WO2022107877A1 - 成熟化剤 - Google Patents

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WO2022107877A1
WO2022107877A1 PCT/JP2021/042557 JP2021042557W WO2022107877A1 WO 2022107877 A1 WO2022107877 A1 WO 2022107877A1 JP 2021042557 W JP2021042557 W JP 2021042557W WO 2022107877 A1 WO2022107877 A1 WO 2022107877A1
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cells
cell population
inhibitor
cdk8
medium
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PCT/JP2021/042557
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健介 佐久間
寛和 松本
太郎 豊田
周平 小長谷
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オリヅルセラピューティクス株式会社
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/22—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from pancreatic cells
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an insulin-positive cell population from pluripotent stem cells. More specifically, the pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells, or the cell population in the subsequent differentiation stage, is referred to as cyclin-dependent kinase 8 and / or cyclin-dependent kinase 19 (hereinafter, "CDK8").
  • CDK8 cyclin-dependent kinase 8 and / or cyclin-dependent kinase 19
  • a method for producing an insulin-positive cell population, which comprises acting with a factor having an inhibitory activity against may be described as / 19 ”).
  • Non-Patent Document 1 the insulin-positive cell population obtained by inducing differentiation includes various cells in addition to the target insulin-positive cells (particularly, insulin-positive and NKX6.1-positive cells, etc.).
  • the target insulin-positive cells particularly, insulin-positive and NKX6.1-positive cells, etc.
  • a new method for inducing differentiation of an insulin-positive cell population that can contain more cells of interest has been eagerly desired.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for inducing differentiation of an insulin-positive cell population from pluripotent stem cells.
  • CDK8 / into a pancreatic precursor cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage in the process of inducing an insulin-positive cell population from pluripotent stem cells.
  • Efficient differentiation of insulin-positive cells, particularly insulin-positive and NKX6.1-positive cells, by the action of a factor having 19 inhibitory activity (hereinafter, may be referred to as "CDK8 / 19 inhibitor"). It has been found that it is possible to induce and obtain an insulin-positive cell population containing more cells as compared with the conventional method.
  • a method for producing an insulin-positive cell population A method comprising differentiating a pancreatic progenitor cell population, or a cell population in a subsequent stage of differentiation, in a medium containing a CDK8 / 19 inhibitor.
  • the method of [1] wherein the medium has substantially no ALK5 inhibitory activity.
  • the method of [1] or [2], wherein the IC 50 of the CDK8 / 19 inhibitor for ALK5 is 1 ⁇ M or more.
  • the CDK8 / 19 inhibitor is diethyl (E)-(4- (3- (5- (4-fluorophenyl) -1-methyl-1H-pyrazole-4-yl) acrylamide) benzyl) phosphonate, 2 -(4- (4- (Isoquinolin-4-yl) phenyl) -1H-pyrazole-1-yl) -N, N-dimethylacetamide, 4-((2- (6- (4-methylpyridazine-1-yl) -1-) Carbonyl) naphthalene-2-yl) ethyl) amino) quinazoline-6-carbonitrile, 4- (4- (2,3-dihydrobenzo [b] [1,4] dioxin-6-yl) -1H-pyrazole- 3-Il) Benzene-1,3-diol, 3- (2- (imidazole [1,2-b] pyridazine-6-ylthio) ethyl
  • the medium of [6] which has substantially no ALK5 inhibitory activity.
  • the medium of [6] or [7] in which the IC50 of the CDK8 / 19 inhibitor for ALK5 is 1 ⁇ M or more.
  • the CDK8 / 19 inhibitor is diethyl (E)-(4- (3- (5- (4-fluorophenyl) -1-methyl-1H-pyrazole-4-yl) acrylamide) benzyl) phosphonate, 2 -(4- (4- (Isoquinolin-4-yl) phenyl) -1H-pyrazole-1-yl) -N, N-dimethylacetamide, 4-((2- (6- (4-methylpyridazine-1-yl) -1-) Carbonyl) naphthalene-2-yl) ethyl) amino) quinazoline-6-carbonitrile, 4- (4- (2,3-dihydrobenzo [b] [1,4] dioxin-6-yl) -1H-pyrazole- 3-Il) Benzene-1,3-diol, 3- (2- (imidazole [1,2-b] pyridazine-6-ylthio) ethyl
  • the present invention it is possible to provide a novel method for inducing differentiation of an insulin-positive cell population from pluripotent stem cells. That is, according to the present invention, in the process of inducing an insulin-positive cell population from pluripotent stem cells, insulin-positive cells, particularly insulin-positive and NKX6.1-positive cells, can be efficiently induced to differentiate. An insulin-positive cell population containing more of the cells can be obtained as compared with the conventional method.
  • FIG. 1 shows insulin-positive in an insulin-positive cell population obtained by treating a pancreatic precursor cell population with a differentiation-inducing medium containing ALK5 Inhibitor II or a CDK8 / 19 inhibitor (Compound 1, Compound 2 or Compound 3). It is a graph showing the cell rate of NKX6.1 positive (indicated as "INS + / NKX +") and the cell rate of insulin positive and NKX6.1 negative (indicated as "INS + / NKX-").
  • FIG. 1 shows insulin-positive in an insulin-positive cell population obtained by treating a pancreatic precursor cell population with a differentiation-inducing medium containing ALK5 Inhibitor II or a CDK8 / 19 inhibitor (Compound 1, Compound 2 or Compound 3). It is a graph showing the cell rate of NKX6.1 positive (indicated as "INS + / NKX +”) and the cell rate of insulin positive and NKX6.1 negative (indicated as "INS + / NKX-").
  • FIG. 2 shows an insulin-positive cell population obtained by treating a pancreatic progenitor cell population with a differentiation-inducing medium containing a predetermined concentration of ALK5 inhibitor II or a CDK8 / 19 inhibitor (Compound 1, Compound 2 or Compound 3). , Insulin and NKX6.1 expression analysis results by flow cytometry are shown.
  • “about” or “approximately” means plus or minus 25%, 20%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, respectively, with respect to the reference value. Or, it indicates a value that fluctuates up to 1%.
  • the term “about” or “approximately” refers to a range of plus or minus 15%, 10%, 5%, or 1%, respectively, relative to the reference value.
  • not using feeder cells basically means that the feeder cells are not contained, and that the medium preconditioned by culturing the feeder cells is not used. Therefore, the medium does not contain substances such as growth factors and cytokines secreted from feeder cells.
  • the "feeder cell” or “feeder” means a cell that is co-cultured with another type of cell, supports the cell, and provides an environment in which the cell can grow.
  • Feeder cells may or may not be of the same species as the cells they support.
  • human skin fibroblasts or human embryonic stem cells may be used as feeders for human cells, primary cultures of mouse embryonic fibroblasts, and immortalized mouse embryonic fibroblasts may be used. ..
  • Feeder cells can be inactivated by irradiation, treatment with mitomycin C, or the like.
  • adheresion means that the cells are attached to a container, eg, the cells are attached to a cell culture dish or flask of sterile plastic (or coated plastic) in the presence of a suitable medium. Refers to that. Some cells cannot be maintained or grow in the culture unless they are adhered to a cell culture vessel. In contrast, non-adhesive cells can be maintained and proliferate in culture without adhering to the vessel.
  • culture refers to maintaining, growing, and / or differentiating cells in an in vitro environment.
  • “Culturing” means sustaining, proliferating, and / or differentiating cells in tissues or in vitro, eg, in cell culture dishes or flasks.
  • the culture includes two-dimensional culture (planar culture) and three-dimensional culture (suspension culture).
  • enriching and enrichment refer to increasing the amount of a particular component in a composition, such as a cellular composition, “enriching”.
  • “Enriched” is the composition of a cell, eg, when used to describe a cell population, such as in a cell population before the amount of a particular component is enriched. Refers to a cell population that is increasing compared to the proportion of constituents.
  • a composition such as a cell population can be enriched with respect to the target cell type, and thus the proportion of target cell type is compared to the proportion of target cells present in the cell population before enrichment.
  • Cell populations can also be enriched for target cell types by cell selection and selection methods known in the art.
  • Cell populations can also be enriched by the specific sorting or selection processes described herein.
  • the method of enriching the target cell population causes the cell population to be at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% with respect to the target cell population. , 90%, 95%, 97%, 98% or 99% enriched.
  • deplete and “depletion” refer to reducing the amount of a particular component in a composition, such as a cellular composition, and “depleted”.
  • a cell composition eg, a cell population
  • “depleted” means that the amount of a particular component is the proportion of such component in the cell population before it is depleted. Refers to a cell population that is declining compared to.
  • a composition such as a cell population can be depleted with respect to the target cell type, thus the proportion of the target cell type is reduced compared to the proportion of target cells present in the cell population before it is depleted. ..
  • Cell populations can also be depleted for target cell types by cell selection and selection methods known in the art.
  • Cell populations can also be depleted by the specific sorting or selection processes described herein.
  • the cell population is reduced by at least 50%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% with respect to the target cell population by a method of depleting the target cell population. (Exhausted).
  • purifying and purifying mean removing impurities in a composition, such as a cell composition, to make it pure for a particular constituent.
  • purified when used to describe a cell composition, eg, a cell population, such a component in the cell population before the amount of impurities is purified. Refers to a cell population that is reduced compared to the proportion of cells and the purity of a particular component is improved.
  • a composition such as a cell population can be purified with respect to the target cell type, thus the proportion of the target cell type is increased compared to the proportion of target cells present in the cell population prior to purification.
  • Cell populations can also be purified for target cell types by cell selection and selection methods known in the art.
  • Cell populations can also be purified by the specific sorting or selection processes described herein.
  • the purity of the target cell population is at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% by a method of purifying the target cell population.
  • impurities including contaminating cells can be undetectable.
  • the term “marker” means a cell antigen or a gene thereof that is specifically expressed by a predetermined cell type, such as “marker protein” or “marker gene”.
  • the marker is a cell surface marker, in which case the enrichment, isolation and / or detection of viable cells can be performed.
  • the marker can be a positive selectable marker or a negative selectable marker.
  • Detection of a marker protein can be performed using an immunological assay using an antibody specific to the marker protein, for example, ELISA, immunostaining, or flow cytometry.
  • the marker gene can be detected by using a nucleic acid amplification method and / or a nucleic acid detection method known in the art, for example, RT-PCR, microarray, biochip and the like.
  • RT-PCR nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid
  • expression is defined as transcription and / or translation of a particular nucleotide sequence driven by an intracellular promoter.
  • the term "factor having CDK8 / 19 inhibitory activity" or "CDK8 / 19 inhibitor” means any substance having CDK8 / 19 inhibitory activity.
  • CDK8 is not required for cell proliferation and inhibition of CDK8 has no significant effect under normal conditions.
  • CDK19 and CDK8 are similar, and CDK8 inhibition is usually accompanied by inhibition of CDK19.
  • a “growth factor” is an endogenous protein that promotes the differentiation and / or proliferation of a particular cell.
  • growth factor examples include epithelial growth factor (EGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), hepatocellular growth factor (HGF), and insulin-like growth factor 1.
  • IGF-1 insulin-like growth factor 2
  • IGF-2 insulin-like growth factor 2
  • KGF keratinocyte growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ transformed growth factor ⁇
  • VEGF Vascular endothelial cell growth factor
  • transferase various interleukins (eg IL-1 to IL-18), various colony stimulators (eg granulocytes / macrophages-colony stimulators (GM-CSF)), Included are various interferons (eg, IFN- ⁇ , etc.) and other cytokines that have effects on stem cells, such as stem cell factor (SCF) and erythropoetin (Epo).
