ES2819863T3 - Anticuerpos contra HER2 biespecíficos - Google Patents

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ES2819863T3 ES15777404T ES15777404T ES2819863T3 ES 2819863 T3 ES2819863 T3 ES 2819863T3 ES 15777404 T ES15777404 T ES 15777404T ES 15777404 T ES15777404 T ES 15777404T ES 2819863 T3 ES2819863 T3 ES 2819863T3
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Melissa Damschroder
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Dorin Toader
Lakshmaiah Gingipalli
Fengjiang Wang
Ryan Fleming
Binyam Bezabeh
Andy Qingan Yuan
Srinath Kasturirangan
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Abstract

Un anticuerpo anti-HER2 biespecifico que comprende un primer dominio de union a antigeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de union a antigeno de inmunoglobulina, y que comprende una primera y una segunda cadenas polipeptidicas asociadas entre si, en el que: (i) el primer dominio de union a antigeno de inmunoglobulina comprende una region variable (VH) de cadena pesada (HC) y una region variable (VL) de cadena ligera (LC) que comprende: (a) una CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) identica a SEQ ID NO: 1; (b) una CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) identica a SEQ ID NO: 2; (c) una CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) identica a SEQ ID NO: 3; (d) una CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) identica a SEQ ID NO: 4; (e) una CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) identica a SEQ ID NO: 5; y, (f) una CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) identica a SEQ ID NO: 6; y (ii) el segundo dominio de union a antigeno de inmunoglobulina comprende un scFv que comprende: (g) una VH-CDR1 que comprende los aminoacidos de SEQ ID NO: 54; (h) una VH-CDR2 que comprende los aminoacidos de SEQ ID NO: 55; (i) una VH-CDR3 que comprende los aminoacidos de SEQ ID NO: 56; (j) una VL-CDR1 que comprende los aminoacidos de SEQ ID NO: 57; (k) una VL-CDR2 que comprende los aminoacidos de SEQ ID NO: 58; y (l) una VL-CDR3 que comprende los aminoacidos de SEQ ID NO: 59; y en el que: (a)la primera cadena polipeptidica se selecciona de: (1) [TZS]-[L1]-[BVH]-[BCH]-[Fcx] (2) [BVH]-[BCH]-[Fcx]-[L2]-[TZS] (3) [BVH]-[BCH]-[L3]-[TZS]-[L4]-[Fcx] y (b) la segunda cadena polipeptidica comprende [BVL]-[CL], en la que - TZs es un scFv que se une al mismo epitopo que trastuzumab; - BVH, BVL y BCH son las regiones VH, VL y CH1, respectivamente, de un anticuerpo que puede unirse a un epitopo de HER2 distinto del epitopo reconocido por el anticuerpo trastuzumab; - CL es una region constante kappa humana o una region constante lambda humana de cadena ligera de IgG; - L1, L2, L3 y L4 son ligadores peptidicos; - Fcx es un dominio Fc; y en la que: - BVH comprende una VH-CDR1, una VH-CDR2, y una VH-CDR3 identicas a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, respectivamente; - BVL comprende una VL-CDR1, una VL-CDR2, y una VL-CDR3 identicas a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 6, respectivamente; - [TZs] comprende una VH-CDR1, una VH-CDR2, y una VH-CDR3 que comprenden los aminoacidos de SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, y SEQ ID NO: 56, respectivamente; y una VL-CDR1, una VL-CDR2, y una VL-CDR3 que comprenden los aminoacidos de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 59, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra HER2 biespecíficos
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/978,516, presentada el 11 de abril, 2014 y la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/107,050, presentada el 23 de enero, 2015.
ANTECEDENTES
La presente invención proporciona composiciones que se unen específicamente a HER2 y métodos para el uso de tales composiciones para el tratamiento de cáncer.
La familia HER de tirosina cinasas receptoras son mediadores importantes del crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celulares. La familia de receptores incluye cuatro miembros distintos incluyendo el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB1, o HER1), HER2 (ErbB2 o p185neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2).
HER2 se identificó originariamente como el producto del gen de transformación de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La amplificación del homólogo humano se ha observado en cánceres de mama y de ovario y se correlaciona con un pronóstico pobre. La sobreexpresión de HER2 (frecuentemente pero no de manera uniforme se debe a la amplificación génica) también se ha observado en otros carcinomas incluyendo carcinomas de estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas y vejiga. HER2 también puede estar sobreexpresado en cáncer de próstata.
Los receptores HER generalmente se encuentran en diversas combinaciones en células y la heterodimerización está pensada para aumentar la diversidad de respuestas celulares a una variedad de ligandos de HER (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). Mientras que EGF y TGFa no se unen a HER2, EGF estimula a EGFR y HER2 para formar un heterodímero, que activa EGFR y da como resultado la transfosforilación de HER2 en el heterodímero. La dimerización y/o transfosforilación parece que activan la tirosina cinasa HER2. Véase Earp et al., citado anteriormente. Asimismo, cuando HER3 se coexpresa con HER2, se forma un complejo de señalización activo y anticuerpos dirigidos contra HER2 que pueden perturbar este complejo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269:14661-14665 (1994)).
Se han descrito numerosos anticuerpos dirigidos hacia HER2 en la técnica (véase, p. ej.,Hudziak et al., Mol. Cell. Biol.
9:1165-1172 (1989); patente estadounidense n.° 5,677,171; Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. In vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11: 117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 1:979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
91:7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); y Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997).
Otros anticuerpos contra HER2 con diversas propiedades se han descrito en Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); patente estadounidense n.° 5,783,186; y Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997).
Trastuzumab (Herceptin®; véase la patente estadounidense n.° 5,821,337), una versión humanizada recombinante del anticuerpo contra HER2 murino 4D5, es clínicamente activo en pacientes con cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan HER2 que han recibido terapia contra el cáncer previa extensa (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). Para seleccionar como diana la ruta de señalización de HER, se desarrolló pertuzumab (Perjeta™; véase la publicación de patente WO2001/00245) como una versión humanizada del anticuerpo murino 2C4 que inhibe la dimerización de HER2 con otros receptores HER, inhibiendo de ese modo la fosforilación y activación dirigidas por ligandos, y la activación posterior de las rutas de RAS y AKT. Ado-trastuzumab emtansina (T-DM1; Kadcyla®) es un conjugado anticuerpo-fármaco de trastuzumab unido al agente citotóxico mertansina aprobado para su uso en pacientes con cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan HER2 resistentes a trastuzumab.
Li et al. (Cancer research, 2013, 73(21): 6471-6483) divulga un anticuerpo anti-ErbB2 biespecífico que emplea trastuzumab y pertuzumab, el cual es otro anticuerpo humanizado específico para ErbB2 que se une a un epítopo distinto del trastuzumab.
Aunque la eficacia terapéutica de trastuzumab en carcinoma de mama está bien demostrada, está limitado estrictamente y sólo aprobado para el 30% de pacientes con cáncer de mama cuyo tumor sobreexpresa HER2. El 70% de los pacientes con cáncer de mama no responden o lo hacen insuficientemente a trastuzumab porque su tumor individual no sobreexpresa o no expresa suficientemente HER2. En otros cánceres y/o cánceres individuales, se sobreexpresa HER2 en un porcentaje significativo de casos que oscila entre el 43 y el 69%, sin embargo, como norma, los niveles de expresión de HER2 son en principio bajos en la mayoría de tumores. Además, la sobreexpresión de receptores HER2 está provocada a menudo por amplificación de genes codificantes (Hynes et al., Nat Rev Cancer 5:341 (2005)). Por tanto, el consenso actual es que la terapia con anticuerpo monoclonal anti-HER2 es ineficaz en tumores con baja expresión de HER2 o falta de sobreexpresión. Además, la resistencia a estos anticuerpos anti-HER2 es un problema significativo.
Dada la falta de una terapia anti-HER2 eficaz en cánceres específicos que expresan bajos niveles de HER2 y resistencia a las terapias actuales, existe la necesidad de anticuerpos mejorados que puedan unirse eficazmente a células cancerosas que expresan un intervalo más amplio de niveles de h ER2 e inhiban su crecimiento mediante, por ejemplo, (i) citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o (ii) acción citotóxica debida a cargas útiles conjugadas a los anticuerpos como conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) y/o (iii) inhibición de la señalización mediada por receptor (p. ej. inhibiendo la dimerización de receptor y/o mediando en la internalización de receptor).
Por tanto, es un objeto de la presente divulgación proporcionar agentes inmunoterápicos mejorados que inhiban eficazmente la señalización celular mediada por HER2 que puedan usarse para el tratamiento de cánceres que expresan HER2, incluyendo cánceres donde HER2 no se expresa a altos niveles.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Se refiere a un anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende dos dominios de unión a HER2 específicos para diferentes epítopos de HER2, a conjugados de anticuerpo-fármaco del mismo y a los usos médicos correspondientes en el tratamiento del cáncer.
SUMARIO DE ASPECTOS GENERALES DE LA DIVULGACIÓN
Más allá del alcance de la invención, que se define exclusivamente en las reivindicaciones adjuntas, la presente divulgación también proporciona un marco más genérico para proporcionar un anticuerpo contra HER2 optimizado y, en particular, formatos biespecíficos del mismo.
Por tanto, la presente divulgación proporciona una molécula de unión anti-HER2 que comprende una cadena pesada (VH) de inmunoglobulina y una cadena ligera (VL) de inmunoglobulina, en la que la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. También se proporciona una molécula de unión anti-HER2 que comprende una VH y una VL, en la que la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En algunos aspectos, la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En algunos aspectos, la molécula de unión anti-HER2 comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo.
La presente divulgación también proporciona un anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que (i) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos sitios de unión del anticuerpo contra HER2, (ii) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a un primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 que comprende un epítopo dentro del dominio II de HER2, y (iii) el primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es distinto del sitio de unión del anticuerpo de pertuzumab. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a un segundo sitio de unión del anticuerpo contra HER2 que comprende un epítopo dentro del dominio IV de HER2. En algunos aspectos, el segundo sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es idéntico al sitio de unión del anticuerpo contra HER2 de trastuzumab. En algunos aspectos, el segundo sitio de unión del anticuerpo contra HER2 se solapa parcialmente con el sitio de unión del anticuerpo contra HER2 de trastuzumab. En otros aspectos, el segundo sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es distinto del sitio de unión del anticuerpo contra HER de trastuzumab.
La presente divulgación también proporciona un anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de h ER2; y en el que el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a HER2 en un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 52.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a HER2 en un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 52 y el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une específicamente a HER2 en un epítopo dentro del dominio IV. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a HER2 en un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 53.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende:
(i) una secuencia de CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 1 o idéntica a SEQ ID NO: 1 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(ii) una secuencia de CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 2 o idéntica a SEQ ID NO: 2 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iii) una secuencia de CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 3 o idéntica a SEQ ID NO: 3 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iv) una secuencia de CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(v) una secuencia de CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y,
(vi) una secuencia de CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido.
En determinados aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende al menos una región de entramado (FW) de dominio variable heteróloga en relación con el dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina que comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
En determinados aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv.
En determinados aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv.
En algunos aspectos, la al menos una región FW heteróloga del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina que comprende además (i) una secuencia de aminoácidos de región de entramado de cadena ligera variable 1 (VL-FW1) que comprende SEQ ID NO: 11; (ii) una secuencia de aminoácidos de VH-FW2 que comprende SEQ ID NO: 12; (iii) una secuencia de aminoácidos de VH-FW3 que comprende SEQ ID NO: 13; (iv) una secuencia de aminoácidos de VH-FW4 que comprende SEQ ID NO: 14; o (vi) cualquier combinación de las mismas.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una VH y una VL, en el que la secuencia de aminoácidos de VH comprende SEQ ID NO: 15; en el que el primer o el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv, y en el que el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una VH y una VL, en el que la secuencia de aminoácidos de VL comprende SEQ ID NO: 16; en el que el primer o el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv, y en el que el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende una VH y una VL, en el que la secuencia de aminoácidos de VH comprende SEQ ID NO: 15; y en el que la secuencia de aminoácidos de VL comprende SEQ ID NO: 16, en el que el primer o el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv, y en el que el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de h ER2.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina que comprende o que consiste en (a) una VH que comprende además una región constante de cadena pesada o un fragmento de la misma y una VL que comprende una región constante de cadena ligera o un fragmento de la misma; (b) un Fv de cadena sencilla ("scFv"); (c) un diacuerpo; (d) un minicuerpo; (e) un F(ab')2; o (f) F(ab). En los mismos aspectos, la región constante de cadena pesada o fragmento de la misma es una región constante de IgG. En algunos aspectos, la región constante de IgG o fragmento de la misma es una región constante de IgG1. En algunos aspectos, la región constante de LC es una región constante kappa.
En algunos aspectos, la región constante de LC es una región constante lambda. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina es un anticuerpo humanizado. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina es un anticuerpo humano. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina es un anticuerpo quimérico. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina es un anticuerpo de afinidad optimizada. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina no compite con trastuzumab o pertuzumab por la unión a epítopos. En algunos aspectos, el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos no solapantes de HER2.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer y un segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que (a) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une específicamente al mismo epítopo en el dominio IV de HER2 que el anticuerpo trastuzumab; (b) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina inhibe competitivamente la unión a HER2 por el anticuerpo trastuzumab; y/o (c) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 54 a 59.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un scFv que comprende: (i) una VH-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 54; (ii) una VH-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (iii) una VH-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID No : 56; (iv) una VL-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 57; (v) una VL-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 58; y (vi) una VL-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 59. En algunos aspectos, el scFv es un scFv estabilizado con disulfuro. En algunos aspectos, el scFv comprende una VH que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una VL que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
En algunos aspectos, la VH y la VL del scFv están covalentemente unidas mediante un ligador peptídico. En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico está covalentemente unido al extremo carboxi-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un ligador interpuesto entre el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y el extremo carboxi-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En otros aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico está covalentemente unido al extremo amino-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un ligador interpuesto entre el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y el extremo amino-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico está covalentemente intercalado en la cadena polipeptídica de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina está covalentemente intercalado entre la región CH1 y la región CH2 de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un ligador interpuesto entre la región CH1 de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, y un segundo ligador interpuesto entre el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y la región CH2 de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina.
En algunos aspectos, el primer ligador y el segundo ligador son idénticos. En otros aspectos, el primer ligador y el segundo ligador son diferentes. En algunos aspectos, uno o más de los ligadores comprenden un ligador peptídico. En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 10, al menos 20 o al menos 30 aminoácidos. En otros aspectos, el ligador peptídico comprende un péptido que tiene la fórmula Serx[(Gly)y-Seu]z donde x es desde 0 hasta 1, y es desde 1 hasta 4, y z es desde 1 hasta 10. Por ejemplo, el ligador de este tipo más largo posible tiene x = 1, y = 4 y z = 10, viz., Ser[Gly4Ser4]10 (SEQ ID NO: 60). En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende SEQ ID NO: 19, 20, 21 ó 22.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende una cadena pesada que puede incluir un dominio Fc que comprende una región CH2 y una CH3. En algunos aspectos, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otros aspectos, el dominio Fc de IgG1 es un dominio Fc de IgG1 nativo. En algunos aspectos, el dominio Fc de IgG1 nativo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.
En algunos aspectos, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 mutante. En otros aspectos, el dominio Fc de IgG1 mutante comprende al menos una mutación que puede reducir la actividad ADCC del anticuerpo biespecífico. En algunos aspectos, al menos una mutación que puede reducir la actividad ADCC del anticuerpo biespecífico es una sustitución de aminoácido. En algunos aspectos, al menos una sustitución de aminoácido comprende L234F, S239A, S239C, o cualquier combinación de las mismas.
En algunos aspectos, el dominio Fc de IgG1 mutante comprende al menos una sustitución de aminoácido que introduce un grupo derivatizable. En algunos aspectos, el grupo derivatizable es un grupo sulfhidrilo. En algunos aspectos, la al menos una sustitución de aminoácido comprende S239C, 248C, 254C, 273C, 279C, 282C, 284C, 286C, 287C, 289C, 297C, 298C, 312C, 324C, 326C, 330C, 335C, 337C, 339C, 350C, 355C, 356C, 359C, 360C, 361C, 375C, 383C, 384C, 389C, 398C, 400C, 413C, 415C, 418C, 422C, 440C, 441C, S442C, 443C y 446C, o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, el dominio Fc mutante comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.
También se proporciona un anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende una primera y una segunda cadenas polipeptídicas asociadas entre sí, en el que la primera cadena polipeptídica comprende una secuencia seleccionada de:
(1) [TZsHL-iH bVHHbCHHFcx]
(2) [bVHHbCHHFcxHL2HTZs]
(3) [bVH]-[bCH]-[Ls]-[TZs]-[L4]-[Fcx]
en las que
TZs es un scFv que se une al mismo epítopo que trastuzumab;
Li, L2, L3, y L4 son ligadores peptídicos;
Fcx es un dominio Fc;
bVH y bCH son las regiones VH y CH1, respectivamente, de un anticuerpo que puede unirse a un epítopo de HER2 distinto del epítopo reconocido por el anticuerpo trastuzumab. En determinados aspectos, el epítopo distinto comprende uno o más residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 52.
En algunos aspectos un polipéptido de bisagra une [bCH] y [Fcx]. En un aspecto específico, el polipéptido de bisagra comprende o alternativamente consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En algunos aspectos, la segunda cadena del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende la secuencia [bVL]-[CL] en la que bVL es la región VL de un anticuerpo que puede unirse a un epítopo de HER2 distinto del epítopo reconocido por el anticuerpo trastuzumab, y CL es una región constante de cadena ligera de IgG. En algunos aspectos, CL se selecciona del grupo que consiste en una región constante kappa humana y una región constante lambda humana. En algunos aspectos la bVL comprende (i) una CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1,2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; (ii) una CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1,2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y, (iii) una CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido. En algunos aspectos, bVL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 44.
En otros aspectos, CL es una cadena ligera kappa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
En otros aspectos, CL es una cadena ligera lambda que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
En algunos aspectos, [TZs] comprende (i) una VH-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 54; (ii) una VH-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (iii) una VH-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (iv) una VL-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 57; (v) una VL-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 58; y (vi) una VL-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 59. En algunos aspectos, [TZS] es un scFv estabilizado con disulfuro. En algunos aspectos, [TZS] comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, covalentemente unidos por un ligador peptídico. En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunos aspectos, [TZs] comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En algunos aspectos, la secuencia de aminoácidos de [Fcx] se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 23, 24, 62, 63, 25, 64 y 65. En algunos aspectos, los aminoácidos de [L1], [L2], [L3], y [L4] se seleccionan independientemente del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, 20, 21 y 22. En otros aspectos (i) [L1] comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) [L2] comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (iii) [L3] comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y, (iv) [Lt] comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, [bVH] comprende (i) una CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 1 o idéntica a SEQ ID NO: 1 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; (ii) una CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 2 o idéntica a SEQ ID NO: 2 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y (iii) una CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 3 o idéntica a SEQ ID NO: 33 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido. En algunos aspectos, [bVH] comprende SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 43. En otros aspectos, [bCH] comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
En algunos aspectos, [bVL] comprende (i) una CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; (ii) una CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y (iii) una CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido. En otros aspectos, [bVL] comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En algunos aspectos, la primera cadena polipeptídica del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30, 31, 67, 32, 68, 6933, 70, 71, 34, 35, 72, 36, 73, 74, 37, 75, 76, 38, 39, 77, 40, 78, 79, 41,80 y 81, y la segunda cadena polipeptídica del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 42 o 82.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico induce internalización tras la unión a la diana de HER2. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo contra HER2 biespecífico promueve un tráfico lisosómico eficaz después de la internalización. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo contra HER2 biespecífico induce la degradación de la diana de HER2. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo contra HER2 biespecífico bloquea la fosforilación de AKT inducida por ligando en células cancerosas con una baja expresión de HER2. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo contra HER2 biespecífico perturba la dimerización HER2:HER3 inducida por ligando.
La presente divulgación también proporciona un ADC que comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente, que comprende además al menos un resto terapéutico. En algunos aspectos, el ADC comprende además al menos un espaciador opcional. En algunos aspectos, el al menos un espaciador es un espaciador peptídico. En algunos aspectos, el al menos un espaciador es un espaciador no peptídico.
Las estrategias de conjugación convencionales para ADC se basan en la conjugación aleatoria de la carga útil (p. ej., resto terapéutico) con el anticuerpo a través de lisinas o cisteínas. Por consiguiente, en algunos aspectos el a Dc se conjuga aleatoriamente con un resto terapéutico. En aspectos particulares, la conjugación específica del sitio de restos terapéuticos con anticuerpos usando residuos de aminoácido reactivos en posiciones específicas produce preparaciones de ADC homogéneas con estequiometría uniforme. En algunos aspectos, el ADC comprende dos, tres o cuatro o más restos terapéuticos. En algunos aspectos, todos los restos terapéuticos son el mismo. En algunos aspectos, cada resto terapéutico está químicamente conjugado con la cadena lateral de un aminoácido en una posición de Kabat específica en la región Fc del anticuerpo biespecífico. En algunos aspectos, las posiciones de Kabat específicas son 239, 442, o ambas. En algunos aspectos, las posiciones específicas son la posición de Kabat 442, una inserción de aminoácido entre las posiciones de Kabat 239 y 240, o ambas. En algunos aspectos, la cadena lateral de aminoácido es una cadena lateral de sulfhidrilo. En algunos aspectos, el resto terapéutico comprende una citotoxina, un radioisótopo, una auristatina, un maitansinoide o una pirrolobenzodiazepina (PBD), o combinaciones de los mismos. En determinados aspectos, la citotoxina es tubulisina. En determinados aspectos, la tubulisina es el compuesto T32 (también denominado en la presente "tubulisina 1508" o simplemente "1508").
La presente divulgación también proporciona un ADC que comprende un anticuerpo anti-HER2 biespecífico, en el que dicho anticuerpo comprende:
(i) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una segunda cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende una molécula de tubulisina covalentemente unida a un aminoácido cisteína en la posición de Kabat 239.
(ii) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una segunda cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos moléculas de tubulisina covalentemente unidas a aminoácidos cisteína respectivamente situados en las posiciones de Kabat 239 y 442.
(iii) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una segunda cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende una molécula de tubulisina covalentemente unida a un aminoácido cisteína en la posición de Kabat 239.
(iv) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una segunda cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos moléculas de tubulisina covalentemente unidas a aminoácidos cisteína respectivamente situados en las posiciones de Kabat 239 y 442.
La presente divulgación también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o un conjunto de moléculas de ácido nucleico que codifican para una molécula de unión anti-HER2 (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente), o un complemento del mismo. También se proporciona un vector o un conjunto de vectores que comprenden tal molécula de ácido nucleico o conjunto de las moléculas de ácido nucleico, o un complemento del mismo. También se proporciona una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico aislada o un conjunto de moléculas de ácido nucleico, o el vector o conjunto de vectores. También se proporciona una célula huésped que expresa una molécula de unión anti-HER2 o anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente. También se proporciona un método para producir una molécula de unión anti-HER2 o anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende cultivar la célula huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.
La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión anti-HER2 o anticuerpo anti-HER2 biespecífico, y un portador farmacéuticamente aceptable. También se proporciona un método para tratar un cáncer que expresa HER2 que comprende administrar una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente, un ADC dado a conocer en la presente, o una composición farmacéutica dada a conocer en la presente a un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer con baja expresión de HER2. En algunos aspectos, el método comprende además administrar al menos un agente terapéutico adicional. En algunos aspectos, el al menos un agente terapéutico adicional es un radionúclido o un agente quimioterápico. También se proporciona un método para dirigir un agente terapéutico o profiláctico a la superficie de células que expresan HER2 que comprende conjugar el agente con una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente. También se proporciona un método para aumentar la actividad de un resto terapéutico que comprende conjugar el agente con una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente. También se proporciona un método para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un agente terapéutico o profiláctico que comprende conjugar el agente con una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente. En algunos aspectos, el resto terapéutico es una citotoxina. En algunos aspectos, la citotoxina es tubulisina. En algunos aspectos, la tubulisina es el compuesto T32 (también denominado en la presente "tubulisina 1508" o simplemente "1508"). También se proporciona un método para tratar la resistencia a un agente terapéutico dirigido hacia HER2 que comprende administrar un anticuerpo contra HER2 biespecífico dado a conocer en la presente, una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, o un ADC dado a conocer en la presente a un paciente que lo necesita. En algunos aspectos, el paciente es resistente a un agente terapéutico dirigido hacia HER2 que comprende trastuzumab y/o el maitansinoide DM1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/LAS FIGURAS
La figura 1 muestra una alineación de secuencias correspondiente a las secuencias de aminoácidos de las regiones de VL y VH del anticuerpo 39S con secuencia líder optimizada (LO)(SEQ ID NO: 16 y 15, respectivamente) y el anticuerpo parental AZ 1.39.1 (WT)(SEQ ID NO: 44 y 43, respectivamente). Se indica la ubicación de CDR1, CDR2 y CDR3. Se destacan los residuos de aminoácido que difieren con respecto al anticuerpo parental. También se destacan las regiones de entramado reemplazadas en la región VL.
La figura 2 muestra que el cambio de las regiones de entramado de cadena ligera a IGKV2D de línea germinal dio como resultado una duplicación de la expresión.
La figura 3 muestra una representación de cintas de la estructura del dominio extracelular de HER2 (SEQ ID NO: 52). Los sitios de unión de 39S, pertuzumab y el scFv de dominio IV se indican con flechas. El sitio de unión de 39S incluye aminoácidos dentro del dominio II que son distintos de los de pertuzumab.
La figura 4 muestra ensayos de competencia por FACS usando 39S marcado con DL-680 (2 |jg/ml) y concentraciones variables de anticuerpos monoclonales no marcados (control de R347, trastuzumab, pertuzumab, AZ 1.39.1 y 39S).
La figura 5 muestra ensayos de proliferación dependiente de ligando usando diferentes combinaciones de anticuerpos y la línea celular MCF-7, demostrando que 39S inhibe de manera sinérgica el crecimiento de las líneas celulares sometidas a ensayo cuando se administra en combinación con trastuzumab y/o pertuzumab. Para cada experimento, las muestras de anticuerpo representadas gráficamente son: control de R347, trastuzumab, pertuzumab más trastuzumab, 39S, 39S más trastuzumab, y 39S más pertuzumab.
La figura 6 muestra ensayos de proliferación dependiente de ligando usando diferentes combinaciones de anticuerpos y la línea celular NCI-N87, demostrando que 39S inhibe de manera sinérgica el crecimiento de las líneas celulares sometidas a ensayo cuando se administra en combinación con trastuzumab y/o pertuzumab. Para cada experimento, las muestras de anticuerpo representadas gráficamente son: control de R347, trastuzumab, pertuzumab más trastuzumab, 39S, 39S más trastuzumab, y 39S más pertuzumab.
La figura 7 representa constructos biespecíficos en los que un resto de unión a HER2 (un scFv estabilizado con cisteínas que se une dentro del dominio IV) se ha fusionado genéticamente a diferentes ubicaciones dentro de la estructura del anticuerpo 39S. Se fusionó el scFv al extremo carboxi-terminal de cada una de las cadenas pesadas del anticuerpo 39S (denominado "Bs3Ab-39SH") (figura 7B), se fusionó al extremo amino-terminal de cada una de las cadenas pesadas del anticuerpo 39S (denominado "Bs2Ab-39SH") (figura 7A), o se intercalaron regiones CH1 y CH2 de cada una de las cadenas pesadas del anticuerpo 39S (denominado "Bs4Ab-39SH") (figura 7C).
La figura 8A muestra las secuencias de las cadenas pesadas de anticuerpos Bs2, indicando los aminoácidos en las ubicaciones de Kabat 234, 239, 239-ins, 330, 332 y 442 en cadenas pesadas de tipo natural y cadenas pesadas que pueden optimizarse para la actividad ADCC o para la producción de ADC que tienen actividad ADCC y/o conjugación específica del sitio reducidas. La figura 8A divulga la secuencia consenso como SEQ ID NO: 84.
La figura 8B muestra las secuencias de las cadenas pesadas de anticuerpos Bs3, indicando los aminoácidos en las ubicaciones de Kabat 234, 239, 239-ins, 330, 332 y 442 en cadenas pesadas de tipo natural y cadenas pesadas que pueden optimizarse para la actividad ADCC o para la producción de ADC que tienen actividad ADCC y/o conjugación específica del sitio reducidas. La figura 8B divulga la secuencia consenso como SEQ ID NO: 85.
La figura 8C muestra las secuencias de las cadenas pesadas de anticuerpos Bs4, indicando los aminoácidos en las ubicaciones de Kabat 234, 239, 239-ins, 330, 332 y 442 en cadenas pesadas de tipo natural y cadenas pesadas que pueden optimizarse para la actividad ADCC o para la producción de ADC que tienen actividad ADCC y/o conjugación específica del sitio reducidas. La figura 8C divulga la secuencia consenso como SEQ ID NO: 86.
La figura 9A muestra ensayos de proliferación dependiente de ligando usando diferentes constructos de anticuerpo biespecífico y células MDA-MB-361 que demuestran que Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH y Bs4Ab-39SH tienen una potencia similar en células MDA-MB-361 y m CF-7 (figuras 9A y 9B, respectivamente), que es también comparable a la actividad de combinación de anticuerpos parental (39S más trastuzumab). Para cada experimento, las muestras de anticuerpo representadas gráficamente son: control de R347, Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH, Bs4Ab-39SH y 39S más trastuzumab.
La figura 9B muestra ensayos de proliferación dependiente de ligando usando diferentes constructos de anticuerpo biespecífico y células MCF-7 que demuestran que Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH y Bs4Ab-39SH tienen una potencia similar en células MDA-MB-361 y MCF-7 (figuras 9A y 9B, respectivamente), que es también comparable a la actividad de combinación de anticuerpos parental (39S más trastuzumab). Para cada experimento, las muestras de anticuerpo representadas gráficamente son: control de R347, Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH, Bs4Ab-39SH y 39S más trastuzumab.
La figura 10 muestra la inmunoprecipitación (IP) de HER2 a partir de células T47D seguida por detección mediante inmunotransferencia de tipo Western (WB) de HER2 y HER3 para medir la perturbación de la dimerización HER2:HER3 inducia por heregulina (HRG1), en presencia o ausencia de anticuerpos anti-HER2. Se incubaron células T47D en condiciones de control (sin anticuerpo y sin HRG1; sin anticuerpo pero con HRG1; o, con anticuerpo de control R347 y con HRG1), y después de la incubación con HRG1 más (i) trastuzumab, (ii) pertuzumab, (iii) anticuerpo 39S, o (iv) el constructo biespecífico Bs2Ab-39SH.
La figura 11 muestra los perfiles de cromatografía de exclusión molecular de HPLC representativos que muestran la separación por tamaños de inmunocomplejos derivados de una razón molar de anticuerpo:HER2 de 1:1. Bs2Ab-39SH puede reticular muchas moléculas de h Er 2 para formar complejos tan grandes como de 1716 kDa de tamaño, mientras que trastuzumab sólo puede unirse a dos moléculas de HER2 como máximo para formar un complejo de 320 kDa.
La figura 12 presenta ensayos de internalización de receptor basados en FACS que muestran que los tres formatos de anticuerpos biespecíficos contra HER2 presentados en la figura 6 se internalizaron rápidamente en la línea celular BT-474. Se representan gráficamente en el gráfico: control de R347, trastuzumab, 39S, trastuzumab más 39S, Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH y BsAb-39SH. Se observaron resultados similares en las líneas celulares MCF-7, T47D, RT-112, MDA-MB-361 y NCI-N87 (no se muestran los datos).
La figura 13 muestra la cinética de internalización de Bs2Ab-39SH por células BT-474. Se tomaron imágenes de microscopía a los 0, 30, 60, 120 y 360 minutos después de la adición del constructo Bs2Ab-39SH, trastuzumab o el control de R347. Se tiñó el citoplasma de las células BT-474 con CellTracker™ Green (Life Technologies Corp.), y se marcaron los anticuerpos con Alexa Fluor® 647 (Life Technologies Corp.).
La figura 14 es una inmunotransferencia de tipo Western que muestra el grado de degradación de HER2, o la falta de la misma, 2 horas, 6 horas y 24 horas después de la incubación de células BT-474 con muestras de anticuerpo. Se usó GAPDH como control. Las muestras de anticuerpo sometidas a prueba fueron: (carril 1) anticuerpo de control R347, (carril 2) trastuzumab, (carril 3) pertuzumab, (carril 4) trastuzumab y pertuzumab, (carril 5) 39S, (carril 6) trastuzumab y 39S, (carril 7) pertuzumab y 39S, (carril 8) trastuzumab, pertuzumab y 39S, (carril 9) Bs2Ab-39SH, (carril 10) Bs2Ab-39SH_aFuc (Bs2Ab-39SH afucosilado de manera homogénea), (carril 11) Bs3Ab-39SH, (carril 12) Bs3Ab-39SH_aFuc (Bs3Ab-39SH_aFuc afucosilado de manera homogénea), (carril 13) Bs4Ab-39SH, y (carril 14) Bs4Ab-39SH_aFuc (Bs4Ab-39SH afucosilado de manera homogénea).
La figura 15 es una representación de dibujo detallada de ADC a modo de ejemplo derivados de los constructos anti-HER2 Bs2Ab-39SH (panel A), Bs3Ab-39SH (panel B) y Bs4Ab-39SH (panel C). Dos posibles sitios de conjugación con agente citotóxico modificados mediante ingeniería en los dominios c H2 y CH3 de los constructos de ADC se indican mediante círculos. Cuando la razón de fármaco con respecto a anticuerpo (DAR) deseada es de 2 a 1 puede usarse o bien el sitio 1 o bien el sitio 2. Cuando es deseable un DAR de 4 se utilizan ambos sitios 1 y 2. Pueden modificarse mediante ingeniería sitios alternativos y/o adicionales. Los ADC anti-HER2 biespecíficos se abrevian en la presente como "Bs2Ab-2T", "Bs3Ab-2T" y "Bs4Ab-2T" (o simplemente como "Bs2-2T", "Bs3-2T" y "Bs4-2T") para los ADC que tienen una DAR de ~2 y como "Bs2Ab-4T", "Bs3Ab-4T" y "Bs4Ab-4T" (o simplemente como "Bs2-4T", "Bs3-4T" y "Bs4-4T") para los ADC que tienen una DAR de ~4. Los constructos específicos que carecen de cualquier agente citotóxico se denominan mediante las designaciones proporcionadas en la figura 7 y pueden identificarse como "desarmados". Tal como se proporciona en la presente (véase, p. ej., la figura 8) los sitios de conjugado modificados mediante ingeniería pueden seleccionarse para reducir o suprimir las funciones de ADCC. Alternativa o adicionalmente, la parte Fc del anticuerpo puede comprender además mutaciones adicionales que reducen o suprimen la actividad ADCC. Alternativamente, puede generarse un ADC usando un método de conjugación clásico tal como conjugación con anticuerpos a través de los residuos lisina a menudo numerosos o residuos cisteína nativos de un anticuerpo, generando una mezcla de conjugado de anticuerpo-fármaco heterogénea.
La figura 16A presenta imágenes de inmunofluorescencia de células SKOV-3 tratadas con 1 |jg/ml del anticuerpo indicado en cada imagen, que muestran la perturbación de la red de microtúbulos intracelular o la falta de la misma. Se muestra la tinción de los microtúbulos. Se sometieron a prueba las siguientes muestras: control de medios sin ningún anticuerpo (imagen i), anticuerpo de control R347 (imagen ii), trastuzumab (imagen iii), Bs2Ab-39SH (imagen iv), R347-DM1 (anticuerpo de control R347 conjugado con el agente citotóxico maitansinoide DM1) (imagen v), R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas del agente citotóxico tubulisina) (imagen vi), T-DM1 (trastuzumab conjugado con maitansinoide DM1) (imagen vii), y Bs2-4T (Bs2Ab-39SH conjugado con 4 moléculas del agente citotóxico tubulisina) (imagen viii).
La figura 16B presenta imágenes de inmunofluorescencia de células JIMT-1 tratadas con 1 jg/m l del anticuerpo indicado en cada imagen, que muestran la perturbación de la red de microtúbulos intracelular o la falta de la misma. Se muestra la tinción de los microtúbulos. Se sometieron a prueba las siguientes muestras: control de medios sin ningún anticuerpo (imagen i), anticuerpo de control R347 (imagen ii), trastuzumab (imagen iii), Bs2Ab-39SH (imagen iv), R347-DM1 (anticuerpo de control R347 conjugado con el agente citotóxico maitansinoide DM1) (imagen v), R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas del agente citotóxico tubulisina) (imagen vi), T-DM1 (trastuzumab conjugado con maitansinoide DM1) (imagen vii), y Bs2-4T (Bs2Ab-39SH conjugado con 4 moléculas del agente citotóxico tubulisina) (imagen viii).
La figura 16C presenta imágenes de inmunofluorescencia de células RT-112 tratadas con 1 jg/m l del anticuerpo indicado en cada imagen, que muestran la perturbación de la red de microtúbulos intracelular o la falta de la misma. Se muestra la tinción de los microtúbulos. Se sometieron a prueba las siguientes muestras: control de medios sin ningún anticuerpo (imagen i), anticuerpo de control R347 (imagen ii), trastuzumab (imagen iii), Bs2Ab-39SH (imagen iv), R347-DM1 (anticuerpo de control R347 conjugado con el agente citotóxico maitansinoide DM1) (imagen v), R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas del agente citotóxico tubulisina) (imagen vi), T-DM1 (trastuzumab conjugado con maitansinoide DM1) (imagen vii), y Bs2-4T (Bs2Ab-39SH conjugado con 4 moléculas del agente citotóxico tubulisina) (imagen viii).
La figura 17A muestra la actividad citotóxica del formato de Bs2Ab con una DAR de 2 ó 4 en relación con T-DM1, Bs2Ab-39SH no conjugado (desarmado) y trastuzumab en la línea celular de cáncer de mama humano SKBR-3. También se muestran las curvas para R347 (anticuerpo de control R347), R347 conjugado con 2 ó 4 tubulisinas (R347-2T y R3474T respectivamente) R347 conjugado con DM1. Tanto Bs2-2T como Bs2-4T son más potentes que T-DM1.
La figura 17B muestra la actividad citotóxica del formato de Bs4Ab con una DAR de 2 ó 4 (panel B) en relación con T-DM1, Bs4Ab-39SH no conjugado (desarmado) y trastuzumab en la línea celular de cáncer de mama humano SKBR-3. También se muestran las curvas para R347 (anticuerpo de control R347), R347 conjugado con 2 ó 4 tubulisinas (R347-2T y R3474T respectivamente) r 347 conjugado con DM1. Tanto Bs4-2T como Bs4-4t son más potentes que T-DM1.
