CN112285083B

CN112285083B - 一种细胞杀伤效力的评价方法

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Publication number: CN112285083B
Application number: CN202011173508.3A
Authority: CN
Inventors: 罗浦文; 姜晶; 陈凯
Original assignee: Shanghai Ruiyu Biotech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Ruiyu Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2040-10-28
Also published as: CN112285083A

Abstract

本发明提供一种细胞杀伤效力的评价方法。所述评价方法包括如下步骤：(1)将携带荧光标记A的靶细胞与效应细胞共培养，再使用荧光标记B对共培养后产生的死细胞进行染色标记，其中，荧光标记A与荧光标记B对应的激发光波长不同；(2)分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像；(3)对所得到的显微图像进行叠加合成分析，根据分析结果评估所述效应细胞的细胞杀伤效力。本发明中，用荧光试剂A和荧光标记B分别对靶细胞和死细胞进行染色标记，而后荧光显微成像和图像合成分析，能够快速、直观且准确地得到细胞杀伤效力的评价结果。

Description

一种细胞杀伤效力的评价方法

技术领域

本发明属于细胞杀伤活性检测技术领域，具体涉及一种细胞杀伤效力的评价方法。

背景技术

与目前的生物制品相比，免疫细胞治疗产品具有其独特的特性，如起始个体差异大、制备工艺规模化程度低、制剂多为活细胞产品、作用机制不是很明确等，使得这类产品的一致性差、批量有限、效期短、同一类产品的可比性差等，这些特点均大大增加了质量控制研究的难度，其中杀伤效力质量控制便是难点之一。同时，在进行病人的免疫水平评价，肿瘤治疗愈后评价，以及细胞治疗过程中的免疫细胞的增殖能力评价等环节中，也都需要对免疫细胞的杀伤能力进行评估。

常用的细胞杀伤检测方法有镉51释放实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放法、BATDA法、CAM法、CytoTox-Glo法和PKH法等。其中经典的方法是镉51释放实验，该方法可重复性好，但是，因其使用同位素标记靶细胞，从而存在半衰期短、同位素废弃物处理及实验防护要求高等多种限制因素，尤其是放射性同位素的使用对健康以及环境具有巨大威胁，其他放射性同位素标记靶细胞如H3亦具有此类缺陷，使该类方法的应用受到局限，因此，很多研究者会采用其它替代方法进行生物学效力检测。传统的LDH法灵敏度及可重复性不稳定，且所需时间较长，批间变异较大，不能适应免疫细胞效期短的特点。

镉51释放实验、LDH法、BATDA法和CytoTox-Glo法都属于间接法，即先用某一试剂对靶细胞进行标记，然后和不同浓度的免疫细胞进行孵育，当靶细胞受到免疫细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，这些物质会释放到上清中，通过测定释放物质的含量可以测定免疫细胞的活性。上述方法都是通过释放物质含量的测定而间接进行定量，反应时间的长短、仪器检测的时间点都会对读取的数值造成影响。

CAM法及PKH法是通过流式细胞仪检测活细胞标记及死亡标记双信号来反映其杀伤效率，与前述方法相比，这两种方法所反映的信号还包括处于凋亡状态的细胞。其中，流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在液流***中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。鉴于其在单细胞水平上高效准确的定量分析优势，目前涌现出多种以流式细胞术为基础的NK细胞杀伤活性的测定方法，但仍然存在缺陷。

由于效应细胞和靶细胞在共培养过程中，靶细胞对效应细胞可能会产生一定抑制和破坏作用，则共培养体系的死亡率可能是包括靶细胞和效应细胞的共同死亡率。流式分析的方法实验阶段需要根据经验调节电压，数据分析阶段需要根据经验进行圈门，这样的过程引入了操作人和分析人的主观误差。因此，尽管流式细胞术能够特异性地检测靶细胞的凋亡率，流式细胞仪属于液流***，无法采集到细胞图像，若需要验证结果的准确性，还需要借助显微镜或其他仪器观察进行佐证。这导致流式的分析方法虽然在科研领域被广泛的使用，但是在需要标准化可重复验证的医疗诊断和生物医药产业化领域难以广泛使用。

