TWI710636B - 源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的純化法及其擴增法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示：一種培養方法，其係源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養方法，該方法包含：(A)將源自多能性幹細胞之胰前驅細胞，在含有屬於上皮成長因子(EGF)家族的因子及/或屬於纖維母細胞成長因子(FGF)家族的因子、及(2)Wnt促效劑之培養基中，進行3次元培養的步驟；一種製造方法，其係從源自多能性幹細胞之胰前驅細胞製造胰島細胞的方法，該方法包含：(E)將藉由上述方法培養之胰前驅細胞分化誘導成胰島細胞的步驟；以及一種凍結保存方法，其係源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的凍結保存方法，該方法包含：(F)將藉由上述方法培養之胰前驅細胞凍結的步驟。

Description

源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的純化法及其擴增法
本發明係關於源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養方法、從源自多能性幹細胞之胰前驅細胞之胰島細胞的製造方法、以及源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的凍結保存方法。再者，本發明係關於源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養用培養基。
就糖尿病(尤其胰島素依存性糖尿病)之治療手段而言，胰臓移植及胰島移植雖然有效，然而有臓器提供數少，及必須服用抑制免疫排斥用之免疫抑制劑等大問題。因此，為了解決此等問題，正使用源自小鼠及人類之細胞，廣泛進行人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹(ES)細胞等多能性幹細胞以及從單離自身體之胰前驅細胞分化誘導成胰島細胞的研究(例如，非專利文獻1)。
在得到胰島細胞之情況，係使多能性幹細胞經中內胚葉細胞、胚性內胚葉而分化成胰前驅細胞後，分化成如內分泌前驅細胞、α細胞、β細胞、δ細胞之胰 島細胞。其中，在胰島移植方面，需要多個胰島細胞，然而已進行分化之胰島細胞增殖力低，另一方面，未分化之多能性幹細胞雖有增殖力，然而除了在分化誘導上需要長時間外，若用於移植之胰島細胞中混入多能性幹細胞，移植後有形成腫瘤之虞。因此，散見嘗試將源自多能性幹細胞之胰前驅細胞增殖的研究報告。
在此等研究中，為了使源自多能性幹細胞之胰前驅細胞增殖，使用各種餵養細胞進行共培養(例如，非專利文獻2及3)。然而，使用此等餵養細胞，及使用血清，成為使用成分不明者，起因於批次間之成分差異而有難以安定及調製具有均勻性質之胰前驅細胞的問題。又，在使用源自異種動物之餵養細胞及血清的情況，存在源自異種動物之未知病原體成為感染源的風險。
在非專利文獻2中，報導藉由將源自ES細胞之前驅細胞與間葉系細胞共培養，可使前驅細胞不分化而增殖。
在非專利文獻3中，報導藉由將源自ES細胞之胰前驅細胞與內皮細胞共培養或於EGFL7存在下培養，可使其不分化而增殖，不過增殖能力並不充分。
又，亦有關於藉由將單離自身體之胰前驅細胞於身體外培養而使其增殖之研究報告，然而在非源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的情況，無法得到充分的增殖。
例如，專利文獻1中，報導將單離自身體之胰臓的組織斷片，使用特定之細胞培養用的培養基培養。 然而，在專利文獻1中，未揭示使用源自多能性幹細胞之胰前驅細胞，又，培養所使用之細胞群非為均勻之細胞群，亦未揭示培養源自胰臓組織之多種細胞群時，如何培養均勻的胰前驅細胞群。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第5722835號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]A Rezania et al. Nat Biotechnol. 2014 Nov; 32(11):1121-1133
[非專利文獻2]JB Sneddon et al.Nature. 2012 Nov;491 (7426):765-768
[非專利文獻3]DI Kao et al. Stem Cell Reports. 2015 Feb;4(2):181-189
本發明之目的為提供一種源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養方法，其可抑制源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的分化，同時使其高效率地增殖。又，本發明之目的為提供依照該培養方法所得到之從源自多能性幹細胞之胰前驅細胞而來之胰島細胞的製造方法、及源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的凍結保存方法。再者，本發明 之目的為提供一種能抑制源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的分化，同時可使其高效率地增殖的培養用培養基。
本發明人等，為了達成上述目的而重複專心研究之結果，得到下述見識：藉由將源自多能性幹細胞之胰前驅細胞，在含有上皮成長因子(EGF)及R-海綿硬蛋白1的培養基中，或在含有FGF-7與GSK阻礙劑(CHIR99021)之各種組合的培養基中，以細胞凝集狀態培養，可達成上述目的。
本發明係基於此等見識，進一步重複檢討而完成者，提供以下源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養方法、從源自多能性幹細胞之胰前驅細胞而來之胰島細胞的製造方法、源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的凍結保存方法、源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養用培養基等。再者，以下「(I-1)~」之記載包含(I-1-A)、(I-1-B)等，其他亦相同。
(I)源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養方法
(I-1)一種培養方法，其係源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養方法，該培養方法包含：(A)將源自多能性幹細胞之胰前驅細胞在含有(1)屬於上皮成長因子(EGF)家族的因子及/或屬於纖維母細胞成長因子(FGF)家族的因子、以及(2)Wnt促效劑的培養基中進行3次元培養的步驟。
(I-1-A)如(I-1)記載之培養方法，其中前述Wnt促效劑 係屬於Wnt家族的因子、屬於R-海綿硬蛋白家族的因子、諾里病蛋白(Norrin)及/或GSK阻礙劑。
(I-1-B)如(I-1)記載之培養方法，其中前述Wnt促效劑包含選自Wnt-1/Int-1、Wnt-2/Irp、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、Wnt-11、Wnt-16、CHIR99021、SB216763、SB415286、A1070722、BIO、BIO-丙酮肟(Acetoxime)、靛玉紅-3’-肟(Indirubin-3’-oxime)、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TWS 119、siRNA、鋰、肯帕羅酮(kenpaullone)、R-海綿硬蛋白1、R-海綿硬蛋白2、R-海綿硬蛋白3、R-海綿硬蛋白4、及諾里病蛋白所成群組中的至少1種因子。
(I-2)如(I-1)記載之培養方法，其中前述Wnt促效劑係屬於海綿硬蛋白家族的蛋白質及/或GSK阻礙劑。
(I-2-A)如(I-1)、(I-1-A)、(I-1-B)或(I-2)記載之培養方法，其中前述(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子係與ErbB1結合之因子及/或與FGFR2IIIb結合之因子。
