BR112013029746B1

BR112013029746B1 - método para a produção recombinante de um complexo, complexo, formulação farmacêutica e uso do complexo

Info

Publication number: BR112013029746B1
Application number: BR112013029746-8A
Authority: BR
Inventors: Hendrik Knoetgen
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2011-06-22
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2021-02-02
Also published as: SG195077A1; EP2723773B1; JP2014519830A; EP2723773A1; MX354663B; TWI563087B; ECSP13013098A; KR102038155B1; US20220089769A1; CO6801646A2; BR112013029746A2; PE20141212A1; CN110229235A; CA2835772A1; US20200157239A1; AU2012274127A1; PL2723773T3; WO2012175508A1; KR20140036251A; AU2012274127B2

Abstract

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UM COMPLEXO , COMPLEXO, ÁCIDO NUCLEICO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO COMPLEXO, MÉTODO PARA A ATRAÇÃO DE CÉLULAS T CITOTÓXICAS VÍRUS- ESPECÍFICAS E MÉTODO DE REMOÇÃO DE CÉLULAS DE CÂNCER. É divulgado na presente invenção um complexo compreendendo como primeira parte uma parte derivada de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo, e como segunda parte um peptídeo derivado de vírus ligado à uma da proteína do complexo MHC de classe I. Com o complexo divulgado na presente invenção, as células T citotóxicas circulantes vírus-específicas (células T de memória e/ou células T efetoras) de um indivíduo podem ser direcionadas para as células que expressam o antígeno alvo, ao qual o anticorpo derivado de parte do complexo covalente se liga especificamente e direciona estas células com complexos MHC de classe I, mimetizando assim uma infecção viral aguda. Outro aspecto da presente invenção é um método para a produção recombinante de um complexo compreendendo: i) um polipeptídeo de fusão de (beta) 2 microglobulina e os domínios extracelulares (alfa) 1, (alfa) 2 e (alfa) 3 de uma molécula MHC de classe I; ii) um par de cadeias polipeptídicas ligadas por ligações de dissulfeto cada uma compreendendo uma região de (...).

Description

[001] É divulgado no presente um polipeptídeo de fusão compreendendo um anticorpo e um componente MHC de classe I e o uso deste para a remoção de células tumorais pela atração direcionada de células T citotóxicas vírus-específicas circulantes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A proteína MHC de classe I consiste de uma cadeia-α (α-1 a α-3 e um domínio transmembrana), e β2-microglobulina. Ela é poligênica (3 loci gênicos para proteína MHC de classe I no genoma haploide) dando origem a seis cadeias-α diferentes para a proteína MHC de classe I (nos seres humanos duas HLA-A, duas HLA-B, e duas HLA-C). O MHC é ainda polimórfico. O alelo HLA-A A*0201 humano é prevalente em cerca de 30% a 50% da população caucasiana (Player et al., J Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19 (1996) 357-363).

[003] O citomegalovírus humano HCMV (= herpes vírus humano 5, HHV-5) é um dos maiores vírus humanos. O seu genoma compreende cerca de 230.000 pb de DNA dupla fita linear e codifica mais de 160 proteínas (Davison, A.J., et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 17-28).

[004] O CMV evoluiu para se tornar um parasita sublime do genoma humano, e é um potente imunógeno e desencadeia respostas imunes fortes por todas as armas do sistema imunológico. Este vírus parece estar entre os antígenos mais imunodominantes conhecidos do sistema imune humano e estimula respostas de células T CD8+ de grandeza sem precedentes.

[005] A “latência” do CMV depende da supressão imunológica crônica do vírus CMV ao invés de uma alteração no padrão de transcrição viral (Moss e Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464).

[006] As respostas imunes de células T CD8+ não são direcionadas uniformemente contra todas as proteínas do CMV, mas são focadas. As proteínas do CMV pp65 e IE-1 são os alvos predominantes (McLaughlin-Taylor, E., et al., J. Med. Chem. Virol. 43 (1994) 103-110; Khan & Moss, Human Immunology 65 (2004) 456-464).

[007] A verdadeira frequência de células-T CMV-específicas é muito elevada, estando as frequências de peptídeos individuais na ordem de 1 até 2% do total de células T CD8+ do repertório (Moss e Khan, Human Immunology, Wills, M.R., et al. Virol. 70 (1996) 7569-7579).

[008] A resposta de células-T CD8+ específicas para CMV aumenta significativamente com a idade e tetrâmeros de peptídeos-HLA individuais coram frequentemente em um excesso de 10% do total do pool de células T CD8+ (Khan, N., et al. J. Immunol.169 (2002) 1984-1992).

[009] A resposta total de células T CD8+ em doadores idosos saudáveis pode constituir aproximadamente 50% do repertório de célula T CD8+.

[010] As enormes expansões de células T CD8+ são frequentemente clonalmente restritas, e estima-se que o CMV seja a causa de pelo menos 30% da expansão clonal das células T CD8+ que são observadas no sangue periférico com o envelhecimento. A contagem total de células T CD8 é duas vezes mais elevada em doadores soropositivos para CMV com idade superior a 60 anos, em comparação com um grupo de pacientes soronegativos para CMV (Looney, R.J., et al. Clin. Immunol. 90 (1999) 213-219).

[011] Uma fusão de HLA solúvel e β-2-microglobulina é divulgada por Mottez et al. (Eur. J. Immunol. 21 (1991) 467-471); Godeau et al. (J. Biol. Chem. 267 (1992) 24223-24229) e Mage et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992) 10658-10662). Uma fusão entre o peptídeo vírus-derivado com o HLA solúvel e β-2-microglobulina é relatado por Mottez et al.(J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502). Uma fusão de uma cadeia pesada de imunoglobulina com HLA solúvel sendo coexpressa a β-2-microglobulina é divulgada por Dal Porto et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6671-6675). Um complexo tetramérico do peptídeo HLA solúvel e β-2-microglobulina biotinilado quimicamente acoplado com estreptoavidina a um fragmento Fab é descrito por Robert et al. (Eur. J. Immun. 30 (2000) 3165-3170). Um Fab quimicamente acoplado com uma fusão de um peptídeo viral-derivado com HLA solúvel e β-2- microglobulina é divulgado por Robert et al.(Cancer Immunity 1 (2001) 2). Uma fusão de um peptídeo viral-derivado com HLA solúvel e β-2-microglobulina a uma cadeia pesada de um anticorpo monoclonal murino é divulgada por Greten et al.(J. Immunol. Methods 271 (2002) 125-135). Uma expressão em E. coli de fusões scFv sem peptídeo, com reenovelamento proteico e carga peptídica in vitro é relatada por Lev et al. (J. Immunol. 169 (2002) 2988-2996), Lev et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (2004) 9051-9056), e Novak et al.(Int. J. Cancer 120 (2006) 329-336). O uso de MHC solúvel biotinilado carregado com peptídeos e acoplado à estreptoavidina fundida a anticorpos Fab ou scFv é divulgado por Mous et al. (Leukemia 20 (2006) 1096-1102).

[012] No documento WO 2005/099361 são divulgados conjugados ‘peptídeo MHC de classe I - -anticorpo’ modificados com beta-2- microglobulina. Exemplos de conjugados conforme divulgado no documento WO 2005/099361 são obtidos a partir da conjugação in vitro da cadeia alfa do complexo MHC (HLA) ou pela coexpressão de genes separados na mesma célula.

[013] Na US 2004/0091488 são divulgadas construções antigênicas de antígenos do complexo principal de histocompatibilidade de classe I com moléculas transportadoras específicas. Os polipeptídeos de fusão mencionados na presente invenção são divulgados sem uma região de dobradiça (hinge).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[014] É divulgado na presente invenção um método para produzir de maneira recombinante um complexo compreendendo como primeira parte uma parte derivada de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo, e como segunda parte, um peptídeo derivado de vírus (vírus-derivado) ligado covalentemente a um complexo de proteína MHC de classe I, bem como o próprio complexo.

[015] Com o complexo conforme divulgado na presente invenção as células T citotóxicas circulantes vírus-específicas (células T de memória e/ou células T efetoras) de um indivíduo podem ser direcionadas para as células que expressam o antígeno alvo, para que parte o anticorpo derivado de parte do complexo se ligue especificamente, endereçando estas células com complexos MHC de classe I mimetizando uma infecção viral aguda pelo peptídeo derivado do vírus ligado ao complexo proteico MHC classe I.

[016] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é um método para a produção recombinante de um complexo compreendendo: i) um polipeptídeo de fusão de β2-microglobulina e os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I; ii) um par de cadeias polipeptídicas ligadas por ligações de dissulfeto cada uma compreendendo uma região de dobradiça de anticorpo; e iii) pelo menos um par de um domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de anticorpo de uma célula eucariótica, compreendendo as etapas de: i) cultivo de uma célula eucariótica compreendendo um ou mais ácidos nucleicos codificante do complexo; e ii) a recuperação do complexo a partir da célula ou do meio de cultivo, em que o complexo compreende exatamente um polipeptídeo de fusão de β2-microglobulina e os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I.

[017] Em um exemplo de realização, o complexo compreende exatamente um polipeptídeo derivado de MHC ou exatamente um polipeptídeo de fusão compreendendo uma molécula derivado de MHC.

[018] Em um exemplo de realização, o complexo é obtido com uma concentração de 1 mg/ml ou mais no meio cultura. Em um exemplo de realização, o complexo é obtido com uma concentração de 4 mg/ml ou mais no meio cultura.

[019] Em um exemplo de realização, a célula eucariótica é uma célula de mamífero. Em um exemplo de realização, a célula de mamífero é uma célula de rim embrionário humano, ou uma célula de ovário de hamster chinês, ou célula de rim filhotes de hamster, ou uma célula de mieloma de camundongo.

[020] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo de fusão compreende, na direção N-terminal para C-terminal, uma β2-microglobulina e os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I que tem uma frequência relativa de ocorrência de menos de 1%.

[021] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo de fusão compreende um peptídeo que suscita uma resposta de células T, uma β2- microglobulina e os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I que tem uma frequência relativa de ocorrência de 1% ou mais.

[022] Em um exemplo de realização os polipeptídeos do par de cadeias polipeptídicas ligadas por ligações de dissulfeto derivadas de uma região de dobradiça do anticorpo: i) são ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; ii) a primeira cadeia polipeptídica ligada por ligações de dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal, um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, ou um domínio constante de cadeia pesada, e um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada do anticorpo, e a segunda cadeia polipeptídica ligada por ligações de dissulfeto compreende uma região do polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada do anticorpo.

[023] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo de fusão está; i) covalentemente ligado tanto na extremidade C-terminal quanto na extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações de dissulfeto; ou ii) covalentemente ligado à extremidade N de um domínio variável de anticorpo que é o cognato complementar do domínio variável de cadeia leve ou pesada que está compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto; ou iii) covalentemente ligado à extremidade C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o complementar ao domínio constante de cadeia leve ou pesada que está compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[024] Em um exemplo de realização, o peptídeo que suscita uma reposta de células T é um peptídeo derivado de vírus.

[025] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo de fusão compreende na direção N- para C-terminal: (I) um peptídeo derivado de vírus que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 9; (II) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22, e 23; (III) uma β2-microglobulina que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC classe I que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 12, 16, 17, 18, 21, 22 e 23.

[026] Em um exemplo de realização, a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto e a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreendem; i) um domínio CH2 da IgG1 humana, compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31, 32 e 33, e um domínio CH3 da IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 34, 35, e 36.

