TW201311893A - 使用包含第一型ｍｈｃ之複合體透過循環病毒特異性毒殺ｔ細胞以移除標的細胞之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係揭示一種複合體，其包含可特異性結合至標的抗原之抗體衍生部分作為第一部分，及病毒衍生肽連接至第一型MHC蛋白質複合體作為第二部分。由於本發明所揭示複合體之存在，藉由使表現標的抗原之細胞帶有第一型MHC複合體以模擬急性病毒感染，可引導個體之病毒特異性循環毒殺型T細胞(T記憶細胞或T效應細胞)至這些細胞，該共價複合體之抗體衍生部分特異性結合至該標的抗原。因此，本發明揭示之一個態樣係一種複合體，其特徵在於包含一條融合多肽，以N至C端方向包含：(i)β2-小球蛋白及(ii)相對頻率小於1%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，或(i)病毒衍生肽、(ii)β2-小球蛋白及(iii)相對頻率1%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及兩條多肽鏈，以一或多個雙硫鍵連接，其中第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域、(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域及(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，而第二條經雙硫鍵連接之多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該融合多肽係以共價結合至該等經雙硫鍵連接之多肽鏈之一者之C端或N端，或以共價結合至一抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈中所包含可變域的互補重鏈或輕鏈可變域。

Description

使用包含第一型MHC之複合體透過循環病毒特異性毒殺T細胞以移除標的細胞之方法
本發明係揭示一種包括抗體及第一型MHC組分之融合多肽，及其藉由標靶式吸引循環病毒特異性毒殺型T細胞以移除腫瘤細胞之用途。
第一型MHC蛋白質係由α-鏈(α-1至α-3及跨膜域)及β2-小球蛋白所組成，其以多基因方式(在單倍體基因組中第一型MHC蛋白質有3個基因座)產生6種不同的第一型MHC蛋白質α-鏈(在人類中，2條HLA-A、2條HLA-B、2條HLA-C)。再者，MHC係呈多型態，人類HLA-A對偶基因A*0201普遍存在於約30%至50%白種人中(Player等人.,J Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19(1996)357-363)。
人類巨細胞病毒(Human cytomegalovirus；HCMV)(即為第5型人類疱疹病毒(Human herpesvirus 5；HHV-5)係最大型人類病毒中其中的一種，其基因組包含約230,000鹼基對之線型雙股DNA，且可編碼160種以上的蛋白質(Davison,A.J.等人.,J.Gen.Virol.84(2003)17-28)。
CMV已進化變成人類基因組的非凡寄生生物，且其係強力的免疫原並可驅動免疫系統所有防禦的強力免疫反應。此病毒似乎是人類免疫系統中已知的最強免疫顯性抗原，且可刺激前所未有幅度的CD8+-T細胞反應。
CMV「潛伏感染狀態」係依靠慢性免疫抑制CMV病毒，而非病毒轉錄作用的形式改變(Moss & Khan,Human Immunology 65(2004)456-464)。
CD8+-T細胞免疫反應並非均勻對抗所有的CMV蛋白質，而是集中重點對抗。CMV蛋白質pp65及IE-1係主要標靶(McLaughlin-Taylor,E.，等人.,J.Med.Virol.43(1994)103-110；Moss & Khan,Human Immunology 65(2004)456-464)。
CMV特異性T細胞之實際頻率極高，就個別肽而言頻率高達總CD8+-T細胞譜系之1至2%(Moss & Khan，Human Immunology supra；Wills,M.R.，等人.,J.Virol.70(1996)7569-7579)。
CMV特異性CD8+-T細胞反應會隨年齡急劇增加，且個別HLA-肽四聚體常佔總CD8+-T細胞群之10%以上(Khan,N.等人.,J.Immunol.169(2002)1984-1992)。
健康老年供體中之總CD8+-T細胞反應可佔CD8+-T細胞譜系中之約50%。
大量CD8+-T細胞擴增常常極具同源細胞的限制，而估計CMV係造成隨著老化發現於外周血液中至少30%同源性CD8+-T細胞擴增的原因。60歲以上CMV血清呈陽性反應供體中之總CD8+-T細胞數量與CMV-血清呈陰性反應同世代相較是2倍(Looney,R.J.等人.,Clin.Immunol.90(1999)213-219)。
可溶性HLA與β2-小球蛋白之融合體係經Mottez等人(Eur.J.Immunol.21(1991)467-471)、Godeau等人(J.Biol.Chem.267(1992)24223-24229)及Mage等人(Proc.Natl. Acad.Sci.89(1992)10658-10662)提出。病毒衍生肽與可溶性HLA及β2-小球蛋白之融合體係經Mottez等人(J.Exp.Med.181(1995)493-502)提出。免疫球蛋白重鏈與可溶性HLA及共同表現β2-小球蛋白之融合體係經Dal Porto等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6671-6675)提出。生物素化肽-可溶性HLA及β-2-小球蛋白與化學偶合至Fab之鏈黴抗生物素蛋白之四聚複合體係經Robert等人描述(Eur.J.Immun.30(2000)3165-3170)。帶有病毒衍生肽與可溶性HLA及β-2-小球蛋白之融合體之化學偶合Fab係經Robert等人提出(Cancer Immunity 1(2001)2)。病毒衍生肽與可溶性HLA及β-2-小球蛋白融合至鼠單株抗體重鏈係經Greten等人提出(J.Immunol.Methods 271(2002)125-135)。不含肽之scFv融合體之大腸桿菌表現、試管內再摺疊及肽負載作用係經Lev等人(J.Immunol.169(2002)2988-2996)、Lev等人(Proc.Natl.Acad.Sci.101(2004)9051-9056)及Novak等人(Int.J.Cancer 120(2006)329-336)提出。負載肽及偶合至經融合鏈黴抗生物素蛋白Fab或scFv抗體之生物素化可溶性MHC的用途係經Mous等人提出(Leukemia 20(2006)1096-1102)。
於WO 2005/099361中揭示帶有經修飾β2-小球蛋白之第一型MHC-肽-抗體共軛物。WO 2005/099361中所揭示之示例性共軛物係藉由在試管內進行MHC-複合體(HLA)α鏈的共軛作用或藉由在相同細胞中不同基因之共同表現而製得。
於US 2004/0091488中，係揭示帶有特異性攜帶體分子之主要組織相容性複合體第一型抗原的抗原性構築體，此文所揭示的融合多肽缺乏鉸鏈區。
本發明係關於一種以重組方式製造複合體之方法及該複合體本身，該複合體包含作為第一部分可特異性結合至標的抗原之抗體衍生部分及作為第二部分以共價方式連接至第一型MHC蛋白質複合體之病毒衍生肽。
由於本發明所揭示複合體，藉由經連接至第一型MHC蛋白質複合體之病毒衍生肽裝整帶有MHC第一型複合體可表現標的抗原細胞模擬急性病毒感染，個體既存的病毒特異性循環毒殺型T細胞(T記憶細胞及/或T效應細胞)會被引導至這些細胞，該複合體之抗體衍生部分就會特異性結合至該抗原。
本發明一個態樣係一種於真核細胞中重組製造複合體之方法，該複合體包含：i)β2-小球蛋白與第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3之融合多肽，ii)經雙硫鍵連接之一對多肽鏈，每一多肽鏈包含抗體鉸鏈區，及iii)至少一對抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域，該方法包含步驟：i)培養真核細胞，該細胞包含可編碼該複合體之一或多種核酸，及ii)自該細胞或該培養基回收該複合體，其中該複合體精確地包含一條β2-小球蛋白與第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3之融合多肽。
於一個實施例中，該複合體精確地包含一條MHC-衍生多 肽或精確地包含MHC-衍生分子之一條融合多肽。
於一個實施例中，該複合體係以1 mg/ml或更高之濃度於該培養基中獲得。於一個實施例中，該複合物係以4 mg/ml或更高之濃度於該培養基中獲得。
於一個實施例中，該真核細胞係哺乳動物細胞。於一個實施例中，該哺乳動物細胞係人類胚胎腎細胞，或中國倉鼠卵巢細胞，或幼齡倉鼠腎細胞或小鼠骨髓瘤細胞。
於一個實施例中，該融合多肽以N至C端方向包含β2-小球蛋白及相對發生頻率小於1%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3。
於一個實施例中，該融合多肽包含T細胞反應誘導肽、β2-小球蛋白及相對發生頻率為1%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3。
於一個實施例中，衍生自抗體鉸鏈區之成對經雙硫鍵連接多肽鏈之多肽：i)係經一或多個雙硫鍵連接，ii)第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域、免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域及抗體重鏈鉸鏈區多肽，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈則包含抗體重鏈鉸鏈區多肽。
於一個實施例中，該融合多肽係：i)以共價方式鍵結至經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或ii)以共價方式鍵結至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補同源重鏈或輕鏈可變域，或iii)以共價方式鍵結至抗體恆定域之C端，該抗體恆 定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，該T細胞反應誘導肽係病毒衍生肽。
於一個實施例中，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)具有選自SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：09之胺基酸序列之病毒衍生肽，(ii)具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列之第一連接子肽，(iii)具有胺基酸序列SEQ ID NO：10之β2-小球蛋白，(iv)具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列之第二連接子肽，(v)具有胺基酸序列SEQ ID NO：11之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及(vi)具有選自SEQ ID NO：12、16、17、18、21、22及23之胺基酸序列之第三連接子肽。
於一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽鏈及第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含：i)包含選自SEQ ID NO：31、32及33之胺基酸序列之人類IgG1 CH2域，及包含選自SEQ ID NO：34、35及36之胺基酸序列之人類IgG1 CH3域。
於一個實施例中，該複合體包含：i)具有胺基酸序列SEQ ID NO：21之第一連接子肽，及/或ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO：22之第二連接子肽，及/或iii)具有胺基酸序列SEQ ID NO：12之第三連接子肽，及/或iv)具有胺基酸序列SEQ ID NO：32或33之人類IgG1 CH2域，及/或v)於第一條經雙硫鍵 連接多肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：35之人類IgG1 CH3域及在第二條經雙硫鍵連接多肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：36之人類IgG1 CH3域。
本發明一個態樣係一種複合體，其特徵在於該複合體包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)β2-小球蛋白，及(ii)具有相對頻率小於1%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，或(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)具有相對頻率為1%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，及(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，且其中第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該融合多肽係：- 以共價方式鍵結至該等經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或 - 以共價方式鍵結至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式鍵結至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於所有態樣之一個實施例中，該複合體係抗原結合複合體。
於所有態樣之一個實施例中，該複合體係共價複合體。
於所有態樣之一個實施例中，該相對頻率為1%或更高之第一型MHC分子具有10%或更高之相對頻率。於一個實施例中，該相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子係HLA-A*0201、或HLA-A*1101、或HLA-A*2402、或HLA-A*340101、或HLA-C*0304、或HLA-C*0401、或HLA-C*0702。
於所有態樣之一個實施例中，該相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子係根據個體之區域加以選擇的，該複合體係依照下列方案投與個體：- 對於歐洲裔個體而言，該第一型MHC分子係選自由HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*4402、HLA-C*0401、HLA-C*0501、HLA-C*0701、及HLA-C*0702組成之群，- 對於澳洲裔個體而言，該第一型MHC分子係選自由HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*340101、 HLA-B*1301、HLA-B*1521、HLA-B*5601、HLA-B*5602、HLA-C*0102、HLA-C*0401、HLA-C*0403、及HLA-C*1502組成之群，- 對於北美裔個體而言，該第一型MHC分子係選自包含HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-C*0202、HLA-C*0304、HLA-C*0401、及HLA-C*0702之群，及- 對於東南亞裔個體而言，該第一型MHC分子係選自包含HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-B*1504、HLA-C*0102、HLA-C*0304、HLA-C*0702、及HLA-C*0801之群。
於所有態樣之一個實施例中，該相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子係根據個體之區域加以選擇的，該複合體係依照下列方案投與個體：- 對於歐洲裔個體而言，該第一型MHC分子係HLA-A*0201，- 對於澳洲裔個體而言，該第一型MHC分子係選自包含HLA-A*2402、HLA-B*1301、HLA-C*0102及HLA-C*0401之群，- 對於北美裔個體而言，該第一型MHC分子係選自包含HLA-A*2402及HLA-C*0304之群，及- 對於東南亞裔個體而言，該第一型MHC係HLA-A*2402。
於所有態樣之一個實施例中，以N至C端方向包含β2-小球蛋白及相對頻率小於1%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3之融合多肽可另外在其N端包含結合至MHC-肽結合溝槽之肽。
於所有態樣之一個實施例中，該T細胞反應誘導肽係 CD8+-T細胞反應誘導肽。於一個實施例中，該T細胞反應誘導肽係病毒衍生肽。
於所有態樣之一個實施例中，該相對頻率小於1%之第一型MHC分子係選自包含HLA-B*4201、HLA-B*5901、HLA-B*6701及HLA-B*7802之群。
於所有態樣之一個實施例中，該融合多肽包含：(i)病毒衍生肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)可溶性HLA-A對偶基因A*0201。
於所有態樣之一個實施例中，該病毒係選自腺病毒、第1型人類疱疹病毒、第2型人類疱疹病毒、第4型人類疱疹病毒(艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus))、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人類巨細胞病毒、人類免疫缺陷病毒、第16型人類乳突瘤病毒、第18型人類乳突瘤病毒、第31型人類乳突瘤病毒、第33型人類乳突瘤病毒、第35型人類乳突瘤病毒、第39型人類乳突瘤病毒、第45型人類乳突瘤病毒、第51型人類乳突瘤病毒、第52型人類乳突瘤病毒、第56型人類乳突瘤病毒、第58型人類乳突瘤病毒、第59型人類乳突瘤病毒、第68型人類乳突瘤病毒、第73型人類乳突瘤病毒、第82型人類乳突瘤病毒、第1型人類T細胞淋巴球細胞性病毒、A型人類流感病毒、B型人類流感病毒、牛痘病毒、登革熱病毒。
於所有態樣之一個實施例中，該病毒衍生肽係選自NLVPMVATV(SEQ ID NO：01)、SLYNTVATL(SEQ ID NO：02)、 GLCTLVAML(SEQ ID NO：03)、GILGFVFTL(SEQ ID NO：04)、STNRQSGRQ(SEQ ID NO：05)、LLFGYPVYV(SEQ ID NO：06)、FAEGFVRAL(SEQ ID NO：07)、LIVIGILIL(SEQ ID NO：08)、或ILHTPGCV(SEQ ID NO：09)、WYAQIQPHW(SEQ ID NO：52)、AFSGVSWTM(SEQ ID NO：53)、ILIGVVITW(SEQ ID NO：54)、MMIPTVVAF(SEQ ID NO：55)、PFPQSNAPI(SEQ ID NO：56)、LLLTLLATV(SEQ ID NO：57)、IVLEHGSCV(SEQ ID NO：58)、LLFKTENGV(SEQ ID NO：59)、PLNEAIMAV(SEQ ID NO：60)、NLVRLQSGV(SEQ ID NO：61)、LVISGLFPV(SEQ ID NO：62)、LLLVAHYAI(SEQ ID NO：63)、LALLAAFKV(SEQ ID NO：64)、VILAGPMPV(SEQ ID NO：65)、HVLGRLITV(SEQ ID NO：66)、VTEHDTLLY(SEQ ID NO：67)、NTDFRVLEL(SEQ ID NO：68)、CVETMCNEY(SEQ ID NO：69)、VLEETSVML(SEQ ID NO：70)、NLVPMVATV(SEQ ID NO：71)、RIFAELEGV(SEQ ID NO：72)、IIYTRNHEV(SEQ ID NO：73)、VLAELVKQI(SEQ ID NO：74)、AVGGAVASV(SEQ ID NO：75)、TVRSHCVSK(SEQ ID NO：76)、IMREFNSYK(SEQ ID NO：77)、GPISHGHVLK(SEQ ID NO：78)、ATVQGQNLK(SEQ ID NO：79)、VYALPLKML(SEQ ID NO：80)、AYAQKIFKIL(SEQ ID NO：81)、QYDPVAALF(SEQ ID NO：82)、YVKVYLESF(SEQ ID NO：83)、DIYRIFAEL(SEQ ID NO：84)、VFETSGGLVV(SEQ ID NO：85)、KARDHLAVL(SEQ ID NO：86)、QARLTVSGL(SEQ ID NO：87)、KARAKKDEL(SEQ ID NO：88)、QIKVRVDMV(SEQ ID NO：89)、RRRHRQDAL(SEQ ID NO：90)、ARVYEIKCR(SEQ ID NO：91)、KMQVIGDQY(SEQ ID NO：92)、NVRRSWEEL(SEQ ID NO：93)、CPSQEPMSIYVY(SEQ ID NO：94)、KPGKISHIMLDVA(SEQ ID NO：95)、ELRRKMMYM(SEQ ID NO：96)、IPSINVHHY(SEQ ID NO：97)、FEQPTETPP(SEQ ID NO：98)、YAYIYTTYL(SEQ ID NO：99)、QEFFWDANDIY(SEQ ID NO：100)、YEQHKITSY(SEQ ID NO：101)、QEPMSIYVY(SEQ ID NO：102)、SEHPTFTSQY(SEQ ID NO：103)、QAIRETVEL(SEQ ID NO：104)、TRATKMQVI(SEQ ID NO：105)、DALPGPCI(SEQ ID NO：106)、CEDVPSGKL(SEQ ID NO：107)、HERNGFTVL(SEQ ID NO：108)、PTFTSQYRIQGKL(SEQ ID NO：109)、QMWQARLTV(SEQ IDNO：110)、HELLVLVKKAQL(SEQ ID NO：111)、或DDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：112)、或其包含1至3個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體。
於所有態樣之一個實施例中，該β2-小球蛋白係人類β2-小球蛋白。於一個實施例中，該β2-小球蛋白係野生型人類β2-小球蛋白。於一個實施例中，該β2-小球蛋白係由胺基酸序列SEQ ID NO：10組成，或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體。
於所有態樣之一個實施例中，該β2-小球蛋白係人類β2-小球蛋白，而相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子係人類HLA-A*0201。於一個實施例中，該第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3係由胺基酸序列SEQ ID NO：11組成或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體。
