KR20170138451A - 항-ｃ-ｍｅｔ 항체 및 항-ｃ-ｍｅｔ 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 및 이의 약학적 용도 - Google Patents

항-ｃ-ｍｅｔ 항체 및 항-ｃ-ｍｅｔ 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 및 이의 약학적 용도 Download PDF

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리안샨 장
웨이캉 타오
야유안 푸
링 장
동 마
동빙 쿠이
얄리 왕
지안얀 쑤
진동 리앙
잉 장
구이양 지앙
전주안 치우
지용 쑨
지핑 자
징핑 웨이
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쑤저우 선카디아 바이오파마수티컬즈 컴퍼니 리미티드
샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

항-c-Met 항체 또는 항원 결합 단편 및 항-c-Met 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트가 제공되며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 또한 암의 치료에 적용되는, 인간화 항-c-Met 항체 또는 항원 결합 단편, 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물을 함유하는 약학적 조성물이 제공된다.

Description

항-Ｃ-ＭＥＴ 항체 및 항-Ｃ-ＭＥＴ 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 및 이의 약학적 용도
본 발명은 c-Met 항체, 이의 항원 결합 단편; c-Met 항체의 CDR 영역을 포함하는 키메라 또는 인간화 항체; 및 이의 c-Met 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 및 이를 포함하는 약학적 조성물; 및 이들의 항암제로서의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간화 c-Met 항체 및 c-Met 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 및 c-Met-매개성 질병 또는 상태의 치료용 약제의 제조에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.
최근, 분자 생물학 및 종양 약리학 연구는 티로신 키나아제(프로테인 티로신 키나아제, Protein Tyrosine Kinase, PTKs)-관련 세포 신호 형질도입 경로가 종양 형성 및 발달에 있어 아주 중요한 역할을 수행하고, 50% 이상의 원발암유전자 및 발암유전자 산물이 티로신 키아나제 활성을 가짐을 보여주었다. c-Met 원발암유전자는 PTKs 패밀리의 Ron 서브패밀리에 속하고, 암호화된 c-Met 단백질은 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor)/산란인자(Scatter Factor), HGF/SF에 대하여 고친화성 수용체이다. HGF/c-Met 신호전달 경로는 혈관신생 및 종양 성장 과정에 밀접하게 관련된다. 이의 지속적인 활성은 세포의 발암 또는 암세포 증식 또는 암세포 과다형성의 중요한 원인이다. 이 경로의 억제는 종양 표적 치료의 새로운 방법이 되었다.
c-Met 원발암유전자는 인간 염색체 7 장완(human chromosome 7 long arm, 7q31)에 위치하며, 이는 120 kb 이상의 크기이고 약 150 kD의 분자량을 갖는 c-Met 단백질 전구체를 암호화하고, 이는 국부적 글리코실화에 의해 170 kD 글리코프로테인을 생산한다. 글리코프로테인은 알파 서브유닛(50 kDa) 및 베타 서브유닛(140 kDa)으로 더 절단되고, 이들은 이황화결합으로 연결되어 성숙 c-Met 단백질 수용체를 형성한다. 헤테로다이머는 두 개의 가닥을 함유하고, 베타 쇄는 세포외 도메인, 막관통(transmembrane) 영역(막 신축 단편(membrane stretch fragment)으로도 불림), 및 세포내 도메인(세포내 티로신 키나아제 결합 부위를 포함)을 갖는다. 알파 쇄는 오직 세포외 부분만을 갖는데, 이는 고도로 글리코실화되어 있고 이황화 결합으로 베타 쇄에 부착되어 있다. 두 서브유닛의 세포외 영역은 상응하는 리간드의 인지 부위이고, 세포내 도메인은 티로신 키나아제 활성을 갖는다.
c-Met 활성 메커니즘은 세 종류로 분류된다: 하나는 HGF 활성 메커니즘에 의존하고, 두 번째는 HGF 활성 메커니즘에 의존하지 않고, 세 번째는 히알루론산 표면 수용체 CD44, adhesion 및 RON 신호 형질도입 경로 등을 통하는 것과 같이, 다른 막 경로를 통한다. 가장 일반적인 것 중 하나는 HGF 활성 메커니즘에 의존하는 것이다. HGF의 N-말단은 c-Met에 결합하여 베타 쇄에서 Tyr1234 및 Tyr1235의 이량체화 및 자가인산화를 촉진하고, C-말단 근처의 Tyr1349 및 Tyr1356의 인산화는 다수의 링커 단백질을 위한 결합 부위를 생산하고, 이는 차례로 다운스트림 신호전달의 P13K/Akt, Ras/Mapk, c-Src 및 STAT3/5-매개성 활성을 유도하고, 세포 생존 및 활성(P13K/Akt 경로와 밀접하게 관련), 종양 전이 및 세포 증식(주로 Ras/Mapk에 의해 매개)과 같은 다양한 세포 반응을 촉발한다. 또한, c-Met과 기타 막 수용체의 크로스-토크(cross-talk)는 종양 형성 및 전이를 촉진하는 것으로 알려져 왔다. c-Met가 종양 형성 및 전이로 이끄는 많은 경로의 교차로이므로, 많은 경로의 동시적 방해는 c-Met을 표적으로 상대적으로 쉽게 달성될 수 있고, c-Met이 항종양 형성 및 전이 치료를 위해 유망한 표적이 되었다.
항체 약물 컨쥬게이트(ADC)는 단클론 항체 또는 항체 단편을 생물학적으로 활성인 세포독소에 안정한 화학적 링커로 연결시킴으로써 형성되는데, 이는 종양 세포 또는 고도로 발현된 항원에 대하여 항체의 특이성 결합 활성 및 세포독소의 높은 효율성을 완전하게 이용하고 정상 세포에 대한 독성 부작용을 피한다. 이는 전통적인 화학치료제와 비교하여, 항체 약물 컨쥬게이트가 종양 세포에 정교하게 결합할 수 있고, 정상 세포에 대한 효과를 감소시킬 수 있음을 의미한다.
ADC는 세 부분으로 구성된다: 항체(표적), 링커 및 독소. 이들 중, 좋은 표적(항체 부분)이 ADC 약물의 특이성을 결정하는데, 이는 특이적 표적 결합 뿐아니라 효과적인 세포내 섭취(endocytosis)를 포함한다.
c-Met 키나아제 표적을 위한 세가지 주요 유형의 억제제가 있다: HGF 및 c-Met 생물학적 길항제, HGF 및 c-Met 항체 및 소분자 c-Met 억제제. 기존의 임상 결과는 HGF 또는 c-Met을 직접적으로 표적하는 항체 또는 c-Met 소분자 억제는 이상적이지 않음을 보여준다. c-Met을 위한 ADC는 종양을 치료하기 위한 가장 효과적인 방법일 수 있다. 현재로서, c-Met ADC 약물 임상 연구가 부재하다.
본 발명은 항-c-Met 항체 ADC 약물을 처음으로 공개하며, 이는 본 발명의 항-c-Met 항체의 항체-의존성 세포 증식 억제 효과를 보유할 뿐아니라, 잠재적 세포독성 약물의 효과를 증가시킨다. 독소의 종양 세포로의 표적화된 방출 때문에, 약물 독성 부작용은 효능의 증가와 함께 증가하지 않는다. 본 발명은 인간 c-Met에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 키메라 항체를 제공하고, 인간화 항체 및 키메라 항체는 높은 친화성, 높은 효능, 세포내 섭취(endocytosis), 좋은 안정성 및 c-Met 작용제 활성의 부재 등에 의해 특징지어 진다. 이러한 훌륭한 성질에 기초하여, 본 발명은 또한 세포 증식의 항체-의존성 억제를 보유하는 한편, 세포독성 약물의 잠재적 효과 및 치료될 질병의 넓은 스펙트럼을 증가시키는, 인간 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물을 제공한다. 또한, 표적 종양 세포로의 독소의 방출 때문에(본 발명의 항-c-Met 항체의 세포내 섭취), 약물 독성 부작용은 효능의 증가에 따라 증가하지 않는다.
발명의 요약
본 발명은 다음 서열 또는 이의 돌연변이 서열 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR을 포함하는, c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다:
중쇄 가변 영역 HCDR 서열: 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8;
및
경쇄 가변 영역 LCDR 서열: 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 항체 중쇄 가변 영역은 다음 서열 또는 이의 돌연변이 서열 중에서 선택된 적어도 하나의 HCDR 영역 서열을 포함한다: 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 항체 경쇄 가변 영역은 다음 서열 또는 이의 돌연변이 서열 중에서 선택된 적어도 하나의 LCDR 영역 서열을 포함한다: 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 항체는 서열번호 6 (HCDR1), 서열번호 7 (HCDR2) 및 서열번호 8 (HCDR3)로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변 영역 서열 또는 이의 돌연변이 서열 및 서열번호 9 (LCDR1), 서열번호 10 (LCDR2) 및 서열번호 11 (LCDR3)로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변 영역 서열 또는 이의 돌연변이 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 CDR 영역의 돌연변이 서열은 항체 활성을 최적화하는 1-3개의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열이고, 여기서 HCDR2 영역의 돌연변이 서열은 바람직하게 서열번호 12이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 쥐 항체 또는 이의 단편이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 쥐 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 4에 나타나 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 쥐 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 5에 나타나 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 쥐 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 4에 나타나 있고, 쥐 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 5에 나타나 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 쥐 항체 또는 이의 단편이 제공되고, 여기서 항체의 중쇄 가변 영역은 쥐 IgG1 또는 이의 변이체, 쥐 IgG2 또는 이의 변이체, 쥐 IgG3 또는 이의 변이체 또는 쥐 IgG4 또는 이의 변이체에서 유래된 중쇄 FR 영역을 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 쥐 항체 또는 이의 단편이 제공되고, 이는 쥐 IgG1 또는 이의 변이체, 쥐 IgG2 또는 이의 변이체, 쥐 IgG3 또는 이의 변이체 또는 쥐 IgG4 또는 이의 변이체에서 유래된 중쇄 불변 영역을 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 쥐 항체 또는 이의 단편이 제공되고, 여기서 항체의 경쇄 가변 영역은 쥐 κ쇄 또는 이의 변이체, 쥐 λ쇄 또는 이의 변이체에서 유래된 경쇄 FR 영역을 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 쥐 항체 또는 이의 단편이 제공되고, 이는 쥐 κ쇄 또는 이의 변이체, 쥐 λ쇄 또는 이의 변이체에서 유래된 경쇄 불변 영역을 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 이는 키메라 또는 인간화 항체 또는 이의 단편이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1 또는 이의 변이체, IgG2 또는 이의 변이체, IgG3 또는 이의 변이체 또는 IgG4 또는 이의 변이체에서 유래된 중쇄 FR 영역을 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 인간 생식계열(germline) 중쇄에서 유래된 중쇄 FR 서열, 바람직하게 인간 생식계열(germline) 중쇄 IGHV 3-33*01을 포함하고; 인간 생식계열(germline) 중쇄 IGHV 3-33*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 프레임워크(framework) 서열, 또는 이의 돌연변이 서열을 포함하고, 바람직하게, 상기 돌연변이 서열이 0-10개의 아미노산 복귀 돌연변이(back-mutation(s))를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체는 서열번호 13-15 또는 이의 변이체로 표시되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 인간 생식계열(germline) 경쇄에서 유래된 경쇄 FR 영역, 바람직하게 인간 생식계열(germline) 경쇄 IGKV085 또는 IGKV4-1*01을 포함하고, 인간 생식계열(germline) 경쇄 IGKV085 또는 IGKV4-1*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 프레임워크(framework) 서열, 또는 이의 돌연변이 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 돌연변이 서열이 0-10개의 아미노산 복귀 돌연변이(back-mutation(s))를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체는 서열번호 16-18 또는 이의 변이체 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체는 서열번호 13-15 중에 선택된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 16-18 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 이는 a) 내지 c) 중 어느 하나 중에서 선택된 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열의 조합을 포함한다:
a) 서열번호 13의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 16의 경쇄 가변 영역 서열;
b) 서열번호 14의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17의 경쇄 가변 영역 서열; 또는
c) 서열번호 15의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 18의 경쇄 가변 영역 서열.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 인간 IgG2 또는 이의 변이체, 인간 IgG3 또는 이의 변이체 또는 인간 IgG4 또는 이의 변이체에서 유래된 불변 영역, 바람직하게 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 인간 IgG2 또는 이의 변이체 또는 인간 IgG4 또는 이의 변이체에서 유래된 불변 영역, 가장 바람직하게 인간 IgG2 또는 이의 변이체에서 유래된 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 이는 서열번호 23-25 또는 서열번호 23-25에 대하여 적어도 90% 상동성을 갖는 서열 중에서 선택된 전장(full length) 중쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체의 경쇄 가변 영역은 인간 κ 또는 λ쇄 또는 이의 변이체 중에서 선택된 경쇄 FR 영역을 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 κ 또는 λ쇄 또는 이의 변이체 중에서 선택된 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 이는 서열번호 26-28 또는 서열번호 26-28에 대하여 적어도 90% 상동성을 갖는 서열 중에서 선택된 전장(full-length) 경쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 이는 서열번호 23-25 중에서 선택된 전장 중쇄 서열 및 서열번호 26-28 중에서 선택된 전장 경쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 인간화 항체는 a) 내지 c) 중 어느 하나 중에서 선택된 전장 경쇄 서열 및 전장 중쇄 서열의 조합을 포함한다:
Ab-9: 서열번호 23의 중쇄 서열 및 서열번호 26의 경쇄 서열;
Ab-10: 서열번호 24의 중쇄 서열 및 서열번호 27의 경쇄 서열; 또는
Ab-11: 서열번호 25의 중쇄 서열 및 서열번호 28의 경쇄 서열.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서 항원-결합 단편은 Fab, Fv, scFv 또는 F(ab')2이다.
본 발명은 상술한 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 DNA 분자 및 발현 전구체 생산물을 더 제공한다.
본 발명은 상술한 바와 같이 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터를 더 제공한다.
본 발명은 상술한 바와 같이 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 더 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 상술한 바와 같이 숙주 세포가 제공되고, 여기서 상기 숙주 세포는 바람직하게 포유류 세포, 보다 바람직하게 CHO 세포이다.
본 발명은 상술한 바와 같이 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 더 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도 또는 c-Met-매개성 질병 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 따른 약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 질병 또는 상태는 바람직하게 암; 보다 바람직하게 c-Met을 발현하는 암; 가장 바람직하게 위암, 췌장암, 폐암, 장암, 신장암, 흑색종, 비소세포성 폐암 중에서 선택되는 암; 가장 바람직하게 위암 및 비소세포성 폐암이다.
본 발명은 c-Met 매개성 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 더 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질병 또는 상태는 바람직하게 암, 보다 바람직하게 c-Met을 발현하는 암; 가장 바람직하게 위암, 췌장암, 폐암, 장암, 신장암, 흑색종, 비소세포성 폐암 중에서 선택되는 암; 가장 바람직하게 위암 및 비소세포성 폐암이다.
본 발명은 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 더 제공한다:
Ab-[(L2)t-L1-D)]y (I)
여기서:
D는 약물 단위이고;
L1 또는 L2는 링커 단위이고;
t는 0 또는 1, 바람직하게 1이고;
y는 1-8, 바람직하게 2-5의 범위이고; y는 소수일 수 있고;
Ab는 상술한 바와 같이 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 여기서 -L2-는 식 (-L2-)으로 표시되고:
Figure pct00001
,
여기서:
X1은 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군 중에서 선택되고;
X2는 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴로 구성된 군에서 선택되고;
m은 0-5, 바람직하게 1-3이고;
S는 황 원자이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 여기서 D의 약물 단위가 독소, 화학치료제, 항생제, 방사성동위원소, 핵산분해 효소 중에서 선택된 세포독성제이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 여기서 D의 약물 단위는 식 (D):
Figure pct00002
또는 이의 토토머(tautomer), 메소머(mesomer), 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 이들의 혼합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 표시되는 화합물이고:
여기서:
R1-R7은 각각 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;
R8-R11은 각각 선택적으로 수소, 할로겐, 알케닐, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게, R8-R11의 적어도 하나는 할로겐, 알케닐, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고, 및 R8-R11의 나머지는 수소이고;
또는 R8-R11의 임의의 둘은 사이클로알킬을 형성하고, 나머지 둘은 각각 수소, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;
R12-R13은 각각 수소, 알킬 및 할로겐으로 구성된 군에서 선택되고;
R14는 아릴 및 헤테로아릴 중에서 선택되고, 여기서 아릴 또는 헤테로아릴은 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되는 치환기로 선택적으로 더 치환되고;
R15는 할로겐, 알케닐, 알킬, 사이클로알킬 또는 COOR17 중에서 선택되고;
R16은 수소, 할로겐, 하이드록시, 시아노, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬 중에서 선택되고;
R17은 수소, 알킬 및 알콕시 중에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 여기서 L2는 Val-Cit, MC, PAB 및 MC-PAB 중에서 선택되는 링커이고, 바람직하게는 MC이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 여기서 D가 마이탄시노이드(maytansinoid) 알칼로이드이고; 바람직하게 DM1, DM3 및 DM4 중에서 선택되고; 보다 바람직하게 DM1이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 여기서 L2가 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 발레레이트(N-succinimidyl 4-(2-pyridylthio) valerate (SPP)), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실산 에스테르(N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-Carboxylic acid esters (SMCC)), 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트(N-succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate (SIAB))로 구성된 군; 바람직하게 SPP 또는 SMCC 중에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 여기서 D가 캄토테신(camptothecin) 알칼로이드이고; 바람직하게 CPT, 10-하이드록시-CPT, CPT-11(이리노테칸), SN-38 및 토포테칸 중에서 선택되고, 더 바람직하게 SN-38이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고 여기서 상기 링커 L2는 Val-Cit, MC, PAB 또는 MC-PAB; 바람직하게 MC 또는 MC-vc-PAB 구조 중에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 이는 식 (II)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
Figure pct00003
여기서:
R2-R16은 식 (D)에 정의된 바와 같고;
Ab, t, y, L1, L2는 식 (I)에 정의된 바와 같다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 이는 식 (III)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
Figure pct00004
여기서:
R2-R16은 식 (D)에 정의된 바와 같고;
Ab, t, y, L1, L2는 식 (I)에 정의된 바와 같고;
n은 3-6, 바람직하게 5이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 이는 식 (IV)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
Figure pct00005
여기서:
R2-R16은 식 (D)에 정의된 바와 같고;
Ab, y는 식 (I)에 정의된 바와 같고;
n은 식 (III)에 정의된 바와 같고;
X1, X2, m은 식 L2에 정의된 바와 같다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고, 이는 식 (V)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다:
Figure pct00006
여기서:
Ab, D, y는 식 (I)에 정의된 바와 같고;
n은 식 (III)에 정의된 바와 같고;
X1, X2, m은 식 L2에 정의된 바와 같다.
본 발명에 따른 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
여기서 Ab-9, Ab-10, Ab-11은 상기 정의된 바와 같은 c-Met 항체이고, y는 1-8, 바람직하게 2-5이다.
여기서, y는 1-8의 범위이고; 바람직하게 1-4의 범위이다.
본 발명은:
Figure pct00010
일반식 (Ab-L2)의 화합물을 일반식 (L1-D)의 화합물과 유기 용매 중 반응시켜 일반식 (V)의 화합물을 얻고; 여기서 상기 유기 용매는 바람직하게 아세토니트릴 또는 에탄올인 단계를 포함하는, 식 (V)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 또한 제공하고,
여기서:
Ab는 본 발명에 따른 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이고;
X1은 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;
X2는 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴로 구성된 군에서 선택되고;
X는 0-5, 바람직하게 1-3이고,
m은 0-5, 바람직하게 1-3이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공되고 이는 시험관내 또는 생체내 세포독성 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 치료학적 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 c-Met 매개성 질병 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명에 따른 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 본 발명에 따른 이를 포함하는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이고, 여기서 질병 또는 상태는 바람직하게 암, 보다 바람직하게 c-Met을 발현하는 암; 가장 바람직하게 위암, 췌장암, 폐암, 장암, 신장암, 흑색종, 비소세포성 폐암 중에서 선택되는 암; 가장 바람직하게 위암, 췌장암, 비소세포성 폐암 및 신장암이다.
본 발명은 또한 c-Met 매개성 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질병 또는 상태는 바람직하게 암, 보다 바람직하게 c-Met을 발현하는 암; 가장 바람직하게 위암, 췌장암, 폐암, 장암, 신장암, 흑색종, 비소세포성 폐암 중에서 선택되는 암; 가장 바람직하게 위암, 췌장암, 비소세포성 폐암 및 신장암이다.
1. 용어
발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 특정 기술적 및 과학적 용어들이 이하 구체적으로 정의된다. 본 문서 내 다른 곳에 특별히 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기타 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산에 대한 단일-글자 코드 및 세-글자 코드는 J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558에 기술된 바와 같다.
