TW201542594A - 雙特異性ｈｅｒ２抗體 - Google Patents

雙特異性ｈｅｒ２抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW201542594A
TW201542594A TW104111702A TW104111702A TW201542594A TW 201542594 A TW201542594 A TW 201542594A TW 104111702 A TW104111702 A TW 104111702A TW 104111702 A TW104111702 A TW 104111702A TW 201542594 A TW201542594 A TW 201542594A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
amino acid
seq
her2
antibody
aspects
Prior art date
Application number
TW104111702A
Other languages
English (en)
Inventor
John Li
Nazzareno Dimasi
Steven Coats
Melissa Damschroder
Changshou Gao
Godfrey Rainey
Cuihua Gao
Dorin Toader
Lakshmaiah Gingipalli
Fengjiang Wang
Ryan Fleming
Binyam Bezabeh
Andy Qingan Yuan
Srinath Kasturirangan
Original Assignee
Medimmune Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54288419&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201542594(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medimmune Llc filed Critical Medimmune Llc
Publication of TW201542594A publication Critical patent/TW201542594A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本發明係關於結合HER2受體之細胞外域的抗-HER2結合分子(例如抗體及其抗原結合片段)、衍生之HER2結合分子(例如雙特異性抗-HER2抗體)及抗體-藥物結合物(ADC)。亦提供包含所揭示之組合物的醫藥調配物及用於治療與HER2介導之信號轉導相關之疾病的方法。

Description

雙特異性HER2抗體
本申請案主張2014年4月11日申請之美國臨時專利申請案第61/978,516號及2015年1月23日申請之美國臨時專利申請案第62/107,050號之權益，該等臨時專利申請案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
本發明提供特異性結合於HER2之組合物及使用此類組合物治療癌症之方法。
受體酪胺酸激酶之HER家族為細胞生長、分化及存活之重要介體。受體家族包括四個不同成員，包括表皮生長因子受體(EGFR、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)及HER4(ErbB4或tyro2)。
HER2最初鑑別為來自經化學處理之大鼠之神經母細胞瘤的轉型基因產物。已在乳癌及卵巢癌中觀測到人類同源物之擴增且其引起不良預後。亦已在包括胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰臟及膀胱之癌瘤的其他癌瘤中觀測到HER2之過度表現(時常但不統一歸因於基因擴增)。HER2亦可在***癌中過度表現。
HER受體一般在細胞中以各種組合發現，且認為雜二聚增加對多種HER配位體之細胞反應的多樣性(Earp等人Breast Cancer Research and Treatment 35：115-132(1995))。雖然EGF及TGFα不結合HER2，但 EGF刺激EGFR及HER2形成雜二聚體，其活化EGFR且使雜二聚體中之HER2轉磷酸化。二聚及/或轉磷酸化似乎使HER2酪胺酸激酶活化。參見Earp等人，上文。同樣，當HER3與HER2共表現時，形成活性信號傳導複合物，且針對HER2之抗體能夠破壞此複合物(Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.,269：14661-14665(1994))。
此項技術中已描述靶向HER2之許多抗體(參見例如Hudziak等人，Mol.Cell.Biol.9：1165-1172(1989)；美國專利第5,677,171號；Fendly等人Cancer Research 50：1550-1558(1990)；Kotts等人In vitro 26(3)：59A(1990)；Sarup等人Growth Regulation 1：72-82(1991)；Shepard等人J.Clin.Immunol.11：117-127(1991)；Kumar等人Mol.Cell.Biol.1：979-986(1991)；Lewis等人Cancer Immunol.Immunother.37：255-263(1993)；Pietras等人Oncogene 9：1829-1838(1994)；Vitetta等人Cancer Research 54：5301-5309(1994)；Sliwkowski等人J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)；Scott等人J.Biol.Chem.266：14300-5(1991)；D'souza等人Proc.Natl.Acad.Sci.91：7202-7206(1994)；Lewis等人Cancer Research 56：1457-1465(1996)；及Schaefer等人Oncogene 15：1385-1394(1997))。
其他具有各種特性之HER2抗體已描述於以下中：Tagliabue等人Int.J.Cancer 47：933-937(1991)；McKenzie等人Oncogene 4：543-548(1989)；Maier等人Cancer Res.51：5361-5369(1991)；Bacus等人Molecular Carcinogenesis 3：350-362(1990)；Stancovski等人PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus等人Cancer Research 52：2580-2589(1992)；Xu等人Int.J.Cancer 53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等人Cancer Research 52：2771-2776(1992)；Hancock等人Cancer Res.51：4575-4580(1991)；Shawver等人Cancer Res.54：1367-1373(1994)；Arteaga等人Cancer Res.54：3758-3765 (1994)；Harwerth等人J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美國專利第5,783,186號；及Klapper等人Oncogene 14：2099-2109(1997)。
曲妥珠單抗(Trastuzumab)(HERCEPTIN®；參見美國專利第5,821,337號)為鼠類HER2抗體4D5之一種重組人類化型式，其在已接受廣泛先前抗癌療法之HER2過度表現之轉移性乳癌患者中為臨床活性的(Baselga等人，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。為靶向HER信號傳導路徑，帕妥珠單抗(Pertuzumab)(PERJETATM；參見專利公開案WO2001/00245)作為鼠類抗體2C4之一種人類化型式而研發，其抑制HER2與其他HER受體之二聚，由此抑制配位體驅動之磷酸化及活化以及下游RAS及AKT路徑之活化。阿多-曲妥珠單抗恩坦辛(Ado-trastuzumab emtansine)(T-DM1；KADCYLA®)為曲妥珠單抗連接於細胞毒性劑美坦辛(mertansine)之抗體藥物結合物，其經批准用於對曲妥珠單抗具有抗性之HER2過度表現之轉移性乳癌患者。
雖然已充分證實曲妥珠單抗在乳癌中之治療功效，但對其嚴格限制且僅僅批准用於30%之腫瘤過度表現HER2之乳癌患者。70%之乳癌患者對曲妥珠單抗不反應或反應不足，因為其個別腫瘤不過度表現或不足夠表現HER2。在其他癌症及/或個別癌症中，HER2在43%至69%範圍內之顯著百分比病例中過度表現，然而，一般而言，HER2表現量原則上在大多數腫瘤中為低的。此外，HER2受體過度表現常常由編碼基因擴增引起(Hynes等人，Nat Rev Cancer 5：341(2005))。因此，當前的共識為抗-HER2單株抗體療法在HER2低表現或缺少過度表現之腫瘤中低效。此外，對此等抗-HER2抗體之抗性為一個重大問題。
假定在HER2表現量低且對當前療法具有抗性之特定癌症中缺乏有效抗-HER2療法，則需要改良之抗體，其能夠有效結合於HER2之表現量在更寬範圍內之癌細胞且經由例如(i)抗體依賴性細胞介導之細 胞毒性(ADCC)，及/或(ii)歸因於有效負載與抗體結合，呈抗體藥物結合物(ADC)的細胞毒性作用，及/或(iii)抑制受體調節信號傳導(例如藉由抑制受體二聚及/或調節受體內化)，來抑制其生長。
因此，本發明之一目標為提供改良之免疫治療劑，其有效抑制HER2介導之細胞信號傳導，可用於治療表現HER2之癌症，包括其中HER2之表現量不高的癌症。
本發明提供一種抗-HER2結合分子，其包含免疫球蛋白重鏈(VH)及免疫球蛋白輕鏈(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。亦提供一種抗-HER2結合分子，其包含VH及VL，其中該VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些態樣中，VH包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些態樣中，抗-HER2結合分子包含抗體或其抗原結合片段。
本發明亦提供一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中(i)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗體結合位點，(ii)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域II內之抗原決定基的第一HER2抗體結合位點，且(iii)該第一HER2抗體結合位點不同於帕妥珠單抗之抗體結合位點。在一些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域IV內之抗原決定基的第二HER2抗體結合位點。在一些態樣中，第二HER2抗體結合位點與曲妥珠單抗之HER2抗體結合位點一致。在一些態樣中，第二HER2抗體結合位點與曲妥珠單抗之HER2抗體結合位點部分重疊。在其他態樣中，第二HER2抗體結合位點不同於曲妥珠單抗之HER抗體結合位點。
本發明亦提供一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋 白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基；且其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域在包含SEQ ID NO：52中一或多個胺基酸殘基之抗原決定基結合HER2。
在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域在包含SEQ ID NO：52中一或多個胺基酸殘基之抗原決定基結合HER2，且第二免疫球蛋白抗原結合結構域在結構域IV內之抗原決定基特異性結合HER2。在一些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域在包含SEQ ID NO：53中一或多個胺基酸殘基之抗原決定基結合HER2。
在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含含有以下各者之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列；(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列；(iv)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列；(v)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列；以及(vi)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列。
在某些態樣中，相對於包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：43之VH及含有胺基酸序列SEQ ID NO：44之VL的免疫球蛋白抗原結合結構域，第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含至少一個異源可變域構架區 (FW)。
在某些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段。
在某些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之至少一個異源FW區包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域，該第一免疫球蛋白抗原結合結構域進一步包含(i)包含SEQ ID NO：11之可變輕鏈構架1(VL-FW1)胺基酸序列；(ii)包含SEQ ID NO：12之VH-FW2胺基酸序列；(iii)包含SEQ ID NO：13之VH-FW3胺基酸序列；(iv)包含SEQ ID NO：14之VH-FW4胺基酸序列；或(vi)其任何組合。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中該VH胺基酸序列包含SEQ ID NO：15；其中該第一或該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段，且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中該VL胺基酸序列包含SEQ ID NO：16；其中該第一或該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段，且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含VH及VL，其中該VH胺基酸序列包含SEQ ID NO：15；且其中該VL胺基酸序列包含SEQ ID NO：16，其中該第一或該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗 體片段，且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域，該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含以下或由以下組成：(a)進一步包含重鏈恆定區或其片段之VH及包含輕鏈恆定區或其片段之VL；(b)單鏈Fv(「scFv」)；(c)雙功能抗體；(d)微型抗體；(e)F(ab')2；或(f)F(ab)。在一些態樣中，重鏈恆定區或其片段為IgG恆定區。在一些態樣中，IgG恆定區或其片段為IgG1恆定區。在一些態樣中，LC恆定區為κ恆定區。
在一些態樣中，LC恆定區為λ恆定區。在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域為單株抗體。在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域為人類化抗體。在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域為人類抗體。在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域為嵌合抗體。在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域為親和力優化抗體。在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域不與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗競爭結合抗原決定基。在一些態樣中，第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同非重疊HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中(a)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於HER2之結構域IV中與曲妥珠單抗抗體相同之抗原決定基；(b)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域競爭性地抑制曲妥珠單抗抗體之HER2結合；及/或(c)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個具有選自由SEQ ID NO：54至59組成之群之胺基酸的互補決定區(CDR)。
在一些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv，該 scFv包含：(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸之VL-CDR3。在一些態樣中，scFv為經二硫化物穩定之scFv。在一些態樣中，scFv包含含有SEQ ID NO：17之胺基酸的VH及含有SEQ ID NO：18之胺基酸的VL。
在一些態樣中，scFv之VH與VL經由肽連接子共價連接。在一些態樣中，肽連接子包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價連接於第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之羧基端。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含***第二免疫球蛋白抗原結合結構域與第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之羧基端之間的連接子。在其他態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價連接於第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之胺基端。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含***第二免疫球蛋白抗原結合結構域與第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之胺基端之間的連接子。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價***第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之多肽鏈。在一些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價***第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之CH1區與CH2區之間。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含***第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之CH1區與第二免疫球蛋白抗原結合結構域之間的連接子，及***第二免疫球蛋白抗原結合結構域與第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之CH2區之間的第二連接子。
在一些態樣中，第一連接子與第二連接子一致。在其他態樣中，第一連接子與第二連接子不同。在一些態樣中，一或多個連接子包含肽連接子。在一些態樣中，肽連接子包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少10個、至少20個或至少30個胺基酸。在其他態樣中，肽連接子包含具有式Serx[(Gly)y-Ser4]z之肽，其中x為0至1，y為1至4，且z為1至10(SEQ ID NO：60)。在一些態樣中，肽連接子包含SEQ ID NO：19、20、21或22。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含可包括包含CH2及CH3區之Fc結構域之重鏈。在一些態樣中，Fc結構域為IgG1 Fc結構域。在其他態樣中，IgG1 Fc結構域為天然IgG1 Fc結構域。在一些態樣中，天然IgG1 Fc結構域包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。
在一些態樣中，Fc結構域為突變IgG1 Fc結構域。在其他態樣中，突變IgG1 Fc結構域包含至少一個能夠降低雙特異性抗體之ADCC活性的突變。在一些態樣中，至少一個能夠降低雙特異性抗體之ADCC活性的突變為胺基酸取代。在一些態樣中，至少一個胺基酸取代包含L234F、S239A、S239C或其任何組合。
在一些態樣中，突變IgG1 Fc結構域包含至少一個引入可衍生基團之胺基酸取代。在一些態樣中，可衍生基團為硫氫基。在一些態樣中，至少一個胺基酸取代包含S239C、248C、254C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、440C、441C、S442C、443C及446C或其任何組合。在一些態樣中，突變Fc結構域包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25之胺基酸。
亦提供一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含彼此締合之第一及第 二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含選自以下各者之序列：(1)[TZS]-[L1]-[BVH]-[BCH]-[FcX]
(2)[BVH]-[BCH]-[FcX]-[L2]-[TZS]
(3)[BVH]-[BCH]-[L3]-[TZS]-[L4]-[FcX]
其中TZS為結合與曲妥珠單抗相同之抗原決定基的scFv；L1、L2、L3及L4為肽連接子；FcX為Fc結構域；BVH及BCH分別為能夠結合於與曲妥珠單抗抗體所識別之抗原決定基不同的HER2抗原決定基之抗體的VH及CH1區。在某些態樣中，不同抗原決定基包含SEQ ID NO：52中之一或多個胺基酸殘基。
在一些態樣中，鉸鏈多肽連接[BCH]與[FcX]。在一特定態樣中，鉸鏈多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸或由其組成。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二鏈包含序列[BVL]-[CL]，其中BVL為能夠結合於與曲妥珠單抗抗體所識別之抗原決定基不同的HER2抗原決定基之抗體的VL區，且CL為IgG輕鏈恆定區。在一些態樣中，CL係選自由人類κ恆定區及人類λ恆定區組成之群。在一些態樣中，BVL包含(i)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。在一些態樣中，BVL包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：44之胺基酸。
在其他態樣中，CL為包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之κ輕鏈。
在其他態樣中，CL為包含胺基酸序列SEQ ID NO：66之λ輕鏈。
在一些態樣中，[TZS]包含(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸之VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸之VL-CDR3。在一些態樣中，[TZS]為經二硫化物穩定之scFv。在一些態樣中，[TZS]包含藉由肽連接子共價連接之包含胺基酸序列SEQ ID NO：17之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：18之VL。在一些態樣中，肽連接子包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。在一些態樣中，[TZS]包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。
在一些態樣中，[Fcx]之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：23、24、62、63、25、64及65組成之群。在一些態樣中，[L1]、[L2]、[L3]及[L4]之胺基酸獨立地選自由SEQ ID NO：19、20、21及22組成之群。在其他態樣中，(i)[L1]包含SEQ ID NO：20之胺基酸；(ii)[L2]包含SEQ ID NO：20之胺基酸；(iii)[L3]包含SEQ ID NO：21之胺基酸；以及(iv)[L4]包含SEQ ID NO：22之胺基酸。
在一些態樣中，[BVH]包含(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)。在一些態樣中，[BVH]包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：43。在其他態樣中，[BCH]包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。
在一些態樣中，[BVL]包含(i)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸 取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。在其他態樣中，[BVL]包含SEQ ID NO：16之胺基酸。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一多肽鏈包含選自由SEQ ID NO：30、31、67、32、68、69、33、70、71、34、35、72、36、73、74、37、75、76、38、39、77、40、78、79、41、80及81組成之群的胺基酸序列，且雙特異性抗-HER2抗體之第二多肽鏈包含SEQ ID NO：42或82之胺基酸。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域在結合於HER2標靶時誘發內化。在一些態樣中，雙特異性HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域在內化後促進有效溶酶體輸送。在一些態樣中，雙特異性HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域誘發HER2標靶降解。在一些態樣中，雙特異性HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域阻斷低HER2表現之癌細胞中配位體誘發之AKT磷酸化。在一些態樣中，雙特異性HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域破壞配位體誘發之HER2：HER3二聚。
本發明亦提供一種ADC，其包含本文所揭示之抗-HER2結合分子，或本文所揭示之抗-HER2雙特異性抗體，其進一步包含至少一種治療部分。在一些態樣中，ADC進一步包含至少一種視情況存在之間隔基。在一些態樣中，至少一種間隔基為肽間隔基。在一些態樣中，至少一種間隔基為非肽間隔基。
ADC之習知結合策略依賴於有效負載(例如治療部分)經由離胺酸或半胱胺酸隨機結合於抗體。因此，在一些態樣中，ADC隨機結合於治療部分。在特定態樣中，使用反應性胺基酸殘基在特定位置使治療部分位點特異性結合於抗體產生具有均一化學計量之均質ADC製劑。 在一些態樣中，ADC包含兩個、三個或四個或四個以上治療部分。在一些態樣中，所有治療部分均相同。在一些態樣中，各治療部分化學結合於雙特異性抗體之Fc區中之特定Kabat位置的胺基酸之側鏈。在一些態樣中，特定Kabat位置為239、442或兩者。在一些態樣中，特定位置為Kabat位置442、Kabat位置239與240之間的胺基酸***或兩者。在一些態樣中，胺基酸側鏈為硫氫基側鏈。在一些態樣中，治療部分包含細胞毒素、放射性同位素、奧瑞他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)或吡咯并苯并二氮呯(PBD)或其組合。在某些態樣中，細胞毒素為妥布賴森(tubulysin)。在某些態樣中，妥布賴森為化合物T32(在本文中亦稱為「妥布賴森1508」或簡稱為「1508」)。
本發明亦提供一種ADC，其包含雙特異性抗-HER2抗體，其中該抗體包含：
(i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於Kabat位置239之半胱胺酸胺基酸之妥布賴森分子。
(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含兩個共價連接於分別位於Kabat位置239及442之半胱胺酸胺基酸之妥布賴森分子。
(iii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於Kabat位置239之半胱胺酸胺基酸之妥布賴森分子。
(iv)包含SEQ ID NO：41之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含兩個共價連接於分別位於Kabat位置239及442之半胱胺酸胺基酸之妥布賴森分子。
本發明亦提供一種分離之核酸分子或一組核酸分子，其編碼抗-HER2結合分子(例如本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體)，或其互補 物。亦提供一種載體或一組載體，其包含此類核酸分子或此組核酸分子，或其互補物。亦提供一種宿主細胞，其包含該分離之核酸分子或該組核酸分子或該載體或該組載體。亦提供一種宿主細胞，其表現本文所揭示之抗-HER2結合分子或雙特異性抗-HER2抗體。亦提供一種用於產生抗-HER2結合分子或雙特異性抗-HER2抗體之方法，其包含培養該宿主細胞且自培養基回收抗體。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含抗-HER2結合分子或抗-HER2雙特異性抗體及醫藥學上可接受之載劑。亦提供一種治療表現HER2之癌症的方法，其包含向有需要之個體投與本文所揭示之抗-HER2結合分子、本文所揭示之抗-HER2雙特異性抗體、本文所揭示之ADC或本文所揭示之醫藥組合物。在一些態樣中，癌症為低HER2表現之癌症。在一些態樣中，該方法進一步包含投與至少一種其他治療劑。在一些態樣中，至少一種其他治療劑為放射核種或化學治療劑。亦提供一種使治療或預防藥劑靶向表現HER2之細胞之表面的方法，其包含使該藥劑結合於本文所揭示之抗-HER2結合分子或本文所揭示之抗-HER2雙特異性抗體。亦提供一種增加治療部分之活性的方法，其包含使藥劑結合於本文所揭示之抗-HER2結合分子或本文所揭示之抗-HER2雙特異性抗體。亦提供一種改善治療或預防藥劑之藥物動力學特性的方法，其包含使該藥劑結合於本文所揭示之抗-HER2結合分子或本文所揭示之抗-HER2雙特異性抗體。在一些態樣中，治療部分為細胞毒素。在一些態樣中，細胞毒素為妥布賴森。在一些態樣中，妥布賴森為化合物T32(在本文中亦稱為「妥布賴森1508」或簡稱為「1508」)。亦提供一種治療對靶向HER2之治療劑之抗性的方法，其包含向有需要之患者投與本文所揭示之雙特異性HER2抗體、本文所揭示之抗-HER2結合分子或本文所揭示之ADC。在一些態樣中，患者對包含曲妥珠單抗及/或類美登素DM1之靶向HER2之治療劑 具有抗性。
圖1展示對應於先導物優化39S抗體(LO)(分別為SEQ ID NO 16及15)及親本AZ 1.39.1抗體(WT)(分別為SEQ ID NO 44及43)之VL及VH區之胺基酸序列的序列比對。指示CDR1、CDR2及CDR3之位置。將相對於親本抗體不同之胺基酸殘基突出顯示。亦將VL區中之置換構架區突出顯示。
圖2展示改變生殖系IGKV2D之輕鏈構架使得表現加倍。
圖3展示HER2(SEQ ID NO：52)之細胞外域之結構的帶狀圖。用箭頭指示39S、帕妥珠單抗及結構域IV scFv之結合位點。39S之結合位點包括結構域II內不同於帕妥珠單抗之胺基酸。
圖4展示使用DL-680標記之39S(2μg/ml)及變化濃度之未標記單株抗體(R347對照、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、AZ 1.39.1及39S)的FACS競爭分析。
圖5展示使用不同抗體組合及細胞株MCF-7之配位體依賴性增殖分析，證實39S在與曲妥珠單抗及/或帕妥珠單抗組合投與時協同抑制所分析之細胞株之生長。對於每一實驗，繪製之抗體樣品為：R347對照、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗加曲妥珠單抗、39S、39S加曲妥珠單抗及39S加帕妥珠單抗。
圖6展示使用不同抗體組合及細胞株NCI-N87之配位體依賴性增殖分析，證實39S在與曲妥珠單抗及/或帕妥珠單抗組合投與時協同抑制所分析之細胞株之生長。對於每一實驗，繪製之抗體樣品為：R347對照、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗加曲妥珠單抗、39S、39S加曲妥珠單抗及39S加帕妥珠單抗。
圖7描繪雙特異性構築體，其中HER2結合部分(在結構域IV內結合之經半胱胺酸穩定之scFv)已基因融合至39S抗體之結構內的不同位 置。scFv融合至39S抗體之每一重鏈之羧基端(稱為「Bs3Ab-39SH」)(圖7B)，融合至39S抗體之每一重鏈之胺基端(稱為「Bs2Ab-39SH」)(圖7A)或***39S抗體之每一重鏈之CH1與CH2區之間(稱為「Bs4Ab-39SH」)(圖7C)。
圖8A展示Bs2抗體之重鏈之序列，指示野生型重鏈以及可針對ADCC活性或針對具有降低之ADCC活性及/或位點特異性結合之ADC的產生優化的重鏈中Kabat位置234、239、239-ins、330、332及442的胺基酸。圖8A揭示共同序列為SEQ ID NO：84。
圖8B展示Bs3抗體之重鏈之序列，指示野生型重鏈以及可針對ADCC活性或針對具有降低之ADCC活性及/或位點特異性結合之ADC的產生優化的重鏈中Kabat位置234、239、239-ins、330、332及442的胺基酸。圖8B揭示共同序列為SEQ ID NO：85。
圖8C展示Bs4抗體之重鏈之序列，指示野生型重鏈以及可針對ADCC活性或針對具有降低之ADCC活性及/或位點特異性結合之ADC的產生優化的重鏈中Kabat位置234、239、239-ins、330、332及442的胺基酸。圖8C揭示共同序列為SEQ ID NO：86。
圖9A展示使用不同雙特異性抗體構築體及MDA-MB-361細胞之配位體依賴性增殖分析，證實Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及Bs4Ab-39SH在MDA-MB-361及MCF-7細胞(分別圖9A及9B)中具有類似效能，其亦與親本抗體組合(39S加曲妥珠單抗)之活性相當。對於每一實驗，繪製之抗體樣品為：R347對照、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH及39S加帕妥珠單抗。
圖9B展示使用不同雙特異性抗體構築體及MCF-7細胞之配位體依賴性增殖分析，證實Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及Bs4Ab-39SH在MDA-MB-361及MCF-7細胞(分別圖9A及9B)中具有類似效能，其亦與親本抗體組合(39S加曲妥珠單抗)之活性相當。對於每一實驗，繪製 之抗體樣品為：R347對照、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH及39S加帕妥珠單抗。
圖10展示HER2自T47D細胞之免疫沈澱(IP)，接著HER2及HER3之西方(WB)偵測，以量測在抗-HER2抗體存在或不存在下由海瑞古林(heregulin)(HRG1)誘發之HER2：HER3二聚破壞。將T47D細胞在對照條件(不具有抗體及不具有HRG1；不具有抗體但具有HRG1；或具有對照抗體R347及HRG1)下培育，且接著與HRG1加(i)曲妥珠單抗、(ii)帕妥珠單抗、(iii)39S抗體或(iv)Bs2Ab-39SH雙特異性構築體一起培育。
圖11展示代表性HPLC尺寸排阻層析型態，其展示由1：1抗體：HER2之莫耳比衍生之免疫複合物的尺寸分離。Bs2Ab-39SH可交聯許多HER2分子以形成尺寸大到1716kDa之複合物，而曲妥珠單抗可僅僅結合於最多兩個HER2分子而形成320kDa複合物。
圖12呈現基於FACS之受體內化分析，其展示圖6中呈現之HER2雙特異性抗體之三種格式在細胞株BT-474中迅速內化。圖上繪製：R347對照、曲妥珠單抗、39S、曲妥珠單抗加39S、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及BsAb-39SH。類似結果在MCF-7、T47D、RT-112、MDA-MB-361及NCI-N87細胞株中見到(資料未展示)。
圖13展示藉由BT-474細胞內化Bs2Ab-39SH之動力學。在添加Bs2Ab-39SH構築體、曲妥珠單抗或R347對照之後0、30、60、120及360分鐘獲取顯微影像。將BT-474細胞之細胞質用CELLTRACKERTM綠(Life Technologies Corp.)染色，且抗體用ALEXA FLUOR®647(Life Technologies Corp.)標記。
圖14為西方免疫墨點，其展示在BT-474細胞與抗體樣品一起培育2小時、6小時及24小時後的HER2降解程度或其缺乏。GAPDH用作對照。測試之抗體樣品為：(色帶1)R347對照抗體、(色帶2)曲妥珠單 抗、(色帶3)帕妥珠單抗、(色帶4)曲妥珠單抗及帕妥珠單抗、(色帶5)39S、(色帶6)曲妥珠單抗及39S、(色帶7)帕妥珠單抗及39S、(色帶8)曲妥珠單抗、帕妥珠單抗及39S、(色帶9)Bs2Ab-39SH、(色帶10)Bs2Ab-39SH_aFuc(均勻去海藻糖基化Bs2Ab-39SH)、(色帶11)Bs3Ab-39SH、(色帶12)Bs3Ab-39SH_aFuc(均勻去海藻糖基化Bs3Ab-39SH_aFuc)、(色帶13)Bs4Ab-39SH及(色帶14)Bs4Ab-39SH_aFuc(均勻去海藻糖基化Bs4Ab-39SH)。
圖15為由Bs2Ab-39SH(圖A)、Bs3Ab-39SH(圖B)及Bs4Ab-39SH(圖C)抗-HER2構築體衍生的示例性ADC之詳細草圖。ADC構築體之CH2及CH3域中兩個潛在之經工程改造之細胞毒性劑結合位點藉由圓圈指示。在所需藥物與抗體比率(DAR)為2：1之情況下，可使用位點1或位點2。在需要4之DAR下，利用位點1與2。可對替代性及/或另外的位點進行工程改造。本文中，對於DAR為約2之ADC，雙特異性抗-HER2 ADC縮寫為「Bs2Ab-2T」、「Bs3Ab-2T」及「Bs4Ab-2T」(或簡稱為「Bs2-2T」、「Bs3-2T」及「Bs4-2T」)，且對於DAR為約4之ADC，雙特異性抗-HER2 ADC縮寫為「Bs2Ab-4T」、「Bs3Ab-4T」及「Bs4Ab-4T」(或簡稱為「Bs2-4T」、「Bs3-4T」及「Bs4-4T」)。缺乏任何細胞毒性劑之雙特異性構築體藉由圖7中所提供之名稱提及且可鑑別為「無臂」。如本文所提供(參見例如圖8)，經工程改造之結合位點可經選擇以降低或除去ADCC功能。或者或另外，抗體之Fc部分可進一步包含降低或除去ADCC活性之其他突變。或者，可使用經典結合方法產生ADC，諸如經由抗體常常大量之離胺酸殘基或天然半胱胺酸殘基結合於抗體，產生非均質的抗體-藥物結合物混合物。
圖16A呈現經1μg/ml在各影像下所指示之抗體處理之SKOV-3細胞之免疫螢光影像，展示細胞內微管網路破壞或缺乏其。展示微管染色。測試以下樣品：不具有任何抗體之培養基對照(影像i)、R347對 照抗體(影像ii)、曲妥珠單抗(影像iii)、Bs2Ab-39SH(影像iv)、R347-DM1(結合於細胞毒性劑類美登素DM1之R347對照抗體)(影像v)、R347-4T(結合於4分子細胞毒性劑妥布賴森之R347對照抗體)(影像vi)、T-DM1(結合於類美登素DM1之曲妥珠單抗)(影像vii)及Bs2-4T(結合於4分子細胞毒性劑妥布賴森之Bs2Ab-39SH)(影像viii)。
圖16B呈現經1μg/ml在各影像下所指示之抗體處理之JIMT-1細胞之免疫螢光影像，展示細胞內微管網路破壞或缺乏其。展示微管染色。測試以下樣品：不具有任何抗體之培養基對照(影像i)、R347對照抗體(影像ii)、曲妥珠單抗(影像iii)、Bs2Ab-39SH(影像iv)、R347-DM1(結合於細胞毒性劑類美登素DM1之R347對照抗體)(影像v)、R347-4T(結合於4分子細胞毒性劑妥布賴森之R347對照抗體)(影像vi)、T-DM1(結合於類美登素DM1之曲妥珠單抗)(影像vii)及Bs2-4T(結合於4分子細胞毒性劑妥布賴森之Bs2Ab-39SH)(影像viii)。
圖16C呈現經1μg/ml在各影像下所指示之抗體處理之RT-112細胞之免疫螢光影像，展示細胞內微管網路破壞或缺乏其。展示微管染色。測試以下樣品：不具有任何抗體之培養基對照(影像i)、R347對照抗體(影像ii)、曲妥珠單抗(影像iii)、Bs2Ab-39SH(影像iv)、R347-DM1(結合於細胞毒性劑類美登素DM1之R347對照抗體)(影像v)、R347-4T(結合於4分子細胞毒性劑妥布賴森之R347對照抗體)(影像vi)、T-DM1(結合於類美登素DM1之曲妥珠單抗)(影像vii)及Bs2-4T(結合於4分子細胞毒性劑妥布賴森之Bs2Ab-39SH)(影像viii)。
圖17A展示相對於T-DM1、未結合(無臂)Bs2Ab-39SH及曲妥珠單抗，具有2或4之DAR之Bs2Ab格式對SKBR-3人類乳癌細胞株的細胞毒性活性。亦展示R347(R347對照抗體)、與2或4個妥布賴森結合之R347(分別為R347-2T及R3474T)、與DM1結合之R347的曲線。Bs2-2T與Bs2-4T均比T-DM1更有效。
圖17B展示相對於T-DM1、未結合(無臂)Bs4Ab-39SH及曲妥珠單抗，具有2或4之DAR之Bs4Ab格式對SKBR-3人類乳癌細胞株的細胞毒性活性(圖B)。亦展示R347(R347對照抗體)、與2或4個妥布賴森結合之R347(分別為R347-2T及R3474T)、與DM1結合之R347的曲線。Bs4-2T與Bs4-4T均比T-DM1更有效。
圖18A展示相對於T-DM1、未結合(無臂)Bs2Ab-39SH及曲妥珠單抗，具有2或4之DAR之Bs2Ab格式對JIMT-1人類乳癌細胞株的細胞毒性活性。亦展示R347(R347對照抗體)、與2或4個妥布賴森結合之R347(分別為R347-2T及R3474T)、與DM1結合之R347的曲線。Bs2-2T與Bs2-4T均非常有效殺死JIMT-1細胞，而T-DM1不展示活性。
圖18B展示相對於T-DM1、未結合(無臂)Bs4Ab-39SH及曲妥珠單抗，具有2或4之DAR之Bs4Ab格式對JIMT-1人類乳癌細胞株的細胞毒性活性(圖B)。亦展示R347(R347對照抗體)、與2或4個妥布賴森結合之R347(分別為R347-2T及R3474T)、與DM1結合之R347的曲線。Bs4-2T與Bs4-4T均非常有效殺死JIMT-1細胞，而T-DM1不展示活性。
圖19A展示相對於T-DM1、未結合(無臂)Bs2Ab-39SH及曲妥珠單抗，具有2或4之DAR之Bs2Ab格式對ZR-75-1人類乳癌細胞株的細胞毒性活性。亦展示R347(R347對照抗體)、與2或4個妥布賴森結合之R347(分別為R347-2T及R3474T)、與DM1結合之R347的曲線。Bs2-4T殺死ZR-75-1細胞之活性最強，而Bs2-2T具有較低活性水準且T-DM1展示無或有限的細胞毒性活性。
圖19B展示相對於T-DM1、未結合(無臂)Bs4Ab-39SH及曲妥珠單抗，具有2或4之DAR之Bs4Ab格式對ZR-75-1人類乳癌細胞株的細胞毒性活性(圖B)。亦展示R347(R347對照抗體)、與2或4個妥布賴森結合之R347(分別為R347-2T及R3474T)、與DM1結合之R347的曲線。Bs4-4T殺死ZR-75-1細胞之活性最強，而Bs4-2T具有較低活性水準且 T-DM1展示無或有限的細胞毒性活性。
圖20展示相對於T-DM1、未結合(無臂)Bs2Ab-39SH及曲妥珠單抗，具有2或4之DAR之Bs2Ab格式對MDA-MB-468人類乳癌細胞株的細胞毒性活性(圖A)。亦展示R347(R347對照抗體)、與2或4個妥布賴森結合之R347(分別為R347-2T及R3474T)、與DM1結合之R347的曲線。數據表明在MDA-MB-468細胞中Bs2-2T與Bs2-4T均無活性，表明Bs2-2T與Bs2-4T之細胞毒性活性視標靶(HER2)而定。類似結果在Bs4-2T及Bs4-4T下觀測到(資料未展示)。
圖21A展示MDA-MB-361腫瘤模型中抗-HER2 ADC活性之活性。展示對應於經以下處理之小鼠的腫瘤生長曲線；(1)媒劑對照；(2)R347-4T(結合於4個妥布賴森分子之R347對照抗體)，3mg/kg；(3)T-DM1(曲妥珠單抗-DM1 ADC)，3mg/kg；(4)Bs2 ADMix(與妥布賴森混合之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體)，3mg/kg；及(5)Bs2-4T(結合於4個妥布賴森之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體)，0.3、1及3mg/kg。濃度在括弧之間指示。
圖21B展示MDA-MB-361腫瘤模型中抗-HER2 ADC活性之活性。展示對應於經以下處理之小鼠的腫瘤生長曲線；(1)媒劑對照；(2)R347-4T(結合於4個妥布賴森分子之R347對照抗體)，3mg/kg；(3)T-DM1(曲妥珠單抗-DM1 ADC)，3mg/kg；(4)Bs4 ADMix(與妥布賴森混合之Bs4Ab-39SH-(FCC)構築體)，3mg/kg；及(5)Bs4-4T(結合於4個妥布賴森之Bs4Ab-39SH-(FCC)構築體)，0.3、1及3mg/kg。濃度在括弧之間指示。
圖22展示ST996三重陰性(ER-/PR-/HER2-1+)PDX腫瘤模型中抗-HER2 ADC之活性。展示對應於經以下處理之小鼠的腫瘤生長曲線；(1)媒劑對照(CTRL)；(2)同型R347-2T CTRL(結合於2個妥布賴森分子之R347對照抗體)；(3)同型R347-4T CTRL(結合於4個妥布賴森分子 之R347對照抗體)；(4)T-DM1(曲妥珠單抗-DM1 ADC)；(5)ADMix(與妥布賴森混合之構築體)；(6)Bs2-2T，亦即結合於2個妥布賴森之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體；或(7)Bs2-4T，亦即結合於4個妥布賴森之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體。濃度在括弧之間指示。給藥時間亦藉由箭頭指示。回應於各種處理之腫瘤生長曲線以平均腫瘤體積(mm3)±SEM呈現。
圖23展示ST225(HER2-3+)BrCa PDX腫瘤模型中抗-HER2 ADC活性之活性。展示對應於經以下處理之小鼠的腫瘤生長曲線；(1)媒劑對照；(2)R347-4T(結合於4個妥布賴森分子之R347對照抗體)；(3)T-DM1(曲妥珠單抗-DM1 ADC)；(4)BS2 ADMix(與妥布賴森混合之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體)；及(5)Bs2-4T(結合於4個妥布賴森之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體)。濃度在括弧之間指示。
圖24展示T-DM-1無反應JIMT-1(HER2-3+)BrCa CBX腫瘤模型中抗-HER2 ADC活性之活性。展示對應於經以下處理之小鼠的腫瘤生長曲線；(1)媒劑對照；(2)R347-4T(結合於4個妥布賴森分子之R347對照抗體)；(3)T-DM1(曲妥珠單抗-DM1 ADC)；(4)BS2 ADMix(與妥布賴森混合之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體)；及(5)Bs2-4T(結合於4個妥布賴森之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體)。濃度在括弧之間指示。
圖25展示ST455B三重陰性(ER-/PR-/HER2-1+)BrCa PDX腫瘤模型中抗-HER2 ADC活性之活性。展示對應於經以下處理之小鼠的腫瘤生長曲線；(1)媒劑對照(CTRL)；(2)同型CTRL(結合於4個妥布賴森分子之R347對照抗體)；(3)T-DM1(曲妥珠單抗-DM1 ADC)；(4)BS2ADMix(與妥布賴森混合之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體)；及(5)Bs2-4T(結合於4個妥布賴森之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體)。濃度在括弧之間指示。
圖26A展示Bs2-4T及T-DM1對親本NCI-N87細胞株(左圖)及對T- DM1具有獲得性抗性之NCI-N87細胞株(右圖)的細胞毒性活性。Bs2-4T在親本細胞株中具有更有效活性，且仍然具有殺死T-DM1抗性細胞之活性。
圖26B展示T-DM1抗性NCI-N87腫瘤模型中抗-HER2 ADC之活性。展示對應於未經處理之小鼠及經以下處理之小鼠的腫瘤生長曲線：(1)ADMix(與妥布賴森混合之構築體)；(2)T-DM1(曲妥珠單抗-DM1 ADC)；(3)T-DM1(曲妥珠單抗-DM1 ADC)加帕妥珠單抗；或(4)Bs2-4T，亦即結合於4個妥布賴森之Bs2Ab-39SH-(FCC)構築體。濃度在括弧之間指示。回應於各種處理之腫瘤生長曲線以平均腫瘤體積(mm3)±SEM呈現(n=7)。*藉由史都登氏t(Student's t test)檢驗，與未經處理之對照組相比，P<0.001。
圖27展示在經曲妥珠單抗預處理之後抗-HER2 ADC之活性。展示對應於經以下處理之小鼠的腫瘤生長曲線：(1)媒劑CTRL(對照)；(2)曲妥珠單抗，接著Bs2-4T；(3)媒劑，接著Bs2-4T；(4)曲妥珠單抗，接著Bs2-4T；或(5)媒劑，接著Bs2-4T。濃度及給藥方案在圓括號之間指示。回應於各種處理之腫瘤生長曲線以平均腫瘤體積(mm3)±SEM呈現(n=10)。
圖28A展示評估雙特異性ADC之旁觀者效應之分析的示意圖。
圖28B展示經(i)單獨培養基、(ii)R347-T4對照、(iii)T-DM1、(iv)Bs2Ab-39SH混合物及(v)Bs2-4T處理之細胞的FACS分析結果。兩象限中細胞數目之減少指示Bs2-4T可殺死共培養物中表現HER2與無HER2之細胞，表明Bs2-4T具有旁觀者效應。相比之下，T-DM1無法殺死共培養物中無HER2之細胞，表明其不具有旁觀者效應。
圖29展示相對於T-DM1及R347-4T(結合於4個妥布賴森分子之R347對照抗體)，Bs2-4T對癌症幹細胞(CSC)球形成之活性(左圖)；以及相對於R34-4T(結合於4個妥布賴森分子之R234對照抗體)，Bs2-4T 對異種移植腫瘤中CSC之活性(右圖)。
圖30A展示使用細胞株MDA-MB-361(來源於腦轉移之人類***導管上皮腺癌)之配位體依賴性增殖分析，其展示所有ADCC增強之去海藻糖基化雙特異性抗體保留活體外抗增殖活性。在每一實驗中，所用抗體樣品為：R347對照、39S加曲妥珠單抗、Bs2Ab-39SH_aFuc、Bs3Ab-39SH_aFuc及Bs4Ab-39SH_aFuc。