因此，开发一种基于显微图像识别的、直观可视地、准确地评估细胞杀伤效力的方法，对于免疫细胞制品的研发或免疫细胞疗法及临床免疫评价的发展具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种细胞杀伤效力的评价方法及其应用。所述评价方法先通过对靶细胞和效应细胞进行荧光染色，区分活靶细胞、死靶细胞、活效应细胞和死效应细胞，并结合荧光显微成像和图像合成分析方法，根据对应细胞个数计算得到细胞杀伤率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种细胞杀伤效力的评价方法，所述评价方法包括如下步骤：

(1)将靶细胞与效应细胞共培养，并使用荧光标记A对靶细胞进行染色标记，使用荧光标记B对共培养后产生的死细胞进行染色标记；

(2)分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像；

(3)通过图像识别对所得到的显微图像中的细胞进行识别，并将同一区域的识别结果进行叠加合成分析，根据分析结果评估所述效应细胞的细胞杀伤效力；

其中，荧光标记A与荧光标记B对应的激发光波长不同；所述叠加合成分析过程中，仅显示荧光标记A的细胞为活靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为死效应细胞，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为死靶细胞，无荧光标记的细胞为活效应细胞。

本发明中，用两种不同激发光波段的荧光试剂A和荧光标记B分别对靶细胞和死细胞进行染色标记，而后能够实现荧光显微成像和图像合成分析，在同一位置或同一视野分别用明场和适合2种荧光标记的显微荧光通道进行显微成像，然后将同一视场的显微图像进行叠加合成分析，得到检测结果，即本发明中采用的是由图像直接得到检测结果的“直读法”，对比镉51释放实验以及流式细胞术采用的间接法，本发明的检测结果更加准确和直观。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述识别结果包括细胞的位置信息、尺寸信息或荧光强度中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，通过明场图像识别方法对明场图像中的明场目标进行识别，获得检测目标的位置信息、尺寸信息等；通过荧光图像识别方法对荧光标记A和荧光标记B荧光图像中的荧光目标进行识别，获得检测目标的位置信息、尺寸信息等；而后对所得到的同一区域明场、荧光标记A和荧光标记B显微图像识别结果进行叠加合成分析。

其中，能够同时在荧光标记A和荧光标记B的显微图像中获取到死靶细胞的位置信息和尺寸信息；活靶细胞的位置信息和尺寸信息仅能在荧光标记A的显微图像中获取；死效应细胞的位置信息和尺寸信息仅能在荧光标记B的显微图像中获取；而活效应细胞的位置信息和尺寸信息无法在荧光标记A和荧光标记B的显微图像中获取，仅能在明场图像中获取。

所述分析结果包括：靶细胞和效应细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活效应细胞数、死效应细胞数、靶细胞死亡率或效应细胞死亡率中的任意一种或至少两种的组合。

其中，所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：

靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；

所述效应细胞死亡率采用如下公式进行计算：

效应细胞死亡率＝死效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100％。

同样的，若为了计算靶细胞活率和效应细胞活率，可以采用如下公式进行计算：

靶细胞活率＝活靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；

效应细胞活率＝活效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100％。

由此可知，靶细胞死亡率和靶细胞活率之和为100％，效应细胞死亡率和效应细胞活率之和也为100％，说明本发明中，各种细胞类型在统计过程中较为准确。

优选地，步骤(1)中将靶细胞与效应细胞共培养时，还分别单独培养靶细胞和效应细胞作为对照组。

优选地，所述评价方法还包括如下步骤：

对所述对照组分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道进行显微成像，得到显微图像；

对所述对照组的显微图像进行叠加合成分析，得到对照组的靶细胞死亡率和/或对照组的效应细胞死亡率。

优选地，步骤(3)所述分析结果还包括：细胞特异杀伤率和/或效应细胞自伤率；

其中，所述细胞特异杀伤率采用如下公式进行计算：

细胞特异杀伤率＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；

所述效应细胞自伤率采用如下公式进行计算：

效应细胞自伤率＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。

优选地，步骤(1)中所述荧光标记A包括荧光蛋白或细胞染料。

优选地，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或荧光素酶(Luc)中的任意一种；即所述靶细胞可以载有GFP、RFP或Luc等中的任意一种作为标签用于识别。