La figura 18A muestra la actividad citotóxica del formato de Bs2Ab con una DAR de 2 ó 4 en relación con T-DM1, Bs2Ab-39SH no conjugado (desarmado) y trastuzumab en la línea celular de cáncer de mama humano JIMT-1. También se muestran las curvas para R347 (anticuerpo de control R347), R347 conjugado con 2 ó 4 tubulisinas (R347-2T y R3474T respectivamente) R347 conjugado con DM1. Tanto Bs2-2T como Bs2-4T son muy potentes en la destrucción de células JIMT-1, mientras que T-DM1 no muestra actividad.
La figura 18B muestra la actividad citotóxica del formato de Bs4Ab con una DAR de 2 ó 4 (panel B) en relación con T-DM1, Bs4Ab-39SH no conjugado (desarmado) y trastuzumab en la línea celular de cáncer de mama humano JIMT-1. También se muestran las curvas para R347 (anticuerpo de control R347), R347 conjugado con 2 ó 4 tubulisinas (R347-2T y R3474T respectivamente) R347 conjugado con DM1. Tanto Bs4-2T como Bs4-4T son muy potentes en la destrucción de células JIMT-1, mientras que T-DM1 no muestra actividad.
La figura 19A muestra la actividad citotóxica del formato de Bs2Ab con una DAR de 2 ó 4 en relación con T-DM1, Bs2Ab-39SH no conjugado (desarmado) y trastuzumab en la línea celular de cáncer de mama humano ZR-75-1. También se muestran las curvas para R347 (anticuerpo de control R347), R347 conjugado con 2 ó 4 tubulisinas (R347-2T y R3474T respectivamente) R347 conjugado con DM1. Bs2-4T es el más activo en la destrucción de células ZR-75-1, mientras que Bs2-2T tiene un menor nivel de actividad y T-DM1 no muestra actividad o muestra actividad citotóxica limitada.
La figura 19B muestra la actividad citotóxica del formato de Bs4Ab con una DAR de 2 ó 4 (panel B) en relación con T-DM1, Bs4Ab-39SH no conjugado (desarmado) y trastuzumab en la línea celular de cáncer de mama humano ZR-75-1. También se muestran las curvas para R347 (anticuerpo de control R347), R347 conjugado con 2 ó 4 tubulisinas (R347-2T y R3474T respectivamente) r 347 conjugado con DM1. Bs4-4T es el más activo en la destrucción de células ZR-75-1, mientras que Bs4-2T tiene un menor nivel de actividad y T-DM1 no muestra actividad o muestra actividad citotóxica limitada.
La figura 20 muestra la actividad citotóxica del formato de Bs2Ab con una DAR de 2 ó 4 (panel A) en relación con T-DM1, Bs2Ab-39SH no conjugado (desarmado) y trastuzumab en la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-468. También se muestran las curvas para R347 (anticuerpo de control R347), R347 conjugado con 2 ó 4 tubulisinas (R347-2T y R3474T respectivamente) R347 conjugado con DM1. Los datos indican que ni Bs2-2T ni Bs2-4T es activo en células MDA-MB-468, lo que indica que la actividad citotóxica de Bs2-2T y Bs2-4T depende de la diana (HER2). Se observaron resultados similares con Bs4-2T y Bs4-4T (no se muestran los datos).
La figura 21A muestra la actividad de ADC anti-HER2 en el modelo tumoral MDA-MB-361. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral correspondientes a ratones tratados con (1) control de vehículo, (2) R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas de tubulisina) at 3 mg/kg, (3) T-DM1 (trastuzumab-DM1 ADC) a 3 mg/kg, (4) mezcla de Bs2 (constructo Bs2Ab-39SH-(FCC) mezclado con tubulisina) a 3 mg/kg, y (5) Bs2-4T (constructo Bs2Ab-39SH-(FCC) conjugado con 4 tubulisinas) a 0.3, 1 y 3 mg/kg. Las concentraciones se indican entre paréntesis.
La figura 21B muestra la actividad de ADC anti-HER2 en el modelo tumoral MDA-MB-361. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral correspondientes a ratones tratados con (1) control de vehículo, (2) R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas de tubulisina) a 3 mg/kg, (3) T-DM1 (trastuzumab-DM1 ADC) a 3 mg/kg, (4) mezcla de Bs4 (constructo Bs4Ab-39SH-(FCC) mezclado con tubulisina) a 3 mg/kg, y (5) Bs4-4T (Bs4Ab-39SH-(FCC) conjugado con 4 tubulisinas) a 0.3, 1 y 3 mg/kg. Las concentraciones se indican entre paréntesis.
La figura 22 muestra la actividad de ADC anti-HER2 en el modelo tumoral de PDX triple negativo ST996 (ER-/PR-/HER2-1+). Se muestran las curvas de crecimiento tumoral correspondientes a ratones tratados con (1) control de vehículo (CTRL), (2) CTRL de isotipo R347-2T (anticuerpo de control R347 conjugado con 2 moléculas de tubulisina), (3) CTRL de isotipo R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas de tubulisina), (4) T-DM1 (trastuzumab-DM1 ADC), (5) mezcla (constructo mezclado con tubulisina), (6) Bs2-2T, es decir, constructo Bs2Ab-39SH-(FCC) conjugado con 2 tubulisinas, o (7) Bs2-4T, es decir, constructo Bs2Ab-39SH-(FCC) conjugado con 4 tubulisinas. Las concentraciones se indican entre paréntesis. El momento de la dosificación también se indica mediante flechas. Se presentan curvas de crecimiento tumoral en respuesta a los diversos tratamientos como el volumen tumoral medio (mm3) ± E.E.M.
La figura 23 muestra la actividad de ADC anti-HER2 en el modelo tumoral de PDX con BrCa ST225 (HER2-3+). Se muestran las curvas de crecimiento tumoral correspondientes a ratones tratados con (1) control de vehículo, (2) R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas de tubulisina), (3) T-DM1 (trastuzumab-DM1 ADC), (4) mezcla de BS2 (constructo Bs2Ab-39SH-(FCC) mezclado con tubulisina), y (5) constructo Bs2-4T (Bs2Ab-39SH-(FCC) conjugado con 4 tubulisinas. Las concentraciones se indican entre paréntesis.
La figura 24 muestra la actividad de ADC anti-HER2 en el modelo tumoral de CBX con BrCa JIMT-1 que no responde a T-DM-1 (HER2-3+). Se muestran las curvas de crecimiento tumoral correspondientes a ratones tratados con (1) control de vehículo, (2) R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas de tubulisina), (3) T-DM1 (trastuzumab-DM1 ADC), (4) mezcla de BS2 (constructo Bs2Ab-39SH-(FCC) mezclado con tubulisina), y (5) constructo Bs2-4T (Bs2Ab-39SH-(FCC) conjugado con 4 tubulisinas. Las concentraciones se indican entre paréntesis.
La figura 25 muestra la actividad de ADC anti-HER2 en el modelo tumoral de PDX con BrCa triple negativo ST455B (ER-/PR-/HER2-1+). Se muestran las curvas de crecimiento tumoral correspondientes a ratones tratados con (1) control de vehículo (CTRL), (2) CTRL de isotipo (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas de tubulisina), (3) T-DM1 (trastuzumab-DM1 Ad C), (4) mezcla de BS2 (constructo Bs2Ab-39SH-(FCC) mezclado con tubulisina), y (5) constructo Bs2-4T (Bs2Ab-39SH-(FCC) conjugado con 4 tubulisinas. Las concentraciones se indican entre paréntesis.
La figura 26A muestra la actividad citotóxica de Bs2-4T y T-DM1 en una línea celular parental NCI-N87 (panel izquierdo) y una línea celular NCI-N87 con resistencia adquirida a T-DM1 (panel derecho). Bs2-4T tiene la actividad más potente en la línea celular parental y todavía es activo en la destrucción de las células resistentes a T-DM1.
La figura 26B muestra la actividad de ADC anti-HER2 en el modelo tumoral NCI-N87 resistente a T-DM1. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral correspondientes a ratones sin tratar y ratones tratados con (1) mezcla (constructo mezclado con tubulisina), (2) T-DM1 (trastuzumab-DM1 ADC), (3) T-DM1 (trastuzumab-DM1 A d C) más pertuzumab, o (4) Bs2-4T, es decir, constructo Bs2Ab-39SH-(FCC) conjugado con 4 tubulisinas. Las concentraciones se indican entre paréntesis. Se presentan curvas de crecimiento tumoral en respuesta a los diversos tratamientos como el volumen tumoral medio (mm3) ± E.E.M. (n=7). *P < 0.001 mediante la prueba de la t de Student en comparación con el grupo control sin tratar.
La figura 27 muestra la actividad de ADC anti-HER2 después del pretratamiento con trastuzumab. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral correspondientes a ratones tratados con (1) CTRL de vehículo (control), (2) trastuzumab seguido por Bs2-4T, (3) vehículo seguido por Bs2-4T, (4) trastuzumab seguido por Bs2-4T, o (5) vehículo seguido por Bs2-4T. Las concentraciones y los regímenes de dosificación se indican entre paréntesis. Se presentan curvas de crecimiento tumoral en respuesta a los diversos tratamientos como el volumen tumoral medio (mm3) /- E.E.M. (n=10).
La figura 28A muestra un esquema para un ensayo para evaluar el efecto de vecindad de los ADC biespecíficos.
La figura 28B muestra resultados de análisis mediante FACS de células tratadas con (i) medios solos; (ii) control de R347-T4; (iii) T-DM1; (iv) mezcla de Bs2Ab-39SH; y (v) Bs2-4T. La reducción en los números celulares en ambos cuadrantes indica que Bs2-4T puede destruir tanto células que expresan HER2 como nulas para HER2 en un co-cultivo, sugiriendo que Bs2-4T tiene efecto de vecindad. En cambio, T-DM1 no puede destruir células nulas para HER2 en un co­ cultivo, sugiriendo que no tiene efecto de vecindad.
La figura 29 muestra la actividad de Bs2-4T sobre la formación de esferas de células madre cancerosas (CSC) (panel izquierdo) en relación con T-DM1 y R347-4T (anticuerpo de control R347 conjugado con 4 moléculas de tubulisina); y sobre CSC en tumores de xenografía (panel derecho) en relación con R34-4T (anticuerpo de control R234 conjugado con 4 moléculas de tubulisina).
La figura 30A muestra ensayos de proliferación dependiente de ligando usando la línea celular MDA-MB-361 (adenocarcinoma epitelial de mama ductal humano derivado de metástasis cerebral), que mostraron que todos los anticuerpos biespecíficos afucosilados potenciados para ADCC retienen la actividad antiproliferativa in vitro. En cada experimento, las muestras de anticuerpo usadas fueron: control de R347, 39S más trastuzumab, Bs2Ab-39SH_aFuc, Bs3Ab-39SH_aFuc, y Bs4Ab-39SH_aFuc.
La figura 30B muestra ensayos de proliferación dependiente de ligando usando la línea celular MCF-7 (adenocarcinoma epitelial de mama ductal humano), que mostraron que todos los anticuerpos biespecíficos afucosilados potenciados para ADCC retienen la actividad antiproliferativa in vitro. En cada experimento, las muestras de anticuerpo usadas fueron: control de R347, 39S más trastuzumab, Bs2Ab-39SH_aFuc, Bs3Ab-39SH_aFuc, y Bs4Ab-39SH_aFuc.
La figura 31A muestra ensayos de citotoxicidad ADCC usando las células MDA-MB-361 como la diana y células efectoras NK modificadas mediante ingeniería (que expresan de manera estable CD16), que mostraron que cada uno de los anticuerpos biespecíficos afucosilados tiene actividad ADCC más potente en comparación con el mismo constructo que tiene glicoformas fucosiladas. Las muestras de anticuerpo usadas fueron: (1) control de R347, (2) trastuzumab, (3) trastuzumab_aFuc, (4) Bs2Ab-39SH, y (5) Bs2Ab-39SH_aFuc.
La figura 31B muestra ensayos de citotoxicidad ADCC usando las células MDA-MB-361 como la diana y células efectoras NK modificadas mediante ingeniería (que expresan de manera estable CD16), que mostraron que cada uno de los anticuerpos biespecíficos afucosilados tiene actividad ADCC más potente en comparación con el mismo constructo que tiene glicosformas fucosiladas. Las muestras de anticuerpo usadas fueron: (1) control de R347, (2) trastuzumab, (3) trastuzumab_aFuc, (4) Bs3Ab-39SH, y (5) Bs3Ab-39SH_aFuc.
La figura 31C muestra ensayos de citotoxicidad ADCC usando las células MDA-MB-361 como diana y células efectoras NK modificadas mediante ingeniería (que expresan de manera estable CD16), que mostraron que cada uno de los anticuerpos biespecíficos afucosilados tiene actividad ADCC más potente en comparación con el mismo constructo que tiene glicoformas fucosiladas. Las muestras de anticuerpo usadas fueron: (1) control de R347, (2) trastuzumab, (3) trastuzumab_aFuc, (4) Bs4Ab-39SH, y (5) Bs4Ab-39SH_aFuc.
La figura 32 muestra la estructura de la carga útil de tubulisina 1508. El doble enlace del grupo maleimida en el extremo derecho reacciona fácilmente con el grupo tiol que se encuentra en cisteína para formar un enlace carbono-azufre estable.
La figura 33 muestra un procedimiento de conjugación de anticuerpo-fármaco específico del sitio a modo de ejemplo, usando el constructo Bs2Ab-FCC como la plataforma derivatizable. El procedimiento comprende las etapas de (a) desocupar los extremos de las cadenas de tamaño de los aminoácidos derivatizables (p. ej., cisteínas), (b) oxidar, (c) conjugar una carga útil(p. ej, un agente citotóxico tal como tubulisina), y (d) pulir retirando los reactivos de conjugación y la carga útil que no ha reaccionado.
DIVULGACIÓN DETALLADA
La invención se refiere a un anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende dos dominios de unión a HER2 específicos para diferentes epítopos de HER2, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Más allá del alcance de la invención, la presente divulgación también proporciona un marco más genérico para proporcionar anticuerpos anti-HER2 optimizados y anticuerpos biespecíficos derivados de tales anticuerpos anti-HER2 optimizados. También se proporcionan polinucleótidos, vectores, células y composiciones farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos anti-HER2 optimizados o anticuerpos anti-HER2 biespecíficos. También se proporcionan métodos de producción de tales anticuerpos anti-HER2 optimizados o anticuerpos biespecíficos. Además, la divulgación proporciona métodos de uso de los anticuerpos anti-HER2 optimizados o anticuerpos anti-HER2 biespecíficos, por ejemplo, métodos de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita.
La presente divulgación también proporciona conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) derivados de anticuerpos anti-HER2 optimizados y anticuerpos biespecíficos derivados de tales anticuerpos anti-HER2 optimizados. También se proporcionan métodos de producción de a Dc derivados de tales anticuerpos optimizados y anticuerpos biespecíficos. También se proporcionan métodos de uso del ADC derivado de anticuerpos anti-HER2 optimizados y anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, métodos de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita. También se proporcionan métodos para tratar pacientes con cánceres resistentes a quimioterapia (p. ej., tumores en pacientes que no responden o responden escasamente a T-DM1); para tratar pacientes que presentan recidiva, son refractarios o no elegibles para que se traten con otras terapias, en particular terapias con ADC monoespecíficos (p. ej. T-DM1); o para tratar pacientes después del pretratamiento con otras terapias (p. ej. T-DM1).
En particular, la presente divulgación proporciona moléculas de unión anti-HER2 que son adecuadas para tratar cáncer que expresa bajos niveles de HER2.
Para que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, se definen en primer lugar determinados términos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
I. Definiciones
Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a composiciones o etapas de procedimiento específicas, ya que pueden variar. Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/o", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. El término “un/o” (o “una“), así como las expresiones “uno o más” y "al menos uno” pueden usarse indistintamente en la presente.
Además, “y/o” cuando se usan en la presente deben tomarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término “y/o” tal como se usa en una frase tal como "A y/o B" en la presente pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo), y "B" (solo). De modo similar, se pretende que el término "y/o", tal como se usa en una frase tal como "A, B y/o C", incluya cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
A menos que se defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente tienen el mismo significado que interpreta comúnmente un experto en la técnica a la que se refiere esta divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; el Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta divulgación.
Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican con su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxilo. Los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos, que pueden obtenerse como referencia a la memoria descriptiva como un todo. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más detalladamente como referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.
Se entiende que siempre que se describan aspectos en la presente con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan aspectos por lo demás análogos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
En la presente, se hace referencia a los aminoácidos ya sea mediante sus símbolos de tres letras conocidos habitualmente o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. De modo similar, se hace referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de una única letra aceptados habitualmente.
Los términos "HER2" y "receptor HER2" se usan indistintamente en la presente, y se refieren a la proteína ErbB2 (también denominada HER2/neu en la bibliografía). Tal como se usa en la presente, los términos pretenden incluir variantes (p. ej., variantes de corte y empalme), isoformas y homólogos de HER2 (tanto ortólogos como parálogos). En algunos aspectos, la unión de una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente a HER2 inhibe el crecimiento de células que expresan HER2 (es decir, normalmente células tumorales, y en particular células cancerosas que expresan bajos niveles de HER2) inhibiendo la formación de complejos heteroméricos entre HER2 y otros miembros de la familia de ErbB, p. ej. inhibiendo la heterodimerización con EGFR o HER3.
HER2 es una tirosina cinasa receptora y se compone de un dominio extracelular (ECD), que consiste en (i) dos dominios ricos en leucina (dominio I/L1 y dominio III/L2) responsables de la unión de ligando, y (ii) dos dominios ricos en cisteína (dominio II/CR1 y dominio IV/CR2) responsables de la dimerización de receptor; un dominio transmembrana; y un dominio de tirosina cinasa intracelular. Existen variantes de corte y empalme alternativas de HER2. Los ejemplos de variantes de corte y empalme alternativas de HER2 incluyen p100 y herstatina (dos formas solubles), así como 611-CTF, 687-CTF, 648-CTF y A16HER2. Las formas solubles de HER2 pueden interaccionar con receptores de longitud completa (p185) e inhibir la dimerización de receptor; 687-CTF es inactivo; 611-CTF y 648-CTF pueden activar varias rutas intracelulares de transducción de señales; y A16HER2 carece de los aminoácidos 634-649 en el dominio IV, lo que induce un cambio conformacional que promueve la formación de heterodímeros de HER2 activados de manera constitutiva. La parte extracelular de HER2 madura, sin la secuencia señal, corresponde a las posiciones 23-652 de la isoforma canónica 1 (véase Uniprot P04626; véase también "Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab". Cho et al., Nature 421:756-760 (2003)). El anticuerpo pertuzumab se une a un epítopo dentro del dominio II de HER2. Los anticuerpos que no se al epítopo de unión a pertuzumab dentro del dominio II incluyen trastuzumab, que se une a un epítopo dentro del dominio IV.
Los términos "inhibir”, "bloquear" y "suprimir" se usan indistintamente en la presente y se refieren a cualquier disminución estadísticamente significativa de la actividad biológica, incluyendo el bloqueo total de la actividad. Por ejemplo, "inhibición" puede referirse a una disminución de aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o el 100% de la actividad biológica. Por consiguiente, cuando los términos "inhibición" o "supresión" se aplican para describir, p. ej., un efecto sobre la fosforilación de HER2 mediada por ligando, el término se refiere a la capacidad de un anticuerpo anti-HER2 o una molécula de unión a HER2 que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo, para disminuir de manera estadísticamente significativa la fosforilación de HER2 inducida por un ligando similar a EGF, en relación con la fosforilación en una célula sin tratar (control).
La célula que expresa HER2 puede ser una célula o línea celular que se produce de manera natural (p. ej., una célula cancerosa) o puede producirse de manera recombinante introduciendo un ácido nucleico que codifica para HER2 en una célula huésped. En un aspecto, la molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o una molécula de unión a HER2 que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la fosforilación de HER2 mediada por ligando en al menos el 10%, o al menos el 20%, o al menos el 30%, o al menos el 40%, o al menos el 50%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90% o aproximadamente el 100%, tal como se determina, por ejemplo, mediante inmunotransferencia de tipo Western seguido por detección con sonda con un anticuerpo antifosfotirosina o mediante ELISA.
Los términos "supresión del crecimiento" o "inhibición del crecimiento" de una célula que expresa HER2, tal como se usa en la presente, se refieren a la capacidad de molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o una molécula de unión a HER2 que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo, para disminuir de manera estadísticamente significativa la proliferación de células que expresan HER2 en relación con la proliferación en ausencia de la molécula de unión anti-HER2. En un aspecto, la proliferación de células que expresan HER2 (p. ej., células cancerosas) puede disminuir en al menos el 10%, o al menos el 20%, o al menos el 30%, o al menos el 40%, o al menos el 50%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90% o aproximadamente el 100% cuando se ponen en contacto células con una molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o una molécula de unión a HER2 que comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo, en relación con la proliferación medida en ausencia de la molécula de unión anti-HER2 (condiciones de control). Puede medirse la proliferación celular según diversos métodos conocidos en la técnica, p. ej., mediante el recuento del número de células viables, identificando la presencia de marcadores de crecimiento, midiendo la incorporación de moléculas (p. ej., moléculas marcadas de manera radiactiva tales como 3H-timidina), midiendo el tamaño de un tumor (p. ej., en volumen o en peso), etc. En determinados aspectos, supresión del crecimiento se refiere a la reducción del número, tamaño o distribución de metástasis.
Tal como se usa en la totalidad de la presente memoria descriptiva, la frase "molécula de unión anti-HER2" se refiere, por ejemplo, a (i) anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al mismo epítopo que o se derivan del anticuerpo 1.39.1 (véase la publicación PCT n.° WO 2008/019290) dado a conocer en la presente solicitud, p. ej., el anticuerpo 39S y fragmentos de unión a antígeno del mismo, y en general moléculas que comprenden tales anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos; (ii) anticuerpos anti-HER2 y otras moléculas de unión a HER2 que se unen al mismo epítopo que o se derivan del anticuerpo 39S que incorporan restos de unión a antígeno adicionales, p. ej., anticuerpos biespecíficos; (iii) conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) que comprenden al menos una de las moléculas según (i) o (ii) conjugada con un resto citotóxico (p. ej., un agente anticancerígeno de molécula pequeña, un radionúclido, etc.), y (iv) moléculas anti-HER2 según (i) o (ii) que tienen ADCC potenciada. Tal como se usa en la presente, el término "anticuerpo 39S" se refiere a un anticuerpo monoclonal con secuencia líder optimizada derivado del anticuerpo 1.39.1 dado a conocer en la publicación PCT n.° WO 2008/019290, en el que dicho anticuerpo optimizado comprende una VH que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una VL que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
Tal como se usa en la presente, el término "tubulisina" se refiere tanto colectiva como individualmente a las tubulisinas que se producen de manera natural, y análogos y derivados de tubulisinas. Se dan a conocer ejemplos ilustrativos de tubulisinas, por ejemplo, en los documentos WO2004005326A2, WO2012019123A1, WO2009134279A1, WO2009055562A1, WO2004005327A1, US7754885, US20100240701, US7816377, US20110021568 y US20110263650 y en los ejemplos proporcionados en la presente. Ha de entenderse que tales derivados incluyen, por ejemplo, profármacos de tubulisina o tubulisinas que incluyen uno o más grupos de protección o protectores, uno o más restos de ligado.
Puede someterse a ensayo la proliferación celular usando técnicas reconocidas en la técnica que miden la tasa de división celular, y/o la fracción de células dentro de una población celular que experimenta división celular, y/o la tasa de pérdida celular de una población celular debido a diferenciación terminal o muerte celular (p. ej., incorporación de timidina).
Los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina", tal como se usan indistintamente en la presente, incluyen anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas sencillas de los mismos y combinaciones de los mismos (p. ej., anticuerpos biespecíficos).
Un anticuerpo típico comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (que se abrevia en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada (que se abrevia en la presente como CH). La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (que se abrevia en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones de VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de entramado (FW). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FW, dispuestas desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a factores o tejidos huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. Los anticuerpos a modo de ejemplo de la presente divulgación incluyen anticuerpos típicos, scFv, y combinaciones de los mismos donde, por ejemplo, un scFv está covalentemente unido (por ejemplo, mediante enlaces peptídicos o mediante un ligador químico) al extremo N-terminal de o bien la cadena pesada y/o bien la cadena ligera de un anticuerpo típico, o intercalado en la cadena pesada y/o la cadena ligera de un anticuerpo típico.
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, un polipéptido, un péptido, un hidrato de carbono, un polinucleótido, un lípido, o combinaciones de los anteriores a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en la presente, el término "anticuerpo" engloba anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), fragmento variable de cadena sencilla (scFv), scFv estabilizados con disulfuro, anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos generados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y/o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una parte de determinación antigénica de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno siempre que los anticuerpos muestren la actividad biológica deseada.
Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (p. ej. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), basándose en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada denominados alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas tales como toxinas, radioisótopos, etc. para formar ADC.
Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une, tal como HER2. En un determinado aspecto, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos santagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. De manera deseable, se reduce la actividad biológica en el 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso el 100%.
Los términos "anticuerpo anti-HER2" o "anti-HER2" se refieren a un anticuerpo que puede unirse a HER2 con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo es útil como agente terapéutico o reactivo de diagnóstico en el direccionamiento hacia HER2. El grado de unión de un anticuerpo anti-HER2 a una proteína distinta de HER2 no relacionada es menor de aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo a HER2 tal como se mide, p. ej., mediante un radioinmunoensayo (RIA), o BIACORE™ (usando HER2 recombinante como analito y anticuerpo como ligando, o viceversa), u otros ensayos de unión conocidos en la técnica. En determinados aspectos, un anticuerpo que se une a HER2 tiene una constante de disociación (Kd) de <1 |jM, <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0.1 nM, <10 pM, <1 pM o <0.1 pM.
Los términos "fragmento de unión a antígeno" se refieren a una parte de un anticuerpo intacto y se refieren a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Se conoce en la técnica que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea implicada en el reconocimiento y la unión altamente específicos de un único determinante antigénico, o epítopo. Esto es a diferencia de los anticuerpos policlonales que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos.
El término "anticuerpo monoclonal" engloba anticuerpos monoclonales tanto intactos como de longitud completa así como fragmentos de anticuerpo (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a tales anticuerpos producidos de varias maneras incluyendo, sin carácter limitante, mediante hibridoma, selección en fago, expresión recombinante y animales transgénicos (p. ej., expresión de un anticuerpo humano en un ratón transgénico).
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo derivado de una inmunoglobulina no humana (p. ej., murina), que se ha modificado por ingeniería para que contenga secuencias no humanas mínimas (p. ej., murinas). Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que se reemplazan residuos de las CDR por residuos de las c Dr de una especie no humana (p. ej., ratón, rata, conejo o hámster) que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, los residuos FW de una inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, y/o afinidad, y/o capacidad deseadas.
El anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente mediante la sustitución de residuos adicionales o bien en las regiones FW y/o bien dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, y/o afinidad, y/o capacidad de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos o tres, dominios variables que contienen todas o sustancialmente todas las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas o sustancialmente todas las regiones FW son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante o dominio (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de métodos usados para generar anticuerpos humanizados se describen en las patentes estadounidenses n.os 5,225,539 o 5,639,641.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera de anticuerpo o la región variable de la cadena pesada de anticuerpo, o bien solas o bien en combinación. Las regiones variables de las cadena pesada y ligera consisten cada en cuatro regiones FW conectadas mediante tres regiones CDR. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las regiones FW y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación de unión a antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en variabilidad de secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Además, a veces se usan combinaciones de estos dos enfoques en la técnica para determinar CDR. Generalmente se usa el sistema de numeración de Kabat cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada) (p. ej., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
Las expresiones "numeración de posición de aminoácido como en Kabat", "la posición de Kabat", y variantes gramaticales de las mismas se refieren al sistema de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FW o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción de un solo aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (p. ej., residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 de FW de cadena pesada.
TABLA 1
Bucle Kabat AcM Chothia
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34
(Numeración de Kabat)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32
(Numeración de Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56
H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102
La numeración de Kabat de residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia con numeración de Kabat "convencional". Chothia se refiere en su lugar a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El final del bucle CDR-H1 de Chothia cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del bucle (esto es porque el esquema de numeración de Kabat sitúa las inserciones en H35A y H35B; si no está presente ni 35A ni 35B, el bucle termina en 32; si sólo está presente 35A, el bucle termina en 33; si están presentes ambos 35A y 35B, el bucle termina en 34). Las regiones hipervariables de AcM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan mediante software de modelado de anticuerpos AcM de Oxford Molecular.
IMGT (ImMunoGeneTics) también proporciona un sistema de numeración para las regiones variables de inmunoglobulina, incluyendo las CDR. Véase p. ej., Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003). El sistema de numeración de IMGT se basó en una alineación de más de 5,000 secuencias, datos estructurales y caracterización de bucles hipervariables y permite una fácil comparación de las regiones variables y CDR para todas las especies. Según el esquema de numeración de IMGT VH-CDR1 está en las posiciones 26 a 35, VH-CDR2 está en las posiciones 51 a 57, VH-CDR3 está en las posiciones 93 a 102, VL-CDR1 está en las posiciones 27 a 32, VL-CDR2 está en las posiciones 50 a 52, y VL-CDR3 está en las posiciones 89 a 97.
Para todas las posiciones de aminoácido de región constante de cadena pesada comentadas en la presente invención, la numeración es según el índice EU descrito por primera vez en Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1 ):78-85, que describe la secuencia de aminoácidos de la proteína de mieloma Eu, que es la primera lgG1 humana secuenciada. El índice EU de Edelman et al. también se expone en Kabat et al., 1991 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda. Por tanto, las expresiones “índice EU tal como se expone en Kabat" o “índice EU de Kabat" y "posición ... según el índice EU tal como se expone en Kabat", y variantes gramaticales de las mismas se refieren al sistema de numeración de residuos basado en el anticuerpo IgG1 Eu humano de Edelman et al. tal como se expone en Kabat 1991.
El sistema de numeración usado para los dominios variables (tanto de cadena pesada como de cadena ligera) y secuencia de aminoácidos de región constante de cadena ligera es el expuesto en Kabat 1991.
Tal como se usa en la presente, la región Fc incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante. Por lo tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios de la región constante de inmunoglobulina de IgA, IgD e IgG y uno de los tres últimos dominios de la región constante de inmunoglobulina de IgE e IgM y la región bisagra flexible N-terminal con respecto a estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la región bisagra entre Cgamma1 (Cy1) y Cgamma2 (Cy2).
Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define habitualmente como que comprende los residuos C226 o P230 hasta su extremo carboxilo-terminal, en la que la numeración es según el índice EU tal como se expone en Kabat. Fc puede referirse a esta región aisladamente, o a esta región en el contexto de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fc.
Se han observado polimorfismos en varias posiciones diferentes dentro de regiones constantes de anticuerpo (p. ej., posiciones de Fc, incluyendo sin carácter limitante las posiciones 270, 272, 312, 315, 356 y 358 tal como se numera mediante el índice EU tal como se expone en Kabat), y por tanto pueden existir ligeras diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias en la técnica anterior. Se han caracterizado bien las formas polimórficas de inmunoglobulinas humanas. En la actualidad, se conocen 18 alotipos de Gm: G1m (1, 2, 3, 17) o G1m (un, x, f, z), G2m (23) o G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, págs. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Se contempla específicamente que los anticuerpos de la presente invención pueden incorporar cualquier alotipo, isoalotipo o haplotipo de cualquier gen de inmunoglobulina, y no se limitan al alotipo, isoalotipo o haplotipo de las secuencias proporcionadas en la presente.
El término "anticuerpo humano" significa un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano preparada usando cualquier técnica conocida en la técnica (p. ej., expresión recombinante en células en cultivos, o la expresión en animales transgénicos). Por tanto, el término anticuerpo humano también engloba un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un anticuerpo producido originariamente por un ser humano (o una variante modificada por ingeniería o derivado del mismo) pero expresado en un sistema no humano (p. ej., producido mediante síntesis química; expresado de manera recombinante en células microbianas, de mamífero o de insecto; o expresado en un sujeto animal). Por consiguiente, un anticuerpo obtenido a partir de un sujeto humano o a partir de células humanas (p. ej., hibridoma o línea celular que expresa un anticuerpo recombinante o fragmento del mismo) y expresado posteriormente en un animal, p. ej., ratones, se considera un anticuerpo humano. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos, y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada y/o ligera humana tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos cadena pesada humana y cadena ligera murina.
El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en los que la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies animales. Normalmente, la región variable de ambas cadenas ligeras y pesadas corresponde a la región variable de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos (p. ej., ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, y/o afinidad, y/o capacidad deseadas mientras que las regiones constantes son homólogas a las secuencias en anticuerpos derivados de otra especie (habitualmente ser humano) para evitar provocar una respuesta inmunitaria en esa especie.
El término "epítopo" tal como se usa en la presente se refiere a un determinante antigénico proteico que puede unirse a un anticuerpo contra HER2 o molécula de unión a HER2 dada a conocer en la presente. Los epítopos consisten habitualmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como cadenas laterales de azúcares o aminoácidos y normalmente tienen unas características estructurales tridimensionales específicas, así como también unas características de carga específicas. La parte de un anticuerpo o molécula de unión que reconoce el epítopo se denomina un parátopo. Los epítopos de antígenos proteicos se dividen en dos categorías, epítopos conformacionales y epítopos lineales, basándose en su estructura e interacción con el parátopo. Un epítopo conformacional se compone de secciones discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno. Estos epítopos interaccionan con el parátopo basándose en las características superficiales 3D y la forma o estructura terciaria del antígeno. En cambio, los epítopos lineales interaccionan con el parátopo basándose en su estructura primaria. Un epítopo lineal se forma mediante una secuencia de aminoácidos continua del antígeno.
El término "sitio de unión de anticuerpo" se refiere a una región en el antígeno (p. ej., HER2) que comprende un sitio continuo o discontinuo (es decir, un epítopo) al que se une específicamente un anticuerpo complementario. Por tanto, el sitio de unión de anticuerpo puede contener zonas adicionales en el antígeno que están más allá del epítopo y que pueden determinar propiedades tales como afinidad de unión y/o estabilidad, o afectar a propiedades tales como dimerización o actividad enzimática del antígeno. Por consiguiente, aunque dos anticuerpos se unan al mismo epítopo dentro de un antígeno, si las moléculas de anticuerpo establecen distintos contactos intermoleculares con aminoácidos fuera del epítopo, se considera que tales anticuerpos se unen a distintos sitios de unión de anticuerpo.
"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (p. ej., un anticuerpo) y su pareja de unión (p. ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede representarse generalmente mediante la constante de disociación (Kd). Puede medirse la afinidad mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad se unen generalmente al antígeno lentamente y tienden a disociarse rápidamente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen generalmente al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. En la técnica se conoce una variedad de métodos de medición de la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente divulgación.
La "potencia" se expresa normalmente como un valor de CI50, en nM a menos que se establezca de otro modo. CI50 es la mediana de la concentración inhibidora de una molécula de unión a antígeno. En ensayos funcionales, CI50 es la concentración que reduce una respuesta biológica en el 50% de su máximo. En estudios de unión de ligando, CI50 es la concentración que reduce la unión a receptor en el 50% del nivel de unión específico máximo. Puede calcularse la CI50 mediante cualquiera de varios medios conocidos en la técnica. Puede determinarse una mejora en la potencia midiendo, p. ej., frente al anticuerpo parental 39S.
Las veces de mejora en la potencia para la molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (por ejemplo, en comparación con el anticuerpo parental 39S, trastuzumab, o combinaciones de los mismos) pueden ser de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 110 veces, al menos aproximadamente 120 veces, al menos aproximadamente 130 veces, al menos aproximadamente 140 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 160 veces, al menos aproximadamente 170 veces, o al menos aproximadamente 180 veces o más.
"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que inmunoglobulinas secretadas unidas sobre receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (p. ej., linfocitos citotóxicos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Anticuerpos IgG de alta afinidad específicos dirigidos a la superficie de células diana "arman" las células citotóxicas y se requieren absolutamente para tal destrucción. La lisis de la célula diana es extracelular, requiere contacto intercelular directo y no implica al complemento. Se contempla que, además de anticuerpos, otras proteínas que comprenden regiones Fc, específicamente proteínas de fusión de Fc, que tienen la capacidad para unirse específicamente a una célula diana que porta antígeno podrán afectar a la citotoxicidad mediada por células. Por simplicidad, la citotoxicidad mediada por células que resulta de la actividad de una proteína de fusión de Fc también se denomina en la presente actividad Ad Cc .
Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está "aislado" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está en una forma no unida en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados incluyen los que se han purificado en un grado que no están ya en una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunos aspectos, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está aislado es sustancialmente puro.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (p. ej., un mamífero), incluyendo, sin carácter limitante seres humanos, primates no humanos, roedores, y similares, que va a ser el receptor de un tratamiento particular. Normalmente, Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en la presente en referencia a un sujeto humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma como para permitir que la actividad biológica del principio activo (p. ej., una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente) sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administrará la composición. Tal composición puede ser estéril.
Una "cantidad eficaz" de una molécula de unión anti-HER2 tal como se da a conocer en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un fin establecido específicamente. Puede determinarse una "cantidad eficaz" empíricamente y de manera rutinaria, en relación con el fin establecido.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o un trastorno en un sujeto o mamífero.
El término "marcador" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o una composición detectable que está conjugado directa o indirectamente con una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente de modo que se genera una molécula de unión anti-HER2 “marcada”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (p. ej., marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o una composición de sustrato que es detectable.
Los términos tales como "grupo derivatizable" y "grupo funcional derivatizable" se usan indistintamente y se refieren a un grupo funcional que puede reaccionar para permitir la formación de un enlace covalente entre una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (p. ej., un anticuerpo contra HER2) y otra sustancia. En algunos aspectos, tal sustancia es un resto terapéutico (p. ej., una citotoxina), un marcador detectable, un polímero (p. ej., PEG), etc. Los grupos derivatizables a modo de ejemplo incluyen tiol, hidroxilo, amino, carboxilo y amida, así como formas modificadas del mismo, tal como formas activadas o protegidas.
Términos tales como "que trata" o "tratamiento" o "tratar" o "que alivia" o "aliviar" se refieren tanto a (1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas de y/o detienen la progresión de un trastorno o estado patológico diagnosticado y (2) medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o retrasan el desarrollo de un trastorno o estado patológico seleccionado como diana. Por tanto, los que necesitan el tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno; los propensos a tener el trastorno; y aquéllos en los que va a prevenirse el trastorno. En determinados aspectos, un sujeto se “trata” satisfactoriamente para cáncer según los métodos de la presente divulgación si el paciente muestra, p. ej., remisión total, parcial o transitoria de un determinado tipo de cáncer.