(I-2-B)如(I-1)、(I-1-A)、(I-1-B)或(I-2)記載之培養方法，其中前述(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子，包含選自EGF、轉形(transforming)成長因子α(TGF-α)、雙調蛋白(amphiregulin)、類肝素結合性EGF成長因子、源自神經鞘瘤(schwannoma)之成長因子、β細胞生長因子、痘病毒(pox virus)成長因子、酸性纖維母細胞成 長因子(aFGF、FGF-1)、鹼性纖維母細胞成長因子(bFGF、FGF-2)、FGF-3、角質細胞成長因子(KGF、FGF-7)、FGF-10、及FGF-22所成群組中的至少1種因子。
(I-3)如(I-1)記載之培養方法，其中前述(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子為EGF，前述(2)Wnt促效劑為R-海綿硬蛋白1。
(I-4)如(I-2)記載之培養方法，其中前述屬於EGF家族的因子為EGF，前述屬於FGF家族的因子為FGF-7，前述屬於R-海綿硬蛋白家族的蛋白質為R-海綿硬蛋白1，前述GSK阻礙劑為CHIR99021。
(I-5)如(I-1)至(I-4)中任一項記載之培養方法，其中前述培養基為無血清培養基。
(I-6)如(I-1)至(I-5)中任一項記載之培養方法，其中前述培養為餵養細胞不存在下之培養。
(I-7)如(I-1)至(I-6)中任一項記載之培養方法，其中前述多能性幹細胞為iPS細胞或ES細胞。
(I-8)如(I-1)至(I-7)中任一項記載之培養方法，其中前述多能性幹細胞係源自人類。
(I-9)如(I-1)至(I-8)中任一項記載之培養方法，其中前述3次元培養為胰前驅細胞之凝集體的懸浮培養。
(I-10)如(I-1)至(I-9)中任一項記載之培養方法，其中包含(B)將在步驟(A)中所得到之胰前驅細胞進一步繼代培養的步驟。
(I-11)如(I-1)至(I-10)中任一項記載之培養方法，其係用於胰前驅細胞之純化。
(I-12)如(I-1)至(I-11)中任一項記載之培養方法，其更包含調製(C)iPS細胞之步驟，並於步驟(A)中使用源自該iPS細胞的胰前驅細胞。
(I-13)如(I-1)至(I-12)中任一項記載之培養方法，其更包含：(D)將多能性幹細胞分化誘導成胰前驅細胞之步驟，並於步驟A中使用該胰前驅細胞。
(II)從源自多能性幹細胞之胰前驅細胞而來之胰島細胞的製造方法
(II-1)一種製造方法，其係從源自多能性幹細胞之胰前驅細胞製造胰島細胞的方法，該製造方法包含：(E)將藉由(I-1)至(I-13)之任一項所述之方法所培養的胰前驅細胞分化誘導成胰島細胞的步驟。
(III)源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的凍結保存方法
(III-1)一種凍結保存方法，其係源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的凍結保存方法，該凍結保存方法包含：(F)將藉由(I-1)至(I-13)之任一項所述之方法所培養的胰前驅細胞凍結的步驟。
(IV)源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養用培養基
(IV-1)一種源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養用 培養基，其含有(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子、以及(2)Wnt促效劑。
(IV-1-A)如(IV-1)記載之培養基，其中前述Wnt促效劑為屬於Wnt家族的因子、屬於R-海綿硬蛋白家族的因子、諾里病蛋白及/或GSK阻礙劑。
(IV-1-B)如(IV-1)記載之培養基，其中前述Wnt促效劑包含選自Wnt-1/Int-1、Wnt-2/Irp、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、Wnt-11、Wnt-16、CHIR99021、SB216763、SB415286、A1070722、BIO、BIO-丙酮肟(Acetoxime)、靛玉紅-3’-肟(Indirubin-3’-oxime)、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TWS 119、siRNA、鋰、肯帕羅酮、R-海綿硬蛋白1、R-海綿硬蛋白2、R-海綿硬蛋白3、R-海綿硬蛋白4、及諾里病蛋白構成之群組的至少1種因子。
(IV-2)如(VI-1)記載之培養基，其中前述Wnt促效劑為屬於海綿硬蛋白家族的蛋白質及/或GSK阻礙劑。
(IV-2-A)如(IV-1)、(IV-1-A)、(IV-1-B)或(IV-2)記載之培養基，其中前述(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子，為與ErbB1結合之因子及/或與FGFR2IIIb結合之因子。
(IV-2-B)如(IV-1)、(IV-1-A)、(IV-1-B)或(IV-2)記載之培養基，其中前述(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF 家族的因子，包含選自EGF、轉形成長因子α(TGF-α)、雙調蛋白、類肝素結合性EGF成長因子、源自神經鞘瘤之成長因子、β細胞生長因子、痘病毒成長因子、酸性纖維母細胞成長因子(aFGF、FGF-1)、鹼性纖維母細胞成長因子(bFGF、FGF-2)、FGF-3、角質細胞成長因子(KGF、FGF-7)、FGF-10、及FGF-22所成群組中的至少1種因子。
(IV-3)如(VI-1)記載之培養基，其中前述(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子為EGF，前述(2)Wnt促效劑為R-海綿硬蛋白1。
(IV-4)如(IV-2)記載之培養基，其中前述屬於EGF家族的因子為EGF，前述屬於FGF家族的因子為FGF-7，前述屬於海綿硬蛋白家族的蛋白質為R-海綿硬蛋白1，前述GSK阻礙劑為CHIR99021。
(IV-5)如(IV-1)至(IV-4)中任一項記載之培養基，其不含血清。
(IV-6)如(IV-1)至(IV-5)中任一項記載之培養基，其係用於餵養細胞不存在下之培養。
(IV-7)如(IV-1)至(IV-6)中任一項記載之培養基，其中前述多能性幹細胞為iPS細胞或ES細胞。
(IV-8)如(IV-1)至(IV-7)中任一項記載之培養基，其中前述多能性幹細胞係源自人類。
(IV-9)如(IV-1)至(IV-8)中任一項記載之培養基，其進一步含有選自音猬因子(Sonic Hedgehog)信號阻礙劑、TGF-β受體阻礙劑及視網酸所成群組中的至少1種。
(IV-10)如(IV-1)至(IV-9)中任一項記載之培養基，其係使用於胰前驅細胞之純化。
(V)源自多能性幹細胞之胰前驅細胞之培養用培養基的使用
(V-1)如上述(IV-1)至(IV-4)及(IV-9)中任一項記載之成分的使用，其係作為源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養用培養基。
(VI)醫藥
(VI-1)一種醫藥，其包含以上述(I-1)至(I-13)中任一項記載之方法所培養的胰前驅細胞。
(VII)培養物
(VII-1)一種單離之培養物，其包含(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子、(2)Wnt促效劑、以及5質量%以上、10質量%以上、15質量%以上或20質量%以上的胰前驅細胞。
若依照本發明之培養方法，可於無血清且無餵養細胞之條件下，抑制源自多能性幹細胞之胰前驅細胞(為均勻性高之細胞群)的分化，同時使其高效率地增殖。由於為在無血清且無餵養細胞之條件下的培養，可減低培養基之批次間的差異，而調製品質安定之胰前驅細胞。
又，本發明之培養方法，由於可利用於繼代培養，故可使胰前驅細胞大量增殖，亦能於繼代培養之過程中，進行胰前驅細胞的純化。
再者，藉由本發明之培養方法而增殖的胰前驅細胞，可分化誘導成包含胰島素產生性細胞(β細胞)的胰島細胞。
藉由本發明之培養方法所增殖的胰前驅細胞，可凍結保存，解凍後亦可與凍結前同樣地使其增殖。
若依照本發明之培養方法，由於可進行大量之胰前驅細胞的調製，故具有能於胰前驅細胞之階段進行細胞的篩選(例如，未分化細胞或致腫瘤性細胞之除去)及安全性的評價，可減低胰前驅細胞之製造期間及製造成本，可於短期間大量供給品質經保證的胰島細胞等優點。
藉由本發明之培養方法所增殖之胰前驅細胞或將藉由本發明之培養方法所增殖的胰前驅細胞分化誘導而取得的胰島細胞，藉著以原樣或膠囊化移植至患部，在作為治療(1型或2型)糖尿病用之細胞醫藥或裝置上有用。