所述荧光标记A也可以是细胞染料，即所述靶细胞也可以使用荧光染料CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)或钙黄绿素AM(CalceinAM)等活性染料或核染料对靶细胞进行标记。

优选地，步骤(1)中所述靶细胞包括病毒感染的细胞或各类肿瘤细胞。例如，所述靶细胞可以是无荧光蛋白标记的或有荧光蛋白标记的K562细胞、Daudi细胞、Jurkat细胞、MCF-7细胞、A549细胞或HepG2细胞等；也可以是其他与前述细胞具有相同作用机理的细胞。

优选地，步骤(1)中所述效应细胞包括免疫细胞或工程化细胞，例如可以是PBMC细胞、NK细胞、T细胞、CTL细胞、LAK细胞、CIK细胞、TIL细胞、DC细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、NK92MI-CD16a细胞等。

优选地，步骤(2)中所述荧光标记B为死细胞染料，例如可以是Annexin-V(膜联蛋白-V)、SYTOX Green(绿菁SYTOX)、PI(溴化丙啶)和7-AAD(7-氨基放线菌素D)等中的任意一种或至少两种的组合。

作为本发明优选的技术方案，所述检测方法包括如下步骤：

(1)先使用荧光标记A标记靶细胞，将标记后的靶细胞与效应细胞共培养，并单独培养靶细胞和效应细胞作为对照组细胞；

所述荧光标记A可以是荧光蛋白，荧光蛋白标签通过基因编辑转入靶细胞当中，使其在生长的过程中同时表达荧光蛋白，常用的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或荧光素酶中的任意一种；

所述荧光标记A也可以是细胞染料，如果所选细胞染料容易产生背景荧光，需进行洗涤，如果所选试剂没有背景荧光或背景荧光不影响分析，可免除此步骤；

(2)使用荧光标记B对步骤(1)得到的共培养细胞进行孵育染色，所述荧光标记B为死细胞染料；

其中，荧光标记A与荧光标记B对应的激发光波长不同；

(3)将所述染色后得到的细胞转移至加入血球计数板或与血球计数板有类似固定距离微缝结构的细胞计数板；

(4)将步骤(3)步制备的已经加样的计数板放置到显微荧光成像***下摄像，对同一位置或同一视野分别摄取明场通道、A荧光试剂匹配通道、B荧光试剂匹配通道下的显微图像，得到3张显微成像图片；

(5)图像合成分析计数；以明场通道获得的图像进行细胞计数，得到总细胞数；而后叠加分析明场、荧光标记A匹配通道和荧光标记B匹配通道获得的图像；

其中，仅显示荧光标记A的细胞为活的靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为死的效应细胞，不显示荧光标记的细胞为活的效应细胞，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为死的靶细胞；

最后，计算靶细胞死亡率、效应细胞死亡率、对照组靶细胞和效应细胞的死亡率、细胞特异杀伤率和效应细胞自伤率，得到细胞杀伤效力的检测结果；

所使用的计算公式如下：

效应细胞死亡率＝死效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100％；

细胞特异杀伤率(％)＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；

效应细胞自伤率(％)＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。

第二方面，本发明提供如第一方面所述的检测方法在检测细胞杀伤力、制备免疫细胞制剂或研究免疫细胞疗法中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述的方法先通过对靶细胞和免疫细胞进行荧光染色，区分活靶细胞、死靶细胞、活效应细胞和死效应细胞，并结合荧光显微成像和图像合成分析方法，采用明场和适合2种荧光标记的显微荧光通道对同一视野下的细胞进行显微成像，将所得图像叠加合成分析，得到靶细胞和效应细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活效应细胞数和死效应细胞数，根据对应细胞个数计算得到细胞杀伤率等结果；

(2)该方法能够同时得到待测细胞的图像信息和数据处理结果，相比流式细胞仪提供的检测结果而言，所得结果更加直观，能在一台仪器上得到细胞死亡率、细胞自伤率以及细胞特异杀伤率等多项数据，减少了检测步骤，提高了检测效率，检测方法简单，根据荧光标记即可统计各种细胞的数量，并得到细胞死亡率、细胞自伤率以及细胞特异杀伤率等多项数据。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例中，所使用的试剂均可购自常规厂商；同时，若无特殊说明，所采用的实验方法均为本领域技术人员知晓的常规方法。