[027] Em um exemplo de realização, o complexo compreende: i) um primeiro peptídeo de ligação que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e/ou ii) um segundo peptídeo de ligação que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e/ou iii) um terceiro peptídeo de ligação que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; e/ou iv) um domínio CH2 da IgG1 humana que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou 33; e/ou v) no primeiro polipeptídeo ligado por dissulfeto um domínio CH3 da IgG1 humana que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e no segundo polipeptídeo ligado por dissulfeto um domínio CH3 da IgG1 humana que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[028] Um aspecto tal como divulgado na presente invenção, é um complexo, caracterizado por compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; e ambos: (i) uma β2-microglobulina, e (ii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I, com uma frequência relativa inferior a 1%; ou (i) um peptídeo que suscita resposta de células T; (ii) uma β2-microglobulina, e (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 1% ou mais; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, e (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e em que a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[029] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o complexo é um complexo de ligação ao antígeno.

[030] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o complexo é um complexo covalente.

[031] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, a molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 1% ou mais, tem uma frequência relativa de 10% ou mais. Em um exemplo de realização, a molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais é é HLA-A*0201 ou HLA-A*1101 ou HLA-A*2402 ou HLA-A*340101, ou HLA- C*0304 ou HLA-C*0401 ou HLA-C*0702.

[032] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, a molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais, é selecionada, dependendo da região do indivíduo ao qual o complexo será administrado da seguinte forma: - Para um indivíduo de origem europeia, a molécula MHC de classe I é selecionada a partir do grupo compreendendo HLA-A*0101, HLA- A*0201, HLA-A*0301, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA- B*4402, HLA-C*0401, HLA-C*0501, HLA-C*0701 e HLA-C*0702; - Para um indivíduo de origem australiana, a molécula MHC de classe I é selecionada a partir do grupo compreendendo HLA-A*0201, HLA- A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-B*1301, HLA-B*1521, HLA-B*5601, HLA B*5602, HLA-C*0102, HLA-C*0401, HLA-C*0403 e HLA C*1502; - Para um indivíduo de origem Norte Americana a molécula MHC de classe I é selecionada a partir do grupo compreendendo HLA-A*0201, HLA- A*2402, HLA C*0202, HLA-C*0304, HLA-C*0401 e HLA-C*0702; e - Para um indivíduo de origem do sudeste Asiático a molécula MHC de classe I é selecionada a partir do grupo compreendendo HLA-A*1101, HLA- A*2402, HLA B*1504, HLA-C*0102, HLA-C*0304, HLA-C*0702 e HLA C*0801.

[033] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, a molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais, é selecionada, dependendo da região do indivíduo ao qual o complexo será administrado da seguinte forma: - Para um indivíduo de origem europeia, a molécula MHC de classe I é HLA-A*0201; - Para um indivíduo de origem Australiana a molécula MHC de classe I é selecionada a partir do grupo compreendendo HLA-A*2402, HLA- B*1301, HLA-C*0102 e HLA-C*0401; - Para um indivíduo de origem Norte Americana a molécula MHC de classe I é selecionada a partir do grupo compreendendo HLA-A*2402 e HLA-C*0304; e - Para um indivíduo de origem do sudeste Asiático, a molécula MHC de classe I é HLA-A*2402.

[034] Em um exemplo de realização de todos os aspectos o polipeptídeo de fusão, que compreende na direção N-terminal para C-terminal, uma β2-microglobulina e os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I, com uma frequência relativa inferior a 1%, compreende adicionalmente na sua extremidade N-terminal um peptídeo de ligação ao sulco de ligação no peptídeo-MHC groove.

[035] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o peptídeo que suscita uma resposta de células T é um peptídeo que suscita uma resposta de células T CD8+. Em um exemplo de realização, o peptídeo que suscita uma reposta de células T é um peptídeo derivado de vírus.

[036] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, a molécula MHC de classe I, com uma frequência relativa inferior a 1%, é selecionada a partir do grupo compreendendo HLA-B*4201, HLA-B*5901, HLA- B*6701 e HLA-B*7802.

[037] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo de fusão compreende: (i) um peptídeo derivado de vírus; (ii) β2-microglobulina; e (iii) o HLA-A solúvel de alelo A*0201.

[038] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o vírus é selecionado a partir de adenovírus, herpesvírus humano 1, herpesvírus humano 2, herpesvírus humano 4 (vírus Epstein-Barr), vírus da hepatite-B, vírus da hepatite-C, citomegalovírus humano, vírus da imunodeficiência humana, papilomavírus humano tipo 16, papilomavírus humano tipo 18, papilomavírus humano tipo 31, papilomavírus humano tipo 33, papilomavírus humano tipo 35, papilomavírus humano tipo 39, papilomavírus humano tipo 45, papilomavírus humano tipo 51, papilomavírus humano tipo 52, papilomavírus humano tipo 56, papilomavírus humano tipo 58, papilomavírus humano tipo 59, papilomavírus humano tipo 68, papilomavírus humano tipo 73, papilomavírus humano tipo 82, Vírus Linfotrópico de células T Humano Tipo 1, vírus da gripe humana, vírus da gripe humana B, vírus vaccinia, vírus da dengue.

[039] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o peptídeo derivado de vírus é selecionado a partir de NLVPMVATV (SEQ ID NO: 1), SLYNTVATL (SEQ ID NO: 2), GLCTLVAML (SEQ ID NO: 3), GILGFVFTL (SEQ ID NO: 4), STNRQSGRQ (SEQ ID NO: 5), LLFGYPVYV (SEQ ID NO: 6), FAEGFVRAL (SEQ ID NO: 7), LIVIGILIL (SEQ ID NO: 8), ou ILHTPGCV (SEQ ID NO: 9), WYAQIQPHW (SEQ ID NO: 52), AFSGVSWTM (SEQ ID NO: 53), ILIGVVITW (SEQ ID NO: 54), MMIPTVVAF (SEQ ID NO: 55), PFPQSNAPI (SEQ ID NO: 56), LLLTLLATV (SEQ ID NO: 57), IVLEHGSCV (SEQ ID NO: 58), LLFKTENGV (SEQ ID NO: 59), PLNEAIMAV (SEQ ID NO: 60), NLVRLQSGV (SEQ ID NO: 61), LVISGLFPV (SEQ ID NO: 62), LLLVAHYAI (SEQ ID NO: 63), LALLAAFKV (SEQ ID NO: 64), VILAGPMPV (SEQ ID NO: 65), HVLGRLITV (SEQ ID NO: 66), VTEHDTLLY (SEQ ID NO: 67), NTDFRVLEL (SEQ ID NO: 68), CVETMCNEY (SEQ ID NO: 69), VLEETSVML (SEQ ID NO: 70), NLVPMVATV (SEQ ID NO: 71), RIFAELEGV (SEQ ID NO: 72), IIYTRNHEV (SEQ ID NO: 73), VLAELVKQI (SEQ ID NO: 74), AVGGAVASV (SEQ ID NO: 75), TVRSHCVSK (SEQ ID NO: 76), IMREFNSYK (SEQ ID NO: 77), GPISHGHVLK (SEQ ID NO: 78), ATVQGQNLK (SEQ ID NO: 79), VYALPLKML (SEQ ID NO: 80), AYAQKIFKIL (SEQ ID NO: 81), QYDPVAALF (SEQ ID NO: 82), YVKVYLESF (SEQ ID NO: 83), DIYRIFAEL (SEQ ID NO: 84), VFETSGGLVV (SEQ ID NO: 85), KARDHLAVL (SEQ ID NO: 86), QARLTVSGL (SEQ ID NO: 87), KARAKKDEL (SEQ ID NO: 88), QIKVRVDMV (SEQ ID NO: 89), RRRHRQDAL (SEQ ID NO: 90), ARVYEIKCR (SEQ ID NO: 91), KMQVIGDQY (SEQ ID NO: 92), NVRRSWEEL (SEQ ID NO: 93), CPSQEPMSIYVY (SEQ ID NO: 94), KPGKISHIMLDVA (SEQ ID NO: 95), ELRRKMMYM (SEQ ID NO: 96), IPSINVHHY (SEQ ID NO: 97), FEQPTETPP (SEQ ID NO: 98), YAYIYTTYL (SEQ ID NO: 99), QEFFWDANDIY (SEQ ID NO: 100), YEQHKITSY (SEQ ID NO: 101), QEPMSIYVY (SEQ ID NO: 102), SEHPTFTSQY (SEQ ID NO: 103), QAIRETVEL (SEQ ID NO: 104), TRATKMQVI (SEQ ID NO: 105), DALPGPCI (SEQ ID NO: 106), CEDVPSGKL (SEQ ID NO: 107), HERNGFTVL (SEQ ID NO: 108), PTFTSQYRIQGKL (SEQ ID NO: 109), QMWQARLTV (SEQ ID NO: 110), HELLVLVKKAQL (SEQ ID NO: 111), ou DDYSNTHSTRYV (SEQ ID NO: 112), ou um variante deste que compreende de 1 a 3 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos.

[040] Em um exemplo de realização de todos os aspectos a β2- microglobulina é β2-microglobulina humana. Em um exemplo de realização, a β2-microglobulina é β2-microglobulina humana tipo selvagem. Em um exemplo de realização, a β2-microglobulina é constituída pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou é uma variante desta que compreende entre 1 e 10 trocas, adições e/ou deleções de aminoácidos.

[041] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, a β2- microglobulina é β2-microglobulina humana e a molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais é a HLA-A*0201 humana. Em um exemplo de realização os domínios extracelulares α1, α2 e α3 da molécula MHC de classe I consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou é uma variante desta compreendendo entre 1 e 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos.

[042] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o peptídeo derivado de vírus está fundido à β 2-microglobulina através de um primeiro peptídeo de ligação. Em um exemplo de realização, o peptídeo derivado do vírus está fundido com a extremidade N- terminal da β2- microglobulina.

[043] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, a β2- microglobulina está fundida com o domínio extracelular α1 de uma molécula MHC de classe I através de um segundo peptídeo de ligação.

[044] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, os domínios extracelulares α3 da molécula MHC de classe I está fundido a uma das cadeias polipeptídicas ligadas por ligações de dissulfeto, através de um terceiro peptídeo de ligação.

[045] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro, segundo e terceiro peptídeo de ligação é o mesmo ou é um peptídeo de ligação diferente.

[046] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro peptídeo de ligação, o segundo peptídeo de ligação, e o terceiro de ligação são selecionados independentemente um do outro a partir das sequências de aminoácidos: GS (SEQ ID NO: 12), GGS (SEQ ID NO: 13), GGGS (SEQ ID NO: 14), GGGSGGGS (SEQ ID NO: 15), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 16), GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 17), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 18), GGGGS (SEQ ID NO: 19), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 22), e GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23).

[047] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[048] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o segundo peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[049] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o terceiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[050] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo é selecionado a partir de um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de um anticorpo humano da classe IgG ou da classe IgE.

[051] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo é selecionado a partir de um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de um anticorpo humano da subclasse IgG1, ou IgG2, ou IgG3 ou IgG4.

[052] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo compreende ou é constituído pela sequência de aminoácidos EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 24), EPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 25), ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 26), ERKCAVECPPCP (SEQ ID NO: 27), ERKACVECPPCP (SEQ ID NO: 28), ELKTPLGDTTHTCPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)3 (SEQ ID NO: 29), ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 30), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 47), VECPPCP (SEQ ID NO: 48), AVECPPCP (SEQ ID NO: 49), DTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 50) ou PPCPSCP (SEQ ID NO: 51).