於所有態樣之一個實施例中，該病毒衍生肽係經由第一連接子肽融合至該β2-小球蛋白。於一個實施例中，該病毒 衍生肽係融合至β2-小球蛋白之N端。
於所有態樣之一個實施例中，該β2-小球蛋白係經由第二連接子肽融合至第一型MHC分子之胞外域α1。
於所有態樣之一個實施例中，該第一型MHC分子之胞外域α3係經由第三連接子肽融合至經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者。
於所有態樣之一個實施例中，第一、第二及第三連接子肽係相同或不同的。
於所有態樣之一個實施例中，第一連接子肽、第二連接子肽及第三連接子肽係彼此獨立地選自胺基酸序列GS(SEQ ID NO：12)、GGS(SED ID NO：13)、GGGS(SEQ ID NO：14)、GGGSGGGS(SEQ ID NO：15)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：16)、GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：17)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：18)、GGGGS(SEQ ID NO：19)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：20)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：21)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：22)、及GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：23)。
於所有態樣之一個實施例中，第一連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：21。
於所有態樣之一個實施例中，第二連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：22。
於所有態樣之一個實施例中，第三連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。
於所有態樣之一個實施例中，該抗體重鏈鉸鏈區多肽係選自IgG或IgE類人類抗體之抗體重鏈鉸鏈區多肽。
於所有態樣之一個實施例中，該抗體重鏈鉸鏈區多肽係選自IgG1、或IgG2、或IgG3、或IgG4子類人類抗體之抗體重鏈鉸鏈區多肽。
於所有態樣之一個實施例中，該抗體重鏈鉸鏈區多肽包含或組成自胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：24)、EPKSADKTHTCPPCP(SEQ ID NO：25)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：26)、ERKCAVECPPCP(SEQ ID NO：27)、ERKACVECPPCP(SEQ ID NO：28)、ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：29)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：30)、DKTHTCPPCP(SEQ ID NO：47)、VECPPCP(SEQ ID NO：48)、AVECPPCP(SEQ ID NO：49)、DTTHTCPRCP(SEQ ID NO：50)、或PPCPSCP(SEQ ID NO：51)。
於所有態樣之一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽及/或第二條經雙硫鍵連接多肽包含人類CH2域及/或CH3域。於一個實施例中，該人類CH2域及CH3域係屬於IgG或IgE類人類抗體。於一個實施例中，該CH2域及CH3域係屬於IgG1、或IgG2、或IgG3、或IgG4子類之人類抗體。於一個實施例中，該CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：31。於一個實施例中，該CH2域係屬於IgG1或IgG2子類人類抗體且包含E233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、P329、A330、及/或P331(依照Kabat之EU索引編號)中至少一個突變。於一個實施例中， 該CH2域係屬於具有突變L234A及L235A，及/或突變D265A及N297A之IgG1子類或人IgG2子類人類抗體，及/或含有PVA236突變，及/或含有突變P329G。於一個實施例中，該CH2域係屬於具有突變L234A及L235A及/或P329G之IgG1子類人類抗體。於一個實施例中，該CH2域係屬於具有突變S228P及/或L235E之IgG4子類人類抗體。於一個實施例中，該CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33。於一個實施例中，該CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：34。
於所有態樣之一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：35，且第二條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：36。
於所有態樣之一個實施例中，第一條及第二條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38。
於所有態樣之一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽或第二條經雙硫鍵連接多肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38組成。
於所有態樣之一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：39，且第二條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：40。
於所有態樣之一個實施例中，經一或多個雙硫鍵連接之多肽鏈係藉由2、或3或4個雙硫鍵連接。
於所有態樣之一個實施例中，該複合體之特徵在於該融合多肽以N至C端方向包含： (i)病毒衍生肽，其具有選自包含SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：09組成之群之胺基酸序列，(ii)第一連接子肽，其具有選自包含SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23組成之群之胺基酸序列，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體，(iv)第二連接子肽，其具有選自包含SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之群之胺基酸序列，(v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC分子具有胺基酸序列SEQ ID NO：11或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體，及(vi)第三連接子肽，其具有選自包含SEQ ID NO：12、16、17、18、21、22及23之群之胺基酸序列。
於所有態樣之一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽及第二條經雙硫鍵連接多肽進一步包含：- 人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：31、32及33之胺基酸序列，及- 人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：34、35及36之胺基酸序列。
於所有態樣之一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)病毒衍生肽，其具有選自SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：09之胺基酸序列， (ii)第一連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體，(iv)第二連接子肽，其具有選自包含SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之群之胺基酸序列，(v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC分子具有胺基酸序列SEQ ID NO：11或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體，及(vi)第三連接子肽，其具有選自包含SEQ ID NO：12、16、17、18、21、22及23之群之胺基酸序列，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，其包含選自SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：47至51之胺基酸序列，(iv)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：31、32及33之胺基酸序列，及(v)人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：34、35及36之胺基酸序列， 且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)抗體重鏈鉸鏈區多肽，其包含選自SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：47至51之胺基酸序列，(ii)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：31、32及33之胺基酸序列，及(iii)人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：34、35及36之胺基酸序列，其中該融合多肽係- 以共價方式結合至第二條經雙硫鍵連接多肽鏈之C端或N端。
於所有態樣之一個實施例中，第一及第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含相同抗體重鏈鉸鏈區多肽。
於所有態樣之一個實施例中，該病毒衍生肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：01，第一連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：21，第二連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：22，第三連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，人類IgG1 CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：32或33，及經雙硫鍵連接多肽其中一條之人類IgG1 CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：35，且另一條經雙硫鍵連接多肽之人類IgG1 CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：36。
於所有態樣之一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含： (i)病毒衍生肽，其具有選自SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：09之胺基酸序列，(ii)第一連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之其變異體，(iv)第二連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，(v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC分子具有胺基酸序列SEQ ID NO：11或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體，及(vi)第三連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：12、16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，其包含選自SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：47至51之胺基酸序列，(iv)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：31、32及33之胺基酸序列，及 (v)人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：34、35及36之胺基酸序列，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，該重鏈鉸鏈區多肽包含選自SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：47至51之胺基酸序列，其中，該融合多肽係：- 以共價方式結合至第一條經雙硫鍵連接多肽鏈之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於所有態樣之一個實施例中，該病毒衍生多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：01，第一連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：21，第二連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：22，第三連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，人類IgG1 CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：32或33，及經雙硫鍵連接肽其中一條之人類IgG1 CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：35，且另一條經雙硫鍵連接多肽之人類IgG1 CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：36。
於所有態樣之一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含： (i)病毒衍生肽，其具有選自SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：09之胺基酸序列，(ii)第一連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體，(iv)第二連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，(v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC分子具有胺基酸序列SEQ ID NO：11或係其包含1至10個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體，及(vi)第三連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：12、16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條及第二條經雙硫鍵連接多肽鏈各自以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，其包含選自SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：47至51之胺基酸序列，(iv)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：31、32 及33之胺基酸序列，及(v)人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：34、35及36之胺基酸序列，其中該融合多肽係：- 以共價方式結合至第二條經雙硫鍵連接多肽鏈之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於所有態樣之一個實施例中，該病毒衍生多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：01，第一連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：21，第二連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：22，第三連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，人類IgG CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：32或33，及經雙硫鍵連接多肽其中一條之人類IgG1 CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：35，且另一條經雙硫鍵連接多肽之人類IgG1 CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：36。
於所有態樣之一個實施例中：- 第一連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：21，及/或- 第二連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：22，及/或- 第三連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，及/或 - 人類IgG1 CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：32或33，及/或- 經雙硫鍵連接多肽其中一條之人類IgG1 CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：35，且另一條經雙硫鍵連接多肽之人類IgG1 CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：36。
於所有態樣之一個實施例中，該病毒衍生肽係選自包含SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：52至SEQ ID NO：112，或係其包含1至3個胺基酸交換、***及/或刪除之變異體。
本發明一個態樣係編碼本發明複合體之核酸。
於一個實施例中，該核酸包含2至4個表現盒，該等表現盒包含可編碼具有不同胺基酸序列之多肽之結構基因。
本發明一個態樣係包含本發明核酸之宿主細胞。
本發明一個態樣係產生本發明複合體之方法，該方法包含培養本發明之宿主細胞以產生該複合體。
於一個實施例中，該複合體係回收自該細胞或該培養基，並藉此產生複合體。
本發明一個態樣係包含本發明複合體及細胞毒性劑之免疫共軛物。
本發明一個態樣係一種醫藥調配物，其包含本發明複合體及視需要之醫藥可接受載劑。
於一個實施例中，該醫藥調配物進一步包含額外治療劑。
本發明一個態樣係本發明複合體作為藥物之用。
本發明一個態樣係本發明複合體作為治療癌症或慢性病 毒感染之用。
本發明一個態樣係本發明複合體作為將個體的病毒特異性毒殺型T細胞吸引至標的物之用。
本發明一個態樣係本發明複合體作為移除癌細胞或經病毒感染細胞之用。
本發明一個態樣係本發明複合體在製造藥物上之用途。
於一個實施例中，該藥物係用於治療癌症或慢性病毒感染。
於一個實施例中，該藥物係用於將個體的病毒特異性毒殺型T細胞吸引至標的物。
於一個實施例中，該藥物係用於移除癌細胞或經病毒感染細胞。
本發明一個態樣係治療罹患癌症或慢性病毒感染之個體之方法，該方法包括將有效量之本發明複合體投與該個體。
於一個實施例中，該方法進一步包含將額外治療劑投與該個體。
本發明一個態樣係將個體的病毒特異性毒殺型T細胞吸引至個體中標的物之方法，該方法包括將有效量之本發明複合體投與該個體，以便將個體的病毒特異性毒殺型T細胞吸引至標的物。
本發明一個態樣係移除個體中之癌細胞或經病毒感染細胞之方法，該方法包括將有效量之本發明複合體投與該個體，以便移除/崩解癌細胞或經病毒感染細胞。
序列簡單說明
SEQ ID NO：01 人類巨細胞病毒衍生肽
SEQ ID NO：02 人類免疫缺陷病毒衍生肽
SEQ ID NO：03 第4型人類疱疹病毒衍生肽
SEQ ID NO：04 A型流感病毒衍生肽
SEQ ID NO：05 B型流感病毒衍生肽
SEQ ID NO：06 第1型人類T細胞淋巴球細胞性病毒衍生肽
SEQ ID NO：07 V-jun肉瘤病毒17致癌基因同源物(JUN)衍生肽
SEQ ID NO：08 第3型人類腺病毒衍生肽
SEQ ID NO：09 C型肝炎病毒衍生肽
SEQ ID NO：10 人類β2-小球蛋白胺基酸序列
SEQ ID NO：11 人類HLA-A*0201 α1至α3鏈胺基酸序列
SEQ ID NO：12至23 連接子肽胺基酸序列
SEQ ID NO：24 人類IgG1重鏈鉸鏈多肽胺基酸序列
SEQ ID NO：25 人類IgG1重鏈鉸鏈變異體多肽胺基酸序列
SEQ ID NO：26 人類IgG2重鏈鉸鏈多肽胺基酸序列
SEQ ID NO：27 人類IgG2重鏈鉸鏈變異體多肽胺基酸序列
SEQ ID NO：28 人類IgG2重鏈鉸鏈變異體多肽胺基酸序列
SEQ ID NO：29 人類IgG3重鏈鉸鏈多肽胺基酸序列
SEQ ID NO：30 人類IgG4重鏈鉸鏈多肽胺基酸序列
SEQ ID NO：31 人類IgG1 CH2域胺基酸序列
SEQ ID NO：32 帶有L234A、L235A突變之人類IgG1 CH2域胺基酸序列
SEQ ID NO：33 帶有L234A、L235A、P329G突變之人類IgG1 CH2域胺基酸序列
SEQ ID NO：34 人類IgG1 CH3域胺基酸序列
SEQ ID NO：35 人類IgG1 CH3域紐結變異體胺基酸序列
SEQ ID NO：36 人類IgG1 CH3域孔眼變異體胺基酸序列
SEQ ID NO：37 人類IgG1 Fc-區域胺基酸序列
SEQ ID NO：38 帶有L234A、L235A突變之人類IgG1 Fc-區域胺基酸序列
