Ki67阳性细胞的数量的方法，或抑制所述阳性细胞增殖的方法，所述方法包括：
将所述细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法不减少所述细胞群中存在的内分泌祖细胞或处于其后分化的阶段的细胞的数量。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述凝胶进一步包含纳米纤维。
7.一种包含藻酸的凝胶，所述凝胶中包埋了包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群。
8.根据权利要求7所述的凝胶，其中，所述细胞群的Ki67阳性细胞少于1％。
9.根据权利要求7所述的凝胶，其中，所述细胞群是多能干细胞衍生的细胞群。
10.根据权利要求7所述的凝胶，其用于在糖尿病治疗方法中使用。
11.一种治疗糖尿病的方法，该方法通过在体内固定包含藻酸的凝胶来治疗糖尿病，所述凝胶中包埋有包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群。
12.包含藻酸的凝胶，用于抑制内分泌祖细胞或处于其后的分化阶段的细胞群中存在的Ki67阳性细胞的增殖。
13.包含藻酸的凝胶在制造包含胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的药物中的用途，所述胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群包含少于3％的Ki67阳性细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是制造包含少于1％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法。
15.一种制造包含少于3％的Ki67阳性细胞的胰岛素产生细胞群或胰腺β细胞群的方法，所述方法包括：
(1)纯化细胞的步骤；
(2)将胰岛素产生细胞群包埋于包含藻酸的凝胶中的步骤；以及
(3)使得所包埋的细胞群分化的步骤。
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