[053] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro polipeptídeo ligado por dissulfeto e/ou o segundo polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende um domínio CH2 e/ou um domínio CH3 de origem humana. Em um exemplo de realização o domínio CH2 e o CH3 de origem humana é de um anticorpo humano da classe IgG ou IgE. Em um exemplo de realização o domínio CH2 e CH3 é de um anticorpo humano da subclasse IgG1, ou IgG2, ou IgG3, ou IgG4. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 é de um anticorpo humano da subclasse IgG1 ou IgG2, e compreende pelo menos uma mutação em E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330 e/ou P331 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, o domínio CH2 é de um anticorpo humano da subclasse IgG1 ou da subclasse IgG2 humana com as mutações L234A e L235A e/ou as mutações D265A e N297A, e/ou contém a mutação PVA236, e/ou contém a mutação P329G. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 é de um anticorpo humano da subclasse IgG1 com as mutações L234A e L235A e/ou P329G. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 é de um anticorpo humano da subclasse IgG4 com a mutação S228P e/ou L235E. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33. Em um exemplo de realização, o domínio CH3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[054] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro peptídeo ligado por ligações de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, e o segundo peptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[055] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro e o segundo polipeptídeo ligado por ligações de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38.

[056] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro ou o segundo polipeptídeo ligado por ligação de dissulfeto consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38.

[057] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro peptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, e o segundo peptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[058] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, as cadeias polipeptídicas, que são ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto, estão ligadas por duas, ou três, ou quatro ligações de dissulfeto.

[059] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o complexo é caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende na direção N- para C-terminal: (i) um peptídeo derivado de vírus que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 9; (ii) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22, e 23; (iii) uma β2-microglobulina que possui sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou é uma variante desta que compreende de 1 a 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22, e 23; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 da molécula MHC de classe I que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou é uma variante desta compreendendo de 1 a 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos; e (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO: 12, 16, 17, 18, 21, 22 e 23. (vii)

[060] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o primeiro polipeptídeo ligado por ligação de dissulfeto e o segundo polipeptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreendem adicionalmente: (viii) um domínio CH2 da IgG1 humana, compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31, 32 e 33; e (ix) um domínio CH3 da IgG1 humana, compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 34, 35 e 36.

[061] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: (x) um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo derivado de vírus que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 9; (ii) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; (iii) uma β2-microglobulina que possui sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou é uma variante desta que compreende de 1 a 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 da molécula MHC de classe I que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou é uma variante desta compreendendo de 1 a 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos; e (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 12, 16, 17, 18, 21, 22 e 23; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 24 até SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NOs: 47-51; (iv) um domínio CH2 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31, 32 e 33; e (v) um domínio CH3 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 34, 35 e 36; em a segunda cadeia do polipeptídeo ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 24 até SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NOs: 47-51; (ii) um domínio CH2 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31, 32 e 33; e (iii) um domínio CH3 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 34, 35 e 36; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal da segunda cadeia polipeptídica ligada por ligação de dissulfeto.

[062] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, a primeira e segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende o mesmo polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo.

[063] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo derivado de vírus compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o primeiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, o segundo peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o terceiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o domínio CH2 de IgG1 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou 33, e o domínio CH3 de IgG1 humana de um polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e o domínio CH3 de IgG1 humana do outro polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[064] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo derivado de vírus que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 9; (ii) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; (iii) uma β2-microglobulina que possui sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou é uma variante desta que compreende de 1 a 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 da molécula MHC de classe I que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou é uma variante desta compreendendo de 1 a 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos; e (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 12, 16, 17, 18, 21, 22 e 23; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 24 até SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NOs: 47-51; (iv) um domínio CH2 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31, 32 e 33; e (v) um domínio CH3 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 34, 35 e 36; e a segunda cadeia polipeptídica ligado por dissulfeto compreende a região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 24 até SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NOs: 47-51; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal da primeira cadeia polipeptídica ligada por ligação de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[065] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo derivado de vírus compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o primeiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, o segundo peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o terceiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o domínio CH2 de IgG1 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou 33, e o domínio CH3 de IgG1 humana de um polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e o domínio CH3 de IgG1 humana do outro polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[066] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo derivado de vírus que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 9; (ii) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; (iii) uma β2-microglobulina que possui sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou é uma variante desta que compreende de 1 a 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 da molécula MHC de classe I que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou é uma variante desta compreendendo de 1 a 10 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos; e (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 12, 16, 17, 18, 21, 22 e 23; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira e segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 24 até SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NOs: 47-51; (iv) um domínio CH2 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31, 32 e 33; e; (v) um domínio CH3 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 34, 35 e 36; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal da segunda cadeia polipeptídica ligada por ligação de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[067] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o polipeptídeo derivado de vírus compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o primeiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, o segundo peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o terceiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o domínio CH2 de IgG1 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou 33, e o domínio CH3 de IgG1 humana de um polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e o domínio CH3 de IgG1 humana do outro polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[068] Em um exemplo de realização de todos os aspectos: - o primeiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e/ou - o segundo peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e/ou - o terceiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; e/ou - o domínio CH2 de IgG1 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou 33; e/ou - o domínio CH3 de IgG1 humana de um polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, e o domínio CH3 de IgG1 humana do outro polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[069] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, o peptídeo derivado de vírus é selecionado a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 52 até a SEQ ID NO: 112, ou uma variante destas que compreende de 1 a 3 alterações, adições e/ou deleções de aminoácidos.

[070] Um aspecto tal como divulgado na presente invenção é um ácido nucleico codificante do complexo, tal como divulgado na presente invenção.

[071] Em um exemplo de realização, o ácido nucleico compreende de dois a quatro cassetes de expressão compreendendo os genes estruturais que codificam polipeptídeos com diferentes sequências de aminoácidos.

[072] Um aspecto tal como divulgado na presente invenção é uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico tal como divulgado na presente invenção.

[073] Um aspecto tal como divulgado na presente invenção é um método para a produção de um complexo conforme divulgado no presente compreendendo o cultivo da célula hospedeira conforme divulgado no presente de modo a que o complexo seja produzido.

[074] Em um exemplo de realização, o complexo é recuperado a partir das células ou a partir do meio de cultura e, dessa forma, o complexo é produzido.

[075] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é um imunoconjugado compreendendo o complexo, tal como relatado na presente invenção e um agente citotóxico.

[076] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é uma formulação farmacêutica que compreende o complexo, conforme divulgado na presente invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

[077] Em um exemplo de realização, a formulação farmacêutica compreende ainda um agente terapêutico adicional.

[078] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é o complexo, tal como divulgado no presente, para a utilização como um medicamento.

[079] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é o complexo, tal como aqui relatado, para a utilização no tratamento do câncer ou de uma infecção viral crônica.

[080] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é o complexo, tal como divulgado no presente, para a utilização na atração de células T citotóxicas vírus-específicas para um alvo em um indivíduo.

[081] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é o complexo, tal como divulgado no presente, para a utilização na remoção de células de câncer ou células infectadas por vírus.

[082] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é o uso do complexo, tal como divulgado no presente, na fabricação de um medicamento.

[083] Em um exemplo de realização o medicamento é para o tratamento do câncer ou uma infecção viral crônica.

[084] Em um exemplo de realização o medicamento é para atrair células T citotóxicas vírus-específicas para um alvo em um indivíduo.

[085] Em um exemplo de realização o medicamento é para remoção de células cancerosas ou de células infectadas por vírus.

[086] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é um método de tratamento de um indivíduo com câncer ou infecção viral crônica, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do complexo divulgado na presente invenção.

[087] Em um exemplo de realização, o método compreende ainda a administração de um agente terapêutico adicional para o indivíduo.

[088] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é um método de atrair células T citotóxicas vírus-específicas de um indivíduo para um alvo no indivíduo, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do complexo divulgado na presente invenção para atrair as células T citotóxicas vírus-específicas do indivíduo para um alvo.

[089] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é um método para a remoção de células de câncer ou células infectadas por vírus em um indivíduo, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do complexo divulgado na presente invenção para remover/desintegrar células cancerosas ou células infectadas por vírus.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[090] Figura 1 Esquema anotado dos complexos, conforme divulgado na presente invenção.

[091] Figura 2 Polipeptídeos exemplificativos compreendidos no complexo, conforme divulgado na presente invenção: polipeptídeos de fusão foram fundidos na extremidade N-terminal a um polipeptídeo compreendendo a cadeia leve de anticorpo ou uma região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo.

[092] Figura 3 Western blot de um gel de SDS poliacrilamida do sobrenadante da cultura de células HEK 293 transfectadas com os plasmídeos de expressão correspondentes. A coloração foi realizada com anticorpo policlonal de coelho anti-cadeia leve-K humana conjugado com peroxidase e anticorpo policlonal de coelho anti-IgG humana conjugado com peroxidase de rábano.

[093] Pistas: 1: peptideo-β2-microglobulina-HLA-A0201-IgG-Fc de dois braços; 2: peptídeo-e2-microglobulina-HLA-A0201-IgG-Fc de um braço + IgG- Fc, 3: peptídeo β2-microglobulina-HLA-A0201-IgG-cadeia pesada de um braço + IgG-cadeia leve + IgG-Fc, 4: peptídeo β2-microglobulina-HLA-A0201-IgG-cadeia pesada de um braço + IgG-cadeia pesada + IgG-cadeia leve; 5: β2-microglobulina- HLA-A0201-IgG-cadeia leve de dois braços + IgG-cadeia pesada; 6: peptídeo-e2- microglobulina-HLA-A0201-IgG-cadeia leve de dois braços + IgG-cadeia pesada; 7: peptídeo-e2-microglobulina-HLA-A0201-IgG-cadeia pesada de dois braços + IgG- cadeia leve; 8: peptídeo-e2-microglobulina-HLA-A0201-IgG-Fc-scFv de dois braços; 9: peptídeo β2-microglobulina-HLA-A0201-IgG-Fc de um braço + IgG de um braço (cadeia pesada e leve); 10: marcador de peso molecular; 11: anticorpo IgG1 padrão de referência.

[094] Figura 4 Análise de citometria de fluxo para determinar o número de células T específica para CMV citolíticas a partir de diferentes doadores antes e depois da estimulação in vitro com o peptídeo específico: Análise dos linfócitos de sangue periférico (PBL) do doador humano 4; anticorpo anti-CD8 conjugado com o marcador FITC (BD, Cat. No. 345.772), conjugado com Pro5 pentâmero APC (ProImmune, Cat. No. F008-4A-E) corado TCR que reconhece MHC de classe I (HLA-A*0201) carregado com peptídeo derivado de CMV (NLVPMVATV, SEQ ID NO: 1); círculo: células-T CMV- específicas CD8+.

[095] Figura 5 Citometria de fluxo para analisar a capacidade citolítica de CTL estimuladas por meio da lise de células tumorais MN60 carregadas com peptídeo CMV.

[096] Figura 6 Remoção de células T específicas de células T pulsadas com CMV: Análise por citometria de fluxo para avaliar a capacidade citolítica de CTLs estimuladas por meio da lise de células tumorais MN60 carregadas com o peptídeo CMV dependendo da relação células efetoras / célula- alvo; preto: células MN60 carregadas com peptídeo CMV, branco: células MN60 não carregadas com peptídeo CMV.

[097] Figura 7 A: Gel de SDS-PAGE com coloração por Coomassie: Pista 1: padrão de peso molecular, pista 2: peptídeo β2- microglobulina-HLA-A0201-IgG-Fc de um braço + complexo IgG de um braço (cadeia leve e pesada), sob condições não redutoras, Pista 3: peptídeo β2- microglobulina-HLA-A0201-IgG-Fc de um braço + complexo IgG de um braço (cadeia leve e pesada), condições de redução.

[098] B: cromatograma da cromatografia por exclusão de tamanho, 1: formas de alto peso molecular (0,7 área%); 2: complexo monomérico (99,3% área%).