SEQ ID NO：39 帶有L234A、L235A突變及孔眼變異體之人類IgG1 Fc-區域胺基酸序列
SEQ ID NO：40 帶有L234A、L235A突變及紐結變異體人類IgG1 Fc-區域胺基酸序列
SEQ ID NO：41 人化抗IGF-1R單株輕鏈抗體胺基酸序列(κ)
SEQ ID NO：42 人化抗IGF-1R單株重鏈抗體胺基酸序列(IgG1 L234A、L235A突變體)
SEQ ID NO：43 人化抗IGF-1R單株重鏈抗體胺基酸序列(IgG1 L234A、L235A突變體及紐結變異體)
SEQ ID NO：44 人化抗IGF-1R單株重鏈抗體胺基酸序列(IgG1 L234A、L235A突變體及孔眼變異體)
SEQ ID NO：45 人類IgG1 Fc-區域突變鉸鏈區及L234A、L23 5A突變體及紐結變異體
SEQ ID NO：46 人化抗IGF-1R單株抗體之經雙硫鍵穩定化單鏈Fv
SEQ ID NO：47至51 截短人類抗體重鏈鉸鏈多肽胺基酸序列
SEQ ID NO：52至66 登革熱病毒衍生肽
SEQ ID NO：67至112 人類巨細胞病毒衍生肽
I.定義
「親和力」係指分子(例如，抗體)單一結合位點與其結合夥伴(例如，抗原)之間的非共價相互作用之總強度。除非另外說明，否則如本文中所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如，抗體與抗原)成員之間1：1相互作用之本身固有結合親和力。分子X對其夥伴Y之親和力一般是以解離常數(Kd)表示。親和力可藉由技藝中已知包括本文所述之常見方法測量。測量結合親和力的具體說明及示例性實施例描述於下文中。
本申請案所使用之術語「胺基酸」係表示α羧基胺基酸群，該等胺基酸係直接由核酸編碼或由核酸編碼成前驅物之形式。個別的胺基酸係由3個核苷酸(所謂之密碼子或鹼基三聯體)所組成之核酸編碼。每一胺基酸係由至少一個密碼子編碼，此稱為「遺傳密碼簡併」。本申請案中所使用之術語「胺基酸」係表示天然α羧基胺基酸，包括丙胺酸(三字母碼：ala，單字母碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、榖胺醯胺(gln，Q)、榖胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異亮胺酸(ile，I)、亮胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、***酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。
術語「抗標的物抗體」及「結合至標的物之抗體」係指能夠以足夠親和力結合至標的物之抗體，如此該抗體可用作為靶向標的物之診斷劑及/或治療劑。於特定實施例中，結合至標的物之抗體具有10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如，10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如，10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。
本文中術語「抗體」係以廣義概念使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，條件係該等可展現所需之抗原結合活性。
「抗體片段」係指包括完整抗體部分之非完整抗體之分子，其可結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙抗體；線抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；單域抗體；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體之「類」係指抗體重鏈的恆定域類型或所擁有恆定區的類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等抗體中有數種可進一步劃分為子類(同型物)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。不同類免疫球蛋白所對應之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
術語「相對頻率為...之第一型MHC分子」係表示各第一型MHC分子以某一頻率出現在特定人群中或具有指定相對頻率之所有人類中。即是說，相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子可出現在特定所有人群中之10%或更高，諸 如，例如歐洲裔所有人群之27.2%。
複合體對其共軛夥伴之「共軛作用」可藉由不同方法實施，諸如化學鍵結，或經由特定鍵結配對的結合。術語「共軛夥伴」係表示例如多肽、可偵測標記、特定鍵結配對之成員。於一個實施例中，複合體對其共軛夥伴之共軛作用係經由該複合體部分之胺基酸序列的N端及/或ε-胺基(離胺酸)、不同離胺酸之ε-胺基、羧基、巰基、羥基及/或酚系官能基，及/或該複合體之碳水結構之糖醇基團以化學鍵結之方式進行。於一個實施例中，該複合物經由特定鍵結配對共軛至其共軛夥伴上。
如本文中所使用之術語「細胞毒性劑」係指可抑制或阻礙細胞功能及/或導致細胞死亡或解構之物質。細胞毒性劑包括但不限於放射活性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射活性同位素)；化學治療劑或藥物(例如，甲胺蝶啶(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloids)(長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段(諸如溶核酶)；抗生素；毒素(諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物源之經酵素作用具有活性的毒素，包括其片段及/或變異體)；及各種抗腫瘤或抗癌藥劑。
色原(螢光或冷光基團及染料)、酵素、NMR-活性基團或 金屬粒子、半抗原(例如，毛地黃毒苷)係「可偵測標記」之實例。可偵測標記亦可為光活化交聯基團，例如，疊氮基或氮丙啶基。可被電化學冷光偵測的金屬螯合物亦是適宜的信號發射基團，特別受關注者是釕螯合物，例如，釕(雙吡啶基)3 2+螯合物。適宜的釕標記基團描述於例如EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511及WO 92/14138中。就直接偵測而言，該標記基團可選自任何已知偵測標記物基團(諸如，染料)、冷光標記基團(諸如化學冷光基團，例如吖啶酯或二氧雜環丁烷)或螢光染料(例如，螢光素、香豆素、若丹明、嗪、試鹵靈(resorufin)、花青素及其等衍生物)。標記基團之其他實例係冷光金屬複合物，諸如釕或銪複合物、例如用於ELISA或用於CEDIA(選殖酶供體免疫分析，例如EP-A-0 061 888)之酵素及放射同位素。
「效應子功能」係指可歸因於抗體Fc區之彼等生物活性，該等功能會隨著抗體同型物而有所變化。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity；CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC)；胞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調控；及B細胞活化作用。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在必要之劑量及時間下可有效完成所需治療或預防結果之含量。
如本文中所使用之術語「表現」係指發生在細胞內之轉錄及/或轉譯及分泌過程。受關注核酸序列在細胞中之轉錄水 平可根據存在於細胞中之對應mRNA之含量確定。例如，受關注序列轉錄之mRNA可藉由RT-PCR或藉由北方雜交作用量化(參見Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室發行，冷泉港，N.Y.(1989))。核酸所編碼之多肽可藉由各種方法量化，例如，藉由ELISA、藉由分析多肽之生物活性，或採用與此活性無關之分析法，諸如，利用可辨別並結合至該多肽之免疫球蛋白之西方墨漬或放射免疫分析(參見Sambrook等人，(1989)，同上)。
「表現盒」係表示含有用以表現至少細胞中所含核酸時所必需之調控元件(諸如，啟動子及聚腺苷酸化位點)之構築體。
術語「表現機構」係表示細胞中的酵素、輔助因子等參與開始時核酸或基因轉錄步驟(即，亦稱為「基因表現機構」)至藉由該核酸所編碼之多肽之後轉譯修飾步驟之總和。例如，表現機構包括DNA轉錄為前mRNA、前mRNA拼接為成熟mRNA、mRNA轉譯為多肽及多肽後轉譯修飾之步驟。
「表現質粒」係提供用以表現宿主細胞中所包含結構基因之所有所需元件之核酸。典型地，表現質粒包括原核質粒增殖單元(例如，就大腸桿菌而言，該單元包含複製起源及可選擇標記物)、真核選擇標記物及用於表現受關注結構基因之一或多個表現盒，各表現盒包含啟動子、結構基因及轉錄終止子(包含聚腺苷酸化信號)。基因表現一般是置於啟動子控制下，而此結構基因被稱之為「可操作地連接」至該啟動子。類似地，若調節元件可調控核心啟動子之活 性，則該調節元件及核心啟動子係可操作地連接。
本文中之術語「Fc區」係用於界定含有恆定區中至少一部分之免疫球蛋白重鏈C端區域。該術語包括天然Fc區及變異Fc區序列。於一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區係自Cys226，或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可以存在或不存在。除非在本文中另外說明，否則在Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係依照Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242所述之EU編號系統(亦稱為EU索引)。
「Fc區」係所熟知的術語，且係根據木瓜蛋白酶切割抗體重鏈所定義的。於一個實施例中，本發明複合體可包含人類Fc區或衍生自人類之Fc區作為抗體重鏈鉸鏈區多肽。於另一實施例中，該Fc區係子類IgG4人類抗體之Fc區或子類IgG1、IgG2或IgG3人類抗體之Fc區，其係經修飾以致無法偵測到Fcγ受體(例如，FcγRIIIa)結合及/或C1q結合。於一個實施例中，該Fc區係人類Fc區且尤其係來自人類IgG4子類或來自人類IgG1子類之經突變Fc區。於一個實施例中，該Fc區係來自具有突變L234A及L235A之人類IgG1子類。雖然IgG4展現較低之Fcγ受體(FcγRIIIa)結合，但其他IgG子類之抗體則展現強力的結合。然而，若改變Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(缺少Fc碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、 Thr307、Gln311、Asn434、或/及His435殘基，則亦提供較低之Fcγ受體結合(Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434)。於一個實施例中，本發明複合體係關於具有L234、L235及/或D265突變或含有PVA236突變之IgG4子類或IgG1或IgG2子類之Fcγ受體結合。於一個實施例中，該突變包括S228P、L234A、L235A、L235E及/或PVA236(PVA236表示IgG1胺基酸位置233至236之胺基酸序列ELLG(以單字母胺基酸碼表示)或IgG4之EFLG係被PVA替代)。於一個實施例中，該突變係於IgG4之S228P，及IgG1之L234A及L235A。抗體之Fc區直接參與ADCC(抗體依賴細胞介導細胞毒性)及CDC(補體依賴性細胞毒性)。未結合Fcγ受體及/或互補因子C1q之複合體不會誘導抗體依賴細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可交換使用，且係指已導入外源核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其等包括初代轉型細胞及自其衍生之子代而不論繼代數。子代之核酸內容可以不完全與親本細胞相同，而是可以含有突變。本文包括具有與原轉型細胞中所篩選或選擇之相同功能或細胞活性之突變體子代。
術語「細胞」包括用於質粒增殖之原核細胞及用於表現核酸之真核細胞。於一個實施例中，該真核細胞係哺乳動 物細胞。於一個實施例中，該哺乳動物細胞係選自包括CHO細胞(例如，CHO K1、CHO DG44)、BHK細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞及COS細胞之哺乳動物細胞群。
「人類抗體」係一種抗體，其擁有之胺基酸序列與人類或人類細胞產生之抗體或衍生自利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源抗體之胺基酸序列相當。人類抗體之此定義明確地排除包含非人類抗原結合殘基之人化抗體。
「免疫共軛物」係表示共軛至一或多種異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)之本發明複合體。
「個體」或「受試者」係哺乳動物。哺乳動物包括但不限於經馴化的動物(例如，牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長動物，諸如，猴)、兔及齧齒動物(例如，小鼠及大鼠)。於特定實施例中，該個體或受試者係人。
「經分離」複合體係已自其天然環境組分分離出來之複合體。於某些實施例中，複合體係經純化至當以例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)測定時為95%或99%之純度。
「經分離」核酸係指已自其天然環境組分分離出來之核酸分子。經分離核酸包括通常含有該核酸分子之細胞中之核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或在與其天然染色體位置不同之染色體位置上。
術語「一條融合多肽」係指僅一條(exactly one)所界定之融合多肽，且排除存在另一條所界定之融合多肽。該術語「一條」表示「僅一條」或「單一條」。
「可操作地連接」係指兩或更多個組分並置，其中所描述之組分是以允許彼等以所欲方式發揮功能之關係。例如，若啟動子及/或增強子以順式作用以控制或調控所連接序列之轉錄，則該啟動子及/或增強子係可操作地連接至該編碼序列。一般而言，但非必然，「可操作地連接」之DNA序列彼此鄰接，且當需接合二種蛋白質編碼區域(諸如分泌前導序列與多肽)時，彼此鄰接且於(讀)框中。然而，雖然可操作地連接之啟動子通常位於編碼序列之上游，但不必與該編碼序列鄰接。增強子不必鄰接。若增強子可增強編碼序列之轉錄，則該增強子係可操作地連接至該編碼序列。可操作地連接之增強子可位於編碼序列上游、其中或下游，且離啟動子相當的距離。若聚腺苷酸化位點位於編碼序列下游端，則該聚腺苷酸化位點係為可操作地連接至該編碼序列，如此轉錄可進行通過該編碼序列至該聚腺苷酸化序列。若轉譯終止密碼子位於編碼序列之下游端(3'端)，則該轉譯終止密碼子係可操作地連接至外顯子核酸序列，如此轉譯可進行通過該編碼序列至該終止密碼子並在此處終止。連接係由此技藝中已知之重組方法達成，例如利用PCR方法及/或藉由在合宜的限制位點接合。若合宜的限制位點不存在，則依照習知實務使用合成之寡核苷酸銜接子(adaptors)或連接子。
術語「包裝插頁」係指治療產品之商業包裝中習慣上包含之說明書，其包含有關適應症、使用方法、劑量、投藥、組合療法、禁忌及/或有關使用此等治療產品之警告之資訊。
術語「肽連接子」表示天然來源及/或合成來源之胺基酸序列。其等係由直線胺基酸鏈組成，其中20種天然存在的胺基酸為單體建構組元。肽連接子具有1至50個胺基酸之長度，於一個實施例中係介於1至28個胺基酸之間，於另一實施例中係介於2至25個胺基酸之間。該肽連接子可含有重複的胺基酸序列或天然存在的多肽序列。
該連接子具有藉由讓多肽正確摺疊及適當展現來確保彼此共軛之多肽可發揮其等生物活性之功能。於一個實施例中，該肽連接子富集甘胺酸、榖胺醯胺及/或絲胺酸殘基。此等殘基係以至多達5個胺基酸之小型重複單元的方式排列，如GS(SEQ ID NO：12)、GGS(SEQ ID NO：13)、GGGS(SEQ ID NO：14)及GGGGS(SEQ ID NO：19)。此小型重複單元可重複達1至5次。在多聚體單元之胺基及/或羧基端，可加入至多達6個額外的任意天然胺基酸。其他合成肽連接子大部分係由單個胺基酸經重複10至20次組成，且可在胺基及/或羧基端包含至多達6個額外任意天然胺基酸。所有肽連接子可藉由核酸分子編碼且因此可重組表現。由於連接子本身係肽，故藉由連接子連結之多肽係經由兩胺基酸之間所形成之肽鍵連結至連接子上。
術語「醫藥調配物」係指一種製劑，其所存在的形式可 以讓其中所包含之活性成分之生物活性具有效果，且不含有對投與該調配物之個體會產生無法接受毒性之其他組分。
「醫藥可接受載劑」係指在醫藥調配物中除活性成分外之成分，其對受試者無毒性。醫藥可接受載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
「多肽」係由透過肽鍵接合之胺基酸組成之天然或合成聚合物。含少於約25個胺基酸殘基之多肽可稱為「肽」，而由兩或更多個多肽組成或包含具有多於100個胺基酸殘基之一種多肽分子可稱為「蛋白質」。多肽亦可包含非胺基酸組分，如碳水化合物基團、金屬離子或羧酸酯。該等非胺基酸組分係表現該多肽之細胞所加入的，且會因細胞類型而有所變化。多肽在本文係根據其等胺基酸主鏈結構或編碼該多肽之核酸來界定的。所加入之組分(諸如碳水化合物基團)通常不會明確說明，但仍可存在。
「結構基因」表示不含信號序列之基因區域，也就是編碼區。
術語「T細胞反應誘導肽」表示存在於第一型MHC複合體之肽結合溝槽中且可以被循環的記憶或效應T細胞識別之肽。肽的識別作用會導致達到移除呈現此肽-第一型MHC複合體之細胞的免疫反應。
如本文中所使用，「治療」(及其語法變形，諸如「處理」)係指企圖改變受治療個體之自然過程之臨床干預，且可用於預防或在臨床病理學療程期間實施。所需之治療效果包 括但不限於防止疾病發生或復發，緩解症狀、消除疾病之任何直接或非直接病理學後果，防止癌轉移、降低疾病惡化速率、改善或減輕疾病狀態及緩和或改善預後。於某些實施例中，本發明抗體係用於延遲疾病發展或減緩疾病惡化。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體結合至抗原時所涉及之抗體重鏈或輕鏈的區域。天然的抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，每一可變域包含4個保守框架區(framework region；FR)及3個高可變區(hypervariable region；HVR)。(參見例如Kindt,T.J.等人，Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，page 91)。單一個VH或VL域即足以提供抗原結合特異性。此外，利用來自可結合該抗原之抗體的VH或VL域分離出可結合特定抗原之抗體，以分別篩選出互補VL或VH域之集合庫。參見例如Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628。
如本文中所使用之術語「載體」係指能夠增殖另一經連接之核酸的核酸分子。該術語包括自行複製核酸結構之載體以及已引入且併入至宿主細胞基因組中之載體。特定載體能夠指引可操作地連接之核酸之表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
II.組合物及方法 A.示例性複合體
本文揭示一種抗原結合複合體，其包含作為第一部分可特異性結合至標的抗原之抗體衍生部分，及作為第二部分經連接至第一型MHC蛋白質複合體之病毒衍生肽。
由於本發明所揭示複合體，藉由裝整帶有MHC第一型複合體的表現抗原細胞模擬急性病毒感染，個體既存的病毒特異性循環毒殺型T細胞(T記憶細胞及/或T效應細胞)會被引導至表現標的抗原之細胞，該複合體之抗體衍生部分就會特異性結合至標的抗原。
於一個態樣中，本發明部分地係基於本發明複合體之發現，該複合體包含作為第一部分經連接至第一型MHC蛋白質之病毒衍生肽及作為第二部分的抗體衍生經雙硫鍵連接分子，該複合體可用於將個體中既存的病毒特異性毒殺型T細胞引導至可以表現模擬急性病毒感染的標的抗原之細胞，並藉此啟動可表現該標的抗原之細胞的移除。
於特定實施例中，係提供包含融合多肽之複合體，該融合多肽包含：(i)病毒衍生肽，(ii)可溶性HLA-A對偶基因A*0201，及(iii)β2-小球蛋白。
本發明複合體可用於(例如)各種諸如癌症或病毒感染之疾病的診斷或治療。
於一個態樣中，本發明提供融合多肽，其可以結合(i)至細胞表面抗原及(ii)至細胞毒性T細胞。於特定實施例中，該融合多肽以10 nM之親和力結合至細胞表面抗原。
本發明複合體利用天然存在高效抗病毒免疫反應來移除/崩解標的細胞，例如，腫瘤細胞或病毒感染細胞。利用個 體自有的極有力循環T細胞而無需任何輔助刺激，即可使該等T細胞活化完成細胞的移除。
此外，細胞表面上進行的作用機轉需要少量之治療分子(Mottez等人，1995)。
治療期間，該融合多肽可以驅動類似於個體免疫接種作用之抗病毒免疫反應，並藉此增進具有多方面治療/應用的功效。
雖然僅有限的病患人群是屬於特定同種異型物(HLA-A同種異型：30%至50%的人群帶有對偶基因A*0201)且特定病毒感染之盛流率亦有限(CMV感染為60%至90%，主要視年齡而定)，但為了增強功效，仍可先施以免疫接種作用作為預處理。
或者，可使用人群中頻率極低的同種異型物，於一個實施例中，頻率是低於1%。此同種異型物的使用是過時的免疫接種步驟，因個體的免疫系統會將該同種異型物辨識成外來物，並引發免疫反應。
該靶向抗體必需具有高度細胞特異性或抗原特異性，以限制毒性及副作用。
因此，藉由使用本發明複合體：(i)僅會活化高度特異性T細胞群(對單一MHC-肽複合體具有特異性之CD8陽性的效應/記憶細胞)，而不會影響其他的CD3+-細胞(CD4+-T細胞：TH1、TH2、TH17，調節T細胞)；(ii)個體免疫系統之自然反應是模擬(經病毒感染細胞之 正常移除)；及(iii)開始時對施用的反應低，但在治療期間可以追加(特異性T細胞將被活化且數量擴增)，隨即可降低開始時的輸液反應及最初的細胞激素釋放。
於一個實施例中，該方法包含藉由施用所選擇的病毒衍生肽(例如，人類巨細胞病毒(HCMV)衍生肽)刺激CD8-陽性毒殺型T細胞之步驟。
咸已證明，經活化CMV-肽特異性T細胞可介導試管內經作用的腫瘤細胞之移除(試管內中有經負載CMV衍生肽之腫瘤細胞)。
病毒感染細胞在其細胞表面上會展現第一型MHC蛋白質之病毒衍生肽，這些病毒衍生肽會被可以移除/消耗這些展現細胞的特異性CD8+T細胞所識別。細胞溶解性(細胞毒性)CD8+-T細胞(CTL)會藉由其特異性T細胞受體識別該等第一型MHC蛋白質之肽，該CTL會驅動經病毒感染細胞之移除而無需輔助刺激的信號。
可使用經以本發明融合多肽中所含之CMV衍生肽預刺激效應細胞(例如，周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)或經FACS篩分的CD8+-T細胞)。
待治療個體之HLA-同種異型必須要經鑑別。