圖30B展示使用細胞株MCF-7(人類侵襲性***導管腺癌)之配位體依賴性增殖分析，其展示所有ADCC增強之去海藻糖基化雙特異性抗體保留活體外抗增殖活性。在每一實驗中，所用抗體樣品為：R347對照、39S加曲妥珠單抗、Bs2Ab-39SH_aFuc、Bs3Ab-39SH_aFuc及Bs4Ab-39SH_aFuc。
圖31A展示使用MDA-MB-361細胞作為標靶及經工程改造之NK效應細胞(穩定表現CD16)之ADCC細胞毒性分析，其展示各去海藻糖基化雙特異性抗體與具有海藻糖基化糖型之相同構築體相比，具有更有效ADCC活性。所用抗體樣品為：(1)R347對照、(2)曲妥珠單抗、(3)曲妥珠單抗_aFuc、(4)Bs2Ab-39SH及(5)Bs2Ab-39SH_aFuc。
圖31B展示使用MDA-MB-361細胞作為標靶及經工程改造之NK效應細胞(穩定表現CD16)之ADCC細胞毒性分析，其展示各去海藻糖基化雙特異性抗體與具有海藻糖基化糖型之相同構築體相比，具有更有效ADCC活性。所用抗體樣品為：(1)R347對照、(2)曲妥珠單抗、(3)曲妥珠單抗_aFuc、(4)Bs3Ab-39SH及(5)Bs3Ab-39SH_aFuc。
圖31C展示使用MDA-MB-361細胞作為標靶及經工程改造之NK效應細胞(穩定表現CD16)之ADCC細胞毒性分析，其展示各去海藻糖基化雙特異性抗體與具有海藻糖基化糖型之相同構築體相比，具有更有效ADCC活性。所用抗體樣品為：(1)R347對照、(2)曲妥珠單抗、(3)曲妥珠單抗_aFuc、(4)Bs4Ab-39SH及(5)Bs4Ab-39SH_aFuc。
圖32展示妥布賴森1508有效負載之結構。在遙遠右側之順丁烯二醯亞胺基之雙鍵容易與在半胱胺酸上發現之硫醇基反應，形成穩定的碳-硫鍵。
圖33展示使用Bs2Ab-FCC構築體作為可衍生平台之示例性位點特異性抗體藥物結合方法。該方法包含以下步驟：(a)打開可衍生胺基酸(例如半胱胺酸)之尺寸鏈；(b)氧化；(c)結合有效負載(例如細胞毒性劑，諸如妥布賴森)；及(d)藉由移除結合試劑及未反應之有效負載進行純化。
本發明提供優化抗-HER2抗體及衍生自此類優化抗-HER2抗體之雙特異性抗體。亦提供包含此類優化抗-HER2抗體或雙特異性抗-HER2抗體之相關聚核苷酸、載體、細胞及醫藥組合物。亦提供製造此類優化抗-HER2抗體或雙特異性抗體之方法。此外，本發明提供使用優化抗-HER2抗體或雙特異性抗-HER2抗體之方法，例如治療有需要之個體之癌症的方法。
本發明亦提供衍生自優化抗-HER2抗體及衍生自此類優化抗-HER2抗體之雙特異性抗體的抗體-藥物結合物(ADC)。亦提供衍生自此類優化抗體及雙特異性抗體之ADC的製造方法。亦提供衍生自優化抗-HER2抗體及雙特異性抗體之ADC之使用方法，例如治療有需要之個體之癌症的方法。亦提供治療患有對化學療法具有抗性之癌症(例如T-DM1無反應或不良反應患者中之腫瘤)之患者的方法，治療復發、難治性或無法經其他療法、尤其單特異性ADC療法(例如T-DM1)治療之患者的方法，或治療在經其他療法(例如T-DM1)預治療之後的患者的方法。
詳言之，本發明提供適合於治療HER2表現量低之癌症的抗-HER2結合分子。
為使本發明更易於理解，首先對某些術語進行定義。在整個實施方式中，闡述其他定義。
I. 定義
在詳細描述本發明之前，應瞭解本發明不限於特定組合物或方法步驟，因而可改變。除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」及「一(an)」及「該(the)」包括複數個指示物。術語「一(a)」(或「一(an)」)以及術語「一或多個/種」及「至少一個/種」在本文中可互換使用。
此外，本文所用之「及/或」應視為兩種指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之特定揭示。因此，本文中諸如「A及/或B」之短語中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，諸如「A、B及/或C」之短語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999,Academic Press；及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，為熟習此項技術者提供許多用於本發明中之術語的通用詞典。
單位、字首及符號以其國際單位體系(Système International de Unites，SI)接受之形式表示。數值範圍包括界定該範圍之數字。除非另外指示，否則胺基酸序列以胺基至羧基方向自左向右書寫。本文所 提供之標題不限制各種態樣，其可整體上參考本說明書。因此，下文緊接著定義之術語由整個說明書更充分定義。
應瞭解無論何種情況下，本文中用語言「包含」描述態樣，則亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」所描述之類似態樣。
氨基酸在本文中可由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名法委員會(Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之單字母符號來提及。類似地，核苷酸由其通常接受之單字母代碼來提及。
術語「HER2」與「HER2受體」在本文中可互換使用，且係指ErbB2蛋白質(文獻中亦稱為HER2/neu)。如本文所使用，該等術語意欲包括HER2之變異體(例如剪接變異體)、同功異型物及同源物(直系同源物與旁系同源物)。在一些態樣中，本文所揭示之抗-HER2結合分子結合於HER2藉由抑制HER2與其他ErbB家族成員之間的雜聚複合物形成，例如抑制與EGFR或HER3之雜二聚，來抑制表現HER2之細胞(亦即通常腫瘤細胞，且尤其HER2表現量低之癌細胞)的生長。
HER2為受體酪胺酸激酶且由以下構成：細胞外域(ECD)，其由(i)負責配位體結合之兩個富含白胺酸之結構域(結構域I/L1及結構域III/L2)，及(ii)負責受體二聚之兩個富含半胱胺酸之結構域(結構域II/CR1及結構域IV/CR2)組成；跨膜結構域；以及細胞內酪胺酸激酶結構域。存在HER2之替代性剪接變異體。HER2之替代性剪接變異體之實例包括p100及赫斯塔丁(herstatin)(兩種可溶形式)以及611-CTF、687-CTF、648-CTF及△16HER2。HER2之可溶形式可與全長受體(p185)相互作用且抑制受體二聚；687-CTF無活性；611-CTF及648-CTF可活化若干細胞內信號轉導路徑；且△16HER2缺乏結構域IV中之胺基酸634-649，該等胺基酸誘發促進組成性活化之HER2均二聚體形 成的構形改變。不具有信號序列之成熟HER2之細胞外部分對應於標準同功異型物1之位置23-652(參見Uniprot P04626；亦參見「Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab」Cho等人，Nature 421：756-760(2003)，以全文引用的方式併入本文中)。帕妥珠單抗抗體結合於HER2之結構域II內之抗原決定基。不結合於結構域II內帕妥珠單抗結合抗原決定基之抗體包括曲妥珠單抗，其結合於結構域IV內之抗原決定基。
術語「抑制」、「阻斷」及「遏制」在本文中可互換使用且係指生物活性之任何統計學上顯著之減少，包括活性完全阻斷。舉例而言，「抑制」可指生物活性減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。因此，當應用術語「抑制」或「遏制」描述例如對配位體介導之HER2磷酸化之作用時，術語係指相對於未經處理之(對照)細胞中之磷酸化，抗-HER2抗體或包含其抗原結合片段之HER2結合分子能夠在統計學上顯著減少由類EGF配位體誘發之HER2磷酸化。
表現HER2之細胞可為天然存在之細胞或細胞株(例如癌細胞)或可藉由將編碼HER2之核酸引入宿主細胞而以重組方式產生。在一個態樣中，如例如藉由西方墨點法，接著用抗-磷酸化酪胺酸抗體探測或藉由ELISA所測定，抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或包含其抗原結合片段之HER2結合分子，抑制配位體介導之HER2磷酸化至少10%，或至少20%，或至少30%，或至少40%，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或約100%。
如本文所使用，術語表現HER2之細胞之「生長遏制」或「生長抑制」係指相對於在不存在抗-HER2結合分子下之增殖，抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或包含其抗原結合片段之HER2結合分子能夠在統計學上顯著減少表現HER2之細胞增殖。在一個態樣中，相 對於在不存在抗-HER2結合分子(對照條件)下量測之增殖，表現HER2之細胞(例如癌細胞)之增殖在細胞與抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或包含其抗原結合片段之HER2結合分子接觸時可減少至少10%，或至少20%，或至少30%，或至少40%，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或約100%。細胞增殖可根據此項技術中已知之各種方法，例如藉由計數活細胞數目，鑑別生長標記物之標記物的存在，量測分子(例如放射性標記分子，如3H-胸苷)之併入，藉由量測腫瘤尺寸(例如按體積計或按重量計)等來量測。在某些態樣中，生長遏制係指數目、尺寸或癌轉移分佈減少。
如在整個說明書中所使用，短語「抗-HER2結合分子」係指例如(i)本申請案中所揭示之結合與1.39.1抗體(參見PCT公開案第WO 2008/019290號)相同之抗原決定基或衍生自1.39.1抗體的抗體及其抗原結合片段，例如39S抗體及其抗原結合片段，且一般而言包含此類抗體及其抗原結合片段之分子；(ii)結合與39S抗體相同之抗原決定基或衍生自39S抗體的抗-HER2抗體及其他HER2結合分子，其併有其他抗原結合部分，例如雙特異性抗體；(iii)包含至少一種根據(i)或(ii)之分子結合於細胞毒性部分(例如小分子抗癌劑、放射核種等)的抗體-藥物結合物(ADC)；及(iv)具有增強之ADCC的根據(i)或(ii)之抗-HER2分子。如本文所使用，術語「39S抗體」係指衍生自PCT公開案第WO 2008/019290號中所揭示之1.39.1抗體的先導物優化單株抗體，其中該優化抗體包含含有SEQ ID NO：15之胺基酸的VH及含有SEQ ID NO：16之胺基酸的VL。
如本文所使用，術語「妥布賴森」總體上且個別地係指天然存在之妥布賴森及妥布賴森之類似物及衍生物。妥布賴森之說明性實例揭示於例如WO2004005326A2、WO2012019123A1、WO2009134279A1、WO2009055562A1、WO2004005327A1、US7754885、US20100240701、 US7816377、US20110021568及US20110263650中以及本文所提供之實例中。應瞭解此類衍生物包括例如妥布賴森前藥或包括一或多個保護或保護基團、一或多個連接部分之妥布賴森。
可使用此項技術所公認之技術分析細胞增殖，該等技術量測細胞***速率，及/或進行細胞***之細胞群體內之細胞分率，及/或細胞因終末分化或細胞死亡(例如併入胸苷)而自細胞群體損失之速率。
如在本文中可互換使用之術語「抗體」或「免疫球蛋白」包括全抗體及其任何抗原結合片段或單鏈以及其組合(例如雙特異性抗體)。
典型抗體包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區(本文中縮寫為CH)構成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2及CH3構成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個結構域(CL)構成。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為構架區(FW)之更保守區。每個VH及VL均由三個CDR及四個FW構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q))的結合。本發明之示例性抗體包括典型抗體、scFv及其組合，其中例如scFv共價連接(例如經由肽鍵或經由化學連接子)於典型抗體之重鏈及/或輕鏈之N端，或***典型抗體之重鏈及/或輕鏈中。
術語「抗體」意謂經由免疫球蛋白分子之可變區內的至少一個抗原識別位點，識別且特異性結合於標靶，諸如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂質或上述各者之組合的免疫球蛋白分子。 如本文所使用，術語「抗體」涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈可變片段(scFv)、經二硫化物穩定之scFv、多特異性抗體(諸如由至少兩種完整抗體及/或其抗原結合片段產生之雙特異性抗體)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、包含抗體之抗原決定部分之融合蛋白及包含抗原識別位點之任何其他經修飾之免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現所需生物活性即可。
抗體可基於稱為α、δ、ε、γ及μ之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域身分，而分別屬於免疫球蛋白之五個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或其亞類(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。免疫球蛋白之不同類別具有不同且熟知之次單元結構及三維組態。抗體可為裸的或結合於諸如毒素、放射性同位素等其他分子以形成ADC。
「阻斷」抗體或「拮抗」抗體為抑制或降低其結合之抗原，諸如HER2之生物活性的抗體。在某一態樣中，阻斷抗體或拮抗抗體實質上或完全抑制抗原之生物活性。理想地，生物活性降低10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
術語「抗-HER2抗體」或「抗-HER2」係指能夠以足夠親和力結合HER2，使得抗體適用作靶向HER2之治療劑或診斷試劑的抗體。如例如藉由放射免疫分析(RIA)或BIACORETM(使用重組HER2作為分析物及抗體作為配位體，或反之亦然)或此項技術中已知之其他結合分析量測，抗-HER2抗體與不相關之非HER2蛋白質的結合程度小於抗體與HER2結合的約10%。在某些態樣中，結合於HER2之抗體的解離常數(KD)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、10pM、1pM或0.1pM。
術語「抗原結合片段」係指完整抗體之一部分且係指完整抗體 之抗原決定可變區。此項技術中已知抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段來執行。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
「單株抗體」係指參與單一抗原決定子或抗原決定基之高度特異性識別及結合的均質抗體。此與多株抗體形成對比，多株抗體通常包括針對不同抗原決定子之不同抗體。
術語「單株抗體」涵蓋完整與全長單株抗體以及抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈可變片段(scFv)、包含抗體部分之融合蛋白及包含抗原識別位點的任何其他經修飾之免疫球蛋白分子。此外，「單株抗體」係指以多種方式，包括(但不限於)藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現及轉殖基因動物(例如人類抗體在轉殖基因小鼠中之表現)製備之抗體。
術語「人類化抗體」係指衍生自非人類(例如鼠類)免疫球蛋白之抗體，其已經工程改造以含有最少非人類(例如鼠類)序列。通常，人類化抗體為其中來自CDR之殘基經來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)之CDR之殘基替換的人類免疫球蛋白，其具有所需特異性、親和力及能力(Jones等人，1986,Nature,321：522-525；Riechmann等人，1988,Nature,332：323-327；Verhoeyen等人，1988,Science,239：1534-1536)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FW殘基經來自非人類物種之具有所需特異性及/或親和力及/或能力的抗體中之對應殘基置換。
人類化抗體可藉由FW區及/或置換之非人類殘基內其他殘基之取代而進一步經修飾以改善及優化抗體特異性及/或親和力及/或能力。一般而言，人類化抗體將包含至少一個及通常兩個或三個含有對應於非人類免疫球蛋白之所有或實質上所有CDR區之可變結構域的實質上 全部，而所有或實質上所有FW區域為人類免疫球蛋白共同序列之FW區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或域(Fc)，通常人類免疫球蛋白恆定區或域之至少一部分。用於產生人類化抗體之方法的實例描述於美國專利第5,225,539號或第5,639,641號中。
抗體之「可變區」係指單獨或組合形式之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。重鏈及輕鏈之可變區各由四個由三個CDR區連接之FW區組成。每條鏈中之CDR藉由FW區緊密地固持在一起，且與來自另一鏈之CDR一起促進抗體之抗原結合位點的形成。存在至少兩項技術用於確定CDR：(1)基於交叉物種序列變化性之方法(亦即Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；以及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。此外，該兩種方法之組合有時用於此項技術中來確定CDR。當提及可變域中之殘基(大致為輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時一般使用Kabat編號系統(例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
短語「如Kabat中之胺基酸位置編號」、「Kabat位置」及其語法變體係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中用於抗體編譯之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或CDR之縮短或***的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可在H2之殘基52後包括單一胺基酸***(根據Kabat，殘基52a)且在重鏈FW殘基82後包括***之殘基(例如根據Kabat，殘基82a、82b及82c等)。
對於給定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。Chothia另外指出結構環之位置(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。當使用Kabat編號協定編號時Chothia CDR-H1環之末端視環長度而定在H32與H34之間變化(此係因為Kabat編號方案在H35A及H35B處設置***；若35A與35B均不存在，則環在32處終止；若僅存在35A，則環在33處終止；若35A與35B均存在，則環在34處終止)。AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且為Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體所用。
IMGT(ImMunoGeneTics)亦為包括CDR之免疫球蛋白可變區提供一種編號系統。參見例如Lefranc,M.P.等人，Dev.Comp.Immunol.27：55-77(2003)，其以引用的方式併入本文中。IMGT編號系統係基於超過5,000個序列之比對、結構數據及高變環之表徵且允許所有物種之可變及CDR區容易比較。根據IMGT編號方案，VH-CDR1在位置26至35，VH-CDR2在位置51至57，VH-CDR3在位置93至102，VL-CDR1在位置27至32，VL-CDR2在位置50至52，且VL-CDR3在位置89至97。
就本發明中所論述之所有重鏈恆定區胺基酸位置而言，編號係根據Eu索引，該Eu索引首次描述於Edelman等人，1969,Proc.Natl.Acad.sci.USA 63(1)：78-85中，其描述骨髓瘤蛋白質Eu(第一個經定 序之人類IgG1)之胺基酸序列。Edelman等人之Eu索引亦闡述於Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda中。因此，短語「如Kabat中所闡述之EU索引」或「Kabat之EU索引」及「根據如Kabat中所闡述之EU索引的位置……」及其語法變體係指基於如Kabat 1991中所闡述之Edelman等人之人類lgG1 Eu抗體的殘基編號系統。
用於可變結構域(重鏈與輕鏈)及輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統為Kabat 1991中所闡述之編號系統。
如本文中所使用，Fc區包括包含除第一恆定區免疫球蛋白結構域外之抗體恆定區之多肽。因此，Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白結構域，及IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白結構域，及此等結構域N端之可撓性鉸鏈。對於IgA及IgM，Fc可包括J鏈。對於IgG，Fc包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3以及Cγ1與Cγ2之間的鉸鏈。
雖然可改變Fc區之邊界，但人類IgG重鏈Fc區通常經界定以包含殘基C226或P230至其羧基端，其中編號係根據如Kabat所闡述之EU索引。Fc可指分離之此區或在抗體、抗體片段或Fc融合蛋白之情形下的此區。
已在抗體恆定區內之許多不同位置(例如Fc位置，包括(但不限於)如Kabat中所闡述之EU索引編號之位置270、272、312、315、356及358)觀測到多形現象，且因此所呈現序列與先前技術中之序列之間可存在微小差異。已經充分表徵人類免疫球蛋白之多形形式。目前，已知18種Gm異型：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、 v、g5)(Lefranc等人，The human IgG subclasses：molecular analysis of structure,function and regulation.Pergamon,Oxford，第43-78頁(1990)；Lefranc,G.等人，1979,Hum.Genet.：50,199-211)。特別涵蓋本發明之抗體可併有任何免疫球蛋白基因之任何異型、同型(isoallotype)或單倍型，且不限於本文所提供之序列之異型、同型或單倍型。
術語「人類抗體」意謂藉由人類產生之抗體，或使用此項技術中已知之任何技術(例如培養細胞中之重組表現或轉殖基因動物中之表現)製備的具有對應於藉由人類產生之抗體之胺基酸序列的抗體。因此，術語人類抗體亦涵蓋胺基酸序列對應於最初由人類產生之抗體(或其經工程改造之變異體或衍生物)但在非人類系統中表現(例如藉由化學合成產生；以重組方式在微生物、哺乳動物或昆蟲細胞中表現；或在動物個體中表現)的抗體。因此，自人類個體或自人類細胞(例如表現重組抗體或其片段之融合瘤或細胞株)獲得且隨後在例如小鼠之動物中表現的抗體視為人類抗體。人類抗體之此定義包括完整或全長抗體、其片段及/或包含至少一個人類重鏈及/或輕鏈多肽的抗體，諸如包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。
術語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列來源於兩種或兩種以上動物物種之抗體。通常，輕鏈與重鏈之可變區對應於來源於一種哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)之具有所需特異性及/或親和力及/或能力之抗體的可變區，而恆定區與來源於另一物種(通常人類)之抗體中之序列同源以避免在該物種中引發免疫反應。
如本文中所使用之術語「抗原決定基」係指能夠結合於本文所揭示之HER2抗體或HER2結合分子的抗原蛋白質決定子。抗原決定基通常由諸如胺基酸或糖側鏈之分子之化學活性表面基團組成，且通常具有特定三維結構特徵以及荷質比特徵。識別抗原決定基之抗體或結 合分子的部分稱為互補位。蛋白質抗原之抗原決定基基於其結構及與互補位之相互作用劃分成兩個類別：構形抗原決定基及線性抗原決定基。構形抗原決定基由抗原胺基酸序列之不連續部分構成。此等抗原決定基與互補位基於3D表面特徵及抗原之形狀或三級結構而相互作用。相比之下，線性抗原決定基與互補位基於其一級結構而相互作用。線性抗原決定基藉由來自抗原之一系列連續胺基酸形成。
術語「抗體結合位點」係指抗原(例如HER2)中包含互補抗體特異性結合之連續或非連續位點(亦即抗原決定基)的區域。因此，抗體結合位點可含有抗原中之其他區域，其超出抗原決定基且可決定諸如結合親和力及/或穩定性之特性或影響諸如抗原酶活性或二聚之特性。因此，即使兩種抗體結合於抗原內之相同抗原決定基，若抗體分子與抗原決定基外部之胺基酸建立起不同的分子間接觸，則此類抗體視為結合於不同抗體結合位點。
「結合親和力」一般係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用的總強度。除非另作說明，否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。低親和力抗體一般與抗原緩慢結合且傾向於容易解離，而高親和力抗體一般與抗原較快結合且傾向於保持較長時間結合。此項技術中已知多種量測結合親和力之方法，該等方法中之任一者均可用於達成本發明之目的。
除非另有說明，否則「效能」通常表示為IC50值，以nM為單位。IC50為抗原結合分子之中位抑制濃度。在功能分析中，IC50為使生物反應降低其最大值之50%的濃度。在配位體結合研究中，IC50為使受體結合減少最大特異性結合水準之50%的濃度。IC50可藉由此項 技術中已知之多種方式計算。效能之提高可藉由例如針對39S親本抗體量測來確定。
本文所揭示之抗-HER2結合分子的效能提高倍數(例如與39S親本抗體、曲妥珠單抗或其組合相比)可為至少約2倍、至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍或至少約180倍或更高。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中結合於某些細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上所存在Fc受體(FcR)的分泌免疫球蛋白使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合於具有抗原之標靶細胞且隨後用細胞毒素殺滅該標靶細胞。針對標靶細胞之表面的特定高親和力IgG抗體「武裝」細胞毒性細胞且為此類殺滅絕對需要。標靶細胞之溶解在細胞外，需要直接的細胞與細胞接觸且不涉及補體。預期除抗體之外，能夠特異性結合於具有抗原之標靶細胞的包含Fc區之其他蛋白質，特別Fc融合蛋白將能夠實現細胞介導之細胞毒性。為簡單起見，由Fc融合蛋白之活性產生的細胞介導之細胞毒性在本文中亦稱作ADCC活性。
「分離」之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為呈在自然界中未發現之形式的多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物。分離之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物包括已在一定程度上純化，使得其不再為在自然界中發現之形式的多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物。在一些態樣中，分離之抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物實質上純。
術語「個體」係指作為特定治療之接受者的任何動物(例如哺乳動物)，包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、嚙齒動物及其類似動物。通常，關於人類個體之術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用。
術語「醫藥組合物」係指一種製劑，其呈允許活性成分(例如本文所揭示之抗-HER2結合分子)之生物活性有效的形式且不含對組合物將投與之個體具有不可接受之毒性的其他組分。此類組合物可無菌。
如本文所揭示之抗-HER2結合分子的「有效量」為足以進行特定陳述之目的之量。「有效量」可憑經驗且以常規方式，關於陳述之目的確定。
術語「治療有效量」係指本文所揭示之抗-HER2結合分子或其他藥物有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或病症的量。
詞語「標記」在本文中使用時係指直接或間接結合於本文所揭示之抗-HER2結合分子，從而產生「經標記」之抗-HER2結合分子的可偵測化合物或組合物。標記本身可偵測(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記之情況下，可催化受質化合物或組合物的化學改變，此改變為可偵測的。
諸如「可衍生基團」及「可衍生官能基」之術語可互換使用且係指能夠反應，以允許在本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如HER2抗體)與另一物質之間形成共價鍵之官能基。在一些態樣中，此類物質為治療部分(例如細胞毒素)、可偵測標記、聚合物(諸如PEG)等。示例性可衍生基團包括硫醇、羥基、胺基、羧基及醯胺，以及其經修飾之形式，諸如經活化或保護之形式。
諸如「治療(treating)」或「治療(treatment)」或「治療(to treat)」或「緩解(alleviating)」或「緩解(to alleviate)」之術語係指以 下兩者：(1)經診斷之病理性病狀或病症治癒、減緩、症狀減輕及/或進展停止的治療性量度；及(2)防止及/或減慢目標病理性病狀或病症發展的預防性或防治性量度。因此，需要治療者包括已患該病症者；傾向於患該病症者；以及有待預防該病症者。在某些態樣中，若患者展示某一類型癌症例如總體、部分或瞬時緩解，則根據本發明之方法，成功「治療」個體之癌症。
術語「癌症」、「腫瘤」、「癌性」及「惡性」係指或描述哺乳動物中通常以不受調控之細胞生長為特徵之生理病狀。癌症之實例包括(但不限於)包括腺癌之癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、黑色素瘤、肉瘤及白血病。此類癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腸胃癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、膠質母細胞瘤、神經膠瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(諸如肝癌瘤及肝癌)、膀胱癌、乳癌(包括激素介導之乳癌，參見例如Innes等人(2006)Br.J.Cancer 94：1057-1065)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、骨髓瘤(諸如多發性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌(諸如腎細胞癌及威耳姆士腫瘤(Wilms' tumor))、基底細胞癌、黑色素瘤、***癌、外陰癌、甲狀腺癌、睾九癌、食道癌、各種類型之頭頸癌及黏液來源癌(諸如黏液性卵巢癌)、膽管癌(肝)及腎乳頭狀癌。在一些態樣中，如本文中所使用之術語癌症特指表現HER2之癌症。在一些特定態樣中，術語癌症係指HER2表現量低之癌症。
如本文所使用，「低HER2量」係指當使用HERCEPTEST®(DakoCytomation California Inc.,Carpenteria,CA)分類時顯示評分小於2+(例如1+)之癌細胞、個體或患者，或已例如藉由FISH鑑別為低HER2量之癌症、癌細胞、個體或患者。
為確定癌症中之HER2表現，可利用各種診斷/預測分析。在一個態樣中，HER2過度表現可藉由IHC，例如藉由使用 HERCEPTEST®(Dako)分析。來自腫瘤生檢之石蠟包埋之組織切片可經受IHC分析且根據如下HER2蛋白質染色強度標準。或者或另外，可在福馬林固定之石蠟包埋之腫瘤組織上進行FISH分析，諸如INFORMTM(由Ventana,Ariz.出售)或PATHVISIONTM(Vysis,Ill.)，以確定腫瘤中HER2過度表現之程度(若存在)。
「低」為一種術語，其係指小於正常、小於標準(諸如預定量度)的量度或相對小於另一子群量度之子群量度。舉例而言，低HER2意謂在呈HER2陽性之患者特定樣品集中小於正常HER2量度之HER2量度。可根據熟習此項技術者可獲得之任何方法確定正常HER2量度。低HER2亦可意謂小於預定量度，諸如預定截止值之HER2量度。低HER2亦可意謂低HER2子群相對低於另一子群之量度。舉例而言(但不限於)，根據本說明書，兩個不同患者子群可藉由圍繞數學確定點(諸如(但不限於)中位值)分開樣品來產生，因此產生相對於量度高之另一組，量度低(亦即小於中位值)之組。HER2可藉由熟習此項技術者已知之任何方法，諸如(但不限於)使用eTag方法或使用任何標準IHC方法，諸如HERCEPTEST®量測。作為另一實例，低HER2含量係指低HER2均二聚體含量，其意謂在呈HER2陽性之特定樣品或患者集中小於HER2均二聚體正常量度之HER2均二聚體量度。低HER2均二聚體亦可意謂小於預定量度，諸如預定截止值之量度。低HER2均二聚體亦可意謂其中低HER2均二聚體子群相對小於另一子群之量度。HER2均二聚體可藉由此項技術中已知之任何方法，諸如螢光共振能量轉移(FRET)、生物發光共振能量轉移(BRET)、近接接合分析(PLA)、二聚體特異性抗體或eTag或熟習此項技術者熟知之任何其他方法量測。
如本文所使用，術語「癌瘤」係指上皮細胞癌症，上皮細胞為覆蓋身體表面、產生激素且構成腺體之細胞。癌瘤之實例為皮膚、 肺、結腸、胃、***、***及甲狀腺之癌症。
如本文中可互換使用，「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物或任何可藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中之受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。前述描述適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
術語「載體」意謂能夠在宿主細胞中傳遞且在一些態樣中表現一或多個基因或序列的構築體。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些諸如生產細胞之真核細胞。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，係指任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可為直鏈或分支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，且其可間雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋已經天然或藉由介入修飾之胺基酸聚合物；該介入例如為形成雙硫鍵、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或諸如與標記組分結合之任何其他操縱或修飾。該定義亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)之多肽，以及此項技術中已知之其他修飾。應瞭解，因為本發明之多肽基於抗體，所以在某些態樣中，多肽可呈單一鏈或締合鏈形式存在。
「重組」多肽或蛋白質係指經由重組DNA技術產生之多肽或蛋白質。出於本發明之目的，以重組方式產生之在工程改造之宿主細胞中表現的多肽及蛋白質視為分離，與藉由任何適合之技術已分離、部分分離或部分或實質上純化之天然或重組多肽一樣。本文所揭示之多肽可使用此項技術中已知之方法以重組方式產生。或者，本文所揭示之 蛋白質及肽可化學合成。
除非另外說明，否則如本文中所使用之術語「經取代」在細胞毒性劑(妥布賴森)之化學結構之修飾的情況下，係指帶有一或多個取代基之母基團。術語「取代基」在本文中以習知含義使用且係指共價附接於或適當時稠合於母基團之化學部分。熟知各種取代基，且亦熟知用於其形成及引入多種母基團中之方法。以下更詳細地描述化學取代基之實例。
如本文中所使用之短語「視情況經取代」在細胞毒性劑之化學結構之修飾的情況下係指可未經取代或可經取代之母基團。
如本文中所使用之術語「經取代」、「胺基酸取代」及其類似術語在多肽情況下係指親本多肽中存在之胺基酸殘基經另一胺基酸殘基置換。胺基酸可在親本多肽中，例如經由化學肽合成或經由此項技術中已知之重組方法經取代。因此，提及「在位置X取代」或「在位置X取代」係指在位置X存在之胺基酸經替代性胺基酸殘基取代。在一些態樣中，取代模式可根據方案AXY描述，其中A為對應於在位置X天然存在之胺基酸的單字母代碼，且Y為取代胺基酸殘基。因此，L234F將指位置234之白胺酸胺基酸(L)經***酸(F)取代。在其他態樣中，取代模式可根據方案XY描述，其中Y為對應於取代位置X天然存在之胺基酸之胺基酸殘基的單字母代碼。因此，239C將指位置239之天然胺基酸經半胱胺酸(C)取代。
「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、***酸、甲硫胺酸、色胺 酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自相同側鏈家族之另一胺基酸置換，則取代視為保守。在另一個態樣中，一串胺基酸可經側鏈家族成員之順序及/或組成不同之結構上類似之一串保守置換。
非保守性胺基酸取代包括以下取代，其中(i)具有正電性側鏈之殘基(例如Arg、His或Lys)取代負電性殘基(例如Glu或Asp)或經負電性殘基(例如Glu或Asp)取代；(ii)親水性殘基(例如Ser或Thr)取代疏水性殘基(例如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或經疏水性殘基(例如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)取代；(iii)半胱胺酸或脯胺酸取代任何其他殘基或經任何其他殘基取代；或(iv)具有龐大疏水性或芳族側鏈之殘基(例如Val、Ile、Phe或Trp)取代具有較小側鏈之殘基(例如Ala、Ser)或無側鏈之殘基(例如Gly)或經具有較小側鏈之殘基(例如Ala、Ser)或無側鏈之殘基(例如Gly)取代。
其他胺基酸取代可容易由一般技術者鑑別。舉例而言，對於胺基酸丙胺酸，取代可取自D-丙胺酸、甘胺酸、β-丙胺酸、L-半胱胺酸及D-半胱胺酸中之任一者。對於離胺酸，置換可為D-離胺酸、精胺酸、D-精胺酸、高精胺酸、甲硫胺酸、D-甲硫胺酸、鳥胺酸或D-鳥胺酸中之任一者。一般而言，可預期誘發分離多肽之特性改變的功能上重要區域之取代為以下取代，其中(i)例如絲胺酸或蘇胺酸之極性殘基取代例如白胺酸、異白胺酸、***酸或丙胺酸之疏水性殘基(或經其取代)；(ii)半胱胺酸殘基取代任何其他殘基(或經其取代)；(iii)例如離胺酸、精胺酸或組胺酸之具有正電性側鏈之殘基取代例如麩胺酸或天冬胺酸之具有負電性側鏈之殘基(或經其取代)；或(iv)例如***酸之具有龐大側鏈之殘基取代例如甘胺酸之不具有此類側鏈之殘基(或經其取代)。以上非保守性取代之一可改變蛋白質之功能特性的可 能性亦與取代相對於蛋白質之功能上重要區域之位置相關：因此一些非保守性取代可對生物特性幾乎無作用。
術語「胺基酸***」係指新胺基酸殘基引入親本序列中存在之兩個胺基酸殘基之間。胺基酸可例如經由化學肽合成或經由此項技術中已知之重組方法***親本序列中。因此，如本文所使用，短語「***位置X與Y之間」或「Kabat位置X與Y之間的***」(其中X及Y對應於胺基酸位置(例如位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸***)係指胺基酸***位置X與Y之間，且亦指核酸序列中編碼胺基酸之密碼子***編碼位置X及Y之胺基酸的密碼子之間。***模式可根據方案AXins描述，其中A為對應於***之胺基酸的單字母代碼，且X為位於***前的位置。因此，C239ins將指半胱胺酸胺基酸(C)***在位置239之後(亦即位置239與240之間的***)。
術語兩個多肽或聚核苷酸序列之間的「序列一致性%」係指考慮到為使兩個序列最佳比對而必須引入之添加或缺失(亦即間隙)，在比較窗口上序列所共享之一致匹配位置的數目。匹配位置為在標靶及參考序列中呈現一致核苷酸或胺基酸的任何位置。標靶序列中呈現之間隙不計數，因為間隙不為核苷酸或胺基酸。同樣，參考序列中呈現之間隙不計數，因為對標靶序列核苷酸或胺基酸計數，而非來自參考序列之核苷酸或胺基酸。
藉由測定兩個序列中存在之一致胺基酸殘基或核酸鹼基的位置數獲得匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100獲得序列一致性百分比來計算序列一致性百分比。兩個序列之間的序列比較及序列一致性%之測定可使用容易進行線上使用及下載之軟體實現。適合之軟體程式可自各種來源獲得，且用於比對蛋白質與核苷酸序列。一種確定序列一致性%之適合程式為bl2seq，可自美國政府之國家生物技術中心(U.S.government's National Center for Biotechnology Information)BLAST網點(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得之BLAST套件一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP演算法執行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他適合之程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，為生物信息學程式之EMBOSS套件一部分且亦可自European Bioinformatics Institute(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa獲得。
與聚核苷酸或多肽參考序列比對之單一聚核苷酸或多肽標靶序列內之不同區域可各具有其自身序列一致性%。應指出，序列一致性%值四捨五入至小數點後一位。舉例而言，80.11、80.12、80.13及80.14四捨五入為80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18及80.19四捨五入為80.2。亦注意，長度值將總是為整數。
在某些態樣中，第一胺基酸序列相對於第二序列胺基酸之一致性百分比「X」計算為100×(Y/Z)，其中Y為在第一及第二序列之比對中評分為一致匹配之胺基酸殘基數目(如藉由目視檢查或特定序列比對程式比對)且Z為第二序列中殘基總數。若第一序列之長度比第二序列長，則第一序列與第二序列之一致性百分比將高於第二序列與第一序列之一致性百分比。
熟習此項技術者將瞭解用於序列一致性%計算之序列比對的產生不限於僅僅由一級序列數據驅動之二元序列-序列比較。序列比對可來源於多個序列比對。一種產生多個序列比對之適合程式為ClustalW2，可自www.clustal.org獲得。另一適合程式為MUSCLE，可自www.drive5.com/muscle/獲得。或者可例如自EBI獲得ClustalW2及MUSCLE。
亦瞭解，序列比對可藉由將序列數據與來自非均質來源之數據(諸如結構數據(例如結晶蛋白質結構)、功能數據(例如突變位置)或系統數據整合來產生。一種將非均質數據整合以產生多個序列比對之適 合程式為T-Coffee，可在www.tcoffee.org獲得，且或者自例如EBI獲得。應瞭解用於計算序列一致性%之最終比對可自動或人工計算。
II. 抗-HER2結合分子
本發明提供抗-HER2結合分子，例如特異性結合HER2之抗-HER2抗體或包含其HER2結合片段之分子。
HER2之全長胺基酸(aa)及核苷酸(nt)序列為此項技術中已知(人類HER2參見例如UniProt寄存編號P04626)。參見例如Yamamoto等人，Nature 319：230-234(1986)；Coussens等人，Science 230：1132-1139(1985)；Tal等人，Mol.Cell.Biol.7：2597-2601(1987)；Semba等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：6497-6501(1985)；King等人，Science 229：974-976(1985)；Sarkar等人，DNA Cell Biol.12：611-615(1993)；Giri等人，Mol.Cell.Biol.25：11005-11018(2005)；Anido等人，EMBO J.25：3234-3244(2006)；Birrane等人，J.Biol.Chem.278：1399-1402(2003)；Ivancic等人，J.Biomol.NMR 27：205-219(2003)；Cho等人，Nature 421：756-760(2003)；Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)；Bostrom等人，Science 323：1610-1614(2009)；Eigenbrot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107：15039-15044(2010)；Stephens等人，Nature 431：525-526(2004)；Greenman等人，Nature 446：153-158(2007)；所有文獻均以全文引用的方式併入本文中。
在某些態樣中，抗-HER2結合分子為抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或包含其HER2結合片段之分子，包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、單鏈Fv、scFv、經二硫化物穩定之scFv、二硫化物連接之Fv、V-NAR結構域、IgNar、胞內抗體、IgG△CH2、微型抗體、F(ab')3、四功能抗體、三功能抗體、雙功能抗體、單域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。在一些態樣中，抗體為IgG類型，例如IgG1類型。
在一些態樣中，抗-HER2結合分子為單特異性。在其他態樣中，抗-HER2結合分子為雙特異性、三特異性、四特異性等。在其他態樣中，抗-HER2結合分子為多特異性。在一些態樣中，抗-HER2結合分子為單價、二價、三價、四價等。在又其他態樣中，抗-HER2結合分子為多價。在特定態樣中，抗-HER2結合分子為二價，例如包含兩個HER2特異性抗原結合位點之抗體。在特定態樣中，抗-HER2結合分子為雙特異性，亦即分子可特異性結合於兩個不同抗原(例如相同或不同分子上之兩個不同抗原決定基)。在一些特定態樣中，抗-HER2結合分子為二價及四價，例如包含可結合於兩個不同抗原(例如相同或不同分子上之兩個不同抗原決定基)之四個抗原結合位點之抗體。
在某些態樣中，抗-HER2結合分子包含抗體或其抗原結合片段，其具有實質上與1.39.1抗體(參見PCT公開案第WO 2008/019290號，其以全文引用的方式併入本文中)之結合位點相同的結合位點。在一特定態樣中，抗-HER2結合分子包含抗體或其抗原結合片段，其結合SEQ ID NO：52之一或多個胺基酸殘基。在某些態樣中，抗-HER2結合分子包含抗體或其抗原結合片段，其具有與1.39.1抗體之結合位點重疊的結合位點。
在某些態樣中，抗-HER2結合分子包含含有與親本1.39.1抗體(參見PCT公開案第WO 2008/019290號)之VH(SEQ ID NO：43)及/或VL(SEQ ID NO：44)相比，經修飾之VH及/或VL的抗體或其抗原結合片段。引入親本抗體中之修飾可包括與親本1.39.1抗體相比，VH及VL之CDR區中及/或FW區中之突變(例如點突變或置換整個子序列)。
在一些態樣中，親本1.39.1抗體之VH-CDR1(SEQ ID NO：45)已經包含SEQ ID NO：1之胺基酸之VH-CDR1置換。在一些態樣中，親本1.39.1抗體之VH-CDR1(SEQ ID NO：45)已經由SEQ ID NO：1之胺基酸組成之VH-CDR1置換。
在其他態樣中，親本1.39.1抗體之VH-CDR3(SEQ ID NO：46)已經包含SEQ ID NO：3之胺基酸之VH-CDR3置換。在其他態樣中，親本1.39.1抗體之VH-CDR3(SEQ ID NO：46)已經由SEQ ID NO：3之胺基酸組成之VH-CDR3置換。
在一些態樣中，親本1.39.1抗體之VH-CDR1(SEQ ID NO：45)及VH-CDR3(SEQ ID NO：46)已分別經包含SEQ ID NO：1之胺基酸及SEQ ID NO：3之胺基酸或由其組成之VH-CDR1及VH-CDR3置換。
在一些態樣中，親本1.39.1抗體之VL-CDR1(SEQ ID NO：47)已經包含SEQ ID NO：4之胺基酸之VL-CDR1置換。在一些態樣中，親本1.39.1抗體之VL-CDR1(SEQ ID NO：3)已經由SEQ ID NO：4之胺基酸組成之VL-CDR1置換。
在一些態樣中，親本1.39.1抗體之VL FW1區(SEQ ID NO：48)已經包含SEQ ID NO：11之胺基酸之VL FW1置換。在一些態樣中，親本1.39.1抗體之VL FW1區(SEQ ID NO：48)已經由SEQ ID NO：11之胺基酸組成之FW1置換。
在其他態樣中，親本1.39.1抗體之VL FW2區(SEQ ID NO：49)已經包含SEQ ID NO：12之胺基酸之FW2置換。在其他態樣中，親本1.39.1抗體之VL FW2區(SEQ ID NO：49)已經由SEQ ID NO：12之胺基酸組成之FW2置換。
在其他態樣中，親本1.39.1抗體之VL FW3區(SEQ ID NO：50)已經包含SEQ ID NO：13之胺基酸之FW3置換。在其他態樣中，親本1.39.1抗體之VL FW3區(SEQ ID NO：50)已經由SEQ ID NO：13之胺基酸組成之VL FW2置換。
在一些態樣中，親本1.39.1抗體之VL FW1區(SEQ ID NO：48)及/或FW2區(SEQ ID NO：49)及/或FW3區(SEQ ID NO：50)已分別經獨立地包含SEQ ID NO：11、12或13或由其組成之FW1及/或FW2及/或FW3 置換。
在一些態樣中，本發明提供一種包含免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)之抗-HER2結合分子，其中VH包含SEQ ID NO：15之胺基酸。在一些態樣中，本發明提供一種包含VH及VL之抗-HER2結合分子，其中VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸。在一些態樣中，VH包含SEQ ID NO：15之胺基酸且VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸。在一些態樣中，本文所揭示之抗-HER2結合分子包含抗體或其HER2結合片段。
在某些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子包含免疫球蛋白重鏈(VH)及免疫球蛋白輕鏈(VL)，其中該結合分子包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸之VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸之VL-CDR3。
在某些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)包含抗體VL及抗體VH，其中VL包含與包含SEQ ID NO：16之胺基酸或由其組成之參考VL至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%一致的胺基酸序列。
在其他態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)包含抗體VL及抗體VH，其中VH包含與包含SEQ ID NO：15之胺基酸或由其組成之參考VH至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%一致的胺基酸序列。