第1圖係展示分化誘導成胰前驅細胞後，藉由流式細胞儀(flow cytometry)之分析結果的圖。
第2圖係展示分化誘導成胰前驅細胞後，於各因子或其組合之存在下，經6日培養之細胞之相位差顯微鏡像的照片。
第3圖係展示分化誘導成胰前驅細胞後，於各因子或其組合存在下培養時細胞數之經時變化圖。縱軸表示在將培養開始時當作1之情況，細胞數的相對值。
第4圖係展示分化誘導成胰前驅細胞後，於各因子或其組合存在下經6日培養之細胞(未進行繼代)藉由流式細胞儀之分析結果的圖。
第5圖係展示分化誘導成胰前驅細胞後，黏著培養時細胞數之經時變化的圖。縱軸表示在將培養開始時當作1之情況，細胞數的相對值。
第6圖係展示各繼代之SOX9及BrdU陽性細胞之比率(%)的圖。
第7圖係展示各繼代中之細胞藉由流式細胞儀之分析結果的圖。
第8圖係展示各繼代中之SOX9及PDX1陽性細胞之比率(%)的圖。
第9圖係展示5繼代後之細胞凝集體之相位差顯微鏡像的照片。
第10圖係展示分化誘導成胰前驅細胞後，每隔6日繼代培養時細胞數之經時變化圖。縱軸係表示在將培養開始時當作1之情況，細胞數的相對值。
第11圖係展示9繼代後之細胞之免疫染色像的照片。
第12圖係展示9繼代後之細胞藉由流式細胞儀之分析結果的圖。
第13圖係展示進行分化誘導而成為胰島細胞的細胞 藉由流式細胞儀之分析結果的圖。
第14圖係展示進行分化誘導而成為胰島細胞的細胞之葡萄糖負荷試驗結果的圖。縱軸係表示C-胜肽之分泌量(pM/256 aggregates,0.5mL,0.5h)。
第15圖係展示進行分化誘導而成為胰島細胞的細胞之免疫染色像的照片。
第16圖係展示使用各種凍結保存液將胰前驅細胞凍結，於-196℃保存後，解凍時之細胞生存率(%)的圖。
第17圖係展示將凍結保存之細胞於解凍後之細胞及未凍結保存之細胞在胰前驅細胞增殖用培養基中培養時之細胞數經時變化的圖。縱軸係表示在將培養開始時當作1之情況，細胞數的相對值。
第18圖係展示添加4因子(EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021)培養時，源自RPChiPS771-2株之胰前驅細胞之細胞數經時變化的圖。縱軸係表示在將培養開始時當作1之情況，細胞數的相對值。
第19圖係展示將源自各人類iPS細胞株之胰前驅細胞在添加4個因子(EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021)下培養時，藉由流式細胞儀之分析結果的圖。
第20圖係展示將源自各人類iPS細胞株之胰前驅細胞在添加2至4個因子而培養時，細胞數變化的圖。縱軸係表示在將培養開始時當作1之情況，細胞數的相對值。
第21圖係展示將源自各人類iPS細胞株之胰前驅細胞在添加2至4個因子而培養時，Ki67及PDX1陽性細胞之 比率(%)的圖。
本說明書包含為本案優先權基礎之日本特願2016-091116(2016年4月28日申請)之說明書所記載的內容。
以下，詳細說明本發明。
再者，在本說明書中「含、含有(comprise)」意指「本質上由…構成(essentially consist of)」，亦包含「由…所成(consist of)」之意義。
在本說明書中，「培養」意指使細胞在試管環境中維持，或/及增殖。「(進行)培養」意指於組織外或體外，例如，於細胞培養皿或燒瓶中，使細胞持續、或/及增殖。
(多能性幹細胞)
多能性幹細胞意指具有可分化為三胚葉(內胚葉、中胚葉、及外胚葉)之任一種之能力(多能性：pluripotency)，且能自己複製的幹細胞。就多能性幹細胞而言，無特別限定，可列舉如胚性幹(ES)細胞、藉由核移植所得到之源自純系胚的胚性幹(ntES)細胞、多能性生殖幹細胞(「mGS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞等。又，就多能性幹細胞之起源生物而言，無特別限定，可列舉如：人類、猴、小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、牛、豬、狗、馬、貓、山羊、綿羊等哺乳動物。其中，以源自人類之多能性幹細胞為較佳。多能性幹細胞可使用市售者、或由特 定機構分讓者、或依照周知之方法製造者。就多能性幹細胞而言，較佳可使用ES細胞及iPS細胞。
ES細胞可依照周知之方法製造。ES細胞除了以取自母體之受精卵作為材料製作者以外，亦有例如以藉由體外受精之受精卵作為材料而製作者。
iPS細胞可藉由周知之方法，例如，在任意之體細胞中導入初期化(reprogramming)因子而製造。其中，就初期化因子而言，可列舉如：Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、K1f4、K1f2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等基因或基因產物，此等初期化因子可單獨使用或將2種以上組合使用。其中，就初期化因子之組合而言，可使用例如，WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D et al.,Nat.Biotechnol.,26：795-797(2008)、Shi Y et al.,Cell Stem Cell,2：525-528(2008)、Eminli S et al.,Stem Cells.26：2467-2474(2008)、Huangfu D et al.,Nat.Biotechnol.26：1269-1275(2008)、Shi Y et al.,Cell Stem Cell,3：568-574(2008)、Zhao Y et al.,Cell Stem Cell,3：475-479(2008)、Marson A,Cell Stem Cell,3：132-135(2008)、Feng B et al.,Nat.Cell Biol.11：197-203(2009)、Judson RL et al.,Nat.Biotechnol.,27：459-461(2009)、Lyssiotis CA et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.106：8912-8917(2009)、Kim JB et al.,Nature.461：649-643(2009)、Ichida JK et al.,Cell Stem Cell.5：491-503(2009)、Heng JC et al.,Cell Stem Cell.6：167-174(2010)、Han J et al.,Nature.463：1096-1100(2010)、Mali P et al.,Stem Cells.28：713-720(2010)、Maekawa M et al.,Nature.474：225-229(2011)等記載者。
就上述體細胞而言，無特別限制，包含胎兒(仔)之體細胞、新生兒(仔)之體細胞、及成熟之健全及疾病性的體細胞，又，亦包含初代培養細胞、繼代細胞、及株化細胞。就體細胞而言，可列舉如：(1)神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、齒髓幹細胞等組織幹細胞(體性幹細胞)；(2)組織前驅細胞、(3)血液細胞(末梢血細胞、臍帶血細胞等)、淋巴球、上皮細胞、內皮細胞、肌肉細胞、纖維母細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃黏膜細胞、腸細胞、脾細胞、胰細胞(胰外分泌細胞等)、腦細胞、肺細胞、腎細胞、脂肪細胞等分化的細胞等。
(胰前驅細胞)
本發明中之胰前驅細胞(pancreatic progenitor)，意指隨後分化為胰島細胞之細胞。胰前驅細胞可用例如，PDX1(胰臓十二指腸同源盒基因(pancreas duodenal horneobox gene 1))陽性(及SOX9陽性)作為指標。
又，本發明中之胰前驅細胞，可追加NKX6.1、NGN3(Nerurogenin 3)等為陰性做為進一步指標，然而NKX6.1及/或NGN3亦可為陽性。
其他，可使用HNF6、HLXB9、PAX4及/或NKX2-2等標記作為胰前驅細胞的指標。
就一例而言，PDX1、HNF6、HLXB9等標記為陽性之細胞、或NKX6.1、NGN3、PAX4、NKX2-2等標記為陽性之細胞，亦包含於本發明之胰前驅細胞。
本發明之胰前驅細胞，較佳為PDX1陽性，更佳為PDX1陽性及SOX9陽性。