용어 “c-Met” 또는 “c-Met 폴리펩티드” 또는 “c-Met 수용체”는 세포 성장 인자(HGF)에 결합하는 수용체 티로신 키나아제를 지칭한다. 본 발명에서, 쥐(murine) c-Met (m-c-Met) 또는 원숭이 c-Met (cyno-c-Met)와 같이 특별히 구체화하지 않는 이상, 용어 c-Met은 보통 인간 c-Met (h-c-Met)을 지칭한다. 본 발명에서 사용된 인간, 마우스 및 시아노몰구스 원숭이 c-Met은 GenBank에 의해 제공되는 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열에 의해 암호화되고, 예를 들어, 인간 펩티드는 GenBank Accession No. NM_000245로 제공되는 뉴클레오티드 서열로 암호화되고, 또는 인간 단백질 또는 이의 세포외 도메인은 GenBank the Accession No. NP_000236에 제공되는 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된다. 원래의 단일-가닥 전구체 단백질은 전사 후 절단되어 알파 및 베타 서브 유닛을 생산하고, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 성숙 수용체를 형성한다. 수용체 티로신 키나아제 c-Met은 예를 들어, 배아발생과 연관된 조직 재생의 이동, 침습 및 형태발생 과정을 포함하는 세포 프로세스(cell processes)에 연관된다.
용어 “c-Met-관련 질병 또는 상태”는 불리하거나(adverse) 부족한 c-Met 발현, 불리한 조절 또는 조절의 부족, 또는 해로운 활성 또는 활성의 부족으로 기원하는 임의의 질병 또는 상태 또는 질환을 지칭하고, 또는 c-Met 발현 또는 활성을 조절함으로써 조절되거나, 치료되거나, 치유될 수 있는 임의의 질병, 상태, 또는 질환을 지칭한다. HGF/c-Met 경로의 활성은 예를 들어, 대부분의 암 환자에서, 또는 질병이 c-Met 경로와 연관된 변화에 의해 실제로 주도되는 환자에서 예상될 수 있다. 예를 들어, 상향조절은 HGF 및/또는 c-Met의 과발현 또는 c-Met 돌연변이의 구성요소 활성과 같은, 여러 메커니즘 때문이다. c-Met-관련 질병 또는 상태는, 이에 제한되는 것은 아니나, 증식성 질병 및 질환 및 염증성 질병 및 질환을 포함한다. 증식성 질병은, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 위암, 식도암, 유두상 신장암(papillary renal cell carcinoma)을 포함하는 신장암, 폐암, 신경교종, 두경부암, 상피암, 피부암, 백혈병, 림프종, 골수종, 뇌암, 췌장암, 대장암, 위장암, 장암, 생식기암, 비뇨기암, 흑색종, 전립선암 및 기타 당업자에게 알려진 종양을 포함한다. 염증성 질병은, 이에 제한되는 것은 아니나, 리스테리아(Listeria) 세균에 기인한 감염을 포함하는, 세균성 감염을 포함한다.
본 발명에서 “항체”는 쇄간 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 동일한 중쇄 및 두 개의 동일한 경쇄로 형성된 네개-펩티드 쇄 구조인, 면역글로불린을 지칭한다. 다양한 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 다양한 아미노산 조성물 및 서열을 나타내고, 따라서 다양한 종류의 항원성을 보여준다. 따라서, 면역글로불린은 면역글로불린 아이소타입, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로도 지칭되는 다섯 개의 범주로 나뉠 수 있고; 이들의 상응하는 중쇄는 각각 μ 쇄, δ 쇄, γ 쇄, α 쇄, ε 쇄이다. 힌지(hinge) 영역의 아미노산 조성물 및 중쇄 이황화 결합의 수 및 위치에 따라, 면역글로불린은 다양한 서브-범주로 나뉠 수 있는데, 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나뉠 수 있다. 경쇄는 다양한 불변 영역에 기초하여 κ 또는 λ 쇄로 나뉠 수 있다. 이들 다섯 범주 중 Ig의 각각의 범주는 κ 또는 λ 쇄가 관련된다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단에서, 약 110개의 아미노산이 주로 변화하는데, 이는 가변 영역(V 영역)으로 알려져 있다; C-말단에서의 아미노산 서열은 상대적으로 안정적이고, 이는 불변 영역(C 영역)으로 알려져 있다. 가변 영역은 세 개의 초가변 영역(HVR) 및 상대적으로 보존된 서열을 갖는 네 개의 FR 영역(FR)을 포함한다. 세 개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정짓고, 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 각각의 중쇄 가변 영역(HCVR)은 세 개의 CDR 영역 및 네 개의 FR 영역으로 구성되고, 아미노산 말단에서 카복실 말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 세 개의 경쇄 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 지칭한다; 세 개의 중쇄 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 지칭한다. 본원에서 항체 또는 항원 결합 단편의 LCVR 및 HCVR 영역 내 CDR 영역 아미노산 잔기의 수 및 위치는 공지된 카바트 넘버링(Kabat numbering) 기준(LCDR1-3, HCDE2-3)에 상응하거나, 카바트 및 코티아 넘버링(kabat and chothia numbering) 기준(HCDR1)에 상응한다.
본 발명에서 용어 "쥐(murine) 항체"는 이 분야의 기술 및 지식에 따라 마우스로부터 제조된 항-인간 c-Met 단클론 항체를 지칭한다. 제조 중, 시험 대상은 c-Met 항원으로 주사되고, 원하는 서열 또는 기능성 특징을 보유하는 항체를 발현하는 혼성세포(hybridoma)가 분리된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 쥐 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 쥐 κ, λ쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 더 포함하거나, 쥐 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 더 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 쥐 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합함으로써 얻어지는 항체이고, 키메라 항체는 쥐 항체-유도성 면역 반응을 완화시킬 수 있다. 키메라 항체를 만들기 위해, 특이적 쥐 단클론 항체를 분비하는 혼성세포를 먼저 만들고, 가변 영역 유전자를 이러한 쥐 혼성세포에서 복제하고 재조합 발현을 위해 인간 항체의 불변 영역 유전자 내로 복제한다.
인간화 CDR-이식(grafted) 항체로도 알려진 용어 "인간화 항체"는 인간 생식계열(germline) 항체 프레임워크(framework) 서열의 다양한 종류를 포함하는, 인간 항체 가변 영역의 프레임워크 상에 쥐 CDR 서열을 이식함으로써 생성된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 다수의 쥐 구성요소를 가지는 키메라 항체에 의해 유도되는 강항 면역 항체 반응을 피한다. 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 커버하는 공공 DNA 데이타베이스 또는 공개 참고문헌으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이타베이스에서 찾을 수 있고(웹사이트 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase 에서 이용가능), Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed에서도 찾을 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, c-Met 인간화 항체의 쥐 CDRs 서열은 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11 중에서 선택된다. 인간 항체 가변 영역 프레임워크는 설계되고, 선택되는데, 여기서 상기 항체 경쇄 가변 영역의 경쇄 FR 영역 서열은 인간 생식계열 경쇄 서열에서 유래되고, 바람직하게 인간 생식계열 경쇄 IGKV085 및 IGKV 4-1*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역을 포함하는, 인간 생식계열 경쇄 IGKV085 또는 IGKV 4-1*01 중에서 선택되고; 상기 항체 중쇄 가변 영역의 중쇄 FR 영역 서열은 인간 생식계열 중쇄 서열에서 유래되고, 바람직하게 인간 생식계열 중쇄 IGHV 3-33*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역을 포함하는, 인간 생식계열 중쇄 IGHV 3-33*01 중에서 선택된다. 면역원성의 감소에 의해 유발되는 활성의 감소를 피하기 위해, 최소한의 복귀 돌연변이(back mutation(s))가 활성 유지를 위해 인간 항체 가변 영역으로 도입될 수 있다.
인간화 항체를 생성하기 위해 당업계에 이용가능한 다수의 방법들이 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 c-Met에 특이적으로 결합하는 모 항체(예를 들어, 쥐 항체 또는 혼성세포에 의해 생산된 항체)의 HCVR 및 LCVR을 암호화하는 핵산 서열을 얻고, 이 암호화 핵산 서열을 선택된 인간 프레임워크-암호화 핵산 서열 상에 이식함으로써 생산될 수 있다. 선택적으로, CDR 영역은 프레임워크 영역 상 CDR 영역을 이식하기 전 CDR 내 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하기 위해서 무작위로 또는 특정 위치에서 돌연변이유발에 의해 최적화될 수 있다. 대안으로, CDR 영역은 당업자에게 이용가능한 방법을 사용하여 인간 프레임워크 영역 내로 삽입된 후 최적화될 수 있다. 바람직하게, "인간화 항체"는 모 항체(즉, 비-인간 항체, 바람직하게 마우스 단클론 항체)에서 기원하거나 유래한 CDRs을 갖고, 한편 프레임워크 및 불변 영역은, 존재하는 정도까지, (또는 이의 중요한 또는 상당한 부분, 즉, 적어도 약 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 상기 항체가 인간 세포에서 생산되는지 상관없이, 인간 생식계열 면역글로불린 영역(예를 들어 International ImMunoGeneTics Database 참고) 내, 또는 이의 재조합 또는 돌연변이 형태 내 발생하는 핵산에 의해 암호화된다. 바람직하게, 인간화 항체의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR은 인간화 항체가 유래된 비-인간 모 항체의 CDR로부터 최적화되어 스크리닝 검정, 예를 들어, ELISA 검정에 의해 확인될 수 있는, 원하는 특성, 예를 들어, 개선된 특이성, 친화성 또는 중화를 생성한다. 바람직하게, 본 발명의 항체 내 최적화된 CDR은 모 항체에 존재하는 CDR과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 모 항체의 CDR과 비교할 때, 본 발명의 인간화 항체의 CDRs 내 특정 아미노산 치환(본원 실시예 6 참고)은 항체의 불안정성(예를 들어, CDR로부터 Asn 잔기의 제거)의 가능성을 감소시키거나, 인간 대상체에 투여되었을 때 항체의 면역원성의 가능성(예를 들어, IMMUNOFILTERTM 기술로 예측되는 바와 같이)을 감소시킨다.
CDR-암호화 서열이 선택된 인간 프레임워크 암호화 서열 상에 이식된 후, 인간화 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 암호화하는 생성된 DNA 서열은 발현되어 c-Met에 결합하는 인간화 항체를 생산한다. 인간화 HCVR 및 LCVR은 전체 항-c-Met 항체 분자의 일부로, 즉, 인간 불변 도메인 서열을 갖는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 그러나, HCVR 및 LCVR 서열은 또한 인간화 항-c-Met scFv를 생성하기 위해 불변 서열의 부재 하에 발현될 수 있다.
사용될 수 있는 마우스 항체의 인간화와 관련된 방법을 더 서술하는 문헌은 예를 들어, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869, 1991 및 Winter 및 동료들의 방법 [Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)]을 포함한다.
본 발명의 "항원-결합 단편"은 항원-결합 활성을 갖는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 뿐아니라, 인간 c-Met에 결합하는 Fv 단편 scFv 단편을 지칭하고; 이는 본 발명에 기술되고, 서열번호 3 내지 서열번호 8로 구성된 군에서 선택된 항체의 하나 이상의 CDR 영역을 포함한다. Fv 단편은 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 불변 영역 없는 모든 항원-결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 일반적으로 Fv 항체는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하고, 항원 결합을 위해 필요한 구조를 형성할 수 있다. 또한, 다양한 링커가 폴리펩티드 쇄,즉, 단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv (scFv)를 형성하기 위해 두 항체의 가변 영역을 연결하기 위해 사용될 수 있다. scFv는 또한 이중특이적 항체를 건설하기 위해 항-EGFR 항체와 같은 다른 항체와 사용될 수도 있다. 본 발명에서 용어 "c-Met에 결합"은 인간 c-Met과 상호작용할 수 있음을 지칭한다. 본 발명에서 용어 "항원-결합 부위"는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 인식되는 항원 상 불연속, 삼차원 부위를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ADCC", 즉 항체 의존성 세포 매개성 세포독성은, Fc 수용체를 발현하는 세포가 항체의 Fc 부분을 인식함으로써 항체로 코팅된 표적 세포를 직접 죽이는 것을 지칭한다. 항체의 ADCC 작용자(effector) 기능은 IgG의 Fc 부분을 변형시킴으로써 감소되거나 제거될 수 있다. 변형은 IgG1 내 N297A, L234A, L235A; IgG2/4 키메라; F235E, 또는 IgG4 내 L234A/E235A 돌연변이 중에서 선택되는 돌연변이와 같은, 항체 중쇄 불변 영역 상 돌연변이를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명에 기술된 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 두 유전자를 공-발현시킴으로써 얻어진 단백질 생산물이다. 재조합 c-Met 세포외 도메인 Fc 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 c-Met 세포외 도메인 및 인간 항체 Fc 단편을 공-발현시킴으로써 얻어진다. c-Met 세포외 도메인은 세포막(cytomembrane) 외부에서 c-Met 모이어티를 지칭한다.
본 발명의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 전통적인 방법을 사용하여 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄(서열번호 4) 및 경쇄(서열번호 5)를 암호화하는 cDNA 서열은 복제되어 pEE6.4 발현 벡터(Lonza Biologics)로 재조합될 수 있다. 재조합된 면역글로불린 발현 벡터는 안정적으로 CHO 세포를 형질감염시킬 수 있다. 당업계에 잘 알려진 더 권고되는 방법으로서, 포유류 발현 시스템은 전형적으로 FC 영역 내 고도로 보존된 N-말단에서 항체를 글리코실화시킬 수 있다. 안정한 클론은 인간 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체의 발현을 통해 얻어질 수 있다. 양성 클론은 바이오리액터 내 항체 생산을 위한 무혈청 배양 배지에서 확장될 수 있다. 항체가 분비되는 배양 배지는 통상적인 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 배지는 호환가능한 완충액으로 평형화된 단백질 A 또는 G 세파로즈 FF 컬럼에 편리하게 적용될 수 있다. 컬럼은 비특이적 결합 성분을 제거하기 위하여 세척된다. 결합된 항체는 PH 구배(gradient)로 용출되고 항체 단편은 SDS-PAGE로 검출되고, 수집된다. 항체는 일반적인 기술을 사용하여 여과되고 농축될 수 있다. 가용성 응집체 또는 다량체(multimers)는 크기 배제 또는 이온 교환을 포함하는 일반적인 기술로 효과적으로 제거될 수 있다. 얻어진 생산물은 예를 들어 -70℃에서 즉시 동결되거나, 동결건조될 수 있다.
본 발명에서 용어 "항체"는 단클론 항체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb"는 단일 세포주에서 유래된 클론에 의해 분비되는 항체를 지칭한다. 세포주는 진핵세포, 원핵세포, 또는 파지 클론 세포주에 제한되지 않는다. 단클론 항체 또는 항원-결합 단편은 재조합, 예를 들어, 혼성세포 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술(예를 들어 CDR-이식) 또는 당업계에 쉽게 공지된 기타 기술에 의해 얻어질 수 있다.
동물, 사람, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때 "투여" 및 "치료"는 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 사람, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여" 및 "치료"는 예를 들어 치료적, 약동학적, 진단적, 연구 및 실험적 방법을 지칭한다. 세포의 치료는 제제를 세포와 접촉시키는 것 뿐아니라 제제를 유체와 접촉시키는 것, 여기서 유체는 세포와 접촉하는 것을 포함한다.
"치료하다(treat)"는 본 발명의 임의의 결합 화합물을 포함하는 조성물과 같은 치료제를 치료제가 공지된 치료학적 활성을 갖는 하나 이상의 질환 증상을 가지는 환자에 내부적으로 또는 외부적으로 투여하는 것을 의미한다. 통상적으로, 치료제는 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 이러한 증상(들)의 진행을 억제하거나 퇴행을 유도함으로써 치료되는 환자 또는 집단에서 하나 이상의 질환 증상을 경감시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정한 질환 증상을 경감시키기에 효과적인 치료제의 양("치료학적 유효량"으로도 지칭됨)은 환자의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 환자에서 원하는 반응을 이끌어내는 약물의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 질환 증상이 경감되는지의 여부는 그 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 기타 숙련된 건강관리 제공자에 의해 통상적으로 사용되는 임의의 임상 측정에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 실시양태(예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)가 모든 환자에서 관심 질환 증상(들)을 경감시키는 데 있어서 효과적이지 않을 수 있지만, 이것은 당해 분야에 공지된 임의의 통계 시험, 예컨대 스튜던트 t-시험, 카이자승(chi-square) 시험, 만(Mann) 및 휘트니(Whitney)에 따른 U-시험, 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험(H-시험), 죤키어-터프스프라(Jonckheere-Terpstra) 시험 및 윌콕슨(Wilcoxon) 시험에 의해 확인되는 바와 같이 통계학적으로 유의적인 수의 환자에서 관심 표적 질환 증상(들)을 경감시킬 것이다.
"보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"은, 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않으면서 변화가 빈번하게 이루어질 수 있도록, 유사한 특징(예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수화도/친수화도, 골격 입체구성 및 경직도 등)을 가지는 다른 아미노산으로의 단백질 내 아미노산의 치환을 지칭한다. 당해 분야의 당업자는, 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 파괴할 가능성이 낮다.
본 명세서 및 청구항에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "필수적으로 구성된" 또는 이의 변형어는 임의의 기재된 성분 또는 성분의 군의 포함, 및 명시된 투약 요법, 방법 또는 조성물의 기본적인 또는 새로운 특성을 실질적으로 변경하지 않는, 기재된 성분과 유사한 또는 상이한 성질의 다른 성분의 선택적 포함을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 기재된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된 결합 화합물은 결합 화합물의 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 아미노산을 또한 포함할 수 있다.
"유효량"은 의학적 상태의 증상 또는 징후를 경감시키거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 진단을 허용하거나 수월하게 하기에 충분한 양을 또한 의미한다. 특정한 환자 또는 수의 대상체에 대한 유효량은 치료되는 상태, 환자의 일반 건강, 투여의 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도와 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 유효량은 상당한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 투약 요법일 수 있다.
"외인성"은 문맥에 따라 유기체, 세포 또는 인간 신체 외부에서 생성된 물질을 지칭한다. "내인성"은 문맥에 따라 세포, 유기체 또는 인간 신체 내에서 생성된 물질을 지칭한다.
"상동성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 아단위가 2개의 비교된 서열의 둘 다에서 위치를 점유할 때, 예를 들어 아데닌이 2개의 DNA 분자의 각각에서의 위치를 점유하면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 2개의 서열 사이의 상동성의 백분율은 2개의 서열에 의해 공유되는 일치하거나 상동성인 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 서열이 최적으로 정렬될 때 2개의 서열에서 10개 중 6개의 위치가 일치하거나 상동성인 경우, 2개의 서열은 60%의 상동성이다. 일반적으로, 2개의 서열이 정렬되어 최대 상동성 백분율이 만들어질 때 비교가 이루어진다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 뒤에 있는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만, 반드시 발생할 필요는 없다는 것을 의미하고, 설명은 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "1-3개의 항체 중쇄 가변 영역을 선택적으로 포함한다"는 특정한 서열을 가지는 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만, 반드시 존재할 필요는 없다는 것을 의미한다.
"약학적 조성물"은 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로/약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭과 다른 화학 성분, 및 부가적인 성분, 예컨대 생리학적으로/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함하는 혼합물을 지칭한다. 약학적 조성물은 유기체에 대한 투여를 촉진하는 것, 활성 성분의 흡수를 수월하게 하는 것 및 이로써 생물학적 효과를 발휘하는 것을 목표로 한다.
전통적인 약학적 조성물의 제조는 중국 약전에서 찾아볼 수 있다.
용어 "담체"는 본 발명의 약물에 적용되는 경우, 약물이 인체로 진입하는 방식을 변화시키고 생체내 분포를 변화시키고 약물의 방출속도를 제어하고 약물을 표적 기관으로 전달할 수 있는 시스템을 지칭한다. 약물 담체 방출 및 표적화 시스템은 약물 분해 및 손실을 감소시킬 수 있고 부작용을 감소시킬 수 있고 생체이용율을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 담체로서 사용되는 고분자 표면활성제는 이의 독특한 양친매성 구조로 인해서 자가-조립하여 각종 형태의 응집체를 형성할 수 있으며, 바람직한 예에는 미셀, 에멀젼, 겔, 액정, 소포 등이 포함된다. 이러한 응집체는 약물 분자를 포획하는 능력을 가질 뿐만 아니라 우수한 막 투과성을 나타내고 탁월한 약물 담체로서 사용될 수 있다.
"희석제"란 용어는 충전제라고도 지칭되며, 이의 주 목적은 정제 중량 및 용적을 증가시키는 것이다. 희석제의 첨가는 특정 용적을 보장하기 위한 것일 뿐만 아니라 주 성분의 용량 편차를 감소시키고 약물의 압착 성형성을 개선시키기 위한 것이다. 약학적 정제가 유성(oily) 성분을 함유하는 경우, 오일 물질을 흡착하고 "건조" 상태를 유지하기 위해 흡착제가 첨가되어야 하고, 이는 정제 제형화를 용이하게 한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 리간드-세포독성 약물 컨쥬게이트의 염 형태를 지칭하며, 이 염은 안전하고 효율적이며 포유동물에서 바람직한 생체내 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트 화합물은 적어도 하나의 아미노기를 포함하며, 이에 의해서 항체-약물 컨쥬게이트 화합물은 산과 함께 염을 형성할 수 있다.
용어 "용매화물"은 본 발명의 리간드-약물 컨쥬게이트와 하나 이상의 용매 분자(들)에 의해 형성된 약학적으로 허용가능한 용매화물을 지칭한다.