在其他態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)包含序列與包含SEQ ID NO：16之胺基酸或由其組成之參考VL至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%一致的VL，且進一步包含序列與包含SEQ ID NO：15之胺基酸或由其組成之參考VH至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%一致的VH。
在一些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)包含重鏈恆定區或其片段。在一些特定態樣中，重鏈恆定區為IgG恆定區。IgG恆定區可包含選自由κ恆定區及λ恆定區組成之群的輕鏈恆定區。
在某些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)可以與1.39.1親本抗體實質上相同或更佳的親和力結合HER2。因此，在一個態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)以小於10-6M，或小於10-7M，或小於10-8M，或小於10-9M，或小於10-10M，或小於10-11M，或小於10-12M，或小於10-13M之解離常數或kd(koff/kon)特異性結合HER2及其抗原片段。
在另一個態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)以小於1×10-3s-1或小於2×10-3s-1之koff結合於HER2及/或其抗原片段。在其他態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)以小於10-3s-1，小於5×10-3s-1，小於10-4s-1，小於5×10-4s-1，小於10-5s-1，小於5×10-5s-1，小於10-6s-1，小於5×10-6s-1，小於5×10-7s-1，小於10-8s-1，小於5×10-8s-1，小於10-9s-1，小於5×10-9s-1或小於10-10s-1之koff結合於HER2及/或其抗原片段。
在另一個態樣中，本發明之抗-HER2結合分子(例如抗-HER2抗體或其HER2結合片段，或雙特異性抗-HER2抗體)以至少105M-1s-1，至少5×105M-1s-1，至少106M-1s-1，至少5×106M-1s-1，至少107M-1s-1，至少5×107M-1s-1，或至少108M-1s-1或至少109M-1s-1之締合速率常數或kon速率結合於HER2及/或其抗原片段。
在其他態樣中，VH及/或VL胺基酸序列可與以上闡述之序列85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%類似，且包含1、2、3、4、5或更多個保守取代。VH及VL區分別與SEQ ID NO：16之VH區及/或SEQ ID NO：15之VL區高度(亦即80%或更大)類似之本文所揭示之抗-HER2結合分子可藉由其相應編碼核酸分子之突變誘發(例如定點或PCR介導之突變誘發)，接著使用本文所描述之功能分析測試改變抗體之保留功能來獲得。
本文所揭示之抗-HER2結合分子對抗原之親和力及/或親合力可以實驗方式使用此項技術中熟知之任何適合方法，例如流動式細胞量測術、酶聯結免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)或動力學(例如BIACORETM分析)測定。亦可容易採用直接結合分析以及競爭性結合分析格式。參見例如Berzofsky等人，「Antibody-Antigen Interactions」,Fundamental Immunology,Paul,W.E.編輯，Raven Press：New York,N.Y.(1984)；Kuby,Immunology,W.H.Freeman and Company：New York,N.Y.(1992)；以及其中描述之方法。
本文所揭示之特定抗-HER2結合分子與HER2抗原之相互作用的量測親和力若在不同條件(例如鹽濃度、pH值、溫度)下量測，則可變化。因此，親和力及其他抗原結合參數(例如KD或Kd、kon、koff)用抗-HER2結合分子及抗原之標準化溶液及如此項技術中已知且諸如本文所描述之緩衝液的標準化緩衝液進行量測。
此項技術中亦已知使用BIACORETM分析量測之親和力可視哪一 反應物結合於晶片而變化。就此而言，親和力可使用其中靶向之抗-HER2結合分子固定至晶片上之格式(稱為「IgG向下」格式)或使用其中標靶蛋白(例如HER2)固定至晶片上之格式(例如稱為「HER2向下」格式)量測。
III. 雙特異性抗-HER2結合分子
本發明亦提供雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中：(i)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗體結合位點；(ii)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域II內之抗原決定基的第一HER2抗體結合位點；以及(iii)該第一HER2抗體結合位點不同於帕妥珠單抗之抗體結合位點。
在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域II內之抗原決定基的第二HER2抗體結合位點。在一些態樣中，第一HER2抗體結合位點與1.39.1或39S抗體之HER2抗體結合位點一致。在一些態樣中，第一HER2抗體結合位點與1.39.1或39S抗體之HER2抗體結合位點部分重疊。在其他態樣中，第一HER2抗體結合位點不同於1.39.1或39S抗體之HER抗體結合位點。
在一些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域IV內之抗原決定基的第二HER2抗體結合位點。在一些態樣中，第二HER2抗體結合位點與曲妥珠單抗之HER2抗體結合位點一致。在一些態樣中，第二HER2抗體結合位點與曲妥珠單抗之HER2抗體結合位點部分重疊。在其他態樣中，第二HER2抗體結合位點不同於曲妥珠單抗之HER抗體結合位點。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原 結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中(i)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗體結合位點；(ii)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域II內之抗原決定基的第一HER2抗體結合位點；以及(iii)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域與HERCEPTIN®競爭結合於HER2之結構域IV。
本發明亦提供雙特異性抗-HER2分子，其結合與以上揭示之抗-HER2結合分子(亦即衍生自1.39.1親本抗體，例如39S抗體之先導物優化抗體)相同的抗原決定基或衍生自以上揭示之抗-HER2結合分子。在一些態樣中，此類雙特異性抗-HER2分子為雙特異性抗-HER2抗體及衍生自此類雙特異性抗體之分子。在一些態樣中，此類衍生自本文所描述之雙特異性抗-HER2分子之分子為抗體-藥物結合物(ADC)。在某些態樣中，本文所提供之ADC具有降低之ADCC活性。在一些態樣中，此類衍生自本文所描述之雙特異性抗-HER2分子之分子具有增強之ADCC活性。
本發明亦提供一種雙特異性HER抗體，其包含第一免疫球蛋白及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中(i)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基；以及(ii)其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域在SEQ ID NO：52之一或多個胺基酸殘基結合HER2。在一些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域在結構域IV內之抗原決定基結合HER2。在其他態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域在SEQ ID NO：53之一或多個胺基酸殘基結合HER2。
因此，在一個態樣中，本發明提供雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含含有以下之重鏈(HC)可變區(VH)及輕鏈(LC)可變區(VL)：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以 外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列；(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列；(iv)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列；(v)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列；以及(vi)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列；其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段；且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含相對於包含含有SEQ ID NO：43之胺基酸之VH及含有SEQ ID NO：44之胺基酸之VL的免疫球蛋白抗原結合結構域之FW區域不同的至少一個異源可變域構架區(FW)。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含(i)包含SEQ ID NO：11之胺基酸之可變輕鏈構架1(VL-FW1)；(ii)包含SEQ ID NO：12之胺基酸之可變輕鏈構架2(VL-FW2)；(iii)包含SEQ ID NO：13之胺基酸之VL可變輕鏈構架3(VL-FW3)；(iv)包含SEQ ID NO：14之胺基酸之可變輕鏈構架4(VL-FW4)；或(v)其任何組合。
在一些態樣中，雙特異性HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含(i)由SEQ ID NO：11之胺基酸組成之VL-FW1；(ii)由SEQ ID NO：12之胺基酸組成之VL-FW2；(iii)由SEQ ID NO：13之胺基酸組成之VL-FW3；(iv)由SEQ ID NO：14之胺基酸組成之VL-FW4；或(v)其任何組合。
在其他態樣中，本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中：(i)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：43之胺基酸；(ii)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段；以及(iii)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在其他態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中：(i)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中VH由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：43之胺基酸組成；(ii)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段；以及(iii)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中：(i)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中VL包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：44之胺基酸；(ii)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段；以及(iii)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不 同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中：(i)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中VL由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：44之胺基酸組成；(ii)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段；以及(iii)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中：(i)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中VL包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：44之胺基酸，且VH包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：45之胺基酸；(ii)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段；以及(iii)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中：(i)第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中VL由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：44之胺基酸組成，且VH由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：43之胺基酸組成；(ii)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段；以及(iii)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不 同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含以下或由以下組成：(a)進一步包含重鏈恆定區或其片段之VH及包含輕鏈恆定區(LC)或其片段之VL；(b)單鏈Fv(「scFv」)；(c)雙功能抗體；(d)微型抗體；(e)F(ab')2或(f)F(ab)。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之重鏈恆定區或其片段為IgG恆定區。在一些態樣中，IgG恆定區或其片段為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區。在特定態樣中，IgG恆定區為IgG1恆定區。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含含有輕鏈恆定區(LC)之VL，其中LC恆定區為κ恆定區。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含含有輕鏈恆定區(LC)之VL，其中LC恆定區為λ恆定區。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域為例如單株抗體、人類化抗體、嵌合抗體或親和力優化抗體。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域為例如人類抗體。在一些態樣中，人類抗體在轉殖基因小鼠中表現(參見例如Bruggemann,「Human antibody expression in transgenic mice」，Arch.Immunol.Therap.Exper.49：203-208,2001，其以全文引用的方式併入本文中)。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一免疫球蛋白抗原結合結構域不與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗競爭結合抗原決定基。在一些 態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。在一些態樣中，不同HER2抗原決定基不重疊。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域(i)特異性結合於與曲妥珠單抗抗體相同的HER2抗原決定基；及/或(ii)競爭性地抑制曲妥珠單抗抗體之HER2結合；及/或(iii)包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個包含SEQ ID NO：54至59中任一者之胺基酸的互補決定區(CDR)。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv。在一些特定態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含經二硫化物穩定之scFv(ds-scFv)。在一些態樣中，經二硫化物穩定之scFv特異性結合於與曲妥珠單抗抗體相同的HER2抗原決定基。
可藉由在經選擇以使得半胱胺酸殘基可形成雙硫鍵之位置引入半胱胺酸取代，在scFv之VH與VL區之間將穩定化二硫化物工程改造。詳言之，此類二硫化物可引入構架區，使得VL及VH區藉由雙硫鍵連接。表示但不限制VH及VL區中符合此等標準之殘基的位置提供於表2中。
表2中之編號根據如Kabat中所闡述之Kabat索引。應瞭解此等位置之野生型胺基酸殘基將變化。無論野生型胺基酸殘基如何，給出對之各位置將經半胱胺酸取代。
本文所揭示之scFv可自任何適合之來源(無論天然還是非天然)獲 得或產生，或其可為重組scFv、合成scFv、半合成scFv、衍生scFv、醱酵優化scFv、融合蛋白或其相等物、突變體及衍生物，只要其保留本發明scFv之所需結合特異性即可。此等包括具有胺基酸取代或具有附接至胺基酸官能基之糖或其他分子的具有結合特異性之scFv。如本文中關於scFv所使用之術語「衍生物」或「衍生」包括scFv之化學修飾。例示性此類修飾將為氫經烷基、醯基或胺基置換。
在一些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域為一種scFv，其包含：(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸之VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸之VL-CDR3。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域由特異性結合於與曲妥珠單抗抗體相同之HER2抗原決定基且包含衍生自曲妥珠單抗抗體之VH及VL(例如曲妥珠單抗抗體中存在之天然VH及/或VL或具有穩定化突變之VH及/或VL突變體，例如表2中展示之突變對)之VH及VL的scFv組成。參見Goldenger,Clin.Ther.21：309-18(1999)。因此，在一些態樣中，結合與曲妥珠單抗相同之抗原決定基的scFv包含含有SEQ ID NO：17之胺基酸之VH及含有SEQ ID NO：18之胺基酸之VL。在一些態樣中，結合與曲妥珠單抗相同之抗原決定基的scFv包含由胺基酸SEQ ID NO：17組成之VH及由SEQ ID NO：18之胺基酸組成之VL。在一些特定態樣中，結合與曲妥珠單抗相同之抗原決定基的scFv之VH及VL經由肽連接子共價連接。在一些態樣中，肽連接子包含SEQ ID NO：19之胺基酸。在一些態樣中，肽 連接子由SEQ ID NO：19之胺基酸組成。
如上文所論述，熟習此項技術者將瞭解結合與曲妥珠單抗相同之抗原決定基的scFv包括衍生自曲妥珠單抗之序列，包含例如其中相對於曲妥珠單抗抗體中之親本序列，至少一個胺基酸已缺失或經取代之突變序列，只要所得分子能夠特異性結合於與曲妥珠單抗抗體相同之HER2抗原決定基，例如經設計以引入至少一個穩定化二硫化物在scFv之VH與VL之間的突變。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價連接於第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之羧基端。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含至少一個***第二免疫球蛋白抗原結合結構域與第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之羧基端之間的連接子。在一些特定態樣中，一個連接子***第二免疫球蛋白抗原結合結構域與第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之羧基端之間。
在一些態樣中，第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價連接於第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之胺基端。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含至少一個***第二免疫球蛋白抗原結合結構域與第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之胺基端之間的連接子。在特定態樣中，一個連接子***第二免疫球蛋白抗原結合結構域與第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之胺基端之間。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價***第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之序列中。在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價***第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之CH1區與CH2區之間。在一些態樣中，一或多個連接子將雙特異性抗-HER2抗體之第二免疫球蛋白抗原結合結構域連接至第一免疫球蛋白抗原結合結構域 之HC之CH1區及/或CH2區。
在一些特定態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含(i)***第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之CH1區與第二免疫球蛋白抗原結合結構域之間的連接子；以及(ii)***第二免疫球蛋白抗原結合結構域與第一免疫球蛋白抗原結合結構域之HC之CH2區之間的第二連接子。在一些態樣中，第一連接子與第二連接子一致。在一些態樣中，第一連接子與第二連接子不同。在一些態樣中，一或多個連接子包含肽連接子。在一些態樣中，肽連接子包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸。在一些態樣中，肽連接子包含超過20個胺基酸。在一些態樣中，肽連接子包含具有式Serx[(Gly)y-Ser4]z之肽，其中x為0至1，y為1至4，且z為1至10(SEQ ID NO：60)。在一些態樣中，肽連接子包含選自SEQ ID NO：19、20、21或22之序列。
在一些態樣中，雙特異性抗-HER2抗體包含一種重鏈，其包含含有Fc結構域之恆定區。在一些態樣中，Fc結構域包含CH2區域及/或CH3區域及/或其片段。在一些特定態樣中，Fc結構域包含CH2區及CH3區。在一些態樣中，Fc結構域由CH2區及CH區組成。在一些態樣中，Fc結構域為IgG Fc結構域，例如來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc結構域。在一些態樣中，IgG Fc結構域為人類或人類化IgG Fc結構域。在一些態樣中，Fc結構域為IgG1 Fc結構域。
在一些態樣中，IgG Fc結構域，例如IgG1 Fc結構域，為天然(野生型)結構域。在一些態樣中，天然IgG1 Fc結構域包含SEQ ID NO：23之胺基酸。在其他態樣中，天然IgG1 Fc結構域由SEQ ID NO：23之胺基酸組成。在其他態樣中，Fc結構域為突變IgG結構域，例如突變IgG1、IgG2、IgG3或IgG4結構域。在一些特定態樣中，突變Fc結構域為突變IgG1 Fc結構域。
在一些態樣中，突變IgG結構域，例如人類或人類化IgG1 Fc結構域，包含至少一個能夠降低雙特異性抗-HER2抗體之ADCC活性的突變。在某些態樣中，至少一個能夠降低抗-HER2雙特異性抗體之ADCC活性的突變為胺基酸取代。在一些態樣中，具有降低之ADCC活性的雙特異性抗-HER2抗體包含選自L234F、S239C、S239A、位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸***或其任何組合的至少一個胺基酸取代，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。能夠降低抗體之ADCC活性的大量突變為此項技術中已知。舉例而言，參見以全文引用的方式併入本文中之WO2012175751、WO2011149999、WO2011066501、WO2000042072、WO2011120134中所描述之突變。具有降低之ADCC效應功能之抗體亦包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中一或多者之取代的抗體(美國專利第6,737,056號)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。此類Fc突變體亦包括在胺基酸位置265、269、270、297及327之兩者或兩者以上具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之Fc突變體(美國專利第7,332,581號，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引)。
在一些態樣中，突變IgG結構域，例如人類或人類化IgG1 Fc結構域，包含至少一個能夠增強雙特異性抗-HER2抗體之ADCC活性的突變。在某些態樣中，至少一個能夠增強抗-HER2雙特異性抗體之ADCC活性之突變為胺基酸取代。在一些態樣中，具有增強之ADCC活性的雙特異性抗-HER2抗體包含至少一個選自S239A、S239D、A330L、I332E、E333A、K334A或其任何組合之胺基酸取代，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。增強ADCC活性之其他突變為熟習此項技術者已知，包括(但不限於)US 6,737,056表2及6-10、US 2006/235208圖41中呈現之表、US 2006/235208之圖5、12及 15中呈現之表、US 2006/0173170之圖8、9及10中呈現之表及WO 09/058492之圖8、9及10中呈現之表中例示的突變。
在一些態樣中，突變IgG1 Fc結構域可包含至少一個引入可衍生官能基之胺基酸取代。在一些態樣中，突變IgG1 Fc結構域包含1至3個引入可衍生基團之胺基酸取代。在一些態樣中，可衍生基團為半胱胺酸胺基酸之硫氫基側鏈。在特定態樣中，經取代之胺基酸出現在抗-HER2結合分子之可接近位點。藉由彼等胺基酸殘基經半胱胺酸取代，反應性硫醇基由此定位在抗-HER2結合分子之可接近位點且可用於將抗-HER2結合分子結合於其他部分，諸如藥物部分或連接子-藥物部分，產生免疫結合物，如本文中進一步描述。可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生經半胱胺酸工程改造之抗體。
在一些態樣中，可衍生基團引入在Kabat位置239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443或446，***在位置239與240之間的胺基酸，或其任何組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。在一些態樣中，引入可衍生硫氫基之胺基酸或胺基酸取代係選自由以下組成之群：S239C、248C、254C、258C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、435C、440C、441C、S442C、443C及446C，在位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸***，或其任何組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。在一些態樣中，引入可衍生硫氫基之胺基酸或胺基酸取代為S239C及/或S442C。
選擇性可衍生之基團為此項技術中熟知，諸如胺基、硫氫基、側接氧基胺基或其他親核基團。可衍生基團可經由一或多個連接子接合於多肽鏈。配位體(例如治療部分、可偵測標記、半衰期延伸聚合物等)可使用適當附接化學物質附接至可衍生基團。此偶合化學物質可包括例如醯胺、脲、硫脲、肟、胺基乙醯基醯胺等。
在一些態樣中，Fc結構域具有增強ADCC活性之改變類型糖基化。Fc區之糖基化可經修飾以增加或降低效應功能(參見例如Umana等人，1999,Nat.Biotechnol 17：176-180；Davies等人.,2001,Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等人，2002,J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等人.,2003,J Biol Chem 278：3466-3473；美國專利第6,602,684號、第6,946,292號、第7,064,191號、第7,214,775號、第7,393,683號、第7,425,446號、第7,504,256；美國公開案第2003/0157108號、第2003/0003097號、第2009/0010921號；POTELLEGENTTM技術(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)；GLYCOMABTM糖基化工程改造技術(GLYCART biotechnology AG,Zurich,Switzerland))。在一些態樣中，Fc結構域為具有減少量之海藻糖基殘基之低海藻糖基化抗體Fc結構域(參見例如美國專利申請公開案第2005/0226867號)。在一個態樣中，如經工程改造以產生高度去海藻糖基化抗體之宿主細胞(例如CHO細胞、浮萍(Lemna minor))中所產生之效應功能(特定言之ADCC)增加之此等抗體，與藉由親本細胞產生之抗體相比，ADCC高過100倍(例如Mori等人，2004,Biotechnol Bioeng 88：901-908；Cox等人，2006,Nat Biotechnol.,24：1591-7)。在一些態樣中，Fc結構域具有增加之二等分GlcNAc結構(例如Umana等人，1999,Nat.Biotechnol 17：176-180；US2009/0010921)。
在一些態樣中，突變Fc結構域包含SEQ ID NO：24、63、25或65之胺基酸。
在一些態樣中，突變Fc結構域包含SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：64之胺基酸。
本發明中亦提供包含彼此締合之第一及第二多肽鏈的雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一多肽鏈係選自：(1)[TZS]-[L1]-[BVH]-[BCH]-[FcX]
(2)[BVH]-[BCH]-[FcX]-[L2]-[TZS]
(3)[BVH]-[BCH]-[L3]-[TZS]-[L4]-[FcX]
其中TZs為結合與曲妥珠單抗抗體所識別相同之抗原決定基的scFv；L1、L2、L3及L4為肽連接子；Fcx為Fc結構域；BVH及BCH分別為能夠結合於與曲妥珠單抗抗體所識別之抗原決定基不同的HER2抗原決定基之抗體的VH及CH1區。
在一些態樣中，不同抗原決定基包含SEQ ID NO：52內之一或多個胺基酸。
在一些態樣中，曲妥珠單抗抗體所識別之抗原決定基包含SEQ ID NO：53中之一或多個胺基酸殘基。
在一些態樣中，第二多肽鏈包含[BVL]-[CL]，其中BVL為能夠結合於與曲妥珠單抗抗體所識別之抗原決定基不同之HER2抗原決定基的抗體之VL區且CL為IgG輕鏈恆定區。在一些態樣中，CL係選自由人類κ恆定區及人類λ恆定區組成之群。
在一些態樣中，BVL包含SEQ ID NO：16之胺基酸。在一些態樣中，BVL包含SEQ ID NO：44之胺基酸。在一些態樣中，BVL包含：(i)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以 外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。
在一些特定態樣中，CL包含SEQ ID NO：27之胺基酸。
在一些特定態樣中，CL包含SEQ ID NO：66之胺基酸。
在一些態樣中，[TZS]包含：(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸之VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸之VL-CDR3。
在一些態樣中，[TZS]為經二硫化物穩定之scFv。在一些態樣中，[TZS]包含藉由肽連接子共價連接的(i)包含SEQ ID NO：17之胺基酸或由其組成的VH或其變異體，與(ii)包含SEQ ID NO：18之胺基酸或由其組成的VL或其變異體。適合於連接scFv之VH與VL部分之大量連接子(例如肽連接子)為此項技術中已知。在一些態樣中，連接子為包含SEQ ID NO：19之胺基酸或由其組成的肽連接子。在其他態樣中，[TZS]包含SEQ ID NO：28之胺基酸或由其組成。
在一些態樣中，鉸鏈多肽連接[BCH]與[Fcx]。在一些態樣中，鉸鏈多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸或由其組成。在一些態樣中，[Fcx]包含至少一個引入可衍生基團之胺基酸取代。在其他態樣中，[Fcx]包含1至3個引入可衍生基團之胺基酸取代。在又其他態樣中，[Fcx]包含超過三個引入可衍生基團之胺基酸取代。在一些態樣中，所有可衍生基團均一致。在其他態樣中，至少一個可衍生基團不同於其餘基團。在一些態樣中，所有可衍生基團均不同。在一些態樣中， 可衍生基團為硫氫基(例如半胱胺酸之硫氫基)。在一些態樣中，可衍生基團經保護。
在一些態樣中，可衍生基團引入在位置239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443或446，或位置239與240之間，或其任何組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。在一些態樣中，可衍生基團為包含S239C、248C、254C、258C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、435C、440C、441C、S442C、443C及446C之至少一個半胱胺酸胺基酸取代、位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸***或其任何組合中之硫氫基，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。在一些態樣中，引入可衍生硫氫基之胺基酸或胺基酸取代為S239C及/或S442C。在一些態樣中，引入可衍生硫氫基之胺基酸或胺基酸取代為位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸***及/或S442C。
在其他態樣中，[Fcx]包含SEQ ID NO：23、24、63、25或65中任一者之胺基酸。
在其他態樣中，[Fcx]包含SEQ ID NO：23、62或64中任一者之胺基酸。
在某些態樣中，[L1]、[L2]、[L3]及[L4]包含獨立地選自由SEQ ID NO：19、20、21及22組成之群之連接子序列的胺基酸。在一些態樣中，所有連接子均不同。在一些態樣中，至少兩個連接子一致。熟習此項技術者將瞭解連接子可為肽連接子、非肽連接子或肽連接子與非 肽連接子之組合。在一些特定態樣中，(i)[L1]包含SEQ ID NO：20之胺基酸或由其組成；(ii)[L2]包含SEQ ID NO：20之胺基酸或由其組成；(iii)[L3]包含SEQ ID NO：21之胺基酸或由其組成；以及(iv)[L4]包含SEQ ID NO：22之胺基酸或由其組成。
在一些態樣中，[BVH]包含：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)。
在一些態樣中，[BVH]包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：43之胺基酸或由其組成。
在一些態樣中，[BVL]包含：(i)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。
在一些特定態樣中，[BVL]包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：44之胺基酸或由其組成。在一些態樣中，[BCH]包含SEQ ID NO：29之胺基酸或由其組成。
在一些特定態樣中，本發明提供包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之雙特異性抗-HER2抗體，其中(i)該第一多肽鏈包含選自由SEQ ID NO：30、31、32、69、33、71、34、35、36、74、37、76、38、39、 40、79、41及81組成之群之胺基酸序列或由其組成，及(ii)該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：42或82之序列或由其組成，其中雙特異性抗-HER2抗體結合於治療部分。
在一些特定態樣中，本發明提供包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之雙特異性抗-HER2抗體，其中(i)該第一多肽鏈包含選自由SEQ ID NO：30、67、68、70、72、73、75、77、78及80組成之群之胺基酸序列或由其組成，及(ii)該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：42或82之序列或由其組成，其中雙特異性抗-HER2抗體具有增強之ADCC活性。
IV. 抗體-藥物結合物(ADC)
本發明亦提供抗體-藥物結合物(ADC)，其包含與至少一種治療部分結合之至少一種本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如結合與39S抗體相同之抗原決定基或衍生自39S抗體的抗體或其HER2結合片段，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體)。因此，在一些態樣中，ADC包含結合於至少一種治療部分(例如細胞毒素)之本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體，其中該雙特異性抗-HER2抗體包含(i)第一免疫球蛋白抗原結合結構域及(ii)第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含含有以下之重鏈(HC)可變區(VH)及輕鏈(LC)可變區(VL)：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列；(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列；(iv)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列； (v)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列；以及(vi)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列；其中：(a)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段；以及(b)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
在一些態樣中，ADC之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含至少一個相對於包含含有SEQ ID NO：43之胺基酸之VH及含有SEQ ID NO：44之胺基酸之VL的免疫球蛋白抗原結合結構域之FW區不同的異源可變域構架區(FW)。
在一些態樣中，ADC進一步包含至少一個視情況存在之間隔基，其可***抗-HER2結合分子之多肽鏈中之胺基酸側鏈(例如本文所揭示之抗-HER2雙特異性抗體之重鏈中之胺基)與治療部分之間。在一些態樣中，至少一個間隔基為肽間隔基。在其他態樣中，至少一個間隔基為非肽間隔基。在一些態樣中，間隔基不穩定，諸如酸不穩定性間隔基(例如肼)。在其他態樣中，間隔基為酶可裂解之肽，例如可裂解之二肽。在一些態樣中，間隔基為不可裂解的(水解穩定的)，例如硫醚間隔基或位阻二硫化物間隔基。在一些態樣中，在抗-HER2結合分子之多肽鏈中之胺基酸側鏈(例如本文所揭示之抗-HER2雙特異性抗體之重鏈中之胺基)與另一治療部分之間***MCC(N-丁二醯亞胺基-4(順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷)。
水解穩定之間隔基實質上在水中穩定且在適用pH值下，包括(但不限於)在生理條件下長時間不與水反應。水解不穩定或可降解之間 隔基於水中或水溶液，包括例如血液中可降解。
酶不穩定或可降解之間隔基可藉由一或多種酶降解。僅舉例而言，PEG及相關聚合物可包括在聚合物主鏈中或在聚合物主鏈與聚合分子之一或多個末端官能團之間的連接基團中的可降解間隔基。此類可降解間隔基包括(但不限於)由PEG羧酸或活化PEG羧酸與生物活性劑上之醇基反應形成的酯鍵，其中此類酯基一般在生理條件下水解以釋放生物活性劑。其他水解可降解之間隔基包括(但不限於)：碳酸酯鍵；由胺與醛反應產生之亞胺鍵；藉由醇與磷酸酯基反應形成之磷酸酯鍵；作為醯肼與醛之反應產物的腙鍵；作為醛與醇之反應產物的縮醛鍵；作為甲酸酯與醇之反應產物的原酸酯鍵；藉由包括(但不限於)聚合物(諸如PEG)末端之胺基與肽之羧基形成的肽鍵；以及由包括(但不限於)聚合物末端之亞磷醯胺基與寡核苷酸之5'羥基形成的寡核苷酸鍵。
在一些態樣中，ADC包含兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個治療部分。在一些特定態樣中，ADC包含兩個、三個或四個治療部分。在一些態樣中，所有治療部分均相同。在一些態樣中，至少一個治療部分不同於其餘治療部分。在一些態樣中，所有治療部分均不同。在一些態樣中，所有間隔基(例如肽及/或非肽間隔基)均相同。在一些態樣中，至少一個間隔基不同於其餘間隔基。在其他態樣中，所有間隔基均不同。
在一些態樣中，各治療部分化學結合於抗-HER2結合分子(例如本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體)之Fc區中之特定位置的胺基酸之側鏈。
在一些態樣中，Fc區中之特定位置係選自由以下組成之群：239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、 360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443、446、位置239與240之間的***以及其組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
在一些態樣中，Fc區中之特定位置為239、442或兩者，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。在一些態樣中，Fc區中之特定位置由442及位置239與240之間的胺基酸***組成，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
在一些態樣中，其中結合治療部分之胺基酸側鏈為硫氫基側鏈，例如半胱胺酸胺基酸之硫氫基。在一些態樣中，至少一個治療部分化學結合於位於抗-HER2結合分子(例如本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體)之Fc區外之位置的胺基酸之側鏈。在一些態樣中，所有治療部分化學結合於位於抗-HER2結合分子(例如本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體)之Fc區外之位置的胺基酸之側鏈。在一些態樣中，使用此項技術中已知之重組技術，將至少一個治療部分以基因方式併入抗-HER2結合分子(例如本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體)之多肽鏈中。
在一些態樣中，該治療部分包含細胞毒素、放射性同位素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞激素、淋巴激素、趨化激素、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光敏性治療劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物、螯合劑或其組合。
在一些特定態樣中，該細胞毒素為奧瑞他汀(auristatin)、妥布賴森、類美登素或吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在另一特定態樣中，細胞毒素為妥布賴森1508。
在特定態樣中，ADC包含本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體，其中該抗體包含 (i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iii)包含SEQ ID NO：36之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iv)包含SEQ ID NO：37之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(v)包含SEQ ID NO：40之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；或(vi)包含SEQ ID NO：41之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包 含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
在特定態樣中，ADC包含本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體，其中該抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：62之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(ii)包含SEQ ID NO：71之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iii)包含SEQ ID NO：74之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iv)包含SEQ ID NO：76之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引； (v)包含SEQ ID NO：79之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；或(vi)包含SEQ ID NO：81之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
本文所揭示之ADC分子包含至少一種本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如結合與39S抗體相同之抗原決定基或衍生自39S抗體的抗體或其HER2結合片段，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體)，其已衍生或連接(例如化學上或以重組方式)於分子(例如肽、小藥物分子、可偵測分子等)。一般而言，抗-HER2抗體或其部分經衍生，使得其HER2結合未受衍生或標記不利地影響。因此，本發明之抗-HER2抗體及抗體部分意欲包括本文所描述之抗-HER2結合分子的完整與經修飾之形式。舉例而言，本文所揭示之抗-HER2結合分子或其HER2結合部分可在功能上連接(藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)於一或多種其他分子實體，諸如細胞毒性劑、藥劑、偵測試劑及/或可介導抗-HER2結合分子與另一分子之締合的蛋白質或肽(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區域或聚組胺酸標籤)。
一種類型衍生分子可藉由將兩種或兩種以上分子實體，例如本文所揭示之抗-HER2結合分子與治療部分(例如細胞毒素，諸如妥布賴森1508)交聯來產生。適合交聯劑包括異源雙官能交聯劑，亦即具有經適當間隔基分離之兩個不同反應性基團的交聯劑(例如間順丁烯 二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯)；或同源雙官能交聯劑(例如辛二酸雙丁二醯亞胺酯)。此類交聯劑可購自例如Pierce Chemical Company,Rockford,II。其他雙官能偶合劑包括N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(諸如辛二酸雙丁二醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸伸苯甲酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
另一類型衍生化分子可藉由併入可偵測標記來產生。適用之偵測試劑包括螢光化合物(例如螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素、鑭系元素磷光體及其類似物)、適用於偵測之酶(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶及其類似物)、藉由二級報導體識別之抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤等)。在一些態樣中，可偵測標記可藉由至少一個間隔臂附接。間隔臂可為各種長度以減少潛在位阻。
抗-HER2結合分子亦可經放射性標記之胺基酸標記。放射性標記可用於診斷與治療之目的。舉例而言，放射性標記可用於藉由X射線或諸如正電子發射斷層攝影法(PET)之其他診斷技術偵測表現HER2之細胞。
此外，放射性標記可在治療學上用作表現HER2之細胞，諸如引起不良免疫反應之細胞的毒素。用於多肽之標記之實例包括(但不限於)以下放射性同位素或放射性核素：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I及131I。在一些態樣中，抗-HER2結合分子可經在成像 時可偵測之順磁、放射性或螢光離子標記。在一些態樣中，順磁離子為鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)或鉺(III)。在其他態樣中，放射性離子為碘-123、鎝-99、銦-111、錸-188、錸-186、銅-67、碘-131、釔-90、碘-125、砹-211及鎵-67。在其他態樣中，抗-HER2結合分子經諸如鑭(III)、金(III)、鉛(II)及鉍(III)之X射線顯影劑標記。抗-HER2結合分子亦可用例如聚合物(諸如聚乙二醇(PEG))、甲基、乙基或碳水化合物基團之化學基團衍生。此等基團可用於改善抗體之生物特徵，例如增加血清半衰期或增加組織結合。