本發明之胰前驅細胞，特佳為PDX1陽性、SOX9陽性、及NKX6.1陰性及/或NGN3陰性。
就其他態樣而言，本發明之胰前驅細胞，特佳為PDX1陽性、SOX9陽性、及NKX6.1陽性及/或NGN3陽性。
(胰島細胞)
本發明中之胰島(朗格漢(Langerhans)氏島)細胞，為包 含分泌高血糖素(glucagon)之α細胞、分泌胰島素之β細胞、及分泌體抑素(somatostatin)之δ細胞中之至少1種者，較佳為至少包含β細胞者。胰島細胞包含α細胞、β細胞、及δ細胞，可分別藉由例如使用針對高血糖素、胰島素或C肽、及體抑素之抗體的免疫染色而確認。β細胞亦可藉由使用針對C肽之抗體的免疫染色來檢測。β細胞亦能藉由雙硫腙染色而檢測。胰島細胞可進一步包含分泌胰臓多肽之F細胞及胰島前驅細胞。
(胰前驅細胞之培養方法(A步驟))
本發明之源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養方法，其特徵為包含將源自多能性幹細胞之胰前驅細胞在含有(1)屬於上皮成長因子(EGF)家族的因子及/或屬於纖維母細胞成長因子(FGF)家族的因子(以下，稱為成分(1))，及(2)Wnt促效劑(以下，稱為成分(2))之培養基中進行3次元培養的步驟。
本發明之培養方法中所使用之胰前驅細胞，係源自多能性幹細胞，亦即從多能性幹細胞分化誘導者。
本發明之培養方法中所用之培養基，係以動物細胞之培養所用的培養基作為基礎培養基，並至少含有(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子、及(2)Wnt促效劑者。就基礎培養基而言，只要可用於動物細胞之培養者即可，無特別限定，例如可列舉IMDM培養基、Medium 199培養基、伊格爾最低必需培養基(Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM))、α MEM培養基、經杜氏修飾的伊格爾培養基(Doulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM))、Ham's F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、MCDB 131培養基、此等之混合培養基等。如此，藉由將成分(1)與成分(2)組合使用，可使胰前驅細胞高效率地增殖。
就屬於EGF家族的因子而言，只要能與EGF受體結合，使其活性上升者即可，無特別限制，較佳為與EGF受體之ErbB1結合的因子，可列舉如：EGF、轉形成長因子α(TGF-α)、雙調蛋白、類肝素結合性EGF成長因子、源自神經鞘瘤之成長因子、β細胞生長因子、痘病毒成長因子等，更佳為EGF。
上皮成長因子(EGF)，係包含促進各種表皮及纖維母細胞之增殖的53個胺基酸的多肽，具有3個分子內二硫鍵。又，與上皮成長因子受體結合。上皮成長因子，亦有時稱為上皮增殖因子、上皮細胞增殖因子、表皮增殖因子、及表皮成長因子。本發明中之上皮成長因子，在具有原本之活性的範圍，亦廣泛地包含天然存在之上皮成長因子的改變體。上皮成長因子可使用市售者或依照周知之方法製造者。
就屬於FGF家族的因子而言，於人類及小鼠存在22種FGF。FGF有時亦稱為纖維母細胞成長因子、及肝素結合性增殖因子。就屬於FGF家族的因子而言，可列舉如：酸性纖維母細胞成長因子(aFGF、FGF-1)、鹼性纖 維母細胞成長因子(bFGF、FGF-2)、FGF-3、角質細胞成長因子(KGF、FGF-7)、FGF-10、FGF-22等，較佳為與FGF受體之FGFR2IIIb結合之因子，更佳為FGF-3、FGF-7、FGF-10及FGF-22。
Wnt促效劑包含將Wnt信號傳達活化而於細胞中將TCF/LEF介在性之轉錄活化的物質，結合於Frizzled受體而使其活化之物質、細胞內β-連環蛋白分解之阻礙劑、TCF/LEF之活化物質等。具體而言，可列舉屬於Wnt家族的因子(例如，屬於Wnt家族之蛋白質、顯示與Wnt家族同樣作用之低分子化合物)、屬於R-海綿硬蛋白家族的因子(例如，屬於R-海綿硬蛋白家族的蛋白質(R-海綿硬蛋白1至4等)、顯示與R-海綿硬蛋白家族同樣作用之低分子化合物)、諾里病蛋白(Norrin)、GSK阻礙劑等，較佳為屬於R-海綿硬蛋白家族的因子及/或GSK阻礙劑，更佳為屬於R-海綿硬蛋白家族的蛋白質及/或GSK阻礙劑。
就屬於Wnt家族之蛋白質而言，無特別限制，可列舉如：Wnt-1/Int-1、Wnt-2/Irp、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、Wnt-11、Wnt-16等，而以Wnt-3a為特佳。
GSK阻礙劑只要為阻礙GSK-3β(肝醣合成酶激酶3β(Glycogen Synthase Kinase 3β))之因子即可，無特別限制，可列舉如：CHIR99021、SB216763、SB415286、 A1070722、BIO、BIO-丙酮肟(Acetoxime)、靛玉紅-3’-肟(Indirubin-3’-oxime)、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TWS 119、siRNA、鋰、肯帕羅酮等，較佳為CHIR99021。
就屬於R-海綿硬蛋白家族的蛋白質而言，較佳為R-海綿硬蛋白1。R-海綿硬蛋白1屬於Wnt調節子之RSPO(RSPO1-4)家族，為調節Wnt/β-連環蛋白信號傳達之分泌蛋白質。本發明中之R-海綿硬蛋白1，亦廣泛地包含在具有原本活性之範圍，天然存在之R-海綿硬蛋白1的改變體。R-海綿硬蛋白1，可使用市售者或依照周知之方法製造者。
培養基中，包含屬於EGF家族的因子、屬於FGF家族的因子、屬於R-海綿硬蛋白家族的因子(例如，蛋白質、顯示與R-海綿硬蛋白家族同樣作用之低分子化合物)、及GSK阻礙劑中的至少2種。培養基中，可包含屬於EGF家族的因子、屬於FGF家族的因子、屬於R-海綿硬蛋白家族的因子(例如，蛋白質、顯示與R-海綿硬蛋白家族同樣作用之低分子化合物)、及GSK阻礙劑中的3種以上，亦可包含4種以上。
培養基中之成分(1)的各濃度，只要胰前驅細胞可增殖即可，無特別限定，例如，以1至1000ng/mL為較佳，以20至100ng/mL為更佳。又，培養基中之成分(2)的各濃度，只要胰前驅細胞可增殖即可，無特別限定，例如，以10至2000ng/mL或0.1至50μM為較佳，以200至1000ng/mL或1至10μM為更佳。在培養基中含有 CHIR99021作為GSK阻礙劑之情況，CHIR99021之濃度較佳為1至20μM，更佳為3至10μM。
培養基中之上皮成長因子的濃度，只要胰前驅細胞可增殖即可，無特別限定，例如，以1至1000ng/mL為較佳、以20至100ng/mL為更佳。又，培養基中之R-海綿硬蛋白-1的濃度，只要胰前驅細胞可增殖即可，無特別限定，例如，以10至2000ng/mL為較佳，以200至1000ng/mL為更佳。
本發明中所使用之培養基中，以進一步含有選自音猬因子(Sonic Hedgehog)信號阻礙劑、TGF-β受體阻礙劑及視網酸所成群組中的至少1種為較佳。
就音猬因子信號阻礙劑而言，只要能阻礙音猬因子信號之因子即可，無特別限定，具體而言，可列舉SANT-1、介芬胺(Jervine)、環杷明(Cyclopamine)-KAAD等。
就TGF-β受體阻礙劑而言，只要能阻礙TGF-β受體之功能的因子即可，無特別限定，具體而言，可列舉：LDN193189、D4476、LY2157299、LY364947、SB525334、SB431542、SD208等。又，亦可使用多索嗎啡(dorsomorphin)、Noggin等BMP信號阻礙劑來代替TGF-β受體阻礙劑。在重複繼代，進行長期培養之情況，以在培養基中添加TGF-β受體阻礙劑及/或BMP信號阻礙劑為較佳。
就視網酸而言，以使用全反式視網酸為特 佳。
再者，在本發明中所使用之培養基，可包含ROCK(Rho-相關捲曲螺旋形成性激酶(Rho-Associated coiled-coil forming kinase)/Rho結合激酶)阻礙劑。ROCK阻礙劑，以添加於繼代後1至2日之培養基中為較佳。
就ROCK阻礙劑而言，只要能阻礙ROCK之功能的因子即可，無特別限定，具體而言，可列舉Y-27632、Fasudil(或HA1077)、H-1152、Wf-536、Y-30141等。
在本發明中所使用之培養基可含有血清，亦可為無血清，其中較佳為無血清培養基。
又，在本發明中所使用之培養基可含有血清代替物(例如，白蛋白、轉鐵蛋白、Knockout血清替代物(Knockout Serum Replacement(KSR))、脂肪酸、胰島素、膠原前驅體、微量元素、2-巰基乙醇、3'-巰基甘油、ITS-補充劑等)。就血清代替物而言，可使用1種或2種以上。