용어 "리간드"는 표적 세포-관련 항원 또는 수용체를 인식하고 이에 결합할 수 있는 고분자 화합물이다. 리간드의 역할은 이 리간드에 결합되는 표적 세포 집단으로 약물을 전달하는 것이다. 리간드는 단백질성 호르몬, 렉틴, 성장 인자, 항체 또는 세포에 결합할 수 있는 기타 분자를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
치료제는 항체 또는 항체 단편 또는 이의 서브-단편과 같은 결합 모이어티와 함께 개별적으로, 동시에 또는 연속적으로 투여되고 질병의 치료에 유용한 분자 또는 원자이다. 치료제의 예로는 항체, 항체 단편, 컨쥬게이트, 약물, 세포독성제, 세포사멸제, 독소, 뉴클레아제(DNase 및 RNase 포함), 호르몬, 면역 조절제, 킬레이트제, 붕소 화합물, 광 감작제 또는 염료, 방사성동위원소 또는 방사성핵종, 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA, 펩티드, 항혈관신생제, 화학치료제, 사이토카인, 케모카인, 프로드럭, 효소, 결합 단백질 또는 펩티드 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
컨쥬게이트는 상술된 바와 같이 치료제에 컨쥬게이트된 항체 성분 또는 기타 표적 모이어티이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "컨쥬게이트" 및 "면역컨쥬게이트"는 상호호환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방해하고 및/또는 세포 죽음 또는 파괴를 초래하는 물질을 지칭한다.
"독소"는 세포 성장 또는 증식에 불리하게 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 지칭한다.
"화학치료제"는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 화학적 화합물을 지칭한다. 정의는 또한 암 성장을 촉진하는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 항-호르몬제를 포함하고, 화학치료제는 종종 전신 또는 전신 치료의 형태이다. 그들 자체가 호르몬일 수 있다.
아우리스타틴(Auristatins)은 물리적 특성 및 약효성(druggability)의 최적화를 촉진하는 비교적 쉽게 형성된 화학적 구조를 갖는 완전하게 합성된 약물이다. 항체 컨쥬게이션을 위해 사용되는 아우리스타틴 유도체는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)를 포함하며, MMAE는 C-말단에 2-아미노-1-페닐프로필-1-올을 첨가함으로써 합성된, 천연 튜불린 폴리머라제 억제제 돌라스타틴-10에서 유래된 합성 펜타펩티드이다. 각종 인간 종양 세포주에 대한 MMAE 억제 활성은 1 나노몰 미만이다. MMAE 자체의 세포독성 활성을 감소시키기 위해, MMAF의 경우, 페닐알라닌이 돌라스타틴-10의 C-말단에 도입된다. 구조 내에 카복실기의 도입으로 인해, MMAF은 막 통과에 있어 불량한 성능을 갖고 이에 따라 세포에 대한 생물학적 활성은 현저하게 감소되지만, 항체와 컨쥬게이션된 후 세포에 대한 억제 활성은 현저하게 증가된다(US7750116).
용어 "튜불린 억제제" 는 튜불린의 중합을 억제하거나 촉진시키고 그 결과 세포 유사분열 과정을 간섭함으로써 항-종양 효과를 발휘하는 화합물 부류를 지칭한다. 비제한적 예에는 마이탄시노이드, 칼리키아마이신, 탁산, 빈크리스틴, 콜히친, 및 돌라스타틴/아우리스타틴, 바람직하게는 마이탄시노이드 또는 돌라스타틴/아우리스타틴; 보다 바람직하게는 식 D1 또는 DM의 화합물을 포함한다.
CPT는 캄토테신(camptothecin)의 두문자어(acronym)이고, 본 출원에서 CPT는 캄토테신 그 자체 또는 캄토테신의 유사체 또는 유도체를 지칭하기 위해 사용된다. 표시된 숫자 및 문자 A-E로 표시된 환을 갖는 캄토테신의 구조 및 이들의 일부 유사체는 다음 식에 제공된다.
Figure pct00011
CPT: R1=R2=R3=H
10-하이드록시-CPT: R1=OH; R2=R3=H
이리노테칸(Irinotecan)(CPT-11):R1=
Figure pct00012
; R2=에틸; R3=H
SN-38: R1=OH; R2=에틸; R3=H
토포테칸(Topotecan): R1=OH; R2=H; R3=CH-N(CH3)2
용어 "세포내 대사물질"은 항체-약물 컨쥬게이트(ADCs)의 세포내 대사 과정 또는 반응에 의해 생성된 화합물을 지칭한다. 대사 과정 또는 반응은 효소 과정, 예컨대 ADC의 펩티드 링커의 단백질분해성 절단 또는 히드라존, 에스테르 또는 아미드와 같은 작용기의 가수분해일 수 있다. 세포내 대사물은 세포 내로 유입, 확산, 섭취 또는 수송 후에 세포내 절단을 거친 항체 및 유리 약물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "세포내 절단의(of intracellular cleavage)" 및 "세포내 절단"은 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)의 세포내 대사 과정 또는 반응을 지칭하고, 여기서 약물 모이어티(D) 및 항체(Ab) 사이의 공유 결합이 절단되어(즉, 링커가 절단된다), 항체로부터 유리 약물의 세포내 해리를 초래한다. ADC로부터 절단된 모듈(module)은 따라서 세포내 대사물이다.
용어 "생체이용률"은 환자에게 투여된 약물의 주어진 양의 전신 이용률(즉, 혈액/혈장 수준)을 지칭한다. 생체이용률은 투여된 용량으로부터 전신 순환을 달성하기 위해 약물에 의해 요구되는 시간(속도) 및 총 양(정도)을 가리키는 절대 용어이다.
용어 "세포독성 활성"은 항체-약물 컨쥬게이트의 세포내 대사물질 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 세포 살해, 세포증식억제(cytostatic), 또는 성장 억제 효과를 지칭한다. 세포독성 활성은 IC50 값, 즉, 세포 절반이 생존할 때의 단위 용적당 농도(몰 또는 질량)로 표현될 수 있다.
용어 "알킬"은 C1-C20을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄, 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 보다 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 가장 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬인 포화 지방족 하이드로카빌기를 지칭한다. 대표적 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 3차-부틸, 2차-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 2,2-디에틸헥실 및 이들의 다양한 분지쇄 이성체가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 알킬기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우, 치환기(들)은 임의의 이용가능한 연결점에서 치환될 수 있고, 치환기(들)은 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬옥실, 알킬티올, 알킬아미노, 할로겐, 티올, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클릭 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클릭 알콕시, 사이클로알킬티오, 헤테로사이클로알킬티오 및 옥소로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이다.
용어 "사이클로알킬"은 포화 또는 부분 불포화 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 하이드로카빌기를 지칭한다. 사이클로알킬은 3 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 12개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다. 모노사이클릭 사이클로알킬의 대표적 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 사이클로헵타트리에닐, 사이클로옥틸 등이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 폴리사이클릭 사이클로알킬은 스피로 환, 융합된 환 또는 브릿지된 환을 갖는 사이클로알킬을 포함한다.
용어 "헤테로사이클릴"은 하나 이상의 사이클릭 원자가 N, O 및 S(O)m(여기서, m은 0 내지 2의 정수이다)로 이루어진 군 중에서 선택되지만 환 내의 -O-O-, -O-S- 또는 -S-S-는 제외한 헤테로원자이고 나머지 사이클릭 원자가 C 원자인, 3 내지 20개의 사이클릭 원자를 갖는 포화 또는 부분 불포화 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소 치환체를 지칭한다. 3 내지 12개 사이클릭 원자가 바람직하고, 여기서 1 내지 4개 원자는 헤테로원자이고; 3 내지 10개의 사이클릭 원자가 더욱 바람직하다. 모노사이클릭 헤테로사이클릴의 대표적 예에는 피롤리디닐, 피페리딜, 피페라지닐, 몰폴리닐, 티오몰폴리닐, 호모피페라지닐 등이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 폴리사이클릭 헤테로사이클릴은 스피로 환, 융합된 환 또는 브릿지된 환을 갖는 헤테로사이클릴을 포함한다.
상기 헤테로사이클릴의 환은 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬의 환에 융합될 수 있고, 여기서 모체 구조에 결합된 환은 헤테로사이클릴이다. 대표적 예에는 다음 기들이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다:
Figure pct00013
헤테로사이클릴은 선택적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우, 치환기(들)은 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬설포, 알킬아미노, 할로겐, 티올, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클릭 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클릭 알콕시, 사이클로알킬티오, 헤테로사이클릭 알킬티오 및 옥소기로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 기(들)이다.
용어 "아릴"은 컨쥬게이트된 π-전자계를 갖는 6원 내지 14원의, 탄소만을 갖는 모노사이클릭 환 또는 융합된 폴리사이클릭 환(즉, 환들은 인접한 탄소 원자 쌍을 공유한다)을 지칭한다. 아릴은 바람직하게는 6원 내지 10원이며, 예를 들면, 페닐 및 나프틸, 바람직하게는 페닐이다. 아릴 환은 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬의 환에 융합될 수 있고, 여기서 모체 구조에 결합된 환은 아릴 환이다. 대표적 예에는 다음 기들이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다:
Figure pct00014
아릴기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우, 치환기(들)는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티올, 알킬아미노, 할로겐, 티올, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오 및 헤테로사이클로알킬티오로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 기이다.
용어 "헤테로아릴"은 1 내지 4개의 헤테로원자 및 5 내지 14개의 사이클릭 원자를 갖는 헤테로방향족 시스템을 지칭하고, 여기서 헤테로원자는 O, S 및 N으로 구성된 군 중에서 선택된다. 헤테로아릴은 바람직하게는 5원 내지 10원, 보다 바람직하게는 5원 또는 6원이며, 예를 들면 푸릴, 티에닐, 피리디닐, 피롤릴, N-알킬피롤릴, 피리미디닐, 피라지닐, 이미다졸릴, 테트라졸릴 등이다. 헤테로아릴 환은 아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬의 환과 융합될 수 있고, 여기서 모체 구조에 결합된 환은 헤테로아릴 환이다. 대표적 예에는 다음 기들이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다:
Figure pct00015
헤테로아릴기는 선택적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우, 치환기(들)는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티올, 알킬아미노, 할로겐, 티올, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오 및 헤테로사이클로알킬티오로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이다.
용어 "알콕시"는 알킬이 상기 정의된 바와 같은 -O-(알킬) 및 -O-(비치환된 사이클로알킬)기 둘 다를 지칭한다. 알콕시의 대표적 예에는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시 및 사이클로헥실옥시가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 알콕시는 선택적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우, 치환체는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬설포, 알킬아미노, 할로겐, 티올, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클릭 알콕시, 사이클로알킬티오 및 헤테로사이클릭 알킬티오로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 기이다.
용어 "결합"은 "-"로서 표시되는 공유결합을 지칭한다.
용어 "하이드록시" 는 -OH 기를 지칭한다.
용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도 원자를 지칭한다.
용어 "아미노" 는 -NH2 기를 지칭한다.
용어 "시아노" 는 -CN 기를 지칭한다.
용어 "니트로" 는 -NO2 기를 지칭한다.
용어 "옥소기" 는 =O 기를 지칭한다.
용어 "선택적" 또는 "선택적으로" 는 이후에 기재되는 사건 또는 상황이 일어날 수 있으나, 반드시 일어날 필요는 없음을 의미하고, 상기 기재는 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않는 경우를 포함한다. 예를 들면, "알킬에 의해 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭기"는 알킬기가 존재할 수 있지만 반드시 존재할 필요는 없음을 의미하고, 상기 기재는 헤테로사이클릭기가 알킬에 의해 치환되는 경우 및 헤테로사이클릭기가 알킬로 치환되지 않는 경우를 포함한다.
"치환된"이란, 기 내의 하나 이상의 수소 원자, 바람직하게는 5개 이하, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 수소 원자가 각각 독립적으로 상응하는 수의 치환체에 의해 치환된 것을 지칭한다. 치환체들이 이들의 가능한 화학적 위치에만 존재한다는 것은 명백하다. 당업자는 실험 또는 이론에 의한 과도한 노력 없이도 치환이 가능한지 불가능한지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 아미노 또는 유리 수소를 갖는 하이드록시기 및 불포화 결합(예를 들어 알켄)을 갖는 카본 원자 사이의 컨쥬게이션은 불안정할 수 있다.
"링커"는 항체를 약물 모듈(module)에 공유적으로 부착시키는 공유결합 또는 원자 사슬을 포함하는 화학적 모듈(module)을 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 링커는: 2가(divalent) 라디칼 예컨대 알킬디일(alkyldiyl), 아릴렌, 헤테로아릴렌, 예컨대, -(CR2)nO(CR2)n- 같은 단위, 하이드로카빌옥시 반복 유닛(예를 들어, 폴리에틸렌아미노, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 아미노알킬(예를 들어, 폴리비닐아미노, JeffamineTM), 등; 및 숙신산 에스테르, 숙신아미드, 비스 글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드를 포함하는 디에스테르 및 아미드를 포함한다.
약어
링커 단위
MC=6-말레이미도-카프로일
Val-Cit 또는 "vc"=발린-시트룰린(프로테아제 절단가능 링커(protease cleavable linker의 예시적 디펩티드)
시트룰린=2-아미노-5-우레이도 펜탄산(2-Amino-5-ureido pentanoic acid)
PAB=P-아미노벤질옥시카보닐("자가-희생"(self-immolative) 링커 단위의 예)
Me-Val-Cit=N-메틸-발린-시트룰린(여기서 링커 펩티드 결합은 카텝신 B에 의한 그의 절단을 방지하기 위해 변형되었다)
MC(PEG)6-OH=말레이미도-카프로일-폴리에틸렌 글리콜(항체 시스테인에 부착될 수 있는)
SPP=N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 발레레이트
SPDP=N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트
SMCC=숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트
IT=이미노 설판(imino sulfane)
세포독성 약물:
MMAE=모노메틸 아우란타틴 E (MW 718)
MMAF=약물 C-말단에 페닐알라닌을 가지는, 아우란타틴 E (MMAE)의 변이체(MW731.5)
MMAF-DMAEA=아미드에 의해 MMAF(MW 801.5)의 C-말단에서 페닐알라닌에 연결된 DMAEA (디메틸아미노에틸아민)
MMAF-TEG=MMAF의 페닐알라닌이 테트라에틸렌 글리콜에 의해 에스테르화된다
MMAF-NtBu=MMAF의 C-말단에 부착된 아미드로서 N-터트-부틸
DM1=N(2')-디아세틸-N(2')-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이티안(N(2')- deacetyl-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytian)
DM3=N(2')-디아세틸-N2-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이티안(N(2')-deacetyl-N2-(4-mercapto-1-oxopentyl)- maytian)
DM4=N(2')-디아세틸-N2-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-마이티안(N(2')- deacetyl-N2-(4-mercapto-4-methyl-1-oxopentyl)-maytian)
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제에 컨쥬게이트된 본 발명의 임의의 항-c-Met 항체 또는 세포내 섭취 활성을 나타내는 기타 c-Met 항체(예를 들어, LY-2875358)를 포함하는 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물("항체-약물 컨쥬게이트" 또는 "ADC"로 상호호환가능한)을 제공하며, 여기서, 세포독성제는 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물-유래 효소-활성 독성 또는 이의 단편) 또는 방사성동위원소(즉, 방사성발광 컨쥬게이트)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물은 항-c-Met 항체 및 화학치료제 또는 기타 독소를 포함한다. 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물을 생산하기 위해 사용될 수 있는 화학치료제는 본원에서 기술되어 왔다(상술됨). 효소-활성 독소 및 이의 단편 또한 사용되며, 이는 명세서에 기술된다.
특정 실시양태에서, 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물은 항-c-Met 항체 및 이에 제한되는 것은 아니나, 캄토테신 유도체, 칼리키미신, 마이탄시노이드, 돌라스타틴, 오리코틴, 트리코테센 및 CC1065 및 이들 약물의 세포독성 단편과 같은 소분자 약물을 포함하는 하나 이상의 소분자 독소를 포함한다.
예시적 링커 L2는 6-말레이미도카프로일("MC"), 말레이미도프로피오닐("MP"), 발린-시트룰린("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌(ala-phe), p-아미노벤질옥시카보닐("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 "SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트("SIAB")를 포함한다. 다양한 링커가 당업계에 알려져 있고, 이하 기술된다.
링커는 세포 내에서 약물의 방출을 촉진할 수 있는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산에 불안정한(acid labile) 링커(예를 들어 하이드라존), 프로테아제-민감성(예를 들어, 펩티다아제-민감성) 링커, 광에 불안정한(light-labile) 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커(Chari et al, Cancer Research 52: 127-131(1992); US 특허 제5,208,020호).
일부 실시양태에서, 링커는 항체를 다른 링커 또는 약물 모듈에 연결하는 "스트레처(stretcher) 단위"일 수 있다. 예시적 스트레처 단위는 이하 나타나 있다(물결선은 항체가 공유적으로 결합하는 부위를 가리킨다):
Figure pct00016
일부 실시양태에서, 링커 단위는 아미노산 단위일 수 있다. 그러한 일 실시양태에서, 아미노산 단위는 프로테아제가 링커를 절단할 수 있도록 하고, 이에 따라 세포내 프로테아제, 예를 들어 리소좀 효소에 노출 후, 약물을 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물로부터 방출이 가능하도록 한다. Doronina et al (2003) Nat. Biotechnol. 21: 778-784 내 실시예를 참고. 예시적 아미노산 단위는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 및 펜타펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린(VC 또는 val-cit); 알라닌-페닐알라닌(AF 또는 ala-phe); 페닐알라닌-라이신(FK 또는 phe-lys); 또는 N-메틸-발린-시트룰린(Me-val-cit)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린(gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신(gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 단위는 천연 발생의 아미노산 잔기 및 작은 아미노산 및 비-천연 발생의 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 종양-연관 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D 또는 혈장 프로테아제와 같은 특이적 효소의 효소적 절단을 위하여 그들의 선택성이 설계되고 최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 항체(연장(extension) 단위 및/또는 아미노산 단위를 통해서 또는 직접적으로)를 약물 모듈에 연결하는 "스페이서(spacer)" 단위일 수 있다. 스페이서 단위는 "자기-희생적(self-immolative)" 또는 "비-자기희생적(non-self immolative)"일 수 있다. "비-자기 희생적" 스페이서 단위는 ADC의 효소적 절단(단백질 가수분해) 후 스페이서 단위가 약물 모듈에 결합된 채로 남는 스페이서 단위의 부분 또는 전부를 지칭한다. 비-자기 희생적 스페이서 단위의 예는 글리신 스페이서 단위 및 글리신-글리신 스페이서 단위를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 서열-특이적 효소 절단에 취약한 펩티드 스페이서의 기타 조합도 또한 고려된다. 예를 들어, 종양-세포-연관 프로테아제에 의한 글리신-글리신 스페이서 단위-함유 ADC의 효소적 절단은 ADC의 나머지로부터 글리신-글리신-약물 모듈의 방출을 초래할 것이다. 이러한 일 실시양태에서, 글리신-글리신-약물 모듈은 종양 세포 내 독립된 가수분해 단계를 겪게 되고, 이에 따라 약물 모듈로부터 글리신-글리신 스페이서 단위가 절단된다.
"자기-희생적" 스페이서 단위는 독립된 가수분해 단계 없이 약물 모듈의 방출을 허용한다. 특정 실시양태에서, 링커의 스페이서 단위는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 이러한 일 실시양태에서, p-아미노벤질 알콜은 아미드 결합을 통해 아미노산 단위에 부착되고, 이에 따라 벤질 알콜 및 세포독성제 사이에 카바메이트, 메틸카바메이트 또는 카보네이트를 형성한다. 예를 들어 Hamann et al, (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15: 1087-1103를 참고. 일 실시양태에서, 스페이서 단위는 p-아미노벤질옥시카보닐(PAB)이다.
본 발명에서 예시적인 링커는 다음과 같다:
Figure pct00017
연장, 스페이서 및 아미노산 단위를 포함하는 링커는 US 2005-02386949 A1에 기술된 바와 같이, 당업계에 알려진 방법에 의해 합성될 수 있다.
예시적인 약물 모듈
마이탄신(Maytansine) 및 마이탄시노이드(maytansinoid) 알칼로이드
일부 실시양태에서, 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물은 하나 이상의 마이탄시노이드 분자에 컨쥬게이트된 발명의 항체를 포함한다. 마이탄시노이드는 튜불린 다량체화를 억제함으로써, 작용하는 유사분열 억제제이다. 마이탄신은 본래 동아프리카 관목 마이티안 나무(Maytian tree)(Maytenus serrate)로부터 분리된다(US 특허 제3,896,111호). 일부 미생물이 또한 마이탄시놀 및 C-3 아데포비르(C-3 adefovir)와 같은 마이탄시노이드 알칼로이드를 생성하는 것은 차후에 발견되었다(US 특허 제4,151,042호).
마이탄시노이드 약물 모듈은 그들이 (i) 발효 또는 발효 생산물로부터 화학적으로 변형되거나 유도체화되기 상대적으로 쉽고; (ii) 비-이황화 링커를 통해 항체에 커플링하기에 적절한 작용기로 유도체화되기 쉽고; (iii) 혈장 내 안정하고; 및 (iv) 다양한 종양 세포주에 효과적이기 때문에 항체-약물 컨쥬게이트 내 매력적인 약물 모듈이다.