根據NCBI，頻率為10%或更高之HLA-同種異型分布狀況如下表中所示。
因此，本發明一個態樣係抗原結合複合體，其中其包含- 一條單一融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)β2-小球蛋白，及(ii)相對頻率小於10%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3， 或(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定區，及(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變區以組合方式特異性結合至抗原，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該融合蛋白係：- 以共價方式結合至該等經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補 重鏈或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，以N至C端包含β2-小球蛋白及相對頻率小於1%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3的融合多肽進一步在其N端處包含可結合至MHC-肽結合溝槽之肽。於一個實施例中，該肽係T細胞反應誘導肽。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)β2-小球蛋白，及(ii)相對頻率小於10%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，或(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，及(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原， 且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該融合多肽係：- 以共價方式結合至經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一個條雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈 第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該融合多肽係：- 以共價方式結合至經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及 - 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，其中輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該融合多肽係：- 以共價方式結合至該等經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，其中該輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含抗體重鏈鉸鏈區多肽、免疫球蛋白重鏈第二恆定區(CH2)及免疫球蛋白重鏈第三恆定區(CH3)，其中該融合多肽係： - 以共價方式結合至經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及 (iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，其中該輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二恆定區(CH2)及免疫球蛋白重鏈第三恆定區(CH3)，其中該融合多肽係：- 以共價方式結合至該等經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含 - 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，其中該輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重 鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二恆定區(CH2)及免疫球蛋白重鏈第三恆定區(CH3)，- 一條多肽鏈，其以N至C端方向包含與第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中之可變域互補之免疫球蛋白可變域，及與第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中可變域其後之恆定域互補之恆定域，其中該融合多肽係：- 以共價方式結合至該等經雙硫鍵連接多肽鏈其中一者之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3， (iv)抗體重鏈鉸鏈區多肽，(v)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，及- 一條第一多肽鏈，其以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，及- 一條第二多肽鏈，其以N至C端方向包含與第一多肽鏈中之可變域互補之免疫球蛋白可變域，及與第一多肽鏈中之恆定域互補之恆定域，其中該輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且其中該融合多肽及該第一多肽鏈係以雙硫鍵連接。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白， (iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，(iv)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，(v)抗體重鏈鉸鏈區多肽，(vi)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，及- 一條第一多肽鏈，其以N至C端方向包含：(i)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(ii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，及- 一條第二多肽鏈，其以N至C端方向包含與第一多肽鏈中之可變域互補之免疫球蛋白可變域，及與第一多肽鏈中之恆定域互補之恆定域，其中該輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且其中該融合多肽及該第一多肽鏈係以雙硫鍵連接。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含： (i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及(iv)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及- 一條第一多肽鏈，其以N至C端方向包含：(i)與融合多肽中之可變域互補之免疫球蛋白可變域及與融合多肽中之恆定域互補之恆定域，(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，其中該輕或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且其中該融合多肽與該第一多肽鏈係以雙硫鍵連接。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白， (iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，(iv)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，(v)抗體重鏈鉸鏈區多肽，(vi)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，及- 一條第一多肽鏈，其以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，及- 一條第二多肽鏈，其以N至C端方向包含與融合多肽鏈中之可變域互補之免疫球蛋白可變域及與融合多肽鏈中之恆定域互補之恆定域， 及- 一條第三多肽鏈，其以N至C端方向包含與第一多肽鏈中之可變域互補之免疫球蛋白可變域及與第一多肽鏈中之恆定域互補之恆定域，其中該融合多肽及/或該第一多肽鏈之輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且其中該融合多肽與該第一多肽鏈係以雙硫鍵連接。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)T細胞反應誘導肽，(ii)β2-小球蛋白，(iii)相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及(iv)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，及- 一條第一多肽鏈，其以N至C端方向包含：(i)與融合多肽中之可變域互補之免疫球蛋白可變域及與融合多肽中之恆定域互補之恆定域， (ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，及- 一條第二多肽鏈，其以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)及選自免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)及免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)之恆定域；或免疫球蛋白重鏈可變域(VH)及選自免疫球蛋白重鏈第一恆定域(CH1)及免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之恆定域，(ii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，及(iii)免疫球蛋白重鏈第二(CH2)及第三(CH3)恆定域，及- 一條第三多肽鏈，其以N至C端方向包含與第二多肽鏈中之可變域互補之免疫球蛋白可變域及與第二多肽鏈中之恆定域互補之恆定域，其中該融合多肽及/或該第二多肽鏈之輕鏈或重鏈可變域係單獨地特異性結合至抗原或與各自互補重鏈或輕鏈可變域以組合方式特異性結合至抗原，且其中，該第一多肽鏈與該第二多肽鏈係以雙硫鍵連接。
於一個實施例中，T細胞反應誘導肽係病毒衍生肽。於一個實施例中，該病毒係選自腺病毒、第1型人類疱疹病毒、第2型人類疱疹病毒、第4型人類疱疹病毒(艾伯斯坦-巴爾病毒)、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人類巨細胞病毒、人類 免疫缺陷病毒、第16型人類乳突瘤病毒、第18型人類乳突瘤病毒、第31型人類乳突瘤病毒、第33型人類乳突瘤病毒、第35型人類乳突瘤病毒、第39型人類乳突瘤病毒、第45型人類乳突瘤病毒、第51型人類乳突瘤病毒、第52型人類乳突瘤病毒、第56型人類乳突瘤病毒、第58型人類乳突瘤病毒、第59型人類乳突瘤病毒、第68型人類乳突瘤病毒、第73型人類乳突瘤病毒、第82型人類乳突瘤病毒、第1型人類T細胞淋巴球細胞性病毒、A型人類流感病毒、B型人類流感病毒、牛痘病毒、登革熱病毒。
於一個實施例中，該病毒衍生肽係選自NLVPMVATV(SEQ ID NO：01)、SLYNTVATL(SEQ ID NO：02)、GLCTLVAML(SEQ ID NO：03)、GILGFVFTL(SEQ ID NO：04)、STNRQSGRQ(SEQ ID NO：5)、LLFGYPVYV(SEQ ID NO：06)、FAEGFVRAL(SEQ ID NO：07)、LIVIGILIL(SEQ ID NO：08)、或ILHTPGCV(SEQ ID NO：09)。
於一個實施例中，該β2-小球蛋白係人類β2-小球蛋白。於一個實施例中，該β2-小球蛋白係由胺基酸序列SEQ ID NO：10組成。
於一個實施例中，相對頻率為10%或更高之第一型MHC分子係人類HLA-A*0201。於一個實施例中，該第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3係由胺基酸序列SEQ ID NO：11組成。
於一個實施例中，該病毒衍生肽係經由第一連接子肽融合至該β2-小球蛋白。
於一個實施例中，該β2-小球蛋白係經由第二連接子肽融合至該第一型MHC分子之胞外域α1。
於一個實施例中，該第一型MHC分子之胞外域α3係經由第三連接子肽(以雙硫鍵或非雙硫鍵連接方式)融合至該多肽。
於一個實施例中，第一連接子肽、第二連接子肽及第三連接子肽是相同的或不同的。
於一個實施例中，第一連接子肽、第二連接子肽及第三連接子肽彼此獨立地選自胺基酸序列GS(SEQ ID NO：12)、GGS(SEQ ID NO：13)、GGGS(SEQ ID NO：14)、GGGSGGGS(SEQ ID NO：15)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：16)、GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：17)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：18)、GGGGS(SEQ ID NO：19)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：20)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：21)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：22)、及GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：23)。
於一個實施例中，第一連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：21。
於一個實施例中，第二連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：22。
於一個實施例中，第三連接子肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。
於一個實施例中，該抗體重鏈鉸鏈區多肽係選自IgG類或 IgE類人類抗體之抗體重鏈鉸鏈區多肽。
於一個實施例中，該抗體重鏈鉸鏈區多肽係選自子類IgG1、或IgG2、或IgG3或IgG4之人類抗體之抗體重鏈鉸鏈區多肽。
於一個實施例中，該抗體重鏈鉸鏈區多肽包含或組成自胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：24)、EPKSADKTHTCPPCP(SEQ ID NO：25)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：26)、ERKCAVECPPCP(SEQ ID NO：27)、ERKACVECPPCP(SEQ ID NO：28)、ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：29)或ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：30)。
於一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽及/或第二條經雙硫鍵連接多肽係包含人源CH2域及/或CH3域。於一個實施例中，該人源CH2域及CH3域係屬於IgG或IgE類人類抗體。於一個實施例中，該CH2域及CH3域係屬於IgG1、或IgG2、或IgG3或IgG4子類人類抗體。於一個實施例中，該CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：31。於一個實施例中，該CH2域係屬於IgG1或IgG2子類人類抗體及包含E233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331及/或P329(依照Kabat EU索引編號)中至少一個突變。於一個實施例中，該CH2域係屬於具有突變L234A及L235A，及/或突變D265A及N297A之IgG1子類或人類IgG2子類人類抗體，及/或含有PVA236突變，及/或含有突變P329G。於一個實施例中，該CH2域係屬於具有 突變L234A及L235A及/或P329G之IgG1子類人類抗體。於一個實施例中，該CH2域係屬於具有突變S228P及/或L235E之子類IgG4人類抗體。於一個實施例中，該CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33。於一個實施例中，該CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：34。
於一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：35，且第二條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：36。
於一個實施例中，第一及第二條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38。
於一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽或第二條經雙硫鍵連接多肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38組成。
於一個實施例中，第一條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：39，且第二條經雙硫鍵連接多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：40。
於一個實施例中，以一或多個雙硫鍵連接之多肽鏈係藉由2、或3，或4個雙硫鍵連接。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)病毒衍生肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：01，(ii)第一連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10，(iv)第二連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：22， (v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC分子具有胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(vi)第三連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：12，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，(iv)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：32及33之胺基酸序列，及(v)人類IgG1 CH3域，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：35或36，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)抗體重鏈鉸鏈區多肽，(ii)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：32及33之胺基酸序列，及(iii)人類IgG1 CH3域，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：36或35，其中該融合多肽- 係以共價方式結合至第二條經雙硫鍵連接多肽鏈之C端或N端。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含： (i)病毒衍生肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：01，(ii)第一連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10，(iv)第二連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：22，(v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC分子具有胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(vi)第三連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：12，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一條經雙硫鍵連接多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，(iv)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：32及33之胺基酸序列，及(v)人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列，且第二條經雙硫鍵連接多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該融合多肽係：- 以共價方式結合至第一條經雙硫鍵連接多肽鏈之C端或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重或輕鏈可變域，或 - 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重或輕鏈恆定域。