如本文中所使用之術語「細胞毒性劑」廣泛定義且係指抑制或阻礙細胞功能及/或引起細胞破壞(細胞死亡)，及/或發揮抗贅生性/抗增殖作用之物質。舉例而言，細胞毒性劑直接或間接防止贅生性腫瘤細胞發育、成熟或擴散。該術語亦包括僅產生細胞生長抑制作用且並非單純細胞毒性作用之此類藥劑。該術語包括如下文所說明之化學治療劑以及其他HER2拮抗劑、抗血管生成劑、酪胺酸激酶抑制劑、蛋白質激酶A抑制劑、細胞激素家族之成員、放射性同位素及毒素(諸如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素)。
術語「化學治療劑」為術語「細胞毒性劑」之包含天然或合成化合物之子群。化學治療劑之實例包括烷基化劑，例如氮芥、伸乙亞胺化合物、烷基磺酸酯及具有烷基化作用之其他化合物(諸如亞硝基脲、順鉑及達卡巴嗪(dacarbazine))；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲***抑制劑，例如長春花生物鹼(Vinca alkaloids)及鬼臼毒素之衍生物；細胞毒性抗生素及喜樹鹼衍生物。其他化學治療劑為阿米福汀(amifostine)(ETHYOL®)、順鉑、達卡巴嗪(DTIC)、放線菌素d(dactinomycin)、二氯甲二乙胺(氮芥)、鏈脲菌素(streptozocin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、卡莫司汀 (carrnustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、小紅莓(doxorubicin)(ADRIAMYCIN®)、小紅莓脂體(DOXIL®)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR®)、道諾黴素(daunorubicin)、道諾黴素脂體(DAUNOXOME®)、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂黴素(mitomycin)、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷(etoposide)、甲胺喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、博萊黴素(bleomycin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL®)、多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE®)、阿地白介素(aldesleukin)、天冬醯胺酶(asparaginase)、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、喜樹鹼(camptothecin)、CPT-11、10-羥基-7-乙基-喜樹鹼(SN38)、吉非替尼(gefitinib)(IRESSA®)、達卡巴嗪、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉賓(fludarabine)、羥基脲(hydroxyurea)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊達比星(idarubicin)、美司鈉(mesna)、干擾素α、干擾素β、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、拓朴替康(topotecan)、亮丙立德(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、普卡黴素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡黴素(plicamycin)、鏈脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊甙(teniposide)、睾內酯(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、長春瑞濱(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、芳香酶抑制劑以及其組合。
IV.A 妥布賴森
在一些態樣中，ADC包含本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如39S抗體或其衍生物，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體之一)結 合於一或多個妥布賴森分子(參見以下妥布賴森A及妥布賴森1508之結構)。
妥布賴森為自黏細菌物種分離之一類天然產物的成員(Sasse等人，J.Antibiot.53：879-885(2000))。作為與細胞骨架相互作用之試劑，妥布賴森為抑制微管蛋白聚合且引起細胞週期停滯及細胞凋亡之有絲***毒物(Steinmetz等人，Chem.Int.Ed.43：4888-4892(2004)；Khalil等人，ChemBioChem.7：678-683(2006)；Kaur等人，Biochem.J.396：235-242(2006))。妥布賴森為極其有效之細胞毒性分子，超過任何臨床上相關之傳統化學治療劑，例如埃博黴素(epothilone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及長春鹼(vinblastine)之細胞生長抑制。此外，其有效針對抗多藥之細胞株(Domling等人，Mol.Diversity 9：141-147(2005))。此等化合物展示針對一組癌細胞株測試之高細胞毒性，其中IC50值在低皮莫耳範圍內；因此，對其作為抗癌治療劑感興趣。參見例如 WO2012019123，其以全文引用的方式併人本文中。妥布賴森結合物揭示於例如美國專利第7,776,814號中。
在一些態樣中，妥布賴森分子或其衍生物為前藥。
IV.B 美登素及類美登素
在一些態樣中，ADC包含本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如39S抗體或其衍生物，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體之一)結合於一或多個類美登素分子。
類美登素為藉由抑制微管蛋白聚合而起作用的有絲***抑制劑。美登素最先係自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離(美國專利第3,896,111號)。隨後，發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成美登醇及其衍生物及類似物例如揭示於美國專利第4,137,230號、第4,248,870號、第4,256,746號、第4,260,608號、第4,265,814號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,317,821號、第4,322,348號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,364,866號、第4,424,219號、第4,450,254號、第4,362,663號及第4,371,533號。
類美登素藥物部分為抗體藥物結合物中之引人注目之藥物部分，此歸因於其：(i)相對易於藉由醱酵或化學改質、醱酵產物之衍生化來製備；(ii)易於經適於經由非二硫化物連接子與抗體結合之官能基衍生化；(iii)在血漿中穩定；及(iv)對多種腫瘤細胞株有效。含有類美登素之免疫結合物、其製造方法及其治療用途揭示於例如以下中：美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP0425235B1；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)(描述包含命名為DM1之類美登素的免疫結合物)；及Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)。
曲妥珠單抗恩坦辛(阿多-曲妥珠單抗恩坦辛，T-DM1，商標KADCYLA®)為由單株抗體曲妥珠單抗(HERCEPTIN®)結合於類美登素美坦辛(DM1)組成之抗體-藥物結合物。參見例如LoRusso等人，Clin.Cancer Res.20：6437-47(2011)，其以全文引用的方式併入本文中。一種工程改造之硫基-曲妥珠單抗-DM1 ADC亦描述於Junutual等人，Clin,Cancer Res.16：4769-78(2010)中，其以全文引用的方式併入本文中。
可藉由在不顯著降低抗體或美登素類化合物分子之生物活性的情況下將抗體與類美登素化合物分子化學連接來製備抗體-類美登素化合物結合物。參見例如美國專利第5,208,020號。每一抗體分子結合平均3-4個類美登素分子已展示增強標靶細胞之細胞毒性的功效，而不負面影響抗體之功能或溶解性，不過將預期甚至一分子毒素/抗體亦相對於使用裸抗體增強細胞毒性。類美登素為此項技術中所熟知，且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。適合類美登素揭示於例如美國專利第5,208,020號中。
在一些態樣中，類美登素分子、其變異體或衍生物為前藥。
IV.C 奧瑞他汀及海兔毒素(Dolastatin)
在一些態樣中，ADC包含本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如39S抗體或其衍生物，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體之一)結合於海兔毒素或海兔毒素肽類似物及衍生物、奧瑞他汀(美國專利第5,635,483號；第5,780,588號)。海兔毒素及奧瑞他汀已展示干擾微管動力學、GTP水解及細胞核及細胞***(Woyke等人，Antimicrob.Agents and Chemother.45：3580-3584(2001))且具有抗癌活性(美國專利第5,663,149號)。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端附接至抗體上(參見例如WO2002088172)。
在一些態樣中，奧瑞他汀或海兔毒素、其變異體或衍生物為前 藥。
IV.D 卡奇黴素
在一些態樣中，ADC包含本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如39S抗體或其衍生物，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體之一)結合於一或多個卡奇黴素分子。抗生素之卡奇黴素家族成員能夠在低於皮莫耳濃度下產生雙鏈DNA斷裂。卡奇黴素為一類衍生自細菌棘袍小單孢菌(Micromonospora echinospora)之烯二炔抗生素，其中卡奇黴素γ1最顯著。其他卡奇黴素為β1Br、γ1Br、α2I、α3I、β1I、γ1I及△1I。參見Lee等人，Journal of Antibiotics 42(7)：1070-87(1989)。關於卡奇黴素家族之結合物的製備，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、第5,877,296號。可使用之卡奇黴素的結構類似物包括(但不限於)γ1I、α2I、α3I、N-乙醯基-γ1I、PSAG及θ11(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)、Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998)及以上提及之頒予American Cyanamid之美國專利)。
在一些態樣中，卡奇黴素分子、其變異體或衍生物為前藥。
IV.E 倍癌黴素(Duocarmycin)
在一些態樣中，ADC包含本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如39S抗體或其衍生物，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體之一)結合於一或多個倍癌黴素分子。倍癌黴素為首先自鏈黴菌分離之一系列相關天然產物之成員且其為有效抗腫瘤抗生素。參見Boger.(1991).Chemtracts：Organic Chemistry 4(5)：329-349(1991)；Tercel等人，Chem.Int.Ed.Engl.52(21)：5442-6(2013)；Boger及Douglas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(9)：3642-3649(1995)；Cacciari等人，Expert Opinion on Therapeutic Patents 10(12)：1853-71(2000)。
天然倍癌黴素包括倍癌黴素A、倍癌黴素B1、倍癌黴素B2、倍癌黴素C1、倍癌黴素C2、倍癌黴素D、倍癌黴素SA及CC-1065。合成類似物包括阿多來新(adozelesin)、比折來新(bizelesin)及卡折來新(carzelesin)(U-80244)。
在一些態樣中，倍癌黴素分子、其變異體或衍生物為前藥。
IV.F 吡咯并苯并二氮呯
在一些態樣中，藥物為吡咯并苯并二氮呯(PBD)。PBD為相對較小之分子且一些能夠識別及共價結合於DNA小溝中之特定序列且因此展現抗生素/抗腫瘤活性。大量PBD及其衍生物為此項技術中已知，例如PBD二聚體(例如SJG-136或SG2000)、C2不飽和之PBD二聚體、具有C2芳基取代之吡咯并苯并二氮呯二聚體(例如SG2285)、藉由水解活化之PBD二聚體前藥(例如SG2285)及聚吡咯-PBD(例如SG2274)。PBD進一步描述於WO 2000/012507、WO 2007/039752、WO 2005/110423、WO 2005/085251及WO 2005/040170及美國專利第7,612,062號，各以全文引用的方式併入本文中。
IV.G 其他細胞毒性劑
在一些態樣中，ADC包含本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如39S抗體或其衍生物，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體之一)結合於其他抗腫瘤劑，例如BCNU、蒽環黴素(anthracycline)(例如道諾黴素或阿德力黴素(adriamycin))、紫杉烷(taxene)(例如太平洋紫杉醇)、鏈脲黴素(streptozoicin)、長春花生物鹼(例如長春新鹼)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、統稱為LL-E33288複合物之藥劑家族(參見美國專利第5,053,394號及第5,770,710號)、埃斯波黴素(esperamicin)(參見美國專利第5,877,296號)。ADC亦可包含本文所揭示之抗-HER2結合分子(例如39S抗體或其衍生物，或本文所揭示之雙特異性抗-HER2抗體之一)結合於可使用之酶活性毒素及其片段，包括白喉A鏈、白喉毒 素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白質、康乃馨蛋白質、洋商陸蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲***素、侷限麴菌素、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecenes)。參見例如WO199321232。在一些態樣中，細胞毒性劑為光活化藥物。
V. 結合於與39S抗體相同之抗原決定基的抗-HER2結合分子
在另一個態樣中，本發明提供結合於與39S抗體相同之抗原決定基的抗-HER2結合分子(例如衍生自39S抗體之抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗-HER2抗體或ADC)。
結合於與39S抗體相同之抗原決定基的此類抗-HER2結合分子可基於標準HER2結合分析中其與39S抗體交叉競爭(例如以統計學上顯著之方式競爭性地抑制結合)之能力鑑別。因此，在一個態樣中，本發明提供與39S抗體或其抗原結合片段競爭結合於HER2之抗-HER2結合分子(例如衍生自39S抗體之抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗-HER2抗體或ADC)。測試抗體抑制例如39S抗體或衍生自39S抗體之結合分子(例如雙特異性抗體或ADC)之結合的能力證實測試抗體可與39S抗體競爭結合於HER2；此類抗-HER2結合分子可根據非限制性理論，結合於HER2上與它所競爭之39S抗體或其抗原結合片段相同或相關(例如結構上類似或空間接近)的抗原決定基。
在一個態樣中，結合於HER2上與39S抗體或衍生自39S抗體之結合分子相同之抗原決定基的抗-HER2分子為人類單株抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗-HER2抗體(例如包含兩個HER2結合區之雙特異性抗體，其中至少一個識別與39S抗體相同之抗原決定基)或ADC(例如包含至少一個識別與39S相同之抗原決定基的抗原結合部分之 ADC；或包含含有兩個HER2結合區之雙特異性抗體的ADC，其中至少一個識別與39S抗體相同之抗原決定基)。
VI.抗-HER2結合分子之作用機制
本發明提供包含結合與1.39.1或39S抗體相同之抗原決定基或衍生自1.39.1或39S抗體之HER2結合結構域的抗HER2結合分子(例如雙特異性抗-HER2抗體或ADC)，其中此類抗-HER2結合分子在結合於HER2標靶時誘發內化。亦提供包含結合與1.39.1或39S抗體相同之抗原決定基或衍生自1.39.1或39S抗體之HER2結合結構域的抗-HER2結合分子(例如雙特異性抗-HER2抗體或ADC)，其中此類抗-HER2結合分子在內化後促進有效溶酶體輸送。本發明亦提供包含結合與1.39.1或39S抗體相同之抗原決定基或衍生自1.39.1或39S抗體之HER2結合結構域的抗HER2結合分子(例如雙特異性抗-HER2抗體或ADC)，其中此類抗-HER2結合分子誘發HER2標靶內化及/或降解。
在一些態樣中，本文所揭示之抗-HER2結合分子可減少、阻斷或抑制HER2磷酸化。在其他態樣中，本文所揭示之抗-HER2結合分子可減少、阻斷或抑制配位體誘發之AKT磷酸化。在一些態樣中，抗-HER2結合分子可在低HER2表現之癌細胞中減少、阻斷或抑制配位體誘發之AKT磷酸化。
在其他態樣中，本申請案中所揭示之抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段可減少、破壞或抑制配位體誘發之HER2-HER3二聚。
在一些態樣中，包含本文所揭示之抗-HER2結合分子之ADC可抑制癌症幹細胞(CSC)球形成及/或增殖。在一些態樣中，本文所揭示之抗-HER2結合分子顯示對CSC之細胞毒性作用。在一些態樣中，包含本文所揭示之抗-HER2結合分子的ADC可在HER2表現量低之腫瘤(例如經由HercepTest，+1至+2)中抑制腫瘤生長及/或誘發腫瘤消退。在 某些態樣中，包含本文所揭示之抗-HER2結合分子之ADC可在對T-DM1具抗性之腫瘤中抑制腫瘤生長及/或誘發腫瘤消退。
在一些態樣中，HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段缺乏ADCC活性。在特定態樣中，抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段可經由不依賴於配位體之作用機制減少或抑制HER2磷酸化、AKT磷酸化及/或腫瘤群落形成。
VII. 製備抗-HER2結合分子
本發明之抗-HER2結合分子(例如結合與1.39.1或39S抗體相同之抗原決定基或衍生自1.39.1或39S抗體之抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體及包含該等抗體之ADC)可根據此項技術中已知之方法製備。舉例而言，本文所揭示之結合於與39S抗體相同之抗原決定基的抗-HER2結合分子可使用融合瘤方法，諸如Kohler及Milstein(1975)Nature 256：495描述之融合瘤方法產生。
使用融合瘤方法，如上所述將小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物免疫接種以引發淋巴細胞產生將特異性結合於免疫抗原之抗體。淋巴細胞亦可在活體外進行免疫接種。在免疫接種後，將淋巴細胞分離且使用例如聚乙二醇與適合骨髓瘤細胞株融合，以形成融合瘤細胞，接著可遠離未融合之淋巴細胞及骨髓瘤細胞來選擇。如藉由免疫沈澱、免疫墨點法或藉由活體外結合分析(例如放射免疫分析(RIA)；酶聯結免疫吸附分析法(ELISA))測定，產生特異性針對所選抗原之單株抗體之融合瘤可接著在活體外培養物中使用標準方法(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,1986)或活體內在動物中作為腹水腫瘤繁殖。接著單株抗體可如針對以上多株抗體所述自培養基或腹水純化。
本發明之抗-HER2結合分子(例如結合與1.39.1或39S抗體相同之抗原決定基或衍生自1.39.1或39S抗體的抗體或其抗原結合片段、雙特 異性抗體及包含該等抗體之ADC)亦可使用如美國專利第4,816,567號中所述之重組DNA方法製備。將編碼單株抗體之聚核苷酸諸如藉由RT-PCR，使用特異性擴增編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸引子，自成熟B細胞或融合瘤細胞分離，且使用習知程序測定其序列。分離之編碼重鏈及輕鏈之聚核苷酸隨後選殖至適合表現載體中，當轉染至宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中(否則不產生免疫球蛋白)時，藉由宿主細胞產生單株抗體。此外，所需物種之重組抗-HER2單株抗體或包含其抗原結合片段之分子可自如所述的表現所需物種之CDR的噬菌體呈現文庫分離(McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)；以及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991))。
編碼本發明之抗-HER2結合分子(例如結合與39S抗體相同之抗原決定基或衍生自39S抗體的抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體及包含該等抗體之ADC)的聚核苷酸可進一步以許多不同方式使用重組DNA技術修飾，產生替代性抗-HER2結合分子。在一些態樣中，例如小鼠單株抗體之輕鏈及重鏈之恆定結構域可取代(1)例如人類抗體之彼等區域以產生嵌合抗體或(2)非免疫球蛋白多肽以產生融合抗體。在一些態樣中，恆定區截短或移除以產生單株抗體之所需抗體片段。可變區之定點或高密度突變誘發可用於優化單株抗體之特異性、親和力等。
在某些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子為人類抗體或其抗原結合片段。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術直接製備。可產生在活體外免疫接種或自產生針對標靶抗原之抗體之免疫個體分離的永生化人類B淋巴細胞(參見例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boemer等人，J. Immunol.147：86-95(1991)；及美國專利第5,750,373號)。可接著製備永生化B淋巴細胞中編碼抗體之一或多個cDNA且***表現載體及/或異源宿主細胞中以表現該抗體之非天然存在之重組型式。
此外，抗-HER2人類抗體或其抗原結合片段可選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫以與異源噬菌體蛋白質之融合蛋白形式表現人類抗體或其片段，如例如Vaughan等人，Nat.Biotech.14：309-314(1996)；Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.95：6157-6162(1998)；Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991)以及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581(1991))中所述。用於產生及使用抗體噬菌體文庫之技術亦描述於美國專利第5,969,108號、第6,172,197號、第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號、第6,593,081號、第6,300,064號、第6,653,068號、第6,706,484號及第7,264,963號中，各以全文引用的方式併入本文中。
親和力成熟策略及鏈改組策略(Marks等人，BioTechnology 10：779-783(1992)，以全文引用的方式併入本文中)為此項技術中已知且可用以產生高親和性人類抗體或其抗原結合片段。
在一些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子可為人類化抗體。亦可使用用於工程改造、人類化或表面重修非人類或人類抗體之方法且為此項技術中所熟知。人類化、重修表面或類似地工程改造之抗體可具有一或多個來自非人類來源，例如(但不限於)小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物或其他哺乳動物之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基經常常稱為「輸入」殘基之殘基替換，該等殘基通常取自已知人類序列之「輸入」可變、恆定或其他結構域。如此項技術中已知，此類輸入序列可用於降低免疫原性或降低、提高或改變結合、親和力、締合速率、解離速率、親合力、特異性、半衰期或任何其他適合特徵。一般而言，CDR殘基直接且最實質上參與影響HER2結合。因此，部 分或所有非人類或人類CDR序列維持，而可變及恆定區之非人類序列可經人類或其他胺基酸置換。在某些態樣中，人類CDR***非人類抗體骨架中以在動物模型系統中製備具有減少之免疫原性的抗體，例如「鼠類化」抗體。
例如抗體之抗-HER2結合分子可視情況人類化、重修表面或工程改造，且保持對抗原HER2之高親和性及其他有利的生物特性。為實現此目標，人類化(或人類)或工程改造之抗-HER2抗體及重修表面之抗體可視情況藉由使用親本、工程改造及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種概念人類化及工程改造產物的方法製備。三維免疫球蛋白模型通常可獲得，且為熟習此項技術者所熟悉。
可利用說明且呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。檢測此等呈現使得可分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原，諸如HER2之能力的殘基。以此方式，可自共同及輸入序列選擇構架殘基且組合以使得達成所要抗體特徵(諸如對標靶抗原之親和力增加)。
人類化、表面重修或工程改造本文所揭示之抗-HER2結合分子可使用任何已知方法進行，諸如(但不限於)以下文獻中所述之方法：Jones等人，Nature 321：522(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988))；Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)；美國專利第5,639,641號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5,814,476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號、第4,816,567號、第 7,557,189號、第7,538,195號及第7,342,110號、第WO90/14443號、第WO90/14424號、第WO90/14430號及第EP229246號，各以全文引用的方式併入本文中，包括其中所引用之參考文獻。
在某些態樣中，提供一種抗-HER2抗體片段。已知各種技術用於產生抗體片段。傳統地，此等片段經由完整抗體之蛋白分解消化來獲得(例如Morimoto等人，J.Biochem.Biophy.Methods 24：107-117(1993)；Brennan等人，Science,229：81(1985))。在某些態樣中，抗-HER2抗體片段以重組方式產生。Fab、Fv及scFv抗體片段可均在大腸桿菌或其他宿主細胞中表現且自其中分泌，因此允許產生大量此等片段。此類抗-HER2抗體片段亦可自上文所論述之抗體噬菌體庫分離。抗-HER2抗體片段亦可為如美國專利第5,641,870號中所述之線性抗體。熟習此項技術者將顯而易知用於產生抗體片段之其他技術。
技術可適用於產生對與39S抗體相同之HER2抗原決定基具有特異性的單鏈抗體(參見例如美國專利第4,946,778號)。此外，方法可適用於構築Fab表現文庫(參見例如Huse等人，Science 246：1275-1281(1989))以允許快速且有效鑑別對HER2具有所需特異性之單株Fab片段或其衍生物、片段、類似物或同源物。抗體片段可藉由此項技術中之技術產生，包括(但不限於)：(a)F(ab')2片段，藉由抗體分子之胃蛋白酶消化產生；(b)Fab片段，藉由還原F(ab')2片段之二硫橋鍵產生；(c)Fab片段，藉由用木瓜蛋白酶及還原劑處理抗體分子產生；及(d)Fv片段。
在一些態樣中，尤其在抗體片段之情況下，抗-HER2抗體或其抗原結合片段可經修飾以增加其血清半衰期。此可例如藉由使抗體或抗體片段中之適當區域突變，將救助受體結合抗原決定基併入抗體或抗體片段中，或藉由將抗原決定基併入隨後在末端或中間(例如藉由DNA或肽合成)與抗體或抗體片段融合之肽標籤中，或藉由YTE突變 來實現。其他增加抗體或其抗原結合片段之血清半衰期之方法，例如結合於諸如PEG之異源分子為此項技術中所熟知。
異質結合物抗-HER2結合分子，例如本文所揭示之結合與39S抗體相同之抗原決定基或衍生自39S抗體的雙特異性抗體或ADC，可使用重組生物技術以及在活體外使用合成蛋白質化學中已知之方法，包括涉及交聯劑之方法製備。舉例而言，雙特異性抗體或ADC可使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵而化學構築。適於達成此目的之試劑為此項技術中已知，且包括亞胺基硫醇酯及甲基-4-巰基丁醯亞胺酸酯。
將注意，在某些態樣中，抗-HER2結合分子可經工程改造以使相應經修飾之抗體或其片段之CH3結構域直接與鉸鏈區融合。在其他構築體中，肽間隔基可***鉸鏈區與經修飾之CH2及/或CH3結構域之間。舉例而言，可表現其中CH2結構域已缺失且剩餘CH3結構域(經修飾或未經修飾)用5-20個胺基酸間隔基與鉸鏈區接合的相容構築體。可添加此類間隔基，例如以確保恆定結構域之調節元件保持自由且可接近或鉸鏈區保留可撓性。然而，應注意在一些情況下胺基酸間隔基可證明為免疫原性且引發針對構築體之不必要免疫反應。因此，在某些態樣中，添加至構築體之任何間隔基將相對為非免疫原性，或甚至完全省去，從而維持經修飾之抗體之所需生物化學品質。
除缺失整個恆定區結構域以外，應瞭解抗-HER2結合分子可藉由幾個或甚至單個胺基酸之部分缺失或取代來提供。舉例而言，CH2結構域之選定區域中單個胺基酸之突變可足以使Fc結合實質上減少，且從而增加腫瘤定位。此外，如以上所暗示，所揭示之抗-HER2結合分子之恆定區可經由一或多個胺基酸之突變或取代經修飾，增強所得構築體之型態。就此而言，可破壞由保守結合位點(例如Fc結合)提供之活性，同時實質上維持經修飾之抗體或其抗原結合片段之組態及免疫 原性型態。某些態樣可包含一或多個胺基酸添加至恆定區以增強所需特徵，諸如減少或增加效應功能或提供更多細胞毒素或碳水化合物附接。在此類態樣中，可***或複製衍生自選定恆定區結構域之特定序列。
VIII. 編碼HER2結合分子之聚核苷酸
在某些態樣中，本發明提供包含編碼特異性結合HER2之本文所揭示之抗-HER2結合分子的核酸序列的聚核苷酸。舉例而言，本發明提供一種聚核苷酸，其包含編碼諸如抗體或其片段之抗-HER2結合分子(例如結合與39S抗體相同之抗原決定基或衍生自39S抗體之分子)的核酸序列。本發明之聚核苷酸可呈RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成DNA；且可為雙股或單股，且若為單股，則可為編碼股或非編碼(反義)股。在某些態樣中，DNA為用於產生非天然存在之重組抗體的cDNA。
在某些態樣中，分離聚核苷酸。在某些態樣中，聚核苷酸實質上純。在某些態樣中，聚核苷酸包含在相同閱讀框架中與有助於例如多肽自宿主細胞表現及分泌之聚核苷酸(天然或異源)(例如充當用於控制多肽自細胞輸送之分泌序列的前導序列)融合的成熟多肽之編碼序列。具有前導序列之多肽為前蛋白質且可具有藉由宿主細胞裂解以形成多肽之成熟形式的前導序列。聚核苷酸亦可編碼作為成熟蛋白質加其他5'胺基酸殘基之抗-HER2結合分子前蛋白。在某些態樣中，改變聚核苷酸以優化某一宿主細胞之密碼子使用。
在某些態樣中，聚核苷酸包含在相同閱讀框架中與允許例如純化編碼多肽之異源標記物序列融合的成熟抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段之編碼序列。舉例而言，標記物序列可為例如藉由pQE-9載體提供之六組胺酸(His6)標籤(SEQ ID NO：61)以在細菌宿主情況下純化與標記物融合之成熟多肽。在其他態樣中，當 使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時，標記物序列可為例如衍生自流感紅血球凝集素蛋白質之紅血球凝集素(HA)標籤。
本發明進一步關於編碼例如本發明之抗-HER2結合分子之HER2結合片段、類似物及衍生物的所述聚核苷酸之變異體。
聚核苷酸變異體可含有編碼區、非編碼區或兩者中之改變。在一些態樣中，聚核苷酸變異體含有產生沉默取代、添加或缺失，但不改變編碼多肽之特性或活性的改變。在一些態樣中，核苷酸變異體藉由歸因於基因密碼簡併之沉默取代而產生。聚核苷酸變異體可出於多種原因產生，例如優化特定宿主之密碼子表現(將人類mRNA中之密碼子改變成諸如大腸桿菌之細菌宿主偏好的密碼子)。亦提供包含本文所描述之聚核苷酸的載體及細胞。
在一些態樣中，編碼抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段之DNA序列可藉由化學合成，例如使用寡核苷酸合成器構築。此類寡核苷酸可基於所需多肽之胺基酸序列且選擇在將產生相關重組多肽之宿主細胞中偏好的彼等密碼子設計。標準方法可應用於合成編碼相關分離多肽之分離聚核苷酸序列。舉例而言，完整胺基酸序列可用於構築回譯基因。此外，可合成含有編碼特定分離多肽之核苷酸序列的DNA寡聚物。舉例而言，可合成編碼所需多肽之部分的若干小寡核苷酸且接著接合。個別寡核苷酸通常含有用於互補組件之5'或3'突出物。
一旦組裝(藉由合成、定點突變誘發或另一方法)，編碼相關特定分離多肽之聚核苷酸序列將***表現載體中且可操作地連接於適合於在所需宿主中表現蛋白質之表現控制序列。適當組件可例如藉由核苷酸測序、限制定位及生物活性多肽在適合宿主中之表現來證實。如在此項技術中所熟知，為獲得經轉染基因在宿主中之高表現量，基因必須可操作地連接於在所選表現宿主中具有功能性之轉錄及轉譯表現控 制序列。
在某些態樣中，重組表現載體用於擴增及表現編碼抗-HER2結合分子之DNA。重組表現載體為可複製的DNA構築體，其具有編碼例如抗-HER2抗體或及其抗原結合片段之多肽鏈的合成或cDNA衍生之DNA片段，可操作地連接於來源於哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因之適合轉錄或轉譯調節元件。轉錄單元一般包含以下組件：(1)在基因表現中具有調節作用之遺傳元件，例如轉錄啟動子或強化子；(2)轉錄成mRNA且轉譯成蛋白質之結構或編碼序列；及(3)適當轉錄及轉譯起始及封端序列，如以下詳細描述。此類調節元件可包括控制轉錄之操縱序列。
可另外併入通常由複製起點賦予之在宿主中複製之能力及促進轉型體識別之選擇基因。DNA區在功能上彼此相關時可操作地連接。舉例而言，若信號肽(分泌前導序列)之DNA表現為參與多肽分泌之前驅物，則其可操作地連接於多肽之DNA；若啟動子控制編碼序列之轉錄，則其可操作地連接於該序列；或若核糖體結合位點經定位從而允許轉譯，則其可操作地連接於編碼序列。意欲用於酵母表現系統中之結構元件包括能夠使轉譯蛋白質由宿主細胞在細胞外分泌的前導序列。或者，在無前導或輸送序列下表現重組蛋白質的情況下，其可包括N端甲硫胺酸殘基。此殘基可視情況隨後自表現之重組蛋白質裂解以提供最終產物。
表現控制序列及表現載體之選擇將視宿主之選擇而定。可採用各種表現宿主/載體組合。適用於真核宿主之表現載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列的載體。適用於細菌宿主之表現載體包括已知之細菌質體，諸如來自大腸桿菌之質體，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物，即更寬宿主範圍之質體，諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。
適用於在適當啟動子控制下表現抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段之宿主細胞包括原核生物、酵母、昆蟲或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌或桿菌。高等真核細胞包括如下所述之所建立的哺乳動物來源細胞株。亦可採用無細胞之轉譯系統。用於細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主之適當選殖及表現載體由Pouwels等人(Cloning Vectors：A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)描述，相關揭示內容以引用的方式併入本文中。
關於蛋白質產生之方法的其他資訊，包括抗體產生，可見於例如美國公開案第2008/0187954號、美國專利第6,413,746號及第6,660,501號以及國際專利公開案第WO 04009823號，各以全文引用之方式併入本文中。
亦宜採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統以表現重組抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段。可在哺乳動物細胞中進行重組蛋白質之表現，因為此類蛋白質一般正確摺疊、適當修飾且完全具有功能。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括HEK-293及HEK-293T、Gluzman(Cell 23：175,1981)描述之猴腎細胞之COS-7細胞株及其他細胞株，包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、NSO、海拉(HeLa)及BHK細胞株。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件，諸如複製起點、連接於待表現基因之適合啟動子及強化子以及其他5'或3'側接非轉錄序列以及5'或3'非轉譯序列，諸如所需核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及接受體位點以及轉錄封端序列。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質之桿狀病毒系統由Luckow及Summers,BioTechnology 6：47(1988)綜述。
藉由轉型宿主產生之抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段可根據任何適合之方法純化。此類標準方法包括例如層 析法(例如離子交換、親和力及篩分管柱層析法)、離心、差異溶解性或藉由蛋白質純化之任何其他標準技術。諸如六聚組胺酸(SEQ ID NO：61)、麥芽糖結合結構域、流感包膜序列、麩胱甘肽-S-轉移酶等親和力標籤可附接於蛋白質以允許藉由通過適當親和力管柱容易純化。分離之蛋白質亦可使用例如蛋白分解、核磁共振或X射線結晶來物理表徵。
舉例而言，來自分泌重組蛋白質至培養基中之系統的上清液可首先使用市售蛋白質濃縮過濾器，例如AMICON®或Millipore PELLICON®超濾單元濃縮。在濃縮步驟後，濃縮物可施加於適合純化基質。或者，可採用陰離子交換樹脂，例如具有側接二乙胺基乙基(DEAE)基團之基質或基底。基質可為丙烯醯胺、瓊脂糖、聚葡萄糖、纖維素或蛋白質純化中常用之其他類型。或者，可採用陽離子交換步驟。
適合陽離子交換劑包括包含磺丙基或羧基甲基之各種不溶基質。最終，可採用一或多個採用疏水性RP-HPLC介質，例如具有側接甲基或其他脂族基之矽膠的逆相高效液相層析(RP-HPLC)步驟，以進一步純化HER2結合分子。亦可採用一些或所有以上純化步驟的各種組合以提供均質重組蛋白質。
在細菌培養物中產生之重組抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段可例如藉由自細胞小球初始提取、接著一或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻層析步驟來分離。可採用高效液相層析(HPLC)進行最終純化步驟。在重組蛋白質表現中所採用之微生物細胞可藉由任何適宜方法，包括凍融循環、音波處理、機械破壞或使用細胞溶解劑來破壞。
此項技術中已知用於純化抗體及其他蛋白質之方法亦包括例如美國專利公開案第US20080312425號、第US20080177048號及第 US20090187005號中所述之方法，各公開案以全文引用之方式併入本文中。
IX.使用治療性抗-HER2結合分子之治療方法
本發明亦提供針對使用抗-HER2結合分子，例如抗體，包括其抗原結合片段、變異體及衍生物治療患有與HER2表現或表現HER2之細胞相關之疾病的患者的方法。
「表現HER2之細胞」意謂表現HER2蛋白質之細胞。用於偵測及/或定量細胞中HER2表現之方法為此項技術中所熟知且包括(但不限於)PCR技術、免疫組織化學(例如HERCEPTESTTM)、流動式細胞量測術、西方墨點法、ELISA及其類似方法。在一些態樣中，本文所揭示之方法應用於治療及診斷方法，其中癌細胞之HER2表現量低。
用本文所揭示之抗-HER2結合分子診斷及治療各種疾病及病症之方法係指保留本發明之抗-HER2結合分子之所需特性，例如能夠特異性結合HER2及中和HER2活性的抗-HER2抗體(例如39S抗體、變異體、衍生物及HER2結合片段；本發明之雙特異性抗-HER2分子；以及本發明之ADC分子)。
在一些態樣中，抗-HER2結合分子為介導人類ADCC之人類或人類化抗-HER2結合分子；或包含已知之介導ADCC之抗-HER2抗體；或包含經工程改造，使得其介導ADCC之抗-HER2結合分子。
在一些態樣中，抗-HER2結合分子為不介導人類ADCC之人類或人類化抗-HER2結合分子或包含已知之不介導ADCC之抗-HER2抗體；或包含經工程改造，使得其不介導ADCC之抗-HER2結合分子。
在一個態樣中，治療包括向個體或患者施加或投與本發明之抗-HER2結合分子、例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，或向來自個體或患者之分離之組織或細胞株施加或投與抗-HER2結合分子，其中該個體或患者患有疾病，具有疾病症狀或易患疾病。在另一 個態樣中，治療亦意欲包括向個體或患者施加或投與包含本發明之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之醫藥組合物，或向來自個體或患者之分離之組織或細胞株施加或投與包含抗-HER2結合分子之醫藥組合物，該個體或患者患有疾病，具有疾病症狀或易患疾病。
本發明之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物適用於治療各種癌症。在一個態樣中，本發明係關於抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，其用作藥劑，尤其用於治療或預防癌症。癌症之實例包括(但不限於)乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌、黑色素瘤、胰腺癌或***癌。在一些特定情況下，如例如經由HERCEPTESTTM測定，癌症之HER2表現量低。
根據本發明之方法，至少一種如本文中其他地方所定義之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物用於促進關於癌症之陽性治療反應。術語關於癌症治療之「陽性治療反應」係指與此等抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之活性相關的疾病改善，及/或與該疾病相關之症狀改善。
舉例而言，疾病改善可表徵為完全反應。術語「完全反應」係指在校正任何先前測試結果下不存在臨床上可偵測之疾病。或者，疾病改善可歸類為部分反應。「陽性治療反應」涵蓋因投與本發明之抗-HER2結合分子而減少或抑制癌症進展及/或持續、減輕或改善癌症嚴重程度及/或改善其一或多種症狀。
在特定態樣中，此類術語係指在投與本發明之抗-HER2結合分子後一個、兩個或三個或三個以上如下結果：(1)穩定、減少或消除癌細胞群體； (2)穩定或減慢癌生長；(3)阻礙癌形成；(4)根除、移除或控制原發性、區域性及/或轉移性癌症；(5)減少死亡；(6)無疾病、無復發、無進展及/或總存活期、總存活持續時間或總存活率增加；(7)增加反應速率、反應持久性或有反應或有緩解之患者的數量；(8)降低住院率，(9)減少住院時長，(10)癌症尺寸(例如體積)維持且不增加或增加小於10%，較佳小於5%、較佳小於4%、較佳小於2%，及(11)增加有緩解之患者之數量；(12)減少治療癌症另外需要之輔助療法(例如化學療法或激素療法)之數量。
臨床反應可使用篩選技術評估，該等篩選技術為諸如PET、磁共振成像(MRI)掃描、x放射線成像、電腦斷層(CT)掃描、流動式細胞量測術或螢光活化細胞分選儀(FACS)分析、組織學、宏觀病理學及血液化學，包括(但不限於)可由ELISA、RIA、層析法及其類似方法偵測之變化。除此等陽性治療反應之外，進行抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之療法的個體可經歷與疾病相關之症狀得到改善的有益作用。
本發明之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可與任何已知之癌症療法組合使用，包括已知適用，或已使用或當前使用以治療癌症，例如結腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌及乳癌之任何藥劑或藥劑組合。醫藥組合調配物或給藥方案之 第二藥劑或藥劑組合較佳具有與本發明之抗-HER2結合分子互補的活性，使得其不會不利地彼此影響。
抗癌劑包括用以治療惡性病(諸如癌生長)之藥物。藥物療法可單獨或與其他治療(諸如手術或放射療法)組合使用。視所涉及之器官之性質而定，若干類藥物可用於癌症治療。舉例而言，乳癌通常藉由***刺激，且可用使性激素不活化之藥物治療。類似地，***癌可用使雄激素，即雄性性激素不活化之藥物治療。
用於本發明之某些方法中的抗癌劑尤其包括抗體(例如結合IGF-1R之抗體、結合EGFR之抗體、結合HER2或HER3之抗體)、靶向IGF1R之小分子、靶向EGFR之小分子、靶向HER2之小分子、抗代謝物、烷基化劑、拓撲異構酶抑制劑、微管靶向劑、激酶抑制劑、蛋白質合成抑制劑、免疫治療劑、激素療法、糖皮質激素、芳香酶抑制劑、mTOR抑制劑、化學治療劑、蛋白激酶B抑制劑、磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑、週期素依賴性激酶(CDK)抑制劑、RLr9、CD289、酶抑制劑、抗-TRAIL、MEK抑制劑等。
在特定態樣中，本文所揭示之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段可與靶向表皮生長因子受體(EGFR)之其他抗體或抗體片段，例如Erbitux®(西妥昔單抗(cetuximab))或帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX®)組合投與。
在其他態樣中，本文所揭示之抗-HER2結合分子可與激酶抑制劑，例如酪胺酸激酶抑制劑組合投與。在一些其他特定態樣中，本文所揭示之抗-HER2結合分子可與同EGFR及/或HER2/neu相關之酪胺酸激酶活性抑制劑，例如拉帕替尼(lapatinib)組合投與。在一些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子可與抗有絲***劑組合投與。在一些特定態樣中，本發明之抗-HER2結合分子可與使有絲***紡錘體微管組件穩定化之藥劑，例如太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇(docetaxel)組合 投與。
在組合療法包含抗-HER2結合分子投與與另一治療劑投與組合的情況下，本發明之方法涵蓋使用分開調配物或單一醫藥調配物共同投與及以任一次序連續投與。在一些態樣中，本文所描述之抗-HER2結合分子與其他藥物組合投與，其中抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物及治療劑可以任一次序依序投與，或同時投與(亦即並行或在相同時間範圍內)。
組合療法可提供「協同作用」且證實「協同性」，亦即當活性成分一起使用時所達成之效應大於由分開使用化合物所產生之效應的總和。協同效應可在活性成分如下時獲得：(1)於組合之單位劑量調配物中共調配及同時投與或傳遞；(2)以分開調配物形式交替或並行傳遞；或(3)藉由一些其他方案。當以交替療法傳遞時，協同效應可在化合物例如藉由以分開注射器不同注射依序投與或傳遞時獲得。一般而言，在交替療法期間，依序(亦即連續)投與有效劑量之各活性成分，然而在組合療法中，一起投與有效劑量之兩種或兩種以上活性成分。
在一些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段，可與生長因子受體(EGFR)抑制劑協同組合投與。在一些態樣中，EGFR抑制劑為抗體。在特定態樣中，EGFR抑制劑抗體為ERBITUX®(西妥昔單抗)或VECTIBIX®(帕尼單抗)。在特定態樣中，本發明之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段，可與同EGFR及/或HER2/neu相關之酪胺酸激酶活性抑制劑，例如拉帕替尼協同組合投與。在一些態樣中，本發明之抗-HER2結合分子可與抗有絲***劑協同組合投與。在一些特定態樣中，抗有絲***劑使有絲***紡錘體微管組件穩定。在一些特定態樣中，抗有絲***劑為太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇。
另一態樣為本發明之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之用途，其用於診斷監測組織中之蛋白質含量，作為臨床測試程序之一部分，例如確定既定治療方案之功效。舉例而言，可藉由使抗體偶合至可偵測物質來促進偵測。可檢測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質和放射性物質。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適合螢光物質之實例包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括魯米諾(luminol)；生物發光物質之實例包括螢光素酶、螢光素和發光蛋白質；以及適合放射性物質之實例包括125I、131I、35S或3H。
另一態樣為本發明之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之用途，其用於治療對靶向HER2之治療劑，例如靶向HER2之結構域IV內之抗原決定基的抗體，諸如曲妥珠單抗，具有抗性之癌症患者。在一些態樣中，治療劑包含靶向與曲妥珠單抗相同之抗原決定基之部分及細胞毒性部分。在一些態樣中，此類細胞毒性部分為類美登素。在一些特定態樣中，類美登素為DM-1。
在一些態樣中，本文所揭示之治療方法包含投與抗-HER2結合分子，該抗-HER2結合分子為包含含有以下之重鏈(HC)可變區(VH)及輕鏈(LC)可變區(VL)的抗-HER2抗體：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)；(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以 外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)；(iv)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(v)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(vi)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。