实施例1

本实施例提供一种细胞杀伤效力的评价方法，具体步骤如下：

(1)靶细胞标记：

培养并收集靶细胞，向靶细胞中加入荧光染料CFSE进行孵育，标记，将标记后的靶细胞制备为细胞溶液；

(2)准备效应细胞：

将效应细胞制备为细胞溶液；

(3)进行细胞共培养：

在培养皿中同时加入靶细胞和效应细胞(作为实验组)；

同时制备对照组细胞：在培养皿中仅加入靶细胞和培养基作为靶细胞对照组，在另外的培养皿中仅加入效应细胞和培养基作为效应细胞对照组；

对上述对照组和实验组放在培养环境下培养；

(4)用荧光染料PI处理所有的细胞；

(5)将步骤(4)得到的细胞加入血球计数板；

(6)将加样的血球计数板放置到检测仪器的样品台上，分别摄取明场通道、FL1通道(匹配荧光染料CFSE)、FL2通道(匹配荧光染料PI)，其中，两个荧光通道信息及顺序分别如下：

FL1：Ex 480nm，Em 535nm；FL2：Ex 525nm，Em 600LP，FL1通道激发与采集CFSE荧光，FL2通道激发与采集PI荧光。

(7)然后在同一位置分别用明场和适合2种荧光试标记的显微荧光通道进行显微成像，得到3张显微成像图片；

(8)图像合成分析：图像识别软件会将明场、FL1通道以及FL2通道下的荧光图片进行识别：

(I)以明场图像判断细胞，区分杂质，计算总细胞数；

(II)仅显示荧光标记A的为活的靶细胞，统计活靶细胞数；

(III)仅显示荧光标记B的为死的效应细胞，统计死的效应细胞数；

(IV)无荧光显示的为活效应细胞，统计活的效应细胞数。

(V)同时显示荧光标记A和荧光标记B的为死的靶细胞，统计死的靶细胞数；

(VI)计算靶细胞死亡率和效应细胞死亡率；

(VII)计算细胞特异杀伤率和效应细胞自伤率；

其中，细胞特异杀伤率(％)＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；效应细胞自伤率(％)＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。

具体操作如下：

明场通道下拍摄图片识别的目标为总细胞(包含靶细胞与效应细胞)；

FL1通道下拍摄图片识别的目标为靶标细胞(包含活的与死的靶细胞)；

FL2通道下拍摄图片识别的目标为总的死细胞(包含死的靶标细胞和死的效应细胞)。

3张图片叠加后，软件对细胞所在的同一位置进行标示：

无荧光信号，标示并统计数目为a；只有FL1信号，标示并统计数目为b；同时有FL1和FL2信号，标示并统计数目为c；只有FL2信号，标示并统计数目为d。

并自定义编辑公式如下：

活靶细胞数＝b、死靶细胞数＝c；

靶细胞死亡率＝c/(b+c)×100％

活效应细胞数＝a、死效应细胞数＝d；

效应细胞死亡率＝d/(a+d)×100％。

实施例2

(1)靶细胞标记：

将绿色荧光蛋白基因转入靶细胞当中并表达，培养并收集靶细胞，制成细胞溶液；

(2)准备效应细胞：

将效应细胞制备为细胞溶液；

(3)进行细胞共培养：

在培养皿中同时加入靶细胞和效应细胞，同时设置不同的效靶比，包括1:1、1:3和1:6，作为实验组；

对上述对照组和实验组放在培养环境下培养；

(4)用荧光染料PI处理所有的细胞；

(5)将步骤(4)得到的细胞加入血球计数板；

(6)将加样的血球计数板放置到检测仪器的样品台上，分别摄取明场通道、FL1通道(匹配荧光蛋白GFP)、FL2通道(匹配荧光染料PI)，其中，两个荧光通道信息及顺序分别如下：