於一個實施例中，該複合體之特徵在於其包含- 一條融合多肽，該融合多肽以N至C端方向包含：(i)病毒衍生肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：01，(ii)第一連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10，(iv)第二連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：22，(v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC分子具有胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(vi)第三連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：12，及- 藉由一或多個雙硫鍵連接之兩條多肽鏈，其中第一及第二條經雙硫鍵連接多肽鏈各自以N至C端包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，(iv)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：32及33之胺基酸序列，及(v)人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：35及36之胺基酸序列，其中該融合多肽係：- 以共價方式結合至第二條經雙硫鍵連接多肽鏈之C端 或N端，或- 以共價方式結合至抗體可變域之N端，該抗體可變域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或- 以共價方式結合至抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係第一條經雙硫鍵連接多肽鏈中所包含之恆定域的互補重或輕鏈恆定域。
自圖14可見，本發明複合體保有與其融合的抗體之結合特性(圖14b)及c))。
於圖15及17中，顯示本發明複合體在試管內的功效及特異性。
細胞毒性分析係於CMV-特異性CD8+T細胞存在下進行。參見圖15a)關於單價抗體及圖15b)關於雙價抗體結果可發現，包含CMV-衍生病毒肽之複合體會誘導標的細胞之溶解/移除/崩解。進一步發現，標的細胞之溶解具有高度特異性，因為與包含EBV-衍生病毒肽(圖15b))及對照抗體(圖15d)及e))之複合體培養並不會導致大規模細胞溶解(自發性溶解約3.5%)。
於圖17中，係顯示IGF-1R陽性肺腺癌細胞株H460M2之溶解。
包含CMV-衍生肽及雙價抗體之複合體的EC50值約10 ng/ml，相當約50 pM。該經測定EC50值與標的細胞對效應細胞的比例是獨立的(參見圖16；標的細胞對效應細胞比例為1：3至1：1，相當為1：0.44至1：0.14之有效比例(76%效應細 胞係CD8陽性，而19%係CMV特異性))。
因此，於一個實施例中，本發明複合體具有約50 pM之EC50值。
1.親和力
於特定實施例中，本發明提供之複合體包含抗體可變域之抗原結合對。於特定實施例中，可變域對其抗原具有10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如，10-8 M或更小，例如，10-8 M至10-13 M，例如，10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。
於一個實施例中，Kd係利用表面電漿共振分析法測量的。
例如，此係利用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000儀器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃下，藉由經固定抗原CM5晶片，在~10個反應單元(RU)下進行。簡言之，以N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二醯胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯胺(NHS)依照供應商說明活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片。以10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml(~0.2 μM)，然後以5 μl/分鐘之流速注射以獲得約10個反應單元(RU)之經偶合蛋白質。注射抗原之後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應基團。為動力學測量，在25℃下，以約25 μl/分鐘之流速，將兩倍連續稀釋的Fab(0.78 nM至500 nM)注射在含0.05%聚山梨糖醇20(TWEEN-20TM)表面活性劑中之PBS(也就是PBST)。利用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE® Evaluation Software 3.2版)，藉由同時試算結合及解離感應圖計算出結合速率(kon)及解離速率 (koff)。平衡解離常數(Kd)係計作koff/kon比。參見例如Chen,Y.等人.,J.Mol.Biol.293(1999)865-881。
2.表現
本發明特定形式的複合體(不同連接子，不同的HLA與β2-小球蛋白之組合)在HEK 293及CHO中的表現(若完全可偵測)會導致複合體積累在內質網內，換言之，該複合體之分離及分泌會嚴重地減少。
當預期複合體包含下表所示多肽其中一者時，無法偵測到複合體分泌至培養基中。
咸已發現，包含連接至第一型MHC蛋白質複合體之病毒衍生肽，及抗體可變域及恆定域中至少一者之兩部分的複合體之表現作用(及特別是分泌作用)不可能在真核細胞中進行。
咸已另外發現，包含兩條融合多肽(包含經連接至第一型MHC蛋白質複合體之病毒衍生肽、至少一個可變域及一對鉸鏈區衍生經雙硫鍵連接多肽)之複合體的表現(及特別是分泌作用)不可能在真核細胞中進行。
因此，為了利用真核細胞產生及分泌本發明複合體，在本發明複合體中，包含連接至第一型MHC蛋白質之病毒衍生肽的融合多肽不能超過1條，且必須存在至少一個抗體可變域及一個抗體恆定域。
因此，包含僅一條(exactly one)連接至第一型MHC蛋白質之病毒衍生肽之融合多肽、抗體重鏈鉸鏈區，及至少一個抗體可變域及一個抗體恆定域之複合體可以在真核細胞中以重組方式產生及分泌出來。於一個實施例中，該至少一個恆定域係抗體重鏈恆定域1(CH1)或抗體輕鏈恆定域(CL)。
因此，包含抗體重鏈鉸鏈區、至少一對抗體可變域、視需要抗體恆定域及僅一條連接至第一型MHC蛋白質之病毒衍生肽之融合肽的複合體可以在真核細胞中以重組方式產 生及分泌出來。於一個實施例中，該至少一個恆定域係抗體重鏈恆定域1(CH1)或抗體輕鏈恆定域(CL)。
測試不同多肽之各種組合。藉由(例如)將免疫球蛋白衍生信號肽融合在複合體的N端可以達到分泌表現，其中該病毒衍生肽融合至第一型MHC分子的N端。該第一型MHC分子重鏈(缺少跨膜及細胞質域之α1-α2-α3)及輕鏈(β2-小球蛋白)之順序可變化。不同融合多肽係融合至包含抗體輕鏈或抗體重鏈鉸鏈區之多肽的N端。示例性組合顯示於圖2中。
由下表可見，當存在單一條病毒衍生肽-小球蛋白-HLA-融合多肽時，帶有抗體可變域及抗體重鏈鉸鏈區衍生多肽之包含融合多肽之複合體才可以表現。
於一些實施例中，本發明複合體包含不同的多肽對。為了讓多肽適當配對，可使用紐結至孔眼技術或交叉-mAb技術以減低不正確締結複合體之數量。
紐結修飾作用是指在抗體CH3域中之突變T366W(依照Kabat之EU索引編號)。
孔眼修飾作用是指在抗體CH3域中之突變T366S、L368A及Y407V(依照Kabat之EU索引編號)。
除了紐結及孔眼修飾作用外，突變S354C可存在其中一個CH3域，且突變Y349C可存在另一CH3域中。
交叉-mAb技術揭示於例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080254、WO 2009/080253、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、及WO 2010/145793中。
3.變異體
於特定實施例中，係涵蓋本發明複合體之胺基酸序列變異體。例如，咸欲增進複合體之結合親和力及/或其他生物性質。藉由將適當修飾作用引入至編碼複合體多肽鏈之核苷酸序列中，或藉由肽合成作用可製備出該複合體之胺基酸序列變異體。此等修飾作用包括(例如)在複合體多肽之胺基酸序列中刪除及/或***及/或替換殘基。假如最終構築體擁有所要的特性(例如，抗原結合)，即可施予刪除、***及替換之任何組合，以便得到最終的構築體。
a)具有替換、***及刪除修飾作用的變異體
於特定實施例中，係提供在多肽鏈中具有一或多個胺基酸替換作用之複合體變異體。保守性替換作用示於下表中之「較佳替換」項目下。更多實質變化係提供於下表之「示例性替換」項目下，及在下文中參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。胺基酸替換作用可引入至受關注複合體中，並針對所要的活性(例如，保留/經改良抗原結合、經降低免疫原性或經改良ADCC或CDC)來篩選產物。
胺基酸根據常見的側鏈特性可分類成：(1)疏水性：正亮胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈方向的殘基：Gly、Pro；(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性替換作用必需是這些類別其中一類的一個胺基 酸與另一類別中一個胺基酸交換。
胺基酸序列***作用包括在胺基-及/或羧基端融合長度範圍為一個殘基至含有上百個或更多個殘基之多肽，及在序列內***單一個或多個胺基酸殘基。末端***作用之實例包含包括具有N端甲硫胺醯殘基之多肽之複合體。其他***性變異體包括將複合體之多肽鏈之N或C端與酶融合。
b)糖基化變異體
於某些實施例中，本發明複合體之多肽係經改變以提高或降低該多肽之糖基化程度。藉由改變胺基酸序列可便利性地完成添加或刪除多肽之糖基化位點，如此可產生或移除一或多個糖基化位點。
當複合體包含抗體Fc區時，其上所連接之碳水化合物可以改變。哺乳動物細胞所產生的原生Fc區典型地包含一種分支之雙觸角寡糖，通常藉由一個N-鍵聯連接至Fc區之CH2域之Asn297。參見例如Wright,A.及Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32。該寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及岩藻糖連接至GlcNAc於該雙觸角寡糖結構之「主幹」中。於一些實施例中，為產生具有某些改良性質的抗體變異體，可以修飾本發明抗體中之寡糖。
於一個實施例中，提供包含多肽變異體之複合體，其具有一個碳水化合物結構缺少岩藻糖連接(直接地或間接地)至Fc區。例如，此Fc區之岩藻糖的含量為1%至80%，1%至65%，5%至65%或20%至40%。藉由計算在Asn297糖鏈中岩 藻糖之平均量，相對於連接至Asn297之所有糖結構(例如複合體、雜合物及高甘露糖結構)之總和，如藉由WO 2008/077546中所述之MALDI-TOF質譜分析法測量，來測定岩藻糖之含量。Asn297係指位於Fc區約297位置(Fc區殘基之EU編號)之天冬醯胺酸殘基；然而，由於抗體中小的序列變化，Asn297亦可位於位置297上游或下游約±3個胺基酸位置，即介於位置294與300之間。此等岩藻糖化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。關於「去岩藻糖基化」或「缺岩藻糖」抗體變異體之公開案實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.，等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。可產生去岩藻糖基化抗體之細胞株的實例包括在蛋白質岩藻糖基化作用有缺陷的Lec13 CHO細胞(Ripka,J.等人.,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，特別是實例11)，及基因敲除細胞株(諸如，敲除α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因(FUT8)的CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；及WO 2003/085107))。
另外係提供包含具有平分型寡糖之Fc區變異體之複合體，例如，其中接合至Fc區之雙觸角寡糖係被GlcNAc分為二。此等變異體具有降低的岩藻糖基化作用及/或經改良ADCC功能。此等抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878；US 6,602,684及US 2005/0123546中。亦提供在接合至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之Fc區變異體。此等Fc區變異體具有經改良CDC功能。對應的抗體變異體描述於例如WO 97/30087；WO 98/58964及WO 99/22764中。
c)Fc區變異體
於特定實施例中，一或多個胺基酸修飾作用可引入至本發明複合體所含多肽之Fc區中，藉此可以產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾作用(例如，替換作用)。
於特定實施例中，本發明涵蓋具有一些但非全部效應子功能之Fc區變異體，該等效應子功能可以讓該變異體成為某些應用之適當候選物，其中，該複合體在活體內的半衰期甚為重要，但某些效應子功能(諸如，補體及ADCC)是不必要的或有害的。可以進行試管內及/或活體內的細胞毒性分析，以確認CDC及/或ADCC活性的減低/消耗。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合分析，以確保該複合體雖沒有FcγR結合(因此可能缺少ADCC活性)，但仍保留FcRn結合能力。介導ADCC之主要細胞(NK細胞)僅會表現FcγRIII，而單核 細胞會表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch,J.V.及Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492之第464頁表3中。用以評估受關注分子之ADCC活性之試管內分析的非限制性實例描述於美國專利案5,500,362(參見例如，Hellstrom,I.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；及Hellstrom,I.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；美國專利案5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者，可採用非放射活性分析方法(參見例如，ACTITM non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96® non-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。對於此等分析法可用之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者，或此外，可在例如諸如Clynes,R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中所揭示之動物模型中評估受關注分子之活體內ADCC活性。亦可進行C1q結合分析，以確認抗體無法結合C1q及因此缺少CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化作用，可進行CDC分析(參見例如，Gazzano-Santoro,H.，等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.，等人，Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.及Glennie,M.J.,Blood 103(2004)2738-2743)。亦可利用技藝中已知方法進行FcRn結合及活 體內清除/半衰期的測定(參見例如，Petkova,S.B.，等人，Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有降低的效應子功能之Fc區包括在Fc區的234、235、238、265、269、270、297、327及329殘基處之其中一處或多處具有替換作用之彼等Fc區。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327處之其中兩處或更多處發生替換作用之Fc突變體，包括所謂在殘基265及297處替換成丙胺酸之「DANA」Fc突變體(US 7,332,581)。
某些對FcR具有經改良或經減弱的結合之Fc區變異體係經揭露(參見例如US 6,737,056；WO 2004/056312及Shields,R.L.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
於特定實施例中，多肽變異體包含帶有可增進ADCC的一或多個胺基酸替換作用之Fc區，例如，在Fc區位置298、333及/或334處之替換作用(EU殘基編號)。
於一些實施例中，在Fc區進行改變會導致經變更的(換言之，增進的或減弱的)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642及Idusogie,E.E.，等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所描述。
US 2005/0014934揭露具有增長半衰期及對負責將母體IgG轉移給胎兒的新生兒Fc受體(FcRn)具有經改良結合之抗體(Guyer,R.L.，等人，J.Immunol.117(1976)587-593，及Kim,J.K.，等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434))。彼等抗體包含帶有可增進Fc區對FcRn結合之一或多個替換作用之Fc區。此等Fc區變異體包括在以下Fc區殘基之其中一 處或多處發生替換作用之彼等變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，在Fc區殘基434處的替換作用(US 7,371,826)。
亦參見Duncan,A.R.及Winter,G.，Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351中關於Fc區變異體之其他實例。
d)衍生物
於特定實施例中，本發明複合體可進一步經修飾以便含有技藝已知且可輕易獲得之額外非蛋白質部分。適合用於複合體進行衍生化作用之部分包括但不限於水可溶聚合物。水可溶聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)及葡聚糖或聚(正乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其等混合物。
因聚乙二醇丙醛在水中的穩定性，因此在製造上具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可為具分支化或非分支化。接合至抗體之聚合物數量可以變化，且如果接合一種以上的聚合物，則該等聚合物可以是相同或不同的分子。一般而言，進行衍生化作用所用的聚合物數量及/或類型可根據以下考量決定：包括但不限於欲改良之抗體的特 定性質或功能、抗體衍生物是否在界定條件下用於治療等等。
於另一實施例中，係提供複合體與可藉由曝露於輻射來選擇加熱之非蛋白質部分之共軛物。於一個實施例中，該非蛋白質部分係碳奈米管(Kam,N.W.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。輻射可屬於任何波長者，且包括但不限於不會損害正常細胞，但可將非蛋白質部分加熱至最接近殺死抗體-非蛋白質部分的細胞之溫度之波長。
B.重組方法及組合物
複合體可利用例如，如US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物製造。於一個實施例中，係提供可編碼本發明複合體多肽之經分離核酸。於另一實施例中，係提供包含此核酸之一或多種載體(例如，表現載體)。於另一實施例中，係提供包含此核酸之宿主細胞。於此一實施例中，宿主細胞包含(例如，業經以下列物質轉型)：(1)包含可編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包含可編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體及包含可編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。於一個實施例中，該宿主細胞係真核細胞，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0細胞)。於一個實施例中，係提供製造本發明複合體之方法，其中該方法包含在適宜表現多肽及形成複合體之條件下培養包含可編碼上述複合體多肽之核酸的宿主 細胞，及視需要自宿主細胞(或宿主培養基)回收該複合體。
為重組製造複合物，分離出可編碼(例如)上述複合體之多肽之核酸，並***至一或多種載體中，以便在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此核酸可利用習知步驟輕易進行分離及定序(例如，利用可特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。
用於選殖或表現載體之適宜宿主細胞包括本文中所描述之原核或真核細胞。例如，尤其當不需要糖基化及Fc效應子功能時，複合體可在細菌中製造。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton,K.A.，於：Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2003),pp.245-254，描述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。表現後，從可溶性部分中之細菌細胞漿液中分離出該複合物，並可進一步純化。
除原核細胞外，諸如絲狀真菌或酵母菌之真核微生物亦係多肽編碼載體之適宜選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已「經人化」之真菌及酵母菌菌株，其等可產生出具有部分或完全人類糖基化型式之抗體。參見Gerngross,T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；及Li.H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用以表現糖基化複合體之適宜宿主細胞亦可衍生自多細胞生物(無脊椎生物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。許多桿狀病毒株業已鑑別出可與昆蟲 細胞併用，特別是針對轉染作用的秋夜盜蛾細胞(Spodoptera frugiperda)細胞。