마이탄시노이드 알칼로이드 약물 모듈로서 사용하기에 적절한 마이탄신 화합물은 당업계에 잘 알려져 있고 공지된 방법에 따라 천연 자원으로부터 분리될 수 있고, 또는 유전 공학 기술을 사용하여 생산될 수 있다(Yu et al (2002) PNAS 99: 7968-7973 참고). 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체는 또한 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
마이탄시노이드 알칼로이드 약물 모듈의 예시적인 실시양태는 본원에서 개시된 바와 같이 DM1, DM3 및 DM4를 포함한다.
아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시양태에서, 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물은 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 또는 유도체(예를 들어, 아우리스타틴)에 컨쥬게이트된 본 발명의 항체를 포함한다(U.S. 특허 제5,635,483호; 제5,780,588호). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 동역학, GTP 가수분해 및 핵 및 세포 분할(Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584), 및 항암 활성(U.S. 특허 제5,663,149호) 및 항진균 활성(Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965)을 간섭하는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모듈은 펩티드 약물 모듈의 N (아미노) 말단 또는 C (카복시) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다(WO02/088172).
아우리스타틴의 예시적인 투여 요법은 N-말단 연결된 모노메틸 아우리스타틴 약물 모듈 DE 및 DF를 포함하고, 이는 Senter et al, Proceedings of the American Association for CancerResearch, volume 45, abstract number 623, March 28, 2004에 개시되어 있으며, 개시내용은 그 전체가 참조로서 본원에 명확히 통합된다. 펩티드 약물 모듈은 하기와 같이 일반식 DE 및 DF 중에서 선택될 수 있다:
Figure pct00018
Figure pct00019
여기서 DE 및 DF의 물결선은 항체 또는 항체-링커의 공유 부착 부위를 가리키고, 각각의 부위는 서로 독립적이다:
R2는 H 및 C1-8 하이드로카빌 중에서 선택되고;
R3는 H, C1-C8 하이드로카빌, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 하이드로카빌-아릴, C1-C8 하이드로카빌-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 하이드로카빌-(C3-C8 헤테로사이클)로 구성된 군 중에서 선택되고;
R4는 H, C1-C8 하이드로카빌, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 하이드로카빌-아릴, C1-C8 하이드로카빌-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 하이드로카빌-(C3-C8 헤테로사이클)로 구성된 군 중에서 선택되고;
R5는 H 및 메틸 중에서 선택되고;
또는 R4 및 R5는 식 -(CRaRb)n-의 카보사이클을 형성하고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 H, C1-C8 하이드로카빌 및 C3-C8 카보사이클로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택되고, 및 n은 2, 3, 4, 5 및 6 중에서 선택되고;
R6는 H 또는 C1-C8 하이드로카빌 중에서 선택되고;
R7는 H, C1-C8 하이드로카빌, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 하이드로카빌-아릴, C1-C8 하이드로카빌-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 하이드로카빌-(C3-C8 헤테로사이클)로 구성된 군 중에서 선택되고;
각 R8은 독립적으로 H, OH, C1-C8 하이드로카빌, C3-C8 카보사이클 및 O-(C1-C8 하이드로카빌)로 구성된 군 중에서 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 하이드로카빌 중에서 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로사이클 중에서 선택되고;
Z는 O, S, NH 또는 NR12 중에서 선택되고, 여기서 R12는 C1-C8 하이드로카빌이고;
R11은 H, C1-C20 하이드로카빌, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14 및 -(R13O)m-CH(R15)2로 구성된 군 중에서 선택되고;
M은 1-1000 중에서 선택된 정수이고,
R13은 C2-C8 하이드로카빌이고;
R14는 H 또는 C1-C8 하이드로카빌이고;
R15는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 하이드로카빌로 구성된 군 중에서 선택되고;
R16은 각각 독립적으로, H, C1-C8 하이드로카빌 또는 -(CH2)n-COOH로 구성된 군 중에서 선택되고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클) 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카보사이클) 중에서 선택되고; 및
n은 0 내지 6에서 선택되는 정수이다.
식 DE의 예시적인 아우리스타틴, 실시양태는 MMAE이고, 여기서 물결선은 항체-약물 컨쥬게이트에 공유적으로 부착된 링커(L)를 가리킨다:
Figure pct00020
MMAE
식 DF의 예시적인 아우리스타틴, 실시양태는 MMAF이고, 여기서 물결선은 항체-약물 컨쥬게이트에 공유적으로 부착된 링커(L)를 가리킨다(US2005/0238649 및 Doronina et al (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124 참고):
Figure pct00021
MMAF
기타 약물 모듈은 다음 중에서 선택된 MMAF 유도체를 포함하고, 여기서 물결선은 항체-약물 컨쥬게이트에 공유적으로 부착된 링커(L)를 가리킨다:
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
일 측면에서, 친수성기는 R11에서 약물 모듈에 부착될 수 있고, 여기서 상기 친수성기는 상술된 바와 같이 트리에틸렌 글리콜 에스테르(TEG)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 임의의 특정 이론에 제한되지 않고, 친수성기는 약물 모듈의 내재화(internalization) 및 비-응집에 기여한다. 일반식 I의 ADC의 예시적 실시양태는 아우리스타틴/돌라스타틴 또는 이의 유도체를 포함하고, 이들은 본원에 참조로서 명백히 통합되는 US2005-0238649A1 및 Doronina et al (2006) Bioconjugate Chem.17:114-124에 기술되어 있다. MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커를 포함하는 일반식 I의 ADCs의 예시적 실시양태는 다음 구조 및 약어를 갖는다(여기서 “Ab”는 항체이고; p는 1 내지 약 8의 범위이고, “Val-Cit”는 발린-시트룰린 디펩티드이고; 및 “S”는 황 원자이다):
Figure pct00025
전형적으로, 펩티드-계 약물 모듈은 둘 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 기술에 잘 알려진 액체상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다(E. Schroder and K.Lubke, The Peptides, volumn 1, pp 76-136, 1965, Academic Press를 참고). 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모듈은 다음 문헌에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다: US2005-0238649A1; US 특허 제5635483호; US 특허 제5780588호; Pettit et al(1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R. et al, Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; 및 Doronina(2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784.
특히, MMAF 및 이의 유도체와 같은 일반식 DF의 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모듈은 US2005-0238649A1 및 Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. MMAE 및 이의 유도체와 같은 일반식 DE의 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모듈은 Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF 및 MC-vc-PAB-MMAE의 약물-링커 모듈은 Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784 및 U.S. 특허출원 공개 제US2005/0238649호 A1에 기재된 것들과 같은 전통적인 방법에 의해 편리하게 합성될 수 있고, 관심 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
약물 로드(Drug load)
약물 로드(로딩, loading)는 y, 즉, 식 I의 분자 내 항체당 약물 모듈의 평균 수로 표현된다. 약물 로드는 항체당 1 내지 20 약물 모듈(D)의 범위일 수 있다. 식 I의 ADC는 다양한 (1-20) 약물 모듈에 컨쥬게이트된 항체의 집합체(collection)를 포함한다. 커플링 반응으로 얻은 ADC 제제 내 항체당 약물 모듈의 평균 수는 질량 분석법, ELISA 검정 및 HPLC와 같은 전통적인 방법으로 특징지어질 수 있다. y의 측면에서 ADC의 정량적 분포를 확인하는 것도 가능하다. 일부 경우에서, 특정 p 값을 갖는 동종의(homogenous) ADC는 다른 약물 로드의 ADC로부터 분리된 후 정제되고 특징지어지며, 이는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 방법으로 달성될 수 있다.
일부 항체-약물 컨쥬게이트에 대하여, y는 항체 상 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 티올이 부착되면, 상기 실례가 되는 실시양태에서와 같이, 항체가 오로지 하나 또는 몇 개의 시스테인 티올기를 가질 수 있고 또는 링커에 부착될 수 있는, 오로지 하나 이상의 반응성 티올기를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 더 높은 약물 로드는, 예컨대 y>5는 응집, 불용성, 독성 또는 특정 항체-약물 컨쥬게이트의 세포 투과성의 손실을 초래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ADC의 약물 로드는 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4; 약 3.1 내지 약 3.9; 약 3.2 내지 약 3.8; 약 3.2 내지 약 3.7; 약 3.2 내지 약 3.6; 약 3.3 내지 약 3.8; 또는 약 3.3 내지 약 3.7의 범위이다. 사실, 일부 ADC에 대해서, 각 항체 약물 모듈의 최적의 비는 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있는 것으로 나타났다. US2005-0238649A1 (이의 전체 내용이 본원에 참조로 통합된다)를 참고.
특정 실시양태에서, 이론적인 최대치 미만을 갖는 약물 모듈은 커플링 반응에서 항체와 연결된다. 항체는 예를 들어 이하 설명되듯이 약물-링커 중간체 또는 링커제(linking agent)와 반응하지 않는 라이신 잔기를 포함할 수 있다. 오로지 가장 반응성인 라이신기가 아민-반응성 링커제와 반응할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모듈에 연결될 수 있는, 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올기를 함유하지 않고; 사실, 항체 내 대부분의 시스테인 티올기는 이황화 브릿지(bridge)의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 항체는 부분적으로 또는 완전히 환원인 조건 하 반응성 시스테인 티올기를 생성하기 위하여 디티오트레이톨(DTT), 또는 트리카보닐 에틸 포스핀(TCEP)와 같은 환원제로 환원될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 라이신 또는 시스테인과 같은 반응성 친핵성기를 노출하기 위하여 변성 조건에 놓인다.
시스테인 잔기의 수 및 위치가 링커-약물 부착의 수 및/또는 위치를 조절하기 위해 변경될 수 있도록(본 발명 및 WO2006/034488 (본원에서 그 전체가 참조로 통합됨) 내 기술된 것들과 같이 제조된 thioMab 또는 thioFab과 같이), ADC의 약물 로드(약물/항체 비, DAR)는 다양한 방법, 예를 들어: (i) 약물-링커 중간체 또는 링커제의 몰 초과를 제한하는 것; (ii) 커플링 반응의 시간 또는 온도를 제한하는 것; (iii) 시스테인 티올의 변형을 제한하거나 환원 조건을 제한하는 것; (iv) 재조합 기술로 항체의 아미노산 서열을 조작하는 것에 의해 조절될 수 있다.
하나 이상의 친핵성기가 약물-링커 중간체 또는 링커 및 이후 약물 모듈제와 반응하면, 생성된 생산물은 항체의 분포에 부착된 하나 이상의 약물 모듈을 갖는 ADC 화합물 혼합물인 것으로 이해되어야 한다. 항체당 약물의 평균 수는 항체-특이적 및 약물-특이적 항체와 관련된 ELISA 검정에 의해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 혼합물 내 다양한 ADC 분자는 질량 분석법에 의해 확인될 수 있고, HPLC, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 로드 값을 갖는 동종(homogeneous) ADC는 전기영동법 또는 크로마토그래피에 의해 커플링 혼합물로부터 분리될 수 있다.
항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물을 제조하는 방법
일반식 I의 ADC는 다음을 포함하는 당업자에게 알려진 유기 화합물 반응, 조건 및 시약을 사용하여 몇가지 경로로 제조될 수 있다: (1) 항체의 친핵성기를 이가 링커제와 반응시켜 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성하고, 이어서 약물 모듈 D와 반응시킨다; 및 (2) 약물 모듈의 친핵성기를 이가 링커제와 반응시켜 공유결합을 통해 D-L을 형성하고, 이어서 항체의 친핵성기와 반응시킨다. 후자 경로를 통해 식 I의 ADC를 제조하는 예시적인 방법은 US2005-0238649A1에 기술되어 있고, 이는 본원에 참조로 명백히 통합된다.
항체의 친핵성기는 (i) N-말단 아민기; (ii) 라이신과 같은 측쇄 아민기; (iii) 시스테인과 같은 측쇄 티올기; 및 (iv) 글리코실화 항체 내 당류의 아미노기 또는 하이드록실기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 하이드록실기는 친핵성이고 공유결합을 형성하기 위하여 링커 모듈 상의 친전자기와 반응할 수 있고, 링커제(linking agent)는: (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트(haloformates) 및 애씨드 할라이드(acid halides); (ii) 하이드로카빌 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실기 및 말레이미드기를 포함한다. 일부 항체는 시스테인 브릿지(bridge)인 환원가능한 쇄간 이황화물을 갖는다. 항체는 링커와 커플링 반응성을 제공하기 위하여 DTT (디티오트레티올) 또는 트리카보닐 에틸포스핀(TCEP)와 같은 환원제로 처리하여 완전하게 또는 부분적으로 환원될 수 있다. 각 시스테인 브릿지는 이론적으로 두 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 대안으로, 설포하이드릴기는 예를 들어, 라이신 잔기를 2-이민 설판(imin sulfane)(트라우트 시약, Traut reagent)과 반응함으로써, 라이신 잔기의 변형을 통해 항체 내로 도입될 수 있고, 티올로의 아민의 전환을 초래할 수 있다.
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트는 또한 항체 상의 친전자기(예를 들어, 알데히드 또는 케톤 카보닐기) 및 링커 또는 약물 상 친핵성기 사이의 반응에 의해 생산될 수 있다. 링커 상의 유용한 친핵성기는 하이드라자이드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴하이드라자이드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 당류는 예를 들어, 과옥소산염 산화제(periodate oxidant) 으로 산화되어 링커 또는 약물 모듈의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프 염기(Schiff base)는 안정한 연결을 형성할 수 있거나 예를 들어 수소화붕소(borohydride) 시약으로 환원되어 안정한 아민 연결을 형성할 수 있다. 일 실시양태에서, 글리코실화 항체의 카보하이드레이트 모이어티와 갈락토스 옥시다제 또는 소듐 메타페리오데이트의 반응은 항체 내 카보닐기(알데히드기 및 케토기)를 생산할 수 있고, 이는 약물 상 적절한 기와 반응될 수 있다(Hermanson, Bioconjugate Techniques). 다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 항체는 소듐 메타페리오데이트와 반응할 수 있고, 첫 번째 아미노산에서 알데히드의 형성을 초래할 수 있다(Geoghegan and Stroh,(1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US5362852). 그러한 알데히드는 약물 모듈 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
약물 모듈 상의 친핵성기는 아민, 티올, 하이드록시, 하이드라자이드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴하이드라자이드기를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 이들은 공유 결합을 형성하기 위하여 링커 모듈 상 친전자성기와 반응할 수 있다. 또한 링커제(linking agent)는 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트(halofoamates) 및 애씨드 할라이드(acid halides); (ii) 하이드로카빌 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실기 및 말레이미드기를 포함한다.
본 발명의 화합물은 다음 가교제(crosslinking agents)에 의해 제조되는 ADC를 분명히 커버하나, 이에 제한되지 않는다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트), 이들은 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, Pierce Biotechnology,Inc., Rockford, IL., U.S.A, 2003-2004 Application Manual 및 제품 카탈로그(2003-2004 Applications Handbook and Catalog) 페이지 467-498)를 참조하라).
항체 및 세포독성제를 함유하는 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 화합물은 다양한 이작용성 단백질 커플링 시약, 예를 들어 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 아미노설판(IT), 이미데이트(imidates)(예컨대 디메틸 아디파미드(dimethyl adipamide HCl)), 활성 에스테르(예컨대 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate)), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드(glutaraldehyde)), 비스 아지드 화합물(bis azide compounds) (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥사메틸렌 디아민), 비스 디아조 유도체(bis diazo derivatives)(예컨대 비스 (p-디아조 벤조일)-에틸렌디아민), 디이소티오시아네이트(diisothiocyanate)(예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 이중 활성 플루오린 화합물(dual active fluorine compounds)(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소(ricin immunotoxins)는 Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 카본-14-표지된 1-이소티오시아네이트 벤질-3-메틸 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 커플링하기 위한 예시적인 킬레이트 시약이다. WO94/11026을 참고.
대안으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질이 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성으로 제조될 수 있다. 재조합 DNA 분자는 각각 서로 인접하거나 링커 펩티드를 암호화하는 영역으로 분리된, 컨쥬게이트의 항체 및 세포독성 모이어티를 각각 암호화하는 영역을 포함할 수 있고, 여기서 상기 링커 펩티드는 컨쥬게이트의 원하는 특성을 파괴하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 종양을 미리-표적화(pre-targeting)하기 위해 "수용체"(예컨대 스트렙타비딘(streptavidin))로 컨쥬게이트될 수 있고, 항체-수용체 컨쥬게이트는 환자에게 투여되고, 이어서 순환으로 결합하지 않은 컨쥬게이트를 제거하는 스캐빈저(scavenger)를 사용한다. 그리고 나서, 세포독성제(예컨대, 방사성 뉴클레오티드)에 연결된 "리간드"(예를 들어 아비딘)가 투여된다. 다음의 실시예들은 오로지 실례를 보여줄 목적으로 제공되는 것이지 본 발명의 범위를 제한하기 위함은 아니다.
도 1은 본 발명의 항-c-Met 항체 및 ADC 분자의 종양 억제 효과를 나타내며, 결과는 ADC의 새로운 분자가 부착된 독소에 의해 종양의 완전한 억제를 달성할 수 있고, 반면 항체 단독으로는 그러한 완전한 억제를 달성할 수 없음을 보여준다. 결과는 또한 독소와의 커플링은 본 발명에서의 ADC 분자의 T1/2에 영향을 미치지 않고, 본 발명의 ADC 약물이 마우스에서 생체내 독성을 나타내지 않음을 보여준다.
이하, 본 발명은 실시예와 관련하여 더 설명된다. 그러나, 본 발명의 범위는 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에서, 특별한 조건이 기술되지 않을 때, 실험은 일반적으로 전통적인 조건 하에서, 또는 재료 또는 제품의 제조사에 의해 제안되는 조건에 따라 수행된다. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY를 참고. 시약의 출처가 구체적으로 주어지지 않으면, 그 시약은 상업적으로 이용가능하다.
실시예
실시예 1. 항원성 항체 클론성 발현(Antigenic antibody Clonal expression)
본 발명에서 사용된 항체(경쇄 및 중쇄) 및 항원은 당업계에 공지된 overlapping extension PCR 방법에 의해 구축된다. overlapping extension PCR에 의해 얻은 DNA 단편을 HindIII/BstBI을 사용하여 발현 벡터 pEE6.4 (Lonza Biologics)로 삽입하고 293F 세포(Invitrogen, Cat # R790-07) 내에서 발현시켰다. 생성된 재조합 단백질은 면역화 또는 스크리닝에 사용한다. c-Met 유전자 주형(template)은 origene Corporation (제품 번호 RC217003)에서 유래된다. 복제 및 발현되는 DNA 서열은 다음과 같다.
인간 c-Met 세포외 영역(ECD) 및 쥐(murine) Fc 영역 융합 단백질(인간 c-Met ECD-mFc) DNA 서열:
Figure pct00026
Figure pct00027
인간 c-Met 세포외 Sema 영역 및 Flag-His tag (인간 c-Met Sema-Flis) DNA 서열:
Figure pct00028
Figure pct00029
인간 c-Met ECD his tag (인간 c-Met ECD-His) 재조합 단백질 DNA 서열:
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
실시예 2. 항체 및 항원 결합 검정(ELISA)
본 실험은 시험관 내에서(재조합적으로 발현된 단클론 항체 또는 혼성세포의 상청액 포함) c-Met 항체의 c-Met 항원에 대한 친화도를 검출하기 위해 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용한다.
실험 과정: 코팅 완충액(PBS; Hyclone, Cat No.: SH30256.01B)을 사용하여 항원(인간 c-Met-His, 실시예 1)을 2 μg/ml로 희석하고, 이를 100μl/well (Costar 9018, Cat No.:03113024)로 96-웰 플레이트에 가하고 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 96-웰 플레이트를 실온으로 회복시키고 세척 완충액(PBS+0.05% 트윈 20 (시그마, Cat No.:P1379))으로 세 번 세척하였다. 차단 완충액을 200 μl/well (PBS+1%BSA (Roche, Cat No.:738328))로 첨가하고 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 플레이트를 세척 완충액으로 세 번 세척하였다. 시험될 항 c-Met 항체를 96-웰 플레이트에 가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서 플레이트를 세척 완충액으로 세 번 세척하였다. 차단 완충액(10000× 희석)으로 희석한 이차 항체(염소 항-마우스 IgG(H+L)(HRP)(Thermo, No.:31432))를 100 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서 플레이트를 세 번 세척하고, TMB 발색성(chromogenic) 기질(eBioscience REF:00-4201-56)을 96-웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 가하였다. 정지 용액 2N H2SO4를 100 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 가하였다. 플레이트 판독기로 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.
실시예 3. 항-인간 c-Met의 쥐( murine ) 단클론 항체의 생산
본 발명은 면역 마우스(immunizing mice), 비장 세포의 융합 및 혼성세포의 스크리닝에 의해 쥐(murine) 항-인간 c-Met 단클론 세포주를 얻는다. 이 방법은 이 분야에 잘 알려져 있다. 재조합적으로 발현된 항원(인간 c-Met ECD-mFc, 인간 c-Met Sema-flis, 실시예 1을 참고)을 PBS(Hyclone, Cat No.:SH30256.01B)로 1 mg/ml로 희석하고 프로이드 보조제(Freund's adjuvant)로 유화시키고(첫 번째 면역법(immunization)은 프로이드의 완전한 보조제로 수행하였고, 다른 부스터 면역법은 프로이드의 불완전한 보조제로 수행하였다); 및 Balb/C 마우스 내로 피하 주사하였고(5 마우스/군), 각 마우스는 100 ㎍ 항원으로 접종하였고, 부스터 면역법은 매 이주마다 실시했다. 첫 번째 부스터 면역법 이래로 마우스 혈청을 각 부스터 면역법 후 7일 내지 10일 동안 수집하였고, 이의 역가(titer)는 ELISA (방법은 실시예 2에 있다)에 의해 검출하였다.