再者，在本發明中所使用之培養基亦可含有B27-補充劑、N2-補充劑、脂質、葡萄糖、胺基酸(非必需胺基酸等)、L-麩醯胺酸、Glutamax(Thermo Fisher Scientific)、維生素、增殖因子、細胞激素、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等1種以上之物質。
就在本發明中所使用之培養基而言，使用不含血清等成分不明者之已知組成(chemically-defined)的培養基，由於培養基之批次間的差異減低，可調製品質安定之胰前驅細胞而較佳。
本發明中所使用之培養基的pH通常為7.0至7.8，較佳為7.2至7.6。培養基於使用前為了防止污染，以藉由過濾、紫外線照射、加熱滅菌、放射線照射等方法滅菌為較佳。
本發明中所使用之培養基，可調製成溶液形式、乾燥形式、或濃縮形式(例如，2x至1000x)。在濃縮形式之情況，可適宜稀釋成適當濃度而使用。使用於稀釋乾燥形式或濃縮形式之培養基的液體，可適宜地選自水、緩衝水溶液、生理食鹽水溶液等。
本發明之胰前驅細胞的培養係以3次元培養進行。其中，3次元培養意指非單層培養之2次元培養，而是在縱方向具有厚度之狀態所進行的培養方法。藉由進行此種3次元培養，可使胰前驅細胞高效率地增殖。就3次元培養之方法而言，只要在能使胰前驅細胞增殖之範圍即可，無特別限制，可廣泛地使用周知的手法。其中，以藉由胰前驅細胞之細胞凝集體的懸浮培養為較佳。
關於使此種胰前驅細胞之細胞凝集體形成的培養方法，如以下說明。
首先，使胰前驅細胞解離為分散細胞(單一細胞或數個細胞之塊)。解離為分散細胞，可藉由胰蛋白酶、膠原酶等酵素、及EDTA等螯合劑之處理、移液(pippeting)等之機械性操作等而進行。將解離成分散細胞之胰前驅細胞懸濁於培養基，播種於培養器，較佳成為10至10000個/孔，更佳成為300至3000個/孔之細胞濃度。 接著，在此狀態靜置一段期間，例如，12至36小時，可使凝集體形成。凝集體之大小(直徑)，通常約50至500μm，較佳為約100至200μm，一個凝集體中之細胞數，通常為約100至5000個，較佳為約500至2000個。
使胰前驅細胞之細胞凝集體形成的培養方法，可使用具有例如0.001至10μl/孔、0.001至1μl/孔、0.005至0.5μl/孔、0.01至0.5μl/孔、0.01至0.1μl/孔等容積之培養孔的培養器。又，細胞容易沉降至底部，形成凝集體之形狀，以具有例如底部向底膨脹而成半球狀的培養孔、或具有圓柱狀，底部成為半球狀之形狀的培養孔等之培養器為較佳。培養器之培養孔的直徑，可列舉如200至800μm、400至800μm等。又，此種培養孔之深度，例如，400至1000μm、400至800μm等。藉由使用具有複數個如上述形狀之孔的多孔培養器，可得到許多胰前驅細胞。
用於使胰前驅細胞之細胞凝集體形成的培養器，為進行不黏著培養，可為培養器表面進行細胞不黏著處理者(例如，進行細胞不黏著處理之塑膠製(例如，聚苯乙烯製)的培養器)，然而以能將細胞以不黏著狀態培養之原材料為較佳。就此種原材料而言，以具有三次元構造而無細胞毒性之親水性原材料為較佳，再者，為了容易觀察培養狀態，以透明之原材料為更佳。又，以使用於細胞之不黏著處理之包含親水性高分子的水凝膠為較佳。
就使用於製作水凝膠之材料而言，可列舉 如：聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚丙烯酸-2-羥基乙酯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸等合成高分子之物理性或化學***聯體及藉由放射線照射之交聯體；再者，構成上述高分子之單體共聚物的交聯體等可形成水凝膠的各種合成高分子材料。又，亦可使用為天然高分子之瓊脂糖、褐藻酸、葡萄聚糖、纖維素等多糖及其衍生物，再者，明膠、白蛋白等蛋白質及其衍生物之交聯體等。就製作水凝膠所用之材料而言，其中以瓊脂糖凝膠為較佳。
就為了能將細胞以不黏著狀態培養而施行處理所用的材料而言，可列舉上述水凝膠之製作所用的原材料、以2-甲基丙烯醯基氧基乙基磷酸基膽鹼(MPC)作為主成分的高分子材料等。
本發明之培養方法的培養條件雖然為與通常細胞培養同樣之條件即可，然而培養溫度以35至39℃為較佳，以37℃為更佳。又，O2濃度通常為約5至20%，CO2濃度通常為約1至10%，較佳為約5%。此種培養可使用周知之CO2培育器進行。
培養時間無特別限制，例如，以3至10日為較佳，以5至7日為更佳。又，培養中以每1至3日交換培養基為較佳。
本發明之培養方法以在餵養細胞不存在下實施為較佳。本發明之培養方法由於可為餵養細胞不存在下之培養，不會混入成分不明者，所以能使保持均勻性質 之胰前驅細胞安定地增殖。
本發明之培養方法由於與分化為胰島細胞、肝臓細胞、神經細胞、胰外分泌細胞等其他功能細胞的細胞相比，使增殖力高之胰前驅細胞有效地增殖，適合用於胰前驅細胞之純化。
(繼代培養(B步驟))
在本發明之培養方法的較佳實施態樣方面，進一步包含將步驟A中所得到之胰前驅細胞進行繼代培養的步驟。
繼代培養可藉由將依照前述方法培養之胰前驅細胞的凝集塊回收，使其解離為分散細胞後，播種於新培養基而進行。其中，解離為分散細胞、細胞之播種、培養基、培養方法等與前述者相同。
繼代次數為例如，1至10次、1至5次、2至3次，較佳為3次以上。再者，在本說明書中，將最初之培養當作第0繼代。
本發明之培養方法，由於即使進行繼代培養，亦能維持胰前驅細胞之增殖力，可進行大量胰前驅細胞之調製。再者，隨著繼代次數增加，亦可使胰前驅細胞之純化提高。
(iPS細胞之調製步驟(C步驟))
本發明之培養方法可進一步包含調製iPS細胞之步驟。
就調製iPS細胞之方法而言，可列舉上述 「多能性幹細胞」項目中記載的方法。其中，將所調製之iPS細胞分化誘導成胰前驅細胞，可將該胰前驅細胞使用於A步驟之培養。
再者，在本發明中，使用iPS細胞以外之多能性幹細胞的情況，可在該步驟中，調製其他多能性幹細胞，代替iPS細胞。
(分化誘導成胰前驅細胞步驟(D步驟))
本發明之培養方法可進一步包含將多能性幹細胞分化誘導成胰前驅細胞的步驟。
其中，可將分化誘導之胰前驅細胞使用於A步驟之培養。
在使多能性幹細胞分化為胰前驅細胞之步驟，只要模仿身體內胰產生之過程的方式，將培養液之組成經時地變化即可。又，該分化誘導步驟可依照前述之藉由細胞凝集體的懸浮培養或黏著培養而進行。
就此種方法而言，可使用例如以下文獻所記載之方法、及將其適宜修正之方法。若為參考文獻2記載之方法，藉由實施至階段4的階段，可分化誘導至胰前驅細胞為止。
[參考文獻1]Rezania A, Bruin JE, Riedel MJ, Mojibian M, Asadi A, Xu J, Gauvin R, Narayan K, Karanu F, O'Neil JJ, Ao Z, Warnock GL, Kieffer TJ. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes 2012;61:2016-2029.
[參考文獻2]Rezania A, Bruin JE, Arora P, Rubin A, Batushansky I, Asadi A, O'Dwyer S, Quiskamp N, Mojibian M, Albrecht T, Yang YH, Johnson JD, Kieffer TJ. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2014;32: 1121-1133.
[參考文獻3]Hrvatin S, O'Donnell CW, Deng F, Millman JR, Pagliuca FW, DiIorio P, Rezania A, Gifford DK, Melton DA. Differentiated human stem cells resemble fetal, not Adult, β cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:3038-3043
[參考文獻4]Pagliuca FW, Millman JR, Gurtler M, Segel M, VAn Dervort A, Ryu JH, Peterson QP, Greiner D, Melton DA. Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell. 2014;159:428-439.