Los términos "cáncer", "tumor", "canceroso" y "maligno" se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen pero no se limitan a, carcinoma incluyendo adenocarcinomas, linfomas, blastomas, melanomas, sarcomas y leucemias. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer de páncreas, glioblastoma, glioma, cáncer cervicouterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado tal como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama (incluyendo cáncer de mama mediado de manera hormonal, véase, p. ej., Innes et al. (2006) Br. J. Cancer 94:1057-1065), cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, mieloma (tal como mieloma múltiple), carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón tal como carcinoma de células renales y tumores de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer de esófago, diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello y cánceres de orígenes mucinosos, tales como, cáncer de ovario mucinoso, colangiocarcinoma (hígado) y carcinoma papilar renal. En algunos aspectos, el término cáncer tal como se usa en la presente se refiere específicamente a cáncer que expresa HER2. En algunos aspectos específicos, el término cáncer se refiere a cánceres con bajos niveles de expresión de HER2.
Un "bajo nivel de HER2" tal como se usa en la presente, se refiere a una célula cancerosa, sujeto o paciente que presenta una puntuación de menos de 2+ (p. ej., 1+) cuando se usa una clasificación HercepTest® (DakoCytomation California Inc., Carpenteria, CA) o un cáncer, célula cancerosa, sujeto o paciente que se ha identificado como tal, por ejemplo, mediante FISH.
Para determinar la expresión de HER2 en el cáncer, están disponibles diversos ensayos de diagnóstico/pronóstico. En un aspecto, puede analizarse la sobreexpresión de HER2 mediante IHC, p. ej., mediante el uso de HercepTest® (Dako). Pueden someterse secciones de tejido incrustadas en parafina de una biopsia tumoral al ensayo IHC y acordarse un criterio de intensidad de tinción de proteína HER2 tal como sigue / Alternativa, o adicionalmente, pueden llevarse a cabo ensayos FISH tales como INFORM™ (vendido por Ventana, Ariz.) o PATHVISION™ (Vysis, Ill.) en tejido tumoral fijado con formalina, incrustado en parafina para determinar la extensión (si la hubiera) de la sobreexpresión de HER2 en el tumor.
"Bajo" es un término que se refiere a una medida que es menor de lo normal, menor que un nivel convencional tal como una medida predeterminada o una medida de subgrupo que es relativamente menor que otra medida de subgrupo. Por ejemplo, HER2 bajo significa una medida de HER2 que es menor que una medida de HER2 normal en un conjunto particular de muestras de pacientes que es positivo para HER2. Puede determinarse una medida de HER2 normal según cualquier método disponible para un experto en la técnica. HER2 bajo también puede significar una medida de HER2 que es menor que una medida predeterminada, tal como un punto de corte predeterminado. HER2 bajo también puede significar una medida en la que un subgrupo de HER2 bajo es relativamente menor que otro subgrupo. Por ejemplo, sin limitación, según la presente memoria descriptiva, pueden crearse dos subgrupos de pacientes distintos dividiendo las muestras alrededor de un punto determinado matemáticamente, tal como, sin limitación, una mediana, creando por tanto un grupo cuya medida es baja (es decir, menor que la mediana) con respecto a otro grupo cuya medida es alta. Puede medirse HER2 mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica tal como, por ejemplo, sin limitación, usando el método de eTag o usando cualquier método IHC convencional tal como HercepTest®. Como otro ejemplo, bajo nivel de HER2 se refiere a un bajo nivel de homodímeros de HER2, lo que significa una medida de homodímeros de HER2 que es menor que una medida normal de homodímeros de HER2 en un conjunto particular de muestras o pacientes que es positivo para HER2. Bajo nivel de homodímeros de HER2 también puede significar una medida que es menor que una medida predeterminada, tal como un punto de corte predeterminado. Bajo nivel de homodímeros de HER2 también puede significar una medida en la que un subgrupo de homodímeros de HER2 bajo es relativamente menor que otro subgrupo. Pueden medirse los homodímeros de HER2 mediante cualquier método conocido en la técnica tal como transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), ensayo de ligamiento de proximidad (PLA), anticuerpos específicos de dímero o eTag o cualquier otro método que conozca bien un experto en la técnica.
Tal como se usa en la presente, el término "carcinomas" se refiere a cánceres de células epiteliales, que son células que cubren la superficie del cuerpo, producen hormonas y constituyen las glándulas. Los ejemplos de carcinomas son cánceres de piel, pulmón, colon, estómago, mama, próstata y tiroides.
"Polinucleótido" o "ácido nucleico", tal como se usan indistintamente en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en la presente, incluyendo ARN y ADN.
El término "vector" significa un constructo, que puede suministrar, y en algunos aspectos, que expresa, uno o más gen(es) o secuencia(s) de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ARN o ADN desnudo, plásmido, vectores de cósmido o fago, vectores de expresión de ARN o ADN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ARN o ADN encapsulados en liposomas, y determinadas células eucariotas, tales como células productoras.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por elementos distintos a aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. También están incluidos dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, dado que los polipéptidos de la presente divulgación se basan en anticuerpos, en determinados aspectos, los polipéptidos pueden aparece como cadenas sencillas o cadenas asociadas.
Un polipéptido o una proteína "recombinante" se refiere a un polipéptido o una proteína producido por tecnología de ADN recombinante. Los polipéptidos y las proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped modificadas por ingeniería se consideran aislados para los fines de la invención, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada. Los polipéptidos dados a conocer en la presente pueden producirse de manera recombinante usando métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, las proteínas y los péptidos dados a conocer en la presente pueden sintetizarse químicamente.
A menos que se especifique de otro modo, el término "sustituido" tal como se usa en la presente en el contexto de modificaciones de la estructura química de los agentes citotóxicos, es decir tubulisinas pertenece a un grupo parental que porta uno o más sustituyentes. El término "sustituyente" se usa en la presente en el sentido convencional y se refiere a un resto químico que está unido covalentemente a, o si es apropiado, fusionado a, un grupo parental. Se conoce una amplia variedad de sustituyentes, y también se conocen bien métodos para su formación e introducción en una variedad de grupos parentales. Se describen ejemplos de sustituyentes químicos en más detalle a continuación.
La expresión "opcionalmente sustituido" tal como se usa en la presente en el contexto de modificaciones de la estructura química de agentes citotóxicos, se refiere a un grupo parental que puede no estar sustituido o que puede estar sustituido.
Los términos "sustituido", "sustitución de aminoácido" y similares tal como se usan en la presente en el contexto de polipéptidos se refieren a reemplazar un residuo de aminoácido presente en un polipéptido parental por otro residuo de aminoácido. Puede sustituirse un aminoácido en un polipéptido parental, por ejemplo, mediante síntesis química de péptidos o a través de métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente, las referencias a una "sustitución en la posición X" o "sustitución en la posición X" se refieren a la sustitución de un aminoácido presente en la posición X por un residuo de aminoácido alternativo. En algunos aspectos, pueden describirse los patrones de sustitución según el esquema AXY, en el que A es el código de una sola letra correspondiente al aminoácido presente de manera natural en la posición X, e Y es el residuo de aminoácido de sustitución. Por consiguiente, L234F se referirá a la sustitución del aminoácido leucina (L) en la posición 234 por una fenilalanina (F). En otros aspectos, pueden describirse los patrones de sustitución según el esquema XY, en el que Y es el código de una sola letra correspondiente al residuo de aminoácido que sustituye al aminoácido presente de manera natural en la posición X. Por consiguiente, 239C se referirá a la sustitución del aminoácido nativo en la posición 239 por una cisteína (C).
Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, si un aminoácido en un polipéptido se reemplaza por otro aminoácido de la misma familia de cadenas laterales, se considera que la sustitución es conservativa. En otro aspecto, una hilera de aminoácidos puede reemplazarse de manera conservativa por una hilera estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composición de miembros de la familia de cadenas laterales.
Las sustituciones de aminoácido no conservativas incluyen aquellas en las que (i) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva (p. ej., Arg, His o Lys) se sustituye por, o mediante, un residuo electronegativo (p. ej., Glu o Asp), (ii) un residuo hidrófilo (p. ej., Ser o Thr) se sustituye por, o mediante, un residuo hidrófobo (p. ej., Ala, Leu, Ile, Phe o Val), (iii) una cisteína o prolina se sustituye por, o mediante, cualquier otro residuo, o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa hidrófoba o aromática (p. ej., Val, His, Ile o Trp) se sustituye por, o mediante, una que tiene una cadena lateral más pequeña (p. ej., Ala, Ser) o sin cadena lateral (p. ej., Gly).
Otras sustituciones de aminoácido pueden identificarse fácilmente por expertos habituales en la técnica. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, puede tomarse una sustitución de una cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para lisina, un reemplazo puede ser una cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina. Generalmente, sustituciones en regiones funcionalmente importantes que puede esperarse que induzcan cambios en las propiedades de polipéptidos aislados son aquellas en las que (i) un residuo polar, p. ej., serina o treonina, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrófobo, p. ej., leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un residuo de cisteína se sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisina, arginina o histidina, se sustituye por (o mediante) un residuo que tiene una cadena lateral electronegativa, p. ej., ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, se sustituye por (o mediante) una que no tiene tal cadena lateral, p. ej., glicina. La probabilidad de que una de las sustituciones no conservativas anteriores pueda alterar las propiedades funcionales de la proteína también se correlaciona con la posición de la sustitución con respecto a regiones funcionalmente importantes de la proteína: por consiguiente, algunas sustituciones no conservativas pueden tener poco o ningún efecto sobre las propiedades biológicas.
El término "inserción de aminoácido" se refiere a introducir un nuevo residuo de aminoácido entre dos residuos de aminoácido presentes en la secuencia parental. Puede insertarse un aminoácido en una secuencia parental, por ejemplo, mediante síntesis química de péptidos o a través de métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente tal como se usa en la presente, las expresiones "inserción entre las posiciones X e Y" o "inserción entre las posiciones de Kabat X e Y", en las que X e Y corresponden a las posiciones de aminoácido (p. ej., una inserción de aminoácido cisteína entre las posiciones 239 y 240), se refiere a la inserción de un aminoácido entre las posiciones X e Y, y también a la inserción en una secuencia de ácido nucleico de un codón que codifica para un aminoácido entre los codones que codifican para los aminoácidos en las posiciones X e Y. Pueden describirse los patrones de inserción según el esquema AXins, en el que A es el código de una sola letra correspondiente al aminoácido que se inserta, y X es la posición que precede a la inserción. Por consiguiente, C239ins se referirá a la inserción de un aminoácido cisteína (C) después de la posición 239 (es decir, una inserción entre la posición 239 y 240).
El término "porcentaje de identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptido o polinucleótido se refiere al número de posiciones coincidentes idénticas compartidas por las secuencias a lo largo de una ventana de comparación, teniendo en cuenta adiciones o deleciones (es decir, huecos) que deben introducirse para la alineación óptima de las dos secuencias. Una posición coincidente es cualquier posición donde se presenta un nucleótido o aminoácido idéntico tanto en la secuencia diana como de referencia. Los huecos presentados en la secuencia diana no se cuentan puesto que los huecos no son nucleótidos o aminoácidos. Asimismo, los huecos presentados en la secuencia de referencia no se cuentan puesto que se cuentan los nucleótidos o aminoácidos de la secuencia diana , no los nucleótidos o aminoácidos de la secuencia de referencia.
El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones en las que el residuo de aminoácido o base de ácido nucleico idéntico aparece en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias puede lograrse usando software fácilmente disponible tanto para uso en línea como para descarga. Están disponibles programas de software adecuados de diversas fuentes, y para la alineación de secuencias tanto de proteína como de nucleótidos. Un programa adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es bl2seq, parte del paquete BLAST de programa disponible a partir del sitio web de BLAST del Centro Nacional para Información Biotecnológica del gobierno de los EE.UU. (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias usando el algoritmo o bien BLASTN o bien BLASTP. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Otros programas adecuados son, p. ej., Needle, Stretcher, Water o Matcher, parte del paquete EMBOSS de programas bioinformáticos y también disponibles del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) en www.ebi.ac.uk/Tools/psa.
Diferentes regiones dentro de una única secuencia diana de polinucleótido o polipéptido que se alinea con una secuencia de referencia de polinucleótido o polipéptido pueden tener cada una su propio porcentaje de identidad de secuencia. Se indica que el valor de porcentaje de identidad de secuencia se redondea a la décima más próxima. Por ejemplo, 80.11, 80.12, 80.13 y 80.14 se redondean a la baja a 80.1, mientras que 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 y 80.19 se redondean al alza a 80.2. También se indica que el valor de longitud siempre será un número entero.
En determinados aspectos, el porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos con una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z), donde Y es el número de residuos de aminoácido puntuados como coincidencias idénticas en la alineación de la primera y la segunda secuencias (tal como se alinean mediante inspección visual o un programa de alineación de secuencias particular) y Z es el número total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la de la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia con la segunda secuencia será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia con la primera secuencia.
Un experto en la técnica apreciará que la generación de una alineación de secuencias para el cálculo de un porcentaje de identidad de secuencia no se limita a comparaciones binarias secuencia-secuencia dirigidas exclusivamente por datos de secuencia primaria. Las alineaciones de secuencias pueden derivarse de alineaciones de secuencias múltiples. Un programa adecuado para generar alineaciones de secuencias múltiples es ClustalW2, disponible de www.clustal.org. Otro programa adecuado es MUSCLE, disponible de www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 y MUSCLE están disponibles alternativamente, p. ej., del EBI.
Se apreciará también que pueden generarse alineaciones de secuencias mediante la integración de datos de secuencia con datos de fuentes heterogéneas tales como datos estructurales (p. ej., estructuras cristalográficas de proteínas), datos funcionales (p. ej., ubicación de mutaciones) o datos filogenéticos. Un programa adecuado que integra datos heterogéneos para generar una alineación de secuencias múltiples es T-Coffee, disponible en www.tcoffee.org, y disponible alternativamente, p. ej., del EBI. Se apreciará también que la alineación final usada para calcular el porcentaje de identidad de secuencia puede calcularse o bien automática o bien manualmente.
II. Moléculas de unión anti-HER2
La presente divulgación proporciona moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos anti-HER2 o moléculas que comprenden fragmentos de unión a HER2 de los mismos, que se unen específicamente a HER2.
Las secuencias de aminoácidos (aa) y nucleótidos (nt) de longitud completa para HER2 se conocen en la técnica (véase, p. ej., UniProt Acc. n.° P04626 para HEr 2 humana). Véase, p. ej., Yamamoto etal., Nature 319:230-234 (1986); Coussens et al., Science 230:1132-1139 (1985); Tal et al., Mol. Cell. Biol. 7:2597-2601 (1987); Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:6497-6501 (1985); King et al., Science 229:974-976 (1985); Sarkar et al., ADN Cell Biol. 12:611-615 (1993); Giri et al., Mol. Cell. Biol. 25:11005-11018 (2005); Anido et al., EMBO J. 25:3234-3244 (2006); Birrane et al., J. Biol. Chem.
278:1399-1402 (2003); Ivancic et al., J. Biomol. NMR 27:205-219 (2003); Cho et al., Nature 421:756-760 (2003); Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004); Bostrom et al., Science 323:1610-1614 (2009); Figenbrot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:15039-15044 (2010); Stefens et al., Nature 431:525-526 (2004); Greenman et al., Nature 446:153-158 (2007).
En determinados aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos aspectos, las moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos anti-HER2 o moléculas que comprenden fragmentos de unión a HER2 de los mismos, comprenden un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fd, un Fv de cadena sencilla, scFv, scFv estabilizado con disulfuro, un Fv unido con disulfuro, un dominio V-NAR, un IgNar, un intracuerpo, un IgGACH2, un minicuerpo, un F(ab')3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de un solo dominio, DVD-Ig, Fcab, mAb2, un (scFv)2 o un scFv-Fc. En algunos aspectos, el anticuerpo es del tipo IgG, por ejemplo del tipo IgG1.
En algunos aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 son monoespecíficas. En otros aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 son biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas, etc. En otros aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 son multiespecíficas. En algunos aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 son monovalentes, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, etc. En aún otros aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 son multivalentes. En aspectos específicos, las moléculas de unión anti-HER2 son bivalentes, p. ej., un anticuerpo que comprende dos sitios de unión a antígeno específicos de HER2. En aspectos específicos, las moléculas de unión anti-HER2 son biespecíficas, es decir, la molécula puede unirse específicamente a dos antígenos diferentes (p. ej., dos epítopos diferentes en las mismas moléculas o diferentes). En algunos aspectos específicos, las moléculas de unión anti-HER2 son bivalentes y tetravalentes, p. ej., un anticuerpo que comprende cuatro sitios de unión a antígeno que pueden unirse a dos antígenos diferentes (p. ej., dos epítopos diferentes en las mismas moléculas o diferentes).
En determinados aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 comprenden anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen un sitio de unión que es sustancialmente el mismo que el sitio de unión del anticuerpo 1.39.1 (véase la publicación PCT n.° WO 2008/019290). En un aspecto específico, las moléculas de unión anti-HER2 comprenden anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a uno o más residuos de aminoácido de SEQ ID NO: 52. En determinados aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 comprenden anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen un sitio de unión que se solapa con el sitio de unión del anticuerpo 1.39.1.
En determinados aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 comprenden anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden una VH y/o una VL que se han modificado en comparación con la VH (SEQ ID NO: 43) y/o la VL (SEQ ID NO: 44) del anticuerpo parental 1.39.1 (véase la publicación PCT n.° WO 2008/019290). Las modificaciones introducidas en el anticuerpo parental pueden incluir mutaciones (p. ej., mutaciones puntuales o el reemplazo de toda una subsecuencia) en las regiones c Dr y/o en las regiones FW de la Vh y la VL en comparación con el anticuerpo parental 1.39.1.
En algunos aspectos, la VH-CDR1 (SEQ ID NO: 45) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una VH-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, VH-CDR1 (SEQ ID NO: 45) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una VH-CDR1 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En otros aspectos, VH-CDR3 (SEQ ID NO: 46) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una VH-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otros aspectos, VH-CDR3 (SEQ ID NO: 46) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una VH-CDR3 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En algunos aspectos, VH-CDR1 (SEQ ID NO: 45) y VH-CDR3 (SEQ ID NO: 46) del anticuerpo parental 1.39.1 se han reemplazado por una VH-CDR1 y una VH-CDR3 que comprenden o que consisten en los aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y los aminoácidos de SEQ ID NO: 3, respectivamente.
En algunos aspectos, la VL-CDR1 (SEQ ID NO: 47) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una VL-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunos aspectos, VL-CDR1 (SEQ ID NO: 3) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una VH-CDR1 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En algunos aspectos, la región FW1 de VL (SEQ ID NO: 48) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una FW1 de VL que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En algunos aspectos, la región FW1 de VL (SEQ ID NO: 48) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una FW1 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En otros aspectos, la región FW2 de VL (SEQ ID NO: 49) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una FW2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En otros aspectos, la región FW2 de VL (SEQ ID NO: 49) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una FW2 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En otros aspectos, la región FW3 de VL (SEQ ID NO: 50) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una FW3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En otros aspectos, la región FW3 de VL (SEQ ID NO: 50) del anticuerpo parental 1.39.1 se ha reemplazado por una FW2 de VL que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
En algunos aspectos, la región FW1 (SEQ ID NO: 48) y/o la región FW2 (SEQ ID NO: 49) y/o la región FW3 de VL(SEQ ID NO: 50) del anticuerpo parental 1.39.1 se han reemplazado por una FW1 y/o una FW2 y/o una FW3 que independientemente comprenden o consisten en los aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 12 ó 13, respectivamente.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula de unión anti-HER2 que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL), en la que la VH comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 15. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula de unión anti-HER2 que comprende una VH y una VL, en la que la VL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En algunos aspectos, la VH comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y la VL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En algún aspecto, una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a HER2 del mismo.
En determinados aspectos, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación comprende una cadena pesada (VH) de inmunoglobulina y una cadena ligera (VL) de inmunoglobulina, en la que la molécula de unión comprende:
(i) VH-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
(ii) VH-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
(iii) VH-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 3;
(iv) VL-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
(v) VL-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y,
(vi) VL-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En determinados aspectos, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) comprende una VL de anticuerpo y una VH de anticuerpo, en la que la VL comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% a una VL de referencia que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En determinados aspectos, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) comprende una VL de anticuerpo y una VH de anticuerpo, en la que la VH comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% a una VH de referencia que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
En otros aspectos, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) comprende una VL que comprende una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% a una VL de referencia que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y comprende además una VH que comprende una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% a una VH de referencia que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
En algunos aspectos, la molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) comprende una región constante de cadena pesada o fragmento de la misma. En algunos aspectos específicos, la región constante de cadena pesada es una región constante de IgG. La región constante de IgG puede comprender una región constante de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en una región constante kappa y una región constante lambda.
En determinados aspectos, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) puede unirse a HER2 con sustancialmente la misma o mejor afinidad que el anticuerpo parental 1.39.1. Por tanto, en un aspecto, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) se une específicamente a HER2 y fragmentos antigénicos de la misma con una constante de disociación o kd (koff/kon) menor de 10-6 M, o menor de 10-7 M, o menor de 10-8 M, o menor de 10-9 M, o menor de 10-10 M, o menor de 10-11 M, o menor de 10-12 M, o menor de 10-13 M.
En otro aspecto, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) se une a HER2 y/o fragmentos antigénicos de la misma con una koff menor de 1*10-3 s-1, o menor de 2*10-3 s-1. En otros aspectos, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) se une a HER2 y fragmentos antigénicos de la misma con una koff menor de 10-3 s-1, menor de 5*10-3 s-1, menor de 10-4 s-1, menor de 5*10-4 s-1, menor de 10-5 s-1, menor de 5*10-5 s-1, menor de 10-6 s-1, menor de 5*10-6 s-1, menor de 5*10-7 s-1, menor de 10-8 s-1, menor de 5*10-8 s-1, menor de 10-9 s-1, menor de 5*10-9 s-1, o menor de 10-10 s-1.
En otro aspecto, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a HER2 del mismo, o un anticuerpo anti-HER2 biespecífico) se une a HER2 y/o fragmentos antigénicos de la misma con una constante de velocidad de asociación o velocidad kon de al menos 105 M-1 s-1, al menos 5*105 M-1 s-1, al menos 106 M-1 s-1, al menos 5*106 M-1 s-1, al menos 107 M-1 s-1, al menos 5*107 M-1 s-1, o al menos 108 M-1 s-1, o al menos 109 M-1 s-1.
En otros aspectos, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser similares en el 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% a las secuencias expuestas anteriormente, y comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más sustituciones conservativas. Una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente que tiene regiones VH y VL que tienen alta similitud (es decir, del 80% o mayor) con la región VH de SEQ ID NO: 16 y/o la región VL de SEQ ID NO: 15, respectivamente, puede obtenerse mediante mutagénesis (p. ej., mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de sus respectivas moléculas de ácido nucleico codificantes, seguido por pruebas del anticuerpo alterado para determinar la función conservada usando los ensayos funcionales descritos en la presente.
La afinidad y/o avidez de una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente por un antígeno puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado bien conocido en la técnica, p. ej., citometría de flujo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA), o cinética (p. ej., análisis mediante BIACORE™). También pueden emplearse fácilmente ensayos de unión directa así como formatos de ensayo de unión competitiva. Véase, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions", En Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman y Company: Nueva York, N.Y. (1992); y métodos descritos en la presente.
La afinidad medida de la interacción de una molécula de unión anti-HER2 particular dada a conocer en la presente con un antígeno de HER2 puede variar si se mide en diferentes condiciones (p. ej., concentración de sal, pH, temperatura). Por tanto, se realizan mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno (p. ej., Kd o Kd, kon, koff) con disoluciones normalizadas de molécula de unión anti-HER2 y antígeno, y un tampón normalizado, tal como se conoce en la técnica y tal como el tampón descrito en la presente.
También se conoce en la técnica que las afinidades medidas usando análisis mediante BIACORE™ pueden variar dependiendo de cuál de los reactivos se une al chip. A este respecto, puede medirse la afinidad usando un formato en el que el que el direccionamiento de la molécula de unión anti-HER2 se inmoviliza sobre el chip (denominado formato de "IgG abajo") o usando un formato en el que la proteína diana (p. ej., HER2) se inmoviliza sobre el chip (denominado, p. ej., formato "HER2 abajo").
MI. Moléculas de unión anti-HER2 biespecíficas
La presente divulgación también proporciona anticuerpos anti-HER2 biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en los que:
(i) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos sitios de unión del anticuerpo contra HER2;
(ii) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a un primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 que comprende un epítopo dentro del dominio II de HER2; y,
(iii) el primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es distinto del sitio de unión del anticuerpo de pertuzumab.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a un sitio de unión del anticuerpo contra HER2 que comprende un epítopo dentro del dominio II de HER2. En algunos aspectos, el primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es idéntico al sitio de unión del anticuerpo contra HER2 de los anticuerpos 1.39.1 ó 39S. En algunos aspectos, el primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 se solapa parcialmente con el sitio de unión del anticuerpo contra HER2 de los anticuerpos 1.39.1 ó 39S. En otros aspectos, el primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es distinto del sitio de unión del anticuerpo contra HER de los anticuerpos 1.39.1 ó 39S.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a un segundo sitio de unión del anticuerpo contra HER2 que comprende un epítopo dentro del dominio IV de HER2. En algunos aspectos, el segundo sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es idéntico al sitio de unión del anticuerpo contra HER2 de trastuzumab. En algunos aspectos, el segundo sitio de unión del anticuerpo contra HER2 se solapa parcialmente con el sitio de unión del anticuerpo contra HER2 de trastuzumab. En otros aspectos, el segundo sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es distinto del sitio de unión del anticuerpo contra HER de trastuzumab.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que (i) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos sitios de unión del anticuerpo contra HER2, (ii) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a un primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 que comprende un epítopo dentro del dominio II de HER2 y es distinto del sitio de unión del anticuerpo de pertuzumab, y (iii) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina compite con HERCEPTIN® por la unión al dominio IV de HER2.
La presente divulgación también proporciona moléculas anti-HER2 biespecíficas que se unen al mismo epítopo que o se derivan de las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer anteriormente (es decir, anticuerpos con secuencia líder optimizada derivados del anticuerpo parental 1.39.1, por ejemplo, el anticuerpo 39S). En algunos aspectos, tales moléculas anti-HER2 biespecíficas son anticuerpos anti-HER2 biespecíficos y moléculas derivadas de tales anticuerpos biespecíficos. En algunos aspectos, tales moléculas derivadas de las moléculas anti-HER2 biespecíficas descritas en la presente son conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). En determinados aspectos, los ADC proporcionados en la presente tienen actividad ADCC reducida. En algunos aspectos, tales moléculas derivadas de las moléculas anti-HER2 biespecíficas descritas en la presente tienen actividad ADCC potenciada.
La presente divulgación también proporciona un anticuerpo contra HER biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina en el que (i) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2; y (ii) en el que el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina une HER2 a uno o más residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 52. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a HER2 en un epítopo dentro del dominio IV. En otros aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina une HER2 a uno o más residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 53.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-HER2 biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en los que el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una región variable (VH) de cadena pesada (HC) y una región variable (VL) de cadena ligera (LC) que comprende:
(i) una secuencia de CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 1 o idéntica a SEQ ID NO: 1 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(ii) una secuencia de CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 2 o idéntica a SEQ ID NO: 2 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iii) una secuencia de CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 3 o idéntica a SEQ ID NO: 3 exceptuando hasta 1,2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iv) una secuencia de CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(v) una secuencia de CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y,
(vi) una secuencia de CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
en los que el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv; y, en los que el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende al menos una región de entramado (FW) de dominio variable heteróloga diferente en relación con las regiones FW de un dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina que comprende una VH que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una VL que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende (i) una región de entramado de cadena ligera variable 1 (VL-FW1) que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (ii) una región de entramado de cadena ligera variable 2 (VL-FW2) que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (iii) una región de entramado de cadena ligera variable VL 3 (VL-FW3) que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (iv) una región de entramado de cadena ligera variable 4 (VL-FW4) que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o (v) cualquier combinación de las mismas.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo contra HER2 biespecífico comprende (i) una VL-FW1 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (ii) una VL-FW2 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (iii) una VL-FW3 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (iv) una VL-FW4 que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o (v) cualquier combinación de las mismas.
En otros aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que:
(i) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una VH y una VL, en el que la VH comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 43;
(ii) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv; y,
(iii) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En otros aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que:
(i) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una VH y una VL, en el que la VH consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 43;
(ii) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv; y,
(iii) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que:
(i) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una VH y una VL, en el que la VL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 44;
(ii) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv; y, (iii) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que:
(i) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una VH y una VL, en el que la VL consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 44;
(ii) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv; y, (iii) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que:
(i) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una VH y una VL, en el que la VL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 44, y la VH comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o Se Q ID NO: 45;
(ii) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv; y, (iii) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que:
(i) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una VH y una VL, en el que la VL consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 44, y la VH consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 43;
(ii) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv; y, (iii) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende o consiste en:
(a) una VH que comprende además una región constante de cadena pesada o un fragmento de la misma, y una VL que comprende una región constante de cadena ligera (LC) o un fragmento de la misma;
(b) un Fv de cadena sencilla ("scFv");
(c) un diacuerpo;
(d) un minicuerpo;
(e) un F(ab')2; o
(f) un F(ab).
En algunos aspectos, la región constante de cadena pesada o fragmento de la misma del anticuerpo anti-HER2 biespecífico es una región constante de IgG. En algunos aspectos, la región constante de IgG o fragmento de la misma es una región constante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En aspectos específicos, la región constante de IgG es una región constante de IgG1. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende una VL que comprende una región constante de cadena ligera (LC), en el que la región constante de LC es una región constante kappa. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende una VL que comprende una región constante de cadena ligera (LC), en el que la región constante de LC es una región constante lambda.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico es, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo de afinidad optimizada. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico es, por ejemplo, un anticuerpo humano. En algunos aspectos, el anticuerpo humano se expresa en un ratón transgénico (véase, por ejemplo, Bruggemann, "Human antibody expression in transgenic mice, "Arch. Immunol. Therap. Exper. 49: 203-208, 2001).
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico no compite con trastuzumab o pertuzumab por la unión a epítopos. En algunos aspectos, el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico se unen específicamente a distintos epítopos de HER2. En algunos aspectos, los distintos epítopos de HER2 son no solapantes.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico (i) se une específicamente al mismo epítopo de HER2 que el anticuerpo trastuzumab; y/o (ii) inhibe competitivamente la unión a HER2 por el anticuerpo trastuzumab; y/o (iii) comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) que comprenden los aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 54 a 59.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un scFv. En algunos aspectos específicos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende un scFv estabilizado con disulfuro (ds-scFv). En algunos aspectos, el scFv estabilizado con disulfuro se une específicamente al mismo epítopo de HER2 que el anticuerpo trastuzumab.
Puede modificarse mediante ingeniería un disulfuro estabilizante entre las regiones VH y VL de un scFv introduciendo sustituciones de cisteína en posiciones seleccionadas de manera que los residuos de cisteína puedan formar un enlace disulfuro. En particular, puede introducirse un disulfuro de este tipo en las regiones de entramado de manera que las regiones VL y VH se unen mediante un enlace disulfuro. La posición de residuos representantes pero no limitantes en las regiones VH y VL que cumplen estos criterios se proporcionan en la tabla 2.
TABLA 2: Pares VH-VLJ
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$ La numeración en la tabla 2 es según el índice de Kabat tal como se expone en Kabat. Se entenderá que el residuo de aminoácidos de tipo natural en estas posiciones variará. Independientemente del residuo de aminoácido de tipo natural cada posición de un par dado se sustituirá por una cisteína.
El scFv dado a conocer en la presente puede obtenerse a partir de o producirse por cualquier fuente adecuada, ya sea natural o no, o puede ser un scFv recombinante, un scFv sintético, un scFv semisintético, un scFv derivatizado, un scFv optimizado para fermentación, una proteína de fusión o equivalentes, mutantes y derivados de los mismos siempre que conserven la especificidad de unión requerida de los scFv de la presente divulgación. Estos incluyen un scFv con especificidad de unión que tiene sustituciones de aminoácido o tiene azúcares u otras moléculas unidas a grupos funcionales de aminoácidos. El término "derivado" o "derivatizado" tal como se usa en la presente con respecto a un scFv incluye la modificación química de un scFv. Serían ilustrativas de tales modificaciones el reemplazo de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina es un scFv que comprende:
(i) una VH-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 54;
(ii) una VH-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
(iii) una VH-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 56;
(iv) una VL-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 57;
(v) una VL-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 58; y,
(vi) una VL-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico consiste en un scFv que se une específicamente al mismo epítopo de HER2 que el anticuerpo trastuzumab y comprende VH y VL derivadas de la VH y la VL del anticuerpo trastuzumab (p. ej., la VH y/o VL nativas presentes en el anticuerpo trastuzumab, o VH y/o VL mutantes con mutaciones estabilizantes, p. ej., los pares de mutaciones mostradas en la tabla 2). Véase Goldenger, Clin. Ther. 21:309-18 (1999). Por consiguiente, en algunos aspectos, el scFv que se une al mismo epítopo que trastuzumab comprende una VH que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 17, y una VL que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En algunos aspectos, el scFv que se une a mismo epítopo que trastuzumab comprende una VH que consiste en los aminoácidos SEQ ID NO: 17, y una VL que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En algunos aspectos específicos, la VH y la VL del scFv que se une a mismo epítopo que trastuzumab están covalentemente unidas mediante un ligador peptídico. En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunos aspectos, el ligador peptídico consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
Tal como se comentó anteriormente, un experto en la técnica apreciará que los scFv que se unen al mismo epítopo que trastuzumab incluyen secuencias derivadas de trastuzumab, que comprenden por ejemplo secuencias mutantes en las que al menos un aminoácido se ha deleccionado o sustituido con respecto a una secuencia parental en el anticuerpo trastuzumab, siempre que la molécula resultante pueda unirse específicamente al mismo epítopo de HER2 que el anticuerpo trastuzumab, p. ej., mutaciones diseñadas para introducir al menos un disulfuro estabilizante entre la VH y la VL del scFv.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico está covalentemente unido al extremo carboxi-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende al menos un ligador interpuesto entre el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y el extremo carboxi-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos específicos, un ligador está interpuesto entre el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y el extremo carboxi-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina está covalentemente unido al extremo amino-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende al menos un ligador interpuesto entre el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y el extremo amino-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En aspectos específicos, un ligador está interpuesto entre el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y el extremo amino-terminal de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico está covalentemente intercalado en la secuencia de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico está covalentemente intercalado entre la región CH1 y la región CH2 de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, uno o más ligadores conectan el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del anticuerpo anti-HER2 biespecífico con la región CH1 y/o la región CH2 de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina.
En algunos aspectos específicos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende (i) un ligador interpuesto entre la región CH1 de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina; y (ii) un segundo ligador interpuesto entre el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y la región CH2 de la HC del primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el primer ligador y el segundo ligador son idénticos. En algunos aspectos, el primer ligador y el segundo ligador son diferentes. En algunos aspectos, uno o más de los ligadores comprenden un ligador peptídico. En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25 o al menos 30 aminoácidos. En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende más de 20 aminoácidos. En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende un péptido que tiene la fórmula Serx[(Gly)y-Seu]z donde x es desde 0 hasta 1, y es desde 1 hasta 4, y z es desde 1 hasta 10 (SEQ ID NO:60). En algunos aspectos, el ligador peptídico comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 19, 20, 21 ó 22.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende una cadena pesada que comprende una región constante que comprende un dominio Fc. En algunos aspectos, el dominio Fc comprende una región CH2 y/o una región CH3, y/o fragmentos de las mismas. En algunos aspectos específicos, el dominio Fc comprende una región CH2 y una región CH3. En algunos aspectos, el dominio Fc consiste en una región CH2 y una región CH3. En algunos aspectos, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, por ejemplo, un dominio Fc de una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunos aspectos, el dominio Fc de IgG es un dominio Fc de IgG humano o humanizado. En algunos aspectos, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1.
En algunos aspectos, el dominio Fc de IgG, por ejemplo un dominio Fc de IgG1, es un dominio nativo (de tipo natural). En algunos aspectos, el dominio Fc de IgG1 nativo comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos, el dominio Fc de IgG1 nativo consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos, el dominio Fc es un dominio de IgG nativo, por ejemplo, un dominio de IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 mutante. En algunos aspectos específicos, el dominio Fc mutante es un dominio Fc de IgG1 mutante.
En algunos aspectos, el dominio de IgG mutante, por ejemplo, un dominio Fc de IgG1 humano o humanizado, comprende al menos una mutación que puede reducir la actividad ADCC del anticuerpo anti-HER2 biespecífico. En determinados aspectos, al menos una mutación que puede reducir la actividad ADCC del anticuerpo anti-HER2 biespecífico es una sustitución de aminoácido. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico con actividad ADCC reducida comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada de L234F, S239C, S239A, una inserción de aminoácido cisteína entre las posiciones 239 y 240, o cualquier combinación de las mismas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat. Se conocen en la técnica numerosas mutaciones que pueden reducir la actividad ADCC de un anticuerpo. Por ejemplo, véanse las mutaciones descritas en los documentos WO2012175751, WO2011149999, WO2011066501, WO2000042072, WO2011120134. Los anticuerpos con función efectora ADCC reducida también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 de la región Fc (patente estadounidense n.° 6,737,056), en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat. Tales mutantes de Fc también incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fc con sustitución de los residuos 265 y 297 a alanina (patente estadounidense n.° 7,332,581, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat).
En algunos aspectos, el dominio de IgG mutante, por ejemplo, un dominio Fc de IgG1 humano o humanizado, comprende al menos una mutación que puede potenciar la actividad ADCC del anticuerpo anti-HER2 biespecífico. En determinados aspectos, al menos una mutación que puede potenciar la actividad ADCC del anticuerpo anti-HER2 biespecífico es una sustitución de aminoácido. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-HER2 biespecífico con actividad ADCC potenciada comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada de S239A, S239D, A330L, I332E, E333A, K334A o cualquier combinación de las mismas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat. Los expertos en la técnica conocen mutaciones adicionales que potencian la actividad ADCC incluyendo sin carácter limitante las ejemplificadas en las tablas 2 y 6-10 del documento US 6,737,056; las tablas presentadas en la figura 41 del documento US 2006/024298; las tablas presentadas en las figuras 5, 12 y 15 del documento US 2006/235208; las tablas presentadas en las figuras 8, 9 y 10 del documento US 2006/0173170 y las tablas presentadas en las figuras 8, 9 y 10 del documento WO 09/058492.