  • SCF stem cell factor
  • Epo erythropoetin
  • ROCK inhibitor means a substance that inhibits Rho-associated, coiled-coil-coiling protein kinase, and is a substance that inhibits either ROCK I or ROCK II. May be.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it has the above-mentioned function, and for example, N- (4-pyridinyl) -4 ⁇ - [(R) -1-aminoethyl] cyclohexane-1 ⁇ -carbamide (in the present specification, Y).
  • the "GSK3 ⁇ inhibitor” is a substance having an inhibitory activity against GSK3 ⁇ (glycogen synthase kinase 3 ⁇ ).
  • GSK3 glycogen synthase kinase 3 ⁇
  • GSK3 glycogen synthase kinase 3 ⁇
  • GSK3 glycogen synthase kinase 3 ⁇
  • the "GSK3 ⁇ inhibitor” used in the present invention is not particularly limited as long as it has GSK3 ⁇ inhibitory activity, and may be a substance having GSK3 ⁇ inhibitory activity together with GSK3 ⁇ inhibitory activity.
  • GSK3 ⁇ inhibitor examples include CHIR98014 (2-[[2-[(5-nitro-6-aminopyridine-2-yl) amino] ethyl] amino] -4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (1H).
  • GSK3 ⁇ is not limited to these, and antisense oligonucleotides against GSK3 ⁇ mRNA, siRNA, antibodies that bind to GSK3 ⁇ , dominant negative GSK3 ⁇ mutants, etc. can also be used as GSK3 ⁇ inhibitors and are commercially available. It can be synthesized according to a known method.
  • serum substitute refers to, for example, KnockOut TM Serum Lipidence (KSR: Thermo Fisher Scientific), StemSure® Serum Replacement (Wako), B-27 supplement, N2-supplement, N2-supplement, and albumin. Lipid-rich albumin), insulin, transferase, fatty acids, collagen precursors, trace elements (eg zinc, selenium (eg sodium selenate)), 2-mercaptoethanol, 3'thiolglycerol or mixtures thereof (eg ITS- G) can be mentioned.
  • B-27 supplements, KSR, StemSure® Serum Recommendation, ITS-G are preferred.
  • the concentration in the medium is 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 2% by weight. In the present invention, it is preferable to use a "serum substitute" instead of serum.
  • a method for producing an insulin-positive cell population which comprises differentiating a pancreatic progenitor cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage in the presence of a CDK8 / 19 inhibitor. I will provide a.
  • the CDK8 / 19 inhibitor acts on the pancreatic progenitor cell population, or cells in subsequent stages of differentiation, to enrich insulin-positive cells, especially insulin-positive and NKX6.1-positive cells. Give birth to a group.
  • the "CDK8 / 19 inhibitor” used in the present invention is not particularly limited as long as it has an inhibitory activity of CDK8 / 19, and any factor that directly or indirectly inhibits the function of CDK8 / 19 is used. be able to.
  • the "CDK8 / 19 inhibitor” refers to a factor that inhibits CDK8 / 19 by 50% or more.
  • a known method may be selected, and examples thereof include the method of Example 1 of the present specification described in detail below.
  • a conventionally known "CDK8 / 19 inhibitor” can also be used, and such a CDK8 / 19 inhibitor can be found in patented or non-patented documents.
  • a CDK8 / 19 inhibitor can be used as the "CDK8 / 19 inhibitor" in the present invention.
  • a compound (or a salt thereof) that selectively has an inhibitory activity on CDK8 / 19 can be used as the "CDK8 / 19 inhibitor" in the present invention.
  • the CDK8 / 19 inhibitor has an inhibitory activity against ALK5 (active receptor-like kinase 5), the CDK8 / 19 inhibitor has a concentration required to show an inhibition rate of 50% against ALK5 (IC 50 ).
  • the value is preferably 1 ⁇ M or more.
  • the CDK8 / 19 inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include the following compounds or salts thereof. Further, these compounds may have one or more substituents as long as they have CDK8 / 19 inhibitory activity, or some partial structures (substructures, rings, etc.) may be converted.
  • CDK8 / 19 inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited, and for example, the compounds 7 to 13 described below or salts thereof can be used.
  • Compounds 7 to 11 are preferably in a free form, and compounds 12 and 13 are preferably trifluoroacetic acid salts.
  • the CDK8 / 19 inhibitor in the present invention is not limited to the compounds shown above, but is an antisense oligonucleotide against the mRNA of CDK8 / 19, siRNA, an antibody that binds to CDK8 / 19, and a dominant negative CDK8 / 19 variant. Etc. can also be used as CDK8 / 19 inhibitors.
  • CDK8 / 19 inhibitor one that is commercially available or synthesized according to a known method can be used.
  • the "insulin-positive cell population” in the present invention means a cell population containing insulin-positive cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells.
  • Insulin-positive cell means a cell characterized by the presence of expression of an insulin marker.
  • Insulin-positive cells may express the marker of NK6 homeobox 1 (NKX6.1), preferably cells expressing both insulin and NKX6.1 markers (ie, insulin-positive and insulin-positive cells). NKX6.1 positive cells).
  • the "insulin-positive cell population” in the present invention is a conventionally known method (that is, a cell population in a pancreatic precursor cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage is cultured in the presence of an ALK5 inhibitor (for example, ALK5 inhibitor II).
  • ALK5 inhibitor for example, ALK5 inhibitor II.
  • Insulin-positive cells especially insulin-positive and NKX6.1-positive, compared to the insulin-positive cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells according to a procedure involving steps (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133, etc.). Is a cell population enriched with insulin.
  • the content of insulin-positive and NKX6.1-positive cells in the insulin-positive cell population of the present invention is 33% or more, preferably 34% or more, more preferably 35% or more, still more preferably 36% or more, and particularly preferably 36% or more. It is 37% or more.
  • the upper limit of the content is not particularly limited, but is 70% or less, 60% or less, or 50% or less.
  • the content rate can be expressed using two numerical values selected from the upper and lower limit values, for example, the content rate is 33% to 50%, preferably 34% to 50%, and more preferably 35. % To 50%, more preferably 36% to 50%, and particularly preferably 37% to 50%.
  • the "insulin-positive cell population" in the present invention is obtained by treating a pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells or a cell population in a subsequent differentiation stage with a CDK8 / 19 inhibitor.
  • Insulin-positive cells preferably insulin-positive and NKX6.1-positive cells, are enriched by treating the pancreatic progenitor cell population or a cell population at a predetermined differentiation stage, which is a subsequent differentiation stage, with a CDK8 / 19 inhibitor.
  • the resulting insulin-positive cell population can be obtained.
  • the insulin-positive cell population includes other cells (eg, endocrine progenitor cells; other pancreatic hormone-producing cells expressing at least one marker of glucagon, somatostatin, and pancreatic polypeptide; Ki67-positive cells. ; CHGA-negative cells, etc.) may be included.
  • other cells eg, endocrine progenitor cells; other pancreatic hormone-producing cells expressing at least one marker of glucagon, somatostatin, and pancreatic polypeptide; Ki67-positive cells. ; CHGA-negative cells, etc.
  • the "pancreatic progenitor cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage” is a pancreatic progenitor cell population, an endocrine progenitor cell population, or a pancreatic progenitor cell population and an endocrine progenitor cell population. Means both cell populations.
  • pluripotency means the ability to differentiate into tissues and cells having various different morphologies and functions, and into cells of any lineage of three germ layers.
  • Pluripotency is a “totipotency” that can differentiate into any tissue in the body, including the scutellum, in that it cannot differentiate into the scutellum and therefore has no ability to form individuals. Is distinguished from.
  • multipotency means the ability to differentiate into a plurality of limited lineages of cells.
  • mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, and neural stem cells are multipotent, but not multipotent.
  • pluripotent stem cell refers to embryonic stem cells (ES cells) and similar pluripotent differentiation, that is, various tissues of the living body (endoblast, mesophyll, exo). Refers to cells that have the potential to differentiate into (all of the embryos). Examples of cells having pluripotency similar to ES cells include "induced pluripotent stem cells” (sometimes referred to as “iPS cells” in the present specification). Preferably, in the present invention, the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • ES cell various mouse ES cell lines established by inGenius, RIKEN, etc. can be used for mouse ES cells, and the US National Institutes of Health for human ES cells.
  • Various human ES cell lines established by (NIH), RIKEN, Kyoto University, and Cellartis are available.
  • NIH CHB-1 to CHB-12 strains
  • RUES1 strains, RUES2 strains, HUES1 to HUES28 strains, etc. WiCell Research Institute H1 strains, H9 strains, RIKEN KhES-1 strains, KhES-2 strains, etc.
  • a strain, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain and the like can be used.
  • “Induced pluripotent stem cell” refers to a cell obtained by introducing a specific factor (nuclear reprogramming factor) into a mammalian somatic cell or an undifferentiated stem cell and reprogramming it.
  • a specific factor nuclear reprogramming factor
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • Yamanaka et al. By introducing four factors, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc, into mouse fibroblasts.
  • iPS cells derived from human cells (Takahashi K, Yamanaka) established by introducing similar four factors into human fibroblasts.
  • Nanog-iPS cells Okita, K., Ichisaka, T. et al.). , And Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.
  • IPS cells prepared by a method that does not contain c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008). , 101-106)
  • iPS cells established by introducing 6 factors virus-free (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8 (5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells.
  • induced pluripotent stem cells (Yu J., Thomason JA. Et al., Science (2007) 318: established by introducing four factors of Oct3 / 4, SOX2, NANOG and LIN28 produced by Thomason et al. 1917-1920.), Induced pluripotent stem cells produced by Dayy et al. (Park IH, Dayley GQ.et al., Nature (2007) 451: 141-146), induced pluripotent stem cells (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-307007) and the like can also be used.
  • iPS cell lines established by NIH, RIKEN (RIKEN), Kyoto University, etc. can be used.
  • RIKEN's HiPS-RIKEN-1A strain, HiPS-RIKEN-2A strain, HiPS-RIKEN-12A strain, Nippons-B2 strain, Kyoto University's Ff-WJ-18 strain Ff- I01s01 shares, Ff-I01s02 shares, Ff-I01s04 shares, Ff-I01s06 shares, Ff-I14s03 shares, Ff-I14s04 shares, QHJI01s01 shares, QHJI01s04 shares, QHJI14s03 shares, QHJI14s03 shares, QHJI14s04 shares, QHJI14s04 shares 253G1 shares 253G1 shares 253G1 shares , 606A1 strain, 610B1 strain, 648A1 strain, MyCell iPS Cells
  • pancreatic progenitor cell population means a cell population containing pancreatic progenitor cells.
  • pancreatic progenitor cells are characterized by expression of the marker NKX6.1 (ie, NKX6.1 positive).
  • Pancreatic progenitor cells may further express at least one marker of PDX-1, PTF-1 ⁇ , GATA4 and SOX9.
  • pancreatic progenitor cells are characterized by expression of NKX6.1 and PDX-1 (ie, NKX6.1 positive and PDX-1 positive).
  • the "pancreatic progenitor cell population" in the present invention is a step of inducing differentiation of pluripotent stem cells into pancreatic ⁇ cells described in detail below, which is a culture after completion of step 4) or step 5). It is a cell population corresponding to the culture in.
  • pancreatic progenitor cell population in the present invention, the proportion of pancreatic progenitor cells is 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more. included.
  • the pancreatic progenitor cell population may include other cells (eg, endocrine progenitor cells, insulin positive cells, Ki67 positive cells, CHGA negative cells, etc.).
  • the proportion of specific cells in the cell population described in the present specification can be determined based on a known method such as flow cytometry that can calculate the number of cells.
  • endocrine progenitor cell population means a cell population containing endocrine progenitor cells.
  • endocrine progenitor cells mean cells characterized by the expression of at least one marker of CHGA, NeuroD and NGN3, and the absence of markers of pancreatic-related hormonal systems (eg, insulin, etc.). do.