면역법 후, 1:105 보다 높은 혈청 역가를 가진 마우스를 융합을 위해 선별하였다. 마우스 B-세포 및 골수종 세포(SP2/0, ATCC number:CRL-1581TM)를 각각 무균 조건으로 제조하였고, 숫자를 세었다. 두 종류의 세포를 B-세포:SP2/0을 1:4의 비율로 혼합하고, 원심분리하였다(1500r/분, 7분). 상청액을 버리고, 1 ml의 50% 폴리에틸렌 글리콜(공급자: SIGMA, Catalogue# RNBB306)을 가하였다. 그 다음, 1 ml의 혈청이 없는 RPMI1640 (공급자: GIBCO, Catalogue#C22400)을 종결을 위해 사용하였고, 10분 동안 원심분리하였다. 그리고 나서 상청액을 버렸다. 펠렛을 혼성세포 세포 성장 인자(공급자: Roche, Catalogue# 1363735001), 혈청(공급자: GIBCO, Catalogue#C20270) 및 HAT (공급자: Invitrogen, Catalogue# 21060-017)을 포함하는 RPMI1640에 재현탁시켰다. B-세포를 플레이트 상에 105/웰로 위치시켰고, 각 웰은 100 ㎕이다. 플레이트를 37℃에서 세포 인큐베이터에 위치시켰다. 3일 후, 혼성세포 세포 성장 인자, 혈청 및 HT (공급자: Invitrogen, Catalogue# 11067-030)를 포함하는 100 ㎕의 RPMI1640를 각 웰에 첨가하였다. 2 내지 4일 후, 각 웰을 혼성세포 세포 성장 인자, 혈청 및 HT를 포함하는 150 ㎕의 RPMI1640로 교체하였다. 다음 날, 양성 클론을 ELISA로 검출하였다(실시예 2의 방법을 참고). 결과는 표 1에 나타나 있다.
표 1. 인간 c-Met 면역화 마우스 내 혼성세포 융합의 검출
Figure pct00033
실시예 4. 위암 세포 MKN45의 증식에 대한 항-인간 c-Met 단클론 항체의 억제 효과
단클론을 얻기 위해 상기 클론을 선별하고 더 배양하였다. ELISA에 의한 결합 활성 검증 후, 단클론을 배양을 위해 선별하고, 생성된 상청액을 세포 생존력 검정 대상으로 삼았다. 실험 원리에 따르면, 본 발명의 항-인간 c-Met 항체는 인간 위암 세포 MKN45의 표면 상 발현되는 c-Met의 인산화를 억제할 수 있고, 이에 따라 MNK45 세포의 증식을 억제한다.
인간 위암 세포(MKN45, JCRB, JCRB0254, P11)를 96-웰 세포 배양 플레이트(costar, #3799)에 1×105 세포/mL 및 50㎕/웰로 가하였다. 배지는 RPMI1640 배지: (GIBCO, cat#11835) +10%FBS (GIBCO-10099141)이다. 시험될 항-인간 c-Met 항체는 50 ㎕/웰로 가하였고, 37℃에서 인큐베이터(제조사: SANYO; Equipment No. TINC035)에서 5일 동안 배양하였다. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega, G7573)를 사용하였고, 세포 증식은 지시내용에 따라 검출하였다. 플레이트는 PerkinElmer 플레이트 판독기, TREA001-RDA-IBA100로 판독하였다. 세포 증식 백분율을 계산하기 위해 다음 식을 사용하였다: % 세포 백분율 = (1-실험군 내 세포 판독/미처리군 내 세포 판독)×100%. 결과는 표 2에 있다.
표 2. 항-인간 c-Met mAb 세포 생존력
Figure pct00034
실시예 5. 항 c-Met 항체 서열 클로닝
실시예 4에서 얻은 좋은 생존력을 가진 단일 세포주 Ab-5를 cDNA 서열 클로닝을 위해 선별하였다. Mab를 재조합적으로 발현하였고 다양한 활성 시험의 대상으로 삼았다. 항체 유전자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 역전사 PCR로 증폭시켰고, 벡터에 연결시켜 시퀀싱에 의해 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 얻었다. 무엇보다, RNA 정제 키트(Qiagen company, No.74134, 이 과정에 대해서 지시내용을 참고)를 사용하여 실시예 4로부터 활성 단일 세포주의 모든 세포 RNA를 추출하였다. 그 다음, cDNA 단일쇄를 cDNA 합성 키트((Invitrogen company, No.18080-051)에 의해 제조하였고, 이는 Oligo-dT 프라이머 cDNA 역전사이다. 생산물을 주형으로 제공하였고, 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 PCR 방법으로 합성하였다. PCR 생산물을 TA 벡터 pMD-18T로 복제하였고 배열 순서를 밝혔다. 얻어진 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 별도로 발현 벡터에 복제하였고(실시예 1을 참고), 단클론 항체를 재조합적으로 발현하여 그의 활성을 증명하였으며(실시예 2 및 4를 참고), 이어서 인간화하였다.
마우스 혼성세포 세포 단클론 항체 Ab-5의 서열:
중쇄 가변 영역:
Figure pct00035
경쇄 가변 영역
Figure pct00036
항-인간 c-Met 항체의 VH/LH CDR의 아미노산 잔기를 확인하고 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 의해 주석을 달았다.
본 발명 내 마우스-기원의 CDR 서열은 표 3에 나타냈다:
표 3. 마우스-기원 항-스클러로스틴(sclerostin) 항체의 CDR 서열
Figure pct00037
실시예 6. 항 c-Met 항체의 인간화
실시예 5에서 얻은 마우스 기원의 항 c-Met 단클론 항체 중쇄 및 경쇄 서열을 상동성에 대한 항체 데이타베이스에 대비하여 정렬하였고, 인간화 항체 모델을 확립하였다. 모델에 따라서, 최적의 인간화 c-Met 단클론 항체를 환원 유전 돌연변이(reversion mutation)에 따라 본 발명의 바람직한 분자로 선별하였다. 얻어진 쥐 후보 분자를 가진 유사한 상동성을 보여주는 결정 구조를 마우스 Fab 결정 구조 모델의 공개 데이타베이스(예를 들어, PDB 데이타베이스)로부터 선별하였고, 고해상도를 갖는 Fab 결정 구조(예컨대, 2.5 Å 미만)를 선별하였고; 마우스 Fab 모델을 확립하였다. 본 발명의 쥐 항체 중쇄 및 경쇄 서열을 모델 내 서열에 대하여 정렬하였고, 일정한(consistent) 서열을 유지시킨 다음 본 발명의 마우스 항체의 구조 모델을 얻을 수 있었다. 불일치하는 아미노산은 복귀 돌연변이(reverse mutation)에 대한 잠재적 부위일 수 있다. Swiss-pdb 뷰어 소프트웨어를 사용하여 마우스 항체 구조 모델을 실행하여 에너지를 최적화(최소화)하였다. 복귀 돌연변이(reverse mutation)는 모델의 CDR 내의 것과 다른 아미노산 부위에서 수행되었고, 생성된 인간화 항체는 활성을 검출하기 위하여 인간화되기 전의 것과 정렬되었다. 좋은 활성을 갖는 인간화 항체가 유지되었다. 그리고 나서, CDR 영역을 글리코실화, 탈아민화(deamination), 산화 부위 등을 피하는 것을 포함하여, 더 최적화시켰다. 최적화된 인간화 항 c-Met 항체의 CDR 영역은 표 4에 나타냈다:
표 4. 최적화된 항 c-Met 항체의 CDR 서열
Figure pct00038
인간화 중쇄 및 경쇄 서열의 가변 영역을 아래 나타낸다:
1. 중쇄 가변 영역
Ab-9
Figure pct00039
Ab-10
Figure pct00040
Ab-11
Figure pct00041
2. 경쇄 가변 영역
Ab-9
Figure pct00042
Ab-10
Figure pct00043
Ab-11
Figure pct00044
인간화 중쇄 및 경쇄 서열을 IgG Fc 영역과 재조합하여 본 발명의 인간화 항 c-Met 단클론 항체를 얻었다. 사용한 Fc 서열은 선택적으로 다음 서열로부터 선별하였다:
중쇄 불변 영역:
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
경쇄 불변 영역:
Figure pct00048
상기 항체를 유전자 클로닝, 및 재조합 발현 각각에 의해 복제하고 발현 및 정제하였다. 최고의 활성을 갖는 인간화 항체 Ab-9, Ab-10, Ab-11을 최종적으로 ELISA (실시예 2) 및 시험관내 결합 활성 검정(실시예 7)을 통해 선별하였다. 서열은 아래와 같다:
Ab-9 인간화 항체:
중쇄:
Figure pct00049
경쇄:
Figure pct00050
Ab-10 인간화 항체
중쇄:
Figure pct00051
경쇄:
Figure pct00052
Ab-11 인간화 항체
중쇄:
Figure pct00053
경쇄:
Figure pct00054
실시예 7. 항 c-Met 인간화 항체의 결합의 시험관내 활성 검출
본 발명의 인간화 항체는 ELISA (실시예 2)에 의해 그의 시험관내 활성을 검출하였고, 또한 c-Met 과-발현을 보이는 세포주 MKN45와 그의 결합 및 c-Met 항원(BIACore 검출)에 대한 그의 친화도를 검출하였다. 결과는 표 5 및 표 6에 나타나 있다.
FACS 방법을 사용하여 c-Met 과-발현을 나타내는 세포주 MKN45와의 c-Met 인간화 항체의 결합 활성을 검출하였다.
MKN45 세포(JCRB, Cat No.: JCRB0254)를 10% (v/v) 송아지 태아 혈청(FBS GIBCO, Cat No.: 10099-141) 및 페니실린/스트렙토마이신 용액(GIBCO, Cat No.: 15070-063)을 함유하는 RPMI1640 배지(GIBCO, Cat No.: 11835-030)에서 10000,000 세포/mL에 도달하도록 재현탁하였다. 2 mL의 재현탁한 MKN45 세포를 96-웰 미세적정 플레이트(Corning, Cat No.: 3799)에 150000 세포/웰로 가하였고, 8 농도의 c-Met 항체(5배 농도구배 희석, 20 ㎍/ml에서 시작)를 상응하는 웰에 가하였고, 최종 용적은 100 ㎕였고, 플레이트는 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액(2.5% (v/v) FBS (Hyclone, Cat: SH30256.01B)를 함유하는 PBS)를 가하였다. 4℃에서 1300 rpm으로 4분 동안 원심분리한 후 상청액을 버렸다. 이 과정을 세 번 반복하였다. 100 ㎕의 이차 항체(1:200 희석한 형광 표지된 염소-항-마우스 이차 항체, Biolegend, Cat No. 405307; 1:30 희석한 형광 표지된 항-인간 이차 항체, Biolegend, Cat No. 409304)를 각 웰에 가하고, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액을 가하고 4분 동안 1300 rpm, 4℃ 이하에서 원심분리하였고, 그리고 나서 상청액을 버렸다; 이 과정을 세 번 반복하였다. 200 ㎕ FACS 완충액을 가하여 세포를 재현탁하였고, 샘플을 제조하고, 플로우 사이토메트리(flow cytometry)(BD FACS Array)로 검출하였다.
c-Met 항원 Sema-His에 대한 c-Met 항체의 친화도는 본 발명에서 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)(SPR)에 의해 검출하였다.
항-마우스 IgG (GE Life Sciences catalog # BR-1008-38) 또는 항-인간 IgG (GE Life Sciences catalog # BR-1008-39) 항체를 각각 소듐 아세테이트 용액 pH 5.0 (GE Healthcare, Cat#BR-1003-51)으로 30 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml으로 희석하였다. 아미노 커플링 키트(GE Life Sciences, Cat#BR100050)를 CM5 칩(GE Life Sciences catalog # BR-1000-12) 상 시험 채널 및 제어 채널에 고정하고 커플링 수준을 15000 RU로 설정하였다. 전기영동용 완충액(Running buffere) PBS (Hyclone, Cat#SH30256.01B) + 0.05% P20 (GE Life Sciences, Cat#BR-1000-54)을 사용하여 c-Met 항체를 1.5 ㎍/ml로 희석하였다. 항원 Sema-His를 전기영동용 완충액(running buffer)으로 200 nM로 희석하였고, 0.78 nM에 도달할 때까지 동일한 완충액으로 1:2 희석으로 희석하였다. 희석한 항체는 30 ㎕/분의 속도로 1분 동안 시험 채널을 통과하였고, 항원은 동일한 속도로 3분 동안 시험 채널 및 제어 채널을 통과하였다. 분리 10분 후, 유속을 10 ㎕/분으로 조정하였고, 재생 완충액(regeneration buffer)이 3분 동안 시험 채널 및 제어 채널을 통과하였다. 이중 공제(double deduction) 후, BiaEvaluation 4.1로 데이타를 맞추었고, 피팅 모델은 1:1 Langmuir 모델이다.
표 5. 인간화 항 c-Met 항체의 결합 활성
Figure pct00055
표 6. MKN45와의 인간화 항 c-Met 항체의 결합 활성; 및 항원에 대한 인간화 항 c-Met 항체의 친화도
Figure pct00056
상기 결과는 인간화 항체의 항원과의 결합 활성이 0.13-8 nM 이내이고, 결과가 사용된 검출 방법에 따라 변화할 수 있음을 보여준다. 결과는 인간화 항 c-Met 항체가 인간화 이전 모 항체의 결합 활성을 유지함을 보여준다.
실시예 8. 항 c-Met 인간화 항체의 시험관내 기능 및 세포 생존력 평가
본 발명의 항체의 기능을 검출하기 위해, 실시예 7에서 c-Met 리간드(간세포 성장 인자, HGF) 및 c-Met 사이의 결합을 차단하는 시험 및 세포 증식 억제 시험(실시예 4)을 수행하여 항체를 평가하였다.
HGF의 c-Met와의 결합은 c-Met 분자의 티로신 인산화 및 c-Met 신호전달 경로의 활성화를 야기한다. HGF를 수용체 c-Met 단백질과의 결합으로부터 차단하는 데 있어서 본 발명의 항 c-Met 항체의 활성(즉, IC50)은 ELISA로 측정한다.
c-Met ECD-mFc (실시예 1)을 2 ㎍/ml의 최종 농도로 PBS (Hyclone, Cat #SH30256.01B)로 희석하고 96-웰 ELISA 플레이트(Costar, cat#2592)를 실온에서 밤새 c-Met ECD-mFc로 코팅하였다. 플레이트를 플레이트 와셔(plate washer)(공급자: BioTex; Model: ELX405; S/N: 251504) 상에서 PBST (PBS+0.05% tween 20, Simga, Cat#P1379)로 세 번 세척하였다. 300 ㎕ 차단 용액 PBS+1%BSA (Roche, Cat #738328)을 96-웰 플레이트에 가하고, 그 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3번 세척한 후, 차단 용액으로 희석한 50 ㎕의 항체를 96-웰 플레이트에 가하고, 그 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 20 ng/ml의 최종 농도로 차단 용액으로 희석한 50 ㎕의 인간 HGF (Sino Biological, #10463-HNAS)을 c-Met 항체를 함유하는 96-웰 플레이트에 가하고, 그 플레이트를 실온에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3번 세척한 후, 100 ng/ml의 최종 농도로 차단 용액으로 희석한 100 ㎕의 비오틴-표지된 항 HGF 항체(R&D, Cat #BAF294)를 96-웰 플레이트에 가하고 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3번 세척한 후, 차단 용액으로 희석한 100 ㎕의 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)(ebioscience, #18-4100-51)를 96-웰 플레이트에 가하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3번 세척한 후, 100 ㎕ 기질(ebioscience, cat#00-4201-56)을 플레이트에 가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎕ 정지 용액(2N H2SO4)를 가하고 데이타를 450 nM 마이프로플레이트 판독기(공급자: Moleculer Devices; Model: MNR0643; Equip ID: TMRP001)로 판독하였다. 데이타 분석은 SoftMax Pro v5로 수행하였다. 결과는 표 7에 나타나 있다.
표 7. 항 c-Met 인간화 항체의 시험관내 기능 및 세포 생존력 평가
Figure pct00057
상기 결과는 본 발명의 인간화 항체가 항원과의 결합 활성을 보유할 뿐만 아니라 항원 및 리간드 사이의 결합을 차단함을 보여준다. 이는 또한 암 세포의 성장 활성 억제를 보여준다.
실시예 9. 항 c-Met 인간화 항체의 효능제 활성 평가
항 c-Met 항체는 HGF/c-Met 결합을 차단하고 c-Met 신호를 활성화시킬 수 있다. 이는 c-Met 항체가 효능제 활성을 가짐을 의미한다. 항 c-Met의 효능제 활성은 본 발명에서 바라는 바가 아니다. 본 발명의 항체가 효능제 활성을 가지는지 검출하기 위해, c-Met 인산화, 전이성 인간 투명 신세포암(human clear renal cell carcinoma)(caki-1)의 증식 및 인간 폐암 H441 세포 이동(migration)을 포함하는 세 가지 실험을 수행하였다. 검출 및 평가를 수행하였다.
HGF의 c-Met에 대한 결합은 c-Met 분자의 티로신 인산화 및 c-Met 신호전달 경로를 활성화시킨다. 그러므로, HGF에 의한 c-Met의 활성화는 효능제 실험의 양성 대조군으로 사용되고, 인간 폐암 세포주 A459를 사용하여 c-Met 티로진 잔기 1349의 유도된 인산화를 평가하였다.
A549 세포를 Ham's F12K, 2 mM 글루타민(Invitrogen, #21127-022), 및 10% (v/v) FBS (GIBCO, #10099141)를 함유하는 용액에 현탁시켰다. 0.2 mL 세포 현탁액을 취하여 96-웰 플레이트(Corning, # 3599)에 가하였고, 세포 농도는 60000 세포/웰이다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2 하 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 96-웰 플레이트 내 배지를 버렸고, 100 ㎕ 저혈청 배지(Ham's F12K + 2mM 글루타민 + 0.5% FBS)를 가했다. 세포는 37℃에서 5% CO2 하 6시간 동안 굶겼다(starved). 항체는 최종 농도 20 ㎍/ml로 상기 저혈청 배지를 사용하여 희석하였다. 양성 대조군 내 HGF 농도는 200 ng/ml이고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 배지를 버렸고, 50 ㎕ 세포 용해 용액(10 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA), 50 nM NaF, 1% (v/v) TRITON-X 100, 프로테아제 억제제(Roche cat # 05892791001), 포스파타제 억제제 칵테일 II (phosphatase inhibitors cocktail II)(Sigma #P5726) 및 포스파타제 억제제 칵테일 III (phosphatase inhibitors cocktail III)(Sigma #P0044)를 플레이트에 가하였다. 세포 용해 후, c-Met 티로신 인산화를 ELISA로 검출하였다. c-Met 캡처(capture) 항체(CST, cat#3148s)를 1:1000 희석으로 PBS로 희석하였고, 그리고 나서 웰당 100 ㎕로 96-웰 ELISA 플레이트(costar, cat#9018)에 가하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.플레이트를 TBS-T로 세 번 세척하고 300 ㎕ 차단 용액(TBS-T plus 2% (w/v) BSA)을 가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS-T로 세 번 세척하였다. 75 ㎕ 세포 차단 용액 및 25 세포 용해물을 가하고 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS-T로 세 번 세척하였고, pY1349 c-Met 항체 (cell signal, #3133)를 1:1000 희석, 웰당 100 ㎕으로 차단 용액으로 희석하였다. 실온에서 인큐베이션 2시간 후, 플레이트를 TBST로 4번 세척하고, HRP 표지된 염소 항 토끼 폴리클로날 항체(cell signaling, cat#7074)를 1:12000으로 차단 용액으로 희석하였다. 웰당 100 ㎕을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS-T로 5번 세척하고, 100 ㎕의 TMB (ebioscience#TMB, 004201)를 각 웰에 가하고 나서, 100 ㎕의 정지 용액(2N H2SO4)를 가하였다. 데이타는 450 nM 마이크로플레이트 판독기(공급자: Moleculer Devices; Model: MNR0643; Equip ID: TMRP001)로 판독하였다. SoftMax Pro v5를 데이타 분석에 사용하였다. 결과는 표 8에 나타나 있다.
Caki-1 세포는 간세포 성장 인자 수용체 c-Met을 발현하고, HGF는 c-Met와 결합하여 Caki-1 세포 증식을 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명의 인간화 항-c-Met 항체 및 HGF 둘다는 Caki-1 세포를 자극하므로 항 c-Met 항체의 효능제 활성이 평가될 수 있다.