En algunos aspectos, el dominio Fc de IgG1 mutante puede comprender al menos una sustitución de aminoácido que introduce un grupo funcional derivatizable. En algunos aspectos, el dominio Fc de IgG1 mutante comprende de una a tres sustituciones de aminoácido que introducen un grupo funcional derivatizable. En algunos aspectos, el grupo derivatizable es la cadena lateral de sulfhidrilo de un aminoácido cisteína. En aspectos particulares, el aminoácido o aminoácidos sustituidos aparecen en sitios accesibles de la molécula de unión anti-HER2. Sustituyendo esos residuos de aminoácido con cisteína, se colocan de ese modo grupos tiol reactivos en sitios accesibles de la molécula de unión anti-HER2 y pueden usarse para conjugar la molécula de unión anti-HER2 con otros restos, tales como restos de fármaco o restos de ligador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en la presente. Pueden generarse anticuerpos modificados por ingeniería en las cisteínas tal como se describe, p. ej., en la patente estadounidense n.° 7,521,541.
En algunos aspectos, el grupo derivatizable se introduce en la posición de Kabat 239, 248, 254, 258, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 435, 440, 441,442, 443 ó 446, en un aminoácido insertado entre las posiciones 239 y 240, o cualquier combinación de las mismas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat. En algunos aspectos, el aminoácido o sustitución de aminoácido que introduce un grupo sulfhidrilo derivatizable se selecciona del grupo que consiste en S239C, 248C, 254C, 258C, 273C, 279C, 282C, 284C, 286C, 287C, 289C, 297C, 298C, 312C, 324C, 326C, 330C, 335C, 337C, 339C, 350C, 355C, 356C, 359C, 360C, 361C, 375C, 383C, 384C, 389C, 398C, 400C, 413C, 415C, 418C, 422C, 435C, 440C, 441C, S442C, 443C y 446C, una inserción de aminoácido cisteína entre las posiciones 239 y 240, o cualquier combinación de las mismas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat. En algunos aspectos, el aminoácido o sustitución de aminoácido que introduce un grupo sulfhidrilo derivatizable es S239C y/o S442C.
Se conocen bien en la técnica grupos derivatizables selectivamente, tal como un grupo amino, grupo sulfhidrilo, oxiamino colgante, u otros grupos nucleófilos. Pueden unirse grupos derivatizables a una cadena polipeptídica mediante uno o más ligadores. Pueden unirse ligandos (p. ej., restos terapéuticos, marcadores detectables, polímeros que amplían la semivida, etc.) a los grupos derivatizables usando la química de unión apropiada. Esta química de acoplamiento puede incluir, por ejemplo, amida, urea, tiourea, oxima, aminoacetilamida, etc.
En algunos aspectos, el dominio Fc tiene un tipo alterado de glicosilación que potencia la actividad ADCC. La glicosilación de la región Fc puede modificarse para aumentar o disminuir la función efectora (véanse por ejemplo, Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; patentes estadounidenses n.os 6,602,684; 6,946,292; 7,064,191; 7,214,775; 7,393,683; 7,425,446; 7,504,256; publicaciones estadounidenses n.os 2003/0157108; 2003/0003097; 2009/0010921; tecnología POTELLEGENT™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación por ingeniería de glicosilación GLYCOMAB™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza)). En algunos aspectos, el dominio Fc es un dominio Fc de anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos fucosilo (véase por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.°2005/0226867). En un aspecto, estos anticuerpos con función efectora aumentada, específicamente ADCC, tal como se genera en células huésped (p. ej., células CHO, Lemna minor) modificadas por ingeniería para producir anticuerpos altamente desfucosilados con una ADCC más de 100 veces mayor en comparación con anticuerpo producido por las células parentales (p. ej., Mori et al., 2004, Biotechnol Bioeng 88:901908; Cox et al., 2006, Nat Biotechnol., 24:1591-7). En algunos aspectos, el dominio Fc tiene estructuras de GIcNAc bisecadas aumentadas (p. ej., Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; US2009/0010921).
En algunos aspectos, el dominio Fc mutante comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 24, 63, 25 o 65.
En algunos aspectos, el dominio Fc de IgG1 nativo comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 64. También se proporcionan en la presente divulgación anticuerpos anti-HER2 biespecíficos que comprenden una primera y una segunda cadenas polipeptídicas asociadas entre sí, en el que la primera cadena polipeptídica se selecciona de: (1) [TZs]-[L1]-[bVH]-[bCH]-[Fcx]
(2) [bVH]-[bCH]-[Fcx]-[L2]-[TZs]
(3) [bVH]-[bCH]-[Ls]-[TZs]-[L4]-[Fcx]
en las que
TZs es un scFv que se une al mismo epítopo reconocido por el anticuerpo trastuzumab;
Li, L2, L3, y L4 son ligadores peptídicos;
Fcx es un dominio Fc;
bVH y bCH son las regiones VH y CH1, respectivamente, de un anticuerpo que puede unirse a un epítopo de HER2 distinto del epítopo reconocido por el anticuerpo trastuzumab.
En algunos aspectos, el epítopo distinto comprende uno o más aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 52.
En algunos aspectos, el epítopo reconocido por el anticuerpo trastuzumab comprende uno o más residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 53.
En algunos aspectos, la segunda cadena polipeptídica comprende [bVL]-[CL] en la que bVL es la región VL de un anticuerpo que puede unirse a un epítopo de HER2 distinto del epítopo reconocido por el anticuerpo trastuzumab, y CL es una región constante de cadena ligera de IgG. En algunos aspectos, CL se selecciona del grupo que consiste en una región constante kappa humana y una región constante lambda humana.
En algunos aspectos, bVL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En algunos aspectos, bVL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 44. En algunos aspectos, bVL comprende:
(i) una CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(ii) una CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y,
(iii) una CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido.
En algunos aspectos específicos, CL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
En algunos aspectos específicos, CL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
En algunos aspectos, [TZs] comprende:
(i) una VH-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 54;
(ii) una VH-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
(iii) una VH-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 56;
(iv) una VL-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 57;
(v) una VL-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 58; y
(vi) una VL-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
En algunos aspectos, [TZs] es un scFv estabilizado con disulfuro. En algunos aspectos, [TZs] comprende (i) una VH que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o una variante del mismo, y (ii) una VL que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o una variante del mismo, covalentemente unidos por un ligador peptídico. Se conocen en la técnica numerosos ligadores (por ejemplo, ligadores peptídicos) adecuados para ligar los restos de VH y VL de un scFv. En algunos aspectos, el ligador es un ligador peptídico que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En otros aspectos, [TZs] comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En algunos aspectos, un polipéptido de bisagra une los [bCH] y [Fcx]. En algunos aspectos, el polipéptido de bisagra comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En algunos aspectos, el [Fcx] comprende al menos una sustitución de aminoácido que introduce un grupo derivatizable. En otros aspectos, el [Fcx] comprende una sustitución de uno a tres aminoácidos que introduce un grupo derivatizable. En aún otros aspectos, el [Fcx] comprende más de tres sustituciones de aminoácido que introducen un grupo derivatizable. En algunos aspectos, todos los grupos derivatizables son idénticos. En otros aspectos, al menos un grupo derivatizable es diferente del resto. En algunos aspectos, todos los grupos derivatizables son diferentes. En algunos aspectos, el grupo derivatizable es un grupo sulfhidrilo (p. ej., el grupo sulfhidrilo de una cisteína). En algunos aspectos, el grupo derivatizable está protegido.
En algunos aspectos, el grupo derivatizable se introduce en la posición 239, 248, 254, 258, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 435, 440, 441, 442, 443 ó 446, o entre las posiciones 239 y 240, o cualquier combinación de las mismas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat. En algunos aspectos, el grupo derivatizable es un grupo sulfhidrilo en al menos una sustitución de aminoácido cisteína que comprende S239C, 248C, 254C, 258C, 273C, 279C, 282C, 284C, 286C, 287C, 289C, 297C, 298C, 312C, 324C, 326C, 330C, 335C, 337C, 339C, 350C, 355C, 356C, 359C, 360C, 361C, 375C, 383C, 384C, 389C, 398C, 400C, 413C, 415C, 418C, 422C, 435C, 440C, 441C, S442C, 443C y 446C, una inserción de aminoácido cisteína entre las posiciones 239 y 240, o cualquier combinación de las mismas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat. En algunos aspectos, el aminoácido o sustitución de aminoácido que introduce un grupo sulfhidrilo derivatizable es S239C y/o S442C. En algunos aspectos, el aminoácido o sustitución de aminoácido que introduce un grupo sulfhidrilo derivatizable es una inserción de aminoácido cisteína entre las posiciones 239 y 240 y/o S442C.
En otros aspectos, [Fcx] comprende los aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 23, 24, 63, 25 o 65.
En otros aspectos, [Fcx] comprende los aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 23, 62 o 64.
En determinados aspectos, [Li], [L2], [L3], y [L4] comprenden los aminoácidos de secuencias de ligador seleccionadas independientemente del grupo que consiste en SEQ iD NO: 19, 20, 21 y 22. En algunos aspectos, todos los ligadores son diferentes. En algunos aspectos, al menos dos de los ligadores son idénticos. Un experto en la técnica entenderá que los ligadores pueden ser ligadores peptídicos, no peptídicos o una combinación de peptídicos y no peptídicos. En algunos aspectos específicos, (i) [L1] comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ iD NO: 20; (ii) [L2] comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (iii) [L3] comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y, (iv) [L4] comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ iD NO: 22.
En algunos aspectos, [BVH] comprende:
(i) una CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 1 o idéntica a SEQ ID NO: 1 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(ii) una CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 2 o idéntica a SEQ ID NO: 2 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y
(iii) una CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 3 o idéntica a SEQ ID NO: 3 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido.
En algunos aspectos, [bVH] comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 43.
En algunos aspectos, [bVL] comprende:
(i) una CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(ii) una CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y,
(iii) una CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido.
En algunos aspectos específicos, [bVL] comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 44. En algunos aspectos, [bCH] comprende o consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
En algunos aspectos específicos, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-HER2 biespecíficos que comprenden una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en los que (i) la primera cadena polipeptídica comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30, 31,32, 69, 33, 71,34, 35, 36, 74, 37, 76, 38, 39, 40, 79, 41 y 81, y (ii) la segunda cadena polipeptídica comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 42 o 82, en el que los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos están conjugados con un resto terapéutico.
En algunos aspectos específicos, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-HER2 biespecíficos que comprenden una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en los que (i) la primera cadena polipeptídica comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30, 67, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, y 80, y (ii) la segunda cadena polipeptídica comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 42 o 82, en el que anticuerpos anti-HER2 biespecíficos tienen actividad ADCC potenciada.
IV. Conjugados anticuerpo-fármaco (ADC)
La presente divulgación también proporciona conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) que comprenden al menos una de las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente (p. ej., anticuerpos que se unen al mismo epítopo que o se derivan del anticuerpo 39S o fragmentos de unión a HER2 del mismo, o los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) conjugados con al menos un resto terapéutico. Por consiguiente, en algunos aspectos, el ADC comprende un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente conjugado con al menos un resto terapéutico (p. ej., una citotoxina), en el que dicho anticuerpo anti-HER2 biespecífico comprende (i) un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y (ii) un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en el que el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una región variable (VH) de cadena pesada (HC) y una región variable (VL) de cadena ligera (LC) que comprende:
(i) una secuencia de CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 1 o idéntica a SEQ ID NO: 1 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(ii) una secuencia de CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 2 o idéntica a SEQ ID NO: 2 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iii) una secuencia de CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 3 o idéntica a SEQ ID NO: 3 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iv) una secuencia de CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(v) una secuencia de CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y,
(vi) una secuencia de CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
en las que:
(a) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo scFv; y,
(b) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina del ADC comprende al menos una región de entramado (FW) de dominio variable heteróloga diferente en relación con las regiones fW de un dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina que comprende una VH que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 43, y una VL que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
En algunos aspectos, el ADC comprende además al menos un espaciador opcional que puede estar intercalado entre la cadena lateral de un aminoácido en una cadena polipeptídica de la molécula de unión anti-HER2 (por ejemplo, un grupo amino en la cadena pesada de un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente) y el resto terapéutico. En algunos aspectos, el al menos un espaciador es un espaciador peptídico. En otros aspectos, el al menos un espaciador es un espaciador no peptídico. En algunos aspectos, el espaciador es inestable, tal como un espaciador lábil en medio ácido (p. ej., una hidracina). En otros aspectos, el espaciador es un péptido escindible por enzimas, p. ej., un dipéptido escindible. En algunos aspectos, el espaciador no puede escindirse (es hidrolíticamente estable), por ejemplo, un espaciador de tioéter o un espaciador de disulfuro impedido. En algunos aspectos, el grupo intercalado entre la cadena lateral de un aminoácido en una cadena polipeptídica de la molécula de unión anti-HER2 (por ejemplo, un grupo amino en la cadena pesada de un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente) y el resto terapéutico adicional es MCC (N-succinimidil-4(maleimidometil)ciclohexano)).
Los espaciadores hidrolíticamente estables son sustancialmente estables en agua no reaccionan a valores de pH útiles, incluyendo sin carácter limitante, en condiciones fisiológicas durante un periodo de tiempo prolongado. Los espaciadores hidrolíticamente inestables o degradables son degradables en agua o en disoluciones acuosas, incluyendo por ejemplo, sangre.
Los espaciadores enzimáticamente inestables o degradables pueden degradarse por una o más enzimas. A modo de ejemplo únicamente, PEG y polímeros relacionados pueden incluir espaciadores degradables en la estructura principal de polímero o en el grupo ligador entre la estructura principal de polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula de polímero. Tales espaciadores degradables incluyen, pero no se limitan a, uniones éster formadas por la reacción de ácidos carboxílicos-PEG o ácidos carboxílicos-PEG activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo, en el que tales grupos éster hidrolizan generalmente en condiciones fisiológicas para liberar el agente biológicamente activo. Otros espaciadores hidrolíticamente degradables incluyen pero no se limitan a uniones carbonato; uniones imina que resultan de la reacción de un amina y un aldehído; uniones éster de fosfato formadas haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; uniones hidrazona que son un producto de reacción de una hidracida y un aldehído; uniones acetal que son el producto de reacción de un aldehído y un alcohol; uniones ortoéster que son el producto de reacción de un formiato y un alcohol; uniones peptídicas formadas por un grupo amina, incluyendo sin carácter limitante, en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y uniones de oligonucleótidos formadas por un grupo fosforamidita, incluyendo sin carácter limitante, en el extremo de un polímero, y un grupo 5'-hidroxilo de un oligonucleótido.
En algunos aspectos, el ADC comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez restos terapéuticos. En algunos aspectos específicos, el ADC comprende dos, tres o cuatro restos terapéuticos. En algunos aspectos, todos los restos terapéuticos son el mismo. En algunos aspectos, al menos un resto terapéutico es diferente del resto. En algunos aspectos, todos los restos terapéuticos son diferentes. En algunos aspectos, todos los espaciadores (p. ej., espaciadores peptídicos y/o no peptídicos) son el mismo. En algunos aspectos, al menos un espaciador es diferente del resto. En todavía otros aspectos, todos los espaciadores son diferentes.
En algunos aspectos, cada resto terapéutico está químicamente conjugado con la cadena lateral de un aminoácido en una posición específica en la región Fc de la molécula de unión anti-HER2 (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente).
En algunos aspectos, las posiciones específicas en la región Fc se seleccionan del grupo que consiste en 239, 248, 254, 258, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 435, 440, 441,442, 443, 446, una inserción entre las posiciones 239 y 240, y combinaciones de las mismas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat.
En algunos aspectos, las posiciones específicas en la región Fc son 239, 442, o ambas, en las que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat. En algunos aspectos, las posiciones específicas en la región Fc consisten en 442 y una inserción de aminoácido entre las posiciones 239 y 240, en las que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat.
En algunos aspectos, la cadena lateral de aminoácido donde el resto terapéutico está conjugado es una cadena lateral de sulfhidrilo, por ejemplo, el grupo sulfhidrilo de un aminoácido cisteína. En algunos aspectos, al menos un resto terapéutico está químicamente conjugado con la cadena lateral de un aminoácido situado en una posición fuera de la región Fc de la molécula de unión anti-HER2 (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente). En algunos aspectos, todos los restos terapéuticos están químicamente conjugados con la cadena lateral de un aminoácido situado en una posición fuera de la región Fc de la molécula de unión anti-HER2 (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente). En algunos aspectos, al menos un resto terapéutico se incorpora genéticamente en la cadena polipeptídica de la molécula de unión anti-HER2 (p. ej., un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente) usando técnicas recombinantes conocidas en la técnica.
En algunos aspectos, el resto terapéutico comprende una citotoxina, un radioisótopo, un radioisótopo, un inmunomodulador, una citocina, una linfocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, un factor de necrosis tumoral, una hormona, un antagonista hormonal, una enzima, un oligonucleótido, un ADN, un ARN, un ARNip, un iARN, un microARN, un agente terapéutico fotoactivo, un agente anti-angiogénico, un agente proapoptótico, un péptido, un lípido, un hidrato de carbono, un agente quelante o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos específicos, la citotoxina es una auristatina, una tubulisina, un maitansinoide o una pirrolobenzodiazepina (PBD). En otro aspecto específico, la citotoxina es tubulisina 1508.
En aspectos específicos, el ADC comprende un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente, en el que dicho anticuerpo comprende:
(i) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína en la posición 239, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(ii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a aminoácidos cisteína situados respectivamente en las posiciones 239 y 442 en las que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(iii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína en la posición 239, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(iv) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a aminoácidos cisteína situados respectivamente en las posiciones 239 y 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(v) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína en la posición 239, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat; o,
(vi) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a aminoácidos cisteína situados respectivamente en las posiciones 239 y 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat.
En aspectos específicos, el ADC comprende un anticuerpo anti-HER2 biespecífico dado a conocer en la presente, en el que dicho anticuerpo comprende:
(i) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO:62 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(ii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 71 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(iii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(iv) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 76 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina MEDI 1508) covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(v) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat; o,
(vi) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 81 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat.
Las moléculas de ADC dadas a conocer en la presente comprenden al menos una de las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente (p. ej., anticuerpos que se unen al mismo epítopo que o se derivan del anticuerpo 39S o fragmentos de unión a HER2 del mismo, o los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) que se han derivatizado o ligado (p. ej., químicamente o de manera recombinante) a otra molécula (p. ej., un péptido, molécula de fármaco pequeña, molécula detectable, etc.). En general, los anticuerpos anti-HER2 o partes de los mismos se derivatizan de manera que su unión a HER2 no se ve afectada adversamente por la derivatización o el marcaje. Por consiguiente, los anticuerpos anti-HER2 y partes de anticuerpo de la presente divulgación pretenden incluir formas tanto intactas como modificadas de las moléculas de unión anti-HER2 descritas en la presente. Por ejemplo, una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente o parte de unión a HER2 de la misma puede ligarse funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otro modo) a una o más de otras entidades moleculares, tales como un agente citotóxico, un agente farmacéutico, un agente de detección, y/o una proteína o un péptido que puede mediar en la asociación de la molécula de unión anti-HER2 con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una cola de polihistidina).
Un tipo de molécula derivatizada puede producirse mediante reticulación de dos o más entidades moleculares, p. ej., una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente y un resto terapéutico (p. ej., una citotoxina tal como tubulisina 1508). Los agentes de reticulación adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, es decir, que tienen dos grupos reactivos de manera distinta separados por un espaciador apropiado (p. ej., éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida); o homobifuncionales (p. ej., suberato de disuccinimidilo). Tales agentes de reticulación están disponibles, por ejemplo, de Pierce Chemical Company, Rockford, II. Los agentes de acoplamiento adicionales incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-acido (tal como bis(pacidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolileno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Otro tipo de molécula derivatizada puede producirse incorporando un marcador detectable. Los agentes de detección útiles incluyen compuestos fluorescentes (p. ej., fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamino-l-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantánidos y similares), enzimas que son útiles para detección (p. ej., peroxidasa del rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares), epítopos reconocidos por un indicador secundario (p. ej., secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas epitópicas, etc.). En algunos aspectos, pueden unirse marcadores detectables mediante al menos un brazo espaciador. Los brazos espaciadores pueden ser de diversas longitudes para reducir un posible impedimento estérico.
Una molécula de unión anti-HER2 también puede marcarse con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador puede usarse tanto para fines de diagnóstico como terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede usarse para detectar células que expresan HER2 mediante rayos X u otras técnicas de diagnóstico tales como tomografía de emisión de positrones (PET).
Además, el radiomarcador puede usarse terapéuticamente como una toxina para células que expresan HER2, tales como las que provocan una respuesta inmunitaria no deseada. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisótopos o radionúclidos: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I y 131I. En algunos aspectos, la molécula de unión anti-HER2 puede marcarse con un ion paramagnético, radiactivo o fluorogénico que puede detectarse mediante formación de imágenes. En algunos aspectos, el ion paramagnético es cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) o erbio (III). En otros aspectos, el ion radiactivo es yodo-123, tecnecio-99, indio-111, renio-188, renio-186, cobre-67, yodo-131, itrio-90, yodo-125, astato-211 y galio-67. En otros aspectos, la molécula de unión anti-HER2 se marca con un agente de formación de imágenes con rayos X tal como lantano (III), oro (III), plomo (II) y bismuto (III). Una molécula de unión anti-HER2 también puede derivatizarse con un grupo químico, por ejemplo un polímero tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo de hidrato de carbono. Estos grupos son útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, p. ej., para aumentar la semivida sérica o para aumentar la unión tisular.
El término "agente citotóxico" tal como se usa en la presente se define ampliamente y se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o provoca la destrucción de células (muerte celular), y/o ejerce efectos antineoplásicos/antiproliferativos. Por ejemplo, un agente citotóxico previene directa o indirectamente el desarrollo, la maduración o diseminación de células tumorales neoplásicas. El término incluye también tales agentes que provocan un efecto citostático sólo y no un mero efecto citotóxico. El término incluye agentes quimioterápicos como los especificados a continuación, así como otros antagonistas de HER2, agentes antiangiogénicos, inhibidores de tirosina cinasas, inhibidores de proteína cinasa A, miembros de la familia de citocinas, isótopos radiactivos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal.
El término "agente quimioterápico" es un subconjunto del término "agente citotóxico" que comprende compuestos químicos naturales o sintéticos. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes, por ejemplo, mostazas de nitrógeno, compuestos de etilenimina, alquilsulfonatos y otros compuestos con una acción alquilante tales como nitrosoureas, cisplatino y dacarbazina; antimetabolitos, por ejemplo, ácido fólico, antagonistas de purina o pirimidina; inhibidores mitóticos, por ejemplo, alcaloides de la Vinca y derivados de podofilotoxina; antibióticos citotóxicos y derivados de camptotecina. Otros agentes quimioterápicos son amifostina (Ethyol®), cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostaza de nitrógeno), estreptozocina, ciclofosfamida, carrnustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorubicina (Adriamycin®), doxorubicina lipo (doxil®), gemcitabina (gemzar®), daunorubicina, daunorubicina lipo (daunoXome®), procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracil (5-FU), vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), aldesleucina, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cladri bina, camptotecina, CPT-11, 10-hidroxi-7-etil-camptotecina (SN38), gefitinib (Iressa®), dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarubicina, mesna, interferón alfa, interferón beta, irinotecán, mitoxantrona, topotecán, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobroman, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, inhibidores de clorambucilo aromatasa, y combinaciones de los mismos.
IV.A Tubulisinas
En algunos aspectos, el ADC comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (p. ej., el anticuerpo 39S o un derivado del mismo, o uno de los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) conjugados con una o más moléculas de tubulisina (véase la estructura de tubulisina A y tubulisina 1508 a continuación).
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Tubulisina 1508 (compuesto T32)
Las tubulisinas son miembros de una clase de productos naturales aislados de especies mixobacterianas (Sasse et al., J. Antibiot. 53:879-885 (2000)). Como agentes de interacción con el citoesqueleto, las tubulisinas son venenos mitóticos que inhiben la polimerización de tubulina y conducen a la detención del ciclo celular y apoptosis (Steinmetz et al., Chem. Int. Ed. 43:4888-4892 (2004); Khalil et al., ChemBioChem. 7:678-683 (2006); Kaur et al., Biochem. J. 396: 235-242 (2006)). Las tubulisinas son moléculas citotóxicas extremadamente potentes, que superan la inhibición del crecimiento celular de cualquier agente quimioterápico tradicional clínicamente relevante, p. ej., epotilonas, paclitaxel y vinblastina. Además, son potentes frente a líneas celulares resistentes a múltiples fármacos (Domling et al., Mol. Diversity 9:141-147 (2005)). Estos compuestos muestran alta citotoxicidad sometidos a prueba frente a un panel de líneas celulares de cáncer con valores de CI50 en el intervalo picomolar bajo; por tanto, son de interés como agentes terapéuticos contra el cáncer. Véase, p. ej., el documento WO2012019123. Se dan a conocer conjugados de tubulisina, p. ej., en la patente estadounidense n.° 7,776,814.
En algunos aspectos, la molécula de tubulisina o derivado de la misma es un profármaco.
IV.B Maitansina y maitansinoides
En algunos aspectos, el ADC comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (p. ej., el anticuerpo 39S o un derivado del mismo, o uno de los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) conjugada con una o más moléculas de maitansinoide.
Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez a partir del arbusto del este de África Maytenus serrata (patente estadounidense n.° 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente estadounidense n.° 4,151,042). El maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se dan a conocer, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.
Los restos de fármaco de maitansinoide son restos de fármaco atractivos en conjugados de anticuerpo-fármaco porque son: (i) relativamente accesibles de preparar mediante fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) propicios para la derivatización con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de ligadores distintos de disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) eficaces frente a una variedad de líneas celulares tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, métodos de preparación de los mismos, y su uso terapéutico se dan a conocer, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5,208,020, 5,416,064 y la patente europea EP0425235B1; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) (inmunoconjugados descritos que comprenden un maitansinoide designado como DM1); y Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992).
Trastuzumab emtansina (ado-trastuzumab emtansina, T-DM1, nombre comercial Kadcyla®) es un conjugado anticuerpofármaco que consiste en el anticuerpo monoclonal trastuzumab (Herceptin®) conjugado con el maitansinoide mertansina (DM1). Véase, p. ej., LoRusso et al., Clin. Cancer Res. 20:6437-47 (2011). También se ha descrito un ADC tiotrastuzumab-DM1 modificado por ingeniería en Junutual et al., Clin, Cancer Res. 16:4769-78 (2010).
Se preparan conjugados anticuerpo-maitansinoide mediante ligamiento químicamente de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica ni del anticuerpo ni de la molécula de maitansinoide. Véase, p. ej., la patente estadounidense n.° 5,208,020. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia en la potenciación de la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo potenciase la citotoxicidad con respecto al uso de anticuerpo desnudo. Se conocen bien en la técnica los maitansinoides y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse a partir de fuentes naturales. Se dan a conocer maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5,208,020.
En algunos aspectos, la molécula de maitansinoide, variante o derivado de la misma es un profármaco.
IV.C Auristatinas y dolastatinas
En algunos aspectos, el ADC comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (p. ej., el anticuerpo 39S o un derivado del mismo, o uno de los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) conjugado con dolastatinas o análogos peptídicos y derivados de dolostatinas, las auristatinas (patentes estadounidenses n.os 5,635,483; 5,780,588). Se ha mostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren en la dinámica de los microtúbulos, hidrólisis de GTP y división nuclear y celular (Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother.
45:3580-3584 (2001)) y tienen actividad anticancerígena (patente estadounidense n.° 5,663,149). El resto de fármaco de dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del extremo N (amino)-terminal o el extremo C (carboxilo)-terminal del resto de fármaco peptídico (véase, p. ej., el documento WO2002088172).
En algunos aspectos, la molécula de auristatina o dolastatina, variante o derivado de la misma es un profármaco.
IV.D Calicheamicina
En algunos aspectos, el ADC comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (p. ej., el anticuerpo 39S o un derivado del mismo, o uno de los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. Miembros de la familia de calicheamicinas de antibióticos que pueden producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones subpicomolares. Las calicheamicinas son una clase de antibióticos enodiinos derivados de la bacteria Micromonospora echinospora, siendo la calicheamicina y1 la más notable. Otras calicheamicinas son p 1 Br, y1 Br, a2I, a3I, p1I, y1I y A1I. Véase Lee et al., Journal of Antibiotics 42(7):1070-87 (1989). Para la preparación de conjugados de la familia de las calicheamicinas, véanse las patentes estadounidenses n.os 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296. Los análogos estructurales de calicheamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, yU a2I, a3I, N-acetil-Y1I, PSAG y 011 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes estadounidenses mencionadas anteriormente concedidas a American Cyanamid).
En algunos aspectos, la molécula de calicheamicina, variante o derivado de la misma es un profármaco.
IV.E Duocarmicinas
En algunos aspectos, el ADC comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (p. ej., el anticuerpo 39S o un derivado del mismo, o uno de los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) conjugado con una o más moléculas de duocarmicina. Las duocarmicinas son miembros de un serie de productos naturales relacionados aislados por primera vez a partir de bacterias Streptomyces y son potentes antibiótico antitumorales. Véase Boger. (1991). Chemtracts: Organic Chemistry 4 (5): 329-349 (1991); Tercel et al., Chem. Int. Ed. Engl. 52(21):5442-6 (2013); Boger & Douglas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(9): 3642-3649 (1995); Cacciari et al., Expert Opinion on Therapeutics Patentes 10(12):1853-71 (2000).
Las duocarmicinas naturales incluyen duocarmicina A, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA y CC-1065. Los análogos sintéticos incluyen adozelesina, bizelesina y carzelesina (U-80244).
En algunos aspectos, la molécula de duocarmicina, variante o derivado de la misma es un profármaco.
IV.F Pirrolobenzodiazepina
En algunos aspectos, el fármaco es una pirrolobenzodiazepina (PBD). Las PBD son moléculas relativamente pequeñas y algunas tienen la capacidad para reconocer y unirse covalentemente a secuencias específicas en el surco menor de ADN y por tanto presentan actividad antibiótica/antitumoral. Se conocen varias PBD y derivados de las mismas en la técnica, por ejemplo, dímeros de PBD (p. ej., SJG-136 o SG2000), dímeros de PBD insaturados C2, dímeros de pirrolobenzodiazepina que portan sustituciones de arilo C2 (p. ej., SG2285), profármaco de dímeros de PBD que se activa mediante hidrólisis (p. ej., SG2285), y polipirrol-PBD (p. ej., SG2274). Las PBD se describen además en los documentos WO 2000/012507, WO 2007/039752, WO 2005/110423, WO 2005/085251, y WO 2005/040170, y la patente estadounidense n.° 7,612,062.
IV. G Otros agentes citotóxicos
En algunos aspectos, el ADC comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (p. ej., el anticuerpo 39S o un derivado del mismo, o uno de los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) conjugados con otros agentes antitumorales, por ejemplo, BCNU, antraciclinas (p. ej., daunomicina o adriamicina), taxenos (p. ej., paclitaxel), estreptozoicina, alcaloides de la Vinca (p. ej., vincristina), 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 (véanse las patentes estadounidenses n.os 5,053,394 y 5,770,710), esperamicinas (véase la patente estadounidense n.° 5,877,296). El ADC también puede comprender una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente (p. ej., el anticuerpo 39S o un derivado del mismo, o uno de los anticuerpos anti-HER2 biespecíficos dados a conocer en la presente) conjugados toxina enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO199321232. En algunos aspectos, el agente citotóxico es un fármaco activado ligero.
V. Moléculas de unión anti-HER2 que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo 39S
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de unión anti-HER2 que se unen al/a los mismo(s) epítopo(s) que el anticuerpo 39S (p. ej., anticuerpos derivados del anticuerpo 39S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, anticuerpos anti-HER2 biespecíficos, o ADC).
Tales moléculas de unión anti-HER2 que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo 39S pueden identificarse basándose en su capacidad para dar competencia cruzada (p. ej., para inhibir competitivamente la unión, de manera estadísticamente significativa) con el anticuerpo 39S en ensayos de unión a HER2 convencionales. Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de unión anti-HER2 (p. ej., anticuerpos derivados del anticuerpo 39S o fragmentos de unión a antígeno del mismo, anticuerpos anti-HER2 biespecíficos, o ADC) que compiten por la unión a HER2 con los fragmentos de unión a antígeno de anticuerpo 39S del mismo. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de, p. ej., el anticuerpo 39S o moléculas de unión derivadas del anticuerpo 39S (p. ej., anticuerpos biespecíficos o ADC) demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con el anticuerpo 39S por la unión a HER2; tal molécula de unión anti-HER2 puede, según una teoría no limitativa, unirse al mismo epítopo o uno relacionado (p. ej., uno estructuralmente similar o espacialmente próximo) en HER2 que el anticuerpo 39S o fragmento de unión a antígeno del mismo con el que compite.
En un aspecto, la molécula anti-HER2 que se une al mismo epítopo en HER2 que el anticuerpo 39S o moléculas de unión derivadas del anticuerpo 39S es un anticuerpo humano monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo anti-HER2 biespecífico (p. ej., un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a HER2, al menos una de las cuales reconoce el mismo epítopo que el anticuerpo 39S), o un ADC (p. ej., un ADC que comprende al menos un resto de unión a antígeno que reconoce el mismo epítopo que 39S; o un ADC que comprende un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a HER2, al menos uno de los cuales reconoce el mismo epítopo que el anticuerpo 39S).
VI. Mecanismos de acción de moléculas de unión anti-HER2
La presente divulgación proporciona moléculas de unión anti-HER2 (p. ej., anticuerpos anti-HER2 biespecíficos, o ADC) que comprenden un dominio de unión a HER2 que se une al mismo epítopo que o se derivan de los anticuerpos 1.39.1 ó 39S, en las que tales moléculas de unión anti-HER2 inducen internalización tras la unión a la diana de HER2. También se proporcionan moléculas de unión anti-HER2 (p. ej., anticuerpos anti-HER2 biespecíficos, o ADC) que comprenden un dominio de unión a HER2 que se une al mismo epítopo que o se derivan de los anticuerpos 1.39.1 ó 39s , en las que tales moléculas de unión anti-HER2 promueven un tráfico lisosómico eficaz después de la internalización. La presente divulgación también proporciona moléculas de unión anti-HER2 (p. ej., anticuerpos anti-HER2 biespecíficos, o ADC) que comprenden un dominio de unión a HER2 que se une al mismo epítopo que o se derivan de los anticuerpos 1.39.1 ó 39s , en las que tales moléculas de unión a HER2 inducen internalización y/o degradación de la diana de HER2.
En algunos aspectos, una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente puede reducir, bloquear o suprimir la fosforilación de HER2. En otros aspectos, una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente puede reducir, bloquear o suprimir la fosforilación de AKT inducida por ligando. En algunos aspectos, la molécula de unión anti-HER2 puede reducir, bloquear o suprimir la fosforilación de AKT inducida por ligando en células cancerosas con baja expresión de HER2.
En todavía otros aspectos, una molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo dado a conocer en la presente aplicación puede reducir, perturbar o suprimir la dimerización HER2-HER3 inducida por ligando.
En algunos aspectos, un ADC que comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente puede inhibir la formación y/o proliferación de esferas de células madre cancerosas (CSC). En algunos aspectos, una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente presenta un efecto citotóxico sobre CSC. En algunos aspectos, un ADC que comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente puede inhibir el crecimiento tumoral y/o inducir regresión tumoral en tumores que expresan bajos niveles de HER2 (p. ej. de 1 a 2 mediante HercepTest). En determinados aspectos, un ADC que comprende una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente puede inhibir el crecimiento tumoral y/o inducir regresión tumoral en tumores resistentes a T-DM1.
En algunos aspectos, una molécula de unión a HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo carece de actividad ADCC. En aspectos específicos, una molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede reducir o suprimir la fosforilación de HER2, la fosforilación de AKT, y/o la formación de colonias tumorales mediante un mecanismo de acción dependiente de ligando.
VII. Preparación de moléculas de unión anti-HER2
Las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al mismo epítopo que o se derivan de los anticuerpos 1.39.1 ó 39S, anticuerpos biespecíficos y ADC que comprenden los mismos) pueden prepararse según métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse las moléculas de unión anti-HER2 que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo 39S dadas a conocer en la presente usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495.
Usando el método del hibridoma, se inmuniza un ratón, hámster, u otro animal huésped apropiado, tal como se describió anteriormente para provocar la producción por linfocitos de anticuerpos que se unirán específicamente a un antígeno de inmunización. También pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Después de la inmunización, se aíslas los linfocitos y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada usando, por ejemplo, polietilenglicol, para formar células de hibridoma que pueden seleccionarse entonces separándolas de linfocitos no fusionados y células de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno elegido tal como se determina mediante inmunoprecipitación, inmunotransferencia, o mediante un ensayo de unión in vitro (p. ej. radioinmunoensayo (RIA); ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)) pueden propagarse entonces o bien en cultivo in vitro usando métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) o bien in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse entonces del medio de cultivo o líquido ascítico tal como se describió para anticuerpos policlonales anteriormente.
Las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al mismo epítopo que o se derivan de los anticuerpos 1.39.1 ó 39S, anticuerpos biespecíficos y ADC que comprenden los mismos) también pueden producirse usando métodos de ADN recombinante tal como se describe en la patente estadounidense n.° 4,816,567. Los polinucleótidos que codifican para un anticuerpo monoclonal se aíslan de células B maduras o célula de hibridoma, tal como mediante RT-PCR usando cebadores de oligonucleótido que amplifican específicamente los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y se determina su secuencia usando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican para las cadenas pesadas y ligeras se clonan entonces en vectores de expresión adecuados, que cuando se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen por lo demás proteína inmunoglobulina, se generan anticuerpos monoclonales por las células huésped. Además, pueden aislarse anticuerpos monoclonales anti-HER2 recombinantes o moléculas que comprenden fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la especie deseada a partir de bibliotecas de presentación en fago que expresan CDR de la especie deseada tal como se describe (McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991); y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)).
El/los polinucleótido(s) que codifica(n) para una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al mismo epítopo que o se derivan del anticuerpo 39S, anticuerpos biespecíficos y ADC que comprenden los mismos) puede(n) modificarse adicionalmente de varias maneras diferentes usando tecnología de ADN recombinante para generar moléculas de unión anti-HER2 alternativas. En algunos aspectos, los dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón puede sustituirse (1) por esas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o (2) por un polipéptido distinto de inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunos aspectos, las regiones constantes se truncan o se retiran para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.