在一些態樣中，本文所揭示之治療方法包含投與抗-HER2結合分子，該抗-HER2結合分子為包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域之抗-HER2抗體，其中(i)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合不同HER2抗體結合位點；(ii)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域II內之抗原決定基的第一HER2抗體結合位點；以及(iii)該第一HER2抗體結合位點不同於帕妥珠單抗之抗體結合位點。
在一些態樣中，本文所揭示之治療方法包含投與抗-HER2結合分子，該抗-HER2結合分子為包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含含有以下之重鏈(HC)可變區(VH)及輕鏈(LC)可變區(VL)：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)；(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)；(iv)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以 外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(v)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(vi)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。
在一些態樣中，此類抗-HER2結合分子之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含至少一個相對於包含含有SEQ ID NO：43之胺基酸之VH及含有SEQ ID NO：44之胺基酸之VL的免疫球蛋白抗原結合結構域之FW區不同的異源可變域構架區(FW)。在一些態樣中，第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含：(i)包含SEQ ID NO：11之胺基酸之可變輕鏈構架1(VL-FW1)；(ii)包含SEQ ID NO：12之胺基酸之VL-FW2；(iii)包含SEQ ID NO：13之胺基酸之VL-FW3；(iv)包含SEQ ID NO：14之胺基酸之VL-FW4；或(vi)其任何組合。
在一些態樣中，此類抗-HER2結合分子之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO：15或43之胺基酸；且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。在一些態樣中，此類抗-HER2結合分子之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中該VL包含SEQ ID NO：16或44之胺基酸；且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。在一些態樣中，此類抗-HER2結合分子之第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO：15之胺基酸；且其中該VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸。
在一些態樣中，此類抗-HER2結合分子之第二免疫球蛋白抗原結 合結構域(a)特異性結合於與曲妥珠單抗抗體相同之HER2抗原決定基；及/或(b)競爭性地抑制曲妥珠單抗抗體之HER2結合；及/或(c)包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個包含SEQ ID NO：54至59中任一者之胺基酸的互補決定區(CDR)。在一些態樣中，此類抗-HER2結合分子之第二免疫球蛋白抗原結合結構域為scFv，其包含(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸的VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸的VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸的VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸的VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸的VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸的VL-CDR3。
在其他態樣中，本文所揭示之治療方法包含投與抗-HER2結合分子，該抗-HER2結合分子為包含雙特異性抗-HER2抗體之ADC，其中該抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iii)包含SEQ ID NO：36之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布 賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iv)包含SEQ ID NO：37之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(v)包含SEQ ID NO：40之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；或(vi)包含SEQ ID NO：41之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
在其他態樣中，本文所揭示之治療方法包含投與抗-HER2結合分子，該抗-HER2結合分子為包含雙特異性抗-HER2抗體之ADC，其中該抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：69之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(ii)包含SEQ ID NO：71之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包 含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iii)包含SEQ ID NO：74之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iv)包含SEQ ID NO：76之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(v)包含SEQ ID NO：79之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分(例如妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；或(vi)包含SEQ ID NO：67之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分(例如兩個妥布賴森1508分子)，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
X. 醫藥組合物及投與方法
抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生 物(例如ADC，諸如Bs2-4T)製備及投與有需要之個體的方法為熟習此項技術者所熟知或容易確定。抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)之投與途徑可為例如經口、非經腸、藉由吸入或局部。如本文所用之術語非經腸包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、經直腸或經***投藥。然而，在與本文中之教示相容之其他方法中，本發明之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)可直接傳遞至有害細胞群體位點，由此增加患病組織對治療劑之暴露。
如本文中所論述，本發明之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)可以醫藥學上在活體內有效治療表現HER2之細胞介導之疾病(諸如某些類型癌症)的量投與。醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之載劑，包括例如水、離子交換劑、蛋白質、緩衝物質及鹽。亦可存在防腐劑及其他添加劑。載劑可為溶劑或分散介質。適用於本文所揭示之治療方法之調配物描述於Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)第16版(1980)中。
在任何情況下，無菌可注射溶液可藉由將需要量之活性化合物(例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，例如ADC，諸如Bs2-4T，本身或與其他活性劑組合)併入適當溶劑中，隨後過濾殺菌來製備。此外，可將製劑封裝且以套組形式銷售。此類製品可具有標籤或包裝說明書，指示相關組合物適用於治療患有或易患疾病或病症之個體。
非經腸調配物可為單次劑量、輸液或負荷單次劑量，之後為維持劑量。此等組合物可以特定固定或可變之時間間隔，例如一天一次，或基於「按需要」來投與。
組合物可以單次劑量、多次劑量或以輸注方式經確定之時段投與。亦可調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療性或預防性反應)。
本發明組合物治療表現HER2之細胞介導之疾病(諸如某些類型癌症，包括例如結腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、***癌及乳癌)的治療有效劑量視許多不同因素而變化，包括投與方式、標靶位點、患者之生理狀態、患者為人類還是動物、其他藥物投與以及預防性治療還是治療性治療。在一些特定態樣中，如例如使用HERCEPTESTTM測定，癌症之HER2表現量低。通常，患者為人類，但亦可治療非人類哺乳動物，包括轉殖基因哺乳動物。治療劑量可使用熟習此項技術者已知之常規方法來滴定以使安全性及功效最佳化。
至少一種抗-HER2結合分子，例如抗體或其結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)投與之量可容易藉由一般技術者在不進行過度實驗下確定。影響投與模式及至少一種抗-HER2結合分子，例如抗體或其結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)之相應量的因素包括(但不限於)疾病嚴重程度、病史及進行治療之個體的年齡、身高、體重、健康及身體情況。類似地，抗-HER2結合分子，例如抗體或其片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)投與之量將視投與模式及個體將進行此藥劑之單次給藥還是多次給藥而定。
本發明亦提供抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)之用途，其用於製造供治療一種類型癌症，包括例如乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌、黑色素瘤、胰腺癌及***癌之藥劑。在一些特定態樣中，如例如使用HERCEPTESTTM測定，癌症之HER2表現量低。
本發明亦提供抗-HER2結合分子，例如本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物之用途，其用於製造供治療個體以治療一種類型癌症之藥劑。在一些特定態樣中，如例如使用HERCEPTESTTM測定，癌症之HER2表現量低。在某些態樣中，藥劑用於已用至少一種其他療法預治療之個體中。
「預治療(pretreated)」或「預治療(pretreatment)」意欲個體在接受包含抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)之藥劑之前已接受一或多種其他療法(例如經至少一種其他抗癌療法治療)。個體不一定為用一或多種先前療法進行之預治療之反應者。因此，接受包含抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)之藥劑的個體可對先前療法之預治療或預治療包含多個療法之一或多個先前療法起反應，反應不良，或可能未能起反應。因此，本發明提供治療作為對其他療法(例如用抗體或ADC，諸如T-DM1治療)之不良反應者或無反應者之患者的方法，其包含投與本文所揭示之抗-HER2結合分子，例如抗體或其結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)。亦提供防止對癌症療法之抗性(例如對用抗體或ADC，諸如T-DM1之治療的抗性)的方法，其包含投與本文所揭示之抗-HER2結合分子，例如抗體或其結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)。
即使患者先前已經HER2抑制劑治療，但熟習此項技術者可確定一個人在用HER2抑制劑治療之後是否顯示不反應。舉例而言，對抑制劑不起反應可反映在患癌症增加，諸如癌症/腫瘤之生長增加，及/或腫瘤尺寸增加，形成(增加)癌轉移或癌轉移數目或尺寸增加。無反應亦可為例如在割除腫瘤之後出現腫瘤或癌轉移，疾病進展時間縮短，或例如在新輔助療法中(a)腫瘤及/或(b)癌轉移之尺寸增加。基於 此等參數或此項技術中已知之其他參數，可鑑別對用HER2抑制劑，如帕妥珠單抗、曲妥珠單抗或T-DM1治療不起反應之患者群。隨後此類患者群可用本文所揭示之抗-HER2結合分子，例如本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)治療。
本發明亦提供治療例如對另一療法反應不良或無反應之患者的方法。如本文中所使用之術語「無反應者」可指對使用HER2抑制劑(例如帕妥珠單抗、曲妥珠單抗或T-DM1)不太可能起反應之個體/患者/個體。如本文中所使用之「不太可能起反應」係指病理性完全反應將出現在用HER2抑制劑治療之患者中的可能性降低。在一些態樣中，患者最初可為優良反應者，且在用此類HER2抑制劑(例如帕妥珠單抗、曲妥珠單抗或T-DM1)治療期間可發展對HER2抑制劑之抗性，引起對治療之反應不良或無反應。
如本文中所使用之術語「優良反應者」係指在使用HER2抑制劑(如帕妥珠單抗、曲妥珠單抗或T-DM1)治療期間或之後，例如基於連續成像研究，腫瘤未顯示生長、癌轉移、癌轉移數目或尺寸增加等的個體，未在一段時間(例如初始診斷後約1年)內經歷腫瘤生長、癌轉移、癌轉移數目或尺寸增加等的個體，及/或經歷一定壽命(例如在初始診斷後約2年或超過2年)之個體。
如本文中所使用之術語「不良反應者」係指在例如使用HER2抑制劑(如帕妥珠單抗、曲妥珠單抗或T-DM1)之標準療法期間或之後不久，腫瘤生長或癌轉移或經歷可歸因於腫瘤之不良臨床作用的個體。
在評估個體為「無反應者」、「不良反應者」還是「不太可能起反應」(基於例如癌細胞中某些生物標記物之存在)的情況下，個體可用本文所揭示之抗-HER2結合分子，例如本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)治療。
本發明亦提供抗-HER2結合分子，例如本發明之抗體或其抗原結 合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)與至少一種其他療法之共同投與。抗-HER2結合分子與至少一種其他療法可一起在單一組合物中共同投與，或可同時或在重疊時間在分開的組合物中一起共同投與。在一些態樣中，抗-HER2結合分子，例如本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)可用作輔助療法。
本發明亦提供抗-HER2結合分子，例如本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物(例如ADC，諸如Bs2-4T)之用途，其用於製造供治療個體以治療癌症之藥劑，其中該抗-HER2結合分子在個體已用至少一種其他療法治療之前投與。
XI.診斷學
本發明進一步提供適用於診斷表現HER2之細胞介導之疾病(諸如某些類型癌症，包括例如結腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、***癌及乳癌)的診斷方法，其包含量測來自個體之組織或其他細胞或體液中HER2蛋白質或轉錄物之表現量，且將所量測之表現量與正常組織或體液中之標準HER2表現量比較，由此與標準比較之表現量的增加指示病症。
本發明之抗-HER2結合分子及其抗原結合片段、變異體及衍生物可用於使用熟習此項技術者已知之經典免疫組織化學方法，分析生物樣品中之HER2蛋白質含量(例如參加Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen等人，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。其他適用於偵測HER2蛋白質表現之基於抗體之方法包括免疫分析，諸如酶聯結免疫吸附分析(ELISA)、免疫沈澱或西方墨點法。適合分析在本文中其他地方更詳細地描述。
「分析HER2多肽之表現量」意欲直接(例如藉由確定或評估絕對蛋白質含量)或相對(例如藉由與第二生物樣品中疾病相關之多肽含量 比較)定性或定量量測或評估第一生物樣品中HER2多肽之含量。第一生物樣品中之HER2多肽表現量可量測或評估且與標準HER2多肽含量比較，標準係取自獲自未患病症之個體的第二生物樣品或藉由來自未患病症之個體群體之平均含量來確定。如此項技術中所瞭解，一旦已知「標準」HER2多肽含量，其可重複用作比較標準。
「生物樣品」意欲為自個體、細胞株、組織培養物或可能表現HER2之細胞的其他來源獲得之任何生物樣品。用於自哺乳動物獲得組織生檢及體液之方法為此項技術中所熟知。
XII. 包含抗-HER2結合分子之套組
本發明亦提供包含本文所揭示之抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段之套組，其可用於進行本文所描述之方法。在某些態樣中，套組在一或多個容器中包含至少一種經純化之抗-HER2結合分子或其抗原結合片段。在一些態樣中，套組含有進行偵測分析所需及/或足夠進行偵測分析之所有組分，包括所有對照、進行分析之指導及用於分析及呈現結果之任何所需軟體。熟習此項技術者將容易認識到本文所揭示之所揭示抗-HER2結合分子，例如抗-HER2抗體或其抗原結合片段可容易併入此項技術中熟知之確定套組格式之一中。
XIII. 免疫分析
本發明分子之抗-HER2結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、其變異體或衍生物可藉由此項技術中已知之任何方法分析免疫特異性結合。可使用之免疫分析包括(但不限於)使用諸如西方墨點法、放射免疫分析、ELISA(酶聯結免疫吸附分析)、「夾心式」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱反應、凝膠擴散沈澱分析、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射測定分析、螢光免疫分析、蛋白質A免疫分析之技術的競爭性及非競爭性分析系統，僅舉數例。此等分析為 常規的且在此項技術中已熟知(參加例如Ausubel等人編輯，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)第1卷，其以全文引用的方式併入本文中)。
本文所揭示之抗-HER2結合分子，例如本發明分子之雙特異性抗-HER2抗體或其抗原結合片段、其變異體或衍生物可用於組織學上，如免疫螢光、免疫電子顯微法或非免疫分析中，以原位偵測HER2受體或其保守變異體或肽片段。原位偵測可藉由自患者移除組織樣本，且向其施加標記之HER2結合分子，例如雙特異性抗-HER2抗體或其抗原結合片段、其變異體或衍生物，較佳藉由將標記之HER2結合分子(例如抗體或片段)覆蓋至生物樣品上施加來實現。經由使用此類程序，可不僅確定HER2或保守變異體或肽片段之存在，亦可確定其在檢驗組織中之分佈。使用本發明，一般技術者容易認識到各種組織學方法(諸如染色程序)中之任一者均可進行修改以實現此類原位檢測。
可根據熟知之方法確定既定批次之抗-HER2結合分子，例如雙特異性抗-HER2抗體或其抗原結合片段、其變異體或衍生物的結合活性。熟習此項技術者將能夠藉由採用常規實驗確定每次測定之操作及最佳分析條件。
適合於測定本發明之抗-HER2結合分子，例如雙特異性抗-HER2抗體或其抗原結合片段、其變異體或改變/突變衍生物之結合特徵的方法及試劑為此項技術中已知及/或可購得。設計用於此類動力學分析之設備及軟體可購得(例如BIAcore、BIAevaluation軟體，GE Healthcare；KinExa軟體，Sapidyne Instruments)。
除非另外指明，否則本發明之實施將採用在此項技術之技能內的細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉殖基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習知技術。此類技術充分解釋於文獻中。參見例如Sambrook等人編，(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編，(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover編，(1985)DNA Cloning，第I及II卷；Gait編，(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人 美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編，(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編，(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning；論文Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller及Calos編(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人編，Methods In Enzymology，第154及155卷；Mayer及Walker編，(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir及Blackwell編，(1986)Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；及Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。
抗體工程改造之一般原理闡述於Borrebaeck編(1995)Antibody Engineering(第2版；Oxford Univ.Press)中。蛋白質工程改造之一般原理闡述於Rickwood等人編(1995)Protein Engineering,A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)中。抗體及抗體-半抗原結合之一般原理闡述於以下中：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(第2版；Sinauer Associates,Sunderland,Mass.)；及Steward(1984)Antibodies,Their Structure and Function(Chapman及 Hall,New York,N.Y.)。另外，一般遵循如以下中，在此項技術中已知且未特別描述之免疫學中之標準方法：Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York；Stites等人編(1994)Basic and Clinical Immunology(第8版；Appleton & Lange,Norwalk,Conn.)以及Mishell及Shiigi(編)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and Co.,NY)中。
闡述免疫學之一般原理之標準參考文獻包括Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York；Klein(1982)J.,Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination(John Wiley & Sons,NY)；Kennett等人編，(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press,NY)；Campbell(1984)「Monoclonal Antibody Technology」,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Burden等人編，(Elsevere,Amsterdam)；Goldsby等人編，(2000)Kuby Immunnology(第4版；H.Freemand & Co.)；Roitt等人(2001)Immunology(第6版；London：Mosby)；Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版；Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann及Dubel(2001)Antibody Engineering(Springer Verlan)；Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Lewin(2003)Genes VIII(Prentice Hall2003)；Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach及Dveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)。
XIV. 實施例
實施例係根據「EnXn」模式指示，其中E意謂「實施例」；n為實施例序數；X視情況存在且可為A或B，其中A表示特別與ADC構築體 有關之實施例，且B表示特別與具有增強之ADCC之構築體有關的實施例；以及m為視情況存在之指示類別內額外實施例之子序數(例如A1、B1等)。
E1. 一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中(i)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗體結合位點，(ii)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域II內之抗原決定基的第一HER2抗體結合位點，且(iii)該第一HER2抗體結合位點不同於帕妥珠單抗之抗體結合位點。
E2. 如E1之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域IV內之抗原決定基的第二HER2抗體結合位點。
E3. 如E2之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二HER2抗體結合位點與曲妥珠單抗之HER2抗體結合位點一致。
E4. 如E2之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二HER2抗體結合位點與曲妥珠單抗之HER2抗體結合位點部分重疊。
E5. 如E2之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二HER2抗體結合位點不同於曲妥珠單抗之HER抗體結合位點。
E6. 一種雙特異性HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基；且其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域在SEQ ID NO：52中之一或多個胺基酸殘基結合HER2。
E7. 根據E6之雙特異性抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域在結構域IV內之抗原決定基結合HER2。
E8. 根據E6之雙特異性抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結 合結構域在SEQ ID NO：53中之一或多個胺基酸殘基結合HER2。
E9. 根據E1-E8之雙特異性抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含含有以下之重鏈(HC)可變區(VH)及輕鏈(LC)可變區(VL)：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)；(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)；(iv)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(v)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(vi)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。
E10. 根據E9之雙特異性抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含相對於包含含有胺基酸SEQ ID NO：43之VH及含有SEQ ID NO：44之胺基酸之VL的免疫球蛋白抗原結合結構域之FW區不同的至少一個異源可變域構架區(FW)。
E11. 根據E10之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含：(i)包含SEQ ID NO：11之胺基酸之可變輕鏈構架1(VL-FW1)；(ii)包含SEQ ID NO：12之胺基酸之VL-FW2；(iii)包含SEQ ID NO：13之胺基酸之VL-FW3； (iv)包含SEQ ID NO：14之胺基酸之VL-FW4；或(v)其任何組合。
E12. 一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO：15或43之胺基酸；且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
E13. 一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中該VL包含SEQ ID NO：16或44之胺基酸；且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
E14. 如E12或E13之雙特異性抗-HER2抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：15之胺基酸；且其中該VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸。
E15. 根據E1至E14中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段。
E16. 根據E1至E15中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含scFv抗體片段。
E17. 根據E1至E16中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含以下或由以下組成：(a)進一步包含重鏈恆定區或其片段之VH及包含輕鏈恆定區(LC)或其片段之VL；(b)單鏈Fv(「scFv」)； (c)雙功能抗體；(d)微型抗體；(e)F(ab')2；或(f)F(ab)。
E18. 根據E17之雙特異性抗-HER2抗體，其中該重鏈恆定區或其片段為IgG恆定區。
E19. 根據E18之雙特異性HER2抗體，其中該IgG恆定區或其片段為IgG1恆定區。
E20. 根據E17至E19中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該LC恆定區為κ恆定區。
E21. 根據E17至E19中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該LC恆定區為λ恆定區。
E22. 根據E1至E21中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域為單株抗體。
E23. 根據E1至E22中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域為人類化抗體。
E24. 根據E1至E22中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域為人類抗體。
E25. 根據E1至E22中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域為嵌合抗體。
E26. 根據E1至E25中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域為親和力優化抗體。
E27. 根據E1至E26中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域不與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗競爭結合抗原決定基。
E28. 根據E1至E27中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該 第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同非重疊HER2抗原決定基。
E29. 根據E1至E28中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中：(a)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於與該曲妥珠單抗抗體相同之HER2抗原決定基；(b)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域競爭性地抑制該曲妥珠單抗抗體之HER2結合；或(c)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個包含SEQ ID NO：54至59中任一者之胺基酸的互補決定區(CDR)。
E30. 根據E29之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域為包含以下之scFv：(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸之VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸之VL-CDR3。
E31. 根據E30之雙特異性抗-HER2抗體，其中該scFv為經二硫化物穩定之scFv。
E32. 根據E30或E31之雙特異性抗-HER2抗體，其中該scFv包含含有SEQ ID NO：17之胺基酸之VH及含有SEQ ID NO：18之胺基酸之VL。
E33. 根據E32之雙特異性抗-HER2抗體，其中該scFv之該VH及VL經由肽連接子共價連接。
E34. 根據E33之雙特異性抗-HER2抗體，其中該肽連接子包含 SEQ ID NO：19之胺基酸。
E35. 根據E29至E34中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價連接於該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之羧基端。
E36. 根據E35之雙特異性抗-HER2抗體，其包含***該第二免疫球蛋白抗原結合結構域與該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之該羧基端之間的連接子。
E37. 根據E29至E34中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價連接於該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之胺基端。
E38. 根據E37之雙特異性抗-HER2抗體，其包含***該第二免疫球蛋白抗原結合結構域與該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之該胺基端之間的連接子。
E39. 根據E29至E34之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價***該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之多肽鏈。
E40. 根據E39之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價***該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之CH1區與CH2區之間。
E41. 根據E40之雙特異性抗-HER2抗體，其包含：(i)***該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之CH1區與該第二免疫球蛋白抗原結合結構域之間的連接子；以及(ii)***該第二免疫球蛋白抗原結合結構域與該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之CH2區之間的第二連接子。
E42. 根據E41之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一連接子與該第二連接子一致。
E43. 根據E41之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一連接子與該第二連接子不同。
E44. 根據E36、E38及E41至E43中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該等連接子中之一或多者包含肽連接子。
E45. 根據E44之雙特異性抗-HER2抗體，其中該肽連接子包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少10個、至少20個或至少30個胺基酸。
E46. 根據E44或E45中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該肽連接子包含具有式Serx[(Gly)y-Ser4]z之肽，其中x為0至1，y為1至4，且z為1至10。
E47. 根據E46之雙特異性抗-HER2抗體，其中該肽連接子包含SEQ ID NO：19-22。
E48. 根據E1至E47中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該重鏈包含含有Fc結構域之恆定區。
E49. 根據E48之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域包含CH2區及CH3區。
E50. 根據E48之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域為IgG1 Fc結構域。
E51. 根據E50之雙特異性抗-HER2抗體，其中該IgG1 Fc結構域為天然IgG1 Fc結構域。
E52. 根據E51之雙特異性抗-HER2抗體，其中該天然IgG1 Fc結構域包含SEQ ID NO：23之胺基酸。
E53. 根據E48之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域為突變IgG1 Fc結構域。
E54A. 根據E53之雙特異性抗-HER2抗體，其中該突變IgG1 Fc結構域包含至少一個能夠降低該雙特異性抗體之ADCC活性的突變。
E54B. 根據E53之雙特異性抗-HER2抗體，其中該突變IgG1 Fc結構域包含至少一個能夠增強該雙特異性抗體之ADCC活性的突變。
E55A. 根據E54A之雙特異性抗-HER2抗體，其中至少一個能夠降低該雙特異性抗體之ADCC活性的突變為胺基酸取代。
E55B. 根據E54B之雙特異性抗-HER2抗體，其中至少一個能夠增強該雙特異性抗體之ADCC活性之突變為胺基酸取代。
E56A. 根據E55A之雙特異性抗-HER2抗體，其包含至少一個包含L234F、S239A、S239C、位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸***或其任何組合之胺基酸取代，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E56B. 根據E55B之雙特異性抗-HER2抗體，其包含至少一個包含S239A、S239D、A330L、I332E、E333A、K334A或其任何組合之胺基酸取代，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E57A. 根據E55A或E56A之雙特異性抗-HER2抗體，其中該突變IgG1 Fc結構域包含至少一個引入可衍生基團之胺基酸取代。
E57B. 根據E48至E53、E54B、E55B或E56B中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域具有增強ADCC活性之改變類型糖基化。
E58A. 根據E57A之雙特異性抗-HER2抗體，其中該突變IgG1 Fc結構域包含1至3個引入可衍生基團之胺基酸取代。
E58B. 根據E57B之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域為具有減少量之海藻糖基殘基之低海藻糖基化抗體。
E59A. 根據E57A或E58A之雙特異性抗-HER2抗體，其中該可衍生基團為硫氫基。
E59B. 根據E57B或E58B之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結 構域具有增加之二等分GlcNAc結構。
E60. 根據E59A之雙特異性抗-HER2抗體，其中該至少一個胺基酸取代包含S239C、248C、254C、258C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、435C、440C、441C、S442C、443C、位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸***及446C或其任何組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E61A. 根據E54A、E55A、E56A、E57A、E58A、E59A或E60中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該突變Fc結構域包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：65之胺基酸。
E61B. 根據E54B、E55B、E56B、E57B、E58B、E59B或E60中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該突變Fc結構域包含SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：64之胺基酸。
E62. 一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含彼此締合之第一及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈係選自：(1)[TZS]-[L1]-[BVH]-[BCH]-[Fcx]
(2)[BVH]-[BCH]-[Fcx]-[L2]-[TZS]
(3)[BVH]-[BCH]-[L3]-[TZS]-[L4]-[Fcx]
其中TZs為結合與曲妥珠單抗相同之抗原決定基的scFv；L1、L2、L3及L4為肽連接子；Fcx為Fc結構域；BVH及BCH分別為能夠結合於與該曲妥珠單抗抗體所識別之抗原 決定基不同的HER2抗原決定基之抗體的VH及CH1區。
E63. 根據E62之雙特異性抗-HER2抗體，其中該不同抗原決定基包含SEQ ID NO：52內之一或多個胺基酸。
E64. 根據E62或E63之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二鏈包含[BVL]-[CL]，其中BVL為能夠結合於與該曲妥珠單抗抗體所識別之抗原決定基不同之HER2抗原決定基的抗體之VL區域，且CL為IgG輕鏈恆定區。
E65. 根據E64之雙特異性抗-HER2抗體，其中CL係選自由人類κ恆定區及人類λ恆定區組成之群。
E66. 根據E64或E65之雙特異性抗-HER2抗體，其中BVL包含：(i)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。
E67. 根據E64、E65或E66之雙特異性抗-HER2抗體，其中BVL包含SEQ ID NO：16或44之胺基酸。
E68. 根據E65之雙特異性抗-HER2抗體，其中CL包含SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：66之胺基酸。
E69. 根據E62至E68中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[TZS]包含：(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸之VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸之VL-CDR1； (v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸之VL-CDR3。
E70. 根據E62至E69中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[TZS]為經二硫化物穩定之scFv。
E71. 根據E62至E70中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[TZS]包含藉由肽連接子共價連接的包含SEQ ID NO：17之胺基酸之VH及包含SEQ ID NO：18之胺基酸之VL。
E72. 根據E71之雙特異性抗-HER2抗體，其中該肽連接子包含SEQ ID NO：19之胺基酸。
E73. 根據E69至E72中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[TZS]包含SEQ ID NO：28之胺基酸。
E74. 根據E62至E73中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中鉸鏈多肽連接[BCH]與[FcX]。
E75. 根據E74之雙特異性抗-HER2抗體，其中該鉸鏈多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸或由其組成。
E76A. 根據E62至E75中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該[Fcx]包含至少一個引入可衍生基團之胺基酸取代。
E76B. 根據E62至E75中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[Fcx]包含至少一個能夠增強該雙特異性抗體之ADCC活性之突變。
E77A. 根據E76A之雙特異性抗-HER2抗體，其中該[Fcx]包含1至3個引入可衍生基團之胺基酸取代。
E77B. 根據E76B之雙特異性抗-HER2抗體，其中至少一個能夠增強該雙特異性抗體之ADCC活性之突變為胺基酸取代。
E78A. 根據E76A或E77A之雙特異性抗-HER2抗體，其中該可衍生基團為硫氫基。
E78B. 根據E77B之雙特異性抗-HER2抗體，其包含至少一個包 含S239A、S239D、A330L、I332E、E333A、K334A或其任何組合之胺基酸取代，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E78B1. 根據E62至E75、E76B、E77B或E78B中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域具有增強ADCC活性之改變類型糖基化。
E78B2.根據E78B1之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域為具有減少量之海藻糖基殘基之低海藻糖基化抗體。
E78B3.根據E78B1或E78B2之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域具有增加之二等分GlcNAc結構。
E79. 根據E78A之雙特異性抗-HER2抗體，其中該至少一個胺基酸取代包含S239C、248C、254C、258C、273C、279C、282C、284C、286C、287C、289C、297C、298C、312C、324C、326C、330C、335C、337C、339C、350C、355C、356C、359C、360C、361C、375C、383C、384C、389C、398C、400C、413C、415C、418C、422C、435C、440C、441C、S442C、443C、446C、位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸***或其任何組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E80A. 根據E62至E75、E76A、E77A、E78A或E79中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[Fcx]包含SEQ ID NO：23、24、63、25及65中任一者之胺基酸。
E80B. 根據E62至E75、E76B、E77B、E78B、E78B1、E78B2、E78B3或E79中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[Fcx]包含SEQ ID NO：23、62及64中任一者之胺基酸。
E81. 根據E62至E79中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[L1]、[L2]、[L3]及[L4]包含獨立地選自由SEQ ID NO：19、20、21及22 組成之群的胺基酸。
E82. 根據E62至E79中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中：(i)[L1]包含SEQ ID NO：19之胺基酸；(ii)[L2]包含SEQ ID NO：20之胺基酸；(iii)[L3]包含SEQ ID NO：21之胺基酸；以及(iv)[L4]包含SEQ ID NO：22之胺基酸。
E83. 根據E62至E82中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[BVH]包含：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)。
E84. 根據E62至E82中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[BVH]包含SEQ ID NO：15或43。
E85. 根據E62至E84中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[BCH]包含SEQ ID NO：29之胺基酸。
E86. 根據E64至E85中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[BVL]包含：(i)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以 外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。