[099] Figura 8 A: Gel de SDS-PAGE com coloração por Coomassie: Pista 1: padrão de peso molecular, pista 2: peptídeo β2-microglobulina-HLA-A0201- IgG-cadeia pesada de um braço + IgG cadeia leve + IgG- complexo Fc sob condições não redutoras, Pista 3: peptídeo β2-microglobulina-HLA-A0201-IgG-cadeia pesada de um braço + IgG-cadeia leve + IgG- complexo Fc, condições de redução.

[0100] B: cromatograma da cromatografia por exclusão de tamanho, 1: formas de alto peso molecular (1,8 área%); 2: complexo monomérico (99,3% área%).

[0101] Figura 9 Análise da ligação de um complexo tal como divulgado no presente para a linhagem de células humanas IGF-1R positivas usando FACS; 1: células H460M2 incubadas com peptídeo β2-microglobulina- HLA-A0201-IgG-cadeia pesada de um braço + IgG-cadeia leve + IgG- complexo Fc, não coradas; 2: células H460M2 incubadas com peptídeo β2-microglobulina- HLA-A0201-IgG-cadeia pesada de um braço + IgG-cadeia leve + IgG- complexo Fc a 4°C, coradas usando anticorpo anti<IgG humana> fluorescentemente marcado; 3: células H460M2 incubadas com peptídeo β2-microglobulina- HLA-A0201-IgG-cadeia pesada de um braço + IgG-cadeia leve + IgG- complexo Fc a 37 °C, coradas usando anticorpo anti<IgG humana> fluorescentemente marcado; 4: células H460M2 incubadas com peptídeo β2-microglobulina- HLA-A0201-IgG-cadeia pesada de um braço + IgG-cadeia leve + IgG- complexo, coradas usando anticorpo (anticorpo anti-DIG) fluorescentemente marcado; 5: células H460M2 coradas com o anticorpo anti-IgG humana fluorescentemente marcado; 6: células H460M2 coradas com o anticorpo anti-IGF-1R humano fluorescentemente marcado.

[0102] Figura 10 Imagem obtida por microscopia do complexo de ligação ao antígeno conforme divulgado na presente invenção pela lise mediada por células I24 3T3 humanas expressando IGF-1R (grandes células crescendo de modo aderente, seta branca). A lise é mediada por células T humanas específicas para CMV (pequenas células em forma redonda - setas brancas, ou células ameboides que migram, seta preta).

[0103] Figura 11 Imagem obtida por microscopia de células I24 3T3 (células grandes cresenco de modo aderente, seta branca) incubadas com células T humanas específicas para CMV (células pequenas, em forma arredondada - seta branca, ou células migratórias ameboides, seta preta), na ausência de um complexo tal como divulgado na presente invenção.

[0104] Figura 12 Ensaio de citotoxicidade: complexo de ligação ao antígeno, tal como divulgado na presente invenção desencadeia a lise de células tumorais H460M2 através das células-T humanas específicas para CMV. a) (6h) Células-alvo: células T efetoras específicas para CMV 1:1,5; b) (6h), células-alvo: células T efetoras específicas para CMV 1:0,75; c) (6h) Células-alvo: células T efetoras específicas para CMV 1:0,5; barra da esquerda: complexo tal como divulgado na presente invenção, barra da direita: mAb IGF-1R-afucosilado.

[0105] Figura 13 Ensaio de citotoxicidade: complexo de ligação ao antígeno, tal como divulgado na presente invenção desencadeia a lise de células tumorais I24 3T3 através das células-T humanas específicas para CMV. a) (9h) Células-alvo: células T efetoras específicas para CMV 1:1,5; b) (9h) Células-alvo: células T efetoras específicas para CMV 1:0,75; c) (9h) Células-alvo: células T efetoras específicas para CMV 1:0,5; barra da esquerda: complexo tal como divulgado na presente invenção; barra do meio: mAb IGF-1R-afu, barra da direita: mAb ed; barra da direita: anticorpo anti-digoxigenina.

[0106] Figura 14 Análise FACS da ligação do anticorpo anti-IGF- 1R e complexos tal como divulgado na presente invenção para a linhagem de células de adenocarcinoma de pulmão H460M2; a) apenas anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-IgG humana (H + L) (Jackson Laboratories, Cat. # 109-116 -088)); b) complexo tal como divulgado na presente invenção, em que o polipeptídeo de fusão está fundido com o N-terminal da cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-1R compreendendo apenas um par de domínios variáveis; c) anticorpo anti-IGF-1R.

[0107] Figura 15 Eficácia e especificidade in vitro (ensaio de citotoxicidade) de diferentes complexos, tal como divulgado na presente invenção; a) complexo compreendendo um anticorpo anti-IGF1R monovalente e um peptídeo derivado de CMV, b) complexo compreendendo um anticorpo anti-IGF1R monovalente e um peptídeo derivado de EBV (controle); c) complexo compreendendo um anticorpo anti-IGF1R bivalente e um peptídeo derivado de CMV; d) anticorpo anti-IGF-1R (controle); e) anticorpo anti- digoxigenina (controle).

[0108] Figura 16 Eficácia e especificidade in vitro (valor de EC50) de um complexo tal como divulgado na presente invenção, em que o polipeptídeo de fusão está fundido com a extremidade N-terminal da cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-1R completo determinado nas relações alvo diferente (T) para célula efetora (E).

[0109] Figura 17 Lise de células-alvo após 6 horas de incubação com: a) um complexo que compreende um anticorpo anti-IGF1R monovalente e um polipeptídeo de fusão compreendendo um peptídeo derivado do CMV; e b) um anticorpo anti-IGF-1R a uma relação de alvo para células efetoras de 1:1,5.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0110] SEQ ID NO: 1: Peptídeo derivado do citomegalovírus humano.

[0111] SEQ ID NO: 2: Peptídeo derivado do vírus do imunodeficiência humana.

[0112] SEQ ID NO: 3: Peptídeo derivado do herpesvírus 4 humano.

[0113] SEQ ID NO: 4: peptídeo derivado do vírus Influenza A.

[0114] SEQ ID NO: 5: Peptídeo derivado do vírus da Hepatite-B.

[0115] SEQ ID NO: 6: Peptídeo derivado do vírus linfotrópico de células T humano tipo 1.

[0116] SEQ ID NO: 7: Peptídeo derivado do oncogene homólogo do vírus do Sarcoma V-jun 17.

[0117] SEQ ID NO: 8: Peptídeo derivado do adenovírus humano tipo 3.

[0118] SEQ ID NO: 9: Peptídeo derivado do vírus da Hepatite-C.

[0119] SEQ ID NO: 10: Sequência de aminoácidos da β2- microglobulina Humana.

[0120] SEQ ID NO: 11: Sequência de aminoácidos da cadeia αl- α3 HLA-A*0201 Humana.

[0121] SEQ ID NO: 12-23: Sequências de aminoácidos do peptídeo de ligação.

[0122] SEQ ID NO: 24: Sequência de aminoácidos do polipeptídeo da dobradiça da cadeia pesada de IgG1 humana.

[0123] SEQ ID NO: 25: Sequência de aminoácidos do polipeptídeo variante da dobradiça da cadeia pesada de IgG1 humana.

[0124] SEQ ID NO: 26: Sequência de aminoácidos do polipeptídeo da dobradiça da cadeia pesada de IgG2 humana.

[0125] SEQ ID NO: 27: Sequência de aminoácidos do polipeptídeo variante da dobradiça da cadeia pesada de IgG2 humana.

[0126] SEQ ID NO: 28: Sequência de aminoácidos do polipeptídeo variante da dobradiça da cadeia pesada de IgG2 humana.

[0127] SEQ ID NO: 29: Sequência de aminoácidos do polipeptídeo da dobradiça da cadeia pesada de IgG3 humana.

[0128] SEQ ID NO: 30: Sequência de aminoácidos do polipeptídeo da dobradiça da cadeia pesada de IgG4 humana.

[0129] SEQ ID NO: 31: Sequência de aminoácidos do domínio CH2 de IgG1 humana.

[0130] SEQ ID NO: 32: Sequência de aminoácidos do domínio CH2 de IgG1 humana com mutações L234A, L235A.

[0131] SEQ ID NO: 33: Sequência de aminoácidos do domínio CH2 de IgG1 humana com mutações L234A, L235A e P329G.

[0132] SEQ ID NO: 34: Sequência de aminoácidos do domínio CH3 de IgG1 humana.

[0133] SEQ ID NO: 35: Sequência de aminoácidos variante do domínio knob CH3 de IgG1 humana.

[0134] SEQ ID NO: 36: Sequência de aminoácidos variante do domínio hole CH3 de IgG1 humana.

[0135] SEQ ID NO: 37: Sequência de aminoácidos da região Fc da IgG1 humana.

[0136] SEQ ID NO: 38: Sequência de aminoácidos da região Fc da IgG1 humana com mutações L234A, L235A.

[0137] SEQ ID NO: 39: Sequência de aminoácidos da região Fc da IgG1 humana com mutações L234A, L235A e cadeia variante hole.

[0138] SEQ ID NO: 40: Sequência de aminoácidos da região Fc da IgG1 humana com mutações L234A, L235A e cadeia variante knob.

[0139] SEQ ID NO: 41: Sequência de aminoácido da cadeia leve do anticorpo monoclonal humanizado anti-IGF-1R (kappa).

[0140] SEQ ID NO: 42: Sequência de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humanizado anti-IGF-1R (IgG1 mutante; L234A, L235A).

[0141] SEQ ID NO: 43: Sequência de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humanizado anti-IGF-1R (IgG1 mutante; L234A, L235A e variante knob).

[0142] SEQ ID NO: 44: Sequência de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humanizado anti-IGF-1R (IgG1 mutante; L234A, L235A e variante hole).

[0143] SEQ ID NO: 45: região de dobradiça mutante da região Fc de IgG1 humana e mutante L234A, L235A e variante knob.

[0144] SEQ ID NO: 46: Fv de cadeia única estabilizada por ligações de dissulfeto do anticorpo monoclonal anti-IGF-1R humanizado.

[0145] SEQ ID NO: 47-51: Sequência de aminoácidos do polipeptídeo da dobradiça da cadeia pesada do anticorpo humano encurtado.

[0146] SEQ ID NO: 52-66: Peptídeos derivados do vírus da dengue.

[0147] SEQ ID NO: 67-112: Peptídeos derivados do citomegalovírus humano. I. DEFINIÇÕES

[0148] “Afinidade” refere-se, em geral, à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Exemplos de realização específicos ilustrativos e exemplares para mensurar a afinidade de ligação são descritos a seguir.

[0149] O termo “aminoácido” conforme utilizado no presente pedido indica o grupo de a-aminoácidos carboxi, que diretamente ou sob a forma de um precursor podem ser codificados por um ácido nucleico. Os aminoácidos individuais são codificados por ácidos nucleicos que consistem de três nucleotídeos, denominados de códons ou tripletos de bases. Cada aminoácido é codificado por pelo menos um códon. Isto é conhecido como “degenerescência do código genético”. O termo “aminoácido” conforme utilizando neste pedido indica o grupo de a-aminoácidos carboxi de ocorrência natural compreendendo alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cis, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutâmico (Glu, E), glicina (Gli, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lis, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Fen, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Tre, T ), triptofano (Trp, W), tirosina (Tir, Y) e valina (Val, V).

[0150] As expressões “anticorpo anti-alvo” e “um anticorpo que se liga ao alvo” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar ao alvo com afinidade suficiente para que o anticorpo se torne útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento ao alvo. Em certos exemplos de realização, um anticorpo que se liga ao alvo tem uma constante de dissociação (Kd) < 10 nM; < 1 nM; < 0,1 nM; < 0,01 nM; ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos; por exemplo, a partir de 10-8 M até 10-13 M; por exemplo, a partir de 10-9 M até 10-13 M).