  • Endocrine progenitor cells may express markers such as PAX-4, NKX2.2, Islet-1, PDX-1 and the like.
  • the "endocrine progenitor cell population" in the present invention is a step of inducing differentiation of pluripotent stem cells into pancreatic ⁇ cells described in detail below, which is a culture after completion of step 5) or step 6). It is a cell population corresponding to the culture in.
  • the proportion of endocrine progenitor cells is 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more. included.
  • the endocrine progenitor cell population may include other cells (eg, pancreatic progenitor cells, insulin positive cells, Ki67 positive cells, CHGA negative cells, etc.) in addition to the endocrine progenitor cells.
  • this differentiation stage can be broadly classified into pluripotent stem cells, embryonic germ layer cells, progenitor tract cells, posterior anterior intestinal cells, pancreatic progenitor cells, endocrine progenitor cells, and insulin-positive cells in relatively undifferentiated order. ..
  • the pancreatic progenitor cell population, or a cell population in a subsequent stage of differentiation can be obtained using a known technique for inducing differentiation of pluripotent stem cells into insulin-positive cells. That is, it is possible to obtain a cell population at each desired differentiation stage by using the following differentiation induction step: Step 1) Induce differentiation from pluripotent stem cells to germ layer cells in the embryo.
  • Step 2 Induce differentiation from germ layer cells in the embryo to proto-intestinal tract cells; Step 3) Induce differentiation from protointestinal cells to posterior anterior enterocytes; Step 4) Induce differentiation from posterior anterior enterocytes to pancreatic progenitor cells; Step 5) Induce differentiation from pancreatic progenitor cells to endocrine progenitor cells; Step 6) Induce differentiation from endocrine progenitor cells to insulin-positive cells.
  • each step will be described, but the induction of differentiation into each cell is not limited to these methods.
  • pluripotent stem cells are first differentiated into germ layer cells in the embryonic body. Methods for inducing germ layers in embryos from pluripotent stem cells are already known, and any of these methods may be used.
  • pluripotent stem cells are cultured in a medium containing activin A, more preferably a medium containing activin A, a ROCK inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor to differentiate into embryonic germ layer cells.
  • the number of cells at the start of culture is not particularly limited, and is 22,000 to 150,000 cells / cm 2 , preferably 22,000 to 100,000 cells / cm 2 , and more preferably 22,000 to 80,000 cells / cm 2 .
  • the culture period is 1 to 4 days, preferably 1 to 3 days, and particularly preferably 3 days.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the medium used in this step is RPMI 1640 medium, MEM medium, iMEM medium, DMEM / F12 medium, Applied MEM Zinc Option medium, Applied MEM / 1% B-27 / Penisilin Streptomycin medium, MCDB131 / 20 mM Glucose / NaHCOse / NaHCO Basic media used for culturing mammalian cells, such as FAF-BSA / ITS-X / GlutaMAX TM / Ascorbic acid / Penisilin Streptomycin medium, can be used.
  • the concentration of activin A in the medium is usually 30 to 200 ng / mL, preferably 50 to 150 ng / mL, more preferably 70 to 120 ng / mL, and particularly preferably about 100 ng / mL.
  • activin A can be included in the medium at low doses, eg, 5-100 ng / mL, preferably 5-50 ng / mL, more preferably 5-10 ng / mL.
  • the concentration of activin A in the medium is about 0.1-100 ng / mL, preferably about 1-50 ng / mL, more preferably about 3-10 ng / mL.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of the GSK3 ⁇ inhibitor used.
  • the concentration is usually 2 to 5 ⁇ M, preferably 2 to 4 ⁇ M, particularly preferably about. It is 3 ⁇ M.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of the ROCK inhibitor used.
  • the concentration is usually 5 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M, and particularly preferably about. It is 10 ⁇ M.
  • Insulin can be further added to the medium.
  • Insulin can be included in the medium in an amount of 0.01-20 ⁇ M, preferably 0.1-10 ⁇ M, more preferably 0.5-5 ⁇ M.
  • the concentration of insulin in the medium may be, but is not limited to, the concentration of insulin contained in the added B-27 supplement.
  • the cells are cultured in a medium containing activin A, a ROCK inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor for one day, and then cultured in a medium containing only activin A for another two days while changing the medium every day.
  • a medium containing activin A a ROCK inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor for one day
  • pluripotent stem cells are first cultured in medium containing 0.01-20 ⁇ M insulin, followed by a second culture in insulin-free medium. It can be manufactured by doing.
  • Step 2) Differentiation into proto-intestinal tract cells
  • the embryonic germ layer cells obtained in step 1) are further cultured in a medium containing a growth factor to induce differentiation into proto-intestinal tract cells.
  • the culture period is 2 to 8 days, preferably about 4 days.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the basic medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be appropriately added to the medium.
  • EGF EGF
  • KGF EGF
  • FGF10 EGF
  • EGF and / or KGF are more preferable
  • KGF is further preferable.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M. In the case of EGF, its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.8 to 320 nM), preferably about 5 to 1000 ng / mL (ie, about 0.8 to 160 nM), more preferably about 10 to. It is 1000 ng / mL (ie, about 1.6-160 nM).
  • FGF10 its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.3 to 116 nM), preferably about 10 to 1000 ng / mL (ie, about 0.6 to 58 nM).
  • concentration is usually 5 to 150 ng / mL, preferably 30 to 100 ng / mL, and particularly preferably about 50 ng / mL.
  • Step 3) Differentiation into posterior anterior enterocytes
  • the progenitor intestinal cells obtained in Step 2) are further cultured in a medium containing growth factors, cyclopamine, nogin and the like to induce differentiation into posterior anterior enterocytes.
  • the culture period is 1 to 5 days, preferably about 2 days.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the basic medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be appropriately added to the medium.
  • EGF EGF
  • KGF EGF
  • FGF10 EGF
  • EGF and / or KGF are more preferable
  • KGF is further preferable.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M. In the case of EGF, its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.8 to 320 nM), preferably about 5 to 1000 ng / mL (ie, about 0.8 to 160 nM), more preferably about 10 to. It is 1000 ng / mL (ie, about 1.6-160 nM).
  • FGF10 its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.3 to 116 nM), preferably about 10 to 1000 ng / mL (ie, about 0.6 to 58 nM).
  • concentration is usually 5 to 150 ng / mL, preferably 30 to 100 ng / mL, and particularly preferably about 50 ng / mL.
  • the concentration of cyclopamine in the medium is not particularly limited, but is usually 0.5 to 1.5 ⁇ M, preferably 0.3 to 1.0 ⁇ M, and particularly preferably about 0.5 ⁇ M.
  • the concentration of nogin in the medium is not particularly limited, but is usually 10 to 200 ng / mL, preferably 50 to 150 ng / mL, and particularly preferably about 100 ng / mL.
  • Step 4) Differentiation into pancreatic progenitor cells
  • the posterior anterior intestinal cells obtained in step 3) further contain a medium containing a factor having CDK8 / 19 inhibitory activity, preferably a factor having CDK8 / 19 inhibitory activity and a growth factor. It is cultured in a medium to induce differentiation into pancreatic progenitor cells.
  • the culture period is 2 to 10 days, preferably about 5 days.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the posterior anterior intestinal cells obtained in step 3 were prepared with a 0.25% tripsin-EDTA solution according to the previous report (Toyoda et al., Stem cell Research (2015) 14,185-197). The cells were treated and dispersed in the solution by pipetting to obtain a cell dispersion, the obtained dispersion was centrifuged, the collected cells were resuspended in a small amount of new medium, and the cell suspension was obtained. Is re-seeded in the new medium of step 4).
  • the basic medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be appropriately added to the medium.
  • the factor having the CDK8 / 19 inhibitory activity the above-mentioned various compounds or salts thereof can be used, and the amount to be added to the medium is appropriately determined depending on the compound used or the salt thereof, but is usually about 0.00001 ⁇ M. It is ⁇ 5 ⁇ M, preferably 0.00001 ⁇ M to 1 ⁇ M.
  • the concentration of the factor having the CDK8 / 19 inhibitory activity in the medium is preferably a concentration reaching 50% or more of the CDK8 / 19 inhibitory activity.
  • EGF EGF
  • KGF EGF
  • FGF10 EGF
  • KGF and / or EGF are more preferable
  • KGF and EGF are further preferable.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M. In the case of EGF, its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.8 to 320 nM), preferably about 5 to 1000 ng / mL (ie, about 0.8 to 160 nM), more preferably about 10 to. It is 1000 ng / mL (ie, about 1.6-160 nM).
  • FGF10 its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.3 to 116 nM), preferably about 10 to 1000 ng / mL (ie, about 0.6 to 58 nM).
  • concentrations of EGF are usually usually 5 to 150 ng / mL, preferably 30 to 100 ng / mL, particularly preferably about 50 ng / mL, and KGF is usually 10 to 200 ng / mL. It is preferably 50 to 150 ng / mL, particularly preferably about 100 ng / mL.
  • the first day of culturing in step 4) may be performed in the presence of a ROCK inhibitor, and thereafter, culturing may be performed in a medium containing no ROCK inhibitor.
  • the medium may contain a protein kinase C (PKC) activator.
  • PKC protein kinase C
  • PDBu PKC activator II
  • TPB PKC activator V
  • the concentration of the PKC activator is about 0.1-100 ng / mL, preferably about 1-50 ng / mL, more preferably about 3-10 ng / mL.
  • dimethyl sulfoxide and / or activin (1 to 50 ng / mL) may be added to the medium.
  • a serum substitute for example, B-27 supplement, ITS-G
  • amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (product name) may be added to the medium.
  • amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (product name) may be added to the medium.
  • antibiotics eg, Antibiotic-Antimycotic, penicillin, streptomycin, or mixtures thereof
  • antibacterial agents For example, amphotelicin B
  • an antioxidant pyruvate
  • a buffer inorganic salts and the like
  • concentration in the medium is usually 0.01 to 20% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • cell culture is performed by adhesive culture without using feeder cells.
  • a culture container such as a dish, a flask, a microplate, and a cell culture sheet such as OptiCell (product name) (Nunc) is used.
  • the culture vessel has surface treatment to improve cell adhesion (hydrophilicity), collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, and matrigel (eg BD matrigel (Japan). Becton Deckonson)), preferably coated with a cell adhesion substrate such as vitronectin.
  • a culture vessel coated with type I collagen, Matrigel, fibronectin, vitronectin, poly-D-lysine or the like is preferable, and a culture vessel coated with Matrigel or poly-D-lysine is more preferable.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) can be further purified by using a known surface marker such as glycoprotein 2 (GP2).
  • GP2 glycoprotein 2
  • the purification can be carried out by a method known per se, for example, beads on which an anti-GP2 antibody is immobilized.
  • Step 5) Differentiation into endocrine progenitor cells
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) are further cultured in a medium containing a growth factor to induce differentiation into endocrine progenitor cells.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the pancreatic precursor cells obtained in step 4) are treated with a 0.25% trypsin-EDTA solution and pipetting to disperse them in the solution to obtain a cell dispersion.
  • the obtained dispersion is subjected to centrifugation, the collected cells are resuspended in a small amount of new medium, and the cell suspension is reseeded in the new medium of step 5).
  • the culture period is 2 to 3 days, preferably about 2 days.
  • the basic medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • SANT1, retinoic acid, ALK5 inhibitor II, T3, and LDN were added to the medium, and Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, and FGF (preferably FGF2) were added.
  • Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, and FGF preferably FGF2
  • Serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be added as appropriate.
  • the ALK5 inhibitor ALK5 inhibitor II, etc.
  • the ALK5 inhibitor ALK5 inhibitor II, etc.
  • the ALK5 inhibitor II, etc. is preferable. Do not use.