植物細胞培養物亦可作為宿主之用。參見例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429(描述用於在轉基因植物中製造抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可作為宿主之用。例如，適應以懸浮方式生長之哺乳動物細胞株可以使用。可使用之哺乳動物細胞株之其他實例係經以SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚胎腎細胞株(描述於例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中之HEK 293或293細胞)；幼齡倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏(sertoli)細胞(如例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所描述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲青猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬類腎細胞(MDCK)；大鼠肝細胞(BRL 3A))；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如例如Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他可使用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，如Y0、NS0及Sp2/0。關於適合抗體製造之特定哺乳動物宿主細胞株之回顧，參見例如Yazaki,P.及Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology, Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。
C.醫藥調配物
本發明複合體之醫藥調配物係將具有所需純度之該複合體與一或多種視需要醫藥可接受載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980))混合製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥可接受載劑一般在所使用之劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括但不限於：緩衝劑(諸如，磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸)；抗氧化劑(包括抗壞血酸及甲硫胺酸)；防腐劑(諸如，十八烷基苄基二甲基氯化銨、氯化六甲雙胺、氯化苯二甲羥銨、氯化芐乙氧銨、酚、丁基或苄基醇、對羥基苯甲酸烷酯(諸如，對羥基苯甲酸甲酯或丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質(諸如，血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；親水聚合物(諸如，聚(乙烯吡咯啶酮)；胺基酸(諸如，甘胺酸、榖胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸)；單糖、雙糖及其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合劑(諸如，EDTA)；糖(諸如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；鹽形成抗衡離子(諸如，鈉)；金屬複合物(例如，Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子性表面活性劑(諸如，聚乙二醇(PEG))。本發明之示例性醫藥可接受載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如，可溶性中性-活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，如 rhuPH20(HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。包括rhuPH20的特定示例性sHASEGP及使用方法係描述於US 2005/0260186及US 2006/0104968中。於一個態樣中，sHASEGP係與一或多種額外葡糖胺多糖酶(如硫酸軟骨素酶)組合。
示例性凍乾抗體調配物描述於US 6,267,958中。水性抗體調配物包括描述於US 6,171,586及WO 2006/044908中之彼等物，後者的調配物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文中之調配物亦可含有一種以上用於待治療之特定適應症必需的活性成分，較佳活性成分是具有彼此不會造成負面影響之互補活性。此等活性成分適宜以針對預期目的之有效量組合存在。
活性成分可藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合包埋於所製備之微膠囊中，例如，各別在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米粒子及奈米膠囊)或粗乳化液中之羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980)。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑之適宜實例包括含有抗體之固體親水性聚合物之半透性基質，該等基質係呈成某種形狀的物件，例如，薄膜或微膠囊形式。
針對用於活體內投與之調配物通常是無菌的。例如，藉由通過無菌濾膜之過濾作用即可輕易地達到無菌性。
D.治療方法及組合物
本文中所提供複合體中之任一者可用於治療方法中。
於一個態樣中，係提供本發明複合體作為藥劑之用。
於其他態樣中，係提供本發明複合體作為治療癌症或病毒感染之用。
於特定實施例中，係提供本發明複合體作為治療方法之用。
於特定實施例中，本發明提供本發明複合體係用於治療罹患癌症或病毒感染個體之方法中，該方法包含將有效量之本發明複合體投與該個體。於此實施例中，該方法進一步包含將有效量(例如)下文所述之額外治療劑其中一者投與該個體。
於其他實施例中，本發明提供本發明複合體係用於移除癌細胞或用於移除病毒感染細胞。於特定實施例中，本發明提供本發明複合體係用於移除個體中之癌細胞或移除病毒感染細胞之方法中，該方法包含將有效量之本發明複合體投與個體以移除癌細胞或移除病毒感染細胞。根據以上實施例中任一者之「個體」可係人類。
於另一態樣中，本發明提供本發明複合體在用於製造或製備藥物上之用途。於一個實施例中，該藥物係用於治療癌症或病毒感染。於另一實施例中，該藥物係用於治療癌症或病毒感染之方法中，該方法包含將有效量之該藥物投與罹患癌症或慢性病毒感染之個體。於此實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外治療劑投與該個體。於另一實施例中，該藥物係用於移除癌細胞或用於移 除病毒感染細胞。於另一實施例中，該藥物係用於移除個體中之癌細胞或移除病毒感染細胞之方法中，該方法包含將有效量之該藥劑投與個體以移除癌細胞或移除病毒感染細胞。根據以上實施例中任一者之「個體」可係人類。
於另一態樣中，本發明提供一種治療癌症或病毒感染之方法。於一個實施例中，該方法包含將有效量之本發明複合體投與罹患此癌症或病毒感染之個體。於此實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外治療劑投與個體。根據以上實施例中任一者之「個體」可係人類。
於另一態樣中，本發明提供一種移除個體中之癌細胞或病毒感染細胞之方法。於一個實施例中，該方法包含將有效量之本發明複合體投與個體以移除癌細胞或病毒感染細胞。於一個實施例中，「個體」係人類。
於另一態樣中，本發明提供包含本發明複合體中之任一者的醫藥組合物，例如，用於以上治療方法之任一者中之複合體。於一個實施例中，醫藥調配物包含本發明複合體中之任一者及醫藥可接受載劑。於另一實施例中，醫藥調配物包含本發明複合體中之任一者及至少一種額外治療劑。
本發明複合體可單獨或與其他試劑組合地用於療法中。例如，本發明複合體可與至少一種額外治療劑共同投與。
上述此組合療法涵蓋組合投與(其中兩或更多種治療劑包含於相同或不同調配物中)及分開投與，於此情況中，可在投與本發明複合體之後、同時及/或之前投與額外治療劑 及/或佐劑。本發明複合體亦可與放射療法組合使用。
本發明複合體(及任何額外治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、經肺內及經鼻內，及若需要局部治療，則以病灶內方式投與。非經腸輸注包括經肌肉內、經靜脈內、經動脈內、經腹膜內或經皮下投與。按劑量給藥可採用任何適宜途徑，例如，藉由注射(諸如，經靜脈內或皮下注射)，部分端視投藥是簡單或緩慢而定。本發明涵蓋各種投藥方案，包括但不限於，在各時間點單或多次投與、大量投與、及脈衝輸注。
本發明複合體係以符合良好醫療實務之方式調配、調劑及投與。在本文中需考量之因素包括待治療之特定病症、待治療之特定哺乳動物、個體病患之臨床狀況、病症起因、投藥位置、投與方法、投藥時程及為醫師所熟知之其他因素。該複合體不必但可視需要與當時用於預防或治療所考慮的病症之一或多種藥劑調配在一起。此等其他藥劑之有效量決定於調配物中所存在之複合體之量、病症或治療之類型及上述其他因素。此等其他藥劑通常以本文中所描述之相同劑量及投與途徑，或本文中所描述劑量之約1至99%，或以經驗/臨床上確定為適宜之任何劑量及任何途徑使用。
就疾病之預防或治療而言，本發明複合體之適宜劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)端視待治療疾病之類型、複合體之類型、疾病之嚴重性及療程、複合體係針對預防或治療目的投與、先前療法、病患臨床病 史及對複合體之反應，及主治醫師的判斷而定。該複合體適宜一次全量或採取系列療法投與病患。根據疾病之類型及嚴重性，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如，0.5 mg/kg至10 mg/kg)複合體可作為初始候選劑量投與病患，並(例如)以一或多次投與，或進行連續性輸注。一個典型日劑量可介於約1 μg/kg至100 mg/kg或更高之間，端視上述因素而定。就以數天或更長時間內重複性投藥而言，根據病症，治療通常係持續進行直至所要的疾病症狀抑制發生。該抗體之一個示例性劑量範圍係從約0.05 mg/kg至約10 mg/kg，因此，可將約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg(或其等任何組合)之一或多種劑量投與病患。此等劑量可以週期性方式投與，例如，每週或每三週一次(例如，如此病患會接受約2至約20次，或例如，約6次抗體劑量)。開始時可投與較高的負荷劑量，接著投與一或多次較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可藉由習知技術及分析法輕易地監控。
咸理解，以上調配物或治療方法中之任一者可利用本發明免疫共軛物完成，該共軛物係代替本發明複合體或另還有本發明複合體。
本發明一個態樣係本發明複合體，其用於治療病患中之癌症或病毒感染之方法中，其中該複合體係在病患利用該複合體中所包含之病毒衍生肽進行免疫之前、同時或之後投與。
本發明一個態樣係本發明複合體之用途，其用於製造併 與對抗免疫複合體中所包含之病毒衍生肽之免疫接種組合使用以治療癌症或病毒感染的藥物。
於第一步驟中，該複合體中所包含之病毒衍生肽首先投與待治療之個體，在特定時間範圍之後，即4天與28天之間，將本發明複合體投與該個體。
藉由第一步驟中單獨地及第二步驟中以本發明複合體之方式接續及分開施用病毒衍生多肽，可增加病毒衍生肽特異性T細胞之數量，及藉此增加治療功效。
III.製造物件
於本發明另一態樣中，係提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製造物件。該製造物件包含容器及粘貼於或組合至該容器之標籤或包裝插頁。適宜的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由各種不同的材料(諸如，玻璃或塑膠)構成。該容器裝載組合物本身或併與可有效治療、預防及/或診斷病況之另一組合物，且可具有無菌取藥處(例如，該容器可為具有可以皮下注射針刺穿之瓶塞的靜脈溶液袋或小瓶)。組合物中至少一種活性藥劑係本發明複合體。標籤或包裝插頁可顯示該組合物係用於治療選擇病況。此外，製造物件可包含(a)其中裝有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明複合體；及(b)其中裝有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。於此本發明實施例中之製造物件可進一步包含包裝插頁，該插頁顯示出該等組合物係用於治療特定病況。或者，或額外地，該製造物 件可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥可接受緩衝劑，諸如，注射用抑菌水(bacteriostatic water for injectin；BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏(Ringer's)溶液及葡萄糖溶液。製造物件可進一步包含從商業及使用者立場所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、填充劑、針頭及注射器。
咸理解，以上製造物件中之任一者可包含本發明免疫共軛物，該共軛物係代替本發明複合體或另還有本發明複合體。
IV.實例
下文係本發明方法及組合物之實例。咸應理解，基於上文所提供之基本描述，可實施各種其他實施例。
實例1 用於分離及刺激人類供體之CMV-特異性CD8陽性T細胞之步驟 PBL之分離
以Ficoll階梯式離心作用從人類供體血液(Greiner bio-one,Cat.No.227290)分離出PBL。將PBL培養在經補充5%人類血清(Sigma Cat.No.H2520)、2 mM L-榖胺醯胺(PAN Biotech,Cat.No.P04-80100)、100 μg/ml青黴素/鏈黴素(羅氏，Cat.No.14001100)之RPMI培養基中。
PBL之刺激
於細胞培養條件(37℃，5% CO2，80%濕度)下，將細胞(2×107細胞/ml)在經補充50 μg/ml CMV pp65衍生肽(SEQ ID NO：01)之細胞培養基中培養2小時。然後，以培養基將細胞上清液稀釋20倍，及進一步以2×105細胞/96孔之接種密度培養在平底96-孔板中。4至5天後，添加20 U/ml IL-2(羅氏，Cat.No.11011456001)、25 ng/ml IL-7(Peprotech,Cat.No.200-01)及25 ng/ml IL-15(Peprotech,Cat.No.200-15)，及再培養細胞7至8天。顯微鏡下可見到T細胞的刺激會呈細胞群集狀。
PBL之再刺激
將T細胞與刺激細胞共同培養，該等刺激細胞係來自同一供體之經肽脈衝的自體原發PBL(新製備的或自冷凍存液衍生獲得)。該刺激細胞係以如上所述之肽進行脈衝。肽培養2小時後，PBL經以照射處理(4000雷得；STS GmbH OB29 Nr.9510-5)並在不含肽之培養基中清洗2次。在圓底96孔板中進行再刺激作用。每96孔係使用8×104至1×105刺激細胞。來自初級培養物的細胞以培養基清洗2次，再懸浮於200 μl培養基中，並將80 μl轉移至含有刺激細胞之各孔中。3天後，添加20 U/ml IL-2、25 ng/ml IL-7及25 ng/ml IL-15。細胞確實有激增，並將細胞每隔2至3天以新培養基於新的板孔中擴增。
T細胞之分析
細胞針對CD8表現(BD,Cat.No.345772)及CMV-特異性T細胞受體(ProImmune,Cat.No.F008-4A-E)進行染色，並在FACS中進行分析。
細胞培養基
RPMI1640(PAN Biotech,Cat.No.P04-17500)、5%人類血清(HS；Sigma Cat.No.H2520)、2 mM L-榖胺醯胺(PAN Biotech,Cat.No.P04-80100)、100 μg/ml青黴素/鏈黴素(羅氏，Cat.No.14001100)。
結果
對4種人類供體衍生周邊血液淋巴細胞(PBL)進行FACS分析。以經APC-共軛Pro5五聚物(ProImmune,Cat.No.F008-4A-E)組合之FITC-共軛抗CD8抗體(BD,Cat.No.345772)將細胞進行標記，以便將帶有可辨識負載有CMV-衍生肽(NLVPMVATV(SEQ ID NO：01))之T細胞受體(TCR)的T細胞染色。結果參見圖4。在第0天時，供體1及4帶有低量的CMV-特異性CD8細胞(分別為0.08%及0.1%)。供體2及3之周邊血液中帶有較高量的CMV特異性CD8 T細胞(分別為0.25%及3.12%)。以經CMV衍生肽脈衝的自體細胞刺激14天以後，僅供體2及3會呈現顯著CMV特異性CD8 T細胞增加(分別為6.2%及71.2%)，而供體1及4沒有呈現CMV-特異性CD8 T細胞數量之增加(分別為0.01%及0.05%)。以經CMV衍生肽脈衝的自體細胞進行第二次刺激後再過14天後，供體2及3會進一步呈現CMV特異性CD8 T細胞的增加(分別為15.1%及96.6%)。
實例2 細胞毒性分析
急性淋巴母細胞白血病細胞MN60帶有A*0201 HLA-A對偶基因。於細胞培養條件(37℃，5% CO2，80%濕度)下，將 MN60細胞(1×106細胞/ml)與50 μg/ml CMV pp65肽(SEQ ID NO：01)培養45分鐘。此培養會導致HLA-A*0201肽結合溝槽處發生肽交換。將經肽交換的MN60細胞離心，並以PBS(PanBiotech,Cat.No.P04-36500)稀釋至1×106細胞/ml之密度，並以1 μM細胞示蹤物羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE,Invitrogen,Cat.No.34554)在室溫(RT)下染色15分鐘。然後以PBS清洗細胞1次及以AIM-V培養基(Gibco,Cat.No.0870112DK)稀釋至1×105細胞/ml。針對該分析，在細胞培養條件下，將MN60細胞(標的細胞)於96孔圓底板中與CMV特異性人類供體3衍生CD8+ T細胞(效應細胞，參見實例1)共同培養4小時。效應細胞與標的細胞比例為4：1。以1 μl/100 μl碘化丙啶(PI,Sigma,Cat.No.P-4864)將死亡細胞染色並進行FACS分析。
結果
進行流式細胞檢測分析，以便透由負載有CMV肽之MN60腫瘤細胞之溶解，來分析經刺激CTL之細胞溶解能力：於圖5a中，係顯示未負載CMV衍生肽之MN60細胞之共同培養之FACS分析。MN60細胞呈FITC陽性，效應細胞呈FITC陰性，死亡細胞呈PI陽性，存活細胞呈PI陰性。可以發現，當MN60細胞未負載CMV衍生肽時，85%以上的細胞會存活(Q2及Q4)。
於圖5b中，係顯示經負載CMV衍生肽之MN60細胞之FACS分析。可以發現，80%以上的MN60細胞是死亡的(Q2及Q4)，然而圖5與圖5b中所示FACS分析之間之存活效應細 胞與死亡效應細胞之比例並無顯著差異(對比圖5a及圖5b中之Q1及Q3)，此說明經CMV肽負載的標的細胞會發生特異性溶解。
進行流式細胞檢測分析，以便透由負載有CMV肽之MN60腫瘤細胞在不同效應對標的細胞比例下之溶解，來分析經刺激CTL之細胞溶解能力： 如上所述般進行細胞毒性分析。採用效應細胞對標的細胞不同比例，比例範圍為0.5效應細胞/標的細胞至4效應細胞/標的細胞(參見圖6)。培養時間為4小時。隨著增加效應細胞對標的細胞比例，未負載CMV衍生肽之MN60細胞並未呈現死亡細胞數量的增加，換言之，效應細胞對標的細胞比例0.5：1增至4：1，未負載CMV衍生肽之MN60細胞死亡數量為8%至13%。
儘管效應細胞對標的細胞比例是低的0.5：1，幾乎20%經負載有CMV衍生肽之MN60細胞在4小時內會被殺死。死亡細胞之數量隨著效應細胞對標的細胞比例的增加會快速地增加，在效應細胞對標的細胞比例為4：1下，死亡細胞數量高達83%。
實例3 DNA製備、轉染、表現、純化及分析 DNA製備
收集250 ml隔夜培養的細菌LB培養物，並依照生產商的程序(High speed Maxi kit,Qiagen,Cat,No.12663)萃取出質粒DNA。於1 ml TE緩衝液中溶離所得之質粒DNA，並以分 光光度測量儀(Epoch,BioTek)測定DNA濃度。
最終的表現載體包含以下元件：- 內切核苷酸限制酶切位點HindIII、NheI，- CMV啟動子- 5'UTR 1(衍生自人類CMV)，- 內含子A，- 5'UTR 2，- 安比西林抗藥基因，- BGH聚A位點(牛生長激素聚腺苷酸化信號)，- pUC Ori。
該複合體元件之胺基酸序列
CMV pp65肽：SEQ ID NO：01 NLVPMVATV
連接子1：SEQ ID NO：21 GGGGSGGGGSGGGGS
β2-小球蛋白：SEQ ID NO：10 IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
連接子2：SEQ ID NO：22 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
HLA-A*0201 α1至α3：SEQ ID NO：11 GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVG YVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW
連接子3：SEQ ID NO：12 GS
連接子4：SEQ ID NO：22 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
Ig輕鏈：SEQ ID NO：41 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSKWPPWTFGQGTKVESKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ig重鏈(IgG1-L234A、L235A突變體)：SEQ ID NO：42 QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTIVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重鏈(含結變異之IgG1-L234A、L235A突變體)：SEQ ID NO：43 QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAREL GRRYFDLWGRGTIVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重鏈(含孔變異之IgG1-L234A、L235A突變體)：SEQ ID NO：44 QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCIVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重鏈Fc-區(IgG1-L234A、L235A突變體Fc-區結變異體)：SEQ ID NO：45 EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scFv：SEQ ID NO：46 QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAIIWFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSKWPPWTFGCGTKVESK
轉染