[0151] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diversas estruturas de anticorpo, incluindo mas não se limitando a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.

[0152] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno para o qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia simples (por exemplo, scFv), anticorpos de domínio simples, e anticorpos multiespecífico formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[0153] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída pela sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de α, δ, ε, Y, e μ, respectivamente.

[0154] O termo “molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de” indica que a respectiva molécula MHC de classe I tem uma frequência de ocorrência em uma população específica de seres humanos ou dentro de todos os seres humanos de uma determinada frequência relativa. Assim, uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais, podem ser encontrada em 10% ou mais de todos os seres humanos de uma população específica, como por exemplo, em 27,2% de todos os seres humanos de origem Europeia.

[0155] A “conjugação” de um complexo com seu parceiro de conjugação pode ser realizada por diferentes métodos, como a ligação química, ou ligação por meio de um par de ligação específico. O termo “parceiro de conjugação” indica, por exemplo, polipeptídeos marcadores detectáveis, membros de pares de ligação específicos. Em um exemplo de realização, a conjugação de um complexo com seu parceiro de conjugação é realizada pela ligação química através da extremidade N-terminal e/ou grupos ε-amino (lisina), grupos ε-amino de diferentes grupos funcionais lisina, carboxi, sulfidrila, hidroxila, e/ou fenólicos da sequência de aminoácidos das partes do complexo, e/ou grupos álcool açúcar da estrutura de carboidrato do complexo. Em um exemplo de realização, o complexo é conjugado com o seu parceiro de conjugação por meio de um par de ligação específica.

[0156] A expressão “agente citotóxico”, da forma como é utilizada no presente refere-se a uma substância que inibe ou previne a função celular e/ou causa a destruição ou morte celular. Os agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, P212 e isótopos radioativos de Lu), drogas ou agentes quimioterápicos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentes intercalantes), agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos destes como, por exemplo, enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas como, por exemplo, pequenas moléculas de toxina ou toxinas ezimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos ou variantes destas; e os diversos agentes antitumorais ou anticâncer.

[0157] Cromógenos (grupos e corantes e fluorescentes ou luminescentes), enzimas, grupos RMN-ativos ou partículas metálicas, haptenos, por exemplo, digoxigenina, são exemplos de “marcadores detectáveis”. O marcador detectável também pode ser um grupo de reticulação fotoativável, por exemplo, um grupo azida ou azirina. Quelatos de metais que podem ser detectados por eletroquimioluminescência também são grupos emissores de sinal adequados, com particular interesse aos quelatos de rutênio, por exemplo, um quelato de rutênio (bispiridila)32+. Grupos de marcação com rutênio adequados são descritos, por exemplo, na EP 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 e WO 92/14138. Para a detecção direta do grupo de marcação, qualquer grupo de marcador detectável conhecido pode ser selecionado a partir de corantes, grupos luminescentes de marcação, tal como grupos quimiluminescentes, por exemplo, ésteres de acridinio ou dioxetanos, ou corantes fluorescentes, por exemplo, fluoresceína, rodamina, cumarina, oxazina, resorufina, cianina e seus derivados. Outros exemplos de grupos de marcação são complexos metálicos luminescentes, tais como complexos de európio, enzimas, por exemplo, como aquelas utilizados no ELISA ou para CEDIA (Imunoensaio com Doador Clonado de Enzima, por exemplo, EP-A-0 061 888) e radioisótopos.

[0158] “Funções efetoras” referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação do C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B), e ativação de células B.

[0159] Uma “quantidade eficaz” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado.

[0160] O termo “expressão”, conforme utilizado no presente, refere-se a transcrição e/ou tradução e processos de secreção que ocorrem dentro de uma célula. O nível de transcrição de uma sequência de ácido nucleico de interesse em uma célula pode ser determinado com base na quantidade de mRNA correspondente que está presente na célula. Por exemplo, o mRNA transcrito a partir de uma sequência de interesse pode ser quantificado por RT-PCR ou por hibridação Northern (vide Sambrook et al, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989)). Os polipeptídeos codificados por um ácido nucleico podem ser quantificados por vários métodos, por exemplo, por ELISA, pela avaliação da atividade biológica do polipeptídeo, ou empregando ensaios que são independentes de tal atividade, tais como radioimunoensaio ou Western blotting, usando as imunoglobulinas que reconhecem e se ligam ao polipeptídeo (vide Sambrook, et al., (1989), supra).

[0161] Um “cassete de expressão” indica uma construção que contém os elementos regulatórios necessários, tais como o promotor e o sítio de poliadenilação, para a expressão de, pelo menos, o ácido nucleico contido em uma célula.

[0162] O termo “maquinaria de expressão” indica a soma de enzimas, cofatores, etc, de uma célula que está envolvida nas etapas iniciando com a etapa de transcrição de um gene ou ácido nucleico (ou seja, também denominada de “maquinaria de expressão gênica”) até a modificação pós- traducionais do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico. A maquinaria de expressão compreende, por exemplo, as etapas de transcrição do DNA em pré-mRNA, splicing do pré-mRNA em mRNA maduro, a tradução do mRNA em um polipeptídeo, e a modificação pós-traducional do polipeptídeo.

[0163] Um “plasmídeo de expressão” é um ácido nucleico que fornece todos os elementos necessários para a expressão do(s) gene(s) estrutural(ais) compreendido(s) em uma célula hospedeira. Normalmente, um plasmídeo de expressão compreende uma unidade de propagação plasmidial procariótica, por exemplo, para E. coli, compreendendo uma origem de replicação e um marcador selecionável, um marcador de seleção eucariótico, e um ou mais cassetes de expressão para a expressão do(s) gene(s) estrutural(ais) de interesse, cada um compreendendo um promotor, um gene estrutural, e um terminador da transcrição, incluindo um sinal de poliadenilação. A expressão do gene é normalmente colocada sob o controle de um promotor, e tal gene estrutural é referido como “operacionalmente ligado” ao promotor. De modo semelhante, um elemento regulador (ou regulatório) e um promotor mínimo (core promoter) estão operacionalmente ligados se o elemento regulador modula a atividade do promotor mínimo.

[0164] O termo “região-Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos um porção constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em um exemplo de realização, uma região-Fc de cadeia pesada da IgG humana se estende a partir da Cis226, ou desde a Pro230, até a extremidade carbóxi-terminal da cadeia pesada. No entanto, a lisina C- terminal (Lis447) de Região-Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região-Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, tal como descrito em Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

[0165] Uma “região Fc” é um termo bem conhecido e definido com base na clivagem de uma cadeia pesada de anticorpo pela papaína. Os complexos conforme divulgado na presente invenção podem compreender em um exemplo de realização como polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo uma região-Fc humana ou uma região-Fc derivada de origem humana. Em um exemplo de realização adicional, a região-Fc é uma região-Fc de um anticorpo humano da subclasse IgG4, ou uma região-Fc de um anticorpo humano da subclasse IgG1, IgG2 ou IgG3 , que é modificada de tal maneira que nenhuma ligação a um receptor FCY (por exemplo, FcyRIIIa) e/ou nenhuma ligação ao C1q possa ser detectada. Em um exemplo de realização, a região-Fc é uma região-Fc humana e, especialmente, de qualquer subclasse de IgG4 humana ou uma região-Fc mutada a partir da subclasse IgG1 humana. Em um exemplo de realização, a região-Fc é da subclasse IgG1 humana com as mutação L234A e L235A. Enquanto a IgG4 exibe uma ligação ao receptor FCY (FcyRIIIa) reduzida, anticorpos das outras subclasses de IgG exibem forte ligação. No entanto os resíduos Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (perda de carboidratos Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gli236, Gli237, Ile253, Ser254, Lis288, Tre307, Gln311, Asn434, e/ou His435 são resíduos que, se alterados, também fornecem ligação reduzida ao receptor FCY (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0307434). Em um exemplo de realização, um complexo tal como divulgado na presente invenção é em relação à ligação ao receptor FCY da subclasse IgG4 ou subclasse IgG1 ou IgG2, com uma mutação L234, L235, e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236. Em um exemplo de realização, as mutações são S228P, L234A, L235A, L235E, e/ou PVA236 (PVA236 significa que a sequência de aminoácidos ELLG (dada como o código de aminoácido de uma letra) a partir da posição de aminoácido 233 até 236 da IgG1 ou EFLG de IgG4 é substituída por PVA). Em um exemplo de realização as mutações são S228P da IgG4, e L234A e L235A da IgG1. A região-Fc de um anticorpo está diretamente envolvida na ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo) e CDC (citotoxicidade dependente de complemento). Um complexo que não se liga ao receptor Fy e/ou ao fator C1q do sistema complemento não suscita a citotoxicidade celular dependente de anticopo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[0166] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de células hospedeiras”, e “cultura de células hospedeiras” são usados de modo alternado e referem-se células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que inclui a célula transformada primária e a progênie derivada desta célula sem levar em conta o número de passagens. As células descendentes (progênie) podem não ser totalmente idênticas quanto ao conteúdo de ácido nucleico da célula-mãe (célula parental), podendo conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção.

[0167] O termo “célula” inclui tanto células procarióticas, que são usadas para a propagação de plasmídeos, como células eucarióticas, que são usadas para a expressão de um ácido nucleico. Em um exemplo de realização, a célula eucariótica é uma célula de mamifero. Em um exemplo de realização, a célula de mamífero é selecionada a partir do grupo de células de mamíferos que compreende células CHO (por exemplo, CHO K1, CHO DG44), células BHK, células NS0, células Sp2/0, células HEK 293, células HEK 293 EBNA, células PER.C6® e células COS.

[0168] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou é derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno.

[0169] Um “imunoconjugado” indica um complexo de conjugado, conforme divulgado na presente invenção, para uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, mas não se limitando a, um agente citotóxico.

[0170] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos tal como macacos), e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em determinados exemplos de realização, o indivíduo ou sujeito é um humano.

[0171] Um complexo “isolado” é aquele que foi separada de um componente a partir de seu ambiente natural. Em alguns exemplos de realização, um complexo é purificada em mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, SDS- PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou por cromatografia (por exemplo, de troca iônica ou HPLC de fase reversa).

[0172] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada a partir de um componente do seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente possuem a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomalmente ou em um local cromossômico que é diferente da sua localização cromossômica natural.

[0173] O termo “um polipeptídeo de fusão” significa exatamente um polipeptídeo de fusão conforme definido e exclui a presença de um polipeptídeo de fusão adicional, tal como definido. O termo “um” indica “exatamente um” ou “um único”.

[0174] “Operacionalmente ligado” refere-se à uma justaposição de dois ou mais componentes, em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permitem funcionar na forma desejada. Por exemplo, um promotor e/ou facilitador (enhancer) está operacionalmente ligado a uma sequência codificante, se ele age em cis para controlar ou modular a transcrição da sequência ao qual está ligado. Geralmente, mas não necessariamente, as sequências de DNA que estão “operacionalmente ligadas” são contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codificantes de proteína, tal como um líder de secreção e um polipeptídeo, são contíguas e dentro do quadro (de leitura). Entretanto, apesar de um promotor operacionalmente ligado esteja geralmente localizado a montante da sequência codificante, ele não está necessariamente contíguo com ela. Os facilitadores (enhancers) não precisam ser contíguos. Um enhancer está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se o enhancer aumenta a transcrição da sequência codificante. Os enhancers operacionalmente ligados podem estar localizados a montante, dentro ou a jusante das sequências codificantes, e a uma distância considerável a partir do promotor. Um sítio de poliadenilação está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se estiver localizado na extremidade a jusante da sequência codificante de tal modo que a transcrição continua através da sequência codificante para a sequência de poliadenilação. Um códon de terminação da tradução está operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico exônica se ele estiver localizado na extremidade a jusante (extremidade 3') da sequência codificante de tal modo que a tradução prossegue através da sequência codificante até o códon de parada e termina neste local. A ligação é conseguida por métodos recombinantes conhecidos no estado da técnica, por exemplo, utilizando a metodologia da PCR e/ou pela ligação em sítios de restrição convenientes. Se os sítios de restrição convenientes não existirem, então adaptadores oligonucleotídicos sintéticos ou ligantes são utilizados de acordo com a prática convencional.