  • Culturing is performed by non-adhesive culture without using feeder cells. During culturing, dishes, flasks, microplates, porous plates (Nunc), etc. or bioreactors are used.
  • the culture vessel is preferably surface-treated to reduce its adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the endocrine progenitor cells obtained in step 5) can be further purified by using a known surface marker such as glycoprotein 2 (GP2).
  • GP2 glycoprotein 2
  • the purification can be carried out by a method known per se, for example, beads on which an anti-GP2 antibody is immobilized.
  • Step 6) Differentiation into insulin-positive cells
  • the endocrine progenitor cells obtained in step 5) are further cultured in a medium containing a growth factor to induce differentiation into insulin-positive cells.
  • the culture period is 10 to 30 days, preferably about 10 to 20 days.
  • the basic medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-cysteine, AXL inhibitor, and ascorbic acid were added to the medium.
  • Wnt inhibitors, ROCK inhibitors, FGFs (preferably FGF2), serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be added as appropriate.
  • ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, and ascorbic acid may be added to the medium, or T3, ALK5 inhibitor II, ZnSO 4 , heparin, N-acetylcysteine, Trolox, and R428 may be added.
  • the ALK5 inhibitor (ALK5 inhibitor II, etc.) may not be used, and the ALK5 inhibitor (ALK5 inhibitor II, etc.) is preferable. Do not use.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture. Culture does not use feeder cells. In the case of three-dimensional culture, non-adhesive culture is used. During culturing, dishes, flasks, microplates, porous plates (Nunc), etc. or bioreactors are used.
  • the culture vessel is preferably surface-treated to reduce its adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • a pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells with a CDK8 / 19 inhibitor, or a cell population in a subsequent differentiation stage brings the cell population into contact with the CDK8 / 19 inhibitor. It can be done by. For example, this can be done by culturing the cell population in a medium supplemented with a CDK8 / 19 inhibitor.
  • the CDK8 / 19 inhibitor can be included in the medium in any amount capable of inhibiting CDK8 / 19 activity, eg, 10 ⁇ M or less, 5 ⁇ M or less, 4 ⁇ M or less, 3 ⁇ M or less, 2 ⁇ M or less, or 1 ⁇ M or less. Can be included in the amount of.
  • the amount should be less than 1 ⁇ M.
  • the lower limit of the amount of the CDK8 / 19 inhibitor added is not particularly limited, but may be 0.1 ⁇ M or more, 0.2 ⁇ M or more, 0.3 ⁇ M or more, 0.4 ⁇ M or more, or 0.5 ⁇ M or more.
  • the amount of the CDK8 / 19 inhibitor added is 10 ⁇ M or less and 0.1 ⁇ M or more, preferably 5 ⁇ M or less and 0.1 ⁇ M or more, more preferably 1 ⁇ M or less and 0.1 ⁇ M or more, for example, less than 1 ⁇ M and 0.1 ⁇ M or more. be.
  • the pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells, or the cell population in the subsequent differentiation stage is cultured for at least 12 hours, preferably 24 hours in the presence of a CDK8 / 19 inhibitor. It can be performed for 2 days or more, 4 days or more, 8 days or more, 10 days or more, or 15 days or more. Culturing in the presence of the CDK8 / 19 inhibitor is preferably carried out for 4 days or longer.
  • the medium can be replaced during the treatment period with the CDK8 / 19 inhibitor, and according to the culture schedule, the medium should be replaced with a medium having the same composition as before the replacement to which the CDK8 / 19 inhibitor was added or a medium having a different composition. Can be done.
  • the pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells, or the cell population in the subsequent differentiation stage, is treated with a CDK8 / 19 inhibitor and further differentiated into the target cell population.
  • treated with a CDK8 / 19 inhibitor means that the step of treating with a CDK8 / 19 inhibitor and the step of differentiating are performed at the same time, or the step of treating with a CDK8 / 19 inhibitor and then differentiating is applied.
  • the medium used for treatment with the CDK8 / 19 inhibitor and the medium used for differentiating the cell population may be different, and the medium used for the differentiation step may further include the CDK8 / 19 inhibitor. It may be added.
  • the CDK8 / 19 inhibitor is the medium after step 5, that is, the medium of step 5, or the medium of step 6, in the step of inducing differentiation of pluripotent stem cells from insulin-positive cells. , The medium of step 5 and the medium of step 6 to act on the cells.
  • pancreatic ⁇ cell population The insulin-positive cell population obtained by the present invention can be induced to differentiate into a cell population containing pancreatic ⁇ cells (hereinafter referred to as “pancreatic ⁇ cell population”).
  • pancreatic ⁇ -cell means a cell that is more mature than "insulin-positive cell", and specifically, at least one marker of MAFA, UCN3, and IAPP, which are markers of pancreatic ⁇ -cell maturation. Means cells that express or are characterized by an elevated insulin secretion response to glucose stimulation.
  • the pancreatic ⁇ cell population may include other cells (eg, insulin positive cells, Ki67 positive cells, CHGA negative cells, etc.).
  • the pancreatic ⁇ -cell population can be obtained by differentiating and maturing an insulin-positive cell population, preferably by differentiating and maturing in an animal body.
  • the "animal” is preferably a mammal, and examples thereof include humans, non-human primates, pigs, cows, horses, sheep, goats, llamas, dogs, cats, rabbits, mice, guinea pigs, and the like, but humans are preferable. ..
  • Transplantation is preferably performed in an in vivo region where the cell population can be fixed in a fixed position, for example, in each organ such as subcutaneous, intraperitoneal, peritoneal epithelium, omentum, adipose tissue, muscle tissue, pancreas, kidney, etc. It can be done under the coating.
  • the number of cells to be transplanted may vary depending on factors such as the stage of differentiation of the cells to be transplanted, the age, body weight, size of the transplant site, and the severity of the disease of the transplant target, and is not particularly limited. It can be about 10 ⁇ 10 4 cells to 10 ⁇ 10 11 cells.
  • the transplanted cell population is induced to differentiate in the in vivo environment and can differentiate into a target cell population, preferably a pancreatic ⁇ cell population, which may be then recovered or left in vivo as it is. May be good.
  • the cell population may be embedded in a gel containing a biocompatible material and transplanted, for example, a cell population embedded in a gel containing a biocompatible material may be encapsulated in a capsule, a bag, a chamber, or the like. It can also be encapsulated in the device of the above and transplanted into the living body.
  • epithelial means that an endocrine progenitor cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage is interspersed and contained in a gel containing a biocompatible material.
  • biocompatible material refers to any material that does not induce a significant immune response or harmful biological reaction (eg, toxic reaction, blood clot, etc.) when transplanted into a living body and left indwelling for a short or long period of time. Means. Further, the "biocompatible material” is preferably a biodegradable material. Examples of such materials include polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polyurethane (PU), polyethylene glycol (PEG), polyhydroxyethyl methacrylate, polyglycolic acid (PGA), and polylactic acid-co-glycolic acid (polylactic acid-co-glycolic acid (PGA).
  • PLA polylactic acid
  • PCL polycaprolactone
  • PU polyurethane
  • PEG polyethylene glycol
  • PGA polyhydroxyethyl methacrylate
  • PGA polyglycolic acid
  • PGA polylactic acid-co-glycolic acid
  • PLGA poly (3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvariate)
  • PHBV poly (3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvariate)
  • PEVA poly (ethylene-co-vinyl acetate) polyacrylamide, polyethylene oxide, polyethylene amine, polyhydroxybutyric acid, poly (N-).
  • Vinylpyrrolidone polyvinyl alcohol, propylene polyfumarate, polyacrylic acid, polye-caprolactone, polymethacrylic acid, polyvinylidene difluoride (PVDF), pectic acid, hyaluronic acid, heparin sulfate, chondroitin sulfate, heparan sulfate proteoglycan, heparin , Chitin, chitosan, xanthane, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl chitosan, alginate, alginate ester, collagen, cellulose, silk fibroin, keratin, gelatin, fibrin, purulan, laminin, gellan, silicon, urethane, elastin and their modifications.
  • the surface of the "biocompatible material” may optionally have surface modifications that allow cell adhesion (eg, cell adhesion substrates (collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin). , Matrigel, Vitronectin, etc.) and functional groups known to control cell proliferation, differentiation and function (eg, amino group, carboxyl group, hydroxyl group, methacrylic acid group, acrylic acid group, etc.) May be modified.
  • cell adhesion substrates collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • functional groups known to control cell proliferation, differentiation and function eg, amino group, carboxyl group, hydroxyl group, methacrylic acid group, acrylic acid group, etc.
  • alginate or alginate ester can be suitably used as the "biocompatible material”.
  • the alginate may be a water-soluble salt, and a metal salt, an ammonium salt, or the like can be used.
  • a metal salt, an ammonium salt, or the like can be used.
  • sodium alginate, calcium alginate, ammonium alginate and the like can be preferably used.
  • Alginic acid ester (also called propylene glycol alginate) is a derivative in which propylene glycol is ester-bonded to the carboxyl group of alginic acid.
  • the ratio of mannuronic acid to gluronic acid (M / G ratio) contained in alginate is arbitrary, and generally, when M> G, a flexible gel can be formed, and M ⁇ . When it is G, a strong gel can be formed.
  • those containing gluronic acid at a ratio of 10 to 90%, 20 to 80%, 30 to 70%, or 40 to 60% can be used.
  • the gel using alginate or alginate ester can be prepared according to a known method (WO2010 / 032242, WO2011 / 154941), and gelation is performed by adding a cross-linking agent to the solution of alginate or alginate ester. It can be obtained by letting it.
  • the alginate or alginate ester can be contained in the solvent in an amount of 0.05 to 10% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight, and more preferably 0.5 to 3% by weight.
  • the solvent may be any solvent as long as it can dissolve alginate or alginate ester, and water, physiological saline or the like can be used.
  • the cross-linking agent may be any as long as it can gel a solution of alginate or alginate ester, and is not particularly limited, but a polyvalent metal cation can be used.
  • a polyvalent metal cation a divalent metal cation is preferable, and calcium ion, strontium ion, and barium ion are more preferable.
  • the cross-linking agent can be used in the form of a salt, and in the present invention, at least one selected from calcium chloride, strontium chloride, and barium chloride can be used as the cross-linking agent.
  • Nanofibers are natural or synthetic fibers with diameters in the nanometer range.
  • natural nanofibers include those containing one or more polysaccharides such as collagen, cellulose, silk fibroin, keratin, gelatin and chitosan.
  • synthetic nanofibers include polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polyurethane (PU), poly (lactide-co-glycolide) (PLGA), and poly (3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvariate) (. PHBV), poly (ethylene-co-vinyl acetate) (PEVA) and the like.
  • Nanofibers are in less than 1% by weight, eg, 0.9% by weight, 0.8% by weight, 0.7% by weight, 0.6% by weight, 0.5% by weight, or less than 1% by weight in gels containing alginic acid. Can be included in quantity.
  • the lower limit of the amount of nanofibers contained in the gel containing alginate or alginate ester is not particularly limited, but may be 0.05% by weight or more, preferably 0.1% by weight or more.
  • Embedding the cell population in a gel containing alginate or alginate can be performed by any means and is not particularly limited, for example, mixing the cell population in a solution of alginate or alginate. It can be done by gelling.
  • the cell population should be included in a solution of alginate or alginate in an amount selected from 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 9 cells / mL, preferably 1 ⁇ 10 7 cells to 1 ⁇ 10 8 cells / mL. Can be done.
  • Gelation of a solution of alginate or alginate ester containing a cell population can be performed by adding a cross-linking agent to the solution.
  • the amount of the cross-linking agent to be added can be an amount selected from 0.1 to 5% by weight, for example, 0.1 to 1% by weight, based on the solution.