En determinados aspectos, la molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación es un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo. Pueden prepararse directamente anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Pueden generarse linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (véase, p. ej., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol. 147:86-95 (1991); y patente estadounidense n.° 5,750,373). Entonces pueden prepararse uno o más ADNc que codifican para el anticuerpo en el linfocito B inmortalizado e insertarse en un vector de expresión y/o una célula huésped heteróloga para la expresión de una versión recombinante que no se produce de manera natural del anticuerpo.
Además, el anticuerpo anti-HER2 humano o fragmento de unión a antígeno del mismo puede seleccionarse de una biblioteca en fago, donde esa biblioteca en fago expresa anticuerpos humanos o fragmentos de los mismos como proteínas de fusión con proteínas de fago heterólogas, tal como se describe, por ejemplo, en Vaughan et al., Nat. Biotech.
14:309-314 (1996); Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991), y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). También se describen técnicas para la generación y el uso de bibliotecas en fago de anticuerpos en las patentes estadounidenses n.os 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; y 7,264,963.
Se conocen en la técnica estrategias de maduración por afinidad y estrategias de intercambio de cadenas (Marks et al., BioTechnology 10:779-783 (1992)) y pueden emplearse para generar anticuerpos humanos de alta afinidad o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En algunos aspectos, una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación puede ser un anticuerpo humanizado. También puede usarse métodos para modificar por ingeniería, humanizar o revestir anticuerpos no humanos o humanos y se conocen bien en la técnica. Un anticuerpo humanizado, revestido o modificado por ingeniería de manera similar puede tener uno o más residuos de aminoácido de una fuente que es no humana, p. ej., sin carácter limitante, ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. Estos residuos de aminoácido no humanos se reemplazan por residuos que se denominan a menudo residuos "importados", que se toman normalmente de un dominio "importado" variable, constante u otro dominio de una secuencia humana conocida. Tales secuencias importadas pueden usarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, potenciar o modificar la unión, afinidad, velocidad de asociación, velocidad de disociación, avidez, especificidad, semivida, o cualquier otra característica adecuada, tal como se conoce en la técnica. En general, los residuos de CDR están implicados directamente y de la manera más sustancial en la influencia de la unión a HER2. Por consiguiente, parte o la totalidad de las secuencia de CDR no humanas o humanas se mantienen mientras que las secuencias no humanas de las regiones variables y constantes pueden reemplazarse por aminoácidos humanos u otros. En determinados aspectos, las CDR humanas se insertan en armazones de anticuerpo no humano para producir un anticuerpo con inmunogenicidad reducida en un sistema de modelo animal, p. ej., un anticuerpo "murinizado".
Las moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos, pueden humanizarse opcionalmente, revestirse o modificarse por ingeniería con retención de alta afinidad por el antígeno HER2 y otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo, pueden prepararse opcionalmente anticuerpos anti-HER2 humanizados (o humanos) o modificado por ingeniería y anticuerpos revestidos mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos conceptuales humanizados y modificados por ingeniería usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales, modificadas por ingeniería y humanizadas. Están disponibles modelos de inmunoglobulina tridimensionales y con los que están familiarizados los expertos en la técnica.
Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno, tal como HER2. De esta manera, pueden seleccionarse residuos de región de entramado y combinarse a partir de la secuencia consenso e importada de modo que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad aumentada por el/los antígeno(s) diana.
Puede realizarse la humanización, el revestimiento o la modificación por ingeniería de las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente usando cualquier método conocido, tal como sin carácter limitante los descritos en, Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), patentes estadounidenses n.os 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567, 7,557,189; 7,538,195; y 7,342,110; documentos WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; y EP229246, incluyendo las referencias citadas en esos documentos.
En determinados aspectos, se proporciona un fragmento de anticuerpo anti-HER2. Se conocen diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (por ejemplo Morimoto et al., J. Biochem. Biophy. Methods 24:107-117 (1993); Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). En determinados aspectos, se producen fragmentos de anticuerpo anti-HER2 de manera recombinante. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv pueden expresarse todos en y secretarse a partir de células huésped de E. coli u otras células huésped, evitando por tanto la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. También pueden aislarse tales fragmentos de anticuerpo anti-HER2 de las bibliotecas en fago de anticuerpos comentados anteriormente. Los fragmentos de anticuerpo anti-HER2 también pueden ser anticuerpos lineales tal como se describe en la patente estadounidense n.° 5,641,870. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para el profesional experto.
Pueden adaptarse técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla específicos para el mismo epítopo de HER2 que el anticuerpo 39S (véase, p. ej., la patente estadounidense n.° 4,946,778). Además, pueden adaptarse métodos para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (véase, p. ej., Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir la identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por HER2, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. Pueden producirse fragmentos de anticuerpo mediante técnicas en la técnica incluyendo, sin carácter limitante: (a) un fragmento F(ab')2 producido mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (b) un fragmento Fab generado reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2, (c) un fragmento Fab generado mediante el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor, y (d) fragmentos Fv.
En algunos aspectos, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpo, un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede modificarse para aumentar su semivida sérica. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión a receptor de reciclaje en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo mediante mutación de la región apropiada en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo o incorporando el epítopo en una etiqueta peptídica que se fusiona entonces al anticuerpo o fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en la parte central (p. ej., mediante síntesis de ADN o péptidos), o mediante mutación YTE. Otros métodos para aumentar la semivida sérica de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, p. ej., conjugación con una molécula heteróloga tal como PEG se conocen bien en la técnica.
Pueden prepararse moléculas de unión anti-HER2 heteroconjugadas, p. ej., anticuerpos biespecíficos que se unen al mismo epítopo que o se derivan del anticuerpo 39S dado a conocer en la presente o a Dc , usando tecnología de biología recombinante así como in vitro usando métodos conocidos en la química de síntesis de proteínas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, pueden construirse químicamente anticuerpos biespecíficos o ADC usando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Se conocen en la técnica reactivos adecuados para este fin, e incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.
Se observará que en determinados aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 pueden modificarse por ingeniería para fusionar el dominio CH3 directamente a la región bisagra de los anticuerpos modificados respectivos o fragmentos de los mismos. En otro constructos, puede insertarse un espaciador peptídico entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, pueden expresarse constructos compatibles en los que el dominio CH2 dominio se ha delecionado y el dominio CH3 restante (modificado o sin modificar) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Puede añadirse un espaciador de este tipo, por ejemplo, para garantizar que los elementos reguladores del dominio constante permanecen libres y accesibles o que la región bisagra permanece flexible. Sin embargo, debe indicarse que los espaciadores de aminoácidos pueden, en algunos casos, demostrar ser inmunogénicos y provocar una respuesta inmunitaria no deseada contra el constructo. Por consiguiente, en determinados aspectos, cualquier espaciador añadido al constructo será relativamente no inmunogénico, o incluso se omitirá totalmente, de modo que se mantengan las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados.
Además de la deleción de los dominios de región constante completos, se apreciará que la molécula de unión anti-HER2 puede proporcionarse mediante la deleción o sustitución parcial de unos pocos o incluso un solo aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en zonas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión a Fc y aumentar de ese modo la localización tumoral. Además, tal como se aludió anteriormente, las regiones constantes de la molécula de unión anti-HER2 dada a conocer pueden modificarse a través de la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que potencia el perfil del constructo resultante. A este respecto, es posible perturbar la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (p. ej., unión a Fc) mientras que se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado o fragmento de unión a antígeno del mismo. Determinados aspectos pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para potenciar características deseables tales como disminuir o aumentar la función efectora o proporcionar más unión a citotoxinas o hidratos de carbono. En tales aspectos, pueden insertarse o replicarse secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados.
VIH. Polinucleótidos que codifican para moléculas de unión a HER2
En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente que se une específicamente a HER2. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de unión anti-HER2 tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo (p. ej., una molécula que se une al mismo epítopo que o se deriva del anticuerpo 39S). Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético; y puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido). En determinados aspectos, el ADN es un ADNc que se usa para producir un anticuerpo recombinante que no se produce de manera natural.
En determinados aspectos, los polinucleótidos están aislados. En determinados aspectos, los polinucleótidos son sustancialmente puros. En determinados aspectos, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a un polinucleótido (o bien natural o bien heterólogo) que ayuda, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido desde una célula huésped (p. ej., una secuencia líder que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula). El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar para una proproteína de molécula de unión anti-HER2 que es la proteína madura más residuos de aminoácido en 5' adicionales. En determinados aspectos, se alteran los polinucleótidos para optimizar el uso de codones para una célula huésped determinada.
En determinados aspectos, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante para el maduro molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo fusionado en el mismo marco de lectura a una secuencia de marcador heteróloga que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia de marcador puede ser una cola de hexa-histidina (His6) (SEQ ID NO: 61) suministrada, por ejemplo, por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano. En otros aspectos, la secuencia de marcador puede ser una cola de hemaglutinina (HA) derivada, por ejemplo, de la proteína hemaglutinina de Influenza, cuando se usa un huésped mamífero (p. ej., células COS-7).
La presente divulgación se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos que codifican para, por ejemplo, fragmentos de unión a HER2, análogos y derivados de las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación.
Las variantes de polinucleótido pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes, o ambas. En algunos aspectos, las variantes de polinucleótido contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunos aspectos, se producen variantes de nucleótidos mediante sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético. Pueden producirse variantes de polinucleótido por una variedad de motivos, p. ej., para optimizar la expresión de codones para un huésped particular (cambiar codones en el ARNm humano a los preferidos por un huésped bacteriano tal como E. coli). También se proporcionan vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en la presente.
En algunos aspectos, puede construirse una secuencia de ADN que codifica para una molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo mediante síntesis química, por ejemplo, usando un sintetizador de oligonucleótidos. Tales oligonucleótidos pueden diseñarse basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando aquellos codones que están favorecidos en la célula huésped en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Pueden aplicarse métodos convencionales para sintetizar una secuencia de polinucleótido aislada que codifica para un polipéptido de interés aislado. Por ejemplo, puede usarse una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Además, puede sintetizarse un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, pueden sintetizarse varios oligonucleótidos pequeños que codifican para partes del polipéptido deseado y luego ligarse. Los oligonucleótidos individuales contienen normalmente proyecciones en 5' o 3' para un ensamblaje complementario.
Una vez ensamblado (mediante síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro método), las secuencias de polinucleótido que codifican para un polipéptido de interés aislado particular se insertarán en un vector de expresión y operativamente unido a una secuencia de control de la expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. Pueden confirmarse el ensamblaje apropiado, por ejemplo, mediante secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Tal como se conoce bien en la técnica, con el fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen debe estar operativamente unido a secuencias de control de la transcripción y la traducción que son funcionales en el huésped de expresión elegido.
En determinados aspectos, se usan vectores de expresión recombinantes para amplificar y expresar ADN que codifica para moléculas de unión anti-HER2. Los vectores de expresión recombinantes son constructos de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN derivados de ADN sintético o ADNc que codifican para, por ejemplo, una cadena polipeptídica de un anticuerpo anti-HER2 o y fragmento de unión a antígeno del mismo, operativamente unido a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insecto. Una unidad de transcripción comprende generalmente un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores transcripcionales, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe para dar ARNm y se traduce para dar proteína, y (3) secuencias de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción apropiadas, tal como se describe en detalle a continuación. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia de operador para controlar la transcripción.
Puede incorporarse adicionalmente la capacidad para replicarse en un huésped, conferida habitualmente por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes. Las regiones de ADN están operativamente unidas cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN para un péptido señal (secuencia señal secretora) está operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está situado de modo que se permita la traducción. Los elementos estructurales pretendidos para su uso en sistemas de expresión en levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de proteína traducida por una célula huésped. Alternativamente, cuando se expresa proteína recombinante sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo puede opcionalmente escindirse posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
La elección de la secuencia de control de la expresión y el vector de expresión dependerá de la elección del huésped. Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucariotas, incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli, incluyendo pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de gama de huéspedes más amplia, tales como M13 y fagos filamentosos de ADN monocatenario.
Las células huésped adecuadas para la expresión de moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos anti-HER2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluyen células procariotas, de levadura, insecto o eucariotas superiores bajo el control de promotores apropiados. Las procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero tal como se describe a continuación. También podrían emplearse sistemas de traducción libres de células. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, y de mamífero por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).
Puede encontrarse información adicional referente a métodos de producción de proteínas, incluyendo producción de anticuerpos, p. ej., en la publicación estadounidense n.° 2008/0187954, patentes estadounidenses n.os 6,413,746 y 6,660,50l, y patente internacional n.° WO 04009823.
También pueden emplearse ventajosamente diversos sistemas de cultivo celular de mamífero o insecto para expresar moléculas de unión anti-HER2 recombinantes, p. ej., anticuerpos anti-HER2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Puede realizarse la expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero porque tales proteínas se pliegan generalmente de manera correcta, se modifican apropiadamente y son completamente funcionales. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen HEK-293 y HEK-293T, las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares incluyendo, por ejemplo, células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), NSO, HeLa y líneas celulares BHK. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados unidos al gen que va a expresarse, y otras secuencias no transcritas flanqueantes en 5' o 3', y secuencias no traducidas en 5' o 3', tales como sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios de corte y empalme donadores y aceptores, y secuencias de terminación de la transcripción. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisan por mediante Luckow & Summers, BioTechnology 6:47 (1988).
Pueden purificarse las moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos anti-HER2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, producidas por un huésped transformado según cualquier método adecuado. Tales métodos convencionales incluyen, por ejemplo, cromatografía (p. ej., cromatografía de intercambio iónico, afinidad y en columna de dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Pueden unirse etiquetas de afinidad tales como hexahistidina (SEQ ID NO: 61), dominio de unión a maltosa, secuencia de cubierta de Influenza, glutatión-S-transferasa, etc., a la proteína para permitir una fácil purificación mediante el paso por una columna de afinidad apropiada. También pueden caracterizarse físicamente proteínas aisladas usando, por ejemplo, proteólisis, resonancia magnética nuclear o cristalografía de rayos X.
Por ejemplo, pueden concentrarse en primer lugar sobrenadantes de sistemas que secretan proteína recombinante en medios de cultivo usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon® o Millipore Pellicon®. Tras la etapa de concentración, puede aplicarse el concentrado a una matriz de purificación adecuada. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o un sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico.
Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) empleando medios de RP-HPLC hidrófobos, p. ej., gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes y otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente una molécula de unión a HER2. También pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
Puede aislarse una molécula de unión anti-HER2 recombinante, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo, producida en cultivo bacteriano, por ejemplo, mediante extracción inicial de sedimentos celulares, seguido por una o más etapa de concentración, precipitación con sales, cromatografía de exclusión molecular o intercambio iónico acuoso. Puede emplearse cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para las etapas de purificación finales. Pueden perturbarse las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, perturbación mecánica o el uso de agentes de lisado celular.
Los métodos conocidos en la técnica para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo, los descritos en las patentes estadounidenses n.os US20080312425, US20080177048 y US20090187005.
IX. Métodos de tratamiento usando moléculas de unión anti-HER2 terapéuticas
La presente divulgación también proporciona métodos referidos al uso de moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión a antígeno, variantes y derivados de los mismos, para tratar pacientes que tienen una enfermedad asociada con la expresión de HER2 o células que expresan HER2.
Por "célula que expresa HER2" quiere decirse una célula que expresa la proteína HER2. Los métodos para detectar y/o cuantificar la expresión de HER2 en células se conocen bien en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de PCR, inmunohistoquímicas (p. ej., Herceptest™), citometría de flujo, inmunotransferencia de tipo Western, ELISA, y similares. En algunos aspectos, los métodos dados a conocer en la presente se aplican al método de tratamiento y diagnóstico en el que las células cancerosas expresan HER2 a bajos niveles.
Los métodos para el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades y trastornos con una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, se refieren a anticuerpos anti-HER2 (p. ej., el anticuerpo 39S, variantes, derivados, y fragmentos de unión a HER2; moléculas anti-HER2 biespecíficas de la presente divulgación; y moléculas de ADC de la presente divulgación) que conservan las propiedades deseadas de las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación, p. ej., que pueden unirse específicamente a HER2 y actividad neutralizante de HER2.
En algunos aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 son moléculas de unión anti-HER2 humanas o humanizadas que median en ADCC humana; o comprenden anticuerpos anti-HER2 conocidos que median en ADCC; o comprenden moléculas de unión anti-HER2 que se modifican por ingeniería de manera que median en ADCC.
En algunos aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 son moléculas de unión anti-HER2 humanas o humanizadas que no median en ADCC humana; o comprenden anticuerpos anti-HER2 conocidos que median en ADCC; o comprenden moléculas de unión anti-HER2 que se modifican por ingeniería de manera que no median en ADCC.
En un aspecto, el tratamiento incluye la aplicación o administración de una molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la presente divulgación a un sujeto o paciente, o la aplicación o administración de la molécula de unión anti-HER2 a una línea celular o un tejido aislado de un sujeto o paciente, en el que el sujeto o paciente tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición a una enfermedad. En otro aspecto, tratamiento también pretende incluir la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la presente divulgación a un sujeto o paciente, o la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión anti-HER2 a una línea celular o un tejido aislado de un sujeto o paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición a una enfermedad.
Las moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la presente divulgación son útiles para el tratamiento de diversos cánceres. En un aspecto, la presente divulgación se refiere a moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos para su uso como medicamento, en particular para su uso en el tratamiento o la profilaxis del cáncer. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de páncreas o cáncer de próstata. En algunos casos específicos, el cáncer expresa bajos niveles de HER2 tal como se determina, por ejemplo, mediante Herceptest™.
Según los métodos de la presente divulgación, al menos una molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo tal como se define en otra parte en la presente se usa para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto al cáncer. El término "respuesta terapéutica positiva" con respecto al tratamiento del cáncer se refiere a una mejora en la enfermedad en asociación con la actividad de estas moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad.
Por ejemplo, una mejora en la enfermedad puede caracterizarse como una respuesta completa. El término "respuesta completa" se refiere a una ausencia de enfermedad clínicamente detectable con normalización de cualquier resultado de prueba previamente. Alternativamente, una mejora en la enfermedad puede clasificarse como que es una respuesta parcial. Una "respuesta terapéutica positiva" engloba una reducción o inhibición de la progresión y/o duración del cáncer, la reducción o mejora de la severidad de cáncer, y/o la mejora de uno o más síntomas del mismo que resultan de la administración de una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación.
En aspectos específicos, tales términos se refieren a uno, dos o tres o más resultados tras la administración de moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación:
(1) una estabilización, reducción o eliminación de la población de células cancerosas;
(2) una estabilización o reducción del crecimiento del cáncer;
(3) una alteración en la formación del cáncer;
(4) erradicación, retirada o control de cáncer primario, regional y/o metastásico;
(5) una reducción de la mortalidad;
(6) un aumento de la tasa o duración libre de enfermedad, libre de recidivas, libre de progresión y/o de supervivencia global;
(7) un aumento de la tasa de respuesta, la durabilidad de la respuesta o el número de pacientes que responden o están en remisión;
(8) una disminución de la tasa de hospitalización,
(9) una disminución de las duraciones de hospitalización,
(10) el tamaño del cáncer (p. ej., en volumen) se mantiene y no aumenta o aumenta en menos del 10%, preferiblemente menos del %, preferiblemente menos del 4%, preferiblemente menos del 2%, y
(11) un aumento del número de pacientes en remisión.
(12) una disminución del número de terapias adyuvantes (p. ej., quimioterapia o terapia hormonal) que se requerirían si no para tratar el cáncer.
Puede evaluarse la respuesta clínica usando técnicas de examen tales como PET, exploración de obtención de imágenes de resonancia magnética (IRM), obtención de imágenes radiográficos con rayos X, exploración tomográfica computerizada (TC), citometría de flujo o análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), histología, patología macroscópica y bioquímica sanguínea, incluyendo sin carácter limitante cambios detectables mediante ELISA, RIA, cromatografía, y similares. Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que se somete a terapia con la molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, puede experimentar el efecto beneficioso de una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad.
Las moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la presente divulgación pueden usarse en combinación con cualquier terapia conocida para el cáncer, incluyendo cualquier agente o combinación de agentes que se sabe que son útiles, o que se han usado o están actualmente en uso, para el tratamiento de cáncer, p. ej., cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello y cáncer de mama. El segundo agente o combinación de agentes de la formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación tiene preferiblemente actividades complementarias a las de la(s) molécula(s) de unión anti-HER2 de la presente divulgación de manera que no se afecten de manera adversa entre sí.
Los agentes anticancerígenos incluyen fármacos usados para tratar tumores malignos, tales como crecimientos cancerosos. La terapia farmacológica puede usarse sola, o en combinación con otros tratamientos tales como cirugía o radioterapia. Pueden usarse varias clases de fármacos en el tratamiento del cáncer, dependiendo de la naturaleza del órgano implicado. Por ejemplo, los cánceres de mama se estimulan comúnmente mediante estrógenos, y pueden tratarse con fármacos que inactivas las hormonas sexuales. De manera similar, el cáncer de próstata puede tratarse con fármacos que inactivan los andrógenos, las hormonas sexuales masculinas.
Los agentes anticancerígenos para su uso en determinados métodos de la presente divulgación incluyen, entre otros, anticuerpos (p. ej., anticuerpos que se unen a IGF-1R, anticuerpos que se unen a EGFR, anticuerpos que se unen a HER2 o HER3), moléculas pequeñas que se dirigen hacia IGF1R, moléculas pequeñas que se dirigen hacia EGFR, moléculas pequeñas que se dirigen hacia HER2, antimetabolitos, agentes alquilantes, inhibidores de topoisomerasa, agentes que se dirigen hacia microtúbulos, inhibidores de cinasas, inhibidores de la síntesis de proteínas, agentes inmunoterápicos, terapias hormonales, glucocorticoides, inhibidores de aromatasa, inhibidores de mTOR, agentes quimioterápicos, inhibidores de proteína cinasa B, inhibidores de fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K), inhibidores de cinasa dependiente de cinasa (CDK), RLr9, CD289, inhibidores enzimáticos, anti-TRAIL, inhibidores de MEK, etc.
En aspectos específicos, las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden administrarse en combinación con otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se dirigen hacia el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), p. ej. Erbitux® (cetuximab) o panitumumab (Vectibix®).
En otros aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente pueden administrarse en combinación con inhibidores de cinasas, p. ej., inhibidores de tirosina cinasas. En algunos otros aspectos específicos, las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente pueden administrarse en combinación con inhibidores de la actividad tirosina cinasa asociada con EGFR y/o HER2/neu, p. ej., lapatinib. En algunos aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación pueden administrarse en combinación con agentes antimitóticos. En algunos aspectos específicos, las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación pueden administrarse en combinación con agentes que estabilizan el ensamblaje de microtúbulos del huso mitótico, p. ej., paclitaxel o docetaxel.
Cuando las terapias combinadas comprenden la administración de una molécula de unión anti-HER2 en combinación con la administración de otro agente terapéutico, los métodos de la presente divulgación engloban la co-administración, usando formulaciones independientes o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden. En algunos aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 descritas en la presente se administran en combinación con otros fármacos, en las que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo y el/los agente(s) terapéutico(s) pueden administrarse secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente (es decir, de manera concurrente o dentro del mismo intervalo de tiempo).
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y demostrar ser "sinérgica", es decir, el efecto logrado cuando se usan juntos los principios activos es mayor que la suma de los efectos que resultan del uso de los compuestos por separado. Puede lograrse un efecto sinérgico cuando los principios activos: (1) se coformulan y se administran o suministran simultáneamente en una formulación de dosificación unitaria combinada; (2) se suministran mediante alternación o en paralelo como formulaciones independientes; o (3) mediante algún otro régimen. Cuando se administran en terapia de alternancia, puede lograrse un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o suministran secuencialmente, p. ej., mediante diferentes inyecciones en jeringas independientes. En general, durante la terapia de alternancia, una dosificación eficaz de cada principio activo se administra secuencialmente, es decir, en serie, mientras que en terapia de combinación, se administran dosificaciones eficaces de dos o más principios activos juntos.
En algunos aspectos, la molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, puede administrarse en una combinación sinérgica con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento (EGFR). En algunos aspectos, el inhibidor de EGFR es un anticuerpo. En aspectos específicos, el anticuerpo inhibidor de EGFR es Erbitux® (cetuximab) o Vectibix® (panitumumab). En aspectos específicos, las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden administrarse en una combinación sinérgica con inhibidores de la actividad tirosina cinasa asociada con EGFR y/o HER2/neu, p. ej., lapatinib. En algunos aspectos, las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación pueden administrarse en una combinación sinérgica con un agente antimitótico. En algunos aspectos específicos, el agente antimitótico estabiliza el ensamblaje de microtúbulos del huso mitótico. En algunos aspectos específicos, el agente antimitótico es paclitaxel o docetaxel.
Un aspecto adicional es el uso de moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, para monitorización de diagnóstico de niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, p. ej., para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Por ejemplo, puede facilitarse la detección mediante el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptadivina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radiactivo adecuados incluyen 125I, 131I, 35S, o 3H.
Un aspecto adicional es el uso de moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, para tratar un paciente con cáncer resistente a un agente terapéutico dirigido hacia HER2, por ejemplo un anticuerpo que se dirige hacia un epítopo dentro del dominio IV de HER2 tal como trastuzumab. En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende un resto que se dirige hacia el mismo epítopo que trastuzumab, y un resto citotóxico. En algunos aspectos, tal resto citotóxico es un maitansinoide. En algunos aspectos específicos, el maitansinoide es DM-1.
En algunos aspectos, los métodos de tratamiento dados a conocer en la presente comprenden la administración de una molécula de unión anti-HER2 que es un anticuerpo anti-HER2 que comprende una región variable (VH) de cadena pesada (HC) y una región variable (VL) de cadena ligera (LC) que comprenden:
(i) una CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 1 o idéntica a SEQ ID NO: 1 exceptuando hasta 1,2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(ii) una CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 2 o idéntica a SEQ ID NO: 2 exceptuando hasta 1,2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iii) una CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 3 o idéntica a SEQ ID NO: 3 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iv) una CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(v) una CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y,
(vi) una CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido.
En algunos aspectos, los métodos de tratamiento dados a conocer en la presente comprenden la administración de una molécula de unión anti-HER2 que es un anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en los que (i) el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos sitios de unión del anticuerpo contra HER2, (ii) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina se une a un primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 que comprende un epítopo dentro del dominio II de HER2, y (iii) el primer sitio de unión del anticuerpo contra HER2 es distinto del sitio de unión del anticuerpo de pertuzumab.
En algunos aspectos, los métodos de tratamiento dados a conocer en la presente comprenden la administración de una molécula de unión anti-HER2 que es un anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, en los que el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una región variable (VH) de cadena pesada (HC) y una región variable (VL) de cadena ligera (LC) que comprenden:
(i) una CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 1 o idéntica a SEQ ID NO: 1 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(ii) una CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 2 o idéntica a SEQ ID NO: 2 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iii) una CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 3 o idéntica a SEQ ID NO: 3 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(iv) una CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4 o idéntica a SEQ ID NO: 4 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido;
(v) una CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5 o idéntica a SEQ ID NO: 5 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; y,
(vi) una CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6 o idéntica a SEQ ID NO: 6 exceptuando hasta 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina de tal molécula de unión anti-HER2 comprende al menos una región de entramado (FW) de dominio variable heteróloga diferente en relación con las regiones FW de un dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina que comprende una VH que comprende los aminoácidos SEQ ID NO: 43 y una VL que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 44. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende:
(i) una región de entramado de cadena ligera variable 1 (VL-FW1) que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 11;
(ii) una VL-FW2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
(iii) una VL-FW3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 13;
(iv) una VL-FW4 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o
(vi) cualquier combinación de las mismas.
En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina de tal molécula de unión anti-HER2 comprende una VH y una VL, en el que la VH comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o 43; y en el que el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina de tal molécula de unión anti-HER2 comprende una VH y una VL, en el que la VL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o 44; y en el que el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina de tal molécula de unión anti-HER2 comprende una VH y una VL, en el que la VH comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y en el que la VL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina de tal molécula de unión anti-HER2 (a) se une específicamente al mismo epítopo de HER2 que el anticuerpo trastuzumab; y/o (b) inhibe competitivamente la unión a HER2 por el anticuerpo trastuzumab; y/o (c) comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) que comprenden los aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 54 a 59. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina de tal molécula de unión anti-HER2 es un scFv que comprende (i) una VH-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 54; (ii) una VH-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (iii) una VH-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (iv) una VL-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 57; (v) una VL-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 58; y (vi) una VL-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
En otros aspectos, los métodos de tratamiento dados a conocer en la presente comprenden la administración de una molécula de unión anti-HER2 que es un ADC que comprende un anticuerpo anti-HER2 biespecífico, en el que dicho anticuerpo comprende:
(i) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína en la posición 239, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(ii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a aminoácidos cisteína situados respectivamente en las posiciones 239 y 442 en las que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(iii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína en la posición 239, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(iv) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a aminoácidos cisteína situados respectivamente en las posiciones 239 y 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(v) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína en la posición 239, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat; o,
(vi) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a aminoácidos cisteína situados respectivamente en las posiciones 239 y 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat.
En otros aspectos, los métodos de tratamiento dados a conocer en la presente comprenden la administración de una molécula de unión anti-HER2 que es un ADC que comprende un anticuerpo anti-HER2 biespecífico, en el que dicho anticuerpo comprende:
(i) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(ii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 71 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442 en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(iii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(iv) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 76 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat;
(v) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico (p. ej., una molécula de tubulisina 1508) covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat; o,
(vi) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO:67 y una segunda cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 42, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos (p. ej., dos moléculas de tubulisina 1508) covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat.
X. Composiciones farmacéuticas y métodos de administración
Los métodos de preparación y administración de moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), a un sujeto que lo necesita se conocen bien por o pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica. La vía de administración de la molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), puede ser, p. ej., oral, parenteral, mediante inhalación o tópica. El término parenteral tal como se usa en la presente incluye, p. ej., administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Sin embargo, en otros métodos compatibles con las enseñanzas en la presente, pueden suministrarse moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), de la presente divulgación directamente en el sitio de la población celular adversa, aumentando de ese modo la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.
Tal como se comenta en la presente, pueden administrarse moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación, p. ej., anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), en un cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de enfermedades mediadas por células que expresan HER2 tales como determinados tipos de cánceres. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender portadores farmacéuticamente aceptables, incluyendo, p. ej., agua, intercambiadores iónicos, proteínas, sustancias tampón y sales. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión. Se describen formulaciones adecuadas para su uso en el métodos terapéuticos dados a conocer en la presente, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16a ed. (1980).
En cualquier caso, pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando un compuesto activo (p. ej., un anticuerpo anti-HER2, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, p. ej., un ADC tal como Bs2-4T, por sí mismo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado seguido por esterilización por filtración. Además, las preparaciones pueden envasarse y venderse en forma de un kit. Tales artículos de fabricación pueden tener marcadores o prospectos que indican que las composiciones asociadas son útiles para tratar a un sujeto que padece, o que está predispuesto a una enfermedad o un trastorno.
Las formulaciones parenterales pueden ser una única dosis en bolo, una infusión o una dosis en bolo de carga seguida por una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse a intervalos específicos fijos o variables, p. ej., una vez al día, o “según se necesite”.
La composición puede administrarse como una única dosis, múltiples dosis o a lo largo de un periodo de tiempo establecido en una infusión. Los regímenes de dosificación también pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica).
Las dosis terapéuticamente eficaces de las composiciones de la presente divulgación, para el tratamiento de enfermedades mediadas por células que expresan HER2 tales como determinados tipos de cánceres incluyendo p. ej., cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de mama, varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otras medicaciones administradas , y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En algunos aspectos específicos, el cáncer expresa bajos niveles de HER2 tal como se determina, por ejemplo, usando Herceptest™. Habitualmente, el paciente es un ser humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos incluyendo mamíferos transgénicos. Pueden ajustarse las dosificaciones de tratamiento usando métodos de rutina conocidos por los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y eficacia.
La cantidad de al menos una molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T) que va a administrarse puede determinarse fácilmente por un experto habitual en la técnica sin experimentación indebida. Los factores que influyen en el modo de administración y la cantidad respectiva de al menos una molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad, el historial de la enfermedad, y la edad, talla, el peso, la salud y el estado físico del individuo que se somete a terapia. De manera similar, la cantidad de molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo, o fragmento, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), que va a administrarse dependerá del modo de administración y de si el sujeto se someterá a una única dosis o múltiples dosis de este agente.
La presente divulgación también proporciona el uso de una molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), en la fabricación de un medicamento para tratar un tipo de cáncer, incluyendo, p. ej., cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. En algunos aspectos específicos, el cáncer expresa bajos niveles de HER2 tal como se determina, por ejemplo, usando Herceptest™.
La divulgación también proporciona el uso de una molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo de la presente divulgación, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto para tratar un tipo de cáncer. En algunos aspectos específicos, el cáncer expresa bajos niveles de HER2 tal como se determina, por ejemplo, usando Herceptest™. En determinados aspectos, el medicamento se usa en un sujeto que se ha pretratado con al menos otra terapia.
Mediante "pretratado" o "pretratamiento" se pretende que el sujeto haya recibido una o más de otras terapias (p. ej., se haya tratado con al menos otra terapia contra el cáncer) antes de recibir el medicamento que comprende la molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T). No es necesario que el sujeto respondiese al pretratamiento con la terapia o terapias previas. Por tanto, el sujeto que recibe el medicamento que comprende la molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T) podría haber respondido, respondido escasamente o podría no haber respondido al pretratamiento con la terapia previa, o a una o más de las terapias previas en el que el pretratamiento comprendía múltiples terapias. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos para tratar pacientes que responden escasamente o no responden a otras terapias (p. ej., tratamiento con un anticuerpo o un ADC tal como T-DM1) que comprenden administrar una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión, un variante o un derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T). También se proporcionan métodos para prevenir la resistencia a terapias contra el cáncer (p. ej., resistencia al tratamiento con un anticuerpo o un ADC tal como T-DM1) que comprenden administrar una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión, una variante o un derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T).
Aunque un paciente se haya tratado previamente con un inhibidor de HER2, un experto en la técnica puede determinar si una persona no mostró respuesta después del tratamiento con el inhibidor de HER2. Por ejemplo, una falta de respuesta a un inhibidor puede reflejarse en un aumento del padecimiento debido al cáncer, tal como un aumento del crecimiento de un cáncer/tumor y/o aumento del tamaño de un tumor, el (aumento de) la formación de metástasis o un aumento del número o el tamaño de metástasis. Una falta de respuesta también puede ser el desarrollo de un tumor o metástasis, por ejemplo después de resección de un tumor, en el acortamiento del tiempo hasta la progresión de una enfermedad, o en el aumento del tamaño de (un) tumor(es) y/o (una) metástasis, por ejemplo en terapia neoadyuvante. Basándose en estos parámetros u otros parámetros conocidos en la técnica, puede identificarse un grupo de pacientes que no responde al tratamiento con inhibidores de HER2, como pertuzumab, trastuzumab o T-DM1. Tal grupo de pacientes podría tratarse entonces con las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente, p. ej., anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T).
La presente divulgación proporciona también métodos para tratar pacientes que, por ejemplo, responden escasamente o no responden a otra terapia. El término "que no responde" tal como se usa en la presente puede referirse a un individuo/paciente/sujeto que es menos probable que responda a un tratamiento usando un inhibidor de HER2 (p. ej., pertuzumab, trastuzumab o T-DM1). "Menos probable que responda" tal como se usa en la presente se refiere a una disminución de la probabilidad de que se produzca una respuesta completa patológica en un paciente tratado con un inhibidor de HER2. En algunos aspectos, un paciente puede inicialmente responder bien, y puede desarrollar resistencia a los inhibidores de HER2 durante el tratamiento con tales inhibidores de HER2 (p. ej., pertuzumab, trastuzumab o T-DM1), que conducen a una escasa o ninguna respuesta al tratamiento.
El término "que responde bien" tal como se usa en la presente se refiere a un individuo cuyo tumor no demuestra crecimiento, metástasis, aumento del número o tamaño de metástasis, etc. durante o después del tratamiento usando un inhibidor de HER2 (como pertuzumab, trastuzumab o T-DM1), por ejemplo basándose en estudios de obtención de imágenes en serie, un individuo que no experimenta crecimiento tumoral, metástasis, aumento del número o tamaño de metástasis, etc. a lo largo de un periodo de tiempo (p. ej., aproximadamente 1 año después del diagnóstico inicial), y/o un individuo que experimenta una determinada duración de vida (p. ej., aproximadamente 2 años o más después del diagnóstico inicial).
El término "que responde escasamente” tal como se usa en la presente se refiere a un individuo cuyo tumor crece o metastatiza durante o poco después de la terapia convencional, por ejemplo usando un inhibidor de HER2 (como pertuzumab, trastuzumab o T-DM1), o que experimenta efectos clínicos adversos atribuibles al tumor.
En casos en los que se evalúa que el sujeto "no responde", un "responde escasamente"" o es "menos probable que responde" (basándose, por ejemplo, en la presencia de determinados biomarcadores en las células cancerosas), el sujeto podría tratarse con las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente, p. ej., anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T).
La presente divulgación también proporciona la co-administración de una molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), y al menos otra terapia. La molécula de unión anti-HER2 y la al menos otra terapia pueden coadministrarse juntas en una única composición o pueden coadministrarse juntas al mismo tiempo o en momentos solapantes en composiciones independientes. En algunos aspectos, una molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T), puede usarse como una terapia adyuvante.
La presente divulgación también proporciona el uso de una molécula de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo (p. ej., un ADC tal como Bs2-4T) en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto para tratar cáncer, en el que la molécula de unión anti-HER2 se administra antes de que un sujeto se haya tratado con al menos otra terapia.
XI. Diagnóstico
La presente divulgación proporciona además métodos de diagnóstico útiles para el diagnóstico de enfermedades mediadas por células que expresan HER2 tales como determinados tipos de cáncer incluyendo, p. ej., cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de mama, que implican medir el nivel de expresión de proteína HER2 o transcrito en tejido u otras células o líquido corporal de un individuo y comparar el nivel de expresión medido con un nivel de expresión de HER2 convencional en tejido normal o líquido corporal, mediante lo cual un aumento en el nivel de expresión en comparación con el convencional es indicativo de un trastorno.
Las moléculas de unión anti-HER2 de la presente divulgación y fragmentos de unión a antígeno, variantes y derivados de los mismos, pueden usarse para someter a ensayo los niveles de proteína HER2 en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., véase Jalkanen, et al., J. Cell. Biol.