E87. 根據E64至E85中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中[BVL]包含SEQ ID NO：16或44之胺基酸。
E88A. 根據E62至E87中任一項之雙特異性HER2抗體，其中第一多肽鏈包含SEQ ID NO：30、31、32、69、33、71、34、35、36、74、37、76、38、39、40、79、41或81中任一者之胺基酸，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO：42或82之胺基酸，其中該雙特異性HER2抗體結合於治療部分。
E88B. 根據E62至E87中任一項之雙特異性HER2抗體，其中第一多肽鏈包含SEQ ID NO：30、67、68、70、34、72、73、75、38、77、78或80中任一者之胺基酸，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO：42或82之胺基酸，其中該雙特異性HER2抗體具有增強之ADCC活性。
E89. 根據E1至E88B中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該雙特異性HER2抗體在結合於HER2標靶時誘發內化。
E90. 根據E89之雙特異性HER2抗體，其中該雙特異性HER2抗體在內化後促進有效溶酶體輸送。
E91. 根據E1至E88B中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該雙特異性HER2抗體誘發HER2標靶降解。
E92. 根據E1至E88B中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該雙特異性HER2抗體阻斷低HER2表現之癌細胞中配位體誘發之AKT磷酸化。
E93. 根據E1至E88B中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該雙特異性HER2抗體破壞配位體誘發之HER2：HER3二聚。
E94. 一種抗-HER2結合分子，其包含免疫球蛋白重鏈(VH)及免疫球蛋白輕鏈(VL)，其中該結合分子包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸之VH-CDR1； (ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸之VL-CDR3。
E95. 一種抗-HER2結合分子，其包含免疫球蛋白重鏈(VH)及免疫球蛋白輕鏈(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：15之胺基酸。
E96. 一種抗-HER2結合分子，其包含VH及VL，其中該VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸。
E97. 如E94或E95或E96之結合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：15之胺基酸且該VL包含SEQ ID NO：16之胺基酸。
E98. 如E94至E97中任一項之結合分子，其包含抗體或其抗原結合片段。
E99A. 一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體或根據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子及至少一個治療部分。
E100A.根據E99A之ADC，其進一步包含至少一個視情況存在之間隔基。
E101A.根據E100A之ADC，其中至少一個間隔基為肽間隔基。
E102A.根據E100A之ADC，其中至少一個間隔基為非肽間隔基。
E103A.根據E99A至E102A中任一項之ADC，其包含兩個、三個或四個治療部分。
E104A.根據E99A至E103A中任一項之ADC，其中所有治療部分均相同。
E105A.根據E99A至E104A中任一項之ADC，其中各治療部分化 學結合於該雙特異性抗體之Fc區中之特定位置的胺基酸之側鏈。
E106A.根據E105A之ADC，其中該等特定位置係選自由以下組成之群：239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443、446、位置239與240之間的***或其組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E107A.根據E105A或106A之ADC，其中該等特定位置為239、442或兩者，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E108A.根據E105A或106A之ADC，其中該等特定位置為442及位置239與240之間的胺基酸***，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E109A. 根據E105A至E108A之ADC，其中該胺基酸側鏈為硫氫基側鏈。
E110A.一種ADC，其包含根據E1至E98中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引； (iii)包含SEQ ID NO：36之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iv)包含SEQ ID NO：37之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(v)包含SEQ ID NO：40之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；或(vi)包含SEQ ID NO：41之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E111A1. 一種ADC，其包含根據技術方案1至113中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：69之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(ii)包含SEQ ID NO：71之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係 根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iii)包含SEQ ID NO：74之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iv)包含SEQ ID NO：76之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(v)包含SEQ ID NO：79之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；或(vi)包含SEQ ID NO：81之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
E112A.根據E99A至E111A中任一項之ADC，其中該治療部分包含細胞毒素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞激素、淋巴激素、趨化激素、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光敏性治療劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物、螯合劑或其組合。
E113A.根據E112A之ADC，其中該細胞毒素為妥布賴森、奧瑞他汀、類美登素或吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
E114. 一種分離之核酸分子或一組核酸分子，其編碼根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體或根據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子或其互補序列。
E115. 一種載體或一組載體，其包含如E114之核酸分子或該組核酸分子或其互補序列。
E116. 一種宿主細胞，其包含根據E114之分離之核酸分子或該組核酸分子，或根據E115之載體或該組載體。
E117. 一種宿主細胞，其表現根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體或根據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子。
E118. 一種用於產生根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體或根據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子的方法，其包含培養根據E116或E117中任一項之宿主細胞及自培養基回收抗體。
E119. 一種醫藥組合物，其包含根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體、根據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子或根據E99A至E113A1中任一項之ADC及醫藥學上可接受之載劑。
E120. 一種治療表現HER2之癌症之方法，其包含向有需要之個體投與根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體、根據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子、根據E99A至E113A1中任一項之ADC或根據E119之組合物。
E121. 根據E120之方法，其中該癌症為低HER2表現癌症。
E122. 根據E120或E121中任一項之方法，其進一步包含投與至少一種其他治療劑。
E123. 根據E122之方法，其中該至少一種其他治療劑為放射核種或化學治療劑。
E124. 一種使治療部分靶向表現HER2之細胞的方法，其包含投與與根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體、根據E94至E98中 任一項之抗-HER2結合分子或根據E99A至E113A1中任一項之ADC融合或結合之該治療部分。
E125. 一種增加治療部分之活性的方法，其包含將該部分結合於根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體、根據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子或根據E99A至E113A1中任一項之ADC。
E126. 一種提高治療部分之藥物動力學特性之方法，其包含將該部分結合於根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體、根據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子或根據E99A至E113A1中任一項之ADC。
E127. 根據E122至E126中任一項之方法，其中該治療部分為細胞毒素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞激素、淋巴激素、趨化激素、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光敏性治療劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物或螯合劑。
E128. 根據E127之方法，其中該細胞毒素為妥布賴森、奧瑞他汀、類美登素或吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
E129. 根據E113A之ADC或根據E128之方法，其中該細胞毒素為具有以下結構之妥布賴森1508：
E130. 一種治療對靶向HER2之治療劑之抗性的方法，其包含向有需要之患者投與根據E1至E93中任一項之雙特異性HER2抗體、根 據E94至E98中任一項之抗-HER2結合分子或根據E99A至E113A中任一項之ADC。
XV. 序列
以下表3提供序列參考號(SEQ ID NO：)、胺基酸序列及關於該序列之評論。
以下實例係以說明而非限制之方式提供。
實例
本發明之態樣可進一步參考以下非限制性實例定義，該等非限制性實例詳細描述本發明之某些抗體的製備及本發明之抗體的使用方法。熟習此項技術者將顯而易知，在不悖離本發明之範疇的情況下，可對材料及方法作出許多修改。
許多HER2抗體已批准用於治療腫瘤過度表現HER2之乳癌患者，包括曲妥珠單抗(HERCEPTIN®；參見美國專利第5,821,337號)、帕妥珠單抗(PERJETATM；專利公開案WO2001/00245)及T-DM1(阿多-曲妥珠單抗恩坦辛，KADCYLATM，由單株抗體曲妥珠單抗連接於細胞毒性劑美坦辛(DM1)組成之抗體-藥物結合物，Niculescu-Duvaz等人，2010,Curr.Opin.Mol.Ther.12：350-60)。然而，未指示此等療法針對大多數HER2表現量低之患者。另外，存在對此等療法不起反應或變得具有抗性之患者。因此，對針對此等患者之優良治療劑存在未滿足之醫學需求。
如以下提供之特定實例中所詳述，藉由結合HER2之結構域II內之新描述之抗原決定基的優化完全人類抗-HER2抗體與結合HER2之結構域IV內之已知抗原決定基的scFv組合，產生高度有效雙特異性抗體。產生許多不同雙特異性抗體組態且測試。所提供之獨特雙特異性抗體展現在所測試之任一單特異性抗-HER2抗體下所未見到之生物活性。在許多分析中，雙特異性抗體亦顯示超越單特異性抗-HER2抗體之協同活性。本文所提供之雙特異性抗體之許多活體外及活體內活性藉由在不存在或嚴重減少與Fcγ受體之結合活性下添加細胞毒性劑(例如妥布賴森1508)而進一步增強。另外，發現本文所提供之獨特雙特異性抗體之活體外活性亦可例如藉由改變糖基化增強ADCC活性來增強(例如使用POTELLEGENTTM技術(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)產生具有增強之ADCC活性之低海藻糖基化抗體)。此等資料表明雙特異性抗體尤其作為ADC或作為ADCC增強之抗體，可具有治療用途，用於治 療表現廣泛範圍之HER2含量之癌症，包括當前無法用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗或T-DM1治療之患者。此外，雙特異性抗體可具有治療現有抗-HER2療法無法治療之癌症患者的治療用途。
實例1
1.1 先導物優化
AZ1.39.1為一種針對人類HER2之完全人類單株抗體，其不與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗競爭結合(專利公開案WO 2008/019290)。39S為一種自AZ1.39.1產生之先導物優化之抗體(圖1)，如下詳述。定點突變誘發用於將輕鏈CDR1中之不成對Cys殘基用Ile置換且藉由將DG改變成DA，來移除重鏈CDR3中之潛在異構化位點(DG)。所得變異體證實與AZ1.39.1相同之結合特異性及活體外抗增殖活性(資料未展示)。為產生較高親和力結合劑，將突變誘發應用於重鏈之CDR殘基且突變體在哺乳動物細胞中表現為IgG且藉由捕捉ELISA，針對其與重組人類HER2細胞外域蛋白質之結合活性來篩選。對結合信號顯著高於野生型對照之純系進行測序以揭露突變資訊。自鑑別之突變構築組合文庫且藉由捕捉ELISA，針對與重組人類HER2細胞外域蛋白質之結合活性進行篩選。發現39S具有最高結合活性，且進一步之序列分析顯示39S在重鏈CDR1中攜帶單一N5S突變。藉由BIAcore所確定，39S對人類HER2之親和力(K D )為約1.0nM，相比之下，親本1.39.1抗體之報導親和力為約2.0nM。因此，此單一突變使得與親本抗體相比，結合親和力增加2倍。為提高抗體表現量，構架序列、尤其輕鏈之FR1、FR2及FR3自IGKV4-1+Jk3.01換成IGVK2D生殖系序列，使得在培養7天之後量測，IgG表現量增加大約2倍(圖2)。
1.2. 先導物優化之抗體39S的結合特異性及物種交叉反應性
為確定39S是否保留其親本抗體AZ1.39.1之結合特異性及物種交叉反應性，藉由捕捉ELISA，檢驗39S與人類ErbB家族之受體 (EGFR、HER2、HER3及HER4)、小鼠Her2及食蟹獼猴Her2之結合。簡言之，將96孔盤用以下重組細胞外域蛋白質之一塗佈：人類EGFR、人類HER2、人類HER3、人類HER4、小鼠Her2或食蟹獼猴Her2。待測試之抗體藉由以逐步1：3連續稀釋而稀釋在50nM至0.28pM範圍內來製備，且接著一式兩份地添加至孔。在培育一小時之後，洗滌培養盤且添加山羊抗人類IgG Fab HRP結合之二級抗體至各孔且將培養盤培育1小時。將培養盤洗滌且添加TMB受質且培育5-20分鐘以允許顯色。在反應結束時添加停止溶液至孔且在450nm下讀取培養盤。使用Prism軟體將結合信號(450nm下吸光度)針對抗體濃度繪製曲線。結果展示，39S類似於AZ1.39.1，可結合於人類HER2及食蟹獼猴Her2，但不結合於人類EGFR、HER3、HER4或小鼠Her2(資料未展示)。
1.3 39S抗原決定基定位及表徵
藉由在人類與小鼠Her2分子之間交換結構域，鑑別出人類HER2之結構域II為39S之抗原決定基。選擇小鼠Her2作為嵌合搭配物，因為其不為39S所識別，但與人類HER2共享85%序列一致性。構築靶向HER2之各結構域之嵌合變異體(參見以下方法)，如表4中所列，包括人類HER2結構域I、II、III或IV經小鼠對應物置換之四種基因剔除(KO，功能損失)變異體及一種將人類HER2之結構域II移植至小鼠Her2分子中之基因嵌入(KI，功能增加)變異體。嵌合變異體命名指示變異體類型(KO/KI)及交換之結構域的數目。39S與此等變異體之結合型態使用基於SPR之儀器ProteOnTM，藉由使用抗人類及小鼠Her2多株抗體捕捉感測器表面上之變異體來表徵(參見以下方法)。藉由抗-His多株抗體，使用ProteOnTM監測變異體之表現。39S與功能喪失變異體之結合結果已證實結構域II為含抗原決定基之結構域。39S不結合於編碼小鼠結構域II之KO_II之變異體(表4)，同時保留與編碼小鼠結構 域I之KO_I之變異體的結合。雖然剔除人類結構域III及IV之變異體(KO_III及KO_IV)不表現，但基於功能增加變異體KI_II上之結合結果，排除此兩個結構域為39S之抗原決定基。此編碼小鼠結構域I、III及IV及人類結構域II之功能增加變異體(KI_II)由結合親和力(168pM)與人類HER2(84pM)類似之39S識別。因此，藉由功能喪失及功能增加變異體，鑑別出人類HER2之結構域II(胺基酸146-310)為39S之含抗原決定基之結構域。
進一步細化39S之抗原決定基且鑑別出結構域II中之胺基酸192-208之區域為關鍵抗原決定基區域。構築一系列嵌合人類/小鼠變異體，靶向在人類與小鼠Her2蛋白質之間具有不同胺基酸序列的結構域II之短區域，如表4中所列。藉由以下人類HER2區每一者經小鼠對應物替換，包括胺基酸146-208、159-162、171-187、192-208、250-261、276-285及295-296來產生七個基因剔除變異體。此外，藉由將人類HER2之胺基酸192-208之區域移植至小鼠分子來構築一種基因嵌入變異體。變異體命名指示變異體類型(KO/KI)及具有胺基酸編號之交換區域。所有變異體均具有抗-His多株抗體可偵測之表現量(表4)。39S不結合於其中人類HER2之胺基酸192-208之區域經小鼠殘基置換之嵌合變異體任一者(KO_146-208、KO_192-208)。當人類HER2之任何其他區域經小鼠胺基酸取代時39S之結合不受影響(KO_159-162、KO_171-187、KO_250-261、KO_276-285及KO_295-296)。此外，39S結合於編碼人類192-208之KI變異體(KI_192-208)，KD為72pM，與人類HER2之KD(84pM)相當。綜合而言，鑑別出人類HER2結構域II中胺基酸192-208之區域為39S之功能性抗原決定基。
變異體命名指示變異體類型(KO/KI)及具有胺基酸編號之交換區域。胺基酸位置係基於不具有信號肽之成熟人類HER2序列之編號方案表示。所有變異體之表現量藉由抗-His多株抗體監測。39S與此等 變異體之結合型態使用基於SPR之儀器ProteOnTM，藉由使用抗人類及小鼠Her2多株抗體捕捉感測器表面上之變異體來表徵。藉由捕捉感測器表面上之Her2蛋白質，預期在39S固定在晶片表面上之格式中，所量測之39S之表觀結合親和力高於單價結合親和力。
嵌合人類/小鼠Her2變異體之構築及表現如下構築。簡言之，藉由重疊PCR，使用人類及小鼠Her2質體作為模板(MedImmune)組裝及擴增編碼具有His標籤之嵌合人類/小鼠Her2變異體的DNA。將經組裝之DNA選殖至哺乳動物表現載體pEBNA(MedImmune)中。隨後使用293fectin及標準方案，根據製造商說明書(Invitrogen)，將HEK293F細胞用各種構築體短暫轉染。
使用ProteOnTM XPR36儀器(BioRad)研究39S與嵌合人類/小鼠變 異體之結合特徵。標準胺偶合用於將10mM乙酸鈉(pH 5.0)中之抗人類或小鼠Her2多株抗體(R&D System)固定至GLC生物感測器晶片之表面，每一通道約5000共振單元(RU)。注射細胞培養物上清液中之嵌合蛋白質且藉由抗人類或小鼠多株抗體捕捉至具有約200RU反應之GLC表面上。抗-HER2 mAb 39S在具有0.005% Tween-20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)(pH 7.4)中自10nM稀釋至0.625nM(1：2稀釋)，且以100μL/min注射180秒，具有600秒解離時間。嵌合變異體之表現量藉由在與注射39S相同之條件下使抗-His多株抗體(MedImmune)流動來監測。藉由在100μL/min下注射甘胺酸緩衝液(10mM，pH 1.5)30秒，使表面再生兩次。所有感測器圖譜資料均用ProteOnTM Manager 3.0.1軟體處理。
基於FACS之結合競爭分析用於確定抗體是否競爭結合於與曲妥珠單抗及/或帕妥珠單抗相同的抗原決定基。收穫BT-474細胞，再懸浮於FACS緩衝液中，且將2.5×105個細胞/孔添加至96孔U形底盤中。待測試之抗體(R347 IgG1同型對照、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、AZ1.39.1及39S)藉由在含有2μg/mL Alexa-Fluor 647標記之39S抗體的FACS緩衝液中以逐步1：4連續稀釋，稀釋在500μg/mL至1.9ng/mL範圍內來製備且接著一式三份地添加至細胞。在冰上染色1小時之後，將細胞用冰冷FACS緩衝液洗滌3次且接著用2% PFA固定。藉由BD LSR II機，用BD FACSDivaTM軟體分析細胞。用FlowJo軟體分析資料且以平均MFI±SEM(n=3)呈現。
圖4展示39S結合於與其親本抗體AZ1.39.1相同之抗原決定基；且39S不與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗競爭結合。39S、帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之結合位點藉由圖3中提供之HER2之帶狀結構上的箭頭指示。
1.4 39S之活體外活性
選擇一組表現各種含量之HER2的人類癌細胞株用於評估抗體或 抗體組合之抗增殖活性。細胞中之HER2表現量藉由HercepTest®及定量FACS測定(表5)。
增殖抑制分析：將細胞於含血清培養基中以每孔5,000至20,000個之密度(視各細胞株之生長動力學而定)塗鋪於96孔培養盤，體積為100μL。2X濃度之待測試之各劑量抗體或抗體組合藉由在培養基中稀釋測試物品來製備。一百微升各測試物品一式三份地添加至細胞，使得以一系列逐步1：4連續稀釋，最終劑量曲線在10μg/mL至0.15ng/mL範圍內。對於配位體依賴性增殖抑制分析，將細胞於無血清培養基中塗鋪且藉由將測試物品在無血清培養基中稀釋來製備4X濃度之待測試之各劑量抗體或抗體組合。將五十微升各測試物品一式三份地添加至細胞，且接著將50μL於無血清培養基中稀釋之32ng/mL濃度的海瑞古林-β1(Heregulin-β1)添加至細胞以實現8ng/mL之最終海瑞古林- β1濃度，且以一系列逐步1：4連續稀釋，最終抗體劑量曲線在100μg/mL至6.1ng/mL範圍內。經處理之細胞在37℃/5% CO2下培養4至7天(視各特定細胞株之生長動力學而定)。使用來自Promega之Cell Titer Glo，根據製造商之說明書，確定細胞活力。使用GraphPad Prism軟體分析資料且呈相對於未經處理之對照的生長抑制%呈現。
圖5展示39S在抑制MCF-7細胞中之配位體驅動之增殖中具有與帕妥珠單抗類似之活性。與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗組合，39S展示配位體依賴性增殖之累加或協同抑制，效能與曲妥珠單抗及帕妥珠單抗組合相當。在諸如MDA-MB-361及RT-112之其他細胞株中觀測到類似結果(資料未展示)。
圖6展示39S與帕妥珠單抗一樣，對抑制含血清培養基中NCI-N87細胞增殖具有有限活性。然而，當與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗組合時，39S證實抑制細胞生長之強協同效應。39S與曲妥珠單抗或帕妥珠單抗之間的協同作用遠超在曲妥珠單抗與帕妥珠單抗之組合下所見到之協同作用。在BT-474細胞中觀測到類似結果(資料未展示)。
實例2
2.1. 雙特異性抗體構築
Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及Bs4Ab-39SH之選殖 藉由將抗-HER2結構域IV抗體(SEQ ID NO：17及18，其中X為C)、抗-HER2抗體39S(SEQ ID NO：15及16)之可變結構域選殖至包含適當恆定區之表現載體中來產生雙特異性表現構築體。抗-HER2結構域IV可變結合結構域構築為單鏈Fv(scFv)。使用以上SEQ ID NO：17及18之胺基酸序列(其中X-C)，設計及合成用於最大哺乳動物蛋白質表現之密碼子優化DNA序列。使用類似於Dimasi等人，(2009)J.Mol.Biol.393,672-692中所述之方法的方法，產生Bs2Ab及Bs3Ab構築體。使用與專利公開案WO2013070565A1中所述之方法類似的方法，產生Bs4Ab構築體。 最終合成基因含有兩個半胱胺酸突變，分別地，一個在輕鏈位置100且一個在重鏈位置44。此等半胱胺酸將在VL與VH結構域之間形成鏈間雙硫鍵以穩定化scFv。使用20個胺基酸殘基(G4S)4(SEQ ID NO：19)連接scFv之兩個VL及VH結構域。藉由使用10個胺基酸殘基連接子(G4S)2(SEQ ID NO：83)，將Bs2Ab中之scFv連接於重鏈N端。藉由使用10個胺基酸殘基連接子(G4S)2(SEQ ID NO：83)，將Bs3Ab格式之scFv連接於抗體CH3結構域之C端。兩個序列連接子(G4S)2(SEQ ID NO：83)用於連接Bs4Ab主鏈中之scFv。使用DNA序列確定構築體一致性及保真度。
圖7提供產生用於結合於HER2抗原之Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH雙特異性抗體格式(分別為圖A、B及C)每一者的示意圖。雙特異性抗體具有兩個結合單元，每一個結合單元結合相同抗原上之不同抗原決定基。結合單元在圖上標記。該分子相對於結合單元兩側對稱。如所描繪，Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH格式係指其中scFv融合於可變區(Bs2Ab-39SH)之胺基端，經由連接子(例如(G4S)2(SEQ ID NO：83))***經修飾之鉸鏈區(Bs4Ab-39SH)或重鏈之CH3之羧基端(Bs3Ab-39SH)中的雙特異性抗體。所示三個雙特異性構築體由經由甘胺酸絲胺酸連接子(例如(G4S)2(SEQ ID NO：83))融合於抗-HER2結構域II人類IgG1之抗-HER2結構域IV結合scFv構成。
Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及Bs4Ab-39SH構築體之胺基酸序列提供於圖8(亦參見SEQ ID NO：30、34及38天然Fc區)。圖8A展示Bs2Ab-39SH之雙特異性抗體重鏈胺基酸序列及針對增強之ADCC及或兩個及四個藥物負載之位點特異性抗體藥物結合之可能取代位點。抗-HER2結構域IV scFv呈VL-(G4S)4連接子-VH格式(『(G4S)4』揭示為SEQ ID NO：19)且經由(G4S)2連接子(SEQ ID NO：83)基因連接於抗-HER2結構域II抗體重鏈之胺基端。可針對增強之ADCC及位點特異性 結合，在抗體之CH2及CH3中進行裏面描繪之胺基酸取代及或***。圖8B展示Bs3Ab-39SH之雙特異性抗體重鏈胺基酸序列及針對增強之ADCC及或兩個及四個藥物負載之位點特異性抗體藥物結合之可能取代位點。抗-HER2結構域IV scFv呈VL-(G4S)4連接子-VH格式(『(G4S)4』揭示為SEQ ID NO：19)且經由(G4S)2連接子(SEQ ID NO：83)基因連接於抗-HER2結構域II抗體重鏈之羧基端。可針對增強之ADCC及位點特異性結合，在抗體之CH2及CH3中進行裏面描繪之胺基酸取代及或***。圖8C展示Bs4Ab-39SH之雙特異性抗體重鏈胺基酸序列及針對增強之ADCC及或兩個及四個藥物負載之位點特異性抗體藥物結合之可能取代位點。抗-HER2結構域IV scFv呈VL-(G4S)4連接子-VH格式(『(G4S)4』揭示為SEQ ID NO：19)且經由兩個(G4S)2連接子(SEQ ID NO：83)***抗-HER2結構域II抗體重鏈之經修飾之鉸鏈區中。可針對增強之ADCC及位點特異性結合，在抗體之CH2及CH3中進行裏面描繪之胺基酸取代及或***。
2.2 雙特異性抗體之結合特異性及物種交叉反應性
如實例1中所述，藉由捕捉ELISA，確定雙特異性抗體對人類EGFR、人類HER2、人類HER3、人類HER4、小鼠Her2或食蟹獼猴Her2之重組細胞外域蛋白質的結合特異性及物種交叉反應性。結果展示所有測試之雙特異性抗體，包括Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及Bs4Ab-39SH，能夠以類似效能結合於人類HER2及食蟹獼猴Her2，且其中無一者結合於人類EGFR、HER3、HER4或小鼠Her2(資料未展示)，表明雙特異性抗體保留其親本單株抗體之結合特異性及物種交叉反應性。
雙特異性抗體對人類HER2及食蟹獼猴Her2之結合動力學藉由BIAcore測定(資料未展示)。Bs2Ab-39SH對人類HER2之親和力(K D )為113pM，且Bs4Ab-39SH為236pM。
2.3 雙特異性抗體之活體外活性
使用實例1中所描述之方法確定雙特異性抗體抑制配位體驅動之細胞增殖之活性。結果展示Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及Bs4Ab-39SH在MDA-MB-361細胞(圖9A)及MCF-7細胞(圖9B)中具有類似效能，其亦與親本抗體組合(39S加曲妥珠單抗)之活性相當。在包括NCI-N87及RT-112之其他細胞株中觀測到類似結果(資料未展示)。
2.4 雙特異性抗體對HER2：HER3雜二聚之破壞
收穫T47D細胞，洗滌且再懸浮於無血清培養基中。將細胞以1×106個細胞/孔之密度接種於6孔盤中且接著在37℃/5% CO2下培育隔夜。次日，將細胞用500nM濃度之待測試之抗體(R347 IgG1同型對照、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、39S及Bs2Ab-39SH)預處理1小時。在預處理之後，添加8ng/mL最終濃度之海瑞古林-β1且將細胞在37℃/5% CO2下培育5分鐘。隨後將細胞用冰冷1×PBS洗滌兩次，溶解且使用小鼠抗人類HER2(純系44E7)抗體及來自Thermo Scientific之Pierce Classic IP套組根據製造商說明書進行免疫沈澱。經免疫沈澱之蛋白質樣品在含有2-巰基乙醇之勒姆利緩衝液(Laemmli buffer)中溶離且藉由西方墨點法，使用標準方案分析。在西方墨點分析中，使用兔抗人類HER2(純系29D8)抗體偵測HER2且使用兔抗人類HER3(C-17)多株抗體偵測HER3。
圖10展示Bs2Ab-39SH及39S類似於帕妥珠單抗，可破壞藉由配位體刺激誘發之HER2：HER3雜二聚。
2.5 雙特異性抗體對HER2之叢集
為檢驗雙特異性抗體是否可交聯HER2以形成大的複合物，將重組人類HER2細胞外域蛋白質與Bs2Ab-39SH或曲妥珠單抗以各種莫耳比混合且在室溫下培育30分鐘。藉由HPLC尺寸排阻層析法分離所形成之免疫複合物；其尺寸隨後藉由多角度光散射(MALS)分析來分 析。
圖11展示來源於1：1之抗體：HER2莫耳比之代表性資料(在其他莫耳比下之資料未展示)。結果表明Bs2Ab-39SH可交聯許多HER2分子以形成大至1716kDa尺寸之蛋白質複合物，而曲妥珠單抗僅可最多結合於兩個HER2分子以形成320kDa複合物。在Bs4Ab-39SH下觀測到類似結果(資料未展示)。
2.6 雙特異性抗體增強內化及溶酶體輸送
藉由FACS量測抗體內化。自T150燒瓶收穫BT-474細胞，再懸浮在冰冷培養基中且接著以1×106個細胞/孔添加至96孔U形底盤中。細胞藉由在4℃下離心粒化。拂去培養基，且將細胞小球一式三份地再懸浮於150μL含有10μg/mL待測試之抗體或抗體組合(R347 IgG1同型對照、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、AZ1.39.1,39S、曲妥珠單抗+39S、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗、帕妥珠單抗+39S、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗+39S、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及Bs4Ab-39SH)之冰冷培養基中。將細胞在冰上培育1小時且接著洗滌以移除未結合之抗體。細胞之等分試樣保存在冰上；其餘部分在37℃/5% CO2下培育不同時段(30分鐘、1小時、2小時或4小時)且接著立即在冰上冷卻。將細胞用冰冷FACS緩衝液洗滌兩次且接著用4% PFA固定20分鐘。固定後，將細胞用抗人類IgG Alexa-Fluor 488染色且藉由BD LSR II機及BD FACSDivaTM軟體分析。用FlowJo軟體分析資料。受體-抗體複合物內化計算為在37℃下，在減去來源於未經處理之對照之平均螢光強度(MFI)的背景值之後，相對於冰上之螢光強度的MFI損失%。
圖12展示雙特異性抗體(Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH)可誘發比任何單一單特異性抗體或抗體組合快得多且強得多之內化。帕妥珠單抗、AZ1.39.1、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗、帕妥珠單抗+39S及曲妥珠單抗+帕妥珠單抗+39S具有與39S類似或更低內化型 態且未展示在圖中。在細胞株NCI-N87、MDA-MB-361及RT-112中觀測到類似結果(資料未展示)。
共聚焦顯微鏡法用於觀察抗體內化及溶酶體輸送。自T-150燒瓶收穫BT-474細胞，且再懸浮在冰冷培養基中且接著以2.5×105個細胞/孔添加至96孔U形底盤中。細胞藉由在4℃下離心粒化。拂去培養基，且將細胞小球再懸浮於在10μg/mL待測試之抗體，諸如R347 IgG1同型對照、曲妥珠單抗、Bs2Ab-39SH及Bs4Ab-39SH存在下之150μL冰冷培養基中。將細胞在37℃/5% CO2下培育不同時段(30分鐘、2小時、4小時或6小時)且接著立即在冰上冷卻。將細胞用冰冷FACS緩衝液洗滌兩次且接著使用BD Biosciences Cytofix/CytopermTM固定/滲透溶液根據製造商說明書固定及滲透。將細胞在黑暗中用抗人類IgG Alexa-Fluor 488及小鼠抗人類LAMP-1(純系H4A3)、隨後抗-小鼠IgG Alexa-647染色。在染色之後，細胞離心塗至正電荷載片上且用含有DAPI之ProLong®金色抗衰減試劑蓋上。隨後藉由Leica SP5共焦顯微鏡及Leica Application Suite Advanced Fluorescence軟體套件目測細胞。
圖13展示抗體內化及輸送至溶酶體。Bs2Ab-39SH與Bs4Ab-39SH促進比曲妥珠單抗快得多之內化及強得多之溶酶體輸送，曲妥珠單抗幾乎不展示內化(Bs4Ab-39SH之資料未展示)。
使用西方墨點分析監測HER2之溶酶體降解。收穫BT-474，洗滌且再懸浮於培養基中。將細胞以5×104個細胞/孔之密度接種於96孔盤中且在37℃/5% CO2下用500nM濃度之待測試之抗體(R347 IgG1同型對照、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、39S、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗、曲妥珠單抗+39S、帕妥珠單抗+39S、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗+39S、Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH及Bs4Ab-39SH)處理2小時、6小時或24小時。在處理結束時，將細胞用冰冷1×PBS洗滌兩次且接著根據製造商 說明書溶解於來自Thermo Scientific之M-PER哺乳動物蛋白質提取物緩衝液中。藉由BCA分析量測各溶解產物之蛋白質濃度。在西方墨點法中將各溶解產物中同等量之蛋白質負載至凝膠上。兔抗人類HER2(純系29D8)抗體及兔抗人類GAPDH(純系D16H11)抗體分別用於偵測HER2及GAPDH。
圖14展示雙特異性抗體(Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH或Bs4Ab-39SH)處理導致BT-474細胞中明顯HER2降解，且單特異性抗體或抗體組合不誘發或誘發有限的HER2降解。
實例3
3.1. 用於位點特異性結合及消除Fcγ受體結合活性之位點特異性突變體的選殖
使用標準重疊PCR法將突變L234F、S239C及S442C獨立或組合(L234F-S239C(FC)及L234F-S239C-S442C(FCC))引入Bs2Ab-39SH及Bs4Ab 39SH構築體之Fc部分中。引子經設計以含有所需突變，且含有限制位點以促進定向選殖之側接引子用於擴增含有特定突變之Fc片段。使用界定之限制位點將經修飾之Fc PCR產物選殖至哺乳動物表現載體中。Fc突變之身分藉由DNA序列分析證實。
圖15展示具有用於位點特異性結合之胺基酸取代的三種抗-HER2雙特異性抗體(Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH、Bs4Ab-39SH)之說明。此外，使用抗體重鏈CH2上之L234F取代(圖中未描繪)將Fcγ受體結合降至最低。在希望2之DAR下，在位點1(例如S239C)或位點2(例如S442C)對半胱胺酸取代進行工程改造，且對於4之DAR，在兩個位點，對半胱胺酸取代進行工程改造。雙特異性藥物構築體在本文中亦稱作Bs2-2T/Bs2-4T、Bs3-2T/Bs3-4T及Bs4-2T/Bs4-4T。
所得雙特異性抗體結合於基本上如下所述之妥布賴森1508有效負載(參見實例5)。
3.2. 雙特異性ADC之結合特異性及物種交叉反應性
為確定妥布賴森1508之結合是否改變抗原結合特異性及物種交叉反應性，如實例1中所述，藉由捕捉ELISA，證實雙特異性ADC與人類EGFR、人類HER2、人類HER3、人類HER4、小鼠Her2及食蟹獼猴Her2之重組細胞外域蛋白質之結合活性。結果展示結合不改變雙特異性ADC之抗原結合特異性及物種交叉反應性。Bs2-4T與Bs4-4T可結合於人類HER2及食蟹獼猴Her2，效能與其未結合型式相同；且其中無一者展示結合於人類EGFR、HER3、HER4或小鼠Her2(資料未展示)。雙特異性ADC對人類HER2之結合動力學藉由BIAcore確定且結果展示Bs2-4T對人類HER2之親和力(K D )為120pM，且Bs4-4T為271pM。
3.3. 雙特異性ADC對細胞內微管網路之破壞
為檢查抗-HER2 ADC對細胞內微管網路之破壞，選擇三種細胞株：SKOV-3、JIMT-1及RT112，其分別代表T-DM1適當、T-DM1無反應及T-DM1不適當。在第1天，藉由胰蛋白酶消化收穫細胞，再懸浮於培養基中，且接著以6×104個細胞/孔之密度接種於8孔室載片。將載片在37℃/5% CO2下培育隔夜。在第2天，抽吸培養基以移除任何未附接之細胞且接著添加含有5nM待測試之ADC的新鮮培養基至細胞。將載片在37℃/5% CO2下培育隔夜。在第3天，將各腔室用1×PBS洗滌兩次。隨後用4% PFA固定細胞20分鐘。在固定結束時，移除腔室且根據標準免疫螢光程序將載片染色。簡言之，使用Triton X-100將細胞滲透且用含有Tween-20之1×PBS洗滌。兔抗人類α-微管蛋白Alexa-Fluor 488(純系11H10)在DAKO抗體稀釋劑中以1：100稀釋且添加至載片。在室溫下培育1小時之後，將載片用含有DAPI之ProLong®金色抗衰減試劑蓋上。藉由Leica SP5共焦顯微鏡及Leica Application Suite Advanced Fluorescence軟體套件目測染色細胞。
圖16A展示在SKOV-3(代表T-DM1適當患者之細胞株)中，T-DM1與Bs2-4T均能夠破壞微管網路。在SKBR-3細胞中觀測到類似結果(資料未展示)。
圖16B展示在JIMT-1(代表T-DM1無反應患者之細胞株)中，僅僅Bs2-4T能夠破壞細胞內微管網路。
圖16C展示在RT-112(代表T-DM1不適當患者之細胞株)中，Bs2-4T能夠破壞細胞內微管網路，而T-DM1無活性。
3.4. 雙特異性ADC之活體外活性
使用一組表現各種含量之HER2的人類癌細胞株評估雙特異性ADC之細胞毒性活性(實例1中之表5)。簡言之，收穫細胞，再懸浮，且於含血清培養基中以每孔5,000至20,000個之密度(視各細胞株之生長動力學而定)塗鋪於96孔盤，體積為100μL。2X濃度之待測試之各劑量抗體或ADC藉由在培養基中稀釋測試物品來製備。一百微升各測試物品一式三份地添加至細胞，使得以一系列逐步1：4連續稀釋，最終劑量曲線在5nM至0.08pM範圍內。將經處理之細胞在37℃/5% CO2下培育3至4天，視各特定細胞株之生長動力學而定。使用Cell Titer Glo根據製造商說明書測定細胞活力。藉由GraphPad Prism軟體分析資料且呈相對於未經處理之對照的生長抑制%呈現。使用S形非線性回歸，用GraphPad Prism軟體分析確定EC50值，且概述於表6中。
圖17A展示SKBR-3(一種代表T-DM1適當患者之人類乳癌細胞株)中Bs2-2T及Bs2-4T相對於T-DM1及各種對照之細胞毒性活性。資料表明在SKBR-3細胞中Bs2-2T與Bs2-4T均比T-DM1有效。
圖17B展示SKBR-3(一種代表T-DM1適當患者之人類乳癌細胞株)中Bs4-2T及Bs4-4T相對於T-DM1及各種對照之細胞毒性活性。資料表明在SKBR-3細胞中Bs4-2T與Bs4-4T比T-DM1有效。
圖18A展示JIMT-1(一種代表T-DM1適當但無反應患者之人類乳癌細胞株)中Bs2-2T及Bs2-4T相對於T-DM1及各種對照之細胞毒性活性。資料表明Bs2-2T與Bs2-4T均非常有效地殺死JIMT-1細胞，而T-DM1未展示活性。
圖18B展示JIMT-1(一種代表T-DM1適當但無反應患者之人類乳癌細胞株)中Bs4-2T及Bs4-4T相對於T-DM1及各種對照之細胞毒性活性。資料表明Bs4-2T與Bs4-4T非常有效地殺死JIMT-1細胞，而T-DM1未展示活性。
圖19A展示ZR-75-1(一種代表T-DM1不適當患者之人類乳癌細胞株)中Bs2-2T及Bs2-4T相對於T-DM1及各種對照之細胞毒性活性。資料表明Bs2-4T殺死ZR-75-1細胞之活性最強，而Bs2-2T具有較低程度之活性且T-DM1未展示或展示有限細胞毒性活性。
圖19B展示ZR-75-1(一種代表T-DM1不適當患者之人類乳癌細胞株)中Bs4-2T及Bs4-4T相對於T-DM1及各種對照之細胞毒性活性。資料表明Bs4-4T殺死ZR-75-1細胞之活性最強，而Bs4-2T具有較低程度 之活性且T-DM1未展示或展示有限細胞毒性活性。
圖20展示MDA-MB-468(一種無HER2表現之人類乳癌細胞株)中Bs2-2T及Bs2-4T相對於T-DM1及各種對照之細胞毒性活性。數據表明在MDA-MB-468細胞中Bs2-2T與Bs2-4T均無活性，表明Bs2-2T與Bs2-4T之細胞毒活性視標靶(HER2)而定。類似結果在Bs4-2T及Bs4-4T下觀測到(資料未展示)。
3.5. 雙特異性ADC構築體之活體內活性
基於細胞株之異種移植(CBX)腫瘤模型及來源於患者之異種移植(PDX)腫瘤模型：所有小鼠實驗均按照the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)公開之指南及the MedImmune Institutional Animal Care and Use Committee批准之方案進行。4-8週齡之間的無胸腺裸鼠用於此項研究中。在皮下CBX模型中，單側在右腰窩上用以特定繼代批次自培養物收穫之腫瘤細胞注射動物。在正位CBX模型中，藉由將5×106個細胞/小鼠(懸浮於50%基質膠中)注射至動物右腰窩上之***脂肪墊中來建立異種移植。在PDX模型中，用自每一者自特定繼代批次植入之宿主動物收穫之腫瘤片段單側植入動物腰窩上。對於各實驗，在其評估開始日期之前大約一週開始，記錄研究前腫瘤體積。當腫瘤達到適當腫瘤體積起始(TVI)範圍(通常150-250mm3)時，動物隨機化至處理及對照組且開始給藥。除非另外說明，否則動物每週給藥一次，其中測試物品經由靜脈內或腹膜內注射。每日觀測動物且每週量測及記錄腫瘤尺寸及體重兩次。使用下式計算腫瘤體積：腫瘤=π÷6(長度×寬度2)。腫瘤生長曲線以平均腫瘤體積(mm3)±SEM呈現。
圖21A展示在MDA-MB-361模型(一種代表T-DM1不適當患者之人類乳癌CBX腫瘤模型)中，甚至在較低濃度(1mg/kg)下，相對於T-DM1(3mg/kg)及各種對照(均為3mg/kg)，Bs2-4T亦具有較高活體內 活性。資料顯示Bs2-4T誘發劑量依賴性腫瘤生長抑制，且在3mg/kg劑量下，Bs2-4T誘發完全腫瘤消退，而T-DM1展示有限活性。在3mg/kg下，相對於T-DM1，Bs4-4T亦顯示較高活體內活性(圖21B)。
圖22展示ST996模型中Bs2-2T相對於Bs2-4T及T-DM1之活體內活性。ST996為來源於三重陰性乳癌患者(HER2 IHC：1+；ER-；PR-)之初級PDX模型。資料顯示在3mg/kg劑量下Bs2-2T誘發穩固的腫瘤生長抑制，不過其抗腫瘤效能與Bs2-4T相比稍微降低。相比之下，在ST996模型中T-DM1未展示活性。在其他低HER2表現之PDX模型ST738、ST455B及ST821中觀測到類似結果(資料未展示)。
圖23展示ST225模型(一種代表T-DM1適當患者之人類乳癌PDX腫瘤模型)中Bs2-4T相對於T-DM1及各種對照之活體內活性。資料顯示在3mg/kg劑量下Bs2-4T誘發完全及持久的腫瘤消退。相比之下，在治療期期間T-DM1僅僅誘發腫瘤停滯，且在停止治療之後腫瘤再次快速生長。
圖24展示JIMT-1模型(一種代表T-DM1適當但無反應患者之人類乳癌CBX正位腫瘤模型)中Bs2-4T相對於T-DM1及各種對照之活體內活性。資料顯示在3mg/kg劑量下Bs2-4T誘發完全及持久的腫瘤消退。相比之下，T-DM1或T-DM1加帕妥珠單抗組合未展示活性。
圖25展示ST455B模型中Bs2-4T相對於T-DM1及各種對照之活體內活性。ST455B為來源於三重陰性乳癌患者(HER2 IHC：1+、ER-、PR-)之初級PDX模型。資料顯示在3mg/kg劑量下Bs2-4T誘發完全腫瘤消退，而T-DM1未展示活性。為進一步擴大圖25中展示之研究結果，在來源於具有相對較低之HER2表現量(經由HercepTest，+1至+2)之乳癌患者的另16個PDX模型中檢驗Bs2-4T。在選擇此等模型時亦考慮其他標準，包括HER2表現不均一性之程度、ER/PR狀態及組織病理學子類，以最大化該研究中腫瘤亞型之多樣性。表7概述此17個不 同PDX乳癌模型中Bs2-4T之活體內活性。Bs2-4T證實無論腫瘤之組織病理學子類及ER/PR狀態如何，均有效之抗腫瘤活性。在1mg/kg劑量下，41%腫瘤模型展示腫瘤消退且6%展示腫瘤停滯。在3mg/kg劑量下，71%模型展示腫瘤消退且12%展示腫瘤停滯。
此等研究證實在廣泛範圍之乳癌模型中，與單特異性ADC療法(例如T-DM1)相比，本發明之雙特異性ADC之優良活性。詳言之，本發明之雙特異性ADC在具有低HER2表現量之癌症模型中及T-DM1無反應患者之模型中具有活體內活性。
3.6. 具有獲得性T-DM1抗性之腫瘤模型中雙特異性ADC之活性
對T-DM1具有獲得性抗性之NCI-N87細胞經由用遞增濃度，至多5μg/mL之T-DM1連續處理來產生。如實例3中所述，在親本與抗性細胞株中檢驗Bs2-4T相對於T-DM1之活體外細胞毒性活性。圖26A中展示之結果表明Bs2-4T與T-DM1在親本NCI-N87細胞中為活性，而Bs2-4T比T-DM1更有效(左圖)。在抗性細胞株中，T-DM1已喪失活性，而Bs2-4T在殺死抗性細胞方面仍然具有活性(右圖)。其他抗性細胞株亦 經由用T-DM1連續處理來產生，包括BT-474、SKOV-3及MDA-MB-361，且在此等抗性細胞株中觀測到在Bs2-4T下類似之細胞毒性活性(資料未展示)。
為建立具有獲得性T-DM1抗性之活體內腫瘤模型，將T-DM1抗性NCI-N87細胞皮下注射至免疫缺乏小鼠。載有腫瘤之小鼠用3mg/kg T-DM1治療。似乎活體外T-DM1抗性未完全轉化成活體內抗性，此反映在動物中腫瘤生長之相當大的變化上。因此，選擇具有大的難治性腫瘤(體積為約1000mm3)之小鼠且腫瘤組織片段繼代至新小鼠，直至在每週一次3mg/kg T-DM1處理存在下腫瘤一致生長。在三次繼代之後，穩定抗性腫瘤進化且使此等腫瘤成碎片且植入小鼠中以評估Bs2-4T之活體內活性。如圖26B中所證實，自重複T-DM1處理復發之腫瘤不僅對T-DM1具抗性，且亦對T-DM1及帕妥珠單抗組合療法無反應。相比之下，在處理後，Bs2-4T誘發穩固及持續腫瘤消退，表明其能夠作為T-DM1復發/難治性患者之有效療法。
圖26B展示Bs2-4T誘發T-DM1抗性NCI-N87腫瘤模型中之腫瘤消退。回應於Bs2-4T(3mg/kg)、T-DM1(3mg/kg)或其他對照抗體/ADC(3mg/kg，除帕妥珠單抗為10mg/kg以外)每週一次靜脈內給藥，總共4次給藥的腫瘤生長曲線展示為平均腫瘤體積(mm3)±SEM(n=7)。*藉由史都登氏t檢驗，與未經處理之對照組相比，P<0.001。
3.7. 藉由曲妥珠單抗預處理未削弱雙特異性ADC之活體內抗腫瘤活性
將ST225 PDX腫瘤片段單側植入無胸腺裸鼠之腰窩。將小鼠隨機化至處理及對照組，且當腫瘤體積達到200-250mm3時開始給藥。在處理組中，向小鼠給予媒劑緩衝液或曲妥珠單抗(3mg/kg)。三天後，小鼠接受每週一次Bs2-4T之靜脈內注射，共4次給藥。圖27展示在ST225 PDX模型中曲妥珠單抗之預處理未削弱Bs2-4T之抗腫瘤活性， 表明若Bs2-4T用於治療復發/曲妥珠單抗或T-DM1難治性患者，則可不需要清除期。ST225為具有HER2過度表現之原發性乳癌PDX模型。回應於各種處理之腫瘤生長曲線以平均腫瘤體積(mm3)±SEM呈現在圖27中(n=10)。
3.8. 雙特異性ADC之旁觀者效應
NCI-N87細胞經綠色螢光蛋白質(GFP)穩定轉染且MDA-MB-468細胞經紅色螢光蛋白質(RFP)穩定轉染。收穫兩種細胞株，洗滌，再懸浮於培養基中且接著作為共培養物接種於6孔盤中之相同孔中。作為對照，將各細胞株作為單一培養物接種於不同6孔盤中(圖28A)。為調整至不同生長動力學，將NCI-N87細胞以5×105個細胞/孔接種且MDA-MB-468細胞以2×105個細胞/孔接種。將細胞在37℃/5% CO2下培育2天。抽吸培養基且添加含有5nM待測試之抗體或ADC之新鮮培養基至細胞，且將培養盤在37℃/5% CO2下培育4天。在處理結束時，收集各孔中之細胞，洗滌，再懸浮於100μL冰冷FACS緩衝液中且接著用2% PFA固定。藉由BD LSR II機及BD FACSDivaTM軟體，分析細胞。用FlowJo軟體分析資料。
圖28B證實Bs2-4T可在共培養物中殺死HER2過度表現與無HER2細胞，表明Bs2-4T具有旁觀者效應。相比之下，T-DM1無法殺死共培養物中無HER2之細胞，表明其不具有旁觀者效應。作為對照，Bs2-4T與T-DM1均展示在單一培養物中有效殺死NCI-N87細胞且Bs2-4T與T-DM1均未展示在單一培養物中殺死MDA-MB-468細胞(資料未展示)。