  • Gelation can be performed in a container having a predetermined configuration and / or shape used for cell culture or cell transplantation, or in a template designed to obtain a gel suitable for the container.
  • a gel capsule containing alginic acid may be formed according to a known method (WO2010 / 010902). That is, a solution of alginate or alginate ester containing a cell population may be added dropwise to the solution of the cross-linking agent.
  • the size of the droplet can be adjusted according to the shape of the nozzle and the method of dropping, and the size of the gel capsule containing alginic acid can be specified.
  • the dropping method is not particularly limited, but it can be performed by a method such as an air spray method, an airless spray method, or an electrostatic spray method.
  • the size of the gel capsule containing alginic acid is not particularly limited, but the diameter can be 5 mm or less, 1 mm or less, and 500 ⁇ m or less.
  • the cross-linking agent solution can contain an amount of cross-linking agent selected from 0.1 to 10% by weight, for example 0.1 to 5% by weight.
  • the insulin-positive cell population obtained by the present invention can be transplanted into an animal body, and when differentiated in the animal body, it can be left as it is and used as a cell that produces and secretes insulin. ..
  • the insulin-positive cell population obtained by the present invention is useful as a cell medicine for treating diabetes, especially type I diabetes, as it is or by encapsulating it and transplanting it into the affected area.
  • the insulin-positive cell population obtained by the present invention may be a prodrug.
  • a prodrug refers to a cell population that differentiates after being transplanted into a living body and changes into a cell having a function of treating a disease.
  • the insulin-positive cell population obtained by the present invention has low toxicity (eg, acute toxicity, chronic toxicity, genetic toxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, carcinogenicity), and is a carrier which is acceptable as it is or pharmacologically.
  • toxicity eg, acute toxicity, chronic toxicity, genetic toxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, carcinogenicity
  • a carrier which is acceptable as it is or pharmacologically.
  • the present invention provides a differentiation medium for a pancreatic progenitor cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage, which comprises a CDK8 / 19 inhibitor.
  • the differentiation medium of the present invention can be used to induce the differentiation of a pancreatic progenitor cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage.
  • the differentiation medium of the present invention can be used in step 5) or step 6) in the above-mentioned method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into insulin-positive cells.
  • the differentiation medium of the present invention is RPMI 1640 medium, MEM medium, iMEM medium, DMEM / F12 medium, Applied MEM Zinc Option medium, Improved MEM / 1% B-27 / Penisilin Streptomycin medium, MCDB131 / 20 mM Glucose / NaHCO 3 -Any CDK8 / 19 inhibitor capable of inhibiting CDK8 / 19 activity in a basal medium used for culturing mammalian cells, such as BSA / ITS-X / GlutaMAX TM / Ascorbic acid / Penisilin Streptomycin medium. Included in quantity. The amount of CDK8 / 19 inhibitor contained in the medium is as defined above.
  • the differentiation medium of the present invention further comprises other factors such as growth factors, various inhibitors, serum substitutes, antibiotics, vitamins, etc. required in steps 5) and 6), respectively. including.
  • the medium used in step 5) includes SANT1, retinoic acid, T3, LDN, Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, and FGF (preferably FGF2). ), Serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like can be added in predetermined amounts.
  • the medium used in step 6) includes T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-cysteine, AXL inhibitor, ascorbic acid, Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, and the like.
  • FGF preferably FGF2
  • serum substitutes vitamins, antibiotics, ZnSO 4 , heparin, N-acetylcysteine, Trolox, R428 and the like can be added in predetermined amounts.
  • the differentiation medium of the present invention has substantially no ALK5 inhibitory activity.
  • “Substantially having no ALK5 inhibitory activity” is as defined above, and not only means that it has no ALK5 inhibitory activity at all, but also has an inhibition rate of less than 50%, preferably 40. % Or less, more preferably 30% or less, still more preferably 20% or less, still more preferably 10% or less, particularly preferably 5% or less, and a compound having ALK5 inhibitory activity (for example, ALK5 inhibitor II). Etc.) may be included as long as the above definition is satisfied.
  • the differentiation medium of the present invention may be provided in one form in which the basal medium, the CDK8 / 19 inhibitor and the above other factors are all mixed, or may be provided in any combination, or separately provided in a plurality of forms. It may be prepared for business.
  • Example 1 Evaluation of ALK4 Inhibiting Activity, ALK5 Inhibiting Activity, CDK8 Inhibiting Activity and CDK19 Inhibiting Activity
  • the test compound diethyl (E)-(4- (3- (5- (4-fluorophenyl) ) -1-Methyl-1H-pyrazole-4-yl) acrylamide) benzyl) phosphonate (Compound 1), 2- (4- (4- (isoquinolin-4-yl) phenyl) -1H-pyrazole-1-yl) -N, N-dimethylacetamide (Compound 2 (BI-1347)) and 4-((2- (6- (4-methylpiperazin-1-carbonyl) naphthalene-2-yl) ethyl) amino) quinazoline-
  • the ALK4 inhibitory activity, ALK5 inhibitory activity, CDK8 inhibitory activity and CDK19 inhibitory activity of 6-carbonitrile Compound 3 (Senexin B) were evaluated.
  • the test compound was added to each of the ALK4, ALK5, CDK8, and CDK19 kinases at 0.1 ⁇ M and 1 ⁇ M (that is, -Log 10 values 7 and 6) to reduce the binding inhibitory activity to 0. Measured at ⁇ 100%.
  • the estimated pIC 50 was calculated from the two obtained values and displayed as a value of 6-8.
  • pIC 50 6 means that the binding inhibitory activity is not shown at any of the added concentrations of 0.1 ⁇ M and 1 ⁇ M in this measurement test, and the compound has no inhibitory activity or weak binding inhibition of pIC 50 ⁇ 6. It means that it was thought to have only activity.
  • Table 3 shows the concentration (estimated pIC 50 value) of each test compound required to show an inhibition rate of 50% for ALK4, ALK5, CDK8, and CDK19.
  • Example 2 Increase in target cells (insulin-positive and NKX6.1-positive cells) in the cell population obtained by treating the pancreatic progenitor cell population with a CDK8 / 19 inhibitor.
  • Method Induction of differentiation of iPS cells into a pancreatic progenitor cell population was carried out according to the above steps 1) -4), previously reported (Stem Cell Research (2015) 14, 185-197) and the like.
  • Induction of differentiation into insulin-positive cells was carried out according to the above steps 5), 6) and the like.
  • ALK5 inhibitor II (10 ⁇ M) or CDK8 / 19 together with differentiation factors (SANT1, retinoic acid, T3, LDN, Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, FGF2) from the pancreatic precursor cell population obtained by inducing differentiation from iPS cells.
  • Differentiation-inducing medium Improved MEM / 1% B-27 / Penicillin Streptomycin
  • an inhibitor Compound 1, Compound 2 or Compound 3
  • ALK5 Inhibitor II (10 ⁇ M) or CDK8 / 19 Inhibitor (Compound 1, Compound 2 or Compound 3) was then combined with differentiation factors (T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, FGF receptor 1 inhibitor PD-166866).
  • T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, FGF receptor 1 inhibitor PD-166866 After culturing in a differentiation-inducing medium (Improved MEM / 1% B-27 / Penicillin Streptomycin medium) containing ALK5 inhibitor II and CDK8 / 19 inhibitor at a predetermined concentration for 7 days, the report (Nature Biotechnology) has been reported.
  • ALK5 Inhibitor II (10 ⁇ M) with T3, LDN, ⁇ -sretase inhibitor RO, N-acetylcysteine, AXL inhibitor R428, ascorbic acid, ROCK inhibitor, ZnSO4, heparin, Trolox.
  • a differentiation-inducing medium (MCDB131 / 20 mM Glucose / NaHCO3 / FAF-BSA / ITS-X / Glutamax /) containing a CDK8 / 19 inhibitor at a predetermined concentration or containing neither ALK5 inhibitor II nor a CDK8 / 19 inhibitor. It was cultured in Penicillin (Streptomycin medium) for 4 days to induce differentiation into an insulin-positive cell population.
  • the number of insulin-positive and NKX6.1-positive cells and the number of insulin-positive and NKX6.1-negative cells in the insulin-positive cell population obtained by the above method were counted by flow cytometry, and the target cells in each cell population were counted. That is, the cell rate of insulin positive and NKX6.1 positive, and the cell rate of non-target cells, that is, insulin positive and NKX6.1 negative were determined.
  • the insulin-positive cell population was conventionally compared to the pancreatic progenitor cell population. It was possible to produce a cell population having a higher proportion of the target insulin-positive and NKX6.1-positive cells than when ALK5 inhibitor II (10 ⁇ M), which was generally used for inducing differentiation, was used. ..
  • the proportion of target insulin-positive and NKX6.1-positive cells in the obtained cell population was about 33%. Even when the concentration of ALK5 inhibitor II added to the medium was increased to 30 ⁇ M, the ratio was about the same or less (data not shown).
  • the proportion of target cells (insulin-positive and NKX6.1-positive cells) in the cell population was increased. , It was confirmed that it was increased by more than 33%.