[0175] O termo "bula" da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.

[0176] O termo “peptídico ligante” denota sequências de aminoácidos de origem natural e/ou sintética. Eles consistem de uma cadeia de aminoácidos linear, em que os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente são os blocos de construção monoméricos. O peptídeo de ligação tem um comprimento de 1-50 aminoácidos, em um exemplo de realização possui entre 1 e 28 aminoácidos, em outro exemplo de realização possui entre 2 e 25 aminoácidos. O peptídeo de ligação pode conter sequências de aminoácidos repetitivas ou sequências de polipeptídeos que ocorrem naturalmente. O ligante tem a função de garantir que os polipeptídeos conjugados entre si possam realizar a sua atividade biológica, permitindo que os polipeptídeos se enovelem corretamente e sejam apresentados de forma adequada. Em um exemplo de realização, o peptídeo de ligação é rico em resíduos de glicina, glutamina e/ou serina. Estes resíduos estão dispostos, por exemplo, em pequenas unidades repetitivas de até cinco aminoácidos, tais como GS (SEQ ID NO: 12), GGS (SEQ ID NO: 13), GGGS (SEQ ID NO: 14) e GGGGS (SEQ ID NO: 19). Esta pequena unidade repetitiva pode ser repetida de uma à cinco vezes. Nas extremidades amino e/ou carboxi-terminal da unidade multimérica podem ser adicionados até seis aminoácidos arbitrários adicionais de ocorrência natural. Outros ligantes peptídicos sintéticos são constituídos por um único aminoácido, que é repetido entre 10 a 20 vezes e pode compreender na extremidade amino-terminal e/ou carboxi-terminal até seis aminoácidos arbitrários adicionais de ocorrência natural. Todos os ligantes peptídicos podem ser codificados por uma molécula de ácido nucleico e, portanto, podem ser expressos de forma recombinante. Como os ligantes são ele próprios peptídeos, o polipeptídeo conectado pelo ligante é ligado ao ligante por meio de uma ligação peptídica que é formada entre dois aminoácidos.

[0177] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permita que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido no presente seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação deveria ser administrada.

[0178] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica que não é o ingrediente ativo, e que não é tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, um excipiente, um estabilizante ou conservante.

[0179] Um “polipeptídeo” é um polímero consistindo de aminoácidos unidos por ligações peptídicas, seja ele produzido naturalmente ou sinteticamente. Os polipeptídeos menores do que cerca de 25 resíduos de aminoácidos podem ser referidos como “peptídeos”, ao passo que as moléculas compostas por dois ou mais polipeptídeos, ou compreendendo um polipeptídeo com mais de 100 resíduos de aminoácidos podem ser referidas como “proteínas”. Um polipeptídeo pode também compreender componentes não aminoácidos, tais como grupos de carboidratos, íons metálicos, ou ésteres de ácidos carboxílicos. Os componentes não aminoácidos podem ser adicionados pela célula na qual o polipeptídeo é expresso, e pode variar com o tipo de célula. Polipeptídeos são definidos na presente invenção em termos de sua estrutura principal ou central de aminoácidos ou do ácido nucleico que codifica a mesma. Adições como grupos de carboidratos geralmente são não especificadas, entretanto, podem estar presentes.

[0180] Um “gene estrutural” denota a região de um gene sem uma sequência de sinal, ou seja, a região codificante.

[0181] O termo “peptídeo que suscita uma resposta de células T” significa um peptídeo que é apresentado no sulco de ligação ao peptídeo de um complexo MHC de classe I e que é reconhecido pelas células-T efetoras de memória circulantes. O reconhecimento do peptídeo resultada em uma resposta imune que realiza a remoção da célula apresentadora de tal ‘peptídeo - complexo MHC de classe I’.

[0182] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações como “tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo que está sendo tratado, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado doentio, e remissão ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença, ou para retardar a progressão de uma doença.

[0183] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere- se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo, que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo possuem geralmente estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FR) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo , Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman & Co., N.Y. (2007), página 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para pesquisar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628).

[0184] O termo “vetor”, da forma utilizada na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual ele está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico de auto-replicação, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos na presente invenção como “vetores de expressão”.

II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS A. COMPLEXOS EXEMPLARES

[0185] É divulgado na presente invenção um complexo de ligação ao antígeno compreendendo como primeira parte uma parte derivada de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo, e como segunda parte um peptídeo derivado de vírus ligado à uma da proteína do complexo MHC de classe I.

[0186] Com o complexo conforme divulgado na presente invenção as células T citotóxicas circulantes vírus-específicas (células T de memória e/ou células T efetoras) de um indivíduo podem ser direcionadas para as células que expressam o antígeno alvo, para que parte o anticorpo derivado de parte do complexo se ligue especificamente, endereçando estas células com complexos MHC de classe I mimetizando uma infecção viral aguda.

[0187] Em um aspecto, a invenção é baseada, em parte, na constatação de que um complexo, tal como divulgado na presente invenção, que compreende como primeira parte um peptídeo derivado de vírus ligada à uma proteína MHC de classe I, e como segunda parte uma molécula de anticorpo derivado ligada por dissulfeto, pode ser usado para direcionar as células T citotóxicas vírus-específicas existentes de um indivíduo para as células que expressam um antígeno alvo mimetizando uma infecção viral aguda e, dessa forma, a remoção das células que expressam o antígeno alvo pode ser iniciada.

[0188] Em determinados exemplos de realização, é fornecido um complexo que compreende um polipeptídeo de fusão compreendendo (i) um peptídeo derivado de vírus; (ii) o alelo HLA-A*0201 solúvel; e (iii) a beta-2- microglobulina.

[0189] Os complexos da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de diversas doenças como o câncer ou infecções virais.

[0190] Em um aspecto, a invenção provê polipeptídeos de fusão que se ligam a: (i) um antígeno da superfície celular; e (ii) às células T citotóxicas. Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos de fusão se ligam ao antígeno de superfície celular com uma afinidade <. 10 nM.

[0191] Os complexos conforme divulgado na presente invenção exploram uma resposta imune antiviral que ocorre naturalmente, altamente eficaz na remoção/ desintegração de células-alvo, por exemplo, células tumorais ou células infectadas por vírus. A remoção de células é conseguida pelo uso de potentes células T circulantes do próprio indivíduo, e que não precisam de qualquer coestimulação para a ativação. Além disso, um pequeno número de moléculas terapêuticas é necessário sobre a superfície celular para o mecanismo de ação (Mottez et al., 1995).

[0192] Durante o tratamento, o polipeptídeo de fusão pode desencadear a resposta imune antiviral do indivíduo semelhante a uma imunização e, desse modo, aumentar a eficácia de múltiplos tratamentos/aplicações.

[0193] Embora apenas uma população limitada de pacientes é específica para o alótipo (alótipo HLA-A: 30% a 50% da população com alelo A*0201) e a prevalência das infecções virais específicas também é limitada (infecção por CMV de 60% a 90% dependendo principalmente da idade) uma imunização como pré-tratamento pode ser utilizada a fim de aumentar a eficácia.

[0194] Alternativamente, pode ser usado um alótipo cuja frequência na população é muito baixa, em um exemplo de realização, inferior a 1%. O uso de tal alótipo pode tornar a utilização de uma etapa de imunização obsoleta, pois o alótipo será reconhecido pelo sistema imunitário do indivíduo como estranho e uma resposta imune será iniciada.

[0195] O anticorpo alvo precisa de ser altamente celular ou antígeno-específico para limitar a toxicidade e efeitos colaterais.

[0196] Assim, por meio de um complexo, conforme divulgado na presente invenção: (i) apenas uma população de células T altamente específicas é ativada (células efetoras/memória CD8 positivas específicas para um único complexo MHC-peptídeo), todas as outras células CD3+ não são afetadas (células T CD4+: TH1, TH2, TH17, células-T reguladoras); (ii) a resposta natural do sistema imune do indivíduo é mimetizada (remoção normal das células infectadas por vírus); e (iii) a resposta ao pedido será baixa no início, mas pode intensificar durante o tratamento (células T específicas serão ativadas e ocorrerá a expansão em número) inicialmente com as mesmas reações de infusão e a liberação inicial de citocinas pode ser reduzida.

[0197] Em um exemplo de realização, o método compreende a etapa de estimular células T citotóxicas CD8 positivas pela aplicação de um peptídeo vírus-derivado selecionado, por exemplo, a partir de um peptídeo derivado do citomegalovírus humano (HCMV).

[0198] Tem sido demonstrado que células T específicas para o peptídeo CMV ativas poderiam mediar a remoção de células tumorais in vitro de maneira eficaz (células tumorais carregadas com o peptídeo derivado do CMV in vitro).

[0199] As células infectadas por vírus apresentam peptídeos derivados do vírus com proteínas MHC de classe I sobre suas superfícies celulares. Estes são reconhecidos por células T CD8+ específicas que removem/depletam as células apresentadoras. Células-T citolíticas (citotóxicas) CD8+ (CTL) reconhecem peptídeos em proteínas MHC de classe I por seus receptores específicos de célula T. As CTLs desencadeiam a remoção de células infectadas com vírus sem a necessidade de um sinal coestimulante.

[0200] As células efetoras, por exemplo, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou células-T CD8+ separadas por FACS, que pode ser pré-estimuladas com o peptídeo derivado do CMV, tal como compreendido no polipeptídeo de fusão divulgado na presente invenção, podem ser usadas.

[0201] O alótipo HLA de um indivíduo a ser tratado deve ser reconhecido.

[0202] De acordo com o NCBI os alótipos HLA com uma frequência de 10% ou mais estão distribuídos conforme é mostrado na tabela a seguir: TABELA

[0203] Assim, um aspecto tal como divulgado na presente invenção é um complexo de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de compreender: - um único polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C-terminal; ambos (i) uma β2-microglobulina; e (ii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa inferior a 10%; ou (i) um peptídeo que suscita uma resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; e (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais, e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, e (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; e a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligação de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0204] Em um exemplo de realização o polipeptídeo de fusão que compreende, na direção N-terminal para C-terminal, uma β2-microglobulina e os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I, com uma frequência relativa inferior a 1%, compreende adicionalmente na sua extremidade N-terminal um peptídeo de ligação ao sulco de ligação ao peptídeo-MHC. Em um exemplo de realização, o peptídeo é um peptídeo que suscita uma reposta de célula-T.