Caki-1 세포(Shanghai Branch of Chinese Academy of Science, TCHu135, P12)를 96-웰 배양 플레이트(costar, #3799)에 1000/웰로 가하였다. 배지는 McCoy's 5A (invitrogen, #16600) + 10%FBS (GIBCO-10099141)였고, 조건은 37℃에서 24시간 동안이었다. 그 후, 세포를 24시간 동안 굶겼다(세포 굶주림을 위한 배지는 McCoy's 5A 및 0.5% FBS이다). 굶기고 난 후, 세포를 구배 희석한 항 c-Met 항체(가장 높은 농도가 20 ㎍/ml이다) 및 양성 대조군으로 5일 동안 처리하였고, 세포 증식은 세포 증식 검정 키트(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega, G7573)로 검출하였다. 플레이트는 플레이트 판독기(제조: PerkinElmer device No.: TREA001-RDA-IBA100)로 판독하였다. 세포의 백분율 증식은: 증식% = 시험군 내 세포로부터 얻은 판독/미처리군 내 세포로부터 얻은 판독 ×100%로 계산된다. 결과는 이 항체가 Caki-1 세포의 증식에 아무런 효과를 가지지 않음을 보여준다; 데이타는 표 8에 나타나 있다.
항 c-Met 항체가 효능제 활성을 갖는다면, 세포의 이동 능력이 영향받을 수 있다. c-Met을 발현하는 H441 세포주가 세포 이동에 영향을 미치는 c-Met 항체의 능력을 평가하기 위해 본 발명에 사용된다.
H441 세포(ATCC, Cat No.: HTB-174)를 10% (v/v) FBS (GIBCO, Cat No.: 10099-141) 및 페니실린-스트렙토마이신(GIBCO, Cat No.: 15070-063)을 함유하는 RPMI 1640 배지(GIBCO, Cat No.: 11835-030) 내에 500000 세포/ml로 재현탁하였다.재현탁한 H441 세포를 1 ml/웰로 12-웰 배양 플레이트(Costar, Cat No.3513) 에 가하고 5% CO2 내 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 두 번 세척하고 0.5% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지로 가하고, 5% CO2 내 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 5 ml 팁(tips)으로 각 웰의 바닥을 긁고 플레이트를 저농도 FBS를 함유하는 배지로 한번 세척하고 나서 저농도의 혈청을 함유하는 배지 RPMI 1640 1 ml를 가하였다. 플레이트를 마크하고 4×확대 도립 현미경으로 무작위로 선별한 스크래치 구역을 사진 찍었다. 이 시간을 출발점으로 설정하였다. 세포를 10 ㎍/ml c-Met 항체 또는 HGF 대조군(200 ng/ml)으로 5% CO2 내 37℃에서 16시간 동안 처리하였다. 이후, 4×확대 도립 현미경으로 마크한 스크래치 구역을 사진 찍고, 이 시간을 이동 후의 시간으로 설정하였다. 세포 이동의 백분율은 출발점과 비교한 이동 거리를 출발점과 비교한 시험군의 이동 거리로 나눈 다음 100을 곱하여 측정한다. 결과는 표 8에 나타나 있다.
표 8. 인간화 항 c-Met 항체의 효능제 활성 평가
Figure pct00058
*: 항체 농도는 20 ㎍/ml였고, HGF (200 ng/ml)에 의한 c-Met 인산화의 활성화를 100%로 설정하였다. #: 항체 농도는 20 ㎍/ml였고, HGF (200 ng/ml)에 영향 받은 H441 이동%를 100%로 설정하였다.
상기 결과로부터, 인간화 항체는 낮은(c-Met 인산화, H441 이동 실험 결과) 또는 전혀 없는(20 ㎍/ml의 항체에서 Caki-1 증식 자극은 관찰되지 않았다) 효능제 활성을 나타낸다.
실시예 10. 생체내 항 c-Met 항체의 약리학적 평가
항체의 항종양 활성을 평가하기 위해, BALB/c 누드 마우스 내 피하 이종이식에 의해 얻어진 인간 위암 MKN45 세포 모델을 검출에 사용한다.
MKN45 세포는 RPMI-1640 배지(10% FBS) 상 배양된 단일층이었고, 배양 환경은 5% CO2 중 37℃였다. 대수(logarithmic) 상에서 세포를 세고 수집하였다. 세포를 적절한 농도로 PBS 내 재현탁시켰고 0.1 ml 3×106 세포를 마우스 오른쪽 날개(right wing)(BALB/c 누드 마우스, 암컷, 10-주령, 22-28g, 출처: Shanghai SLAC experimental animal ltd. 면허번호. 2007000548777; 환경: SPF 등급)에 피하 접종하였다. 종양의 평균 용적이 114 ㎣에 도달하였을 때, 무게를 재었고, 종양 용적을 측정하였고, 그리고 나서 마우스를 군으로 분리하고 투여하였다. 대조군은 PBS로 처리하였고, 항체 요법군은 본 발명의 5 mg/kg 항체로 처리하였고 빈도는 일주일에 한 번 및 시간당 두 번이다. 종양의 용적 및 무게를 일주일에 두 번 측정하였고, 실험은 25일째 종결하였다. 종양 크기를 계산하는 식은: 종양 용적(㎣)=0.5×(종양 길이×종양 직경2)이다. 억제율을 계산하는 식은: 억제율=(V0-VT)/V0×100%, 및 V0, VT는 각각 실험 시작 및 끝의 종양 용적이다.
결과는 항체 Ab-9, Ab-10의 억제율이 각각 56% 및 64%임을 보여준다. 실험 도중 마우스 무게의 뚜렷한 변화는 없었다(22-24g). 이 결과는 인간화 항 c-Met 항체가 생체내에서 종양의 성장을 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 11. 항 c-Met 항체의 세포내 섭취
본 발명의 항체는 인간 c-Met에 결합할 수 있고, 매우 훌륭한 생체내 활성을 갖고, 생체내에서 종양 활성을 억제한다. 게다가, 항체가 효능제 활성을 갖지 않거나 매우 약한 효능제 활성을 갖는다. 항체가 일단 인간 c-Met에 결합하여 인간 c-Met과 함께 세포 내로 섭취될 수 있는지 검출하기 위해 c-Met을 발현하는 인간 위암 세포 MKN45 (JCRB, Cat No.: JCRB0254)를 평가에 사용하였다.
MKN45 세포를 10%(v/v) FBS (GIBCO, Cat No.: 10099-141) 및 페니실린-스트렙토마이신(GIBCO, Cat No.: 15070-063)을 함유하는 RPMI 1640 배지(GIBCO, Cat No.: 11835-030)에 10000,000 세포/mL로 재현탁하였다. 2 mL의 재현탁한 MKN45 세포를 250,000 세포/웰로 96-웰 미세적정 플레이트에 가하고, 10 ㎍/ml의 c-Met 항체를 상응하는 웰에 가하였고, 최종 용적은 100 ㎕이고, 플레이트를 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. FACS 완충액(2.5% 우태아혈청을 포함하는 인산 완충 용액; Hyclone, Cat: SH30256.01B)을 가하고 4℃, 1300 rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버렸고, 이 과정을 세 번 반복하였다. 100 ㎕의 이차 항체 용액(1:200 희석으로 형광 표지된 염소 항 마우스 이차 항체, Biolegend, Cat No. 405307; 1:30 희석으로 형광 표지된 항-인간 이차 항체, Biolegend, Cat No. 409304)을 각 웰에 가하였다. 플레이트를 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. FACS 완충액을 가하고 4℃, 1300 rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버렸고, 이 과정을 세 번 반복하였다. 완전 세포 배양 배지(10% FBS를 갖는 RPMI 1640 배지)를 가하고 0, 0.5, 1, 2, 4시간 동안 5% CO2 내 37℃에서 인큐베이션하였다. 5 ㎕ 7-AAD (Biolegend, Cat:420403)를 100 ㎕ FACS 완충액 각 웰에 가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액을 가하고 4℃, 1300 rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 이 과정을 세 번 반복하였다. 200 ㎕ 스트리핑 완충액(stripping buffer)(1:1(v/v)에 따라 혼합한 0.05 M 글리신, pH 3.0; 0.1 M NaCl)을 각 웰에 가하였다. 세포를 재현탁하고 실온에서 7분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 실온에서 4분 동안 1300 rpm으로 원심분리하고 상청액을 버렸다. 200 ㎕ 중화(neutralizing) 세척 완충액(0.15 M 트리하이드록시메틸 아미노메탄, pH 7.4)를 각 웰에 가하고, 상청액을 버렸다. 200 ㎕ FACS 완충액을 가하고 세포를 재현탁시켰다. 샘플을 제조하고 플로우 사이토메트리(flow cytometry)(BD FACS Calibur)로 검출하였다. 결과는 표 9에 나타내었다.
c-Met 항체의 세포내 섭취% = (다양한 시점에서 형광 강도 - 0 시간에서 형광 평균 강도)/0시간에서 형광 평균 강도.
표 9. 인간화 항 c-Met 항체의 세포내 섭취 평가(세포내 섭취%)
Figure pct00059
*대조군: 실험 오차는 4.9% 내지 3.6%이고, 이는 세포내 섭취가 없는 것으로 간주한다.
표 9는 본 발명의 항체가 효능제 활성 없이도 훌륭한 세포내 섭취를 가짐을 보여준다. 표적 세포에 일단 결합하면, 항체 및 수용체 둘다는 신속하게 표적 세포 내로 섭취될 것이고 최대 값은 2-4시간 내 도달되었다.
실시예 12. 항 c-Met 항체의 생물물리학적 안정성 분석
글리코실화의 존재 및 탈아민화 및 안정성과 같은, 본 발명의 항체의 생물물리학적 안정성을 평가하기 위하여, LC-MS 분석을 사용하여 항 c-Met 항체를 평가하였다.
중쇄 및 경쇄의 분자량을 글리코실화 분석을 위한 LC-MS에 의해 검출하였다. 탈아민화는 긴 시간(적어도 3달) 동안 4℃에서 또는 가속화 조건 하 21일 동안 40℃에서 LC-MS로 분석하였다. 다양한 조건으로 처리한 샘플들 취하여 pH 7.2 Tris-HCl로 2 mg/ml로 희석하고 10 mM TCEP 및 6 M 우레아(AMRESCO, Cat# 0378)3에 가하고, 그리고 나서 샘플을 7℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 최종 농도 20 mM를 갖는 IAA(Sigma-Aldrich, Cat#I1149)를 가하고 설포하이드릴 기를 보호하기 위해 어둠 속에서 15분간 인큐베이션하였다. pH를 pH 7.2 Tris-HCl로 조정하고, 프로테아제(Sigma-Aldrich, Cat# T6567)를 10:1 (단백질: 효소)의 중량비로 가하였다. 샘플을 37℃에서 25분 동안 인큐베이션하고 나서, 최종 농도 0.1%를 갖는 포름산(Fluca, Cat#94318)을 가하여 반응을 종결시켰다. 샘플을 원심분리하고 LC-MS로 분석하였다.
BiopharmaLynx를 사용하여 탈아민화의 존재를 분석하였다. 추출된 이온 크로마토그램(Extracted Ion Chromatogram)(EIC) 다이어그램은 탈아민화 부위를 포함하는 천연 펩티드 및 변형된 생산물을 검색하고, 모(parent) 이온을 추출함으로써 LC-MS 데이타로부터 얻었다. 피크 면적은 적분(integration)으로 얻었고, 탈아민화 및 산화의 백분율을 계산하였다. 결과는 표 10에 나타내었다.
표 10. 본 발명의 인간화 항 c-Met 항체의 물리적 안정성 평가
Figure pct00060
*: 중쇄는 모두 글리코실화와 관련되고, 분자량은 예상대로 였다. #: 탈아민화 분자 비율(%). 0.66-1.0%는 검출의 백그라운드(background) 내이다.
상기 결과는 본 발명의 항체가 안정하고 훌륭한 물리적 성질을 가짐을 보여준다.
실시예 13. 항-c-Met 항체 Ab -10 컨쥬게이티드 독소 MC- MMAF
본 발명의 항-c-Met 항체는 효능제 활성 없이 수용체 결합의 억제 활성을 가지고, 물리적 안정성 뿐아니라 표적 세포 내 세포내 섭취의 활성을 보여준다. 이러한 성질은 본 발명의 항체를 c-Met 발현 암의 치료를 위해 독소와 컨쥬게이트할 때, ADC 약물의 제조에 특별히 적합하도록 만들어준다. 커플링 과정은 아래에 나타나 있다:
Figure pct00061
Figure pct00062
1 단계. 티오아세트산 S-(3-카보닐 프로필) 에스테르(0.7 mg, 5.3 μmol)를 0.9 mL의 아세토니트릴 용액에 용해시켰다. 상기 제조된 티오아세트산 S-(3-카보닐 프로필) 에스테르의 아세토니트릴 용액을 Ab-10 단클론 항체를 함유하는 아세트산/아세트산 나트륨 완충액 pH 4.3 (10.35 mg/ml, 9.0 ml, 0.97 mmol)에 가하고 1.0 mL 수소화 붕소 나트륨 수용액(14.1 mg, 224 μmol)을 25℃에서 2시간 동안 진탕하면서 가하였다. 반응 종결시 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: 0.05 M PBS 용액 pH 6.5)에서 탈염 및 정제를 수행하고, 생산물 1b 용액을 수집하고 다음 반응을 위해 10 mg/ml로 직접 농축하였다.
2 단계. 0.35 ml 2.0 M의 하이드록실아민 염산염 용액을 25℃에서 30분간 진탕하면서 1b 용액 11.0 mL에 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: 0.05 M PBS 용액 pH 6.5)에서 탈염 및 정제를 수행하고, 표제의 생산물 Ab-10 단클론 항체-프로필 메르캅탄 1c 용액을 수집하였다(6.17 mg/ml, 14.7 ml).
3 단계. MC-MMAF (1.1 mg, 1.2 μmol; PCT 특허 WO2005081711에 공개된 방법으로 제조됨)를 0.3 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 3.0 ml의 Ab-10 단클론 항체-프로필 메르캅탄 1c 용액 (6.17 mg/ml) 내로 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: 0.05M PBS 용액 pH 6.5) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건에서 0.2 μm 필터로 여과하여 표제의 생산물인 ADC-1 (3.7 mg/ml, 4.7 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 148119.2 (MAb+0D), 149278.1 (MAb+1D), 150308.1 (MAb+2D), 151314.1 (MAb+3D). 독소:항체 비율(DAR)은 분석으로 계산하였고, 평균 값은 y=1.7이다.
실시예 14. 항-c-Met 항체 Ab -10 컨쥬게이티드 독소 MC-VC- PAB - MMAE
Figure pct00063
MC-VC-PAB-MMAE (1.6 mg, 1.2 μmol; PCT 특허 WO2004010957에 개시된 방법으로 제조됨)를 0.3 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 3.0 ml의 Ab-10 단클론 항체-프로필 메르캅탄 1c 용액(6.17 mg/ml) 내로 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M)으로 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건 하 0.2 μm 필터로 여과하여 표제의 생산물 ADC-2 (3.6 mg/ml, 4.8 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 148118.4 (MAb+0D), 149509.2 (MAb+1D), 150903.1 (MAb+2D), 152290.4 (MAb+3D), 153680.7 (MAb+4D). 독소:항체 비율(DAR)은 분석으로 계산하였고, 평균 값은 y=1.8이다.
실시예 15. 항-c-Met 항체 Ab -10 컨쥬게이티드 독소 MC-VC- PAB - MMAF
Figure pct00064
MC-VC-PAB-MMAF (1.6 mg, 1.2 μmol; PCT 특허 WO2005081711에 개시된 방법으로 제조됨)를 0.3 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 3.0 ml의 Ab-10 단클론 항체-프로필 메르캅탄 1c 용액(6.17 mg/ml) 내로 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건 하 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 표제의 생산물 ADC-3 (3.5 mg/ml, 4.9 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 148119.1 (MAb+0D), 149525.3 (MAb+1D), 150930.7 (MAb+2D), 152335.2 (MAb+3D), 153739.8 (MAb+4D). 독소:항체 비율(DAR)은 분석으로 계산하였고, 평균 값은 y=1.6이다.
실시예 16. 항-c-Met 항체 Ab -10 컨쥬게이티드 독소 MC- MMAE
Figure pct00065
MC-MMAE (1.2 mg, 1.2 μmol; 특허출원 US7/750/116B1에 개시된 방법으로 제조됨)를 0.3 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 3.0 ml의 Ab-10 단클론 항체-프로필 메르캅탄 1c 용액(6.17 mg/ml) 내로 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건 하 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 표제의 생산물 ADC-4 (3.4 mg/ml, 5.0 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 148118.6(MAb+0D), 149104.3(MAb+1D), 150090.1(MAb+2D), 151075.8(MAb+3D). 독소:항체 비율(DAR)은 분석으로 계산하였고, 평균 값은 y=1.6이다.
실시예 17. 항-c-Met 항체 Ab -9 컨쥬게이티드 독소 MC- MMAE
Figure pct00066
Figure pct00067
1 단계. 티오아세트산 S-(3-카보닐 프로필) 에스테르(0.7 mg, 5.3 μmol)를 0.9 mL의 아세토니트릴 용액에 용해시켰다. 상기에서 제조된 티오아세트산 S-(3- 카보닐 프로필) 에스테르의 아세토니트릴 용액을 Ab-9 단일 클론 항체를 함유하는 아세트산/아세트산 나트륨 완충액(10.85 mg/ml, 9.0 ml, 0.976 mmol)에 가하고, 1.0 mL 수소화 붕소 나트륨 수용액(14.1 mg, 224 μmol)을 25℃에서 2시간 동안 진탕하면서 첨가하였다. 반응 종료 후, Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하고 생성물 5b 용액을 수집하고 다음 반응을 위해 10 mg/ml로 직접 농축하였다.
단계 2. 0.35 ml 하이드록실아민 염산염 용액 2.0 M을 25℃에서 30분간 진탕하면서 5b 용액 11.0 mL에 가하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH가 6.5인 0.05M PBS 용액) 상에서 탈염 및 정제를 수행하고, 표제의 생산물 Ab-9 단클론 항체-프로필 메르캅탄 5c 용액을 수집하였다(6.2 mg/ml, 15.0 ml).
단계 3. MC-MMAE (1.1 mg, 1.2 μmol)을 0.3 ml 아세토니트릴에 용해시키고 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 3.0 ml Ab-9 단클론 항체-프로필 메르캅탄 5c 용액 (6.2 mg/ml)에 가하고, Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건 하 0.2 μm 필터로 여과하여 표제의 생산물인 ADC-5 (3.8 mg/ml, 4.6 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 150530.9(MAb+0D), 151915.7(MAb+1D), 153333.6(MAb+2D), 154763.4(MAb+3D), 156271.9(MAb+4D). 독소:항체 비율(DAR)은 분석으로 계산하였고, 평균 값은 y=1.5이다.
실시예 18. 항-c-Met 항체 Ab -9 컨쥬게이티드 독소 MC- MMAF
Figure pct00068
MC-MMAF (1.1 mg, 1.2 μmol)를 0.3 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 3.0 ml의 Ab-9 단클론 항체-프로필 메르캅탄 5c 용액(6.17 mg/ml) 내로 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건 하 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 표제의 생산물 ADC-6 (3.8 mg/ml, 4.6 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 150537.8(MAb+0D), 152087.9(MAb+1D), 153486.5(MAb+2D), 154911.7(MAb+3D), 156499.9(MAb+4D). 독소:항체 비율(DAR)은 분석으로 계산하였고, 평균 값은 y=1.7이다.
실시예 19. 항-c-Met 항체 Ab -9 컨쥬게이티드 독소 MC-VC- PAB - MMAF
Figure pct00069
MC-VC-PAB-MMAF (1.6 mg, 1.2 μmol)를 0.3 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 3.0 ml의 Ab-9 단클론 항체-프로필 메르캅탄 5c 용액(6.2 mg/ml) 내로 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건 하 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 표제의 생산물 ADC-7 (3.8 mg/ml, 4.6 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 150537.8(MAb+0D), 152087.9(MAb+1D), 153486.5(MAb+2D), 154911.7(MAb+3D), 156499.9(MAb+4D). 독소:항체 비율(DAR)은 분석으로 얻었고, 평균 값은 y=1.8이다.
실시예 20. 항-c-Met 항체 Ab -9 컨쥬게이티드 독소 MC-VC- PAB - MMAE
Figure pct00070
MC-VC-PAB-MMAE (1.6 mg, 1.2 μmol)를 0.3 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 3.0 ml의 Ab-9 단클론 항체-프로필 메르캅탄 5c 용액(6.2 mg/ml) 내로 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건 하 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 표제의 생산물 ADC-8 (3.8 mg/ml, 4.6 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 150508.6(MAb+0D), 151903.6(MAb+1D), 153314.5(MAb+2D), 154747.8(MAb+3D), 156039.5MAb+4D). 독소:항체 비율(DAR)은 분석으로 얻었고, 평균 값은 y=1.6이다.
실시예 21. 항-c-Met 항체 Ab -10 컨쥬게이티드 독소 SMCC - DMI
Figure pct00071
Figure pct00072
1 단계
SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트; 1.65 mg, 4.94 μmol, Shanghai Hanhong Biochemical Company, Batch No. BH-4857-111203에서 구매함)을 0.9 mL의 아세토니트릴 용액에 용해시켰다. 상기에서 제조 한 SMCC의 아세토니트릴 용액을 Ab-10 단클론 항체를 함유하는 pH 6.5 PBS 완충액(10.15 mg/ml, 9.0 ml, 0.62 μmol)에 25℃에서 2시간 동안 진탕하면서 가하였다. 반응 후, Sephadex G25 겔 칼럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였고, 생산물 9b 용액을 수집하고 다음 반응을 위해 10 mg/ml (8.3 mg/ml, 11 ml)로 농축하였다.