轉染前一天，將HEK 293細胞稀釋至8×105細胞/ml。依照生產商程序，約1至1.6×106細胞/ml進行轉染。就30 ml之最終轉染體積而言，以Opti-MEM® I低量血清培養基(Gibco,Cat.No.31985070)將30 μg DNA稀釋至1 ml最終體積。以Opti-MEM®培養基將2 μl 293fectinTM試劑(Invitrogen,Cat.No.12347019)/1 μg DNA同樣地稀釋至1 ml最終體積及培養5分鐘。培養之後，將經稀釋之DNA添加至經稀釋之293fectinTM試劑，小心混合，再培養20至30分鐘及然後逐滴移液至28 ml HEK 293細胞至獲得30 ml最終體積。將細胞在細胞培養條件(37℃，8% CO2，80%濕度)下，在125 rpm旋轉軌道振盪器上培養細胞及在72小時後收集。使收集物在1000 rpm下離心10分鐘，在3000 rpm下離心10分鐘，及過濾通過22 μm無菌過濾器(Millipore,Cat.No.SCGPU05RE)。
西方墨漬法
用Pall Nanosep Omega-Membran 30KD離心裝置(Pall, Cat.No.0D030C33)將500 μl細胞培養物上清液濃縮成50 μl體積。用4×XT樣品稀釋劑(Bio Rad,Cat.No.161-0791)及20×XT還原劑(BioRad,Cat.No.161-0792)將17.5 μl各濃縮物稀釋至25 μl最終體積，在96℃下加熱8分鐘及施加在4至12% Criterion XT預澆鑄凝膠(Cat.No.345-0124)上。用Trans-Blot SD半乾式轉漬槽(BioRad)在20 V下於Trans-blot純硝基纖維素膜(0.45 μm)(BioRad,Cat.No.162-0117)上進行30分鐘轉漬。用1×西方阻封試劑(羅氏，Cat.No.11921681001)在室溫下阻封該膜達1小時。藉由過氧化酶共軛多株兔抗人類κ輕鏈(DAKO，Cat.No.P0129，稀釋1：3000)及多株兔抗人類IgG抗體HRP共軛物(DAKO,Cat.No.P0214，稀釋1：5000)在室溫下染色1小時。藉由LUMI-Imager F1(羅氏)實施冷光偵測。
純化
藉由離心作用將細胞從培養基移除。藉由蛋白A親和力層析(MabSe1ect-Sepharose，在ÄKTA-Avant上)從上清液中純化複合體。將溶離出的複合體以Amicon離心管濃縮成3 mg/ml之蛋白質濃度。用尺寸排阻層析(HPLC TSKgel GFC300 Sys89)分析分液。在Superdex 200上進行製備性SEC，以移除聚結物及藉由20 mM組胺酸、140 mM NaCl，pH 6.0中緩衝該融合蛋白質。將溶離複合體以Amicon離心管濃縮至1 mg/ml之蛋白質濃度並以無菌方式過濾(0.2 μm孔徑)。
分析
利用UV分光光度計，藉由OD280分析複合體樣品，以測定溶液中之蛋白質濃度。此所需之消光係數係依照Pace自胺基酸序列計算(Pace等人，Protein Science 4(1995)2411-2433)。在包含0.25 M KCl，pH 7.0作為移動相之TSK-Gel300SWXL或裝有0.2 M磷酸鉀緩衝液之Superdex 200管柱上進行尺寸排除層析(SE-HPLC)，以測定樣品中單體、聚結物及降解物質之含量。進行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳(還原條件及非還原條件)，以分析複合體純度中關於產物相關降解產物及不相關雜質。用經還原(TCEP)及去糖基化(N-糖苷酶F)樣品進行電噴霧離子化質譜法(ESI-MS)，以確認各鏈之正確質量/特性及偵測化學修飾。實施去糖基化樣品之ESI-MS以分析完全經組裝蛋白質之屬性及品質，並偵測可能的潛在產物相關副產品。
SDS-PAGE及考馬斯染色
裝置：Invitrogen XCell Sure Lock迷你槽
凝膠：4至20% Tris-甘胺酸凝膠，Invitrogen EC6025BOX
緩衝液：Tris-甘胺酸SDS電泳緩衝液(10×)，Invitrogen LC2675-5
樣品緩衝液：Tris-甘胺酸SDS樣品緩衝液(2×)，Invitrogen LC2676
還原性緩衝液：NuPAGE樣品還原劑(10×)，Invitrogen NP0004
分子量標籤：Mark 12，MW標準物，Invitrogen LC5677
蛋白質樣品製備
將樣品用緩衝液調整至1 mg/ml之蛋白質濃度。為將樣品還原，進行下列步驟：
- 還原緩衝液：4 ml樣品緩衝液(2×)及1 ml還原性緩衝液(10×)
- 用還原緩衝液將樣品進行1：1稀釋
- 在70℃下培養5分鐘
在125 V下進行凝膠電泳90分鐘。用簡單藍色安全染色劑(Invitrogen,Cat.No.LC6065)將凝膠染色。
結果
圖7及圖8是顯示根據前面表中所選的複合體編號1及2a之經考馬斯染色的SDS凝膠及對應SEC層析圖。咸可發現，可獲得所定義之複合體。
實例4 MHC-抗體-融合體結合至人類IGF-1R陽性細胞株
在AIM-V培養基(Gibco,Cat.No.0870112DK)中將H460M2細胞稀釋至8×105細胞/ml。以10 μg之本發明複合體在4℃或37℃下將500 μl細胞懸浮液混染1小時。然後，用冰冷AIM-V培養基清洗細胞1次及用第二抗體(共軛至R-PE之山羊F(ab')2抗人類IgG(H+L)抗體(Dianova,Cat.No.109-116-088，稀釋1：50))在4℃下混染30分鐘。然後，用冰冷AIM-V培養基清洗細胞1次及經由FACS Canto II(BD Bioscience)圈選活細胞測量螢光度。雙特異性抗體作為同型物對照組，抗IGF-1R抗體(參見例如WO 2004/087756及WO 2007/115814)作為陽性對照組。
結果
結果示於圖9中。考量PE-螢光測量值(X-軸)的偏移，相較於對照組抗體(圖9-6)，本發明複合體對H460M2標的細胞之結合並沒有顯而易見的差異(圖9-2)。本發明複合體不論在4℃或37℃下進行培養亦沒有差異(參見圖9-2與圖9-3)。細胞僅與同型物對照組(圖9-4)或與螢光標記第二抗體(圖9-5)進行培養均未呈現出任何PE螢光測量偏移，儘管本發明複合體融合了第一型MHC分子，但本發明複合體之抗體可變域仍結合至H460M2標的細胞。
雖然本發明上文已透過說明及實例方式在某程度上進行詳細描述以便達到清楚領會之目的，然而該等說明及實例不應視為對本發明範圍之限制。本文中所引述之所有專利案及科學文獻之公開內容係以引用其等全文之方式併入本文。
實例5 試管內抗原表現細胞之移除
將I24標的細胞(1×105細胞/ml)接種在裝於WillCo玻璃底皿(FA.WillCo Wells BV，REF GWST-3522)中之培養基(補充有2 mM L-榖胺醯胺、1 mM丙酮酸鈉、0.1 mM NEAA及10%(體積/重量)FCS之RPMI 1640)中達24至48小時。每一Will玻璃底皿以50 μg/ml聚-L-離胺酸鹽酸鹽(Sigma Aldrich,Cat# P2658)進行預塗佈30分鐘。塗佈之後，以無菌組織培養等級的水充分沖洗該等玻璃皿並乾燥2小時。
培養後，移除細胞培養基並添加溶於3 mM K+ Krebs Ringer HEPES緩衝液pH 7.3(補充有0.5 mM DL-二硫蘇糖醇、1 mM抗壞血酸及4 mM谷胱甘肽)最終濃度為5 μg/ml之本發明抗原結合複合體，該複合體包含一條[CMV-pp65-肽]-[連接子1]-[β2-小球蛋白]-[連接子2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[連接子3]-[含變異之孔眼IgG1-L234A,L235A突變體]融合多肽、一條IgG1-L234A,L235A突變體Fc區紐結變異體雙硫鍵連接多肽及一條Ig輕鏈，其中該複合體可特異性結合至人類IGF-1R(參見，例如實例3)。
在1：10之標的細胞對效應細胞比例下添加T細胞。以Zeiss Axiovert 135顯微鏡進行4小時照相。
結果
圖10係顯示抗原結合複合體培養在顯微鏡下的成像圖，該複合體包含一條[CMV-pp65-肽]-[連接子1]-[β2-小球蛋白]-[連接子2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[含孔眼變異之連接子3]-[IgG1-L234A,L235A突變體]融合多肽、一條IgG1-L234A,L235A突變體Fc區紐結變異體雙硫鍵連接多肽及一條Ig輕鏈，其中該複合體可特異性結合至人類IGF-1R。可以發現，該複合體會介導表現人類IGF-1R之I24 3T3細胞(白色三角箭頭所指之大的附著性生長細胞)的溶解作用。溶解作用係藉由人類CMV-特異性T細胞(或為白色箭頭所指之圓形小細胞，或為黑色箭頭所指之變形蟲樣移動細胞)介導。將I24細胞與濃度為5 μg/ml之複合體及人類CMV-特異性T細胞(以HLA-A0201+/CMV肽脈衝之APC進行預活化)培養。各圖下方顯示出時間間隔。注意I24細胞與T細胞在56分鐘及76分鐘時之相互作用及隨後在125分鐘後I24細胞之崩解。
圖11係顯示對照組在顯微鏡下的成像圖，I24 3T3細胞(三角白色箭頭所指之大的附著性生長細胞)透由人類CMV-特異性T細胞(或為白色箭頭所指之圓形小細胞，或為黑色箭頭所指之變形蟲樣移動細胞)在沒有本發明抗原結合複合體存在下不會發生溶解作用。I24細胞與特異性毒殺型T細胞(以HLA-A0201+/CMV肽脈衝的APC進行預活化)培養。各圖下方顯示出時間間隔。
實例6 細胞毒性檢定
用移液管將細胞培養基(50 μl)移液至Xcelligence 96孔E板(羅氏，Cat# 05232368001)之各孔中，以進行背景測量。
以細胞培養基(RPMI 1640，內含2 mM L-榖胺醯胺、1 mM丙酮酸鈉、0.1 mM NEAA、10%(體積/重量)FCS)將I24細胞稀釋至1×106細胞/ml，並以移液管取50 μl(2×104細胞/孔)移液至Xcelligence 96孔板之各孔中，以使各孔最終體積為100 μl及培養24小時(37℃，8% CO2，80%濕度)。24小時後，移除培養基及以200 μl AIM-V(無血清培養基(Invitrogen)T細胞培養基(Cat-No)：12055-83)培養基清洗細胞。將以在AIM-V培養基最終濃度為1 μg/ml之本發明抗原結合複合體(包含一條[CMV-pp65-肽]-[連接子1]-[β2-小球蛋白]-[連接子2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[連接子3]-[含孔眼變異之IgG1-L234A,L235A突變體]融合多肽、一條IgG1-L234A,L235A突變體Fc區紐結變異體經雙硫鍵連接多肽及一條Ig輕鏈，其中該複合體可特異性結合至人類IGF-1R)添加至該經清洗標的細胞。將相當比例的效應細胞添加在AIM-V培養基中使最終體積達150 μl。對抗人類IGF-1R之非典型岩藻糖基化IgG1單株抗體(非典型岩藻糖基化抗-IGF-1R抗體)及非結合人類抗毛地黃毒苷抗體(抗毛地黃毒苷抗體)分別作為同型物對照組及特異性抗體對照組。用Xcelligence系統(羅氏)分別進行6至9小時測量。
結果
本發明複合體可透由人類CMV-特異性T細胞驅動H460M2腫瘤的細胞溶解作用。
將腫瘤細胞與1 μg/ml複合體(其包含一條[CMV-pp65-肽]-[連接子1]-[β2-小球蛋白]-[連接子2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[連接子3]-[含孔眼變異之IgG1-L234A,L235A突變體]融合多肽、一條IgG1-L234A,L235A突變體Fc區紐結變異體雙硫鍵連接多肽及一條Ig輕鏈，其中該複合體可特異性結合至人類IGF-1R)及與各別比例之特異性T細胞(1：1.5至1：0.5)培養4小時(參見圖12)。溶解百分比顯示在各別柱狀的上方。對抗人類IGF-1R之非典型岩藻糖基化IgG1單株抗體(MAB IGF-1R-afu)不會驅動明顯的腫瘤細胞溶解作用。
本發明複合體會透由人類CMV-特異性T細胞驅動I24 3T3標的細胞溶解作用。
將標的細胞與1 μg/ml抗原結合複合體(其包含一條[CMV-pp65-肽]-[連接子1]-[β2-小球蛋白]-[連接子2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[連接子3]-[含孔眼變異之IgG1-L234A,L235A突變體]融合多肽、一條IgG1-L234A,L235A突變體Fc區紐結變異體雙硫鍵連接多肽及一條Ig輕鏈，其中該複合體可特異性結合至人類IGF-1R)及與各別比例之特異性T細胞(1：1.5至1：0.5)培養(參見圖13)。溶解百分比顯示在各別柱狀的上方。對抗人類IGF-1R之非典型岩藻糖基化IgG1單株抗體(去岩藻糖基化抗-IGF-1R抗體)及非結合人類抗-毛地黃毒苷抗體)不會驅動明顯的標的細胞溶解作用。
實例7 試管內的功效
在效應細胞對標的細胞的低比例下(1.5至0.5特異性T細胞/腫瘤細胞)，將IGF-1R陽性肺腺癌細胞株H460M2與1 μg/ml包含hCMV衍生肽及抗IGF-1R抗體的複合體及人類CMV特異性CD8陽性T細胞培養。對照組抗體係經糖化處理之抗-IGF-1R抗體。培養時間為6小時。與複合體培養會有效的移除H460M2腫瘤細胞。
圖1 本發明複合體之註解圖示。
圖2 本發明複合體所包含之示例性多肽：融合多肽係端融合至包含抗體輕鏈或包含抗體重鏈鉸鏈區之多肽的N端。
圖3 經以對應表現質粒轉染之HEK293細胞之細胞培養物上清液之SDS聚丙烯醯胺凝膠之西方墨漬分析。經以過氧化物酶共軛多株兔抗人類κ-輕鏈抗體及共軛至辣根過氧化物酶之多株兔抗人類IgG抗體進行染色。第1道：雙臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc；第2道：單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc+IgG-Fc；第3道：單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-輕鏈+IgG-Fc；第4道：單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-重鏈+IgG-輕鏈；第5道：雙臂的β2-小球蛋白 -HLA-A0201-IgG-輕鏈+IgG-重鏈；第6道：雙臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-輕鏈+IgG-重鏈；第7道：雙臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-輕鏈；第8道：雙臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc-scFv；第9道：單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc+單臂IgG(重鏈及輕鏈)；第10道：分子量標記物；第11道：參考標準IgG1抗體。
圖4a及4b 以流式細胞分析法測定來自不同供體之CMV特異性毒殺型T細胞在試管內經以特異性肽進行刺激之前及之後的數量：分析4種人類供體衍生周邊血液淋巴細胞(PBL)；共軛至FITC標記染色之抗CD8抗體(BD，Cat.No.345772)，其與Pro5五聚體APC(ProImmune，Cat.No.F008-4A-E)染色TCR組合，識別負載有CMV衍生肽(NLVPMVATV，SEQ ID NO：01)之第一型MHC(HLA-A*0201)；圓圈處：CMV特異性CD8+-T細胞。
圖5a及5b 以流式細胞分析法透由負載有CMV肽之MN60腫瘤細胞之溶解作用，分析經刺激CTL之細胞溶解能力。
圖6 經CMV脈衝T細胞之T細胞特異性移除：以流式細胞分析法根據效應細胞對標的細胞的比例，透由負載有CMV肽之MN60腫瘤細胞之溶解作用，分析經刺激CTL之細胞溶解能力；黑色柱狀：負載有CMV肽 之MN60細胞，白色柱狀：未負載CMV肽之MN60細胞。
圖7 A：經以考馬斯染色之SDS-PAGE凝膠：第1道：分子重量標準品；第2道：單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc+單臂IgG複合體(重鏈及輕鏈)，非還原條件下；第3道：單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc+單臂的IgG複合體(重鏈及輕鏈)，還原條件下。B：尺寸排阻層析圖(size exclusion chromatography)；1：高分子量形式(0.7面積%)；2：單體複合體(99.3面積%)。
圖8 A：經以考馬斯染色之SDS-PAGE凝膠：第1道：分子量標準品；第2道：單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-輕鏈+IgG-Fc複合體，非還原條件下；第3道：單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-輕鏈+IgG-Fc複合體，還原條件下。B：尺寸排阻層析圖；1：高分子量形式(1.8面積%)；2：單體複合體(98.2面積%)。
圖9a及9b 利用FACS分析本發明複合體對人類IGF-1R陽性細胞株之結合；1：與單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-輕鏈+IgG-Fc複合體培養之H460M2細胞，未染色； 2：在4℃下，與單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-輕鏈+IgG-Fc複合體培養之H460M2細胞，經以螢光標記抗<人類IgG>抗體染色；3：在37℃下，與單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-輕鏈+IgG-Fc複合體培養之H460M2細胞，經以螢光標記抗<人類IgG>抗體染色；4：與單臂的肽-β2-小球蛋白-HLA-A0201-IgG-重鏈+IgG-輕鏈+IgG-Fc複合體培養之H460M2細胞，經以螢光標記對照抗體(抗DIG抗體)染色；5：經以螢光標記抗人類IgG抗體染色之H460M2細胞；6：經以螢光標記抗-人類IGF-1R抗體染色之H460M2細胞。
圖10 本發明抗原結合複合體介導表現人類IGF-1R之I24 3T3細胞(白色三角箭頭所指之大的附著性生長細胞)溶解作用在顯微鏡下的成像圖。溶解作用係藉由人類CMV-特異性T細胞(或為白色箭頭所指的圓形小細胞，或為黑色箭頭所指的變形蟲樣移動細胞)所介導。
圖11 本發明複合體不存在下，與人類CMV特異性T細胞(或為白色箭頭所指的圓形小細胞，或為黑色箭頭所指的變形蟲樣移動細胞)培養之I24 3T3細胞(白色三角箭頭所指之大的附著性生長細胞)在顯微鏡下的成像圖。
圖12 細胞毒性分析：本發明抗原結合複合體透由人類CMV-特異性T細胞驅動H460M2腫瘤細胞的溶解作用。a)(6小時)標的細胞：CMV-特異性效應T細胞為1：1.5；b)(6小時)標的細胞：CMV-特異性效應T細胞為1：0.75；c)(6小時)標的細胞：CMV-特異性效應T細胞為1：0.5；左邊柱狀：本發明複合體；右邊柱狀：IGF-1R-非典型岩藻糖化MAB。
圖13 細胞毒性分析：本發明抗原結合複合體透由人類CMV特異性T細胞驅動I24 3T3腫瘤細胞之溶解作用；a)(9小時)標的細胞：CMV特異性效應T細胞為1：1.5；b)(9小時)標的細胞：CMV特異性效應T細胞為1：0.75；c)(9小時)標的細胞：CMV特異性效應T細胞為1：0.5；左邊柱狀：本發明複合體；中間柱狀：IGF-1R-非典型岩藻化MAB；右邊柱狀：MAB ed；右邊柱狀：抗毛地黃毒苷抗體。
圖14 抗IGF-1R抗體及本發明複合體結合至肺腺癌細胞株H460M2之FACS分析；a)僅二級抗體(山羊抗人類IgG(H+L)(Jackson Laboratories，Cat# 109-116-088))；b)本發明複合體，其中融合多肽融合至僅包含一對可變域之抗IGF-1R抗體之重鏈的N端；c)抗IGF-1R抗體。
圖15 不同的本發明複合體在試管內的功效及特異性(細胞毒性分析)；a)包含單價抗IGF-1R抗體及CMV衍生肽之複合體；b)包含單價抗IGF-1R抗體及EBV衍生 肽之複合體(對照組)；c)包含雙價抗IGF-1R抗體及CMV衍生肽之複合體；d)抗IGF-1R抗體(對照組)；e)抗毛地黃毒苷抗體(對照組)。
圖16 本發明複合體於試管內在不同的標的細胞(T)對效應細胞(E)比例下所測得之功效及特異性(EC50值)，其中該融合多肽係融合至完整抗-IGF-1R抗體之重鏈的N端。
圖17 在標的細胞對效應細胞比例為1：1.5下，標的細胞與下列物質培養6小時後之溶解作用：a)包含單價抗IGF-1R抗體及包含CMV衍生肽之融合多肽之複合體，及b)抗IGF-1R抗體。
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<220>
<223> V-jun肉瘤病毒17致癌基因同源物(JUM)
<400> 7
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 第3型人類腺病毒
<400> 8
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> C型肝炎病毒
<400> 9
<210> 10
<211> 99
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 10
<210> 11
<211> 274
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 11
<210> 12
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽1
<400> 12
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽2
<400> 13
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽3
<400> 14
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽4
<400> 15
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽5
<400> 16
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽6
<400> 17
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽7
<400> 18
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽8
<400> 19
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽9
<400> 20
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽10
<400> 21
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽11
<400> 22
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子肽12
<400> 23