FL1：Ex 488nm，Em 507nm；FL2：Ex 525nm，Em 600LP，FL1通道激发与采集GFP荧光，FL2通道激发与采集PI荧光。

具体操作如下：

3张图片叠加后，软件对细胞所在的同一位置进行标示：

并自定义编辑公式如下：

活靶细胞数＝b、死靶细胞数＝c；

靶细胞死亡率＝c/(b+c)×100％；

活效应细胞数＝a、死效应细胞数＝d；

效应细胞死亡率＝d/(a+d)×100％。

同时，本实施还可以根据不同效靶比下靶细胞死亡率和效应细胞死亡率，得到最佳的效靶比。

综上所述，本发明提供一种细胞杀伤效力的评价方法，使用两种激发光波长不相同的荧光标记分别标记靶细胞和死细胞，而后对其进行成像，得到明场和适合2种荧光标记的显微荧光通道下的图像，对同一视野下的图像进行叠加分析，得到靶细胞和效应细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活效应细胞数和死效应细胞数，并计算得到靶细胞死亡率、效应细胞死亡率、细胞特异杀伤率以及效应细胞自伤率，所得结果更加直观，减少了检测步骤，提高了检测效率。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种细胞杀伤效力的评价方法，其特征在于，所述评价方法包括如下步骤：

（1）将携带荧光标记A的靶细胞与效应细胞共培养，再使用荧光标记B对共培养后产生的死细胞进行染色标记，其中，荧光标记A与荧光标记B对应的激发光波长不同；

（2）分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像；

（3）通过图像识别对所得到的显微图像中的细胞进行识别，并将同一区域的识别结果进行叠加合成分析，根据分析结果评估所述效应细胞的细胞杀伤效力；

其中，所述识别结果包括细胞的位置信息、尺寸信息或荧光强度中的任意一种或至少两种的组合；所述叠加合成分析过程中，仅显示荧光标记A的细胞为活靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为死效应细胞，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为死靶细胞，无荧光标记的细胞为活效应细胞；

所述分析结果包括：靶细胞和效应细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活效应细胞数、死效应细胞数、靶细胞死亡率或效应细胞死亡率中的任意一种或至少两种的组合；

其中，所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：

靶细胞死亡率=死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100%；

所述效应细胞死亡率采用如下公式进行计算：

效应细胞死亡率=死效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100%。

2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤（1）中将靶细胞与效应细胞共培养时，还分别单独培养靶细胞和效应细胞作为对照组。

3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括如下步骤：

对所述对照组的显微图像进行图像识别，并将识别结果进行叠加合成分析，得到对照组的靶细胞死亡率和/或对照组的效应细胞死亡率。

4.根据权利要求3所述的评价方法，其特征在于，步骤（3）所述分析结果还包括：细胞特异杀伤率和/或效应细胞自伤率；

其中，所述细胞特异杀伤率采用如下公式进行计算：

细胞特异杀伤率=靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；

所述效应细胞自伤率采用如下公式进行计算：

效应细胞自伤率=效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。

5.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤（1）中所述荧光标记A包括荧光蛋白或细胞染料；

所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或荧光素酶中的任意一种；

步骤（2）中所述荧光标记B为死细胞染料。

6.根据权利要求5所述的评价方法，其特征在于，步骤（1）中使用荧光标记A对靶细胞进行染色标记后，还包括洗涤的操作。

7.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤（1）中所述靶细胞包括病毒感染的细胞和/或肿瘤细胞；

步骤（1）中所述靶细胞包括无荧光蛋白标记和/或有荧光蛋白标记的K562细胞、Daudi细胞、Jurkat细胞、MCF-7细胞、A549细胞或HepG2细胞中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤（1）中所述效应细胞包括免疫细胞或工程化细胞；

步骤（1）中所述效应细胞包括PBMC细胞、NK细胞、T细胞、CTL细胞、LAK细胞、CIK细胞、TIL细胞、DC细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞或NK92MI-CD16a细胞中的任意一种或至少两种的组合。

9.如权利要求1~8任一项所述的评价方法在非疾病的诊断和治疗目的的、检测细胞杀伤力或制备免疫细胞制剂中的应用。