[0205] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; ambos (i) uma β2-microglobulina; e (ii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa inferior a 10%; ou (i) um peptídeo que suscita resposta de células T; (ii) uma β2-microglobulina; e (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, e (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; e a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0206] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de células T; (ii) uma β2-microglobulina; e (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (I) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1); ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; - m que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; - a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0207] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; e (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1), ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; e a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0208] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; e (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1); ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; e o segundo polipeptídeo ligado por dissulfeto compreendem, na direção N- para C-terminal, um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo, região constante da segunda cadeia pesada de imunoglobulina (CH2), e uma região constante da terceira cadeia pesada de imunoglobulina (CH3); em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0209] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; e (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais, e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1), ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo, e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; em a segunda cadeia do polipeptídeo ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1); ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo, e (iii) uma região constante da segunda cadeia pesada de imunoglobulina (CH2), e uma região constante da terceira cadeia pesada de imunoglobulina (CH3); em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0210] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; e (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1), ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; em a segunda cadeia do polipeptídeo ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1), ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) uma região constante da segunda cadeia pesada de imunoglobulina (CH2), e uma região constante da terceira cadeia pesada de imunoglobulina (CH3); - uma cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C- terminal; um domínio variável de imunoglobulina complementar ao domínio variável na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto e um domínio constante complementar ao domínio constante após o domínio variável na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0211] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; (iv) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; (v) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; e; - uma primeira cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1), ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina, e - uma segunda cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; um domínio variável de imunoglobulina complementar ao domínio variável na primeira cadeia polipeptídica e um domínio constante complementar ao domínio constante na primeira cadeia polipeptídica; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno, e em que o polipeptídeo de fusão e a primeira cadeia polipeptídica estão ligados por ligações de dissulfeto.

[0212] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; (iv) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1); ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); (v) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; (vi) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; e; - uma primeira cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; (i) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo ; e (ii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; e; - uma segunda cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; um domínio variável de imunoglobulina complementar ao domínio variável na primeira cadeia polipeptídica e um domínio constante complementar ao domínio constante na primeira cadeia polipeptídica; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; e em que o polipeptídeo de fusão e a primeira cadeia polipeptídica estão ligados por ligações de dissulfeto.

[0213] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; e (iv) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1); ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e - uma primeira cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; (i) um domínio variável de imunoglobulina complementar ao domínio variável no polipeptídeo de fusão e um domínio constante complementar ao domínio constante no polipeptídeo de fusão; (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada, isolado ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; e em que o polipeptídeo de fusão e a primeira cadeia polipeptídica estão ligados por ligações de dissulfeto.

[0214] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais; (iv) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1), ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e (v) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; (vi) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina, e - uma primeira cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1), ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; e; - uma segunda cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; um domínio variável de imunoglobulina complementar ao domínio variável na cadeia polipeptídica de fusão e um domínio constante complementar ao domínio constante na cadeia polipeptídica de fusão; e; - uma terceira cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; um domínio variável de imunoglobulina complementar ao domínio variável na primeira cadeia polipeptídica e um domínio constante complementar ao domínio constante na primeira cadeia polipeptídica; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada do polipeptídeo de fusão e/ou a primeira cadeia polipeptídica, isolada ou em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; e em que o polipeptídeo de fusão e a primeira cadeia polipeptídica estão ligados por ligações de dissulfeto.

[0215] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo que suscita resposta de célula-T; (ii) uma β2-microglobulina; (iii) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou mais, e (iv) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1); ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); e; - uma primeira cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; (i) um domínio variável de imunoglobulina complementar ao domínio variável no polipeptídeo de fusão e um domínio constante complementar ao domínio constante no polipeptídeo de fusão; (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; e; - uma segunda cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; (i) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL) e domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1); ou um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e um domínio constante selecionado a partir do domínio constante da primeira cadeia pesada de imunoglobulina (CH1) e domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina (CL); (ii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; e (iii) um domínio constante da segunda (CH2) e terceira (CH3) cadeia pesada de imunoglobulina; e; - uma terceira cadeia polipeptídica que compreende na direção N- para C-terminal; um domínio variável de imunoglobulina complementar ao domínio variável na segunda cadeia polipeptídica e um domínio constante complementar ao domínio constante na segunda cadeia polipeptídica; em que o domínio variável de cadeia leve ou pesada do polipeptídeo de fusão e/ou da segunda cadeia polipeptídica, isolada em combinação com o respectivo domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar, se liga especificamente a um antígeno; e em que a primeira cadeia polipeptídica e a segunda cadeia polipeptídica estão ligadas por ligações de dissulfeto.

[0216] Em um exemplo de realização, o peptídeo que suscita uma reposta de célula-T é um peptídeo derivado de vírus. Em um exemplo de realização, o vírus é selecionado a partir de adenovírus, herpesvírus humano 1, herpesvírus humano 2, herpesvírus humano 4 (vírus Epstein-Barr), vírus da hepatite-B, vírus da hepatite-C, citomegalovírus humano, vírus da imunodeficiência humana, papilomavírus humano tipo 16, papilomavírus humano tipo 18, papilomavírus humano tipo 31, papilomavírus humano tipo 33, papilomavírus humano tipo 35, papilomavírus humano tipo 39, papilomavírus humano tipo 45, papilomavírus humano tipo 51, papilomavírus humano tipo 52, papilomavírus humano tipo 56, papilomavírus humano tipo 58, papilomavírus humano tipo 59, papilomavírus humano tipo 68, papilomavírus humano tipo 73, papilomavírus humano tipo 82, Vírus Linfotrópico de células T Humano Tipo 1, vírus da gripe humana, vírus da gripe humana B ou vírus vaccinia.

[0217] Em um exemplo de realização, o peptídeo derivado de vírus é selecionado a partir de NLVPMVATV (SEQ ID NO: 1), SLYNTVATL (SEQ ID NO: 2), GLCTLVAML (SEQ ID NO: 3), GILGFVFTL (SEQ ID NO: 4), STNRQSGRQ (SEQ ID NO: 5), LLFGYPVYV (SEQ ID NO: 6), FAEGFVRAL (SEQ ID NO: 7), LIVIGILIL (SEQ ID NO: 8), ou ILHTPGCV (SEQ ID NO: 9).

[0218] Em um exemplo de realização, a β2-microglobulina é β2- microglobulina humana. Em um exemplo de realização, a β2-microglobulina consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[0219] Em um exemplo de realização a molécula MHC de classe I com uma frequência relativa de 10% ou menos é a HLA-A*0201 humana. Em um exemplo de realização os domínios extracelulares α1, α2, e α3 da molécula MHC de classe I consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0220] Em um exemplo de realização, o peptídeo derivado de vírus está fundido à β 2-microglobulina através de um primeiro peptídeo de ligação.

[0221] Em um exemplo de realização, a β2-microglobulina está fundida com o domínio extracelular α1 de uma molécula MHC de classe I através de um segundo peptídeo de ligação.

[0222] Em um exemplo de realização o domínio extracelular α3 da molécula MHC de classe I está fundido ao polipeptídeo (por uma ligação de dissulfeto ou uma ligação não dissulfeto) por meio de um terceiro polipeptídeo de ligação.

[0223] Em um exemplo de realização, o primeiro, segundo e terceiro peptídeo de ligação é o mesmo peptídeo de ligação ou é um peptídeo de ligação diferente.

[0224] Em um exemplo de realização, o primeiro peptídeo de ligação, o segundo peptídeo de ligação, e o terceiro de ligação são selecionados independentemente um do outro a partir das sequências de aminoácidos: GS (SEQ ID NO: 12), GGS (SEQ ID NO: 13), GGGS (SEQ ID NO: 14), GGGSGGGS (SEQ ID NO: 15), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 16), GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 17), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 18), GGGGS (SEQ ID NO: 19), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 22), e GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23).

[0225] Em um exemplo de realização, o primeiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[0226] Em um exemplo de realização, o segundo peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[0227] Em um exemplo de realização, o terceiro peptídeo de ligação compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0228] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo é selecionado a partir de um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de um anticorpo humano da classe IgG ou da classe IgE.

[0229] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo é selecionado a partir de um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de um anticorpo humano da subclasse IgG1, ou IgG2, ou IgG3 ou IgG4.

[0230] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo compreende ou é constituído pela sequência de aminoácidos EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 24), EPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 25), ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 26), ERKCAVECPPCP (SEQ ID NO: 27), ERKACVECPPCP (SEQ ID NO: 28), ELKTPLGDTTHTCPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)3 (SEQ ID NO: 29), ou ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 30).

[0231] Em um exemplo de realização, o primeiro polipeptídeo ligado por dissulfeto e/ou o segundo polipeptídeo ligado por dissulfeto compreende um domínio CH2 e/ou um domínio CH3 de origem humana. Em um exemplo de realização o domínio CH2 e o CH3 de origem humana é de um anticorpo humano da classe IgG ou IgE. Em um exemplo de realização o domínio CH2 e CH3 é de um anticorpo humano da subclasse IgG1, ou IgG2, ou IgG3, ou IgG4. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 é de um anticorpo humano da subclasse IgG1 ou IgG2, e compreende pelo menos uma mutação E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 e/ou P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, o domínio CH2 é de um anticorpo humano da subclasse IgG1 ou da subclasse IgG2 humana com as mutações L234A e L235A e/ou as mutações D265A e N297A, e/ou contém a mutação PVA236, e/ou contém a mutação P329G. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 é de um anticorpo humano da subclasse IgG1 com as mutações L234A e L235A e/ou P329G. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 é de um anticorpo humano da subclasse IgG4 com mutações S228P e/ou L235E. Em um exemplo de realização, o domínio CH2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33. Em um exemplo de realização, o domínio CH3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[0232] Em um exemplo de realização, o primeiro peptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, e o segundo peptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[0233] Em um exemplo de realização, o primeiro e o segundo polipeptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38.

[0234] Em um exemplo de realização, o primeiro ou o segundo polipeptídeo ligado por ligação de dissulfeto consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38.

[0235] Em um exemplo de realização, o primeiro peptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, e o segundo peptídeo ligado por ligação de dissulfeto compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[0236] Em um exemplo de realização, as cadeias polipeptídicas, que são ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto, estão ligadas por duas, ou três, ou quatro ligações de dissulfeto.

[0237] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo derivado de vírus que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (ii) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (iii) uma β2-microglobulina que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC classe I que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e; (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; (iv) um domínio CH2 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 32 e 33; e (v) um domínio CH3 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 35 ou 36; em a segunda cadeia do polipeptídeo ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; (ii) um domínio CH2 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 32 e 33; e (iii) um domínio CH3 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 36 ou 35; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal da segunda cadeia polipeptídica ligada por ligação de dissulfeto.

[0238] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo derivado de vírus que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (iii) uma β2-microglobulina que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC classe I que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; (iv) um domínio CH2 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 32 e 33; e (v) um domínio CH3 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 35 ou 36; (vi) a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; em que o polipeptídeo de fusão está: (vii) covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal da primeira cadeia polipeptídica ligada por ligação de dissulfeto, ou (viii) covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou (ix) covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0239] Em um exemplo de realização, o complexo é caracterizado pelo fato de compreender: (x) um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- para C- terminal; (i) um peptídeo derivado de vírus que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (ii) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (iii) uma β2-microglobulina que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC classe I que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; e; - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto; em que a primeira e segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina; (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo; (iv) um domínio CH2 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 32 e 33; e (v) um domínio CH3 de IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 35 e 36; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou extremidade N-terminal da segunda cadeia polipeptídica ligada por ligação de dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar aquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

[0240] A partir da Figura 14, pode se observar que o complexo conforme divulgado na presente invenção mantém as propriedades de ligação do anticorpo ao qual está fundido (Figura 14 b) e c)).

[0241] Nas Figuras 15 e 17, a eficácia in vitro e a especificidade de um complexo conforme divulgado na presente invenção são demonstradas.