Abstract

本発明は、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を分化誘導するための新規な方法を提供することを目的とするものであり、膵前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む培地中で分化させることを含む、インスリン陽性細胞集団を製造する方法を提供する。

Description

成熟化剤
　本発明は、多能性幹細胞からのインスリン陽性細胞集団の製造方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、サイクリン依存キナーゼ８及び／又はサイクリン依存キナーゼ１９（以下、「ＣＤＫ８／１９」と記載する場合がある）に対する阻害活性を有する因子と作用させることを特徴とするインスリン陽性細胞集団の製造方法に関する。
　［発明の背景］
　ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、インスリン陽性細胞や膵β細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。
　これまでに、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団へと分化誘導するために様々な手法が、開発・報告されている（非特許文献１）。しかしながら、分化誘導して得られるインスリン陽性細胞集団には、目的とするインスリン陽性細胞（特に、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞等）以外にも、様々な細胞が含まれている。インスリン陽性細胞集団を糖尿病治療に応用しようとした場合、細胞集団に含まれる細胞の種類を厳密に制御することは、安全性の観点から極めて重要である。そのため、目的とする細胞をより多く含むことを可能とする新たなインスリン陽性細胞集団の分化誘導方法が切望されていた。
Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７
　本発明は、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を分化誘導するための新規な方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を誘導する過程において、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団にＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子（以下、「ＣＤＫ８／１９阻害剤」と記載する場合がある）を作用させることによって、インスリン陽性細胞、特に、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞、を効率的に分化誘導することができ、従来法と比べて、当該細胞をより多く含むインスリン陽性細胞集団を得ることが可能であることを見出した。
　本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］　インスリン陽性細胞集団を製造する方法であって、
膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む培地中で分化させることを含む、方法。
［２］　前記培地がＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない、［１］の方法。
［３］　前記ＣＤＫ８／１９阻害剤のＡＬＫ５に対するＩＣ50が１μＭ以上である、［１］又は［２］の方法。
［４］　ＣＤＫ８／１９阻害剤が、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミドからなる群より選択される一又は複数である、［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］　膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導して製造されたものである、［１］～［４］のいずれかの方法。
［６］　ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の分化培地。
［７］　ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない、［６］の培地。
［８］　ＣＤＫ８／１９阻害剤のＡＬＫ５に対するＩＣ50が１μＭ以上である、［６］又は［７］の培地。
［９］　ＣＤＫ８／１９阻害剤が、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミドからなる群より選択される一又は複数である、［６］～［８］のいずれかの培地。
　本明細書は本願の優先権の基礎である２０２０年１１月２０日に出願された日本国特許出願２０２０－１９３４５４号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
　本発明によれば、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を分化誘導するための新規な方法を提供することができる。すなわち、本発明によれば、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を誘導する過程において、インスリン陽性細胞、特に、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞、を効率的に分化誘導することができ、従来法と比べて、当該細胞をより多く含むインスリン陽性細胞集団を得ることができる。
図１は、膵前駆細胞集団を、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を含む分化誘導培地で処理して得られたインスリン陽性細胞集団における、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性（「ＩＮＳ＋／ＮＫＸ＋」と表示）の細胞率、及びインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性（「ＩＮＳ＋／ＮＫＸ－」と表示）の細胞率を示すグラフ図である。 図２は、膵前駆細胞集団を、所定濃度のＡＬＫ５インヒビターＩＩ、又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を含む分化誘導培地で処理して得られたインスリン陽性細胞集団の、インスリン及びＮＫＸ６．１のフローサイトメトリーによる発現解析結果を示す。
１．用語
　以下、本明細書において記載される用語について説明する。
　本明細書において、「約」又は「およそ」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ２５％、２０％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。
　本明細書において、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
　本明細書において、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）　ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。
　本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。
　なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンＣ処理などによって不活性化することができる。
　本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。
　本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。培養には２次元培養（平面培養）や、３次元培養（浮遊培養）が含まれる。
　本明細書において、「富化する（ｅｎｒｉｃｈ）」及び「富化すること（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％富化される。
　本明細書において、「枯渇する（ｄｅｐｌｅｔｅ）」及び「枯渇すること（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも５０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％減少（枯渇）している。
　本明細書において、「純化する（ｐｕｒｉｆｙ）」及び「純化すること（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％になるか、不純物（夾雑細胞を含む）は検出できない程度になりうる。
　本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。
　マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。本明細書において、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、本明細書において、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ－ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ－ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。
　本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
　本明細書において、「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」又は「ＣＤＫ８／１９阻害剤」とは、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じＣＤＫファミリーの他のタンパク質とは対照的に、ＣＤＫ８は、細胞増殖には必要とされず、ＣＤＫ８の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。ＣＤＫ１９とＣＤＫ８は類似しており、ＣＤＫ８阻害は通常ＣＤＫ１９の阻害も伴う。
　本明細書において、「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１８）、種々のコロニー刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）が挙げられる。
　本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ　ＩとＲＯＣＫ　ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ－（４－ピリジニル）－４β－［（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（本明細書中、Ｙ－２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル］スルホニル］ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン（Ｈ－１１５２）、４β－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－（４－ピリジル）ベンゼン－１α－カルボアミド（Ｗｆ－５３６）、Ｎ－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）－４ＰＥＲ（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（Ｙ－３０１４１）、Ｎ－（３－｛［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ｝フェニル）－４－｛［２－（４－モルホリニル）エチル］－オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－６－メチル－２－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－ピリジン－５－カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）を挙げることができる。ＲＯＣＫ阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＲＯＣＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＲＯＣＫに結合する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体等もＲＯＣＫ阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　本明細書において、「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２－［［２－［（５－ニトロ－６－アミノピリジン－２－イル）アミノ］エチル］アミノ］－４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＴＤＺＤ－８（４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＴＷＳ－１１９（３－［６－（３－アミノフェニル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－イルオキシ］フェノール）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）及びＡＲ－ＡＯ１４４－１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム複合体、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。ＧＳＫ３βはこれらに限定されるものではなく、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＧＳＫ３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ３β変異体等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　本明細書において「血清代替物」とは、例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔTM　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、Ｂ－２７サプリメント、Ｎ２－サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ－Ｇ）が挙げられる。血清代替物としては、Ｂ－２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ－Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１～１０重量％、好ましくは０．１～２重量％である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。
２．インスリン陽性細胞集団の製造方法
　本発明は、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤の存在下で分化させることを含む、インスリン陽性細胞集団を製造する方法を提供する。
　ＣＤＫ８／１９阻害剤は、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団に作用して、インスリン陽性細胞、特にインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞、が富化されたインスリン陽性細胞集団を生じる。
　本発明で使用する「ＣＤＫ８／１９阻害剤」は、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するものであれば特に限定されず、ＣＤＫ８／１９の機能を直接的又は間接的に阻害するあらゆる因子を使用することができる。好ましくは、本発明において「ＣＤＫ８／１９阻害剤」とは、ＣＤＫ８／１９を５０％以上阻害する因子を指す。ＣＤＫ８／１９阻害活性の有無を見る方法としては、公知の方法から選択すればよく、例えば下記に詳述する本明細書実施例１の方法が挙げられる。
　本発明において「ＣＤＫ８／１９阻害剤」は従来公知のものも使用することができ、このようなＣＤＫ８／１９阻害剤は、特許文献又は非特許文献から見つけることができる。例えば、ＵＳ２０１２／００７１４７７、ＷＯ２０１５／１５９９３７、ＷＯ２０１５／１５９９３８、ＷＯ２０１３／１１６７８６、ＷＯ２０１４／００３８９５８、ＷＯ２０１４／１３４１６９、ＪＰ２０１５／５０６３７６、ＵＳ２０１５／０２７４７２６、ＵＳ２０１６／００００７８７、ＷＯ２０１６／００９０７６、ＷＯ２０１６／００１６９５１、ＷＯ２０１６／０１８５１１、ＷＯ２０１６／１００７８２及びＷＯ２０１６／１８２９０４に記載される化合物のうち、ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する化合物（又はその塩）を、本発明における「ＣＤＫ８／１９阻害剤」として利用することができる。特に、上記化合物のうち、ＣＤＫ８／１９に選択的に阻害活性を有する化合物（又はその塩）を好適に利用することができる。
　「ＣＤＫ８／１９阻害剤」がＡＬＫ５（ａｃｔｉｖｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ　５）に対する阻害活性を有する場合には、ＣＤＫ８／１９阻害剤はＡＬＫ５に対して阻害率５０％を示すのに必要な濃度（ＩＣ50値）が１μＭ以上であるものが好ましい。このようなＣＤＫ８／１９阻害剤を利用することによって、ＣＤＫ８／１９阻害剤が添加された培地が、ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さないものとすることが可能となる。「ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない」とは、培地がＡＬＫ５阻害活性を全く有さない場合を意味するだけでなく、ＡＬＫ５に対する阻害率が５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下である場合も含まれる。
　より具体的には、本発明において利用可能なＣＤＫ８／１９阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、下記の化合物又はその塩が挙げられる。また、これらの化合物はＣＤＫ８／１９阻害活性を有する限り一又は複数の置換基を有していてもよいし、一部の部分構造（置換基、環等）が変換されていてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、本発明において利用可能なＣＤＫ８／１９阻害剤としては、特に限定されないが、たとえば、下記に記載の化合物７～１３又はその塩を使用することができる。化合物７～１１はフリー体が好ましく、化合物１２及び１３はトリフルオロ酢酸塩が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明におけるＣＤＫ８／１９阻害剤は上記に示した化合物に限定されるものではなく、ＣＤＫ８／１９のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＣＤＫ８／１９に結合する抗体、ドミナントネガティブＣＤＫ８／１９変異体等もＣＤＫ８／１９阻害剤として使用することができる。
　上記のＣＤＫ８／１９阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成されたものを利用することができる。
　本発明における「インスリン陽性細胞集団」は、多能性幹細胞から分化誘導して得られる、インスリン陽性細胞を含む細胞集団を意味する。「インスリン陽性細胞」は、インスリンのマーカーの発現が認められることによって特徴付けられる細胞を意味する。「インスリン陽性細胞」は、ＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６．１）のマーカーを発現していてもよく、好ましくは、インスリン及びＮＫＸ６．１の両方のマーカーが発現している細胞（すなわち、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞）である。
　本発明における「インスリン陽性細胞集団」は、従来公知の手法（すなわち、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ）の存在下で培養する工程を含む手法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３等））に従い多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン陽性細胞集団と比べて、インスリン陽性細胞、特にインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞が富化された細胞集団である。本発明のインスリン陽性細胞集団における、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の含有率は、３３％以上、好ましくは３４％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは３６％以上、特に好ましくは３７％以上である。当該含有率の上限は特に限定されないが、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下である。当該含有率は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該含有率は３３％～５０％、好ましくは３４％～５０％、より好ましくは３５％～５０％、さらに好ましくは３６％～５０％、特に好ましくは３７％～５０％である。
　本発明における「インスリン陽性細胞集団」は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤で処理することにより得ることができる。膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階という所定の分化段階にある細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤で処理することによって、インスリン陽性細胞、好ましくはインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞が富化されたインスリン陽性細胞集団を得ることができる。インスリン陽性細胞集団には、インスリン陽性細胞に加えて、その他の細胞（例えば、内分泌前駆細胞；グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも一つのマーカーを発現する他の膵ホルモン産生細胞；Ｋｉ６７陽性細胞；ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。
　本発明において「膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団」とは、膵前駆細胞集団、あるいは、内分泌前駆細胞集団であるか、又は、膵前駆細胞集団及び内分泌前駆細胞集団の両細胞集団を意味する。
　本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは区別される。