101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpo útiles para detectar la expresión de proteína HER2 incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación o inmunotransferencia de tipo Western. Se describen ensayos adecuados en más detalle en otra parte en la presente.
Por "someter a ensayo el nivel de expresión de un biológica muestra HER2" se entiende medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de polipéptido HER2 en una primera muestra biológica o bien directamente (p. ej., determinando o estimando el nivel de proteína absoluto) o bien relativamente (p. ej., comparando con el nivel de polipéptido asociado con enfermedad en una segunda muestra biológica). El nivel de expresión de polipéptido HER2 en la primera muestra biológica puede medirse o estimarse y compararse con un nivel de polipéptido HER2 convencional, tomándose el nivel convencional de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o determinándose promediando los niveles de una población de individuos que no tienen el trastorno. Tal como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce el nivel de polipéptido HER2 "convencional", puede usarse repetidamente como nivel convencional para la comparación.
Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, línea celular, cultivo tisular, u otra fuente de células que expresan potencialmente HER2. Se conocen bien en la técnica métodos para obtener biopsias de tejido y líquidos corporales de mamíferos.
XII. Kits que comprenden moléculas de unión anti-HER2
La presente divulgación también proporciona kits que comprenden una molécula de unión anti-HER2 dada a conocer en la presente, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede usarse para realizar los métodos descritos en la presente. En determinados aspectos, un kit comprende al menos una molécula de unión anti-HER2 purificada o un fragmento de unión a antígeno de la misma en uno o más recipientes. En algunos aspectos, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un ensayo de detección, incluyendo todos los controles, instrucciones para realizar los ensayos, y cualquier software necesario para el análisis y la presentación de los resultados. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo, pueden incorporarse fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que se conocen bien en la técnica.
XIII. Inmunoensayos
Las moléculas de unión anti-HER2, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, variantes o derivados de los mismos de las moléculas de la presente divulgación pueden someterse a ensayo para determinar la unión inmunoespecífica mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse incluyen pero no se limitan a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como inmunotransferencias de tipo Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar unos cuantos. Tales ensayos son de rutina y se conocen bien en la técnica (véase, p. ej., Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1).
Las moléculas de unión anti-HER2 dadas a conocer en la presente, p. ej., anticuerpos anti-HER2 biespecíficos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, variantes o derivados de los mismos de las moléculas de la presente divulgación, pueden emplearse histológicamente, como en ensayos de inmunofluorescencia, microscopía inmunoelectrónica o no inmunológicos, para la detección in situ de receptores HER2 o variantes conservadas o fragmentos peptídicos de los mismos. Puede lograrse la detección in situ retirando una muestra histológica de un paciente, y aplicando a la misma una molécula de unión a HER2 marcada, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado del mismo, aplicarse preferiblemente recubriendo la molécula de unión a HER2 marcada (p. ej., un anticuerpo o fragmento) sobre una muestra biológica. A través del uso de un procedimiento de este tipo, es posible determinar no sólo la presencia de HER2, o variantes conservadas o fragmentos peptídicos, sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente divulgación, los expertos habituales percibirán fácilmente que puede modificarse cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) para lograr tal detección in situ.
La actividad de unión de un lote dado de molécula de unión anti-HER2, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado del mismo, puede determinarse según métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica podrán determinar condiciones operativas y de ensayo optimas para cada determinación mediante el empleo de experimentación de rutina.
Se conocen en la técnica y/o están comercialmente disponibles métodos y reactivos adecuados para la determinación de características de unión de una molécula de unión anti-HER2 de la presente divulgación, p. ej., un anticuerpo anti-HER2 biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o un derivado alterado/mutante del mismo. Están comercialmente disponibles equipos y software diseñados para tales análisis cinéticos (p. ej., BIAcore, software BIAevaluation, GE Healthcare; software KinExa, Sapidyne Instruments).
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular clonación un Laboratory Manual (2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. patente estadounidense n.° 4,683,195; Hames y Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer y Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir y Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); y en Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
Los principios generales de modificación por ingeniería de anticuerpos se exponen en Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press). Los principios generales de modificación por ingeniería de proteínas se exponen en Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Los principios generales de los anticuerpos y la unión anticuerpo-hapteno se exponen en: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, Nueva York, N.Y.). Adicionalmente, se siguen generalmente métodos convencionales en inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8a ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) y Mishell y Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman y Co., NY).
Las obras de referencia convencionales que exponen los principios generales de la inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Ámsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunnology (4a ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6a ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5a ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes V iII (Prentice Hall2003); Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach y Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press.
XIV Secuencias
La tabla 3 a continuación proporciona el número de referencia de secuencia (SEQ ID NO:), secuencia de aminoácidos y comentarios con respecto a las secuencias.
TABLA 3
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Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración y no a modo de limitación.
EJEMPLOS
Pueden definirse adicionalmente aspectos de la presente divulgación con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, que describen la preparación en detalle de determinados anticuerpos de la presente divulgación y métodos para usar los anticuerpos de la presente divulgación. Resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden ponerse en práctica muchas modificaciones, tanto de materiales como de métodos, sin apartarse del alcance de la presente divulgación.
Se han aprobado varios anticuerpos contra HER2 para su uso en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama cuyo(s) tumor(es) sobreexpresan HER2 incluyendo trastuzumab (Herceptin®; véase la patente estadounidense n.° 5,821,337), pertuzumab (Perjeta™; publicación de patente WO2001/00245) y T-DM1 (ado-trastuzumab emtansina, Kadcyla™, un conjugado anticuerpo-fármaco que consiste en el anticuerpo monoclonal trastuzumab unido al agente citotóxico mertansina (DM1), Niculescu-Duvaz et. al., 2010, Curr. Opin. Mol. Ther. 12:350-60). Sin embargo, estas terapias no están indicadas para la mayoría de pacientes que expresan niveles inferiores de HER2. Adicionalmente, existen pacientes que no responden a estas terapias o que se vuelven resistentes. Por tanto, existe una necesidad médica sin cubrir de agentes terapéuticos superiores para abordar a estos pacientes.
Tal como se detalla en los ejemplos específicos proporcionados a continuación, se generaron anticuerpos biespecíficos altamente potentes combinando un anticuerpo anti-HER humano completamente optimizado que se une a un epítopo recientemente descrito dentro del dominio II de HER2 con un scFv que se une a un epítopo conocido dentro del dominio IV de HER2. Se generaron y se sometieron a prueba varias configuraciones de anticuerpo biespecífico diferentes. Los anticuerpos biespecíficos únicos proporcionados presentan actividades biológicas que no se han visto con ninguno de los anticuerpos anti-HER2 monoespecíficos sometidos a prueba. En muchos ensayos los anticuerpos biespecíficos también demuestran una actividad sinérgica sobre anticuerpos anti-HER2 monoespecíficos. Varias de las actividades in vitro e in vivo de los anticuerpos biespecíficos proporcionados en la presente se potencian además mediante la adición de agentes citotóxicos (p. ej., tubulisina 1508) en ausencia de o con actividades de unión a receptores de Fc gamma fuertemente reducidas. Adicionalmente, se encontró que la actividad in vitro de los anticuerpos biespecíficos únicos proporcionados en la presente también puede potenciarse mediante la potenciación de la actividad ADCC, por ejemplo mediante la alteración de la glicosilación (p. ej., usando tecnología POTELLEGENT™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.) para generar anticuerpos hipofucosilados que tienen actividad ADCC potenciada). Estos datos sugieren que los anticuerpos biespecíficos pueden tener uso terapéutico, particularmente como ADC o como anticuerpos con ADCC potenciada, para el tratamiento de cánceres que expresan una amplia gama de niveles de HER2, incluyendo pacientes actualmente no elegibles para el tratamiento con trastuzumab, pertuzumab o T-DM1. Además, los anticuerpos biespecíficos pueden tener uso terapéutico para el tratamiento de pacientes con cáncer en los que han fracasado las terapias anti-HER2 existentes.
Ejemplo 1
1.1. Optimización de secuencia líder
AZ1.39.1 es un anticuerpo monoclonal completamente humano contra HER2 humana que no compite por la unión o bien con trastuzumab o bien con pertuzumab (publicación de patente WO 2008/019290). 39S es un anticuerpo optimizado para la secuencia líder generado a partir de AZ1.39.1 (Figura 1) tal como se detalla a continuación. Se usó mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar un residuo Cys sin aparear en la CDR1 de cadena ligera con Ile y se eliminó un sitio de isomerización potencial (DG) en la CDR3 de cadena pesada cambiando el DG a DA. La variante resultante demostró la misma especificidad de unión y actividad antiproliferativa in vitro como AZ1.39.1 (no se muestran los datos). Para generar agentes de unión de mayor afinidad, se aplicó mutagénesis a los residuos CDR de cadena pesada y se expresaron los mutantes como IgG en células de mamífero y se examinaron para determinar su actividad de unión a la proteína de dominio extracelular de HER2 humana recombinante mediante ELISA de captura. Se secuenciaron clones con una señal de unión significativamente mayor que el control de tipo natural para revelar la información de mutación. Se construyó una biblioteca combinatoria a partir de las mutaciones identificadas y se examinaron para determinar su actividad de unión a la proteína de dominio extracelular de HER2 humana recombinante mediante ELISA de captura. Se encontró que 39S tiene la mayor actividad de unión, y un análisis de secuencia adicional reveló que 39S portaba una única mutación N5S en la CDR1 de cadena pesada. La afinidad de 39S a HER2 humana (KD) es ~ 1.0 nM, determinada mediante BIAcore, en contraste la afinidad notificada del anticuerpo 1.39.1 parental es ~ 2.0 nM. Por tanto, esta única mutación dio como resultado un aumento en 2 veces en afinidad de unión sobre el anticuerpo parental. Para mejorar el nivel de expresión de anticuerpo se intercambió la secuencia de entramado, en particular FR1, FR2 y FR3 de la cadena ligera, de la secuencia de línea germinal IGKV4-1 Jk3.01 a IGVK2D, dando como resultado un aumento en aproximadamente 2 veces en el nivel de expresión de IgG medido tras 7 días en cultivo (figura 2).
1.2. Especificidad de unión y reactividad cruzada entre especies del anticuerpo 39S optimizado para secuencia líder
Para determinar si 39S conserva la especificidad de unión y reactividad cruzada entre especies de su anticuerpo AZ1.39.1 parental, se examinó la unión de 39S a los receptores de la familia ErbB humana (EGFR, HER2, HER3, y HER4), la Her2 de ratón, y la HER2 de macaco cangrejero mediante ELISA de captura. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con una de las siguientes proteínas de dominio extracelular recombinantes: EGFR humana, h ER2 humana, HER3 humana, HER4 humana, Her2 de ratón, o Her2 de macaco cangrejero. Se preparó el anticuerpo que va a someterse a prueba diluyendo en una dilución en serie 1:3 gradual que oscila entre 50 nM y 0.28 pM y después se añadió a los pocillos por duplicado. Después de una hora de incubación, se lavaron las placas, y se añadió anticuerpo secundario de cabra anti-Fab de IgG humano conjugado con HRP a cada pocillo y se incubaron las placas durante 1 hora. Se lavaron las placas y se añadió sustrato de TMB y se incubó durante 5-20 min para permitir el desarrollo de color. Se añadió la disolución de detención a los pocillos al final de la reacción y se leyeron las placas a 450 nm. Se representó la señal de unión (absorbancia a 450 nm) frente a la concentración de anticuerpo usando el software de Prism. Los resultados muestran que 39S, similar a AZ1.39.1, puede unirse a HER2 humana y Her2 de macaco cangrejero, pero no a EGFR, HER3, HER4 humanas, o Her2 de ratón (no se muestran los datos).
1.3. Mapeo de epítopo de 39S y caracterización
Se identificó el dominio II de HER2 humana como el epítopo de 39S intercambiando dominios entre moléculas de Her2 humanas y de ratón. Se eligió Her2 de ratón como el componente quimérico porque no se reconoce por 39S, pero comparte el 85% de identidad de secuencia con HER2 humana. Se construyeron variantes quiméricas que se dirigen hacia cada dominio de HER2 (véase el método a continuación) tal como se enumera en la tabla 4, incluyendo cuatro variantes deficientes (KO, pérdida de función) que reemplazan el dominio I, II, III, o IV de HER2 humana con el equivalente de ratón, y una variante activada (KI, ganancia de función) injertando el dominio II de HER2 humana en la molécula de Her2 de ratón. La nomenclatura de variante quimérica indica los tipos de variantes (KO/KI) y el número de dominios intercambiados. Se caracterizaron los perfiles de unión de 39S a estas variantes usando un instrumento ProteOn™ basado en SPR captando variantes sobre superficies de sensor usando anticuerpos policlonales anti-Her2 humanos y de ratón (véase el método a continuación). Se monitorizó la expresión de las variantes mediante anticuerpo policlonal anti-His usando ProteOn™. Los resultados de unión de 39S frente a las variantes de pérdida de función han demostrado que el dominio II es el dominio que contiene epítopo. 39S no se unió a la variante de KO_II que codifica para el dominio II de ratón (tabla 4), mientras que conservó la unión a la variante de KO_I que codifica para el dominio I de ratón. Aunque las variantes deficientes para dominio III y IV humanas (KO_III y KO_IV) no se expresaron, estos dos dominios se excluyeron como el epítopo de 39S basándose en los resultados de unión de la variante de ganancia de función KI_11.39S reconoció esta variante de ganancia de función (KI_II), que codifica para dominios I, III y IV de ratón y dominio II humano, con afinidad de unión similar (168pM) en cuanto a HER2 humana (84pM). Por tanto, se identificó el dominio II (aminoácidos 146-310) de HER2 humana como el dominio que contiene el epítopo de 39S tanto por la variante de pérdida de función como la de ganancia de función.
Se refinó adicionalmente el epítopo de 39S y se identificó la región de aminoácidos 192-208 en el dominio II como la región de epítopo crítica. Se construyó una serie de variantes humanas/de ratón quiméricas que se dirigen hacia regiones de dominio II cortas que poseen diferentes secuencias de aminoácidos entre proteínas de Her2 humanas y de ratón, tal como se enumera en la tabla 4. Se generaron siete variantes deficientes reemplazando cada una de las siguientes regiones de HER2 humanas con las equivalentes de ratón, incluyendo los aminoácidos 146-208, 159-162, 171-187, 192­ 208, 250-261,276-285, y 295-296. Además, se construyó una variante activada injertando la región de aminoácidos 192­ 208 de HER2 humana a la molécula de ratón. La nomenclatura de variante indica los tipos de variantes (KO/KI) y las regiones intercambiadas con la numeración de aminoácido. Todas las variantes tenían niveles de expresión detectables por anticuerpo policlonal anti-His (tabla 4). 39S no se unió a ninguna de las variantes quiméricas, en las que se reemplazó la región de aminoácidos 192-208 de HER2 humana por residuos de ratón (KO_146-208, KO_192-208). La unión de 39S no se afectó cuando se sustituyó cualquier otra región de HER2 humana por aminoácidos de ratón (KO_159-162, KO_171-187, KO_250-261, KO_276-285, y KO_295-296). Además, 39S se une a la variante KI que codifica para 192-208 humano (KI_192-208) con un KD de 72 pM, comparable al KD (84 pM) de HER2 humana. Resumiendo, se identificó la región de aminoácido 192-208 en el dominio II de HER2 humana como el epítopo funcional de 39S.
La nomenclatura de variante indica los tipos de variantes (KO/KI) y las regiones intercambiadas con la numeración de aminoácido. Se denominaron las posiciones de aminoácido basándose en el esquema de numeración de secuencias de HER2 humana maduras sin su péptido señal. Se monitorizaron los niveles de expresión de todas las variantes por un anticuerpo policlonal anti-His. Se caracterizaron los perfiles de unión de 39S a estas variantes usando un instrumento ProteOn™ basado en SPR captando variantes sobre superficies de sensor usando anticuerpos policlonales anti-Her2 humanos y de ratón. Captando proteínas de Her2 sobre superficies de sensor, se espera que las afinidades de unión aparentes medidas de 39S sean mayores que la afinidad de unión monovalente en el formato de inmovilización de 39S sobre superficies de chip.
Tabla 4. Perfiles de unión de 39S a variantes de HER2 humana/de ratón quiméricas
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Construcción y expresión de variantes de HER2 humana/de ratón quiméricas fue tal como sigue. Brevemente, se ensamblaron los ADN que codifican para variantes de HER2 humana/de ratón quiméricas con una cola de His y se amplificaron mediante PCR solapante usando plásmidos de HER2 humana y de ratón como plantillas (MedImmune). Se clonaron los ADN ensamblados en el vector de expresión pEBNA de mamífero (MedImmune). Entonces se transfectaron transitoriamente células HEK293F con los diversos constructos usando 293fectin y protocolos convencionales según las instrucciones del fabricante (Invitrogen).
Se estudiaron las características de unión de 39S a variantes quiméricas humanas/de ratón usando un instrumento ProteOn™ XPR36 (BioRad). Se usó acoplamiento amina estándar para inmovilizar un anticuerpo policlonal anti-HER2 humano o de ratón (R&D System) en acetato de sodio 10 mM (pH 5.0) a la superficie de un chip de biosensor GLC a ~5000 unidades de resonancia (RU) para cada canal. Se inyectaron las proteínas quiméricas en el sobrenadante de cultivo celular y se captaron por anticuerpos policlonales anti-ser humano o ratón sobre la superficie de GLC con una respuesta de ~200 RU. Se diluyó Acm 39S anti-HER2 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.4) con Tween-20 al 0.005% desde 10 nM hasta 0.625 nM (dilución 1:2), y se inyectó a 100 |jL/min durante 180 s con un tiempo de disociación de 600 segundos. Se monitorizaron los niveles de expresión de las variantes quiméricas haciendo fluir anticuerpo policlonal anti-His (MedImmune) en las mismas condiciones como en la inyección de 39S. Se regeneró la superficie dos veces inyectando tampón glicina (10 mM, pH 1.5) a 100 |jL/min durante 30 s. Se procesaron todos los datos de sensograma con el software ProteOn™ Manager 3.0.1.
Se usó un ensayo de competición de unión basado en FACS para determinar si los anticuerpos competían por la unión al mismo epítopo que trastuzumab, y/o pertuzumab. Se recogieron células BT-474, se resuspendieron en tampón FACS, y se añadieron 2.5 x 105 células/pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo en U. Se preparó el anticuerpo que va a someterse a prueba (control de isotipo de IgG1 R347, trastuzumab, pertuzumab, AZ1.39.1, y 39S) diluyendo en tampón FACS que contenía 2 |jg/mL de anticuerpo 39S marcado con Alexa Fluor 647 en una dilución en serie 1:4 gradual que oscila entre 500 jg/m L y 1.9 ng/mL y después se añadió a las células por triplicado. Después de 1 hora de tinción en hielo, se lavaron las células 3 veces con tampón FACS enfriado con hielo y después se fijaron con PFA al 2%. Se analizaron las células mediante una máquina Bd LSR II con software BD FACSDiva™. Se analizaron los datos con el software FlowJo y se presentaron como MFI medio E.E.M. (n=3).
La figura 4 muestra que 39S se une al mismo epítopo que su anticuerpo AZ1.39.1 parental; y 39S no compite con trastuzumab o pertuzumab por la unión. Los sitios de unión de 39S, pertuzumab y trastuzumab se indican por flechas sobre la estructura de cintas de HER2 proporcionada en la figura 3.
1.4. Actividad de 39S in vitro
Se seleccionó un panel de líneas celulares de cáncer humano que expresan diversos niveles de HER2 para evaluar la actividad antiproliferativa de anticuerpos o combinaciones de anticuerpo. Se determinó el nivel de expresión de HER2 en células por HercepTest® mediante FACS cuantitativo (tabla 5).
TABLA 5: Niveles de expresión de HER2 en líneas celulares de cáncer humano
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Ensayo de inhibición de proliferación: Se sembraron en placa células en medios de cultivo que contienen suero a una densidad de 5,000 a 20,000 por pocillo (dependiendo de las cinéticas de crecimiento de cada línea celular) de placas de 96 pocillos en un volumen de 100 |jL. Se preparó una concentración 2X de cada dosis de anticuerpo o combinación de anticuerpos que va a someterse a prueba diluyendo los artículos de prueba en medio de cultivo. Se añadieron cien microlitros de cada artículo de prueba a las células por triplicado de manera que la curva de dosis final oscilaba entre 10 jg/mL y 0.15 ng/mL en una serie de diluciones en serie 1:4 graduales. Para el ensayo de inhibición de proliferación dependiente de ligando, se sembraron en placa células en medios sin suero y se preparó una concentración 4X de cada dosis de anticuerpo o combinación de anticuerpos que va a someterse a prueba diluyendo los artículos de prueba en medio sin suero. Se añadieron cincuenta microlitros de cada artículo de prueba a células por triplicado y después se añadieron 50 jL de heregulina-p1 a una concentración de 32 ng/mL diluida en medio sin suero a células para alcanzar la concentración de heregulina-p1 final de 8 ng/mL y la curva de dosis de anticuerpo final oscilaba entre 100 jg/mL y 6.1 ng/mL en una serie de diluciones en serie 1:4 graduales. Se cultivaron las células tratadas a 37°C / CO 2 al 5% durante de 4 a 7 días (dependiendo de las cinéticas de crecimiento de cada línea celular particular). Se determinó la viabilidad celular usando Cell Titer Glo de Promega según las instrucciones del fabricante. Se analizaron los datos usando el software GraphPad Prism y se presentaron como porcentaje de inhibición de crecimiento en relación con el control sin tratar.
La figura 5 muestra que 39S tiene una actividad similar a pertuzumab inhibiendo la proliferación dirigida por ligando en células MCF-7. En combinación con trastuzumab o pertuzumab, 39S muestra inhibición aditiva o sinérgica de proliferación dependiente de ligando con potencia comparable a trastuzumab y combinación de pertuzumab. Se observaron resultados similares en otras líneas celulares tales como MDA-MB-361 y r T-112 (no se muestran los datos).
La figura 6 muestra que 39S, como pertuzumab, tiene una actividad limitada inhibiendo la proliferación celular de NCI-N87 en medios que contienen suero. Sin embargo cuando se combina con trastuzumab o pertuzumab 39S demuestra un efecto sinérgico fuerte inhibiendo el crecimiento celular. La sinergia entre 39S y trastuzumab o pertuzumab es mucho mayor de lo que se vio con la combinación de trastuzumab y pertuzumab. Se observaron resultados similares en células BT-474 (no se muestran los datos).
Ejemplo 2
2.1. Construcción de anticuerpo biespecífico
Clonación de B s2Ab-39SH, B s3A b-39S H y Bs4Ab-39SH. Se generaron constructos de expresión biespecíficos clonando los dominios variables para el anticuerpo de dominio IV de anti-HER2 (SEQ ID NO: 17 y 18 donde X es C) anticuerpo anti-HER2 39S (SEQ ID NO: 15 y 16) en vectores de expresión que comprenden las regiones constantes apropiadas. Se construyó el dominio de unión variable de dominio IV de anti-HER2 como Fv de cadena sencilla (scFv). Se diseñó y se sintetizó una secuencia de ADN con optimización de codones para la expresión de proteína de mamífero máxima usando las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18 (donde X-C) anteriores. Se generaron los constructos de Bs2Ab y Bs3Ab usando métodos similares a los descritos en Dimasi et al., (2009) J. Mol. Biol. 393, 672­ 692. Se generó el constructo Bs4Ab usando métodos similares a los descritos en la publicación de patente WO2013070565A1. El gen sintético final contiene dos mutaciones cisteína, una en la cadena ligera en la posición 100 y una en la cadena pesada en la posición 44, respectivamente. Estas cisteínas formarán un enlace disulfuro intercatenario entre los dominios VL y VH con el fin de estabilizar el scFv. Se unieron los dos dominios VL y VH del scFv usando 20 residuos de aminoácidos (G4S)4 (SEQ ID NO: 19). Se unió el scFv en Bs2Ab al extremo N-terminal de la cadena pesada usando un ligador de 10 residuos de aminoácido (G4S)2 (SEQ ID NO: 83). Se unió el scFv en el formato de Bs3Ab al extremo C-terminal del dominio CH3 de anticuerpo usando un ligador de 10 residuos de aminoácido (G4S)2 (SEQ ID NO: 83). Se usaron dos ligadores de secuencia (G4S)2 (SEQ ID NO: 83) para conectar el scFv en el esqueleto de Bs4Ab. Se determinó la identidad y fidelidad de constructo usando la secuencia de ADN.
La figura 7 proporciona un diagrama esquemático de cada uno de los formatos de anticuerpo biespecífico Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH, Bs4Ab-39SH (Paneles A, B y C, respectivamente) generados para unirse a antígeno He R2. Los anticuerpos biespecíficos tienen dos unidades de unión, cada una de las cuales se une a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Las unidades de unión se marcan en la figura. La molécula es simétrica de manera bilateral con respecto a las unidades de unión. Tal como se representa, los formatos Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH, Bs4Ab-39SH se refieren a anticuerpos biespecíficos en los que un scFv se fusiona al extremo amino-terminal de la región variable (Bs2Ab-39SH), se inserta en una región bisagra modificada (Bs4Ab-39SH) o el extremo carboxi-terminal de CH3 (Bs3Ab-39SH) de una cadena pesada a través de un ligador (p. ej., (G4S)2 (SEQ ID NO: 83)). Los tres constructos biespecíficos mostrados se componen de un scFv de unión a dominio IV de anti-HER2 fusionado a un dominio II de anti-HER2 de IgG humana mediante un ligador de glicina-serina (p. ej., (G4S)2 (SEQ ID NO: 83)).
Las secuencias de aminoácidos de los constructos Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH y Bs4Ab-39SH se proporcionan en la figura 8 (también véase SEQ ID NO: 30, 34 y 38 región Fc nativa). La figura 8A muestra las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de anticuerpo biespecífico para Bs2Ab-39SH y los posibles sitios de sustitución para ADCC potenciada y/o la conjugación anticuerpo-fármaco específica del sitio para dos y cuatro cargas de fármaco. El scFv de dominio IV de anti-HER2 está en el formato VL-(G4S)4 ligador-VH ('(G4S)4' divulgado como SEQ ID NO: 19) y está genéticamente unido al extremo amino-terminal de la cadena pesada del anticuerpo de dominio II de anti-HER2 mediante un ligador (G4S)2 (SEQ ID NO: 83). Las sustituciones y/o inserciones de aminoácido representadas dentro pueden realizarse en CH2 y CH3 del anticuerpo para ADCC potenciada y conjugación específica del sitio. La figura 8B muestra las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de anticuerpo biespecífico para Bs3Ab-39SH y los posibles sitios de sustitución para ADCC potenciada y/o la conjugación anticuerpo-fármaco específica del sitio para dos y cuatro cargas de fármaco. El scFv de dominio IV de anti-HER2 está en el formato VL-(G4S)4 ligador-VH ('(G4S)4' divulgado como SEQ ID NO: 19) y está genéticamente unido al extremo carboxi-terminal de la cadena pesada del anticuerpo de dominio II de anti-HER2 mediante un ligador (G4S)2 (SEQ ID NO: 83). Las sustituciones y/o inserciones de aminoácido representadas dentro pueden realizarse en CH2 y CH3 del anticuerpo para ADCC potenciada y conjugación específica del sitio. La figura 8C muestra las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de anticuerpo biespecífico para Bs4Ab-39SH y los posibles sitios de sustitución para ADCC potenciada y/o la conjugación anticuerpo-fármaco específica del sitio para dos y cuatro cargas de fármaco. El scFv de dominio IV de anti-HER2 está en el formato VL-(G4S)4 ligador-VH ('(G4S)4' divulgado como SEQ ID NO: 19) y se inserta en una región bisagra modificada de la cadena pesada del anticuerpo de dominio II de anti-HER2 mediante dos ligadores (G4S)2 (SEQ ID NO: 83). Las sustituciones y/o inserciones de aminoácido representadas dentro pueden realizarse en CH2 y CH3 del anticuerpo para ADCC potenciada y conjugación específica del sitio.
2.2. Especificidad de unión y reactividad cruzada entre especies de anticuerpo biespecífico
Se determinaron la especificidad de unión y reactividad cruzada entre especies de anticuerpos biespecíficos con la proteína de dominio extracelular recombinante de EGFR humana, HER2 humana, HER3 humana, HER4 humana, Her2 de ratón, o Her2 de macaco cangrejero mediante ELISA de captura tal como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados muestran que todos los anticuerpos biespecíficos sometidos a prueba, incluyendo Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH y Bs4Ab-39SH, pueden unirse a HER2 humana y Her2 de macaco cangrejero a una potencia similar y ninguno de ellos muestra unión a la EGFR, HER3, HER4 humanas, o la Her2 de ratón (no se muestran los datos), sugiriendo que los anticuerpos biespecíficos conservan la especificidad de unión de reactividad cruzada entre especies de sus anticuerpos monoclonales parentales.
Se determina la cinética de unión de los anticuerpos biespecíficos a HER2 humana y Her2 de macaco cangrejero mediante BIAcore (no se muestran los datos). La afinidad para HER2 humana (Kd) es 113 pM para Bs2Ab-39SH, y 236 pM para Bs4Ab-39SH.
2.3. Actividad in vitro de anticuerpo biespecífico
Se determinó la actividad de anticuerpo biespecífico en la inhibición de la proliferación celular dirigida por ligando usando métodos descritos en el Ejemplo 1. Los resultados muestran que Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH y Bs4Ab-39SH tienen similar potencia en células MDA-MB-361 (Figura 9A) y células MCF-7 (Figura 9B), que también es comparable con la actividad de la combinación de anticuerpos parentales (39S más trastuzumab). Se observaron resultados similares en otras líneas celulares incluyendo NCI-N87 y r T-112 (no se muestran los datos).
2.4. Perturbación de la heterodimerización HER2:HER3 por anticuerpo biespecífico
Se recogieron células T47D, se lavaron y se resuspendieron en medios sin suero. Se sembraron las células a una densidad de 1 x 106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos y entonces se incubaron durante la noche a 37°C/5% de CO2. Al día siguiente se pretrataron las células durante 1 hora con anticuerpo que iba a someterse a prueba (control de isotipo de IgG R347, trastuzumab, pertuzumab, 39S y Bs2Ab-39SH) a una concentración de 500 nM. Después del pretratamiento, se añadió heregulina-p1 a una concentración final de 8 ng/mL y se incubaron las células durante 5 min a 37°C/5% de CO2. Entonces se lavaron las células dos veces con PBS 1x enfriado con hielo, se lisaron y se obtuvieron inmunoprecipitados usando anticuerpo de ratón anti-HER2 humano (clon 44E7) y el kit Pierce Classic IP de Thermo Scientific según las instrucciones del fabricante. Se eluyeron muestras de proteína inmunoprecipitada en tampón Laemmli que contenía 2-mercaptoetanol y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un protocolo estándar. Se usó anticuerpo de conejo anti-HER2 humano (clon 29D8) para detectar HER2 y anticuerpo policlonal de conejo anti-HER3 humano (C-17) para detectar HER3 en el análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
La figura 10 muestra que Bs2Ab-39SH y 39S, similares a pertuzumab, pueden perturbar la heterodimerización HER2:HER3 inducida mediante estimulación de ligando.
2.5. Agrupación de HER2 por anticuerpo biespecífico
Para examinar si el anticuerpo biespecífico puede reticular HER2 para formar un complejo grande, se mezcló la proteína de dominio extracelular de HER2 humana recombinante con Bs2Ab-39SH o trastuzumab a diversas razones molares y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Se separaron los inmunocomplejos formados mediante cromatografía de exclusión molecular-HPLC; se analizaron entonces los tamaños de los mismos mediante ensayo de dispersión de luz en multiángulo (MALS).
La figura 11 muestra los datos representativos derivados de una razón molar de anticuerpo:HER2 de 1:1 (no se muestran datos a otras razones molares). Los resultados indican que Bs2Ab-39SH puede reticular muchas moléculas de HER2 para formar un complejo de proteína de hasta 1716 kDa de tamaño, mientras que trastuzumab sólo puede unirse a dos moléculas de HER2 como máximo para formar un complejo de 320 kDa. Se observaron resultados similares con Bs4Ab-39SH (no se muestran los datos).
2.6. Internalización y tráfico lisosómico potenciados por anticuerpo biespecífico
Se midió la intemalización de anticuerpo mediante FACS. Se recogieron células BT-474 de un frasco T150, se resuspendieron en medios de cultivo enfriados con hielo y se añadieron entonces a una placa de 96 pocillos de fondo en U a 1 x 106 células/pocillo. Se sedimentaron las células mediante centrifugación a 4°C. Se retiraron los medios mediante golpecitos, y se resuspendieron los sedimentos celulares por triplicado en 150 |jL de medios de cultivo enfriados con hielo que contenían 10 jg/m L de anticuerpo o combinación de anticuerpos que iba a someterse a prueba (control de isotipo de IgG R347, trastuzumab, pertuzumab, AZ1.39.1, 39S, trastuzumab+39S, trastuzumab+pertuzumab, pertuzumab+39S, trastuzumab+pertuzumab+39S, Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH y Bs4Ab-39SH). Se incubaron las células en hielo durante 1 hora y entonces se lavaron para retirar anticuerpos no unidos. Se mantuvo una alícuota de células en hielo; se incubó el resto a 37°C/5% de CO2 durante un periodo de tiempo diferente (30 min, 1 hora, 2 horas o 4 horas) y entonces se enfrió en hielo inmediatamente. Se lavaron las células dos veces con tampón FACS enfriado con hielo y entonces se fijaron con PFA al 4% durante 20 min. Después de la fijación, se tiñeron las células con anticuerpo anti-IgG humana con Alexa-Fluor 488 y se analizaron mediante una máquina BD LSR II y software BD FACSDiva™. Se analizaron los datos con software FlowJo. Se calculó la internalización de complejo receptor-anticuerpo como porcentaje de la pérdida de intensidad de fluorescencia media (MFI) a 37°C en relación con lo que había en hielo después de restarse el valor del fondo de MFI derivado del control sin tratar.
La figura 12 muestra que el anticuerpo biespecífico (Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH, Bs4Ab-39SH) puede inducir una internalización mucho más rápida y más intensa que cualquier anticuerpo monoespecífico individual o combinación de anticuerpos. Pertuzumab, AZ1.39.1, trastuzumab+pertuzumab, pertuzumab+39S y trastuzumab+pertuzumab+39S tienen perfiles de internalización similares al o menores del de 39S y no se muestran en el gráfico. Se observaron resultados similares en las líneas celulares NCI-N87, MDA-MB-361 y RT-112 (no se muestran los datos).
Se usó el método de microscopía confocal para visualizar la internalización de anticuerpo y el tráfico lisosómico. Se recogieron células BT-474 de un frasco T-150 y se resuspendieron en medios de cultivo enfriados con hielo y se añadieron entonces a una placa de 96 pocillos de fondo en U a 2.5 x 105 células/pocillo. Se sedimentaron las células mediante centrifugación a 4°C. Se retiraron los medios mediante golpecitos, y se resuspendieron los sedimentos celulares en 150 jL de medios de cultivo enfriados con hielo en presencia de 10 jg/m L de anticuerpo que iba a someterse a prueba, tal como control de isotipo de IgG R347, trastuzumab, Bs2Ab-39SH y Bs4Ab-39SH. Se incubaron las células a 37°C/5% de CO2 durante un periodo de tiempo diferente (30 min, 2 horas, 4 horas o 6 horas) y entonces se enfriaron en hielo inmediatamente. Se lavaron las células dos veces con tampón FACS enfriado con hielo y entonces se fijaron y se permeabilizaron usando disolución de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm™ de BD Biosciences según las instrucciones del fabricante. Se tiñeron las células en la oscuridad con anticuerpo anti-IgG humana con Alexa-Fluor 488, y anticuerpo de ratón anti-LAMP-1 humano (clon H4A3) seguido por anticuerpo anti-IgG de ratón con Alexa-Fluor 647. Después de la tinción, se sometieron las células a citocentrifigación sobre portaobjetos de carga positiva y se taparon con cubreobjetos con reactivo protector de fluorescencia de oro ProLong® que contiene DAPI. Entonces se visualizaron las células mediante un microscopio confocal Leica SP5 y el paquete de software de fluorescencia avanzado Leica Application Suite.
La figura 13 muestra la internalización de anticuerpo y el tráfico a los lisosomas. Tanto Bs2Ab-39SH como Bs4Ab-39SH promueven una internalización mucho más rápida y un tráfico lisosómico más intenso que trastuzumab, que muestra poca a ninguna internalización (no se muestran los datos para Bs4Ab-39SH).
Se usó análisis de inmunotransferencia de tipo Western para monitorizar la degradación lisosómica de HER2. Se recogieron células BT-474, se lavaron y se resuspendieron en medios de cultivo. Se sembraron las células a una densidad de 5 x 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se trataron a 37°C/5% de CO2 con anticuerpo que iba a someterse a prueba (control de isotipo de IgG R347, trastuzumab, pertuzumab, 39S, trastuzumab+pertuzumab, trastuzumab+39S, pertuzumab+39S, trastuzumab+pertuzumab+39S, Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH y Bs4Ab-39SH) a una concentración de 500 nM durante 2 horas, 6 horas o 24 horas. Al final del tratamiento, se lavaron las células dos veces con PBS 1x enfriado con hielo y entonces se lisaron en tampón de extracción de proteínas de mamífero M-PER de Thermo Scientific según las instrucciones del fabricante. Se midió la concentración de proteína de cada lisado mediante el ensayo de BCA. Se cargó una cantidad igual de proteína en cada lisado sobre gel en la inmunotransferencia de tipo Western. Se usaron anticuerpo de conejo anti-HER2 humano (clon 29D8) y anticuerpo de conejo anti-GAPDH humano (clon D16H11) para detectar HER2 y g Ap DH, respectivamente.
La figura 14 muestra que el tratamiento con el anticuerpo biespecífico (Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH o Bs4Ab-39SH) conduce a la degradación significativa de HER2 en células BT-474, y el anticuerpo monoespecífico o la combinación de anticuerpos no induce degradación o induce degradación limitada de HER2.
Ejemplo 3
3.1. Clonación de mutantes específicos del sitio para conjugación específica del sitio y para la ablación de actividades de unión a receptor de Fc gamma
Se usaron métodos de PCR solapante convencionales para introducir la mutación L234F, S239C y S442C, independientemente o en combinación (L234F-S239C (FC) y L234F-S239C-S442C (FCC)) en la parte de Fc de los constructos Bs2Ab-39SH y Bs4Ab-39SH. Se diseñaron los cebadores para contener mutaciones y cebadores flanqueantes deseados, que contenían sitios de restricción para facilitar la clonación direccional, se usaron para amplificar los fragmentos Fc que contenían las mutaciones específicas. Se clonaron productos de PCR con Fc modificado en vectores de expresión de mamífero usando sitios de restricción definidos. Se confirmaron las identidades de las mutaciones de Fc mediante análisis de secuencia de ADN.