3.9. 雙特異性ADC針對癌症幹細胞之活性
癌症幹細胞球分析：將MDA-MB-361細胞在標準組織培養條件下在補充有20% FBS之Leibovitz L-15培養基中培養。藉由胰蛋白酶消化收穫細胞，用PBS洗滌兩次，且再懸浮於幹細胞培養基(SCM：補充 有20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF、5mg/mL胰島素、0.4% BSA及1%基因剔除血清替代之DMEM/F12)中達每毫升30,000個細胞。為形成原發性球，將1mL細胞塗鋪至24孔超低附接培養盤中且用10pM R347-4T、T-DM1或BS2-4T處理且在37℃/5% CO2下培育4天。在處理結束時，收穫原發性球，使用0.05%胰蛋白酶解離且以30,000個細胞/毫升之密度再懸浮於含有與原發性球培養物相同之抗體處理的SCM中。隨後將細胞一式三份地塗鋪至96孔超低附接培養盤中且培育4天。使用Cell Titer Glo根據製造商說明書測定球細胞活力。資料呈相對於未經處理之對照的CSC球形成倍數呈現。圖29(左圖)展示Bs2-4T抑制CSC球形成達84%且T-DM1不具有抑制CSC球形成之活性。在包括BT-474、JIMT-1及T47D之其他癌細胞株中觀測到類似結果(資料未展示)。
經Bs2-4T處理之異種移植腫瘤中癌症幹細胞之評估：將來自評估Bs2-4T之活體內活性的MDA-BM-361異種移植研究之腫瘤切除，切成4mm片且使用Cryostor冷凍保存。使冷凍腫瘤片在37℃下解凍，在漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)中洗滌兩次且使用無菌刮刀進一步絞碎。為獲得單細胞懸浮液，隨後將腫瘤片與每毫升DMEM/F12培養基200單元超純膠原蛋白酶III混合。將腫瘤懸浮液在37℃下培育大約1小時，其中機械破壞各30分鐘。在培育結束時，細胞經由70μm耐綸篩過濾且用HBSS洗滌兩次。在持續洗滌後，使細胞穿過40μm細胞過濾器且使用Vi-Cell XR細胞活力分析器計數。使用Stemcell Technologies Aldefluor套組且根據製造商說明書，分析細胞之醛脫氫酶活性，作為CSC之量度。細胞在LSRII流式細胞儀上操作且用FlowJo分析。圖29(右圖)展示在MDA-MB-361乳癌異種移植模型中用Bs2-4T處理使得CSC減少54%。
實例4
4.1 去海藻糖基化雙特異性抗體之產生及表徵
使用POTELLEGENTTM技術(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)表現雙特異性抗體以產生具有增強ADCC活性之去海藻糖基化抗體。表8展示如藉由BIAcore所量測之具有海藻糖基化(_Fuc)及不具有海藻糖基化(_aFuc)之Bs2Ab-39SH及Bs4Ab-39SH雙特異性抗體及曲妥珠單抗與Fcγ受體(FcγR)及C1q結合的K D (nM)，證實去海藻糖基化抗體具有增強的與FcγRI及FcγRIIIa之兩種對偶基因之結合。
平衡結合常數之量測：人類Fcγ受體：在ProteOn XPR36儀器上量測抗-HER2雙特異性抗體與人類FcγR之結合的結合常數(K D )。簡言之，使用如儀器製造商所概述之標準胺基偶合化學將雙特異性抗體以高密度固定在GLC感測器晶片上。測得IgG之最終表面密度大約3000RU。亦在此感測器晶片上使用減去蛋白質之一致固定方案製備參考流動池。於儀器緩衝液(含有50mM磷酸鹽(pH 7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA及0.005% Tween-20之磷酸鹽緩衝鹽水[PBS]/Tween/乙二胺四乙酸[EDTA]緩衝液)中製備4000nM、16,000nM或32,000nM之各FcγR之儲備溶液，且接著在相同緩衝液中連續稀釋(1：3)，從而獲得各受體之所需濃度系列：1.82nM-4,000nM(FcγRI)、197.5nM-16,000nM(FcγRIIA)、395.1nM-16,000nM(FcγRIIb)、21.9nM-16,000nM(hFcγRIIIA-158V)及395-32,000mM(FcγRIIIA-158F)。將各濃度之FcγR以25μL/min之流速注射在雙特異性抗體及參考單元表面上，歷 時8分鐘，在此期間收集結合資料。在注射之間，用60秒脈衝之5mM HCl使表面再生(亦即移除結合之FcγR)。在整個一系列注射中亦穿插若干次緩衝液注射。接著，將此等緩衝液注射之一連同參考單元資料用於經由通常稱為「雙重參考」之技術(Myszka,1999)校正任何注射假像(例如非特異性結合)之結合資料。在收集所有結合資料之後，將各濃度(C)下結合之個別資料集求平均值(平衡下反應[Req])，且接著擬合成1：1結合等溫線(Req相對於C)曲線。自此，使用銷售商之評估軟體3.1.0.6版推導平衡結合常數K D 。
平衡結合常數之量測：人類FcRn蛋白質：在ProteOn XPR36儀器上量測雙特異性抗體與人類FcRn蛋白質(huFcRn)之結合的親和力(K D )。簡言之，如上所述，使用標準胺基偶合化學將雙特異性抗體以高密度固定在GLC感測器晶片上。於儀器緩衝液(含有150mM NaCl及0.05% Tween-20之50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6))中製備3000nM之huFcRn蛋白質之儲備溶液，且接著在相同緩衝液中連續稀釋(3：1)至1.37nM。將各濃度之huFcRn以25μL/min之流速依序注射在串聯連接之雙特異性抗體及參考單元表面上，歷時16分鐘。收集結合資料，隨後在各受體或緩衝液空白注射之間注射含有150mM NaCl及0.05% Tween 20之50mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.4)60秒，使IgG表面再生(亦即移除結合之huFcRn蛋白質)。在整個一系列注射中亦穿插若干次緩衝液注射。接著，此等緩衝液注射之一與參考單元資料一起用以經由「雙重參考」(Myszka,1999)校正注射假像(例如非特異性結合)之原始資料集。在收集所有結合資料之後，將各濃度(C)下結合之個別資料集求平均值(Req)，且接著擬合成1：1結合等溫線(Req相對於C)曲線。自此，使用銷售商之BIAevaluation軟體4.1版推導平衡結合常數K D 。結果展示雙特異性抗體具有與習知IgG1相當之類似K D 值。
4.2. 去海藻糖基化雙特異性抗體之活體外活性
使用實例1中所描述之方法確定去海藻糖基化雙特異性抗體抑制配位體驅動之細胞增殖之活性。結果展示在MDA-MB-361細胞(圖30A)及MCF-7細胞(圖30B)中去海藻糖基化Bs2Ab-39SH、去海藻糖基化Bs3Ab-39SH及去海藻糖基化Bs4Ab-39SH具有類似抗增殖效能，其亦與親本抗體組合(39S加曲妥珠單抗)之活性相當。在包括NCI-N87及RT-112之其他細胞株中觀測到類似結果(資料未展示)。
4.3. 去海藻糖基化雙特異性抗體之增強ADCC活性
KC1333為表現FcγRIIIa之一種人類自然殺傷(NK)細胞株，在ADCC分析中其用作效應細胞且MDA-MB-361細胞株用作標靶細胞以評估抗-HER2抗體之ADCC活性。收穫兩種細胞株，洗滌且再懸浮於分析培養基中。將KC1333以1×106個細胞/毫升之密度再懸浮且MDA-MB-361以4×105個細胞/毫升之密度再懸浮。將五十微升各細胞株添加至96孔U形底盤中之孔中以實現1：2.5之標靶：效應比率。3X濃度之各劑量抗體藉由在分析培養基中稀釋測試物品來製備。五十微升各測試物品一式三份地添加至細胞，使得以一系列逐步1：4連續稀釋，最終劑量曲線在10μg/mL至0.15ng/mL範圍內。將培養盤離心以使各孔中之細胞粒化且接著在37℃/5% CO2下培育隔夜。次日，使用Promega之CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析，根據製造商說明書，定量各孔上清液中之LDH。使用GraphPad Prism軟體分析資料且呈相對於未經處理之對照的細胞毒性%呈現。
圖31A至31C展示MDA-MB-361細胞中去海藻糖基化雙特異性抗體相對於曲妥珠單抗及去海藻糖基化曲妥珠單抗之ADCC活性。資料表明去海藻糖基化抗體之ADCC活性高於其海藻糖基化型式且在去海藻糖基化雙特異性抗體中ADCC效能排序為Bs2Ab-39SH_aFuc>Bs4Ab-39SH_aFuc>Bs3Ab-39SH_aFuc。在包括BT-474、NCI-N87、MDA-MB-453、T47D及JIMT-1之其他細胞株中觀測到類似結果(資料 未展示)。
實例5
5.1. 妥布賴森1508有效負載之合成
如圖32中所示之用於結合的妥布賴森1508細胞毒素有效負載之合成在下文例示性實例中詳述，其中除非另外說明，否則：(i)除非另外說明，否則當在室溫或環境溫度下進行操作時，溫度以攝氏度(℃)給出，亦即在18-25℃之範圍內；(ii)溶液經無水硫酸鈉或硫酸鎂乾燥；在高達30℃之浴溫下在減壓(4.5-30mmHg)下使用旋轉式蒸發器蒸發有機溶劑；(iii)層析意謂矽膠急驟層析法；薄層層析法(TLC)在矽膠板上進行；(iv)一般而言，繼該等反應過程之後為TLC或液相層析/質譜分析(LC/MS)且反應時間僅出於說明之目的給出；(v)最終產物具有令人滿意之質子核磁共振(NMR)譜及/或質譜資料；(vi)產量僅出於說明而給出且不一定為可藉由努力製程開發所獲得之彼等產量；若需要更多物質則重複製備；(vii)當給出時，除非另外說明，否則主要診斷質子之核磁共振(NMR)資料呈δ值形式，以相對於作為內標之四甲基矽烷(TMS)之百萬分率(ppm)給出，在300或400MHz下於d6-DMSO中測定；(viii)化學符號具有其常見含義；(ix)溶劑比率以體積：體積(v/v)術語給出；以及(x)化合物之純化使用以下方法中之一或多者進行：a)常規矽膠急驟層析法；b)使用Isco Combiflash®分離系統之矽膠急驟層析法：RediSep正相急驟管柱，流速30-40ml/min(ISCO MPLC)；請添加 ISCO反相管柱；c)Gilson semiprep HPLC分離系統：YMC pack ODS-AQ管柱，100×20mm，S 5μm 12nm，水(0.1%三氟乙酸)及乙腈(0.1%三氟乙酸)作為溶劑，操作20分鐘。
向(2R,4R)-4-甲基哌啶-2-甲酸(2g，13.97mmol)於MeOH(40mL)及水(40.0mL)中之溶液中添加三聚甲醛(2.52g，27.94mmol)及Pd/C(10%)(0.8g，7.52mmol)。將反應混合物在氫氣氛圍下在室溫下攪拌隔夜。自TLC，反應未完成。添加另一當量三聚甲醛(2.52g，27.94mmol)且將反應混合物再攪拌24小時。TLC指示反應完成且過濾反應混合物，用MeOH(2×30mL)洗滌催化劑。將濾液真空濃縮，得到呈白色固體狀之粗產物，將其用***(3×30mL)洗滌，在高真空中乾燥隔夜，得到呈白色固體狀之(2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酸(T1)(1.870g，85%)。LC-MS：158(M+1)；1H NMR(400MHz，氧化氘)δ ppm 0.97(d,J=5.52Hz,3 H),1.54(br.s,1 H),1.71-1.87(m,3 H),1.91-2.07(m,1 H),2.84(s,3 H),3.13(td,J=8.41,3.76Hz,1 H),3.35(m,1 H),3.65(m,1 H)。
在攪拌下在室溫下將二碳酸二第三丁酯(243.0g，1.1mol)逐滴添加至(R)-3-胺基-4-甲基戊酸(可購得)(133.0g，1.0mol)及Na2CO3(212g，2.0mol)於丙酮(1L)及水(1L)中之懸浮液中。將反應混合物攪拌隔夜且在減壓下移除有機溶劑。將殘餘物用水(1L)稀釋且用EtOAc (500mL×3)洗滌。水相用2N HCl溶液酸化至pH=3且所得混合物用EtOAc(800mL×3)萃取。將合併之萃取物用鹽水(800mL×1)洗滌，乾燥(無水Na2SO4)且濃縮，得到呈油狀之化合物(T2)(224.0g，97%產率)，其未經進一步純化即用於下一步中。
在攪拌下在0℃下將三乙胺(67g，0.61mol)添加至化合物(T2)(140.0g，0.61mol)及N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(74.1g，0.76mol)於CH2Cl2(1.4L)中之懸浮液中。在0℃下將懸浮液攪拌0.5小時且分部分添加EDCI(74g，0.61mol)。在0℃下將反應混合物攪拌2小時且添加水(800mL)。分離有機相，用5% KHSO4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO3溶液(800mL×3)及鹽水(800mL×1)洗滌，乾燥(無水Na2SO4)且濃縮至乾。殘餘物藉由矽膠急驟管柱層析法(EtOAc/己烷=1：5)來純化，得到呈油狀之化合物(T3)(141.0g，84%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 5.26(m,1H),3.75(m,1H),3.70(s,3H),3.15(s,3H),2.60~2.80(m,2H),1.85(m,1H),1.41(s,9H),0.90(d,J=6.6Hz,3H),0.88(d,J=6.6Hz,3H)。
在攪拌下在0℃下將碘乙烷(250.0g，1.6mol)添加至化合物(T3)(55.0g，0.2mol)於DMF(1.1L)中之溶液中。接著在0℃下分部分添加NaH(60%懸浮液，24.0g，0.60mol)且使反應混合物升溫至室溫且攪拌12小時。將反應用水(2L)小心淬滅且添加EtOAc(2L)。分離有機相，用5% KHSO4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO3溶液(800mL×3)及鹽 水(800mL×1)洗滌，乾燥(無水Na2SO4)且濃縮至乾。殘餘物藉由矽膠急驟管柱層析法(EtOAc/己烷=1：10)來純化，得到呈油狀之化合物(T4)(35.1g，58%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 3.70(s,3H),3.65(m,1H),3.10-3.30(m,5H),2.50-2.95(m,2H),1.90-2.20(m,1H),1.40~-.55(m,9H),1.10(t,J=7.2Hz,3H),0.90(d,J=6.6Hz,3H),0.88(d,J=6.6Hz,3H)。
在-78℃下在N2下在攪拌下將n-BuLi溶液(106ml，2.5N於己烷中，0.17mol)逐滴添加至2-溴-4-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)噻唑(74g，0.24mol)(如Wipf,P等人Org.Lett.2007,9(8)，第1605頁中所述製備)於無水THF(500mL)中之溶液中，歷經1小時。將懸浮液再攪拌30分鐘且接著經30分鐘，在-78℃下逐滴添加化合物(T4)(51.0g，0.17mol)於無水THF(300mL)中之溶液。將反應混合物在-78℃下攪拌1小時且接著使其升溫至室溫且攪拌12小時。將反應用20%氯化銨水溶液(1L)淬滅且在減壓下移除有機溶劑。所得混合物用EtOAc(800mL×3)萃取。將合併之有機相用5% KHSO4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO3溶液(800mL×3)及鹽水(800mL×1)洗滌，乾燥(Na2SO4)且濃縮至乾。粗物質藉由矽膠急驟管柱層析法(EtOAc/己烷=1：10)來純化，得到呈油狀之化合物(T5)(58.1g，73%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 7.53(m,1H),4.90(s,2H),4.04(m,1H),3.35(m,2H),3.15(m,2H),2.00(m,1H),1.40(s,9H),0.80-1.20(m,18H),0.14(s,6H)。
在室溫下在攪拌下經0.5小時之時間將LiBH4(4.8g，0.22mol)分部分添加至化合物(T5)(47.1g，0.1mol)於甲醇(500mL)中之溶液中。將懸浮液攪拌2小時且在減壓下移除溶劑。殘餘物溶解於EtOAc(800mL)中且將所得溶液用飽和NaHCO3溶液(500mL×3)及鹽水(500mL×1)洗滌，乾燥(Na2SO4)且濃縮至乾。粗物質藉由急驟管柱層析法(EtOAc/己烷=1：6)來純化，得到化合物(T6)(13.5g，28%產率)及其異構體(T6')(21.0g，45%產率)。1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ ppm-0.06-0.05(m,6 H)0.76-0.89(m,15 H)1.12(t,J=6.97Hz,3 H)1.39(s,9 H)1.55-2.05(m,3 H)2.86-3.21(m,2 H)3.76-3.96(m,1 H)4.73(d,J=1.13Hz,4 H)7.01(s,1 H)。
經10分鐘，在0℃下在攪拌下將乙醯氯(45.2g，0.58mol)逐滴添加至化合物(T6)(34.0g，72mmol)於吡啶(500mL)中之溶液中。使反應混合物升溫至室溫且攪拌12小時。將反應用水(200mL)淬滅且在減壓下移除溶劑。將殘餘物用CH2Cl2(800mL)處理且所得混合物用5% KHSO4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO3溶液(800mL×3)及鹽水(800mL×1)洗滌，乾燥(Na2SO4)且濃縮至乾。粗物質藉由矽膠急驟管柱層析法(EtOAc/己烷=1：10)來純化，得到呈油狀之化合物(T7)(25.7g，69%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 7.15(m,1H),5.95(m,1H),4.84(s,2H),4.04(m,1H),3.10(m,2H),2.35(m,1H),2.15(s,3H),2.00(m,1H),1.70(m,1H),1.45(s,9H),1.25(t,J=7.2Hz,3H),0.80~1.10(m,15H),0.08(s,6H)。
化合物 T8
在0℃下在攪拌下將氟化四丁基銨(65.3g，0.25mol)於THF(200mL)中之溶液逐滴添加至化合物(7)(25.7g，50mmol)於THF(300mL)中之溶液中。使反應混合物升溫至室溫且攪拌4小時。添加水(800mL)且在減壓下移除有機溶劑。將殘餘物用CH2Cl2(800mL)處理且所得混合物用5% KHSO4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO3溶液(800mL×3)及鹽水(800mL×1)洗滌，乾燥(Na2SO4)且濃縮至乾。粗物質藉由矽膠急驟管柱層析法(EtOAc/己烷=1：4)來純化，得到呈油狀之化合物(T8)(19.5g，98%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 8.26(m,1H),5.95(m,1H),4.83(m,2H),4.10(m,1H),3.17(m,2H),2.40(m,1H),2.20(s,3H),2.18(m,1H),1.75(m,1H),1.56(s,9H),1.10-1.30(m,3H),0.80-1.05(m,6H)。
將戴斯-馬丁試劑(Dess-Martin reagent)(32.7g，75mmol)添加至化合物(T8)(20.0g，50mmol)於二氯甲烷(300mL)中之溶液中且將反應混合物在室溫下攪拌12小時。將混合物分別用氫氧化鈉溶液(1N，300mL×3)、硫代硫酸鈉溶液(1N，300mL×3)、飽和NaHCO3(300mL×3)溶液及鹽水(300mL×1)洗滌。有機層乾燥(Na2SO4)且濃縮至乾，得到對應醛。
在室溫下，此粗醛溶解於第三丁醇(500mL)中且經1小時逐滴添加亞氯酸鈉(80%，36.4g，320mmol)及磷酸二氫鈉單水合物(105g，0.77mol)於水(300mL)中之溶液。將反應混合物攪拌3小時且用鹽酸溶液(0.1N，500mL)稀釋。所得混合物用EtOAc(500mL×1)萃取且 將合併之有機層用5% KHSO4溶液(500mL×3)及鹽水(500mL×1)洗滌，經Na2SO4乾燥且濃縮至乾。殘餘物藉由矽膠急驟管柱層析法(CH2Cl2/MeOH=100：5)來純化，得到化合物(T9)(15.4g，58%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 9.90(br s,1H),8.27(s,1H),5.96(m,1H),4.07(m,1H),3.15(m,1H),2.35(m,1H),2.20(s,3H),2.18(m,1H),1.75(m,1H),1.45(s,9H),1.20(t,J=7.2Hz,3H),0.98(d,J=6.6Hz,3H),0.88(d,J=6.6Hz,3H)。
在0℃下向2-((1R,3R)-1-乙醯氧基-3-((第三丁氧羰基)(乙基)胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(T9)(6.5g,15.68mmol)於DCM(60mL)中之溶液中逐滴添加TFA(30mL)。將混合物在0℃下攪拌1小時。溶劑真空蒸發，得到粗產物(T10)。粗產物未經進一步純化即用於下一步反應中(7.2公克)。LC-MS：315(M+1)。
向2-((1R,3R)-1-乙醯氧基-3-(乙基胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸三氟乙酸鹽(T10)(5g，11.67mmol)及碳酸氫鈉(9.80g，116.71mmol)於丙酮(300mL)與水(150mL)之混合物中之溶液中添加碳酸(9H-茀-9-基)甲酯(2,5-二側氧基吡咯啶基-1-基)酯(3.94g，11.67mmol)。將混合物在室溫下攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。混合物用鹽酸酸化至(pH 2)且丙酮真空蒸發。將產物用DCM(3×300mL)萃取。合併之有 機萃取物用0.1% HCl溶液(200mL)、鹽水(200mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，且真空蒸發。殘餘物藉由急驟層析法(矽膠，MeOH/DCM，0%至5% MeOH)來純化，得到呈白色固體狀之2-((1R,3R)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(乙基)胺基)-1-乙醯氧基-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(T11)(3.53g，54.6%)。LC-MS：537.2(M+1)；1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 0.84(d,J=6.78Hz,3 H),0.92-1.05(m,5 H),1.14(d,J=3.01Hz,1 H),1.73(dt,J=10.23,6.43Hz,1 H),1.92-2.05(m,1 H),2.12-2.27(m,4 H),2.28-2.44(m,1 H),2.90-3.33(m,2 H),3.98(t,J=9.29Hz,1 H),4.12-4.32(m,1 H),4.47-4.82(m,2 H),5.95(dd,J=10.92,2.89Hz,1 H),7.29-7.45(m,4 H),7.55-7.69(m,2 H),7.72-7.81(m,2 H),8.22-8.29(m,1 H)。
將DMAP(106g，0.86mol)添加至Boc-L-4-硝基-***酸(1800g，0.58mol)及米氏酸(Meldrum's acid)(92g，0.64mol)於二氯甲烷(1.5L)中之溶液中。所得溶液在N2氛圍下冷卻在-5℃下，接著經1小時添加含DCC(240g，1.16mol)之二氯甲烷(1L)。將混合物在0-5℃下攪拌隔夜。接著藉由過濾移除沈澱之N,N'-二環己基脲且濾液用5% HCl水溶液(1L×3)及鹽水(1L×1)洗滌，且經MgSO4乾燥。在藉由過濾移除MgSO4後，有機相濃縮至乾。殘餘物用EtOAc/己烷(1：1,500mL)濕磨，且乾燥，得到呈黃色固體狀之化合物(T12)(130.0g，51%產率)。
化合物 T13
在-5℃下在N2下將AcOH(400mL)添加至化合物(T12)(130.0g，0.298mol)於二氯甲烷(1.5L)中之溶液中。經2小時分少部分添加固體NaBH4(22.7g，0.597mol)(氣體放出及放熱)。在-5℃下再攪拌3小時，TLC指示反應完成。將混合物用鹽水(1L)淬滅。分離有機層，且先後用水(1L×2)、飽和NaHCO3水溶液(1L×3)及鹽水(1L×3)洗滌，且經MgSO4乾燥。濾液濃縮至乾且得到呈黃色固體狀之化合物(T13)(70.3g，55%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 8.18(d,J=8.7Hz,2H),7.41(d,J=8.7Hz,2H),4.58(m,1H),4.29(m,1H),3.85(m,1H),2.97(d,J=6.6Hz,2H),2.27(m,2H),1.80(s,3H),1.76(s,3H),1.35(s,9H)。
將K2CO3(35g，0.25mol)及MeI(36g，0.25mol)添加至化合物(T13)(70.3g，0.167mol)於丙酮(400mL)及DMF(400mL)中之溶液中。將混合物在室溫下攪拌隔夜。TLC顯示起始物質耗盡。添加水(2L)且將混合物再攪拌一小時。沈澱固體藉由過濾來收集，用水洗滌，乾燥，得到呈淺黃色固體狀之化合物(T14)(34.5g，47%產率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 8.17(d,J=8.7Hz,2H),7.34(d,J=8.7Hz,2H),4.22(m,1H),3.85(m,1H),2.85(m,2H),2.22(m,2H),1.73(s,3H),1.73(s,3H),1.52(s,3H),1.31(s,9H)。
化合物 T15
使化合物(T14)(34.5g，79.1mmol)溶解於甲苯(500mL)中。溶液在回流下加熱40小時。TLC指示反應完成。移除溶劑，得到化合物(T15)(30g)，其未經進一步純化即用於下一步。
將K2CO3(22g，0.16mol)添加至化合物(T15)(30g，79mmol)於MeOH(300mL)中之溶液中。將混合物在室溫下攪拌3小時。TLC顯示完全轉化。移除溶劑，使殘餘物溶解於二氯甲烷(500mL)中，用鹽水(500mL×3)洗滌，經MgSO4乾燥。在藉由過濾移除MgSO4後，有機相濃縮至乾。殘餘物藉由矽膠層析法(EtOAc/己烷=1：10)來進一步純化且得到呈1：1非對映異構體混合物之化合物(T16)(23.5g，兩步產率81%)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 8.13(d,J=8.7Hz,2H),7.34(d,J=8.7Hz,2H),4.43(m,1H),3.85(m,1H),3.65(s,3H),2.85(m,2H),2.65(m,1H),1.85(m,1H),1.50(m,1H),1.30(s,9H),1.15(t,J=6.6Hz,3H)。
使50g化合物(T16)經受使用SFC(超臨界流體層析)，在Chiralpak ID 21×250mm，5μ管柱上，使用移動相A 90%二氧化碳及相B異丙醇10%，在60ml/min流速下的對掌性層析。在40℃下進行分離且在270nM下偵測。實現基線分離且分離兩個溶離份。峰B為所需化合物(T17)且呈固體狀獲得，27.4g(55%)。
在Chiralpak IA 4.6×250mm，5μ管柱上，10% 1：1甲醇：異丙醇/含0.1%二乙胺改質劑之己烷，>99：1非對映異構體過量。
LC/MS(2分鐘，Acid_CV10.olp方法367(M+1),1.16分鐘。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ ppm 8.16(d,J=8.53Hz,2 H)7.46(d,J=8.53Hz,2 H)3.79-3.93(m,1 H)3.68(s,3 H)2.90-2.99(m,1H)2.71-2.81(m,1 H)2.47-2.59(m,1 H)1.81-1.95(m,1 H)1.55-1.66(m,1 H)1.32(s,9 H)1.21-1.25(m,2 H)1.16(d,J=7.03Hz,3 H)。
將(2S,4R)-4-((第三丁氧羰基)胺基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸甲酯(T17)(3.5g，9.55mmol)於6N HCl水溶液(8.0mL，263.30mmol)中之溶液在微波中在130℃下加熱30分鐘。將反應混合物凍乾，得到呈固體狀之(2S,4R)-4-胺基-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸(T18)。產物未經進一步純化即用於下一反應(3.2g)。LC-MS：253(M+1)；1H NMR(400MHz，氧化氘)δ ppm 1.12(d,J=7.28Hz,3 H),1.62-1.76(m,1 H),1.90-2.02(m,1 H),2.56-2.68(m,1 H),3.02-3.11(m,2 H),3.58-3.69(m,1 H),7.47(d,J=8.53Hz,2 H),8.18(d,J=8.78Hz,2 H)。
向化合物(T18)(0.43g，1.49mmol)及碳酸氫鈉(1.251g，14.89mmol)於丙酮(30mL)與水(15mL)之混合物中之溶液中添加碳酸(9H- 茀-9-基)甲酯2,5-二側氧基吡咯啶基-1-基酯(0.502g，1.49mmol)。將混合物在室溫下攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。混合物用鹽酸酸化至pH 2且丙酮真空蒸發。產物用DCM(3×60mL)萃取。將合併之有機萃取物用1N HCl溶液(40mL)、鹽水(40mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，且真空蒸發。殘餘物藉由矽膠急驟層析法，0%至100% EtOAc/DCM來純化，得到呈白色固體狀之(2S,4R)-4-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基胺基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸(0.630g，89%)(T19)。LC-MS：475.5(M+H)；1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 0.81-1.06(m,1 H),1.08-1.28(m,2 H),1.33-1.75(m,1 H),1.77-2.11(m,1 H),2.36-2.69(m,2 H),2.76-3.18(m,1 H),3.43-4.08(m,1 H),4.09-4.19(m,1 H),4.21-4.53(m,2 H),4.54-4.80(m,1 H),7.18-7.58(m,8 H),7.66-7.82(m,2 H),7.95-8.17(m,2 H),8.67(br.s.,1 H)。
將DIEA(0.419mL，2.40mmol)添加至(2S,4R)-4-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基胺基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸(0.380g，0.80mmol)(T19)於DCM(4.5mL)中之溶液中，且將混合物在室溫下攪拌5分鐘，接著將2-氯三苯甲基氯樹脂(0.5g，0.80mmol)添加至混合物。將混合物在室溫下震盪隔夜，所得樹脂用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)及DCM(3×6mL)洗滌，接著在室溫下用DIEA(0.419mL，2.40mmol)及MeOH/DCM(1：1，5mL)處理30分鐘。過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)及DCM(3×6mL)洗滌，在高真空中乾燥隔夜。少量化合物自樹脂裂解，且藉由LCMS分析。所得樹脂(T20)用於下一步反應。LC-MS：475(M+1)
向樹脂中(T20)(0.5g，0.80mmol)添加含20%哌啶之DMF(5mL)。將混合物在室溫下震盪6分鐘，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)洗滌，真空乾燥。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T21)用於下一步反應。LC-MS：253(M+H)。
在室溫下向樹脂(T21)(0.5g，1.88mmol)中添加2-((1R,3R)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(乙基)胺基)-1-乙醯氧基-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(3)(1.108g，2.07mmol)、HATU(1.428g，3.76mmol)、2,4,6-三甲基吡啶(0.500mL，3.76mmol)及DIEA(0.656mL，3.76mmol)於DMF(5mL)中之溶液。將混合物在室溫下震盪2小時，且過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)及DCM(3×6mL)洗滌，真空乾燥。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T22)用於下一步。LC-MS：771(M+H)。
向樹脂(T22)(0.5g，0.80mmol)中添加含20%哌啶之DMF(5 mL)。將混合物在室溫下震盪6分鐘，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)洗滌，真空乾燥。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T23)用於下一反應步驟。LC-MS：549(M+1)。
經由套管經10分鐘向(2S,3S)-2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基胺基)-3-甲基戊酸(Fmoc-異白胺酸)(7g，19.81mmol)及吡啶(1.602mL，19.81mmol)於DCM(120mL)中之溶液中添加DAST(3.11mL，23.77mmol)於DCM(20mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，用DCM(80mL)稀釋，用冰冷水(2×200mL)洗滌，有機層經MgSO4乾燥，過濾且真空蒸發，得到呈白色固體狀之(2S,3S)-1-氟-3-甲基-1-側氧基戊-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(6.65g，94%)。藉由使Fmoc-Ile-F(5mg)溶解於無水MeOH(0.3mL)及DIEA(0.030mL)中且使其在室溫下反應15分鐘，進行酯化測試以確保定量酸氟化物形成。接著混合物真空蒸發且藉由LCMS蒸發，展示存在少於1%之Fmoc-Ile-OH。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 0.83-1.12(m,6 H)1.18-1.37(m,1 H)1.42-1.59(m,1 H)2.01(br.s.,1 H)4.26(t,J=6.78Hz,1 H)4.44-4.63(m,3 H)5.20(d,J=8.53Hz,1 H)7.31-7.39(m,2 H)7.40-7.47(m,2 H)7.61(d,J=7.28Hz,2 H)7.80(d,J=7.53Hz,2 H)。
化合物 T25
在室溫下向樹脂(T23)(0.5g，0.80mmol)中添加(2S,3S)-1-氟-3-甲基-1-側氧基戊-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(T24)(0.569g，1.60mmol)、DMAP(4.89mg,0.04mmol)及DIEA(0.419mL，2.40mmol)於DCM(5mL)中之溶液。將混合物在室溫下震盪隔夜，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)洗滌，在高真空中乾燥。少量化合物自樹脂裂解，且藉由LC/MS分析。LCMS指示反應完成。所得樹脂(T25)用於下一反應步驟。LC-MS：884(M+H)。
向樹脂(T25)(0.5g，0.80mmol)中添加含20%哌啶之DMF(5mL)。將混合物在室溫下震盪6分鐘，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)洗滌，真空乾燥。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T26)用於下一反應步驟。LC-MS：662(M+1)。
向樹脂(T26)(0.5g，0.80mmol)中添加(2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酸(1)(0.252g，1.60mmol)、HATU(0.608g，1.60mmol)、2,4,6-三甲基吡啶(0.320mL，2.40mmol)及DIEA(0.419mL，2.40mmol)於DMF(5mL)中之溶液。將混合物在室溫下震盪2小時，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)及DCM(3×6mL)洗滌，真空乾燥。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T27)用於下一反應步驟。LC-MS：801(M+1)。
向樹脂(T27)中添加氯化錫(II)脫水物(1.805g，8.00mmol)及乙酸鈉(0.197g，2.40mmol)於DMF(5mL)中之溶液。將混合物在室溫下震盪4小時，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)及DCM(3×6mL)洗滌，且真空洗滌。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T28)用於下一步。LC-MS：771(M+H)。
向樹脂(T28)(0.2g，0.32mmol)中添加(S)-2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基胺基)-6-(第三丁氧羰基胺基)己酸(可購得)(0.300g，0.64 mmol)、HATU(0.243g，0.64mmol)、2,4,6-三甲基吡啶(0.128mL，0.96mmol)及DIEA(0.168mL，0.96mmol)於DMF(4mL)中之溶液。將混合物在室溫下震盪2小時，過濾所得樹脂，用DMF(3×2mL)、MeOH(3×2mL)及DCM(3×2mL)洗滌，且真空乾燥。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T29)用於下一步反應。LC-MS：1221(M+1)。
向樹脂(T29)(0.2g，0.32mmol)中添加含20%哌啶之DMF(2mL)。將混合物在室溫下震盪6分鐘，過濾所得樹脂，用DMF(3×3mL)、MeOH(3×3mL)、DCM(3×3mL)洗滌，真空乾燥。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T30)用於下一步反應。LC/MS：999(M+H)。
在室溫下向樹脂(T30)(0.2g，0.32mmol)中添加6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶基-1-基酯(0.148g， 0.48mmol)於DMF(2mL)中之溶液，接著添加N-甲基嗎啉(0.106mL，0.96mmol)。將混合物在室溫下震盪2小時，過濾所得樹脂，用DMF(3×3mL)、DCM(3×3mL)洗滌，真空乾燥。少量化合物自樹脂裂解，藉由LCMS分析，其指示反應完成。所得樹脂(T31)用於下一步。LC-MS：1192(M+1)。
在室溫下向樹脂(T31)(0.2g，0.32mmol)中添加DCM(1mL)及TFA(1mL)。將混合物在室溫下震盪20分鐘，接著過濾。樹脂用DCM/TFA(1：1，3×2mL)洗滌，濾液真空蒸發。殘餘物藉由逆相HPLC(ACN/H2O(含有0.1% TFA)、5%至75% ACN，14分鐘內)來純化。使純溶離份凍乾，得到呈白色固體狀之(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙醯氧基-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲醯胺基)-N-乙基-3-甲基戊醯胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲醯胺基)-5-(4-((S)-6-胺基-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)己醯胺基)苯基)-2-甲基戊酸(T32)(0.095g，22.48%)。LC-MS：1092[M+1]；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ ppm 7.99(s,1 H),7.34(d,J=8.53Hz,2 H),7.10(d,J=8.53Hz,2 H),6.66(s,2 H),5.64(d,J=10.79Hz,1 H),4.50-4.61(m,1 H),4.21-4.35(m,2 H),3.92(d,J=9.29Hz,1 H),3.69(br.s.,1 H),3.37(t,J=7.15Hz,2 H),3.15-3.35(m,4H),3.04(dt,J=3.58,1.85Hz,1 H),2.84(t,J=7.65Hz,2 H),2.76(d,J=7.03Hz,2 H),2.62(br.s., 2 H),2.38-2.52(m,2 H),2.25(t,J=11.54Hz,1 H),2.16(t,J=7.40Hz,2 H),2.04-2.11(m,4 H),1.70-2.00(m,7 H)1.42-1.69(m,11 H),1.34-1.40(m,1 H),1.27(t,J=6.78Hz,3 H),1.16-1.24(m,2 H),1.01-1.14(m,7 H),0.90(d,J=6.78Hz,3 H),0.94(d,J=6.53Hz,3 H),0.84(t,J=7.40Hz,3 H),0.79(d,J=6.53Hz,3 H)。
5.2. 妥布賴森1508之結合
化合物T32(妥布賴森1508)包含容易結合於抗體之硫醇殘基，形成硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵之連接子及順丁烯二醯亞胺基團。包含順丁烯二醯亞胺基團之細胞毒素(例如妥布賴森1508)可結合於工程改造至本文所提供之本發明抗-HER2抗體(例如Bs2Ab-39SH、Bs3Ab-39SH或Bs4Ab-39SH)中之特定半胱胺酸殘基。或者或視情況，可使用經典結合方法將細胞毒性劑附接於所述抗體。用於結合於天然離胺酸及半胱胺酸殘基之方法為此項技術中熟知。以下提供位點特異性(在工程改造之半胱胺酸殘基)及經典結合(在天然半胱胺酸殘基)之代表性方法。
代表性位點特異性抗體藥物結合方法概述於圖33中且包括以下步驟：(a)將可衍生胺基酸(例如半胱胺酸)之尺寸鏈打開；(b)氧化；(c)結合有效負載(例如細胞毒性劑，諸如妥布賴森1508)；及(d)藉由移除結合試劑及未反應之有效負載進行純化。舉例而言，可藉由在具有1mM乙二胺四乙酸之1X PBS中調配抗體來結合於經工程改造之半胱胺酸。使用輕度還原，藉由每一抗體添加四十當量三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽產生游離硫醇，在37℃下培育三小時。在具有1mM乙二胺四乙酸之1X PBS中連續透析三次，以移除三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(或者可使用脫鹽管柱)。藉由添加約20當量脫氫松香酸(dhAA)且在室溫下培育約4小時，使抗體鏈間二硫化物鍵再形成。在準備結合時，將二甲亞碸添加至抗體，達10% v/v，且分別對於2T及4T藥物負載，添 加二甲亞碸中8或12當量妥布賴森1508有效負載且在室溫下培育約1小時(或者在4℃下培育約16小時)。藉由添加每一有效負載約4莫耳當量之N-乙醯基半胱胺酸(NAC)將反應猝滅。根據製造商建議，藉由陶瓷用羥基磷灰石自結合抗體移除游離有效負載。必要時，最終產物可經受緩衝液交換。結合抗體可藉由非還原及還原SDS-PAGE分析以證實純度及與重鏈之結合。
藥物隨機結合於天然半胱胺酸殘基之抗體-藥物結合物藉由部分還原抗體，隨後與所需連接子-藥物反應來製備。5mg/mL濃度之抗體藉由在pH 8.0下添加約3莫耳當量DTT，接著在約37℃下培育約2小時而部分還原。隨後還原反應物在冰水冷卻中且例如經由透濾來移除過量DTT。隨後將連接子-藥物添加至約1：10之連接子-藥物/硫醇莫耳比。結合反應在約10%v/v DMSO存在下進行。在結合之後，添加過量游離半胱胺酸(與連接子-藥物約2倍莫耳比率)以淬滅未反應之連接子-藥物，產生半胱胺酸-連接子-藥物加合物。將反應混合物純化(例如藉由疏水相互作用層析法)且可經緩衝液交換成PBS。使用諸如疏水相互作用層析法及經還原之逆相層析法之標準方法確定藥物負載分佈。
5.3. 化學縮寫
以引用的方式併入
本文中所引用之全部參考文獻(包括專利、專利申請案、論文、課本及類似者)及其中引用之參考文獻在其尚未引用之程度上，在此 以全文引用之方式併入本文中，達成所有目的。
相等物
認為前述書面說明書足以使熟習此項技術者實踐實施例。前述描述及實例詳述某些實施例且描述本發明者所涵蓋之最佳方式。然而，應瞭解，無論前文可在本文中如何詳細地呈現，實施例均可以多種方式實踐且申請專利範圍包括其任何相等物。
<110> 美商麥迪紐有限責任公司
<120> 雙特異性HER2抗體
<130> ERB2-105TW1
<140> TW 104111702
<141> 2015-04-10
<150> 62/107,050
<151> 2015-01-23
<150> 61/978,516
<151> 2014-04-11
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 2
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 6
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 7
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 8
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 10
<210> 11
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 11
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 12
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 13
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 14
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 15
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 16
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> Lys或Cys
<400> 17
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (100)..(100)
<223> Gln或Cys
<400> 18
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 19
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 20
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 22
<210> 23
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 23
<210> 24
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 24
<210> 25
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 25
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 26
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 27
<210> 28
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> Lys或Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (240)..(240)
<223> Gln或Cys
<400> 28
<210> 29
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 29
<210> 30
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 30
<210> 31
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 31
<210> 32
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 32
<210> 33
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 33
<210> 34
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 34
<210> 35
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 35
<210> 36
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 36
<210> 37
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 37
<210> 38
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 38
<210> 39
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 39
<210> 40
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 40
<210> 41
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 41
<210> 42
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 42
<210> 43
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 43
<210> 44
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 44
<210> 45
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 45
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 46
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 47
<210> 48
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 48
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 49
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 50