　本明細書において「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔだが、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔではない。
　本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。
　「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理化学研究所（理研）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）、理研、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばＥＳ細胞株としては、ＮＩＨのＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨ１株、Ｈ９株、理研のＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。
　「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３－６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１－８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４４８，３１３－３１７．）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６））、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ；８（５）：４０９－１２，Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８－６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ　Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７－１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ　ＩＨ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１－１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８－３０７００７号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ　Ｙ．，Ｄｉｎｇ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ　５，５６８－５７４；Ｋｉｍ　ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ　ＨＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６－６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ　７，７９５－７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８－３０７００７号、特開２００８－２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性細胞株としては、ＮＩＨ、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、京都大学のＦｆ－ＷＪ－１８株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＣＤＩ社のＭｙＣｅｌｌ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（２１５２５．１０２．１０Ａ）株、ＭｙＣｅｌｌ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（２１５２６．１０１．１０Ａ）株、等が挙げられる。
　本明細書において「膵前駆細胞集団」とは、膵前駆細胞を含む細胞集団を意味する。本明細書において、膵前駆細胞は、マーカーであるＮＫＸ６．１の発現によって特徴付けられる（すなわち、ＮＫＸ６．１陽性である）。膵前駆細胞は、さらに、ＰＤＸ－１、ＰＴＦ－１α、ＧＡＴＡ４およびＳＯＸ９の少なくとも一つのマーカーが発現していてもよい。好ましくは、膵前駆細胞は、ＮＫＸ６．１及びＰＤＸ－１の発現によって特徴付けられる（すなわち、ＮＫＸ６．１陽性かつＰＤＸ－１陽性である）。
　一実施形態において、本発明における「膵前駆細胞集団」は、下記に詳述する多能性幹細胞を膵β細胞へと分化誘導する工程において、工程４）終了後の培養物、又は工程５）における培養物に該当する細胞集団である。
　本発明における「膵前駆細胞集団」には、膵前駆細胞が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、よりさらに好ましくは７０％以上の割合で含まれる。膵前駆細胞集団には、膵前駆細胞に加えて、その他の細胞（例えば、内分泌前駆細胞、インスリン陽性細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。
　なお、本明細書中に記載する細胞集団中の特定の細胞の割合は、フローサイトメトリーのような細胞数を算出可能な公知の手法に基づいて求めることができる。
　本明細書において「内分泌前駆細胞集団」とは、内分泌前駆細胞を含む細胞集団を意味する。本明細書において、内分泌前駆細胞は、ＣＨＧＡ、ＮｅｕｒｏＤ及びＮＧＮ３の少なくとも一つのマーカーの発現、および膵関連のホルモン系（例えば、インスリン等）のマーカーが発現していないことによって特徴付けられる細胞を意味する。内分泌前駆細胞は、ＰＡＸ－４、ＮＫＸ２．２、Ｉｓｌｅｔ－１、ＰＤＸ－１などのマーカーが発現していてもよい。
　一実施形態において、本発明における「内分泌前駆細胞集団」は、下記に詳述する多能性幹細胞を膵β細胞へと分化誘導する工程において、工程５）終了後の培養物、又は工程６）における培養物に該当する細胞集団である。
　本発明における「内分泌前駆細胞集団」には、内分泌前駆細胞が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、よりさらに好ましくは７０％以上の割合で含まれる。内分泌前駆細胞集団には、内分泌前駆細胞に加えて、その他の細胞（例えば、膵前駆細胞、インスリン陽性細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。
　多能性幹細胞からインスリン陽性細胞へと分化する過程においては、分化段階に応じて異なる特徴を有する細胞が出現することが知られている（ＷＯ２００９／０１２４２８、ＷＯ２０１６／０２１７３４）。例えば、この分化段階は比較的未分化な順に、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、インスリン陽性細胞に大きく分類することができる。
　膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、多能性幹細胞をインスリン陽性細胞へと分化誘導する公知の手法を用いて得ることができる。すなわち、以下の分化誘導工程を利用して各目的の分化段階にある細胞集団を得ることができる：
　　工程１）多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する；
　　工程２）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する；
　　工程３）原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する；
　　工程４）後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する；
　　工程５）膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する；
　　工程６）内分泌前駆細胞からインスリン陽性細胞へと分化誘導する。
　以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。
工程１）胚体内胚葉細胞への分化
　多能性幹細胞は、まず胚体内胚葉細胞に分化させる。多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は既に公知であり、そのいずれの方法を用いてもよい。好ましくは、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地、より好ましくはアクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、２２０００～１５００００細胞／ｃｍ2、好ましくは２２０００～１０００００細胞／ｃｍ2、より好ましくは２２０００～８００００細胞／ｃｍ2である。培養期間は１日～４日、好ましくは１日～３日、特に好ましくは３日である。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　本工程で用いる培地としては、ＲＰＭＩ　１６４０培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／ＧｌｕｔａＭＡＸTM／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地を使用することができる。
　アクチビンＡの培地中の濃度は、通常３０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０～１２０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　別の態様として、アクチビンＡは培地中に低用量にて、例えば、５～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５～１０ｎｇ／ｍＬの量にて含めることができる。
　さらに別の態様として、アクチビンＡの培地中の濃度は、約０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３～１０ｎｇ／ｍＬである。
　ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２～５μＭ、好ましくは２～４μＭ、特に好ましくは約３μＭである。
　ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５～２０μＭ、好ましくは５～１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭである。
　培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンは培地中に０．０１～２０μＭ、好ましくは０．１～１０μＭ、より好ましくは０．５～５μＭの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したＢ－２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。
　特定の態様では、アクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で１日培養した後、アクチビンＡのみを含む培地で１日毎に培地を交換しながらさらに２日培養する。あるいは、低用量のアクチビンＡの存在下、多能性幹細胞を、インスリンを０．０１～２０μＭ含む培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンを含まない培地中で第２の培養を行うことにより製造することができる。
工程２）原腸管細胞への分化
　工程１）で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日～８日、好ましくは約４日である。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
工程３）後方前腸細胞への分化
　工程２）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日～５日、好ましくは約２日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
　シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常０．５～１．５μＭ、好ましくは０．３～１．０μＭ、特に好ましくは約０．５μＭである。
　ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
工程４）膵前駆細胞への分化
　工程３）で得られた後方前腸細胞を、さらにＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導する。培養期間は２日～１０日、好ましくは約５日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　２次元培養の場合には、既報（Ｔｏｙｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４，１８５－１９７）に従い、工程３）で得られた後方前腸細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で処理し、ピペッティングにより当該液中に分散させて細胞分散液を得、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を少量の新たな培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を工程４）の新しい培地に再播種する。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ～５μＭ、好ましくは０．００００１μＭ～１μＭである。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、ＣＤＫ８／１９に対して５０％以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＫＧＦ及び／又はＥＧＦがより好ましく、ＫＧＦ及びＥＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦ及びＥＧＦを使用する場合の濃度は、ＥＧＦは通常通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、ＫＧＦは通常１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　工程４）における培養の最初の１日はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行い、以後はＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。
　また、培地にはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤を含めても良い。ＰＫＣ活性化剤としては、ＰＤＢｕ（ＰＫＣ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＩＩ）、ＴＰＢ（ＰＫＣ　ａｃｔｏｖａｔｏｒ　Ｖ）などを使用するが、その限りでない。ＰＫＣ活性化剤の濃度は約０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３～１０ｎｇ／ｍＬで添加する。
　また、培地にはジメチルスルホキシド、及び／又はアクチビン（１～５０ｎｇ／ｍＬ）を添加してもよい。
　いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物（例えば、Ｂ－２７サプリメント、ＩＴＳ－Ｇ）を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１～２０重量％、好ましくは０．１～１０重量％である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　また細胞培養は、２次元培養の場合は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（製品名）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Ｉ型コラーゲン、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ－Ｄ－リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ－Ｄ－リジンでコートされた培養容器がより好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　工程４）で得られた膵前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
工程５）内分泌前駆細胞への分化
　工程４）で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程４）で得られた膵前駆細胞を、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で処理し、ピペッティングすることにより当該液中に分散させて細胞分散液を得、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を少量の新たな培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を工程５）の新しい培地に再播種する。培養期間は２日～３日、好ましくは約２日である。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。なお、本発明においては、工程５）にてＣＤＫ８／１９阻害剤を使用する場合、ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）は使用しなくてもよく、好ましくはＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）を使用しない。
　培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　工程５）で得られた内分泌前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
工程６）インスリン陽性細胞への分化
　工程５）で得られた内分泌前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養してインスリン陽性細胞に分化誘導する。培養期間は１０日～３０日、好ましくは約１０～２０日である。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ4、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。なお、本発明においては、工程６）にてＣＤＫ８／１９阻害剤を使用する場合、ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）は使用しなくてもよく、好ましくはＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）を使用しない。
　培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養は、フィーダー細胞を使用しない。３次元培養の場合、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　ＣＤＫ８／１９阻害剤による、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の処理は、当該細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤と接触させることにより行うことができる。例えば、ＣＤＫ８／１９阻害剤を添加した培地で当該細胞集団を培養することにより行うことができる。ＣＤＫ８／１９阻害剤は培地に、ＣＤＫ８／１９活性を阻害することが可能な任意の量にて含めることができ、例えば、１０μＭ以下、５μＭ以下、４μＭ以下、３μＭ以下、２μＭ以下、又は１μＭ以下の量にて含めることができる。特に、ＣＤＫ８／１９阻害剤がＡＬＫ５に対する阻害活性を有し、ＡＬＫ５に対して阻害率５０％を示すのに必要な濃度（ＩＣ50値）が１μＭ以上である場合には、１μＭ未満の量にて含めることができる。ＣＤＫ８／１９阻害剤の添加量の下限は、特に限定されないが、０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．３μＭ以上、０．４μＭ以上、又は０．５μＭ以上とすることができる。例えば、ＣＤＫ８／１９阻害剤の添加量は、１０μＭ以下０．１μＭ以上であり、好ましくは５μＭ以下０．１μＭ以上、より好ましくは１μＭ以下０．１μＭ以上、例えば、１μＭ未満０．１μＭ以上、である。
　また、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団のＣＤＫ８／１９阻害剤の存在下における培養は、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間以上、２日以上、４日以上、８日以上、１０日以上、又は１５日以上行うことができる。ＣＤＫ８／１９阻害剤の存在下における培養は、４日以上行うことが好ましい。ＣＤＫ８／１９阻害剤による処理期間中も培地の交換は可能であり、培養スケジュールにしたがって、ＣＤＫ８／１９阻害剤が添加された交換前と同じ組成を有する培地又は異なる組成を有する培地と交換することができる。
　多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理すると共に、目的の細胞集団へとさらに分化させる工程に付すことができる。ここで「ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理すると共に」とは、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理する工程と分化させる工程とを同時に行う場合、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理した後に分化させる工程に付す場合、ならびに、分化させる工程に付した後にＣＤＫ８／１９阻害剤で処理する工程に付す場合も含む。したがって、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理するのに用いる培地と細胞集団を分化させるのに用いる培地とは別々のものであってもよいし、分化させる工程に用いる培地にＣＤＫ８／１９阻害剤がさらに添加されてもよい。
　本発明の一実施形態において、ＣＤＫ８／１９阻害剤は、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞を分化誘導する工程において、工程５以降の培地、すなわち、工程５の培地、又は工程６の培地、あるいは、工程５の培地及び工程６の培地に含めて、細胞に作用させる。
　本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、膵β細胞を含む細胞集団（以下、「膵β細胞集団」と記載する）に分化誘導することができる。本明細書において「膵β細胞」は、「インスリン陽性細胞」より成熟した細胞を意味しており、具体的には、膵β細胞の成熟マーカーであるＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現する、あるいはグルコース刺激によるインスリン分泌上昇反応によって特徴付けられる細胞を意味する。膵β細胞集団には、膵β細胞に加えて、その他の細胞（例えば、インスリン陽性細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。