La figura 15 muestra ilustraciones de tres anticuerpos anti-HER2 biespecíficos, (Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH, Bs4Ab-39SH) con sustituciones de aminoácidos para conjugación específica del sitio. Además, se usa la sustitución L234F en el CH2 de la cadena pesada de anticuerpo (no se representa en la figura) para minimizar la unión al receptor de Fc gamma. Cuando se desea una DAR de 2 se modifica por ingeniería una sustitución de cisteína en el sitio 1 (p. ej., S239C) o el sitio 2 (p. ej., S442C), y para una DAR de 4 se modifica por ingeniería una sustitución de cisteína en ambos sitios. Los constructos de anticuerpo biespecífico-fármaco también se denominan en la presente Bs2-2T/Bs2-4T, Bs3-2T/Bs34T y Bs4-2T/Bs4-4T.
Se conjugaron los anticuerpos biespecíficos resultantes con la carga útil de tubulisina 1508 esencialmente tal como se describe a continuación (véase el Ejemplo 5).
3.2. Especificidad de unión y reactividad cruzada entre especies de ADC biespecífico
Para determinar si la conjugación de tubulisina 1508 altera la especificidad de unión a antígeno y la reactividad cruzada entre especies, se confirmaron la actividad de unión de ADC biespecífico a la proteína de dominio extracelular recombinante de EGFR humana, HER2 humana, HER3 humana, HER4 humana, Her2 de ratón y Her2 de macaco cangrejero mediante ELISA de captura tal como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados muestran que la conjugación no cambió la especificidad de unión a antígeno ni la reactividad cruzada entre especies del ADC biespecífico. Tanto Bs2-4T como Bs4-4T pueden unirse a HER2 humana y Her2 de macaco cangrejero a la misma potencia que su versión no conjugada; y ninguno de ellos muestra unión a EGFr , HER3, HER4 humanas o Her2 de ratón (no se muestran los datos). Se determina la cinética de unión del ADC biespecífico a HER2 humana mediante BIAcore y los resultados muestran que la afinidad para HER2 humana (Kd) es 120 pM para Bs2-4T, y 271 pM para Bs4-4T.
3.3. Perturbación de la red de microtúbulos intracelular por ADC biespecífico
Para examinar la perturbación de la red de microtúbulos intracelular por ADC anti-HER2, se seleccionaron tres líneas celulares: SKOV-3, JIMT-1 y RT112, que representan los pacientes elegibles para T-DM1, los que no responden a T-DM1 y los no elegibles para T-DM1, respectivamente. En el día 1, se recogieron las células mediante tripsinización, se resuspendieron en medios de cultivo, y entonces se sembraron en portaobjetos de cámara de 8 pocillos a una densidad de 6 x 104 células/pocillo. Se incubaron los portaobjetos a 37°C/5% de CO2 durante la noche. En el día 2, se aspiraron los medios para retirar cualquier cantidad de células no adheridas y entonces se añadieron a las células nuevos medios que contenían ADC 5 nM que iba a someterse a prueba. Se incubaron los portaobjetos a 37°C/5% de CO2 durante la noche. En el día 3, se lavó cada cámara dos veces con PBS 1x. Entonces se fijaron las células con PFA al 4% durante 20 min. Al final de la fijación, se retiraron las cámaras y se tiñeron los portaobjetos después de procedimientos de inmunofluorescencia convencionales. Brevemente, se permeabilizaron las células usando Triton X-100 y se lavaron con PBS 1x que contenía Tween-20. Se diluyó anticuerpo de conejo anti-a-tubulina humana con Alexa-Fluor 488 (clon 11H10) 1:100 en diluyente de anticuerpo DAKO y se añadió a los portaobjetos. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, se taparon los portaobjetos con cubreobjetos con reactivo de protección de fluorescencia de oro ProLong® que contenía DAPI. Se visualizaron las células teñidas mediante el microscopio confocal Leica SP5 y el paquete de software de fluorescencia avanzado Leica Application Suite.
La figura 16A muestra en SKOV-3, una línea celular que representa los pacientes elegibles para T-DM1, que tanto T-DM1 como Bs2-4T pueden perturbar las redes de microtúbulos. Se observaron resultados similares en células SKBR-3 (no se muestran los datos).
La figura 16B muestra en JIMT-1, una línea celular que representa a pacientes que no responden a T-DM1, que sólo Bs2-4T puede perturbar las redes de microtúbulos intracelulares.
La figura 16C muestra en RT-112, una línea celular que representa los pacientes no elegibles para T-DM1, que Bs2-4T puede perturbar las redes de microtúbulos intracelulares, mientras que T-DM1 es inactivo.
3.4. Actividad in vitro de ADC biespecífico
Se usó un panel de líneas celulares de cáncer humano que expresan diversos niveles de HER2 para evaluar la actividad citotóxica de ADC biespecífico (tabla 5 en el Ejemplo 1). Brevemente, se recogieron las células, se resuspendieron, y se sembraron en placa en medios de cultivo que contenían suero a una densidad de 5,000 a 20,000 por pocillo (dependiendo de la cinética de crecimiento de cada línea celular) de placas de 96 pocillos en un volumen de 100 |jL. Se preparó una concentración 2X de cada dosis de anticuerpo o ADC que iba a someterse a prueba diluyendo los artículos de prueba en medio de cultivo. Se añadieron cien microlitros de cada artículo de prueba a células por triplicado de manera que la curva de dosis final oscilaba entre 5 nM y 0.08 pM en una serie de diluciones en serie 1:4 graduales. Se incubaron las células tratadas a 37°C/5% de CO2 durante de 3 a 4 días, dependiendo de la cinética de crecimiento de cada línea celular particular. Se determinó la viabilidad celular usando Cell Titer Glo según las instrucciones del fabricante. Se analizan los datos mediante el software GraphPad Prism y se presentan como el porcentaje de inhibición del crecimiento en relación con el control sin tratar. Se determinaron valores de CE50 usando análisis de regresión no lineal sigmoideo con el software GraphPad Prism y se resumieron en la tabla 6.
Tabla 6: Potencia in vitro de ADC anti-HER2 en un panel de líneas celulares de cáncer (CE50 en pM)
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La figura 17A muestra la actividad citotóxica de Bs2-2T y Bs2-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en SKBR-3, una línea celular de cáncer de mama humano que representa los pacientes elegibles para T-DM1. Los datos indican que tanto Bs2-2T como Bs2-4T son más potentes que T-DM1 en células SKBR-3.
La figura 17B muestra la actividad citotóxica de Bs4-2T y Bs4-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en SKBR-3, una línea celular de cáncer de mama humano que representa los pacientes elegibles para T-DM1. Los datos indican que tanto Bs4-2T como Bs4-4T son más potentes que T-DM1 en células SKBR-3.
La figura 18A muestra la actividad citotóxica de Bs2-2T y Bs2-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en JIMT-1, una línea celular de cáncer de mama humano que representa a los pacientes elegibles para pero que no responden a T-DM1. Los datos indican que tanto Bs2-2T como Bs2-4T son muy potentes en la destrucción de células JIMT-1, mientras que T-DM1 no muestra actividad.
La figura 18B muestra la actividad citotóxica de Bs4-2T y Bs4-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en JIMT-1, una línea celular de cáncer de mama humano que representa a los pacientes elegibles para pero que no responden a T-DM1. Los datos indican que tanto Bs4-2T como Bs4-4T son muy potentes en la destrucción de células JIMT-1, mientras que T-DM1 no muestra actividad.
La figura 19A muestra la actividad citotóxica de Bs2-2T y Bs2-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en ZR-75-1, una línea celular de cáncer de mama humano que representa los pacientes no elegibles para T-DM1. Los datos indican que Bs2-4T es el más activo en la destrucción de células ZR-75-1, mientras que Bs2-2T tiene un menor nivel de actividad y T-DM1 no muestra actividad citotóxica o muestra actividad citotóxica limitada.
La figura 19B muestra la actividad citotóxica de Bs4-2T y Bs4-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en ZR-75-1, una línea celular de cáncer de mama humano que representa los pacientes no elegibles para T-DM1. Los datos indican que Bs4-4T es el más activo en la destrucción de células ZR-75-1, mientras que Bs4-2T tiene un menor nivel de actividad y T-DM1 no muestra actividad citotóxica o muestra actividad citotóxica limitada.
La figura 20 muestra la actividad citotóxica de Bs2-2T y Bs2-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en MDA-MB-468, una línea celular de cáncer de mama humano sin expresión de HER2. Los datos indican que ni Bs2-2T ni Bs2-4T es activo en células MDA-MB-468, lo que indica que la actividad citotóxica de Bs2-2T y Bs2-4T depende de la diana (es decir HER2). Se observaron resultados similares con Bs4-2T y Bs4-4T (no se muestran los datos).
3.5. Actividad in vitro de constructos de ADC biespecíficos
Modelos tumorales de xenoinjerto basado en línea celular (CBX) y modelos tumorales de xenoinjerto derivado de paciente (PDX): Se llevaron a cabo todos los experimentos en ratones en cumplimiento con las directrices publicadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) y protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de MedImmune. Se usaron ratones desnudos atímicos de entre 4-8 semanas de edad en los estudios. En modelos de CBX subcutáneos, se inyectó a los animales de manera unilateral en el flanco derecho células tumorales recogidas de cultivo en un lote de pase específico. En modelos de CBX ortotópicos, se establecieron xenoinjertos inyectando 5 x 106 células por ratón (suspendidas en Matrigel al 50%) en el panículo adiposo mamario en el flanco derecho de los animales. En modelos de PDX, se implanta a los animales de manera unilateral en el flanco fragmentos tumorales recogidos de los animales huésped implantados cada uno de un lote de pase específico. Se registraron los volúmenes tumorales antes del estudio para cada experimento comenzando aproximadamente una semana antes de su fecha de inicio estimada. Cuando los tumores alcanzan el intervalo de iniciación de volumen tumoral apropiado (TVI) (normalmente 150-250 mm3), se aleatorizan los animales en grupos de tratamiento y control y se inicia la dosificación. Se dosificó a los animales una vez a la semana a menos que se especifique de otro modo artículos de prueba mediante inyección intravenosa o intraperitoneal. Se observaron los animales diariamente y se midieron las dimensiones tumorales y los pesos corporales y se registraron dos veces a la semana. Se calculan los volúmenes tumorales usando la siguiente fórmula: volumen tumoral= n 6 (longitud x anchura2). Se presentó la curva de crecimiento tumoral como el volumen tumoral medio (mm3) ± E.E.M.
La figura 21A muestra que incluso a menores concentraciones (1 mg/kg) Bs2-4T tiene mayor actividad in vivo en relación con T-DM1 (3 mg/kg) y diversos controles (todos a 3 mg/kg) en el modelo MDA-MB-361, un modelo tumoral de CBX de cáncer de mama humano que representa los pacientes no elegibles para T-DM1. Los datos demuestran que Bs2-4T indujo una inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosis, y a una dosis de 3 mg/kg Bs2-4T indujo una regresión tumoral completa mientras que T-DM1 mostró actividad limitada. A 3 mg/kg Bs4-4T también presentó mayor actividad in vivo en relación con T-DM1 (Figura 21B).
La figura 22 muestra la actividad in vivo de Bs2-2T en relación con Bs2-4T y T-DM1 en el modelo ST996. ST996 es un modelo de PDX primario derivado de un paciente con cáncer de mama triple negativo (IHC de HER2: 1+; ER-; PR-). Los datos demuestran que Bs2-2T a una dosis de 3 mg/kg indujo una robusta inhibición del crecimiento tumoral, aunque su potencia antitumoral se redujo ligeramente en comparación con Bs2-4T. En cambio, T-DM1 no mostró actividad en el modelo ST996. Se observaron resultados similares en los modelos de PDX con baja expresión de HER2 adicionales ST738, ST455B y ST821 (no se muestran los datos).
La figura 23 muestra la actividad in vivo de Bs2-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en el modelo ST225, un modelo tumoral de PDX de cáncer de mama humano que representa pacientes elegibles para T-DM1. Los datos demuestran que Bs2-4T a una dosis de 3 mg/kg indujo una regresión tumoral completa y duradera. En cambio, T-DM1 sólo indujo estasis tumoral durante la fase de tratamiento y el tumor volvió a crecer rápidamente después de detenerse el tratamiento.
La figura 24 muestra la actividad in vivo de Bs2-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en el modelo JIMT-1, un modelo tumoral ortotópico de CBX de cáncer de mama humano que representa pacientes elegibles para pero que no responden a T-DM1. Los datos demuestran que Bs2-4T a una dosis de 3 mg/kg indujo una regresión tumoral completa y duradera. En cambio, T-DM1 o la combinación de T-DM1 más pertuzumab no mostraron actividad.
La figura 25 muestra la actividad in vivo de Bs2-4T en relación con T-DM1 y diversos controles en el modelo ST455B. ST455B es un modelo de PDX primario derivado de un paciente con cáncer de mama triple negativo (IHC de HER2: 1+, ER-, PR-). Los datos demuestran que Bs2-4T a una dosis de 3 mg/kg indujo regresión tumoral completa mientras que T-DM1 no mostró actividad. Para ampliar adicionalmente el hallazgo mostrado en la figura 25, se examinó Bs2-4T en otros 16 modelos de PDX derivados de pacientes con cáncer de mama con niveles relativamente bajos de expresión de HER2 (de 1 a 2 mediante HercepTest). También se consideraron otros criterios en la selección de estos modelos, incluyendo el grado de heterogeneidad en la expresión de HER2, el estado de ER/PR y la subclase histopatológica, para maximizar la diversidad de subtipos tumorales en el estudio. La tabla 7 resume la actividad in vivo de Bs2-4T en estos 17 modelos de PDX de cáncer de mama diferentes. Bs2-4T demostró potente actividad antitumoral independientemente de la subclase histopatológica y el estado de ER/PR del tumor. A la dosis de 1 mg/kg, el 41% de los modelos tumorales mostraron regresión tumoral y el 6% mostró estasis tumoral. A la dosis de 3 mg/kg, el 71% de los modelos mostraron regresión tumoral y el 12% mostró estasis tumoral.
Estos estudios demuestran la actividad superior del ADC biespecífico de la presente invención en comparación con terapias con ADC monoespecíficos (p. ej. T-DM1) a través un amplia gama de modelos de cáncer de mama. En particular, el ADC biespecífico de la presente invención tiene actividad in vivo en modelos de cáncer con bajos niveles de expresión de HER2 y en modelos de pacientes que no responden a T-DM1.
Tabla 7: Resumen de eficacia in vivo de Bs2-4T en un panel de modelos de PDX de cáncer de mama que representan pacientes con bajo nivel de HER2/no elegibles para T-DM1. En el punto de tiempo que muestra una respuesta máxima al tratamiento con Bs2-4T, si el volumen tumoral disminuye en comparación con el volumen tumoral a la dosificación iniciada (TVI), se expresa la eficacia in vivo como el porcentaje de cambio del volumen tumoral a lo largo del TVI. Si no, se expresa la eficacia in vivo como el porcentaje de cambio del volumen tumoral en relación con el control de vehículo. Se clasificó la capacidad de respuesta al tratamiento como "regresión" si el volumen tumoral disminuyó en >20%, "estasis" si el volumen tumoral cambió en <20%, y "progresión" si el volumen tumoral aumentó en >20%.
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3.6. Actividad de ADC biespecífico en modelos tumorales con resistencia a T-DM1 adquirida
Se generaron células NCI-N87 con resistencia adquirida a T-DM1 a través del tratamiento continuo con una concentración de T-DM1 aumentada gradualmente hasta 5 |jg/mL. Se examinó la actividad citotóxica in vitro de Bs2-4T en relación con T-DM1 en líneas celulares tanto parentales como resistentes tal como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados mostrados en la figura 26A indican que tanto Bs2-4T como T-DM1 son activos en las células NCI-N87 parentales aunque Bs2-4T es más potente que T-DM1 (panel izquierdo). En la línea celular resistente, T-DM1 ha perdido la actividad, mientras que Bs2-4T es todavía activo en la destrucción de las células resistentes (panel derecho). También se generaron otras líneas celulares resistentes a través del tratamiento continuo con T-DM1, incluyendo BT-474, SKOV-3 y MDA-MB-361, y se observó actividad citotóxica similar con Bs2-4T en estas líneas celulares resistentes (no se muestran los datos).
Para establecer un modelo tumoral in vivo con resistencia a T-DM1 adquirida, se inyectaron por vía subcutánea las células NCI-N87 resistentes a T-DM1 a los ratones inmunodeficientes. Se trataron los ratones que portaban tumor con 3 mg/kg de T-DM1. Pareció que la resistencia a T-DM1 in vitro no se traducía completamente en resistencia in vivo, reflejado por variaciones considerables en el crecimiento tumoral entre animales. Por tanto, se seleccionaron ratones con grandes tumores refractarios (~1000 mm3 de volumen) y se hicieron pasar los fragmentos de tejido tumoral a nuevos ratones hasta que los tumores crecieron uniformemente en presencia de tratamiento semanal de T-DM1 3 mg/kg. Después de tres pases, evolucionaron tumores resistentes estables y se fragmentaron estos tumores y se implantaron en ratones para evaluar la actividad in vivo de Bs2-4T. Tal como se demuestra en la figura 26B, los tumores que presentaron recidiva a partir del tratamiento con T-DM1 repetido eran no sólo resistentes a T-DM1, sino también sin respuesta al tratamiento de combinación con T-DM1 y pertuzumab. En cambio, Bs2-4T indujo una regresión tumoral robusta y sostenida después del tratamiento, sugiriendo que su potencial como terapia eficaz para los pacientes que presentan recidiva/son refractarios para T-DM1.
La figura 26B muestra que Bs2-4T induce regresión tumoral en el modelo tumoral NCI-N87 resistente a T-DM1. Se muestran curvas de crecimiento tumoral, en respuesta a la dosificación intravenosa semanal de Bs2-4T (3 mg/kg), T-DM1 (3 mg/kg) u otro anticuerpo de control/ADC (3 mg/kg, excepto para pertuzumab que es 10 mg/kg) para un total de 4 dosis, se muestran como el volumen tumoral medio (mm3) ± E.E.M. (n=7). *P < 0.001 mediante la prueba de la t de Student en comparación con el grupo control sin tratar.
3.7. La actividad antitumoral in vivo de ADC biespecífico no se atenúa mediante el pretratamiento de trastuzumab
Se implantaron de manera unilateral fragmentos de tumor de PDX ST225 en el flanco de ratones desnudos atímicos. Se aleatorizaron los ratones en grupos de tratamiento y control y se inició la dosificación cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 200-250 mm3. En los grupos de tratamiento, a los ratones o bien se les dosificó tampón de vehículo o bien trastuzumab (3 mg/kg). Tres días más tarde, los ratones recibieron una inyección intravenosa semanal de Bs2-4T para un total de 4 dosis. La figura 27 muestra que pretratamiento de trastuzumab no atenúa la actividad antitumoral de Bs2-4T en el modelo de PDX ST225, sugiriendo que puede no ser necesario un periodo de lavado si se usa Bs2-4T para tratar pacientes que presentan recidiva/son refractarios para trastuzumab o T-DM1. ST225 es un modelo de PDX de cáncer de mama primario con sobreexpresión de HER2. Se presentan curvas de crecimiento tumoral en respuesta a diversos tratamientos en la figura 27 como el volumen tumoral medio (mm3) ± E.E.M. (n=10).
3.8. Efecto de vecindad de ADC biespecífico
Se transfectaron de manera estable células NCI-N87 con proteína fluorescente verde (GFP) y se transfectaron de manera estable células MDA-MB-468 con proteína fluorescente roja (RFP). Se recogieron ambas líneas celulares, se lavaron, se resuspendieron en medios de cultivo y entonces se sembraron en una placa de 6 pocillos como co-cultivo. Como control, se sembró cada línea celular en una placa de 6 pocillos diferente como cultivo individual (Figura 28A). Para ajustarse a diferentes cinéticas de crecimiento, se sembraron células NCI-N87 a 5 x 105 células/pocillo y se sembraron células MDA-MB-468 a 2 x 105 células/pocillo. Se incubaron las células durante 2 días a 37°C/5% de CO2. Se aspiraron los medios y se añadieron a las células nuevos medios que contenían 5 nM de anticuerpo o ADC que iba a someterse a prueba y se incubaron las placas durante 4 días a 37°C/5% de CO2. Al final del tratamiento, se recogieron las células en cada pocillo, se lavaron, se resuspendieron en 100 |jL de tampón FACS enfriado con hielo y entonces se fijaron con PFA al 2%. Se analizaron las células mediante una máquina BD LSR II y software BD FACSDiva™. Se analizaron los datos con software FlowJo.
La figura 28B demuestra que Bs2-4T puede destruir tanto células que expresan HER2 como células nulas para HER2 en un co-cultivo, sugiriendo que Bs2-4T tiene efecto de vecindad. En cambio, T-DM1 no puede destruir células nulas para HER2 en un co-cultivo, sugiriendo que no tiene efecto de vecindad. Como controles, tanto Bs2-4T como T-DM1 mostraron una potente destrucción de células NCI-N87 en cultivos individuales y ni Bs2-4T ni T-DM1 mostraron destrucción de células MDA-MB-468 en cultivos individuales (no se muestran los datos).
3.9. Actividad de ADC biespecífico frente a células madre cancerosas
Ensayo de esferas de células madre cancerosas: Se cultivaron células MDA-MB-361 en condiciones de cultivo tisular convencionales en medio L-15 de Leibovitz complementado con FBS al 20%. Se recogieron las células mediante tripsinización, se lavaron dos veces con PBS, y se resuspendieron hasta 30,000 células por mL en medio de células madre (SCM: DMEM/F12 complementado con EGF 20 ng/mL, bFGF 10 ng/mL, insulina 5 mg/mL, BSA al 0.4% y sustituto de suero de desactivación al 1%). Para formar esferas primarias, se sembró 1 mL de células en placas de ultra baja adhesión de 24 pocillos y se trató con 10 pM de cualquiera de R347-4T T-DM1 o BS2-4T y se incubó durante 4 días a 37oC/5% de CO2. Al final del tratamiento, se recogieron las esferas primarias, se disociaron usando tripsina al 0.05% y se resuspendieron a una densidad de 30,000 células/mL en SCM que contenía el mismo tratamiento con anticuerpo que el cultivo de esferas primarias. Entonces se sembraron las células por triplicado en placas de ultra baja adhesión de 96 pocillos y se incubaron durante 4 días. Se determinó la viabilidad celular usando Cell Titer Glo según las instrucciones del fabricante. Se presentan los datos son como las veces de formación de esferas CSC en relación con el control sin tratar. La figura 29 (panel izquierdo) muestra que Bs2-4T inhibió la formación de esferas CSC en el 84% y T-DM1 no tuvo actividad en la inhibición de la formación de esferas CSC. Se observaron resultados similares en otras líneas celulares de cáncer incluyendo BT-474, JIMT-1 y T47D (no se muestran los datos).
Evaluación de células madre cancerosas en tumores dexenoinjerto tratados con Bs2-4T: Se extirparon tumores de estudio de xenoinjerto MDA-BM-361 que evaluaban la actividad in vivo de Bs2-4T, se cortaron en trozos de 4 mm y se crioconservaron usando Cryostor. Se descongelaron a 37°C los trozos de tumor congelados, se lavaron dos veces en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y se trituraron además usando hojas de bisturí estériles. Para obtener suspensiones monocelulares, se mezclaron los trozos de tumor con 200 unidades de colagenasa III ultrapura por mL de medio DMEM/F12. Se incubó la suspensión tumoral a 37°C durante aproximadamente 1 hora, con perturbación mecánica cada 30 minutos. Al final de la incubación, se filtraron las células a través de una malla de nailon de 70 |jm y se lavaron dos veces con HBSS. Después del último lavado, se pusieron las células a través de un filtro celular de 40 jm y se contaron usando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell XR. Se sometieron a ensayo las células para determinar la actividad aldehído deshidrogenasa como una medida de CSC usando el kit Aldefluor de Stemcell Technologies y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se hicieron pasar las células por un citómetro de flujo LSRII y se analizaron con FlowJo. La figura 29 (panel derecho) muestra que el tratamiento con Bs2-4T dio como resultado la reducción de CSC en el 54% en el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MDA-MB-361.
Ejemplo 4
4.1. Producción y caracterización de anticuerpos biespecíficos afucosilados
Se expresaron los anticuerpos biespecíficos usando la tecnología POTELLEGENT™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.) para generar anticuerpos afucosilados que tienen actividad ADCC potenciada. La tabla 8 muestra la Kd (nM) tal como se mide mediante BIAcore de los anticuerpos biespecíficos Bs2Ab-39SH y Bs4Ab-39SH y trastuzumab con fucosilación (_Fuc) y sin fucosilación (_aFuc) que se unen a receptores de Fc gamma (FcyRs) y C1q demostrando que los anticuerpos afucosilados tienen unión potenciada a FcyRI, y ambos alelos de FcYRIIIa.
Tabla 8: Kd (nM) medida mediante BIAcore
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Medición de constantes de unión de equilibrio: Receptores de Fc gamma humanos: Se midieron las constantes de unión (Kd) para la unión de anticuerpos anti-HER2 biespecíficos a FcyR humanos en un instrumento ProteOn XPR36. Brevemente, se inmovilizaron los anticuerpos biespecíficos a alta densidad sobre un chip sensor de GLC usando una química de acoplamiento de amino convencional tal como se expone brevemente por el fabricante del instrumento. La densidad de superficie final de IgG midió aproximadamente 3000 UR. También se preparó una celda de flujo de referencia en este chip sensor usando el protocolo de inmovilización idéntico menos la proteína. Se prepararon disoluciones madre de cada FcyR a o bien 4000 nM, o bien 16,000 nM o bien 32,000 nM en tampón del instrumento (solución salina tamponada con fosfato [PBS]/Tween/tampón de ácido etilendiaminotetraacético [EDTa ] que contenía fosfato 50 mM, pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM y Tween-20 al 0.005%), y entonces se diluyó en serie (1:3) en el mismo tampón para obtener la serie de concentración deseada para cada receptor: 1.82 nM-4,000 nM (FcyRI), 197.5 nM-16,000 nM (FcyRIIA), 395.1 nM-16,000 nM (FcYRIIb), 21.9 nM-16,000 nM (hFcgRIIIA-158V) y 395-32,000 mM (FcyRIIIA-158F). Se inyectó cada concentración de FcyR tanto sobre la superficie celular de anticuerpo biespecífico como de referencia a una velocidad de flujo de 25 |jL/min durante 8 min, durante lo cual se recopilaron datos de unión. Entre inyecciones, se regeneraron las superficies (es decir, se retiró el FcyR unido) con un pulso de 60 s de HCl 5 mM. También se intercalaron varias inyecciones de tampón en la totalidad de la serie de inyección. Después, se usó uno de estas inyecciones de tampón junto con los datos de la celda de referencia para corregir los datos de unión para cualquier artefacto de inyección (p. ej., unión inespecífica) a través de una técnica denominado comúnmente "doble referenciación" (Myszka, 1999). Después de recopilarse todos los datos de unión, se promediaron conjuntos de datos individuales para la unión (respuesta a equilibrio [Req]) a cada concentración (C), y entonces se ajustaron a una representación gráfica de isoterma de unión 1:1 (Req frente a C). A partir de esto, se derivaron las constantes de unión de equilibrio, Kd , usando el software de evaluación del proveedor, versión 3.1.0.6.
Medición de constantes de unión de equilibrio: Proteína FcRn humana: Se midió la afinidad (Kd) para la unión de los anticuerpos biespecíficos a proteína FcRn humana (huFcRn) en un instrumento ProteOn XPR36. Brevemente, se inmovilizaron los anticuerpos biespecíficos a alta densidad sobre un chip sensor de GLC usando una química de acoplamiento de amino convencional tal como se describió anteriormente. Se prepararon disoluciones madre de proteína huFcRn a 3000 nM en tampón de instrumento (tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 6, que contenía NaCl 150 mM y Tween-20 al 0.05%), y entonces se diluyeron en serie (3:1) hasta 1.37 nM en el mismo tampón. Se inyectó secuencialmente cada concentración de huFcRn sobre las superficies de la celda de anticuerpo biespecífico y de referencia, conectadas en serie, a una velocidad de flujo de 25 jL/min durante 16 min. Se recopilaron datos de unión, seguido por una inyección durante 60 s de tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7.4, que contenía NaCl 150 mM y Tween-20 al 0.05% entre inyecciones de cada receptor o blanco de tampón para regenerar la superficie de IgG (es decir, retirar la proteína huFcRn unida). También se intercalaron varias inyecciones de tampón en la totalidad de la serie de inyección. Después, se usó uno de estas inyecciones de tampón junto con los datos de la celda de referencia para corregir los conjuntos de datos sin procesar para los artefactos de inyección (p. ej., unión inespecífica) a través de "doble referenciación" (Myszka, 1999). Después de recopilarse todos los datos de unión, se promediaron conjuntos de datos individuales para la unión (Req) a cada concentración (C), y entonces se ajustaron a una representación gráfica de isoterma de unión 1:1 (Req frente a C). A partir de esto, se derivaron las constantes de unión de equilibrio, Kd , usando el software BIAevaluation del proveedor, v. 4.1. Los resultados muestran que los anticuerpos biespecíficos tienen valores de Kd similares que son comparables a IgG1 convencional.
4.2. Actividad in vitro de anticuerpo biespecífico afucosilado
Se determinó la actividad de anticuerpo biespecífico afucosilado en la inhibición de la proliferación celular dirigida por ligando usando métodos descritos en el Ejemplo 1. Los resultados muestran que Bs2Ab-39SH afucosilado, Bs3Ab-39SH afucosilado y Bs4Ab-39SH afucosilado tienen similar potencia antiproliferativa en células MDA-MB-361 (Figura 30A) y células MCF-7 (Figura 30B), que también es comparable con la actividad de la combinación de anticuerpos parentales (39S más trastuzumab). Se observaron resultados similares en otras líneas celulares incluyendo NCI-N87 y RT-112 (no se muestran los datos).
4.3. Actividad ADCC potenciada de anticuerpo biespecífico afucosilado
Se usó KC1333, una línea celular de linfocito citolítico natural (NK) humano que expresa FcYRIIIa, como célula efectora y se usó la línea celular MDA-MB-361 como célula diana en el ensayo de ADCC para evaluar la actividad ADCC de anticuerpos anti-HER2. Se recogieron ambas líneas celulares, se lavaron y se resuspendieron en medio de ensayo. Se resuspendieron KC1333 a una densidad de 1 x 106 células/mL y MDA-MB-361 a 4 x 105 células/mL. Se añadieron cincuenta microlitros de cada línea celular a los pocillos en una placa de 96 pocillos de fondo en U para alcanzar una razón diana:efector de 1:2.5. Se preparó una concentración 3X de cada dosis de anticuerpo diluyendo los artículos de prueba en medio de ensayo. Se añadieron cincuenta microlitros de cada artículo de prueba a células por triplicado de manera que la curva de dosis final oscilaba entre 10 |jg/mL y 0.15 ng/mL en una serie de diluciones en serie 1:4 graduales. Se centrifugaron las placas para sedimentar las células en cada pocillo y entonces se incubaron durante la noche a 37°C/5% de CO2. Al día siguiente, se cuantificó LDH en el sobrenadante de cada pocillo usando el ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® de Promega según las instrucciones del fabricante. Se analizan los datos usando el software GraphPad Prism y se presentan como porcentaje de citotoxicidad en relación con el control sin tratar.
Las figuras 31A a 31C muestran la actividad ADCC de anticuerpos biespecíficos afucosilados en relación con trastuzumab y trastuzumab afucosilado en células MDA-MB-361. Los datos sugieren que la actividad ADCC del anticuerpo afucosilado es mayor que la de su versión fucosilada y el rango de potencia de ADCC entre los anticuerpos biespecíficos afucosilados es Bs2Ab-39SH_aFuc > Bs4Ab-39SH_aFuc > Bs3Ab-39SH_aFuc. Se observaron resultados similares en otras líneas celulares incluyendo BT-474, NCI-N87, MDA-MB-453, T47D y JIMT-1 (no se muestran los datos).
Ejemplo 5
5.1. Síntesis de carga útil de tubulisina 1508
La síntesis de la carga útil de citotoxina tubulisina 1508 tal como se muestra en la figura 32 para conjugación se detalla en el siguiente ejemplo ilustrativo en el que, a menos que se establezca de otro modo:
(i) las temperaturas se facilitan en grados centígrados (°C); cuando se llevan a cabo operaciones a temperatura ambiente o temperatura ambiental, es decir, en un intervalo de 18-25°C, a menos que se establezca de otro modo;
(ii) se secaron las disoluciones sobre sulfato de magnesio o sulfato de sodio anhidro; se llevó a cabo la evaporación del disolvente orgánico usando un evaporador rotatorio a presión reducida (4.5 - 30 mmHg) con una temperatura del baño de hasta 30°C;
(iii) cromatografía significa cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice; se llevó a cabo cromatografía en capa fina (CCF) sobre placas de gel de sílice;
(iv) en general, se siguió el transcurso de las reacciones por CCF o cromatografía de líquidos /espectrometría de masas (LC/EM) y se facilitan los tiempos de reacción únicamente para ilustración;
(v) los productos finales tienen datos de espectros de resonancia magnética nuclear de protón (RMN) y/o espectros de masas satisfactorios;
(vi) se facilitan los rendimientos únicamente para ilustración y no son necesariamente los que pueden obtenerse mediante el desarrollo diligente del procedimiento; se repitieron las preparaciones si se requería más material;
(vii) cuando se facilitan, los datos de resonancia magnética nuclear (RMN) están en forma de datos de delta (5) para protones de diagnóstico principales, facilitados en partes por millón (ppm) en relación con tetrametilsilano (TMS) como patrón interno , determinados a 300 o 400 MHz en d6-DMSO a menos que se establezca de otro modo;
(viii) los símbolos químicos tienen sus significados habituales;
(ix) se facilita la razón de disolvente en cuanto a volumen:volumen (v/v); y
(x) se llevó a cabo la purificación de los compuestos usando uno o más de los siguientes métodos:
a) cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice regular;
b) cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando el sistema de separación Isco Combiflash®: columna ultrarrápida de fase normal RediSep, velocidad de flujo, 30-40 ml/min (ISCO MPLC); añadir la columna de fase inversa ISCO
c) sistema de separación de HPLC semiprep. Gilson: columna ODS-AQ con relleno YMC, 100x20mm, S 5|jm 12 nm, agua (ácido trifluoroacético al 0.1%) y acetonitrilo (ácido trifluoroacético al 0.1%) como disolventes, ejecución de 20 min.
Compuesto T1
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A una disolución de ácido (2R,4R)-4-metilpiperidin-2-carboxílico (2 g, 13.97 mmol) en MeOH (40 mL) y agua (40.0 mL) se le añadió paraformaldehído (2.52 g, 27.94 mmol) y Pd/C (al 10%) (0.8 g, 7.52 mmol). Se agitó la mezcla de reacción bajo una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante la noche. A partir de la CCF, no se completó la reacción. Se añadió otro equivalente de paraformaldehído (2.52 g, 27.94 mmol) y se agitó la mezcla de reacción otras 24 horas. La CCF indicó que se completó la reacción y se filtró la mezcla de reacción, se lavó el catalizador con MeOH (2 * 30 mL). Se concentró el filtrado a vacío dando el producto en bruto como un sólido blanco, que se lavó con éter (3 * 30 mL), se secó a alto vacío durante la noche produciendo ácido (2R,4R)-1,4-dimetilpiperidin-2-carboxílico (T1) (1.870 g, 85 %) como un sólido blanco. LC-MS: 158 (M+ 1); 1H RMN (400 MHz, óxido de deuterio) ppm 0.97 (d, J=5.52 Hz, 3 H), 1.54 (s a, 1 H), 1.71 - 1.87 (m, 3 H), 1.91 - 2.07 (m, 1 H), 2.84 (s, 3 H), 3.13 (td, J=8.41, 3.76 Hz, 1 H), 3.35 (m, 1 H), 3.65 (m, 1 H).
Compuesto T2
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Se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (243.0 g, 1.1 mol) gota a gota a una suspensión de ácido (R)-3-amino-4-metilo pentanoico (comercialmente disponible) (133.0 g, 1.0 mol) y Na2CO3 (212 g, 2.0 mol) en acetona (1 L) y agua (1 L) con agitación a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla de reacción durante la noche y se eliminó el disolvente orgánico a presión reducida. Se diluyó el residuo con agua (1 L) y se lavó con EtOAc (500 mL *3). Se acidificó la fase acuosa con disolución de HCl 2 N hasta pH=3 y se extrajo la mezcla resultante con EtOAc (800 mL *3). Se lavaron con salmuera los extractos combinados (800 mL *1), se secaron (Na2SO4 anhidro) y se concentraron dando el compuesto (T2) (224.0 g, 97% de rendimiento) como un aceite, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Compuesto T3
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Se añadió trietilamina (67 g, 0.61 mol) a una suspensión de compuesto (T2) (140.0 g, 0.61 mol) y clorhidrato de N,0-dimetilhidroxilamina (74.1 g, 0.76 mol) en CH2O2 (1.4 L) con agitación a 0°C. Se agitó la suspensión durante 0.5 horas y se añadió EDCI (74 g, 0.61 mol) en porciones a 0°C. Se agitó la mezcla de reacción durante 2 horas a 0°C y se añadió agua (800 mL). Se separó la fase orgánica, se lavó con disolución de KHSO4 al 5% (800 mL*3), disolución saturada de NaHCO3 (800 mL*3) y salmuera (800 mL*1), se secó (Na2SO4 anhidro) y se concentró hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (EtOAc/hexano=1:5) produciendo el compuesto (T3) (141.0 g, 84% de rendimiento) como un aceite. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): 55.26 (m, 1h ), 3.75 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 2.60~2.80 (m, 2H), 1.85 (m, 1H), 1.41 (s, 9H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
Compuesto T4
Figure imgf000085_0004
N
Boc OMe
Se añadió yodoetano (250.0 g, 1.6 mol) a una disolución de compuesto (T3) (55.0 g, 0.2 mol) en DMF (1.1 L) con agitación a 0°C. Entonces se añadió NaH (suspensión al 60%, 24.0 g, 0.60 mol) en porciones a 0°C y se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se agitó durante 12 horas. Se extinguió la reacción con agua (2 L) cuidadosamente y se añadió EtOAc (2 L). Se separó la fase orgánica, se lavó con disolución de KHSO4 al 5% (800 mL*3), disolución saturada de NaHCO3 (800 mL*3) y salmuera (800 mL*1), se secó (Na2SO4 anhidro) y se concentró hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (EtOAc/hexano=1:10) produciendo el compuesto (T4) (35.1 g, 58% de rendimiento) como un aceite. 1H RMN (300 MHz, CDCb): 53.70 (s, 3H), 3.65 (m, 1H), 3.10-3.30 (m, 5H), 2.50-2.95 (m, 2H), 1.90-2.20 (m, 1H), 1.40~-.55 (m, 9H), 1.10 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
Compuesto T5
Figure imgf000086_0001
Se añadió gota a gota una disolución de n-BuLi (106 mi, 2.5 N en hexano, 0.17 mol) a una disolución de 2-bromo-4-((tercbutildimetilsililoxi)-metil)-tiazol (74 g, 0.24 mol) (preparado tal como se describe en Wipf, P et al Org. Lett. 2007, 9(8), pág.