2 단계
3.0 mg L-DM1의 에탄올 용액(3.0 mg L-DM1/1.1 ml 에탄올)(Journal of Medicinal Chemistry, 2006, 49, 4392-4408에 공개된 공지된 방법으로 제조됨)을 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 9b 용액(11.0 ml)에 가하였고 그리고 나서 Sephadex G25 겔 칼럼(용출상: pH가 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하고, 생산물 ADC-9 용액을 수집하고(6.3 mg/ml, 14.0 mL) 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 148119.6(MAb+0D), 149078.1(MAb+1D), 149836.4 (MAb+2D), 150593.7(MAb+3D), 151552.5(MAb+4D).
평균 값은 y=2.3이다.
실시예 22. 항-c-Met 항체 Ab -9 컨쥬게이티드 독소 SMCC -DM1
Figure pct00073
Figure pct00074
1 단계
SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트; 1.65 mg, 4.94 μmol)을 0.9 mL의 아세토니트릴 용액에 용해시켰다. 상기에서 제조한 SMCC의 아세토니트릴 용액을 Ab-9 단클론 항체를 함유하는 pH 6.5 PBS 완충액(10.15 mg/ml, 9.0 ml, 0.62 μmol)에 25℃에서 2시간 동안 진탕하면서 가하였다. 반응 후, Sephadex G25 겔 칼럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였고, 생산물 10b 용액을 수집하고 다음 반응을 위해 10 mg/ml (8.3 mg/ml, 11 ml)로 농축하였다.
2 단계
3.0 mg L-DM1의 에탄올 용액(3.0 mg L-DM1/1.1 ml 에탄올)을 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 9b 용액(11.0 ml)에 가하였고 그리고 나서 Sephadex G25 겔 칼럼(용출상: pH가 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하고, 생산물 ADC-10 용액을 수집하고(6.3 mg/ml, 14.0 mL) 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 150534.2(MAb+0D), 151492.6(MAb+1D), 152451.7(MAb+2D), 153409.7(MAb+3D), 154368.1(MAb+4D).
평균 값은 y=2.2이다.
실시예 23. 항-c-Met 항체 Ab -9 컨쥬게이티드 독소 SN -38
Figure pct00075
Figure pct00076
MC-VC-PAB-SN-38 (1.3 mg, 1.2 μmol)를 0.3 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 3.0 ml의 Ab-9 단클론 항체-프로필 메르캅탄 5c 용액(6.2 mg/ml) 내로 25℃에서 4시간 동안 진탕하면서 가하고, 그리고 나서 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건 하 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 표제의 생산물 ADC-11 (3.7 mg/ml, 4.5 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 150537.1(MAb+0D), 151786.6(MAb+1D), 152948.6(MAb+2D), 154161.7(MAb+3D), 155365.9(MAb+4D), 156477.8(MAb+5D).
평균 값은 y=2.6이다.
실시예 24. 항-c-Met 항체 Ab -10 컨쥬게이티드 독소
1. 독소의 제조
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부티르아미드)부티르아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐)프로피온산
Figure pct00077
Figure pct00078
1 단계. (S)-터트-부틸-2-아미노-3-(2-플루오로페닐)프로피온산
(S)-2-아미노-3-(2-플루오로페닐)프로피온산 12a (400 mg, 2.18 mmol, "Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354 (17), 3327-3332"에 공지된 방법에 따라 제조됨)을 터트-부틸 아세테이트 10 mL에 용해시켰다. 과염소산(300 mg (70 %), 3.3 mmol)을 첨가하고 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 후 물 6 ml를 가하고 용액을 분리하였다. 유기 상을 포화 중탄산 나트륨 용액(5 ml)으로 세척하였다. 수상을 포화 중탄산 나트륨 용액으로 pH=8로 조정한 후, 디클로로메탄(5 ml × 3)으로 추출하고, 유기상과 합하였다. 그리고 나서, 반응 혼합물을 물(3 ml) 및 포화 염화나트륨 용액(5 ml)으로 연속적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고; 여액을 감압하에 농축시켰다. 조 생산물인 (S)-터트-부틸 2-아미노-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산 12b를 수득하였고(390 mg, 황색, 기름기 있음(oily)), 이를 정제하지 않고 바로 다음 반응 대상으로 삼았다.
2 단계.
(1S,3S,5S)-터트-부틸 3-((1R,2R)-3(((S)-1-(t-부톡시)-3-(2-플루오로페닐)-1-카보닐프로필-2-)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-카보닐 프로필)-2-아자바이사이클로 [3.1.0] 헥산-2-카복실산
(2R, 3R)-3-((1S, 3S, 5S)-2-(터트-부톡시카보닐)-2-아자바이사이클로 [3.1.0] 헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸 프로피오네이트 12e (100 mg, 0.334 mmol)을 디클로로메탄 및 디메틸포름아미드의 혼합물 (V/V=5:1) 6 ml에 용해시키고, 조 생산물 (S)-터트-부틸 2-아미노-3-(2-플루오로페닐) 프로피오네이트 12b (80 mg 0.334 mmol)을 가하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(0.29 ml, 1.67 mnmol) 및 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(152.3 mg, 0.40 mmol)을 그 혼합물에 가하였다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 1시간 동안 교반하였다. 반응 후, 10 ml의 물을 첨가하고 교반하였다. 디클로로메탄 층을 포화 염화나트륨 용액(10 ml)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 여액을 감압하에 농축시켰다. 잔사를 용리제(eluent) 시스템 B를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제의 생산물인 (1S, 3S, 5S)-터트-부틸-3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(t-부톡시)-3-(2-플루오로페닐)-1-카보닐프로필-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-카보닐 프로필)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-2-카복실산 12c (173 mg, 투명한 액체)를 수득하였다. 수율은 99.5 %이다.
MS m/z (ESI): 521.2 [M+1]
3 단계.
(S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로피온아미드)-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산
( 1S,3S,5S)-터트-부틸-3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(t-부톡시)-3(2-플루오로페닐)-1-카보닐프로필-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-카보닐 프로필)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-2-카복실산 12c (173 mg, 0.33 mmol)을 2 ml의 디옥산에 용해시키고 5.6 M의 수소 클로라이드 디옥산 용액(0.21 ml, 1.16 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 1시간 동안 교반하고, 냉장고에 12시간 동안 두었다. 반응 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축시키고, 5 ml의 디클로로메탄을 첨가하여 반응 혼합물을 희석시켰다. 10 ㎖의 포화 중탄산 나트륨 용액을 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 생산물을 분리하고, 수상을 디클로로메탄 (5 ml×3)으로 추출하였다. 디클로로메탄 층을 합하고 포화 염화나트륨 용액 (10 ml)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 여액을 감압하에 농축시켰다. 조 생산물 (S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,2S,5S)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로피온아미드-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산 12d (77 mg, 황색 액체)를 얻었으며, 정제하지 않고 바로 다음 반응의 대상으로 삼았다.
MS m / z (ESI) : 421.2 [M + 1]
4 단계.
(S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-세크부틸)-1-(9H-플루오렌-9-일)-5,8-디이소프로필-12-메톡시-4,10-디메틸-3,6,9-트리카보닐-2-옥시젠-4,7,10-트리아자테트라데실-14-아실)-2-아자바이사이클로[3.1.0] 헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판 아미드)-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산
조 생산물 (S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,2S,5S)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로피온아미드)-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산 12d (77 mg, 0.183 mmol) 및 (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-세크부틸)-1-(9H-플루오렌-9-일)-5,8-디이소프로필-12-메톡시-4,10-디메틸-3,6,9-트리카보닐-2-옥소-4,7,10-트리아자테트라데실-14-카복실산 12i (116.8 mg, 0.183 mmol, 특허 출원 "WO 2013072813"에 공개된 방법으로 제조됨)을 디클로로메탄 및 디메틸포름아미드 (V/V=5:1)의 6 ml 혼합물에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(0.16 ml, 0.915 mmol) 및 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(84 mg, 0.22 mmol)를 그 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하 1시간 동안 교반하였다. 반응 후, 10 ml의 물을 첨가하고 교반하였다. 디클로로메탄 층을 포화 염화나트륨 용액(10 ml)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 여액을 감압하에 농축시켰다. 잔사를 용리제(eluent) 시스템 B를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제의 생산물인 (S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-세크부틸)-1-(9H-플루오렌-9-일)-5,8-디이소프로필-12-메톡시-4,10-디메틸-3,6,9-트리카보닐-2-옥소-4,7,10-트리아자테트라데실-14-아실)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로피온아미드)-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산 12e (190.5 mg, 황색 점성)을 100% 수율로 얻었다.
MS m/z (ESI): 1040.6 [M+1]
5 단계.
(S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미드)부탄아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산
(S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-세크부틸)-1-(9H-플루오렌-9-일)-5,8-디이소프로필-12-메톡시-4,10-디메틸-3,6,9-트리카보닐-2-옥소-4,7,10-트리아자테트라데실-14-아실)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸 프로피온아미드)-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산 12e (190.5 mg, 0.183 mmol)을 1.5 ㎖의 디클로로메탄에 용해시키고 2 ㎖의 디에틸아민을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하 3시간 동안 교반하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 감압 농축하고 조 표제의 생산물 (S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미드)부탄아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐)프로피온산 12f (150 mg, 황색 점성)를 수득하였다. 생산물을 정제하지 않고 직접 다음 반응의 대상으로 삼았다.
MS m/z (ESI): 818.5 [M+1]
6 단계.
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미드)부탄아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐)프로피온산
조 생산물 (S)-터트-부틸-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미드)부탄아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐)프로피온산 12f (150 mg, 0.183 mmol)을 1 ml의 디옥산, 3 ml의 5.6 M 염화수소 디옥산에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하 12시간 동안 교반하였다. 반응 후, 반응 용액을 에테르 용매로 감압하에 농축시켰다. 잔사를 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하여 표제 생산물 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미드)부탄아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산 12g (28 mg, 백색 분말)을 20%의 수율로 수득하였다.
MS m/z (ESI): 762.7[M+1]
Figure pct00079
2. 독소 중간체의 제조
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디카보닐-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미드)-3-메틸 부탄아미드)-N,3-디메틸 부탄아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐)프로피온산
Figure pct00080
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미드)부탄아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐)프로피온산 12g (25 mg, 0.033 mmol)을 3 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민(0.029 ml, 0.164 mmol)을 첨가하였다. 반응계를 아르곤 분위기 하에 두고, 상기에서 제조한 6-(2,5-디카보닐-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일 클로라이드 4b (11.3 mg, 0.049 mmol)의 디클로로메탄 용액을 얼음욕(ice-bath)에서 혼합물에 적가하고, 반응을 실온에서 3시간 동안 수행하였다. 반응 후, 5 ml의 물을 첨가하고 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 혼합물이 층을 형성할 때까지 방치하고, 유기 층상을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 여액을 감압하에 농축하였다. 잔사를 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하여 표제 생산물인 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디카보닐-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸 헥산아미드)-3-메틸 부탄아미드)-N,3-디메틸부탄아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)-2-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-(2-플루오로페닐) 프로피온산 12h (7 mg, 황색 점성)을 얻었다. 수율은 22.4%이다.
MS m/z (ESI): 955.4 [M+1]
Figure pct00081
3. 항체-독소 컨쥬게이트의 제조
Figure pct00082
Figure pct00083
화합물 12h (1.2 mg, 1.2 μmol)를 0.3 ml 아세토니트릴에 용해시켰다. Ab-10 단클론 항체-프로필메르캅탄 1c 용액 (6.17 mg/ml)을 25℃ 에서 4시간 동안 진탕하면서 첨가한 후 Sephadex G25 겔 컬럼(용출상: pH가 6.5인 PBS 용액 0.05 M) 상에서 탈염 및 정제를 수행하였다. 무균 조건에서 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 표제의 생산물 ADC-12 (3.3 mg/ml, 5.0 ml)의 PBS 완충 용액을 얻은 후 4℃에서 보관하였다.
Q-TOF LC/MS: 특징적 피크: 148119.6(MAb+0D), 149150.5 (MAb+1D), 150221.1 (MAb+2D), 151265.1(MAb+3D), 152314.3(MAb+4D).
평균 값:y=1.6.
실시예 13-24를 참조하여, 실시예 25-27의 ADC 화합물을 제조하였다.
Figure pct00084
항-c-Met 항체 독소 컨쥬게이트 ( ADC ) 분자의 시험 실시예
시험 실시예 1. 항-c-Met 항체 독소 컨쥬게이트 ( ADC ) 분자의 안정성 평가
세포내 섭취를 갖는 본 발명의 ADC 분자 또는 기타 c-Met 항체-독소 컨쥬게이트(예를 들어, LY-2875358-ADC)의 독소 중간체 및 독소를 PBS, 인간 및 원숭이 혈장 중의 유리 독소의 안정성에 대해 평가하였다.
실시예 화합물 ADC-1 및 ADC-12의 독소 중간체 및 독소를 PBS, 인간 또는 원숭이 혈장(Suzhou Xishan Zhongke Pharmaceutical Research and Development Co., Ltd., 동물 생산 면허 번호: SCXK (Su) 2012-0009)으로 500 ㎍ml로 희석하고, 샘플을 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하고, 0, 3 및 7일째에 유리 독소 및 독소 중간체의 농도를 측정하였다. 20 ㎕의 내부 대조군(캄토테신, Shanghai Ronghe Pharmaceutical Technology Development Co., Ltd., batch number 090107, 100 ng/ml) 및 150 ㎕ 아세토니트릴을 약물을 함유하는 50 ㎕의 인간, 원숭이 혈장 또는 PBS 샘플에 첨가하고, 샘플을 3분 동안 흔들어 주고(vortexd), 10분 동안 15000 rpm에서 원심분리하고, 80 μL의 상청액을 취하여 0.2% 포름산 80 ㎕와 혼합한 후, 10 ㎕의 샘플을 주사를 위해 취하였다. 표준 곡선 방법은 하기와 같이 수행 하였다: 50 ㎕의 블랭크(blank) 사람, 원숭이 혈장 또는 PBS 샘플을 각각 50 ㎕의 작업 용액에 첨가하였다; 20 ㎕의 내부 대조군(캄토테신, 100 ng/ml) 및 100 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하고, 샘플을 3분간 흔들어 주고(vortexd), 15000 rpm에서 10분간 원심분리하였다; 80 ㎕의 상청액을 취하여 80 ㎕의 0.2% 포름산과 혼합하였다; 10 ㎕의 샘플을 주사용으로 취하였다.
다음의 크로마토그래피 조건 설정 컬럼과 함께, Shimadzu LC-30AD 초-고성능 액체 크로마토그래피 시스템(Shimadzu Corporation), UPLC-MS/MS 질량 분석기 API4000 3중 4극자 탠덤 질량 분석기(triple quadrupole tandem mass spectrometer)(AB SCIEX)를 사용하였다: Waters XBridgeTM BEH300 C18 (100 mm×4.6 mm i.d., 3.5 mm), 이동상은 0.2% 포름산-아세토니트릴(농도구배 용출)이었다. 결과는 표 11 및 표 12에 나타나 있다.
표 11. 본 발명의 ADC-1의 독소 중간체 및 독소 약물의 혈장 안정성 평가
Figure pct00085
*: 시험값은 샘플 내 유리 독소의 백분율이다. 0.01-0.19%는 검출 백그라운드(background)의 범위 내이다; ND: 검출될 수 없음, 검출되지 않음.
표 12. 본 발명의 ADC-12의 독소 중간체 및 독소 약물의 혈장 안정성 평가
Figure pct00086
ND: 검출될 수 없음, 검출되지 않음.
상기 결과는 본 발명의 ADC-1 및 ADC-12의 독소 중간체 및 독소가 다양한 용매(PBS, 인간 혈장, 원숭이 혈장 등)에서 안정함을 보여준다. 0일, 3일 및 7일 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에도 분해 생산물, 유리 독소 및 독소 중간체(독소-링커)가 관찰되지 않았다.
시험 실시예 2. 항-c-Met 항체 독소 컨쥬게이트(ADC)의 시험관내 활성 평가
본 발명의 ADC-1, ADC-12의 시험관내 활성을 FACS (c-Met 양성 세포와의 결합 활성 검출) 및 세포내 섭취(방법은 실시예 11을 참고)로 평가하였다. 결과는 표 13에 나타나 있다.
표 13. 본 발명의 ADC 분자의 시험관내 활성
Figure pct00087
*: 데이타는 1시간째 세포내 섭취 비율로 표현하였다.
상기 결과는 독소에 컨쥬게이트된 본 발명의 항체가 결합 활성 및 항체의 세포내 섭취 활성을 여전히 유지함을 보여준다.
시험 실시예 3. 항-c-Met 항체 독소 컨쥬게이트(ADC)의 세포독성 시험
세포에 대한 본 발명의 ADC 분자의 독성 효과를 평가하기 위해 ATP 독성 시험을 수행하였다. ATP는 살아있는 세포의 대사 지표이고, ATP의 검출은 세포에 대한 분자 독성의 효과를 반영할 수 있다.
HepG2 세포(Chinese Academy of Sciences cell bank, Cat# TCHu 72)를 10% FBS를 함유하는 EMEM 완전 배지에서 배양하고, MKN45 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 완전 배지에서 배양하였다. 2~3 ml의 트립신을 첨가하여 2~3분간 소화시키고, 소화가 완료될 때 10~15 ml의 완전 배지를 첨가하여 소화된 세포를 용리시키고, 세포를 1000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 10-20 ml의 완전 배지를 첨가하여 세포를 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 얻고, 세포 밀도를 4×104 세포/ml로 조정하였다. 상기 세포 현탁액 0.1 ㎖를 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고, 2% FBS를 함유하는 EMEM 배지 또는 2% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지 90 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 시험 샘플(실시예 13의 화합물 및 독소)을 다양한 농도 구배로 PBS로 희석하고, 10 ㎕의 샘플을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 검출은 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 검정 키트(Promega, Cat # G7571)의 지시사항에 따라 수행하였다. 화학 발광은 마이크로플레이트 판독기(VICTOR 3, PerkinElmer)로 측정하였고 결과는 GraphPad Prism (버전 5.0) 소프트웨어로 분석하였다. 그 결과는 표 14에 나타내었다.
표 14. 본 발명의 ADC 분자 및 상응하는 유리 독소의 세포독성
Figure pct00088
ND: 활성이 검출되지 않았다; NA: 해당사항 없음
논의: 상기 결과는 c-Met 양성 세포 MKN45에 대한 ADC-1 및 ADC-12의 세포 독성이 동일함을 보여준다(IC50은 각각 0.51 nM 및 0.59 nM이다). 그러나 c-Met 양성 세포에 대한 각 독소 모이어티의 세포독성 효과는 상이하였고, 이들 두 ADC 사이에는 93배의 차이가 있다(79.4/0.85).
본 발명의 ADC-1 및 ADC-12는 c-Met-음성 HepG2 세포에 대한 세포 독성 효과를 가지지 않고, 이는 ADC 화합물이 특정 표적 효과를 가짐을 가리킨다. 그러나, c-Met-음성 HepG2 세포에 대한 각각의 독소 모이어티의 세포 독성 효과는 상이하였으며, 이들 두 ADC 사이에는 82배의 차이가 있다(400.8/4.88).
이러한 결과는 ADC-1과 ADC-12가 특정 표적 효과를 가지며 비특이적(정상 세포) 세포에 대해 독성 효과 없이 c-Met 양성 세포의 증식을 억제할 수 있음을 보여준다. ADC-1과 ADC-12의 차이점은 표적 세포와 비표적 세포에 대한 ADC-1과 ADC 12의 유리 독소의 독성이 다르다는 것이다. c-Met 양성 세포와 음성 HepG2 세포에 대한 ADC-12의 독소 모이어티의 세포 독성은 각각 ADC-1의 세포 독성보다 93배 및 82배 낮다. 따라서, 분자가 표적 세포에 도달할 때, 유리 독소가 방출되면, ADC-12의 비특이적 독성 효과는 ADC-1의 독성 효과보다 약하다. 따라서 독성 부작용이 더 적고 안전성이 우수하다.
시험 실시예 4. 종양 세포에 대한 항-c-Met 항체 독소 컨쥬게이트 ( ADC ) 분자의 증식 억제 효과
이러한 결과는 ADC-1 (실시예 13)이 c-Met을 발현하는 종양 표적 세포를 특이적으로 살해할 수 있음을 나타낸다. 종양 세포에 대한 독성 효과의 증식 억제를 검출하기 위하여, 본 발명의 분자를 다양한 종양 세포에 대하여 시험하였다; 세포 증식에 대한 샘플의 억제 효과를 CCK 법으로 측정하고, 본 발명의 ADC 분자의 시험 관내 세포 활성을 IC50 값에 따라 평가하였다.
사용한 세포 및 상응하는 배지를 하기 표 15에 나타내었다. Cell Counting Kit (Dojindo chem Co. Cat # CK04)를 사용하여 세포 증식을 측정하였다(지침에 따라).