　膵β細胞集団は、インスリン陽性細胞集団を分化・成熟させることによって、好ましくは動物生体内で分化・成熟させることによって得ることができる。
　「動物」は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。
　移植は、細胞集団を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、動物の皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。移植される細胞数は、移植される細胞の分化段階や、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、１０×１０4細胞個～１０×１０11細胞個程度とすることができる。移植された細胞集団は、生体内環境において分化誘導され、目的の細胞集団、好ましくは膵β細胞集団へと分化することができ、その後、回収されてもよいし、そのまま生体内に留置してもよい。
　移植に際して、細胞集団は、生体適合性材料を含むゲル中に包埋して移植してもよく、例えば、生体適合性材料を含むゲル中に包埋された細胞集団をカプセル、バッグ、チャンバーなどのデバイスに封入して生体内に移植することもできる。
　本明細書において「包埋」とは、生体適合性材料を含むゲル中に内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、散在させ収容することを意味する。
　本明細書において「生体適合性材料」とは生体内に移植し、短期又は長期留置した場合に、顕著な免疫応答や有害な生体反応（例えば、毒性反応、凝血等）を誘導しない任意の材料を意味する。また、「生体適合性材料」は生分解性材料であることが好ましい。このような材料としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンアミン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリフマル酸プロピレン、ポリアクリル酸、ポリｅ－カプロラクトン、ポリメタクリル酸、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ペクチン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、キチン、キトサン、キサンタン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサン、アルギン酸塩、アルギン酸エステル、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、フィブリン、プルラン、ラミニン、ゲラン、シリコン、ウレタン、エラスチン等及びそれらの修飾体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。「生体適合性材料」の表面は必要に応じて、細胞の接着を可能とする表面修飾（例えば、細胞接着用基質（コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチン等）によるコーティング）や、細胞の増殖、分化や機能を制御することが知られている官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メタクリル酸基、アクリル酸基等）での改変、が施されていてもよい。特定の態様において、「生体適合性材料」として、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを好適に用いることができる。
　アルギン酸塩は水溶性の塩であればよく、金属塩、アンモニウム塩等を利用することができる。例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウム等を好適に用いることができる。
　アルギン酸エステル（アルギン酸プロピレングリコールとも称される）はアルギン酸のカルボキシル基にプロピレングルコールがエステル結合した誘導体である。
　アルギン酸塩に含まれるマンヌロン酸とグルロン酸の割合（Ｍ／Ｇ比）は任意であり、一般的に、Ｍ＞Ｇである場合には柔軟性に富んだゲルを形成することができ、Ｍ＜Ｇである場合には強固なゲルを形成することができる。本発明においては、グルロン酸を１０～９０％、２０～８０％、３０～７０％、又は、４０～６０％の割合で含むものを利用することができる。
　アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを用いたゲルの作製は、公知の手法（ＷＯ２０１０／０３２２４２、ＷＯ２０１１／１５４９４１）に準じて作製することができ、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液に架橋剤を添加してゲル化させることにより得ることができる。
　アルギン酸塩又はアルギン酸エステルは溶媒中に、０．０５～１０重量％、好ましくは、０．１～５重量％、より好ましくは０．５～３重量％の量で含めることができる。溶媒はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルを溶解可能なものであればよく、水、生理食塩水等を利用することができる。
　架橋剤はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液をゲル化できるものであればよく、特に限定されないが、多価の金属カチオンを利用することができる。多価の金属カチオンとしては、２価の金属カチオンが好ましく、より好ましくは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンである。架橋剤は塩の形態で利用することができ、本発明においては、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウムから選択される少なくとも一つを架橋剤として利用することができる。
　アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲルにはナノファイバーを含めることができる。ナノファイバーは、ナノメートル領域の直径を有する天然又は合成ファイバーである。天然ナノファイバーとしては、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、キトサンなどの多糖類の一又は複数を含むものが挙げられる。合成ナノファイバーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）などが挙げられる。ナノファイバーはアルギン酸を含むゲル中に１重量％未満、例えば、０．９重量％、０．８重量％、０．７重量％、０．６重量％、０．５重量％、又はそれ未満の量にて含めることができる。アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲル中に含めるナノファイバーの量の下限は特に限定されないが、０．０５重量％以上、好ましくは０．１重量％以上とすることができる。
　アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲルへの細胞集団の包埋は任意の手段で行うことができ、特に限定されるものではないが例えば、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に細胞集団を混合し、ゲル化させることにより行うことができる。
　細胞集団はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に１×１０4細胞～１×１０9細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０7細胞～１×１０8細胞／ｍＬから選択される量にて含めることができる。
　細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液のゲル化は、当該溶液に架橋剤を添加して行うことができる。添加する架橋剤の量は、当該溶液に対し０．１～５重量％、例えば、０．１～１重量％、から選択される量とすることができる。ゲル化は、細胞培養や細胞移植に用いられる所定の構成及び／又は形状を有する容器内にて、あるいは当該容器に適合するゲルが得られるように設計された鋳型内で行うことができる。
　あるいは、公知の手法（ＷＯ２０１０／０１０９０２）に準じてアルギン酸を含むゲルカプセルを形成することにより行われてもよい。すなわち、架橋剤の溶液に対し、細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液を滴下して行ってもよい。滴下する際のノズルの形状や滴下方法に応じて、液滴のサイズを調整することができ、ひいてはアルギン酸を含むゲルカプセルの大きさを規定することができる。滴下方法は特に限定されないが、エアスプレー法、エアレススプレー方式、静電スプレー法等の手法により行うことができる。アルギン酸を含むゲルカプセルの大きさは特に限定されないが、直径が５ｍｍ以下、１ｍｍ以下、５００μｍ以下とすることができる。架橋剤溶液には、０．１～１０重量％、例えば、０．１～５重量％、から選択される量の架橋剤を含めることができる。
　本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、動物生体内に移植して、動物生体内で分化させた場合にはそのまま留置して、インスリンを産生・分泌する細胞として利用することが可能である。
　本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、そのままあるいはカプセル化して患部に移植することで、糖尿病、特にＩ型糖尿病を治療するための細胞医薬として有用である。
　また、本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、プロドラッグであってもよい。本明細書において、プロドラッグとは、生体内に移植した後に分化し、疾患を治療する機能を有する細胞に変化する細胞集団をいう。
　本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、毒性（例、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、癌原性）が低く、そのまま、または薬理学的に許容される担体等と混合して医薬組成物とすることにより、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）に対して、安全に投与することができる。
３．分化培地
　本発明は、ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の分化培地、を提供する。
　本発明の分化培地は、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の分化誘導に用いることができる。本発明の分化培地は、上述の多能性幹細胞をインスリン陽性細胞へと分化誘導する方法における、工程５）、又は工程６）にて使用することができる。
　本発明の分化培地は、ＲＰＭＩ　１６４０培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／ＧｌｕｔａＭＡＸTM／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地に、上記ＣＤＫ８／１９阻害剤をＣＤＫ８／１９活性を阻害することが可能な任意の量にて含んでなる。培地に含まれるＣＤＫ８／１９阻害剤の量は上記定義のとおりである。
　本発明の分化培地はＣＤＫ８／１９阻害剤に加えてさらに、工程５）、及び工程６）にてそれぞれ要求される増殖因子、各種阻害剤、血清代替物、抗生物質、ビタミン等のその他の因子を含む。既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、例えば、工程５）にて使用される培地には、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、Ｔ３、ＬＤＮ、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を所定の量にて添加することができる。また、工程６）にて使用される培地には、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質、ＺｎＳＯ4、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｒ４２８等を所定の量にて添加することができる。
　本発明の分化培地は、ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さないものである。「ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない」とは、上記定義のとおりであり、ＡＬＫ５阻害活性を全く有さない場合を意味するだけでなく、ＡＬＫ５に対する阻害率が５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下である場合も含まれ、ＡＬＫ５阻害活性を有する化合物（例えば、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）が上記定義を満たす限りにおいて含まれていてもよい。
　本発明の分化培地は、基本培地、ＣＤＫ８／１９阻害剤及び上記その他の因子は全て混合され一つの形態で提供されてもよいし、あるいは任意の組み合わせで、又はそれぞれ別々に複数の形態で提供され用事調製されてもよい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＡＬＫ４阻害活性、ＡＬＫ５阻害活性、ＣＤＫ８阻害活性及びＣＤＫ１９阻害活性の評価
　以下の方法により、試験化合物である、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート（化合物１）、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（化合物２（ＢＩ－１３４７））、及び、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル（化合物３（Ｓｅｎｅｘｉｎ　Ｂ））のＡＬＫ４阻害活性、ＡＬＫ５阻害活性、ＣＤＫ８阻害活性及びＣＤＫ１９阻害活性を評価した。
　キナーゼパネル試験にて、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＣＤＫ８、及びＣＤＫ１９の各キナーゼに対し、試験化合物を０．１μＭ、１μＭ（すなわち－Ｌｏｇ10値７乗、６乗）で添加し、その結合阻害活性を０～１００％で測定した。得られた２つの値から推定ｐＩＣ50を算出し、６－８の値で表示した。表中ｐＩＣ50＝６とは、本測定試験において０．１μＭ、１μＭのいずれの添加濃度においても結合阻害活性が示されず、該当化合物は阻害活性を持たないか、ｐＩＣ50≦６の弱い結合阻害活性しか持たないと考えられたことを意味する。同様にｐＩＣ50＝８とは０．１μＭ、１μＭの結合阻害活性から求められた推定ｐＩＣ50値が８以上、ｐＩＣ50≧８の強い結合活性を示したことを意味する。
　ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＣＤＫ８、及びＣＤＫ１９に対して阻害率５０％を示すのに必要な各試験化合物の濃度（推定ｐＩＣ50値）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３より、化合物１、化合物２、及び化合物３は、ＣＤＫ８及びＣＤＫ１９を強く阻害することが確認された。
実施例２：膵前駆細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤で処理して得られた細胞集団における目的細胞（インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞）の増加
１．方法
　ｉＰＳ細胞から膵前駆細胞集団への分化誘導は、上記工程１）－４）、既報（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７）等に従い実施した。インスリン陽性細胞への分化誘導は、上記工程５）、６）等に従い実施した。
　ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団を分化因子（ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、Ｔ３、ＬＤＮ、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ２）と共に、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）、又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を所定の濃度にて含む、又はＡＬＫ５インヒビターＩＩ及びＣＤＫ８／１９阻害剤のいずれも含まない分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で２日間培養して内分泌前駆細胞集団に分化誘導した。
　次いで、分化因子（Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、ＦＧＦ受容体１阻害剤ＰＤ－１６６８６６）と共に、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を所定の濃度にて含む、又はＡＬＫ５インヒビターＩＩ及びＣＤＫ８／１９阻害剤のいずれも含まない分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で７日間培養後、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－アセチルシステイン、ＡＸＬ阻害剤Ｒ４２８、アスコルビン酸、ＲＯＣＫ阻害剤、ＺｎＳＯ４、ヘパリン、Ｔｒｏｌｏｘと共にＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）又はＣＤＫ８／１９阻害剤を所定の濃度にて含む、又はＡＬＫ５インヒビターＩＩ及びＣＤＫ８／１９阻害剤のいずれも含まない分化誘導培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ３／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で４日間培養してインスリン陽性細胞集団に分化誘導した。
　上記方法で得られたインスリン陽性細胞集団中のインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞数、ならびにインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性の細胞数をフローサイトメトリーにより計数し、各細胞集団中における目的細胞、すなわちインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞率、ならびに目的外細胞、すなわちインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性の細胞率を求めた。
２．結果
　ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を所定の濃度にて含む、又はＡＬＫ５インヒビターＩＩ及びＣＤＫ８／１９阻害剤のいずれも含まない分化誘導培地で処理した場合に得られた、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞率、及びインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性の細胞率の結果を図１に示す。また、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）、０．３μＭにて化合物１、３ｎＭにて化合物２、及び０．１μＭにて化合物３を用いた場合に得られた細胞集団のフローサイトメトリーの結果を図２に示す。
　分化誘導培地にＣＤＫ８／１９阻害剤を含めた場合、目的とするインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の割合が、目的外であるインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性細胞の割合以上である細胞集団を製造できることが確認された。
　特に、ＣＤＫ８／１９阻害剤として、０．３μＭにて化合物１、３ｎＭにて化合物２、及び０．１μＭにて化合物３を用いた場合には、従来、膵前駆細胞集団よりインスリン陽性細胞集団を分化誘導する際に一般的に用いられていたＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）を用いた場合よりも、目的とするインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の割合が高い細胞集団を製造することができた。
　ＡＬＫ５インヒビターＩＩを利用した場合、得られた細胞集団における目的とするインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の割合は３３％程度であった。これは培地に加えるＡＬＫ５インヒビターＩＩの濃度を３０μＭまで高めた場合であっても、その割合は同程度又はそれ以下であった（データ示さず）。
　一方、膵前駆細胞集団よりインスリン陽性細胞集団を分化誘導する製造過程でＣＤＫ８／１９阻害剤の処理を行うことによって、細胞集団中の目的細胞（インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞）の割合は、３３％を超えて高められることが確認された。
　以上の結果より、膵前駆細胞集団よりインスリン陽性細胞集団を分化誘導する過程にある細胞集団を、ＡＬＫ５インヒビターＩＩに代えて、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理することによって、従来法よりも高い割合で目的細胞（インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞）を含むインスリン陽性細胞集団を製造できることが明らかとなった。


 

Claims (9)

  1. 　インスリン陽性細胞集団を製造する方法であって、
    膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む培地中で分化させることを含む、方法。
  2. 　前記培地がＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＣＤＫ８／１９阻害剤のＡＬＫ５に対するＩＣ50が１μＭ以上である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　ＣＤＫ８／１９阻害剤が、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミドからなる群より選択される一又は複数である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導して製造されたものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の分化培地。
  7. 　ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない、請求項６に記載の培地。
  8. 　ＣＤＫ８／１９阻害剤のＡＬＫ５に対するＩＣ50が１μＭ以上である、請求項６又は７に記載の培地。
  9. 　ＣＤＫ８／１９阻害剤が、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミドからなる群より選択される一又は複数である、請求項６～８のいずれか一項に記載の培地。


     
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