例如，以在初期階段添加激活素A(Activin A)及Wnt3A為較佳，然後亦以添加視網酸、音蝟(hedgehog)信號阻礙劑(例如，SANT-1及環杷明(Cyclopamine)-KAAD)、纖維母細胞增殖因子等為較佳。
又，在分化之過程中，為了模仿身體內胰產生之過程，得到胰前驅細胞，可於適當時期添加維持未分化性且促進增殖的物質、抑制增殖而促進分化的物質、於活體內之胰臓中所表現的蛋白質等。就該物質而言，可 列舉GSK-3β(肝醣合成酶激酶3β(Glycogen Synthase Kinase 3β))阻礙劑(例如，CHIR99021)、ALK阻礙劑(例如，SB431542)、Notch信號阻礙劑(例如，DAPT)、TGFβ阻礙劑(例如，LDN193189)、AMPK及BMP信號阻礙劑(例如，多索嗎啡(Dorsomorphin))、PKC活化劑(例如，Pdbu)、類胰島素增殖因子-1、上皮成長因子、肝細胞成長因子、類高血糖素肽-1、市售之補充劑等。
(分化誘導成胰島細胞的步驟(E步驟))
本發明之從源自多能性幹細胞之胰前驅細胞製成胰島細胞的製造方法，其特徵為包含將依照上述方法培養之胰前驅細胞分化誘導成胰島細胞的步驟。
在使胰前驅細胞分化成胰島細胞的步驟中，只要模仿在活體內胰產生的過程，經時改變培養液的組成即可。又，該分化誘導步驟可藉由採用前述細胞凝集體之懸浮培養而進行。
就此種方法而言，可使用例如上述參考文獻1-4所記載的方法、及將其適當修正的方法。若為參考文獻2記載的方法，藉由實施階段5至階段7的階段，可分化誘導至胰島細胞為止。
(胰前驅細胞的凍結步驟(F步驟))
本發明之源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的凍結保存方法，其特徵為包含將藉由上述方法所培養之胰前驅細 胞凍結的步驟。
就胰前驅細胞而言，可使用藉由上述之培養方法所培養的細胞、及進一步繼代培養的細胞之任一種。又，凍結保存之胰前驅細胞，以使其解離成分散細胞為較佳。使其解離成分散細胞的方法與前述者相同。
就凍結保存液而言，無特別限定，可列舉市售之凍結保存液(例如，cell banker(註冊商標)2(日本全藥工業股份有限公司)、stem cell banker(註冊商標)(日本全藥工業股份有限公司)、StemSure(註冊商標)Freezing Medium(和光純藥工業股份有限公司)等)、添加有約5至20容量%之二甲基亞碸的培養液(例如，於上述培養方法中使用的培養基)等。
凍結保存通常可於約-70至-196℃，較佳於-100℃以下進行凍結。在進行長期保存之情況，可於液態氮細胞保存容器之液態氮中或液態氮上部的氣相中進行保存。
凍結保存之細胞的解凍，可藉由於通常約20至40℃，較佳於約35至38℃之水浴中急速加溫而進行。
藉由本發明之培養方法增殖的胰前驅細胞，凍結保存後亦維持與凍結保存前相同程度之增殖力。因此，亦可期待此技術適用於胰前驅細胞的細胞銀行。
[實施例]
以下，列舉實施例更詳細說明本發明。然而，本發明不受此等實施例等任何限定。
再者，在以下實施例中，特別記述iPS細胞株之名稱的情況，係使用253G1株之實驗結果。
[瓊脂糖微孔的準備]
使用Microtissues公司之3D培養皿(Petri Dish)，參考製造者之規程(http：//www.funakoshi.co.jp/contents/5556)，製作瓊脂糖微孔。使用孔直徑400μm、256孔/凝膠-盤之模板。具體而言，依照以下之順序製作瓊脂糖微孔。
首先，於模板中流入加溫之瓊脂糖溶液(Lonza公司製瓊脂糖，2.5%瓊脂糖/生理食鹽水)。繼而，於室溫冷卻，瓊脂糖凝膠化後，從模板取出瓊脂糖微孔。將瓊脂糖微孔移至細胞培養用之聚苯乙烯製12孔培養盤，從周圍添加培養基(DMEM/F12)，並使瓊脂糖微孔培養盤浸漬於培養基中。放入培育器(37℃，5%CO2)一夜以上，使瓊脂糖微孔培養盤與周邊之培養基平衡化。藉此，得到具有256個孔的瓊脂糖微孔，其中此等孔各具有直徑400μm的圓柱部且具有半球狀的底部。以上之操作係於乾淨工作台內，以無菌狀態進行。
[凝集體形成及分化誘導成胰前驅細胞]
將iPS細胞(253G1，得自Riken Cell Bank)，使用經Geltrex(Thermo Fisher Scientific)塗布之培養容器，在E8培養基(Thermo Fisher Scientific)中培養3至4日。於70%至80%融合之狀態，使用TrypLE(Thermo Fisher Scientific)處理，將細胞以單一細胞之狀態回收。將細胞懸濁於含有10μM之Y-27632(ROCK阻礙劑：和光純藥工業股份有限公司)的E8培養基中，然後將其以成為平均2500個細胞/孔之方式播種在256孔瓊脂糖微孔培養盤中，該256孔瓊脂糖微孔培養盤係設置於上述製備之聚苯乙烯製12孔培養盤之孔之一內。
靜置10分鐘使細胞沉降至微孔之底部後，於瓊脂糖微孔培養盤之周邊添加培養基(E8培養基+ROCK阻礙劑)，並將每一培養盤浸漬於培養基之中央。以37℃、5%CO2之條件進行24小時培養(5%CO2、37℃)，使細胞凝集後，以設定之期間培養，進行分化誘導。具體而言，如下述每日將培養基吸出，加入新培養基，進行交換，又，於設定之日使培養基組成改變。培養基之組成及在各個培養基中之培養日數係依照A Rezania et al.Reversal of diabetes with insulin producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.Nat Biotechnol.2014 Nov；32(11)：1121-33.之記載。
第1階段(3日)
MCDB131(Thermo Fisher Scientific)+1.5g/L NaHCO3(Nakarai Tesque股份有限公司)+0.5%無脂BSA(和光純藥工業股份有限公司)+2mM GlutaMax(Thermo Fisher Scientific)+10mM D-葡萄糖(Nakarai Tesque股份有限公司)+3μM CHIR99021(Tocris Bioscience)+100ng/mL激活素A(R&D Systems)(CHIR99021只添加於首日之培養基中)
第2階段(2日)
MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+2mM GlutaMax+10mM D-葡萄糖+50ng/mL纖維母細胞增殖因子7(FGF-7,PeproTech)+0.25mM抗壞血酸(Sigma-Aldrich)
第3階段(2日)
MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%脂肪酸不含牛血清白蛋白(無脂BSA)+1/200 ITS補充劑(Thermo Fisher Scientific)+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖+50ng/mL FGF-7+0.25μM SANT-1(和光純藥工業股份有限公司)+0.1μM LDN193189(和光純藥工業股份有限公司)+1μM視網酸(Sigma-Aldrich)+0.2μM TBP(PKC活化劑；目錄編號：565740號；EMD Chemicals Inc.)+0.25mM抗壞血酸
第4階段(2日)
MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+1/200 ITS補充劑+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖+50ng/mL FGF-7+0.25μM SANT-1+0.2μM LDN193189+0.1μM視網酸+0.1μM TBP+0.25mM抗壞血酸
TBP：(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯醯基胺基)苯并內醯胺
將上述第1階段至第4階段之培養所得之細胞藉由流式細胞儀的分析結果示於第1圖。第1圖中，SOX9為胰前驅細胞標記，BrdU為細胞增殖標記(用於對有增殖能力之細胞之核標上記號的核酸類似體)，PDX1為胰前驅細胞及胰島細胞標記。將BrdU添加於培養液中，經24小時培養後，進行染色及流式細胞儀分析。就一次抗體而言，使用山羊抗PDX1抗體(R&D systems)、兔抗SOX9抗體(Merck Millipore)、小鼠抗BrdU抗體(Dako)；就二次抗體而言，使用FITC標識抗小鼠IgG抗體(Thermo Fisher Scientific)、PE標識抗山羊IgG抗體(Thermo Fisher Scientific)、FITC標識抗兔IgG抗體(BD Biosciences)、PE標識抗小鼠IgG抗體(BD Biosciences)。測定係使用Guava(註冊商標)easyCyte(Merck Millipore)。
從第1圖，約6成之細胞分化為PDX1陽性之胰細胞，並包含約3成之增殖中之SOX9/BrdU陽性胰前驅細胞。就結果而言，成為不均勻之細胞集團，推測包含未分化之細胞、胰前驅細胞(SOX9及PDX1陽性且NKX6.1陰性細胞)、已成熟為內分泌細胞的細胞。
[胰前驅細胞之擴增]
將上述第1階段至第4階段之培養所得到之細胞的凝集塊，使用細胞分散用酵素液TrypLE(Thermo Fisher Scientific)，分散為單一細胞。將細胞懸濁於含有10μM之Y-27632(ROCK阻礙劑：和光純藥工業股份有限公司)的下述培養基，以1000細胞/孔播種在設置於12孔培養盤內之 256孔瓊脂糖微孔培養盤中(1000×256=2.56×105/培養盤)。靜置10分鐘使細胞沉於底後，從瓊脂糖微孔培養盤之周邊添加下述之培養基，將每個培養盤浸漬於培養基中。然後，以37℃、5%CO2之條件培養6日。培養基交換係每隔一日進行。
MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+1/200 ITS補充劑+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖+50ng/mL上皮成長因子(EGF，和光純藥工業股份有限公司)+200ng/mL r-海綿硬蛋白1(RSPD1,R&D Systems)+0.25μM SANT-1(和光純藥工業股份有限公司)+0.2μM LDN193189(和光純藥工業股份有限公司)+0.1μM視網酸(Sigma-Aldrich)
將結果示於第2至4圖。在第3圖中，於6日後進行一次繼代。在第4圖中，將BrdU添加於培養液中，進行24小時培養後，進行染色及流式細胞儀分析。其中，於24小時培養中增殖之細胞以BrdU標識。再者，在第4圖中、SOX9為胰前驅細胞標記。從第2及3圖，在共添加r-海綿硬蛋白1及EGF之情況，細胞良好地增殖。又，從第4圖可知，在共添加r-海綿硬蛋白1及EGF之情況，SOX9/BrdU陽性細胞之比率為最高。與培養前相比，SOX9及PDX1陽性之胰前驅細胞亦增加(26.3%→57.5%)，篩選此等胰前驅細胞。
在塗布Geltrex之6孔培養盤上，使上述第1階段至第4階段之培養所得到的細胞，以20000或40000細胞/cm2之密度黏著於培養盤基材上，藉由與上述胰前驅 細胞之擴增同樣的培養方法進行黏著培養。以37℃、5%CO2之條件培養12日。在培養6日後，進行繼代。每隔一日進行培養基交換。將結果示於第5圖。從第5圖可知，在進行黏著培養之情況，許多細胞分化成外分泌細胞(數據未顯示)，在重複繼代之途中，細胞之增殖性減退，細胞數轉為減少。
[胰前驅細胞之純化]
每隔6日從瓊脂糖微孔培養盤回收細胞凝集體，分散成單一細胞後，播種於新瓊脂糖微孔培養盤。細胞之分散方法、培養基組成及培養條件與上述[胰前驅細胞之擴增]相同。
第6圖係表示計測各繼代中之SOX9及BrdU陽性細胞之比率的結果。再者，第6圖中P意指繼代數。從第6圖可知，每經過繼代，SOX9/BrdU陽性細胞之比率增加，於1繼代後上升至60%。第7至8圖係表示計測各繼代中之SOX9及PDX1陽性細胞之比率的結果。每經過繼代，SOX9及PDX1陽性之胰前驅細胞的比率增加，於3繼代後上升至90%。從此等結果，研判與成熟細胞相比，增殖能力高之前驅細胞的純度增加。
[胰前驅細胞之長期培養]
每隔6日從瓊脂糖微孔培養盤回收細胞凝集體，分散成包含SOX9及PDX1陽性之胰前驅細胞的單一細胞後， 播種於新瓊脂糖微孔培養盤。細胞之分散方法、培養基組成、及培養條件，與上述[胰前驅細胞之擴增]相同。
將結果示於第9至12圖。第9圖之左圖，表示於瓊脂糖微孔上培養時之細胞凝集體的相位差顯微鏡像，右圖表示從瓊脂糖微孔培養盤取出後之細胞凝集體的相位差顯微鏡像。在第11圖及第12圖中，BrdU為細胞增殖標記、PDX1為胰前驅細胞及胰島細胞標記、SOX9為胰前驅細胞標記、C-胜肽為β細胞標記、NKX6.1為內分泌細胞標記。雖在包含雜類細胞之細胞集團中，凝集體之形態會扭曲，然而從第9圖，藉由得到接近球形之細胞凝集體，可推測凝集體內之細胞為均勻之胰前驅細胞。從第10圖可知，細胞增殖能力並未減弱，可長期(48日)之擴增，藉由每1繼代，亦即6日之培養，細胞數增加至3倍。從第11及12圖可知，長期擴增之細胞，胰前驅細胞標記SOX9及PDX1為陽性。又，若將BrdU添加於培養液，培養24小時後進行染色，亦可觀察到多數為BrdU陽性之增殖中細胞。然而，進展到β細胞標記C-胜肽為陽性且內分泌細胞標記NKX6.1為陽性的成熟細胞仍稀少。
[成熟為內分泌細胞]
與上述[胰前驅細胞之擴增]同樣地，將6繼代擴增培養後之胰前驅細胞播種於瓊脂糖孔培養盤。播種密度為3000細胞/孔。依照下述第1階段至第3階段所示之順序，使之成熟為內分泌細胞。具體而言，如下述，使培養基組 成經時地改變。每隔1日吸出培養基，並以新培養基交換，又，於設定之日使培養基組成改變。培養基之組成及在各個培養基中之培養日數，係依照A Rezania et al.Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.Nat Biotechnol.2014 Nov；32(11)：1121-33.之記載。
第1階段(3日)
MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+1/200 ITS補充劑+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖+0.25μM SANT-1+0.2μM LDN193189+0.05μM視網酸+1μM T3(甲狀腺激素，三碘甲狀腺素(triiodothyronine),Sigma-Aldrich)+10μM Alk5i II(類激活素受體激酶受體5阻礙劑II,Enzo Life Sciences,Inc.)+10μg/mL肝素(Nakarai Tesque股份有限公司)+10μM硫酸鋅(Sigma-Aldrich)
第2階段(7日)
MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+1/200 ITS補充劑+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖+0.2μM LDN193189+1μM T3+10μM Alk5i II+10μg/mL肝素+10μM硫酸鋅+0.1μM GSi XX(gamma-secretase inhibitor XX,Merck Millipore)
第3階段(7-14日)
MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+1/200 ITS 補充劑+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖+1μM T3+10μM Alk5i II+10μg/mL肝素+10μM硫酸鋅+1mM N-Cys(N-乙醯基半胱胺酸(acetylcysteine),Sigma-Aldrich)+2μM R428(Axl阻礙劑，Selleckchem)+10μM Trolox(Merck Millipore)
為調查分化誘導效率之目的，調查分化誘導成胰島細胞之細胞凝集體中的C-胜肽陽性胰β細胞。將結果示於第13圖。第13圖中，NKX6.1為內分泌細胞標記，C-胜肽為β細胞標記。從第13圖可知，在使用6繼代擴增培養之胰前驅細胞的情況，未擴增之胰前驅細胞亦以相同程度之比率分化為C-胜肽/NKX6.1陽性之β細胞。
對於分化誘導成胰島細胞之細胞凝集體，進行糖負荷試驗。亦即，將凝集體浸漬於含有2.5M、22.5mM、2.5mM、22.5mM葡萄糖之克‧林試液(Krebs-Ringer solution)中各30分鐘，藉由ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法定量克.林試液中分泌之C-胜肽。將結果示於第14圖。從第14圖可知從胰前驅細胞成熟之細胞，C-胜肽之分泌量會隨著葡萄糖濃度而改變。就結果而言，顯示擴增之胰前驅細胞，可分化誘導成包含β細胞之胰內分泌細胞，具有反應葡萄糖濃度，使胰島素分泌量改變的能力。
關於分化誘導成胰島細胞之細胞凝集體，將進行免疫染色之結果示於第15圖。再者，第15圖中，高血糖素為α細胞標記，體抑素為δ細胞標記，胰島素為β細胞標記。從第15圖可知，分化誘導成胰島細胞之細 胞凝集體中，亦包含高血糖素陽性之α細胞、體抑素陽性之δ細胞。
[胰前驅細胞之凍結保存] ‧凍結
與上述[胰前驅細胞之擴增]同樣地進行5繼代後，使胰前驅細胞分散成單一細胞。使用市售之凍結保存液(Cell Banker 2(日本全藥工業股份有限公司)或Stem Cell Banker(日本全藥工業股份有限公司))或在增殖用之培養液中添加10%二甲基亞碸的溶液，藉由緩慢凍結法將細胞凍結。具體而言，將5×105細胞懸濁在500μL之凍結保存液中，注入凍結小瓶中。在凍結處理容器(Bicell，日本Freezer股份有限公司)中放入小瓶，於-80℃保存一晚。長期保存時，將小瓶移至液態氮槽中進行保存。
‧解凍方法
將於-80℃保存1日，在液態氮之保存槽中保存6小時的凍結小瓶在37℃之水浴中加溫，急速地解凍。將解凍之細胞懸濁液添加於10mL之培養液(MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+1/200 ITS補充劑+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖)中。藉由離心除去上清液後，將細胞懸濁於含有10μM之Y-27632的培養基(MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+1/200 ITS補充劑+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖+50ng/mL EGF+200ng/mL r-海綿硬蛋白1+0.25μM SANT-1+0.2μM LDN193189+0.1μM視網酸+10μM Y-27632)中，在其中添加台盼藍(trypan blue)染色液，算出解凍後之細胞生存率。
將結果示於第16圖。再者，在第16圖中，表示CB2，使用Cell Banker 2；SCB，使用Stem Cell Banker，DMSO，使用培養基+10% DMSO(自作凍結保存液)作為凍結保存液之結果。從第16圖可知，在使用任一種凍結保存液之情況，均有70至80%之生存率。