2~3 ml의 트립신을 첨가하여 2~3분간 소화시키고, 소화가 완료될 때 10-15 ml의 완전 배지를 첨가하여 소화된 세포를 용출시키고, 1000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 10-20 ml 완전 배지를 가하여 세포를 재현탁시키고 단일 세포 현탁액을 얻었고, 세포 밀도를 4×104 세포/ml로 조정하였다. 상기 세포 현탁액 0.1 ㎖를 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고, 2% FBS를 함유하는 배지 90 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 시험 샘플을 상이한 농도의 구배로 PBS로 희석하고, 10 ㎕의 샘플을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 10 ㎕의 CCK8을 각 웰에 첨가하고 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. OD450은 마이크로플레이트 판독기(VICTOR 3, PerkinElmer)로 검출하였고 데이터는 GraphPad Prism (버전 5.0) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그 결과는 표 16에 나타나 있다.
표 15. 본 실시예에 사용한 배양 배지
Figure pct00089
표 16. 다양한 암세포의 증식에 대한 본 발명의 분자의 억제 효과
Figure pct00090
표 16의 결과는 본 발명의 항-c-Met 항체가 위암 세포주 MKN45 및 SUN에 대하여 비교적 훌륭한 활성을 가짐을 보여준다. 그러나, 폐암 세포와 같이, 낮은 c-Met 발현 또는 c-Met 발현의 부재를 갖는 다른 종양 세포의 경우, 활성은 매우 약하거나 존재하지 않는다. 본 발명의 ADC-1이 추가의 독소를 가지고 있기 때문에 위암 세포주 MKN45 및 SUN을 비롯한 c-Met을 발현하는 종양 세포, 특히 c-Met 항체가 효과가 없거나 매우 약한 효과를 갖는 폐암, 췌장암 및 신세포암 세포에서 좋은 활성을 갖는다.
시험 실시예 5. 항-c-Met 항체 독소 컨쥬게이트 ( ADC ) 분자의 생체내 효능 평가
1. 시험 목적
본 발명의 항-c-Met 항체 및 ADC 분자의 항종양 효능을 보다 잘 평가하기 위하여 실시예 10의 방법을 사용하여 항체 Ab-10 및 ADC-1의 병행(parallel) 비교 실험을 수행하였다. 실시예 10과 대조적으로, 이 시험은 단일 용량의 투여로 수행하였다. 이 실험은 종양 억제 효과가 회복되는 경향이 나타날 때 종결될 것이다.
2. 시험할 항체
Ab-10 (5 mg/kg), 스톡(stock) 용액 (2.18 mg/ml)을 최종 농도가 0.5 mg/ml가 되도록 PBS로 희석하였다.
Ab-10 (10 mg/kg), 스톡(stock) 용액 (2.18 mg/ml)을 최종 농도가 1 mg/ml 가 되도록 PBS로 희석하였다.
Ab-10 (30 mg/kg), 스톡(stock) 용액 (2.18 mg/ml)을 최종 농도가 3 mg/ml 가 되도록 PBS로 희석하였다.
ADC-1 (2.5 mg/kg), 스톡(stock) 용액 (10 mg/ml)을 최종 농도가 0.25 mg/ml 가 되도록 PBS로 희석하였다.
ADC-1 (5 mg/kg), 스톡(stock) 용액 (10 mg/ml)을 최종 농도가 0.5 mg/ml 가 되도록 PBS로 희석하였다.
ADC-1 (10 mg/kg), 스톡(stock) 용액 (10 mg/ml)을 최종 농도가 1 mg/ml 가 되도록 PBS로 희석하였다.
모든 동물은 꼬리 정맥 주사로 투여하였고, 투여량은 0.2 ml/마우스였다.
3. 시험 과정
MKN-45 세포(1×106/마우스)를 우측 늑골 내 피하로 누드 마우스에게 접종 하였다. 종양의 평균 용적이 (150.19 + 8.44)㎣에 도달하면, 동물을 무작위로 각 군이 8 마리의 쥐인 상이한 투여 군으로 나누었다. 특정 투여 요법은 표 17에 나타나 있다.
마우스는 일주일에 두 번 종양 용적 및 무게를 측정하였고, 데이타를 기록하였다.
엑셀 통계 소프트웨어: 평균 값은 avg로 계산된다; SD는 STDEV로 계산된다; SEM은 STDEV/SQRT로 계산된다; 상이한 군 간의 P 값은 TTEST로 계산된다.
종양 용적(V)은: V=1/2×Llength×Lwidth 2로 계산된다
종양 억제율(%)=(V0-VT)/V0*100%
여기서 V0 및 VT는 각각 실험 시작시 및 실험 종료시의 종양 용적이다.
4. 결과
표 17. MKN-45 누드 마우스에 화합물을 투여하는 치료 효능
Figure pct00091
**p<0.01 *p<0.05
결론: 본 발명의 항체 및 ADC 화합물은 MKN-45 이종이식 종양을 가진 누드 마우스에 대하여 뚜렷한 효과를 가진다.
본 발명의 ADC-12의 생체내 효능을 평가하기 위해 상술한 동일한 시험 방법으로 ADC-1 및 ADC-2를 병행 비교하였다. 동일한 용량이 단일 용량의 투여, 3 mg/kg이다. 결과는 표 18에 나타나 있다.
표 18. 종양에 대한 ADC-1 및 ADC-12의 억제 효과
Figure pct00092
상기 결과는 ADC-1 및 ADC-12의 종양 억제율이 11일째 유사하나, ADC-1의 효율이 15일 이후 감소하고(21일째 27.1%), 반면 ADC-12의 항종양 효과는 11일의 수준을 유지하였다(50.4%).
시험 실시예 6. 인간 폐암 NCI-H1993의 피하 종양 이종이식을 가진 누드 마우스에 대한 ADC -12의 효과
1. 시험 목적
인간 폐암 NCI-H1993의 피하 종양 이종이식을 가진 누드 마우스에 대한 ADC-12 및 Ab-10 항체 용액의 효능의 평가 및 비교
2. 약물 제조
ADC-12를 주사수(injection water) 20 mg/ml로 용해시키고, 분취하고 -80℃에서 냉장고에 보관하였다. 샘플을 사용 전 0.1% BSA를 함유하는 보통 식염수로 상응하는 농도로 희석하였다. Ab-10의 스톡(stock) 농도는 16.3 mg/ml이고, 이를 0.1% BAS를 함유하는 보통 식염수로 희석하고 분취하고 -80℃ 냉장고에 보관하였다.
3. 실험 동물
BALB/cA-누드 마우스, 6-7 주령,♀, Shanghai Ling Chang Biological Technology Co., Ltd.에서 구매함, 생산 면허 번호: SCXK (Shanghai) 2013-0018; 동물 증명서 번호 2013001814303. 섭식 환경: SPF 등급.
4. 시험 과정
인간 폐암 세포 NCI-H1993으로 누드 마우스를 피하 접종하였다. 종양 용적이 100-150 ㎣에 도달하면, 동물을 무작위로 군으로 나누었다(D0). 투여 요법 및 용량은 표 19에 나타나 있다. 마우스는 일주일에 2-3번 종양 용적 및 체중을 측정하였고, 데이타를 기록하였다. 종양 용적(V)은 다음과 같이 계산된다:
V=1/2×a×b2, 여기서 a 및 b는 각각 길이 및 너비를 나타낸다.
T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100, 여기서 T 및 C는 실험 종료시의 종양 용적을 나타낸다. T0 및 C0은 실험 시작시의 종양 용적을 나타낸다.
5. 결과
ADC-12는 항-c-Met 항체-독소 컨쥬게이트이다. ADC-12 (1, 3, 10 mg/kg, IV, D0)는 용량 의존적으로 누드 마우스에서 c-Met 과발현 인간 폐암 NCI-H1993의 피하 이종이식 종양의 성장을 억제하였고, 종양 억제율은 각각 45%, 63%, 124%였다; 10 mg/kg 용량 군의 70% 마우스가 부분적 퇴행을 나타냈다(D21); Ab-10 항체 스톡(stock) 용액은 ADC-12의 제조에 사용된 항체이고, Ab-10 항체의 종양 억제율(30 mg/kg, IV, 6번 동안 일주일에 두 번)은 NCI-H1993에 대하여 42%였다; 종양을 가진 마우스는 상기 약물들에 내약성이 좋았고, 무게의 감소와 같은 증상은 관찰되지 않았다. 비교에 의해, NCI-H1993에 대한 ADC-12의 효과는 Ab-10 항체 스톡 용액의 효과보다 명백히 강력하다.
표 19. 누드 마우스에서 인간 폐암 NCI-H1993의 피하 이종이식 종양에 대한 ADC-12 및 Ab-10 항체 스톡(stock) 용액의 효과
Figure pct00093
D0: 첫 투여 시간; P 값, 용매와 비교함; **P<0.01, Ab-10 항체 용액의 30 mg/kg 군의 것과 비교함; Student's t test를 사용하였다. 실험 시작시 마우스의 수: n=10.
논의: ADC-12 (1, 3, 10 mg/kg, IV, D0)는 용량 의존적으로 누드 마우스에서 c-Met 과발현 인간 폐암 NCI-H1993의 피하 이종이식 종양의 성장을 억제하였고, 부분적 종양 퇴행을 야기하였다; Ab-10 항체 스톡 용액(30 mg/kg, IV, 6회 동안 일주일에 두 번)도 NCI-H1993에 대하여 효과적이었다; NCI-H1993에 대한 ADC-12의 효과는 Ab-10 항체 스톡 용액의 효과보다 명백히 강력하다. 종양을 가진 마우스는 상기 약물들에 내약성이 좋았다.
SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD. <120> ANTI-C-MET ANTIBODY AND ANTI-C-MET ANTIBODY - CYTOTOXIC DRUG CONJUGATES AND PHARMACEUTICAL USE THEREOF <130> 2015 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2796 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> human cMet extracellular domain (ECD) and murine Fc region fusion protein (human cMet ECD-mFc) DNA sequence <400> 1 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 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2823 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> human c-Met ECD his tag (Human cMet ECD-His) recombinant protein DNA sequence <400> 3 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacacacc atcatcacca tcactgattc 2820 gaa 2823 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Murine <400> 4 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Pro Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Phe Val 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn His Asp Asn Pro Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 112 <212> PRT <213> Murine <400> 5 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Tyr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Asn Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Leu Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 6 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Murine <400> 7 Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Phe Val Ser 1 5 10 15 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Murine <400> 8 Asn His Asp Asn Pro Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Murine <400> 9 Arg Ala 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Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Phe Val 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn His Asp Asn Pro Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ab-9 light chain variable region <400> 16 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 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Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 19 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 20 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 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Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 21 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 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Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Phe Val 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Phe 65 70 75 80 Thr Met Asn Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn His Asp Asn Pro Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 24 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ab-10 heavy chain <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Phe Val 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn His Asp Asn Pro Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 25 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ab-11 heavy chain <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Pro Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Phe Val 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn His Asp Asn Pro Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 26 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ab-9 light chain <400> 26 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 27 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ab-10 light chain <400> 27 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Asp Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 28 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ab-11 light chain <400> 28 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Asn Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (42)

  1. 다음 서열 또는 이의 돌연변이 서열 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR 영역을 포함하는 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    항체 중쇄 가변 영역 HCDR 서열: 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8; 및
    항체 경쇄 가변 영역 LCDR 서열: 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11.
  2. 제1항에 있어서, 항체 중쇄 가변 영역이 다음 서열 또는 이의 돌연변이 서열 중에서 선택되는 적어도 하나의 HCDR 영역 서열을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편: 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8.
  3. 제1항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역이 다음 서열 또는 이의 돌연변이 서열 중에서 선택되는 적어도 하나의 LCDR 영역을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편: 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 표시된 중쇄 가변 영역 서열 또는 이의 돌연변이 서열; 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 표시된 경쇄 가변 영역 서열 또는 이의 돌연변이 서열을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 영역의 돌연변이 서열은 항체 활성을 최적화하는 1-3개의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열이고, 여기서 HCDR2 영역의 돌연변이 서열은 바람직하게 서열번호 12인 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 쥐(murine) 항체 또는 이의 단편인 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 쥐(murine) 항체의 중쇄 가변 영역 서열이 서열번호 4에 표시된 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제6항에 있어서, 쥐(murine) 항체의 경쇄 가변 영역 서열이 서열번호 5에 표시된 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 쥐(murine) 항체의 중쇄 가변 영역이 서열번호 4에 표시되고, 쥐(murine) 항체의 경쇄 가변 영역이 서열번호 5에 표시되는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 키메라 항체 또는 이의 단편인 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 인간화 항체 중쇄 가변 영역이 인간 생식계열(germline) 중쇄 서열에서 유래된 중쇄 FR 영역, 바람직하게 인간 생식계열(germline) 중쇄 IGHV 3-33*01을 포함하고; 여기서 상기 중쇄 FR 영역은 인간 생식계열(germline) 중쇄 IGHV 3-33*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 프레임워크(framework) 서열, 또는 이의 돌연변이 서열을 포함하고, 바람직하게, 상기 돌연변이 서열이 0-10개의 아미노산 복귀 돌연변이(back-mutation(s))를 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 인간화 항체가 서열번호 13-15 또는 이의 변이체 중에서 선택된 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제10항에 있어서, 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 인간 생식계열(germline) 경쇄 서열에서 유래된 경쇄 FR 영역, 바람직하게 인간 생식계열(germline) 경쇄 IGKV085 또는 IGKV4-1*01을 포함하고; 여기서 상기 경쇄 FR 영역이 인간 생식계열(germline) 경쇄 IGKV085 또는 IGKV4-1*01의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 프레임워크(framework) 서열, 또는 이의 돌연변이 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 돌연변이 서열이 0-10개의 아미노산 복귀 돌연변이(back-mutation(s))를 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 인간화 항체가 서열번호 16-18 또는 이의 변이체 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체가 서열번호 13-15 중에 선택된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 16-18 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제5항 및 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, a) 내지 c) 중 어느 하나 중에서 선택된 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열의 조합을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a) 서열번호 13의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 16의 경쇄 가변 영역 서열;
    b) 서열번호 14의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17의 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    c) 서열번호 15의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 18의 경쇄 가변 영역 서열.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 인간 IgG2 또는 이의 변이체, 인간 IgG3 또는 이의 변이체 또는 인간 IgG4 또는 이의 변이체에서 유래된 불변 영역, 바람직하게 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 인간 IgG2 또는 이의 변이체 또는 인간 IgG4 또는 이의 변이체에서 유래된 불변 영역, 가장 바람직하게 인간 IgG2 또는 이의 변이체에서 유래된 불변 영역을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, 서열번호 23-25 또는 서열번호 23-25에 대하여 적어도 90% 상동성을 갖는 서열 중에서 선택된 전장(full length) 중쇄 서열을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 κ 또는 λ 또는 이의 변이체 중에서 선택된 불변 영역을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, 서열번호 26-28 또는 서열번호 26-28에 대하여 적어도 90% 상동성을 갖는 서열 중에서 선택된 전장(full-length) 경쇄 서열을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체가
    Ab-9: 서열번호 23의 중쇄 서열 및 서열번호 26의 경쇄 서열;
    Ab-10: 서열번호 24의 중쇄 서열 및 서열번호 27의 경쇄 서열; 또는
    Ab-11: 서열번호 25의 중쇄 서열 및 서열번호 28의 경쇄 서열
    중에서 선택된 전장(full-length) 경쇄 서열 및 전장(full-length) 중쇄 서열의 조합을 포함하는 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 DNA 분자.
  23. 제22항에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
  24. 제23항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포로서, 숙주 세포가 바람직하게 포유류 세포, 보다 바람직하게 CHO 세포인 숙주 세포.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  26. 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Ab-[(L2)t-L1-D)]y (I)
    여기서:
    D는 약물 단위이고;
    L1, L2는 링커 단위이고;
    t는 0 또는 1, 바람직하게 1이고;
    y는 1-8, 바람직하게 2-5에서 선택되고;
    Ab는 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
  27. 제26항에 있어서, -L2-는 식 (-L2-)으로 표시되고:
    Figure pct00094
    ,
    여기서:
    X1은 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;
    X2는 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴로 구성된 군에서 선택되고;
    m은 0-5, 바람직하게 1-3이고;
    S는 황 원자인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  28. 제26항에 있어서, D의 약물 단위가 독소, 화학치료제, 항생제, 방사성동위원소, 핵산분해 효소 중에서 선택된 세포독성제인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  29. 제26항에 있어서, D가 식 (D):
    Figure pct00095

    또는 이의 토토머(tautomer), 메소머(mesomer), 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 이들의 혼합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 표시되고:
    여기서:
    R1-R7은 각각 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;
    R8-R11은 각각 선택적으로 수소, 할로겐, 알케닐, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게, R8-R11의 적어도 하나는 할로겐, 알케닐, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고, 및 R8-R11의 나머지는 수소이고;
    또는 R8-R11의 임의의 둘은 사이클로알킬을 형성하고, 나머지 둘은 각각 수소, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;
    R12-R13은 각각 수소, 알킬 및 할로겐으로 구성된 군에서 선택되고;
    R14는 아릴 및 헤테로아릴 중에서 선택되고, 여기서 아릴 또는 헤테로아릴은 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되는 치환기 군으로 선택적으로 더 치환되고;
    R15는 할로겐, 알케닐, 알킬, 사이클로알킬 또는 COOR17 중에서 선택되고;
    R16은 수소, 할로겐, 하이드록시, 시아노, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬 중에서 선택되고;
    R17은 수소, 알킬 및 알콕시 중에서 선택되는 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  30. 제29항에 있어서, L2가 Val-Cit, MC, PAB 및 MC-PAB 중에서 선택되는 링커를 포함하고, 바람직하게는 MC를 포함하는 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  31. 제26항에 있어서, D가 마이탄시노이드(maytansinoid) 알칼로이드; 바람직하게 DM1, DM3 또는 DM4; 보다 바람직하게 DM1인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  32. 제31항에 있어서, L2가 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 발레레이트(N-succinimidyl 4-(2-pyridylthio) valerate (SPP)), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실산 에스테르(N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-Carboxylic acid ester (SMCC)), 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트(N-succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate (SIAB))로 구성된 군; 바람직하게 SPP 또는 SMCC 중에서 선택된 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  33. 제26항에 있어서, D가 캄토테신(camptothecin) 알칼로이드이고; 바람직하게 CPT, 10-하이드록시-CPT, CPT-11(이리노테칸), SN-38 및 토포테칸 중에서 선택되고, 더 바람직하게 SN-38인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 링커 L2가 Val-Cit, MC, PAB 또는 MC-PAB; 바람직하게 MC 또는 MC-vc-PAB 중에서 선택되는 구조를 포함하는 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  35. 제26항에 있어서, 식 (II)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00096

    여기서:
    R2-R16은 제27항에 정의된 바와 같고;
    Ab, t, y, L1, L2는 제24항에 정의된 바와 같다.
  36. 제26항에 있어서, 식 (III)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00097

    여기서:
    R2-R16은 제27항에 정의된 바와 같고;
    Ab, t, y, L1, L2는 제24항에 정의된 바와 같고;
    n은 3-6, 바람직하게 5이다.
  37. 제26항에 있어서, 식 (IV)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00098

    여기서:
    R2-R16은 제27항에 정의된 바와 같고;
    Ab, y는 제24항에 정의된 바와 같고;
    n은 제34항에 정의된 바와 같고;
    X1, X2, m은 제25항에 정의된 바와 같다.
  38. 제26항에 있어서, 식 (V)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00099

    여기서:
    Ab, D, y는 제24항에 정의된 바와 같고;
    n은 제34항에 정의된 바와 같고;
    X1, X2, m은 제25항에 정의된 바와 같다.
  39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이
    Figure pct00100
    ,
    Figure pct00101
    ,
    Figure pct00102
    ,
    Figure pct00103
    ,
    Figure pct00104
    ,
    Figure pct00105
    ,
    Figure pct00106
    ,
    Figure pct00107
    ,
    Figure pct00108
    ,
    Figure pct00109
    ,
    Figure pct00110
    ,
    Figure pct00111
    ,
    Figure pct00112
    ,
    Figure pct00113
    ,
    Figure pct00114

    로 구성된 군에서 선택되고;
    여기서 Ab-9, Ab-10, Ab-11은 제21항에 정의된 바와 같고, y는 1-8, 바람직하게 2-5의 범위인 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  40. Figure pct00115

    일반식 (Ab-L2)의 화합물을 일반식 (L1-D)의 화합물과 유기 용매 중 반응시켜 일반식 (V)의 화합물을 얻고; 상기 유기 용매는 바람직하게 아세토니트릴 또는 에탄올인 단계를 포함하는, 제38항에 따른 식 (V)의 컨쥬게이트된 약물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 제조하는 방법으로서,
    여기서:
    Ab는 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이고;
    X1은 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 알킬, 알콕시 및 사이클로알킬로 구성된 군에서 선택되고;
    X2는 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴로 구성된 군에서 선택되고;
    X는 0-5, 바람직하게 1-3이고,
    m은 0-5, 바람직하게 1-3이다.
  41. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  42. c-Met-매개성 질병 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 다음 중 어느 하나의 용도:
    제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 c-Met 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제25항에 따른 약학적 조성물, 또는 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 식 (I)의 항체-세포독성 약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 제41항에 따른 약학적 조성물,
    여기서 상기 질병 또는 상태는 바람직하게 암; 보다 바람직하게 c-Met을 발현하는 암; 가장 바람직하게 위암, 췌장암, 폐암, 장암, 신장암, 흑색종, 비소세포성 폐암 중에서 선택되는 암; 가장 바람직하게 위암, 췌장암, 비소세포성 폐암 및 신장암이다.
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