1605) en THF seco (500 mL) a -78°C bajo N2 con agitación a lo largo de 1 hora. Se agitó la suspensión durante 30 min adicionales y entonces se añadió gota a gota una disolución de compuesto (T4) (51.0 g, 0.17 mol) en THF seco (300 mL) a lo largo de 30 min a -78°C. Se agitó la mezcla de reacción durante 1 hora a -78°C y entonces se permitió que se calentase hasta temperatura ambiente y se agitó durante 12 horas. Se extinguió la reacción con disolución acuosa de cloruro de amonio al 20% (1 L) y se eliminó el disolvente orgánico a presión reducida. Se extrajo la mezcla resultante con EtOAc (800 mL*3). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con disolución de KHSO4 al 5% (800 mL*3), disolución saturada de NaHCO3 (800 mL*3) y salmuera (800 mL*1), se secaron (Na2SO4) y se concentraron hasta sequedad. Se purificó el material en bruto mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (EtOAc/hexano=1:10) produciendo el compuesto (T5) (58.1 g, 73% de rendimiento) como un aceite. 1H RMN (300 MHz, CDCb): 57.53 (m, 1H), 4.90 (s, 2H), 4.04 (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 1.40 (s, 9H), 0.80-1.20 (m, 18H), 0.14 (s, 6H).
Compuesto T6
Figure imgf000086_0002
Se añadió LiBhU (4.8 g, 0.22 mol) en porciones a una disolución de compuesto (T5) (47.1 g, 0.1 mol) en metanol (500 mL) a temperatura ambiente a lo largo de un periodo de 0.5 horas con agitación. Se agitó la suspensión durante 2 horas y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se disolvió el residuo en EtOAc (800 mL) y se lavó la disolución resultante con disolución saturada de NaHCO3 (500 mL*3) y salmuera (500 mL*1), se secó (Na2SO4) y se concentró hasta sequedad. Se purificó el material en bruto mediante cromatografía ultrarrápida en columna (EtOAc/hexano=1:6) produciendo el compuesto (T6) (13.5 g, 28% de rendimiento) y su isómero (T6') (21.0 g, 45% de rendimiento). 1H RMN (300 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm -0.06 - 0.05 (m, 6 H) 0.76 - 0.89 (m, 15 H) 1.12 (t, J=6.97 Hz, 3 H) 1.39 (s, 9 H) 1.55 - 2.05 (m, 3 H) 2.86 - 3.21 (m, 2 H) 3.76 - 3.96 (m, 1 H) 4.73 (d, J=1.13 Hz, 4 H) 7.01 (s, 1 H).
Compuesto T7
Figure imgf000086_0003
Se añadió gota a gota cloruro de acetilo (45.2 g, 0.58 mol) a una disolución de compuesto (T6) (34.0 g, 72 mmol) en piridina (500 mL) a 0°C con agitación a lo largo de 10 min. Se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se agitó durante 12 horas. Se extinguió la reacción con agua (200 mL) y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se trató el residuo con CH2O2 (800 mL) y se lavó la mezcla resultante con disolución de KHSO4 al 5% (800 mL*3), disolución saturada de NaHCO3 (800 mL*3) y salmuera (800 mL*1), se secó (Na2SO4) y se concentró hasta sequedad. Se purificó el material en bruto mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (EtOAc/ hexano=1:10) produciendo el compuesto (T7) (25.7 g, 69% de rendimiento) como un aceite. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): 57.15 (m, 1H), 5.95 (m, 1H), 4.84 (s, 2H), 4.04 (m, 1H), 3.10 (m, 2H), 2.35 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.00 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.80~1.10 (m, 15H), 0.08 (s, 6H).
Compuesto T8
Figure imgf000086_0004
Se añadió gota a gota una disolución de fluoruro de tetrabutilamonio (65.3 g, 0.25 mol) en THF (200 mL) a una disolución de compuesto (7) (25.7 g, 50 mmol) en THF (300 mL) a 0°C con agitación. Se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta alcanzar temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas. Se añadió agua (800 mL) y se eliminó el disolvente orgánico a presión reducida. Se trató el residuo con CH2O2 (800 mL) y se lavó la mezcla resultante con disolución de KHSO4 al 5% (800 mL*3), disolución saturada de NaHCO3 (800 mL*3) y salmuera (800 mL*1), se secó (Na2SO4) y se concentró hasta sequedad. Se purificó el material en bruto mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (EtOAc/ hexano=1:4) produciendo el compuesto (T8) (19.5 g, 98% de rendimiento) como un aceite. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): 5 8.26 (m, 1H), 5.95 (m, 1H), 4.83 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 3.17 (m, 2H), 2.40 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.18 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.56 (s, 9H), 1.10-1.30 (m, 3H), 0.80-1.05 (m, 6H).
Compuesto T9
Figure imgf000087_0001
Se añadió reactivo de Dess-Martin (32.7 g, 75 mmol) a una disolución de compuesto (T8) (20.0 g, 50 mmol) en diclorometano (300 mL) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 horas. Se lavó la mezcla con disolución de hidróxido de sodio (1 N, 300 mL*3), disolución de tiosulfato de sodio (1N, 300 mL*3), disolución saturada de NaHCO3 (300 mL*3) y salmuera (300 mL*1), respectivamente. Se secó la fase orgánica (Na2SO4) y se concentró hasta sequedad dando el aldehído correspondiente.
Se disolvió este aldehido en bruto en alcohol terc-butílico (500 mL) y una disolución de clorito de sodio (al 80%, 36.4 g, 320 mmol) y se añadió gota a gota dihidrogenofosfato de sodio monohidratado (105 g, 0.77 mol) en agua (300 mL) a lo largo de 1 hora a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla de reacción durante 3 horas y se diluyó con disolución de ácido clorhídrico (0.1 N, 500 mL). Se extrajo la mezcla resultante con EtOAc (500 mL*1) y se lavaron las fases orgánicas combinadas con disolución de KHSO4 al 5% (500 mL*3) y salmuera (500 mL*1), se secó sobre Na2SO4 y se concentró hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH=100:5) produciendo el compuesto (T9) (15.4 g, 58% de rendimiento). 1H RMN (300 MHz, CDCla): 59.90 (s a, 1H), 8.27 (s, 1H), 5.96 (m, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.15 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.18 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.98 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
Compuesto T10
Figure imgf000087_0002
A una disolución de ácido 2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((terc-butoxicarbonil)(etil)amino)-4-metilpentil)-tiazol-4-carboxílico (T9) (6.5g, 15.68 mmol) en DCM (60 mL) se le añadió TfA( 30 mL) gota a gota a 0 °C. Se agitó la mezcla a 0°C durante 1 hora. Se evaporó el disolvente a vacío dando el producto en bruto (T10). Se usó el producto en bruto para la reacción de la siguiente etapa sin purificación adicional (7.2 gramos). LC-MS : 315 (M 1).
Compuesto T11
Fmoc
Figure imgf000087_0003
A la disolución del ácido 2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-(etilamino)-4-metilpentil)-tiazole-4-carboxílico 4, sal del ácido trifluoroacético (T10) (5 g, 11.67 mmol) y bicarbonato de sodio (9.80 g, 116.71 mmol) en una mezcla de acetona (300 mL) y agua (150 mL) se le añadió (2,5-dioxopirrolidin-1-il) carbonato de (9H-fluoren-9-il)metilo (3.94 g, 11.67 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante toda la noche. CL-EM indicó que se completó la reacción. Se acidificó la mezcla hasta (pH 2) con ácido clorhídrico y se vaporó la acetona a vacío. Se extrajo el producto con DCM (3 * 300 mL). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con disolución de HCl al 0.1% (200 mL), salmuera (200 mL), se secaron sobre Na2SO4, y se evaporaron a vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, MeOH/DCM, MeOH a desde el 0% hasta el 5%,) dando ácido 2-((1R,3R)-3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)-carbonil)(etil)amino)-1-acetoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxílico (T11) (3.53 g, 54.6 %) como un sólido blanco. LC-MS : 537.2 (M+1); 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) ppm 0.84 (d, J=6.78 Hz, 3 H), 0.92 - 1.05 (m, 5 H), 1.14 (d, J=3.01 Hz, 1 H), 1.73 (dt, J=10.23, 6.43 Hz, 1 H), 1.92 - 2.05 (m, 1 H), 2.12 - 2.27 (m, 4 H), 2.28 - 2.44 (m, 1 H), 2.90 - 3.33 (m, 2 H), 3.98 (t, J=9.29 Hz, 1 H), 4.12 - 4.32 (m, 1 H), 4.47 - 4.82 (m, 2 H), 5.95 (dd, J=10.92, 2.89 Hz, 1 H), 7.29 - 7.45 (m, 4 H), 7.55 - 7.69 (m, 2 H), 7.72 - 7.81 (m, 2 H), 8.22 - 8.29 (m, 1 H).
Compuesto T12
Figure imgf000088_0001
Se añadió DMAP (106 g, 0.86 mol) a una disolución de Boc-L-4-nitro-fenilalanina (1800 g, 0.58 mol) y ácido de Meldrum (92 g, 0.64 mol) en diclorometano (1.5 L). Se enfrió la disolución resultante a -5°C bajo atmósfera de N2, seguido por la adición de DCC (240 g, 1.16 mol) en diclorometano (1 L) a lo largo de 1 h. Se agitó la mezcla durante la noche a 0-5°C. Entonces se retiró mediante filtración la N,N'-diciclohexilurea precipitada y se lavó el filtrado con HCl acuoso al 5% (1 L * 3), y salmuera (1 L * 1), y se secó sobre MgSO4. Después de la retirada del MgSO4 mediante filtración, se concentró la fase orgánica hasta sequedad. Se trituró el residuo con EtOAc/hexano (1:1, 500 mL), y se secó produciendo el compuesto (T12) (130.0 g, 51% de rendimiento) como un sólido amarillo.
Compuesto T13
Figure imgf000088_0002
Se añadió AcOH (400 mL) a una disolución de compuesto (T12) (130.0 g, 0.298 mol) en diclorometano (1.5 L) a -5°C bajo N2. Se añadió NaBH4 sólido (22.7 g, 0.597 mol) en pequeñas porciones a lo largo de 2 horas (desprendimiento de gas y exotérmica). Después de agitación durante 3 h adicionales a -5 °C, la CCF indicó que se completó la reacción. Se extinguió la mezcla con salmuera (1 L). Se separó la fase orgánica, y se lavó secuencialmente con agua (1 L*2), NaHCO3 acuoso saturado (1 L*3) y salmuera (1 L*3), y se secó sobre MgSO4. Se concentró el filtrado hasta sequedad y proporcionó el compuesto (T13) (70.3 g, 55 % de rendimiento) como un sólido amarillo. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): 58.18 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.41 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.58 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 3.85 (m,1H), 2.97 (d, J=6.6 Hz, 2H), 2.27 (m ,2H), 1.80 (s, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.35 (s, 9H).
Compuesto T14
Figure imgf000088_0003
Se añadieron K2CO3 (35 g, 0.25 mol) y Mel (36 g, 0.25 mol) a una disolución de compuesto (T13) (70.3 g, 0.167 mol) en acetona (400 mL) y DMF (400 mL). Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. La CCF indicó que el material de partida se había consumido. Se añadió agua (2 L) y se agitó la mezcla durante una hora adicional. Se recogió mediante filtración el sólido precipitado, se lavó con agua, se secó produciendo el compuesto (T14) (34.5 g, 47% de rendimiento) como un sólido de color amarillo pálido. 1H RMN (300 m Hz , CDCb): 58.17 (d, J=8.7 Hz, 2h ), 7.34 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.22 (m, 1H), 3.85 (m,1H), 2.85 (m, 2H), 2.22 (m ,2H), 1.73 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.31 (s, 9H).
Compuesto T15
Figure imgf000088_0004
Se disolvió el compuesto (T14) (34.5 g, 79.1 mmol)en tolueno (500 mL). Se calentó la disolución a reflujo durante 40 horas. La CCF indicó que se completó la reacción. Se eliminó el disolvente produciendo el compuesto (T15) (30g), que se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.
Compuesto T16
Figure imgf000089_0001
Se añadió K 2 C O 3 (22 g, 0.16 mol) a una disolución de compuesto (T15) (30 g, 79 mmol) en MeOH (300 mL). Se agitó la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente. La CCF mostró conversión completa. Se eliminó el disolvente, se disolvió el residuo en diclorometano (500 mL), se lavó con salmuera (500 mL*3), se secó sobre MgSO4. Después de la retirada del MgSO4 mediante filtración, se concentró la fase orgánica hasta sequedad. Se purificó adicionalmente el residuo mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc/hexano=1:10) y proporcionó el compuesto (T16) (23.5 g, 81% de rendimiento para dos etapas) como una mezcla diastereomérica 1:1. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): 5 8.13 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.34 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.43 (m, 1H), 3.85 (m,1H), 3.65 (s ,3H), 2.85 (m, 2H), 2.65 (m ,1H), 1.85 (m, 1H), 1.50 (m, 1H), 1.30 (s, 9H), 1.15 (t, J=6.6 Hz, 3H).
Compuesto T17
Figure imgf000089_0002
una columna Chiralpak ID 21 *250 mm, 5 p usando como fase móvil A dióxido de carbono al 90% y fase B isopropanol al 10% a una velocidad de flujo de 60 ml/min. Se realizó la separación a 40°C y la detección a 270 nm. Se logró la separación de nivel inicial y se aislaron dos fracciones. El pico B era el compuesto deseado (T17) y se obtuvo como un sólido, 27.4 g (55%).
>99:1 de exceso diastereomérico en una columna Chiralpak IA 4.6*250 mm, 5p, metanol:isopropanol 1:1 al 10% en hexano con modificador de dietilamina al 0.1%.
CL/EM (2 minutos, Acid _CV10.olp método 367 (M 1), 1.16 minutos.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 8.16 (d, J=8.53 Hz, 2 H) 7.46 (d, J=8.53 Hz, 2 H) 3.79 - 3.93 (m, 1 H) 3.68 (s, 3 H) 2.90 - 2.99 (m, 1H) 2.71 - 2.81 (m, 1 H) 2.47 - 2.59 (m, 1 H) 1.81 - 1.95 (m, 1 H) 1.55 - 1.66 (m, 1 H) 1.32 (s, 9 H) 1.21 - 1.25 (m, 2 H) 1.16 (d, J=7.03 Hz, 3 H).
Compuesto T18
A la disolución de compuesto (T18) (0.43 g, 1.49 mmol) y bicarbonato de sodio (1.251 g, 14.89 mmol) en una mezcla de acetona (30 mL) y agua (15 mL) se le añadió 2,5-dioxopirrolidin-1-il-carbonato de (9H-fluoren-9-il)metilo (0.502 g, 1.49 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante toda la noche. CL-EM indicó que se completó la reacción. Se acidificó la mezcla hasta pH 2 con ácido clorhídrico y se evaporó la acetona a vacío. Se extrajo el producto con DCM (3 X 60 mL). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con disolución HCl 1 N (40 mL), salmuera (40 mL), se secaron sobre Na2SO4, y se evaporaron a vacío. Se purificó el residuo mediante gel de sílice cromatografía ultrarrápida, EtOAc a desde el 0% hasta el 100% en DCM, dando ácido (2S,4R)-4-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)-carbonilamino)-2-metil-5-(4-nitrofenil)pentanoico (0.630 g, 89 %) (T19) como un sólido blanco. LC-MS : 475.5 (M+H); 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) ppm 0.81 - 1.06 (m, 1 H), 1.08 - 1.28 (m, 2 H), 1.33 - 1.75 (m, 1 H), 1.77 - 2.11 (m, 1 H), 2.36 - 2.69 (m, 2 H), 2.76 - 3.18 (m, 1 H), 3.43 - 4.08 (m, 1 H), 4.09 - 4.19 (m, 1 H), 4.21 - 4.53 (m, 2 H), 4.54 - 4.80 (m, 1 H), 7.18 -7.58 (m, 8 H), 7.66 - 7.82 (m, 2 H), 7.95 - 8.17 (m, 2 H), 8.67 (s a, 1 H).
Compuesto T20
Figure imgf000090_0001
metil-5-(4-nitrofenil)pentanoico (0.380 g, 0.80 mmol) (T19) en DCM (4.5 mL), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min, entonces se añadió resina de cloruro de 2-clorotritilo (0.5 g, 0.80 mmol) a la mezcla. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche, se lavó la resina resultante con DMF (3 X 6 mL), MeOH (3 X 6 mL), y DCM (3 X 6 mL), entonces tratados con DIEA (0.419 mL, 2.40 mmol) y MeOH/DCM (1:1, 5 mL) a temperatura ambiente durante 30 min. Se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 X 6 mL), MeOH (3 X 6 mL), y Dc M (3 X 6 mL), se secó a alto vacío durante toda la noche. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, y se analizó mediante CL-EM. Se usó la resina resultante (T20) :e etapa. LC-MS : 475 (M 1)
Compuesto T21
Figure imgf000090_0002
A la resina (T20) (0.5 g, 0.80 mmol) se le añadió piperidina al 20% en DMF (5 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 6 min, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 6 mL), MeOH (3 * 6 mL), DCM (3 * 6 mL), se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T21) para la reacción de la siguiente etapa. LC-MS: 253 (M H).
Compuesto T22
Figure imgf000090_0003
A la resina (T21) (0.5 g, 1.88 mmol) se le añadió una disolución de ácido 2-((1R,3R)-3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)(etil)amino)-1-acetoxi-4-metilpentil)tiazol-4-carboxílico (3) (1.108 g, 2.07 mmol), hAt U (1.428 g, 3.76 mmol), 2,4,6-trimetilpiridina (0.500 mL, 3.76 mmol) y DIEA (0.656 mL, 3.76 mmol) en DMF (5 mL) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas, y se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 6 mL), MeOH (3 * 6 mL), y DCM (3 * 6 mL), se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T22) para la siguiente etapa. LC-MS: 771 (M H).
Compuesto T23
Figure imgf000091_0001
A la resina (T22) (0.5 g, 0.80 mmol) se le añadió piperidina al 20% en DMF (5 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 6 min, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 6 mL), MeOH (3 * 6 mL), DCM (3 * 6 mL), se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T23) en la siguiente etapa de reacción. LC-MS : 549 (M 1).
Compuesto T24
Figure imgf000091_0002
A una disolución de ácido (2S,3S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-3-metilpentanoico (Fmoc-lsoleucina) (7 g, 19.81 mmol) y piridina (1.602 mL, 19.81 mmol) en DCM (120 mL) se le añadió mediante cánula una disolución de DAST (3.11 mL, 23.77 mmol) en DCM (20 mL) a lo largo de 10 min. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 hora, se diluyó con DCM (80 mL), se lavó con agua enfriada con hielo (2 * 200 mL), se secó la fase orgánica sobre MgSO4, se filtró y se evaporó a vacío dando (2S,3S)-1-fluoro-3-metil-1-oxopentan-2-ilcarbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (6.65 g, 94 %) como un sólido blanco. Se realizó una prueba de esterificación para garantizar la formación cuantitativa del fluoruro de ácido disolviendo Fmoc-Ile-F (5 mg) en MeOH anhidro (0.3 mL) y DIEA (0,030 mL) y permitiendo que reaccionasen a temperatura ambiente durante 15 min. Entonces se evaporó la mezcla a vacío y se analizó mediante CL-EM, que mostró menos del 1% de Fmoc-Ile-OH presente.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 0.83 - 1.12 (m, 6 H) 1.18 - 1.37 (m, 1 H) 1.42 - 1.59 (m, 1 H) 2.01 (s a, 1 H) 4.26 (t, J=6.78 Hz, 1 H) 4.44 - 4.63 (m, 3 H) 5.20 (d, J=8.53 Hz, 1 H) 7.31 - 7.39 (m, 2 H) 7.40 - 7.47 (m, 2 H) 7.61 (d, J=7.28 Hz, 2 H) 7.80 (d, J=7.53 Hz, 2 H).
Compuesto T25
Figure imgf000091_0003
A la resina (T23) (0.5 g, 0.80 mmol) se le añadió una disolución de (2S,3S)-1-fluoro-3-metil-1-oxopentan-2-ilcarbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (T24) (0.569 g, 1.60 mmol), DMAP (4.89 mg, 0.04 mmol), y DIEA (0.419 mL, 2.40 mmol) en DCM (5 mL) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante toda la noche, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 6 mL), MeOH (3 * 6 mL), d Cm (3 * 6 mL), se secó a alto vacío. Se escindió una pequeña cantidad de compuesto de la resina, y se analizó mediante CL/EM, CL-EM indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T25) en la siguiente etapa de reacción. LC-MS : 884 (M H).
Compuesto T26
Figure imgf000092_0001
A la resina (T25) (0.5 g, 0.80 mmol) se le añadió piperidina al 20% en DMF (5 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 6 min, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 6 mL), MeOH (3 * 6 mL), DCM (3 * 6 mL), se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T26) en la siguiente etapa de reacción. LC-MS: 662 (M 1).
Compuesto T27
Figure imgf000092_0002
A la resina (T26) (0.5 g, 0.80 mmol) se le añadió una disolución de ácido (2R,4R)-1,4-dimetilpiperidin-2-carboxílico (1) (0.252 g, 1.60 mmol), HATU (0.608 g, 1.60 mmol), 2,4,6-trimetilpiridina (0.320 mL, 2.40 mmol) y DIEA (0.419 mL, 2.40 mmol) en DMF (5 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 6 mL), MeOH (3 * 6 mL), y DCM (3 * 6 mL), se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T27) en la siguiente etapa de reacción. LC-MS: 801 (M 1).
Compuesto T28
Figure imgf000092_0003
A la resina (T27) se le añadió una disolución de cloruro de estaño (II) deshidratado (1.805 g, 8.00 mmol) y acetato de sodio (0.197 g, 2.40 mmol) en DMF (5 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 6 mL), MeOH (3 * 6 mL), y DCM (3 * 6 mL), y se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T28) para la siguiente etapa. LC-MS: 771 (M H).
Compuesto T29
Figure imgf000093_0001
A la resina (T28) (0.2 g, 0.32 mmol) se le añadió una disolución de ácido (S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoico (comercialmente disponible) (0.300 g, 0.64 mmol), HATU (0.243 g, 0.64 mmol), 2,4,6-trimetilpiridina (0.128 mL, 0.96 mmol) y DIEA (0.168 mL, 0.96 mmol) en DMF (4 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 2 mL), MeOH (3 * 2 mL), y DCM (3 * 2 mL), y se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T29) para la reacción de la siguiente etapa. LC-MS: 1221 (M 1).
Compuesto T30
Figure imgf000093_0002
A la resina (T29) (0.2 g, 0.32 mmol) se le añadió piperidina al 20% en DMF (2 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 6 min, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 3 mL), MeOH (3 * 3 mL), DCM (3 * 3 mL), se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T30) para la reacción de la siguiente etapa. LC/MS : 999 (M H).
Compuesto T31
Figure imgf000093_0003
A la resina (T30) (0.2 g, 0.32 mmol) se le añadió una disolución de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (0.148 g, 0.48 mmol) en DMF (2 mL) , seguido por N-metilmorfolina (0.106 mL, 0.96 mmol) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas, se filtró la resina resultante, se lavó con DMF (3 * 3 mL), DCM (3 * 3 mL), se secó a vacío. Se escindió una pequeña cantidad del compuesto de la resina, se analizó mediante CL-EM, que indicó que se completó la reacción. Se usó la resina resultante (T31) para la siguiente etapa. LC-MS: 1192 (M 1).
Compuesto T32 (tubulisina 1508)
Figure imgf000094_0001
A la resina (T31) (0.2 g, 0.32 mmol) se le añadió DCM (1 mL) y TFA (1 mL) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 20 min, entonces se filtró. Se lavó la resina con DCM/TFA (1:1, 3 * 2 mL), se evaporaron los filtrados a vacío. Se purificó el residuo mediante HPLC de fase inversa (ACN/H2O (contenía TFA al 0.1%), ACN a desde el 5% hasta el 75% en 14 min.) Se liofilizaron las fracciones puras dando ácido (2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-acetoxi-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-dimetilpiperidin-2-carboxamido)-N-etil-3-metilpentanamido)-4-metilpentil)tiazol-4-carboxamido)-5-(4-((S)-6-amino-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)hexanamido)fenil)-2-metilpentanoico (T32) (0.095 g, 22.48%) como un sólido blanco. LC-MS : 1092 [M+1]; 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 7.99 (s, 1 H), 7.34 (d , J =8.53 Hz, 2 H), 7.10 (d , J=8.53 Hz, 2 H), 6.66 (s, 2 H), 5.64 (d, J=10.79 Hz, 1 H), 4.50 - 4.61 (m, 1 H), 4.21 - 4.35 (m, 2 H), 3.92 (d, J=9.29 Hz, 1 H), 3.69 (s a, 1 H), 3.37 (t, J=7.15 Hz, 2 H), 3.15-3.35 ( m, 4H), 3.04 (dt, J=3.58, 1.85 Hz, 1 H), 2.84 (t, J=7.65 Hz, 2 H), 2.76 (d, J=7.03 Hz, 2 H), 2.62 (s a, 2 H), 2.38 - 2.52 (m, 2 H), 2.25 (t, J=11.54 Hz, 1 H), 2.16 (t, J=7.40 Hz, 2 H), 2.04 - 2.11 (m, 4 H), 1.70 - 2.00 (m, 7 H) 1.42 - 1.69 (m, 11 H), 1.34 - 1.40 (m, 1 H), 1.27 (t, J=6.78 Hz, 3 H), 1.16 - 1.24 (m, 2 H), 1.01 - 1.14 (m, 7 H), 0.90 (d, J=6.78 Hz, 3 H), 0.94 (d, J=6.53 Hz, 3 H), 0.84 (t, J=7.40 Hz, 3 H), 0.79 (d, J=6.53 Hz, 3 H).
5.2. Conjugación de tubulisina 1508
El compuesto T32 (tubulisina 1508) comprende un ligador y un grupo maleimida que se conjuga fácilmente con un residuo tiol de un anticuerpo formando una unión tiol-maleimida. Las citotoxinas que comprenden un grupo maleimida (p. ej., tubulisina 1508) pueden conjugarse con residuos cisteína específicos modificados por ingeniería para dar los anticuerpos anti-HER2 de la invención proporcionados en la presente (p. ej. Bs2Ab-39SH, Bs3Ab-39SH, o Bs4Ab-39SH). Alternativa, u opcionalmente pueden usarse métodos de conjugación clásicos para unir un agente citotóxico a los anticuerpos descritos. Se conocen bien en la técnica métodos para la conjugación con residuos lisina y cisteína nativos. A continuación se proporcionan métodos representativos para conjugación específica del sitio (en residuos cisteína modificados por ingeniería) y clásica (en residuos cisteína nativos).
Se expone brevemente un procedimiento de conjugación de anticuerpo-fármaco específica del sitio en la figura 33 e incluye las etapas de (a) desocupación de los extremos de las cadenas de tamaño de los aminoácidos derivatizables (p. ej., cisteínas), (b) oxidación, (c) conjugación de una carga útil (p. ej., un agente citotóxico tal como tubulisina 1508), y (d) pulido mediante retirada de los agentes de conjugación y carga útil que no ha reaccionado. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la conjugación con una cisteína modificada por ingeniería formulando el anticuerpo en PBS 1X con ácido etilendiaminotetraacético 1 mM. Se usa reducción suave para generar tioles libres añadiendo cuarenta equivalencias de clorhidrato de T ris(2-carboxietil)fosfina por anticuerpo, se incuba a 37°C durante tres horas. Se usan tres diálisis sucesivas en PBS 1X con ácido etilendiaminotetraacético 1 mM para retirar el clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (alternativamente pueden usarse columnas de desalación). Se permite que vuelvan a formarse enlaces disulfuro intercatenarios de anticuerpo mediante la adición ~20 equivalencias de ácido deshidroabiético (dhAA) e incubación ~ cuatro horas a temperatura ambiente. En la preparación para conjugación, se añadió dimetilsulfóxido al anticuerpo hasta el diez por ciento v/v y se añaden 8 ó 12 equivalencias de la carga útil de tubulisina 1508 en dimetilsulfóxido y se incuba a temperatura ambiente durante ~1 hora (alternativamente se incuba a 4oC durante ~16 horas) para la carga de fármaco 2T y 4T, respectivamente. Se extingue la reacción añadiendo ~4 equivalencias molares de N-acetil-cisteína (NAC) por carga útil. Se retiró la carga útil libre del anticuerpo conjugado mediante hidroxiapatita cerámica siguiendo las recomendaciones de fabricación. Puede someterse el producto final a intercambio de tampón si se desea. Pueden analizarse los anticuerpos conjugados mediante SDS-PAGE no reductora y reductora para confirmar la pureza y conjugación con la cadena pesada.
Se preparan conjugados anticuerpo-fármaco con fármacos conjugados aleatoriamente con residuos cisteína nativos mediante reducción parcial del anticuerpo seguido por reacción con el ligador-fármaco deseado. Se reduce parcialmente el anticuerpo a una concentración de 5 mg/mL mediante la adición de ~3 equivalentes molares de DTT a pH 8.0, seguido por incubación a ~37 °C durante ~2 h. Entonces se enfría bruscamente la reacción de reducción en hielo y se retira el DTT en exceso, por ejemplo mediante diafiltración. Entonces se añade el ligador-fármaco a una razón molar de ligador-fármaco/tiol de ~1: 10. Se lleva a cabo la reacción de conjugación en presencia de ~10% v/v de DMSO. Después de la conjugación, se añade cisteína libre en exceso (~2 veces la razón con respecto a ligador-fármaco) para extinguir el ligador-fármaco que no ha reaccionado para producir el aducto de cisteína-ligador-fármaco. Se purifica la mezcla de reacción (p. ej., mediante cromatografía de interacción hidrófoba) y puede someterse a intercambio de tampón en PBS. Se determina la distribución de carga de fármaco usando métodos convencionales tales como cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de fase inversa reducida.
5.3. Abreviaturas químicas
Ac acetilo
ACN acetonitrilo
Boc dicarbonato de di-ferc-butilo
t-Bu terc-butilo
Bzl bencilo, donde Bzl-OMe es metoxibencilo y Bzl-Me es metilbenceno
Cbz o Z benciloxi-carbonilo, donde Z-Cl y Z-Br son cloro- y bromobenciloxicarbonilo, respectivamente DAST trifluoruro de dietilaminoazufre
DCM diclorometano
DIAD azodicarboxilato de diisopropilo
DIC N,N'-diisopropilcarbodiimida
DIEA dietilisopropilamina
DMF N,N-dimetilformamida
DTT ditiotreitol
EtOAc acetato de etilo
Et2O dietil éter
Fmoc 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo
HATU hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio HCl ácido clorhídrico
CL-EM cromatografía de líquidos-espectrometría de masas
MeOH metanol
Na2CO3 bicarbonato de sodio
NaHCO3 hidrogenocarbonato de sodio
PAB para-aminobenciloxicarbonilo
RT temperatura ambiente
TEA trietilamina
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
CCF cromatografía en capa fina

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-HER2 biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina y un segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina, y que comprende una primera y una segunda cadenas polipeptídicas asociadas entre sí, en el que:
(i) el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una región variable (VH) de cadena pesada (HC) y una región variable (VL) de cadena ligera (LC) que comprende:
(a) una CDR-1 de cadena pesada variable (VH-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 1;
(b) una CDR-2 de cadena pesada variable (VH-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 2;
(c) una CDR-3 de cadena pesada variable (VH-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 3;
(d) una CDR-1 de cadena ligera variable (VL-CDR1) idéntica a SEQ ID NO: 4;
(e) una CDR-2 de cadena ligera variable (VL-CDR2) idéntica a SEQ ID NO: 5; y,
(f) una CDR-3 de cadena ligera variable (VL-CDR3) idéntica a SEQ ID NO: 6; y
(ii) el segundo dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende un scFv que comprende:
(g) una VH-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 54;
(h) una VH-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
(i) una VH-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 56;
(j) una VL-CDR1 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 57;
(k) una VL-CDR2 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 58; y
(l) una VL-CDR3 que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 59;
y en el que:
(a) la primera cadena polipeptídica se selecciona de:
(1) [TZsH U H bVHHbCHHFcx]
(2) [bVH]-[bCH]-[Fcx]-[L2]-[TZs]
(3) [bVH]-[bCH]-[Ls]-[TZs]-[L4]-[Fcx]
y
(b) la segunda cadena polipeptídica comprende [bVL]-[CL],
en la que
- TZs es un scFv que se une al mismo epítopo que trastuzumab;
- bVH, bVL y bCH son las regiones VH, VL y CH1, respectivamente, de un anticuerpo que puede unirse a un epítopo de HER2 distinto del epítopo reconocido por el anticuerpo trastuzumab;
- CL es una región constante kappa humana o una región constante lambda humana de cadena ligera de IgG;
- Li, L2, L3 y L4 son ligadores peptídicos;
- Fcx es un dominio Fc;
y en la que:
- bVH comprende una VH-CDR1, una VH-CDR2, y una VH-CDR3 idénticas a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, respectivamente;
- bVL comprende una VL-CDR1, una VL-CDR2, y una VL-CDR3 idénticas a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID n O: 6, respectivamente;
-[TZs] comprende una VH-CDR1, una VH-CDR2, y una VH-CDR3 que comprenden los aminoácidos de SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, y SEQ ID NO: 56, respectivamente; y una VL-CDR1, una VL-CDR2, y una VL-CDR3 que comprenden los aminoácidos de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 59, respectivamente. 2. Anticuerpo anti-HER2 biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina comprende una v H y una VL, en el que:
(a) la VH comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 15;
(b) la VL comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
y en el que el primer y el segundo dominios de unión a antígeno de inmunoglobulina se unen específicamente a distintos epítopos de HER2.
3. Anticuerpo anti-HER2 biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el [bCH] es de es una región constante de IgG.
4. Anticuerpo anti-HER2 biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo de afinidad optimizada.
5. Anticuerpo anti-HER2 biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio Fcx comprende al menos una mutación que puede reducir o potenciar la actividad ADCC del anticuerpo biespecífico.
6. Anticuerpo anti-HER2 biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el [Fcx] comprende
(i) al menos una sustitución de aminoácido que introduce un grupo derivatizable; y/o,
(ii) al menos una mutación que puede potenciar la actividad ADCC del anticuerpo biespecífico;
7. Anticuerpo contra HER2 biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo contra HER2 biespecífico:
(a) induce internalización tras la unión a la diana de HER2;
(b) promueve un tráfico lisosómico eficaz después de la internalización;
(c) induce degradación de la diana de HER2;
(d) bloquea la fosforilación de AKT inducida por ligando en células cancerosas con baja expresión de HER2;
(e) altera la dimerización HER2:HER3 inducida por ligando; o
(f) combinaciones de los mismos.
8. Conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende el anticuerpo contra HER2 biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y al menos uno, dos, tres o cuatro restos terapéuticos, y que comprende opcionalmente al menos un espaciador.
9. ADC según la reivindicación 8, en el que cada resto terapéutico está químicamente conjugado con la cadena lateral de un aminoácido en una posición específica en la región Fc del anticuerpo biespecífico.
10. ADC según la reivindicación 9, donde las posiciones específicas se seleccionan del grupo que consiste en 239, 248, 254, 258, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 435, 440, 441, 442, 443, 446, una inserción entre las posiciones 239 y 240, y combinaciones de las mismas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat.
11. ADC según la reivindicación 10, en el que las posiciones específicas son 239, 442, o ambas, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat.
12. ADC según la reivindicación 8, en el que la numeración de posición de aminoácido es según el índice EU tal como se expone en Kabat y en el que dicho anticuerpo comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica en el que la segunda cadena comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y dicho anticuerpo comprende además:
(i) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 32, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico covalentemente unido a un aminoácido cisteína en la posición 239;
(ii) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 33, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos covalentemente unidos a aminoácidos cisteína respectivamente situados en las posiciones 239 y 442;
(iii) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 36, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico covalentemente unido a un aminoácido cisteína situado en la posición 239;
(iv) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 37, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos covalentemente unidos a aminoácidos cisteína respectivamente situados en las posiciones 239 y 442;
(v) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 40, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico covalentemente unido a un aminoácido cisteína situado en la posición 239;
(vi) una primera cadena polipeptídica que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 41, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos covalentemente unidos a aminoácidos cisteína respectivamente situados en las posiciones 239 y 442;
(vii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 32, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240;
(viii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 71, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442;
(ix) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 74, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240;
(x) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 76, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442;
(xi) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 79, en el que la primera cadena polipeptídica comprende un resto terapéutico covalentemente unido a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240; o,
(xii) una primera cadena polipeptídica que comprende o que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 81, en el que la primera cadena polipeptídica comprende dos restos terapéuticos covalentemente unidos a un aminoácido cisteína insertado entre las posiciones 239 y 240 y un aminoácido cisteína situado en la posición 442.
13. ADC según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el resto terapéutico comprende una citotoxina, un radioisótopo, un inmunomodulador, una citocina, una linfocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, un factor de necrosis tumoral, una hormona, un antagonista hormonal, una enzima, un oligonucleótido, un ADN, un ARN, un ARNip, un iARN, un microARN, un agente terapéutico fotoactivo, un agente anti-angiogénico, un agente proapoptótico, un péptido, un lípido, un hidrato de carbono, un agente quelante, o combinaciones de los mismos.
14. ADC según la reivindicación 13, en el que la citotoxina es una tubulisina, una auristatina, un maitansinoide o una pirrolobenzodiazepina (PBD).
15. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo contra HER2 biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un ADC según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, y un portador farmacéuticamente aceptable.
16. Anticuerpo contra HER2 biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un ADC según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, o la composición farmacéutica según la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa HER2.
17. Anticuerpo, ADC, o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 16, en el que el cáncer es un cáncer con baja expresión de HER2.
18. Anticuerpo contra HER2 biespecífico, un ADC, o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 16, en el que dicho cáncer es resistente a un agente terapéutico dirigido hacia HER2.
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