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 24
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1重鏈鉸鏈區多肽變異體
<400> 25
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 26
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2重鏈鉸鏈區多肽變異體1
<400> 27
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2重鏈鉸鏈區多肽變異體2
<400> 28
<210> 29
<211> 62
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 29
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 30
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 31
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶有突變L234A及L235A之人類IgG1 CH2域
<400> 32
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 帶有突變L234A、L235A及P329G之人類IgG CH2域
<220>
<223> human IgG CH2 domain with the mutations L234A,L235A and P329G
<400> 33
<210> 34
<211> 105
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 34
<210> 35
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1 CH3域紐結變異體
<400> 35
<210> 36
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1 CH3域孔眼變異體
<400> 36
<210> 37
<211> 232
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 37
<210> 38
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶有突變L234A及L235A之人類IgG1重鏈Fc區
<400> 38
<210> 39
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含突變L234A及L235A作為孔眼變異體之人類IgG1重鏈Fc區
<400> 39
<210> 40
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶有突變L234A及L235A紐結變異體之人類IgG1重鏈Fc區
<400> 40
<210> 41
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig輕鏈
<400> 41
<210> 42
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig重鏈(IgG1-L234A,235A突變體)
<400> 42
<210> 43
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig重鏈(帶有紐結變異之IgG1-L234A，L235A突變體)
<400> 43
<210> 44
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig重鏈(帶有孔眼變異之IgG1-L234A，L235A突變體)
<400> 44
<210> 45
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ig重鏈Fc區(IgG1-L234A，L235A突變體Fc區)
<400> 45
<210> 46
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 46
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 47
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 48
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 49
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 50
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 51
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 52
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 53
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 54
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 55
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 56
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 57
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 58
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 60
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 61
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 63
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 64
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 65
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 登革熱病毒
<400> 66
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 67
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 68
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 69
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨大細胞病毒
<400> 70
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 71
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 72
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 73
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 74
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 75
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 76
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 77
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 78
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 79
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 80
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 81
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 82
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 83
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 84
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 85
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 86
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 87
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 88
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 89
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 90
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 91
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 92
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 93
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 94
<210> 95
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 95
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 96
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 97
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 98
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 99
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 100
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 101
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 102
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 103
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 104
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 105
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 106
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 107
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 108
<210> 109
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 109
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 110
<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 111
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<400> 112

Claims (28)

  1. 一種於真核細胞中重組產生複合體之方法，該複合體包含：i)β2-小球蛋白與第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3之融合蛋白，ii)衍生自抗體鉸鏈區之一對經雙硫鍵連接多肽鏈，及iii)至少一對抗體輕鏈可變域及抗體重鏈可變域，該方法包含以下步驟：培養包含編碼該複合體之一或多個核酸之真核細胞，及從該細胞或該培養基回收該複合體，其中該複合體包含僅一條(exactly one)β2-小球蛋白與第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3之融合多肽。
  2. 如請求項1之方法，其中該複合體在該培養基中係以1 mg/ml或更高之濃度獲得。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該真核細胞係哺乳動物細胞。
  4. 如請求項3之方法，其中該哺乳動物細胞係人類胚胎腎細胞，或中國倉鼠卵巢細胞，或幼倉鼠腎細胞，或小鼠骨髓瘤細胞。
  5. 如請求項1或2之方法，其中該融合多肽以N至C端方向包含β2-小球蛋白及相對頻率小於1%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3。
  6. 如請求項1之方法，其中該融合多肽包含T細胞反應引發肽、β2-小球蛋白及相對頻率1%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3。
  7. 如請求項1之方法，其中該衍生自抗體鉸鏈區之經雙硫鍵 連接之多肽鏈係：i)由一或多個雙硫鍵連接，ii)第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈以N至C端方向包含免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域、免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域及抗體重鏈鉸鏈區多肽，且第二條經雙硫鍵連接之多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該融合多肽係：i)以共價結合至該等經雙硫鍵連接之多肽鏈之一者之C端或N端，或ii)以共價結合至一抗體可變域之N端，該抗體可變域係該第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈中所包含可變域的互補同源重鏈或輕鏈可變域，或iii)以共價結合至一抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係該第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈中所包含恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域。
  9. 如請求項6之方法，其中該T細胞反應引發肽係病毒衍生肽。
  10. 如請求項6之方法，其中該融合多肽以N至C端方向包含：(i)病毒衍生肽，其具有選自SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：09之胺基酸序列，(ii)第一連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10，(iv)第二連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、 21、22及23之胺基酸序列，(v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC分子具有胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(vi)第三連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：12、16、17、18、21、22及23之胺基酸序列。
  11. 如請求項1之方法，其中該第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈及該第二條經雙硫鍵連接之多肽鏈包含：i)人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：31、32及33之胺基酸序列，及ii)人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：34、35及36之胺基酸序列。
  12. 如請求項10或11之方法，其中該複合體包含：i)第一連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，及/或ii)第二連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：22，及/或iii)第三連接子肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：12，及/或iv)人類IgG1 CH2域，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：32或33，及/或v)於該第一條經雙硫鍵連接之多肽中之人類IgG1 CH3域，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：35，及於該第二條經雙硫鍵連接之多肽中之人類IgG1 CH3域，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：36。
  13. 一種複合體，其特徵在於包含：一條融合多肽，以N至C端方向包含：(i)β2-小球蛋白，及(ii)相對頻率小於1%之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，或(i)T細胞反應引發肽，(ii)β2-小球蛋白，及(iii)相對頻率1%或更高之第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，及兩條多肽鏈，藉由一或多個雙硫鍵連接，其中第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈以N至C端方向包含：(i)免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變域，(ii)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恆定域，及(iii)抗體重鏈鉸鏈區多肽，且其中第二條經雙硫鍵連接之多肽鏈包含抗體重鏈鉸鏈區多肽，其中該融合多肽係：以共價結合至該等經雙硫鍵連接之多肽鏈之一者之C端或N端，或以共價結合至一抗體可變域之N端，該抗體可變域係該第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈中所包含可變域的互補重鏈或輕鏈可變域，或 以共價結合至一抗體恆定域之C端，該抗體恆定域係該第一條經雙硫鍵連接之多肽鏈中所包含恆定域的互補重鏈或輕鏈恆定域，條件是該複合體包含僅一條(exactly one)融合多肽。
  14. 如請求項13之複合體，其中該T細胞反應引發肽係病毒衍生肽。
  15. 如請求項13之複合體，其中該融合多肽以N至C端方向包含(i)病毒衍生肽，其具有選自SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：09之胺基酸序列，(ii)第一連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，(iii)β2-小球蛋白，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：10，(iv)第二連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：16、17、18、21、22及23之胺基酸序列，(v)第一型MHC分子之胞外域α1、α2及α3，該MHC具有胺基酸序列SEQ ID NO：11，及(vi)第三連接子肽，其具有選自SEQ ID NO：12、16、17、18、21、22及23之胺基酸序列。
  16. 如請求項13之複合體，其中該第一條經雙硫鍵連接之多肽及該第二條經雙硫鍵連接之多肽進一步包含：人類IgG1 CH2域，其包含選自SEQ ID NO：31、32及33之胺基酸序列，及人類IgG1 CH3域，其包含選自SEQ ID NO：34、35及36之胺基酸序列。
  17. 如請求項15或16之複合體，其中該第一連接子肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，及/或該第二連接子肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：22，及/或該第三連接子肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：12，及/或該人類IgG1 CH2域具有胺基酸序列SEQ ID NO：32或33，及/或一條經雙硫鍵連接之多肽之人類IgG1 CH3域具有胺基酸序列SEQ ID NO：35，且另一條經雙硫鍵連接之多肽之人類IgG1 CH3域具有胺基酸序列SEQ ID NO：36。
  18. 如請求項13至16中任一項之複合體，其係用作藥物。
  19. 如請求項13至16中任一項之複合體，其係用於治療癌症或慢性病毒感染。
  20. 如請求項13至16中任一項之複合體，其係用於將個體之病毒特異性毒殺型T細胞吸引至標的。
  21. 如請求項13至16中任一項之複合體，其係用於移除癌細胞或病毒感染細胞。
  22. 一種核酸，其編碼如請求項13至17中任一項之複合體。
  23. 一種宿主細胞，其包含如請求項22之核酸。
  24. 一種醫藥調配物，其包含如請求項13至17中任一項之複合體及視需要之醫藥可接受載劑。
  25. 一種如請求項13至17中任一項之複合體之用途，其用於製造藥物。
  26. 如請求項25之用途，其中該藥物係用於治療癌症或慢性病毒感染。
  27. 如請求項25之用途，其中該藥物係用於將個體之病毒特異性毒殺型T細胞吸引至標的。
  28. 如請求項25之用途，其中該藥物係用於移除癌細胞或病毒感染細胞。
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