又，將解凍後之細胞以與上述[胰前驅細胞之擴增]同樣方式，藉由3次元培養，每隔6日進行繼代時之細胞數的變化，示於第17圖。第17圖係藉由Cell Banker 2進行凍結保存之細胞的結果。從第17圖所示之結果，進行凍結保存之細胞，明顯地具備與無凍結保存之細胞相同程度的增殖能力。
[從其他iPS細胞株分化誘導成胰前驅細胞]
就源自人類之iPS細胞而言，使用454E2株(得自Riken Cell Bank)、RPChiPS771-2株(ReproCELL股份有限公司)、及P11025株(Takara Bio股份有限公司)。
454E2株，係使用以Geltrex(Thermo Fisher Scientific)塗布之培養容器，藉由E8培養基(Thermo Fisher Scientific)培養3至4日而得者。於70%至80%融合之狀態，使用TrypLE(Thermo Fisher Scientific)處理，以單一細胞之狀態回收細胞。將細胞懸濁於包含10μM之Y-27632 (ROCK阻礙劑：和光純藥工業股份有限公司)的E8培養基中，以1.2至1.5×105個細胞/cm2播種在以Geltrex(Thermo Fisher Scientific)塗布之培養容器中。454E2株，係藉由黏著培養而分化誘導成胰前驅細胞。除了進行第4階段之培養3日以外，以與上述同樣之培養液及培養期間進行分化誘導。
771-2株，係使用以Geltrex(Thermo Fisher Scientific)塗布之培養容器，藉由StemFit AK02N培養基(味之素股份有限公司)培養3至4日而得者。使用TrypLE(Thermo Fisher Scientific)處理，以單一細胞之狀態回收細胞後，將細胞懸濁於含有10μM之Y-27632(ROCK阻礙劑：和光純藥工業股份有限公司)的StemFit AK02培養基(味之素股份有限公司)中，並以1.2至1.5×105個細胞/cm2播種在以Geltrex(Thermo Fisher Scientific)塗布之培養容器中。771-2株係藉由黏著培養，進行分化誘導成胰前驅細胞。除了進行第4階段之培養3日以外，以與上述同樣之培養液及培養期間進行分化誘導。
P11025株，係以DEF-CS Culture System(Takara Bio股份有限公司)培養3至4日。使用TrypLE(Thermo Fisher Scientific)處理，以單一細胞之狀態回收細胞後，將細胞懸濁於包含10μM之Y-27632(ROCK阻礙劑：和光純藥工業股份有限公司)的DEF-CS培養基(Takara Bio股份有限公司)中，並以1.2至1.5×105個細胞/cm2播種在以DEF-CS coat(Takara Bio股份有限公司)塗布之培養容器中。P11025株係藉由黏著培養，進行分化誘導成胰前驅細胞。第4階段之培養除進行3日以外，以與上述同樣之培養液及培養期間進行分化誘導。
[源自其他iPS細胞株之胰前驅細胞的擴增]
將上述所得到之胰前驅細胞與253G1株同樣地使用細胞分散用酵素液TrypLE(Thermo Fisher Scientific)分散成單一細胞。將細胞懸濁於包含10μM之Y-27632(ROCK阻礙劑：和光純藥工業股份有限公司)的下述培養基中，並以1000細胞/孔播種在設置於12孔培養盤之孔內的256孔瓊脂糖微孔培養盤中(1000×256=2.56×105/培養盤)。靜置10分鐘使細胞沉於底後，從瓊脂糖微孔培養盤之周邊添加下述之培養基，將每個培養盤浸漬於培養基中。然後，以37℃、5%CO2之條件培養4日。培養基交換係每隔一日進行。再者，亦使用含有3因子(EGF+RSPD1+CHIR99021或EGF+RSPD1+FGF-7)或2因子(FGF-7+CHIR99021)之培養基，代替含有4因子(EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021)之培養基，進行培養。
MCDB131+1.5g/L NaHCO3+0.5%無脂BSA+1/200 ITS補充劑+2mM GlutaMax+20mM D-葡萄糖+50ng/mL上皮成長因子(EGF，和光純藥工業股份有限公司)+200ng/mL r-海綿硬蛋白1(RSPD1,R&D Systems)+0.25μM SANT-1(和光純藥工業股份有限公司)+0.2μM LDN193189(和光純藥工業股份有限公司)+0.1μM視網酸(Sigma-Aldrich)+4.5μ M CHIR99021(Tocris Bioscience)+50ng/mL纖維母細胞成長因子7(FGF-7,PeproTech)
將結果示於第18-21圖。第18圖係展示添加4因子(EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021)時，來自771-2株之胰前驅細胞的細胞數變化(培養8日)。來自771-2株之胰前驅細胞，藉由添加4因子，並藉由4日之培養，胰前驅細胞增殖為約2倍。又，從第19圖可知，在3種細胞株中，添加4因子時，約70%之細胞的胰細胞標記PDX1及細胞***標記Ki67為陽性。第20-21圖展示添加2至4因子時的結果。從此結果可知，添加3因子(EGF+RSPD1+CHIR99021或EGF+RSPD1+FGF-7)及2因子(FGF-7+CHIR99021)時，細胞亦增殖約2倍，50%以上之比率為PDX1及Ki67陽性，可進行胰前驅細胞之增殖。
來自P11025株之胰前驅細胞以添加4因子(EGF+RSPD1+FGF-7+CHIR99021)之增殖培養基進行2繼代後，進行朝向內分泌細胞之成熟培養。成熟培養之方法，為與來自253G1株之胰前驅細胞的情況相同。對於分化誘導之細胞進行免疫染色，結果在分化誘導成胰島細胞之細胞凝集體中，亦包含胰島素陽性之β細胞、高血糖素陽性之α細胞、體抑素陽性之δ細胞。
本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請案以其原文作為參考文獻之方式納入本說明書中。
由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (13)

  1. 一種培養方法，其係源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的培養方法，該培養方法包含：(A)將源自多能性幹細胞之胰前驅細胞在含有(1)屬於上皮成長因子(EGF)家族的因子及/或屬於纖維母細胞成長因子(FGF)家族的因子、以及(2)Wnt促效劑的培養基中進行3次元培養的步驟，其中該多能性幹細胞係iPS細胞、ES細胞、ntES細胞、mGS細胞或EG細胞，該3次元培養係胰前驅細胞之凝集體的懸浮培養。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之培養方法，其中該Wnt促效劑為屬於R-海綿硬蛋白家族的蛋白質及/或GSK阻礙劑。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之培養方法，其中該(1)屬於EGF家族的因子及/或屬於FGF家族的因子為EGF，該(2)Wnt促效劑為R-海綿硬蛋白1。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之培養方法，其中該培養基為無血清培養基。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之培養方法，其中該培養係於餵養細胞不存在下的培養。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之培養方法，其中該多能性幹細胞為iPS細胞或ES細胞。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中該多能性幹細胞係源自人類。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之培養方法， 其更包含：(B)將於步驟A中所得到之胰前驅細胞繼代培養的步驟。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之培養方法，其係用於胰前驅細胞的純化。
  10. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其更包含：(C)調製iPS細胞的步驟，且在步驟A中係使用該源自iPS細胞的胰前驅細胞。
  11. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之培養方法，其更包含：(D)將多能性幹細胞分化誘導成胰前驅細胞的步驟，且在步驟A中係使用該胰前驅細胞。
  12. 一種製造方法，其係從源自多能性幹細胞之胰前驅細胞製造胰島細胞之方法，該製造方法包含：(E)將藉由如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之培養方法所培養的胰前驅細胞分化誘導成胰島細胞的步驟。
  13. 一種凍結保存方法，其係源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的凍結保存方法，該凍結保存方法包含：(F)將如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之培養方法所培養的胰前驅細胞凍結的步驟。
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