<210> 51
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 51
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 52
<210> 53
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 53
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 54
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 55
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 56
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 57
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 58
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 59
<210> 60
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 可存在或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(13)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(21)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(29)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(37)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(45)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(53)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(61)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(69)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(77)
<223> 此區域可涵蓋1-4個殘基，其中一些位置可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(81)
<223> 此序列可涵蓋1-10個(Gly)y-(Ser)4重複單元，其中y為1-4且一些位置可不存在
<220>
<223> 關於取代及較佳實施例之詳細描述，參見所申請之說明書
<400> 60
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成6xHis標籤
<400> 61
<210> 62
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 62
<210> 63
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 63
<210> 64
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 64
<210> 65
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 65
<210> 66
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 66
<210> 67
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 67
<210> 68
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 68
<210> 69
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 69
<210> 70
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 70
<210> 71
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 71
<210> 72
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 72
<210> 73
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 73
<210> 74
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 74
<210> 75
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 75
<210> 76
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 76
<210> 77
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 77
<210> 78
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 78
<210> 79
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 79
<210> 80
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 80
<210> 81
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 81
<210> 82
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 82
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 83
<210> 84
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (500)..(500)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (505)..(505)
<223> Ser、Asp或Cys
<220>
<221> misc_feature
<222> (506)..(506)
<223> 可存在或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (597)..(597)
<223> Ala或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (599)..(599)
<223> Ile或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (709)..(709)
<223> Ser或Cys
<400> 84
<210> 85
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (238)..(238)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (243)..(243)
<223> Ser、Asp或Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (244)..(244)
<223> 可存在或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (335)..(335)
<223> Ala或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (337)..(337)
<223> Ile或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (447)..(447)
<223> Ser或Cys
<400> 85
<210> 86
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (504)..(504)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (509)..(509)
<223> Ser、Asp或Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (510)..(510)
<223> 可存在或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (601)..(601)
<223> Ala或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (603)..(603)
<223> Ile或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (713)..(713)
<223> Ser或Cys
<400> 86

Claims (25)

  1. 一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中(i)該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗體結合位點，(ii)該第一免疫球蛋白抗原結合結構域結合於包含HER2之結構域II內之抗原決定基的第一HER2抗體結合位點，且(iii)該第一HER2抗體結合位點不同於帕妥珠單抗之抗體結合位點。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含含有以下之重鏈(HC)可變區(VH)及輕鏈(LC)可變區(VL)：(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)；(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)；(iv)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(v)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(vi)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)。
  3. 一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域及第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域包含VH及VL，其中 (a)該VH包含SEQ ID NO：15或43之胺基酸；(b)該VL包含SEQ ID NO：16或44之胺基酸；且其中該第一及第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於不同HER2抗原決定基。
  4. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域及/或該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含以下或由以下組成：(a)進一步包含重鏈恆定區或其片段之VH及包含輕鏈恆定區(LC)或其片段之VL；(b)單鏈Fv(「scFv」)；(c)雙功能抗體；(d)微型抗體；(e)F(ab')2；或(f)F(ab)。
  5. 如請求項4之雙特異性抗-HER2抗體，其中(a)該重鏈恆定區或其片段為IgG恆定區；及/或(b)該LC恆定區為κ恆定區或λ恆定區。
  6. 如請求項1至5中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第一免疫球蛋白抗原結合結構域為單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體或親和力優化抗體。
  7. 如請求項1至6中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中：(a)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域特異性結合於與曲妥珠單抗抗體相同之HER2抗原決定基；(b)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域競爭性地抑制該曲妥珠單抗抗體之HER2結合；或(c)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個包含SEQ ID NO：54至59中任一者之胺基酸的互補決定區(CDR)。
  8. 如請求項7之雙特異性抗-HER2抗體，其中該第二免疫球蛋白抗原結合結構域為包含以下之scFv：(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸之VH-CDR1； (ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸之VL-CDR3。
  9. 如請求項7或請求項8之雙特異性抗-HER2抗體，其中(a)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價連接於該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之羧基端；(b)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價連接於該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之胺基端；或(c)該第二免疫球蛋白抗原結合結構域共價***該第一免疫球蛋白抗原結合結構域之該HC之多肽鏈。
  10. 如請求項1至9中任一項之雙特異性抗-HER2抗體，其中該重鏈包含含有Fc結構域之恆定區。
  11. 如請求項10之雙特異性抗-HER2抗體，其中該Fc結構域包含至少一個能夠降低或增強該雙特異性抗體之ADCC活性的突變。
  12. 一種雙特異性抗-HER2抗體，其包含彼此締合之第一及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈係選自：(1)[TZS]-[L1]-[BVH]-[BCH]-[Fcx](2)[BVH]-[BCH]-[Fcx]-[L2]-[TZS](3)[BVH]-[BCH]-[L3]-[TZS]-[L4]-[Fcx]其中TZs為結合與曲妥珠單抗相同之抗原決定基的scFv；L1、L2、L3及L4為肽連接子；Fcx為Fc結構域；BVH及BCH分別為能夠結合於與該曲妥珠單抗抗體所識別之抗 原決定基不同的HER2抗原決定基之抗體的VH及CH1區；且其中該第二鏈包含[BVL]-[CL]，其中BVL為能夠結合於與該曲妥珠單抗抗體所識別之抗原決定基不同的HER2抗原決定基之抗體的VL區，且CL為選自由人類κ恆定區及人類λ恆定區組成之群的IgG輕鏈恆定區。
  13. 如請求項12之雙特異性抗-HER2抗體，其中BVL包含(i)與SEQ ID NO：4一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：4一致之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)；(ii)與SEQ ID NO：5一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：5一致之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：6一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：6一致之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)；其中[TZS]包含(i)包含SEQ ID NO：54之胺基酸之VH-CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸之VH-CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：56之胺基酸之VH-CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：57之胺基酸之VL-CDR1；(v)包含SEQ ID NO：58之胺基酸之VL-CDR2；以及(vi)包含SEQ ID NO：59之胺基酸之VL-CDR3；其中該[Fcx]包含(i)至少一個引入可衍生基團之胺基酸取代；及/或(ii)至少一個能夠增強該雙特異性抗體之ADCC活性之突變；且其中[BVH]包含(i)與SEQ ID NO：1一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：1一致之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)； (ii)與SEQ ID NO：2一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：2一致之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)；以及(iii)與SEQ ID NO：3一致或除至多1、2、3或4個胺基酸取代以外與SEQ ID NO：3一致之可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)。
  14. 如請求項1至13中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該雙特異性HER2抗體：(a)在結合於該HER2標靶時誘發內化；(b)在內化後促進有效溶酶體輸送；(c)誘發HER2標靶降解；(d)阻斷低HER2表現之癌細胞中配位體誘發之AKT磷酸化；(e)破壞配位體誘發之HER2：HER3二聚；或(f)其組合。
  15. 一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含如請求項1至14中任一項之雙特異性HER2抗體及至少一個、兩個、三個或四個治療部分，且視情況包含至少一個間隔基。
  16. 如請求項15之ADC，其中各治療部分化學結合於該雙特異性抗體之Fc區中之特定位置的胺基酸之側鏈。
  17. 如請求項16之ADC，其中該等特定位置係選自由以下組成之群：239、248、254、258、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、435、440、441、442、443、446、位置239與240之間的***或其組合，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
  18. 如請求項17之ADC，其中該等特定位置為239、442或兩者，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
  19. 一種ADC，其包含如請求項1至14中任一項之雙特異性HER2抗體，其中該抗體包含：(i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iii)包含SEQ ID NO：36之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(iv)包含SEQ ID NO：37之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(v)包含SEQ ID NO：40之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於位置239之半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(vi)包含SEQ ID NO：41之胺基酸之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價 連接於分別位於位置239及442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(vii)包含SEQ ID NO：32之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(viii)包含SEQ ID NO：71之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(ix)包含SEQ ID NO：74之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(x)包含SEQ ID NO：76之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引；(xi)包含SEQ ID NO：79之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸之治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所 闡述之EU索引；或(xii)包含SEQ ID NO：81之胺基酸或由其組成之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO：42之胺基酸或由其組成之第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含共價連接於***位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸及位於位置442之半胱胺酸胺基酸之兩個治療部分，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
  20. 如請求項15至19中任一項之ADC，其中該治療部分包含細胞毒素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞激素、淋巴激素、趨化激素、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光敏性治療劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物、螯合劑或其組合。
  21. 如請求項20之ADC，其中該細胞毒素為妥布賴森(tubulysin)、奧瑞他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)或吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
  22. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之雙特異性HER2抗體或如請求項15至21中任一項之ADC及醫藥學上可接受之載劑。
  23. 一種治療表現HER2之癌症之方法，其包含向有需要之個體投與如請求項1至14中任一項之雙特異性HER2抗體、如請求項15至21中任一項之ADC或如請求項22之醫藥組合物。
  24. 如請求項23之方法，其中該癌症為低HER2表現之癌症。
  25. 一種治療對靶向HER2之治療劑之抗性的方法，其包含向有需要之個體投與如請求項1至14中任一項之雙特異性HER2抗體、如請求項15至21中任一項之ADC或如請求項22之醫藥組合物。
TW104111702A 2014-04-11 2015-04-10 雙特異性ｈｅｒ２抗體 TW201542594A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461978516P 2014-04-11 2014-04-11
US201562107050P 2015-01-23 2015-01-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201542594A true TW201542594A (zh) 2015-11-16

Family

ID=54288419

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104111702A TW201542594A (zh) 2014-04-11 2015-04-10 雙特異性ｈｅｒ２抗體

Country Status (17)

Country Link
US (1) US10160812B2 (zh)
EP (1) EP3129055B1 (zh)
JP (1) JP2017512765A (zh)
KR (1) KR20160143808A (zh)
CN (1) CN106232139A (zh)
AU (1) AU2015243377A1 (zh)
BR (1) BR112016022910A2 (zh)
CA (1) CA2943299A1 (zh)
CL (1) CL2016002547A1 (zh)
ES (1) ES2819863T3 (zh)
HK (1) HK1232127A1 (zh)
IL (1) IL247478A0 (zh)
MX (1) MX2016012830A (zh)
RU (1) RU2016144176A (zh)
SG (1) SG11201608192SA (zh)
TW (1) TW201542594A (zh)
WO (1) WO2015157592A1 (zh)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3733714A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-04 Universität Zürich Her2-binding tetrameric polypeptides
NZ725131A (en) * 2014-04-11 2018-03-23 Medimmune Llc Tubulysin derivatives
RU2710194C9 (ru) 2015-11-10 2020-09-14 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Связывающие молекулы, специфичные в отношении asct2, и их применения
TWI727380B (zh) 2015-11-30 2021-05-11 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
CA3012960A1 (en) 2016-02-01 2017-08-10 Pfizer Inc. Tubulysin analogs and methods for their preparation
JP2019506865A (ja) * 2016-02-05 2019-03-14 ゲンマブ エー／エス 改善された内部移行特性を有する多重特異性抗原結合分子
CN107446045A (zh) * 2016-07-22 2017-12-08 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗her2的抗体、其药物组合物及用途
EP3579848A4 (en) 2017-02-08 2021-03-03 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS AND THEIR THERAPEUTIC USES FOR TREATING CANCER
AU2018220736A1 (en) 2017-02-20 2019-09-05 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding HER2, NKG2D and CD16
CA3052837A1 (en) * 2017-02-28 2018-09-07 Seattle Genetics, Inc. Cysteine mutated antibodies for conjugation
CR20200100A (es) 2017-08-01 2020-05-09 Medimmune Llc Conjugado de anticuerpo monoclonal contra bcma -fármaco
CN107789631B (zh) * 2017-11-03 2021-03-16 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 抗人ErbB2双表位抗体-药物偶联物及其应用
CN112368012A (zh) 2018-02-08 2021-02-12 蜻蜓疗法股份有限公司 靶向nkg2d受体的抗体可变结构域
SG10201801219VA (en) 2018-02-13 2019-09-27 Agency Science Tech & Res Anti-HER2 Antibodies
SG11202008770QA (en) 2018-03-13 2020-10-29 Zymeworks Inc Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
US20210198370A1 (en) * 2018-05-31 2021-07-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Bi-specific antibodies and use thereof
EA202091888A1 (ru) * 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
EP3864054A1 (en) * 2018-10-08 2021-08-18 Universität Zürich Her2-binding tetrameric polypeptides
JP2024504880A (ja) * 2018-12-24 2024-02-02 サノフイ 疑似ｆａｂベースの多重特異性結合タンパク質
CN113226329A (zh) * 2018-12-28 2021-08-06 国立大学法人东京大学 识别癌细胞的抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白
JP2022529232A (ja) * 2019-03-22 2022-06-20 オリビア・ニュートン－ジョン・キャンサー・リサーチ・インスティテュート 抗ｈｅｒ２結合分子
JP7436520B2 (ja) * 2019-05-31 2024-02-21 ザイムワークス ビーシー インコーポレイテッド 胆道癌の治療のための、ｈｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合構築物の使用方法
US20220387618A1 (en) 2019-11-15 2022-12-08 Seagen Inc. Methods of treating her2 positive breast cancer with tucatinib in combination with an anti-her2 antibody-drug conjugate
KR20210068264A (ko) 2019-11-30 2021-06-09 김상엽 스트랩 부착형 헬스장갑
BR112022016232A2 (pt) * 2020-02-19 2022-11-16 Denali Therapeutics Inc Proteínas biespecíficas anti-her2 manipuladas
IL295312A (en) 2020-02-28 2022-10-01 Regeneron Pharma Bispecific antigen binding molecules that bind her2 and methods of using them
GB202004263D0 (en) 2020-03-24 2020-05-06 Autolus Ltd Antibody conjugate
FR3112939B1 (fr) * 2020-07-31 2024-01-05 Univ Montpellier Produit universel de thérapie cellulaire et son utilisation
BR112023004415A2 (pt) 2020-09-11 2023-05-09 Medimmune Ltd Moléculas terapêuticas de ligação a b7-h4
US11866502B2 (en) 2020-10-22 2024-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-FGFR2 antibodies and methods of use thereof
CN114539413A (zh) * 2020-11-25 2022-05-27 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合her2的多价双特异性抗体、其制备方法和用途
CN117616052A (zh) * 2021-07-05 2024-02-27 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 抗体药物偶联物及其应用
TW202348252A (zh) 2022-02-16 2023-12-16 英商梅迪繆思有限公司 用治療性結合分子治療癌症的組合療法
WO2023169896A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Astrazeneca Ab BINDING MOLECULES AGAINST FRα
WO2023170216A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Astrazeneca Ab A SCORING METHOD FOR AN ANTI-FRα ANTIBODY-DRUG CONJUGATE THERAPY
CN116874606B (zh) * 2023-09-08 2023-11-24 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 一种靶向trop2和cd3的双特异性抗体及其制备方法与应用

Family Cites Families (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0229046B1 (fr) 1985-03-30 1994-05-04 BALLIVET, Marc Procede d'obtention d'adn, arn, peptides, polypeptides ou proteines, par une technique de recombinaison d'adn
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US7838216B1 (en) 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
WO1990014443A1 (en) 1989-05-16 1990-11-29 Huse William D Co-expression of heteromeric receptors
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
AU687346B2 (en) 1992-06-30 1998-02-26 Oncologix, Inc. A combination of anti-erbB-2 monoclonal antibodies and method of using
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5977322A (en) 1995-06-14 1999-11-02 The Regents Of The University Of California High affinity human antibodies to tumor antigens
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
US7264963B1 (en) 1995-08-18 2007-09-04 Morphosys Ag Protein(poly)peptide libraries
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
NZ519191A (en) 1996-10-18 2005-04-29 Univ Texas Antibodies that bind to domain 1 of ErbB2 useful for inducing cell death via apoptosis, and nucleic acids encoding such antibodies
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US7244826B1 (en) 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
GB9818731D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
EP1189641B1 (en) 1999-06-25 2009-07-29 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
WO2001002588A2 (en) 1999-07-02 2001-01-11 Morphosys Ag Generation of specific binding partners binding to (poly)peptides encoded by genomic dna fragments or ests
DE60028970T2 (de) 1999-07-02 2007-02-15 Genentech Inc., San Francisco An her2 bindende peptidverbindungen
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
US7306801B2 (en) 2000-05-15 2007-12-11 Health Research, Inc. Methods of therapy for cancers characterized by overexpression of the HER2 receptor protein
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US20030003097A1 (en) 2001-04-02 2003-01-02 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
ITRM20010408A1 (it) 2001-07-10 2003-01-10 Univ Napoli Federico Ii Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2.
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US7135174B2 (en) 2002-01-07 2006-11-14 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to PDGFD and uses thereof
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
CA2481515C (en) * 2002-04-10 2013-10-01 Genentech, Inc. Anti-her2 antibody variants
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
EP1521769B1 (de) 2002-07-09 2015-09-09 Dömling, Alexander Tubulysinkonjugate
US7816377B2 (en) 2002-07-09 2010-10-19 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysin analogues
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
MXPA05004712A (es) 2002-11-07 2005-11-23 Immunogen Inc Anticuerpos anti-cd33 y metodo para tratamiento de leucemia mieloide aguda utilizando los mismos.
DE10254439A1 (de) 2002-11-21 2004-06-03 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysine, Herstellungsverfahren und Tubulysin-Mittel
US20050226867A1 (en) 2003-10-08 2005-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. IL-5R-specific antibody composition
AU2004284075A1 (en) 2003-10-22 2005-05-06 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
EP2270010B1 (en) 2004-03-01 2012-01-25 Spirogen Limited 11-hydroxy-5h-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-one derivatives as key intermediates for the preparation of c2 substituted pyrrolobenzodiazepins
WO2005075514A2 (en) 2004-03-10 2005-08-18 Lonza Ltd. Method for producing antibodies
WO2005086875A2 (en) * 2004-03-11 2005-09-22 City Of Hope A humanized anti-cea t84.66 antibody and uses thereof
GB0410725D0 (en) 2004-05-13 2004-06-16 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine therapeutic agents
WO2006024497A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CN102746404B (zh) 2004-11-12 2016-01-20 赞科股份有限公司 对FcRn的结合被改变的Fc变体
DE602006011300D1 (de) 2005-04-21 2010-02-04 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine
ATE427949T1 (de) 2005-10-05 2009-04-15 Spirogen Ltd 4-a4-(5-oxo-2,3,5,11a-tetrahydro-5h-pyrrolo a2, 1-cua1,4ubenzodiazepin-8-yloxy)-butyrylaminou-1 - pyrrol-2-carbonsaurealkylesterderivate und verwandte verbindung zur behandlung einer proliferativen erkrankung
JP5597793B2 (ja) 2006-06-19 2014-10-01 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｉｌｔ３結合分子およびその使用
RU2009107494A (ru) * 2006-08-04 2010-09-10 Астразенека Аб (Se) АНТИТЕЛА К ErbB2
US8455622B2 (en) 2006-12-01 2013-06-04 Seattle Genetics, Inc. Variant target binding agents and uses thereof
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
WO2009012958A2 (en) 2007-07-20 2009-01-29 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Tubulysin d analogues
US8476451B2 (en) 2007-07-20 2013-07-02 The Regents Of The University Of California Tubulysin D analogues
JP2010535032A (ja) * 2007-07-31 2010-11-18 メディミューン，エルエルシー 多重特異性エピトープ結合性タンパク質およびその用途
US9187521B2 (en) 2007-10-25 2015-11-17 Endocyte, Inc. Tubulysins and processes for preparing
AU2009205995B2 (en) 2008-01-18 2014-04-03 Medimmune, Llc Cysteine engineered antibodies for site-specific conjugation
EP2287174B8 (en) 2008-01-18 2016-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of antibody fragments by apatite chromatography
WO2011005481A1 (en) * 2009-06-22 2011-01-13 Medimmune, Llc ENGINEERED Fc REGIONS FOR SITE-SPECIFIC CONJUGATION
WO2011066501A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Centocor Ortho Biotech Inc. Antibody fc mutants with ablated effector functions
WO2011120135A1 (en) 2010-03-29 2011-10-06 Zymeworks, Inc. Antibodies with enhanced or suppressed effector function
EP2576616A4 (en) 2010-05-27 2014-05-21 Merck Sharp & Dohme PROCESS FOR PREPARING ANTIBODIES WITH IMPROVED PROPERTIES
MX2013001402A (es) 2010-08-06 2013-08-29 Endocyte Inc Proceso para preparar tubulisinas.
UY33826A (es) 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión con dominios trivariables y sus usos
CN103796678B (zh) * 2011-04-20 2018-02-27 健玛保 针对her2的双特异性抗体
EP2537864B1 (en) 2011-06-24 2019-08-07 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Fc variants with reduced effector functions
EP2776061B1 (en) * 2011-11-07 2019-08-14 MedImmune, LLC Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
WO2015157595A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies
NZ725131A (en) 2014-04-11 2018-03-23 Medimmune Llc Tubulysin derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
CA2943299A1 (en) 2015-10-15
HK1232127A1 (zh) 2018-01-05
ES2819863T3 (es) 2021-04-19
IL247478A0 (en) 2016-11-30
RU2016144176A (ru) 2018-05-14
AU2015243377A1 (en) 2016-09-15
WO2015157592A1 (en) 2015-10-15
JP2017512765A (ja) 2017-05-25
SG11201608192SA (en) 2016-10-28
KR20160143808A (ko) 2016-12-14
US10160812B2 (en) 2018-12-25
EP3129055A4 (en) 2017-11-22
CL2016002547A1 (es) 2017-06-23
US20170291955A1 (en) 2017-10-12
EP3129055A1 (en) 2017-02-15
RU2016144176A3 (zh) 2018-11-20
MX2016012830A (es) 2017-01-05
EP3129055B1 (en) 2020-07-01
CN106232139A (zh) 2016-12-14
BR112016022910A2 (pt) 2017-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10160812B2 (en) Bispecific HER2 antibodies
JP7361727B2 (ja) Ｐｓｍａ結合剤及びその使用
CN107531786B (zh) 抗axl拮抗抗体
CN113645996B (zh) 抗claudin 18抗体及其使用方法
KR102080535B1 (ko) Her3에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
US11447551B2 (en) Binding molecules specific for claudin 18.2, compositions and methods thereof, for the treatment of cancer and other diseases
JP2016536020A (ja) 新規の抗クローディン抗体および使用方法
JP2018524312A (ja) 抗ｈｅｒ２抗体及び使用方法
EP4261223A1 (en) Anti-sirp? antibody and application thereof
WO2019241893A2 (en) Anti-her3 antibody and uses thereof
TW202241507A (zh) Psma結合蛋白及其用途
KR20220113790A (ko) 항-ly6g6d 항체 및 사용 방법
RU2800779C2 (ru) Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы и способы их применения
TW202227498A (zh) 新型抗ｃｌａｕｄｉｎ１８抗體
CN117279951A (zh) 抗5t4抗体及其用途
JP2021512613A (ja) 二重特異性抗原結合分子及びその使用方法
NZ625046B2 (en) Binding molecules specific for her3 and uses thereof