[0242] O ensaio de citotoxicidade foi realizado na presença de células T CD8+ específicas para CMV. Pode ser observado que os complexos que compreendem um peptídeo derivado do vírus CMV induz a lise/remoção/desintegração de células-alvo (vide a Figura 15-A para o anticorpo monovalente, e Figura 15 b para o anticorpo bivalente). Pode ainda ser observado que a lise das células-alvo é altamente específica pela incubação com os complexos compreendendo um peptídeo derivado do vírus EBV (Figura 15 b)); e os anticorpos controle (Figura 15 d) e e)) não resultam em grande lise celular (a lise espontânea é de aproximadamente 3,5%).

[0243] Na Figura 17, é demonstrada a lise da linhagem celular H460M2 de adenocarcinoma de pulmão positivo para IGF-1R.

[0244] O valor de EC50 para um complexo que compreende um peptídeo derivado de CMV e um anticorpo bivalente é de cerca de 10 ng/mL, correspondendo a cerca de 50 pM. O valor EC50 determinado é independente da razão célula-alvo por célula efetora (vide a Figura 16; a razão entre célula- alvo e célula efetora é de 1:3 a 1:1, correspondendo a uma proporção eficaz de 1:0,44 a 1:0,14 (76% de células efetoras são células CD8 positivas e 19% são específicas para CMV)).

[0245] Assim, em um exemplo de realização o complexo conforme é divulgado na presente invenção tem um valor de EC50 de aproximadamente 50 pM.

1. AFINIDADE

[0246] Em determinados exemplos de realização, um complexo conforme proporcionado na presente invenção compreende um par de ligação ao antígeno de domínios variáveis de anticorpo. Em certos exemplos de realização, o domínio variável possui uma constante de dissociação (Kd) < 10 nM; < 1 nM; < 0,1 nM; < 0,01 nM; ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos; por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M; por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M) com relação ao seu antígeno.

[0247] Em um exemplo de realização, a Kd é mensurada utilizando ensaios de ressonância plasmônica de superfície.

[0248] Por exemplo, isto pode ser feito usando um instrumento BIACORE®-2000 ou BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C com chips de antígenos imobilizados CM5 a ~ 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, os chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 μg/mL (~ 0,2 μM) antes de ser injetado a uma velocidade de fluxo de 5 μL/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina 1 M é adicionada para bloquear grupos que não reagiram. Para a mediação cinética, diluições seriadas de duas vezes a cada passagem de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05 % de surfactante polisorbato-20 (Tween-20®) (PBST) a 25 °C em uma velocidade de fluxo de cerca de 25 μl/min. A velocidade de associação (kon) e a velocidade de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para- um de Langmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2) pelo ajuste simultâneo de sensogramas de associação e dissociação. A constante do equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a relação koff/kon. Vide, por exemplo., Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999): 865-881.

2. EXPRESSÃO

[0249] A expressão de forma específica do complexo conforme divulgado na presente invenção (diferente ligante, diferentes combinações de HLA e microglobulina β2) em células HEK 293 e CHO conduziu a um acúmulo do complexo, se detectável, dentro do retículo endoplasmático, ou seja, o isolamento e a secreção do complexo foram fortemente prejudicados.

[0250] Nenhuma secreção de um complexo para o meio de cultura pôde ser detectada quando o complexo foi concebido para compreender um dos polipeptídeos tal como descrito nas tabelas a seguir: TABELA

[0251] Verificou-se que a expressão, e especialmente a secreção dos complexos compreendendo duas partes de um peptídeo derivado de vírus ligado a uma proteína do complexo MHC de classe I, e pelo menos um domínio variável e um domínio constante de um anticorpo, não é possível em células eucarióticas.

[0252] Adicionalmente, foi verificado que a expressão, e especialmente a secreção dos complexos compreendendo dois polipeptídeos de fusão compreendendo um peptídeo derivado de vírus ligado a uma proteína do complexo MHC de classe I, e pelo menos um domínio variável, e um par de polipeptídeos derivado da região de dobradiça ligados por dissulfeto não é possível em células eucarióticas.

[0253] Assim, um complexo tal como é divulgado no presente de um polipeptídeo de fusão compreendendo um peptídeo derivado de vírus ligado a uma proteína MHC de classe I não podem estar presente em mais do que uma vez e em pelo menos um domínio variável de anticorpo e um domínio constante de anticorpo devem estar presentes a fim de permitir a produção e secreção do complexo utilizando células eucarióticas.

[0254] Assim, um complexo que compreende exatamente um polipeptídeo de fusão de um peptídeo derivado de vírus ligado à uma proteína MHC de classe I, uma região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo, e pelo menos um domínio variável de anticorpo e um domínio constante de anticorpo pode ser produzido de forma recombinante e secretado pelas células eucarióticas. Em um exemplo de realização o pelo menos um domínio constante é um domínio constante 1 de cadeia pesada de anticorpo (CH1) ou um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL).

[0255] Assim, um complexo que compreende exatamente uma região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo, pelo menos um par de domínios variáveis de anticorpo, opcionalmente um domínio constante de anticorpo, e exatamente um polipeptídeo de fusão de um peptídeo derivado de vírus ligado à uma proteína MHC de classe I pode ser produzido de forma recombinante e secretado por células eucarióticas. Em um exemplo de realização o pelo menos um domínio constante é um domínio constante 1 de cadeia pesada de anticorpo (CH1) ou um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL).

[0256] Várias combinações de diferentes polipeptídeos foram testadas. A expressão secretada pode ser realizada por, por exemplo, fusão N-terminal de um peptídeo sinal derivado de imunoglobulina em complexos onde o peptídeo derivado de vírus está fundido no N-terminal à molécula MHC de classe I. A molécula MHC de classe I de cadeia pesada (α1-α2-α3 sem o domínio transmembrana e domínio citoplasmático) e a cadeia leve (beta2-microglobulina) podem ter a ordem alterada. Os diferentes polipeptídeos de fusão foram fundidos na extremidade N- terminal a um polipeptídeo compreendendo a cadeia leve de anticorpo ou uma região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo. Combinações exemplares são fornecidas na Figura 2.

[0257] Como pode ser observado a partir da seguinte tabela de complexos compreendendo polipeptídeos de fusão, tais complexos apenas podem ser expressos com o domínio variável de anticorpo e região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo quando um único peptídeo derivado de vírus-microglobulina-HLA-polipeptídeo de fusão está presente. TABELA

[0258] Em alguns exemplos de realização, o complexo compreende, conforme divulgado na presente invenção, diferentes pares de polipeptídeos. A fim de permitir um bom pareamento dos polipeptídeos a tecnologia knobs-into-holes ou a tecnologia cross-mAb pode ser usada a fim de reduzir a quantidade de complexo que não se associa corretamente.

[0259] A modificação knob indica a mutação T366W no domínio CH3 de um anticorpo (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0260] A modificação hole indica a mutação T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 de um anticorpo (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[0261] Além da modificação knob e hole a mutação S354C no domínio CH3 e a mutação Y349C no outro domínio CH3 podem estar presentes.

[0262] A tecnologia cross-mAb é relatada, por exemplo, na WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080254, WO 2009/080253, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, e WO 2010/145793.

3. VARIANTES

[0263] Em determinados exemplos de realização, são contempladas sequências variantes de aminoácidos do complexo fornecido na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do complexo. As sequências de aminoácidos variantes do complexo podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica as cadeias polipeptídicas do complexo, ou pela síntese peptídica. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos dos polipeptídeos do complexo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.

A) VARIANTES POR SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E DELEÇÃO

[0264] Em determinados exemplos de realização, são fornecidas formas variantes de complexo contendo uma ou mais substituições de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela a seguir sob o título de “substituições preferidas”. Alterações mais substanciais são fornecidas na tabela a seguir sob o título de “substituições exemplares” e, conforme melhor descrito abaixo em referência às classes de cadeias laterais de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um complexo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno mantida/melhorada, diminuição da imunogenicidade, ou ADCC ou CDC melhorada. TABELA

[0265] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com propriedades comuns da cadeia lateral: (1) Hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cis, Ser, Tre, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lis, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gli, Pro; (6) aromático: Trp, Tir, Fen.

[0266] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[0267] As inserções de sequências de aminoácidos incluem: fusões carbóxi- e/ou amino-terminais que variam de comprimento desde um resíduo, até polipeptídeos que possuem cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um complexo compreendendo um polipeptídeo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção incluem a fusão ao N- ou C-terminal das cadeias polipeptídicas do complexo à uma enzima.

B) VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO

[0268] Em determinadas realizações, um polipeptídeo do complexo fornecido na presente invenção é alterado para aumentar ou diminuir o grau que o polipeptídeo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação em um polipeptídeo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais sítios de glicosilação é criado ou removido.

[0269] Quando o complexo compreende uma região Fc de anticorpo, os carboidratos ligados a estes podem ser alterados. Regiões-Fc nativas produzidas por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado bianternário que geralmente está ligado por uma ligação N a uma Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright, A. e Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo bianternário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.

[0270] Em um exemplo de realização, complexos compreendendo polipeptídeos variantes são fornecidos possuindo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexa (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose em tal região Fc pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada pelo cálculo do valor médio de fucose dentro da cadeia de açúcar na Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas à Asn297 (por exemplo, estruturas complexas e híbridas de alto teor de manose), mensurado por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado aproximadamente na posição 297 da região Fc (numeração de resíduos da região Fc-UE), no entanto, Asn297 também pode estar localizada a aproximadamente ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a variações menores na sequência em anticorpos. Essas variantes de fucosilação podem ter a função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, as publicações US 2003/0157108; US 2004/0093621. Exemplos de publicações relacionadas com variantes de anticorpos "defucosilados" ou "com deficiência de fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: (2004) 614-622. Exemplos de linhagens celulares que produzem anticorpos defucosilados incluem células Lec13 CHO deficiente na fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. (1986) 249:533-545; US 2003/0157108, e documento WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens de células nocautes, tais como para o gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células nocautes CHO (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87 : 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e documento WO2003/085107).

[0271] Complexos compreendendo região-Fc variantes são fornecidos adicionalmente com oligossacarídeos divididos, por exemplo, onde um oligossacarídeo bianternário anexado a região Fc é cortado pela GlcNAc. Tais variantes podem possuir fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Exemplos de tais variantes de anticorpos estão descritos, por exemplo, no WO 2003/011878; US 6.602.684 e US 2005/0123546. São fornecidas variantes da região Fc com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes da região - Fc podem ter a função CDC melhorada. Variantes de anticorpos correspondentes estão descritas, por exemplo, nos documentos WO 97/30087, WO 98/58964 e WO 99/22764.

c) VARIANTES DA REGIÃO-FC

[0272] Em determinados exemplos de realização, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um polipeptídeo compreendido no complexo fornecido no presente documento, gerando assim uma Região-Fc variante. A região Fc variante pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc da IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos.

[0273] Em um exemplo de realização, a invenção contempla um região Fc variante que possuí alguma, mas não todas as funções efetoras, que a torna um candidato desejável para muitas aplicações no qual a meia vida in vivo do complexo é importante, ainda que certas funções efetoras (como o complemento e a ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Um ensaio de citotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução / depleção das atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação com o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que o complexo não tenha ligação ao FCYR (e portanto carece de atividade ADCC), mas mantém a capacidade de ligação ao FcRn. As principais células mediadoras da ADCC, as células NK, expressam apenas FCYRIII, enquanto monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas é resumida na tabela 3 na página 464 de Ravetch J.V. e Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-92. Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse é descrita na Patente US 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I., et al. Proc. Nat Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063 e Hellstrom, I et al., Proc. Nat Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 ; Patente US 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativamente, métodos de ensaio não radioativo podem ser utilizados (vide, por exemplo, ACTI™ ensaio de citotoxicidade não radioativo por citometria de fluxo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA, e CyTotox 96® ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, WI). As células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Matadoras Naturais (natural killer - NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como descrito em Clynes R. et al., Proc. Nat Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar à C1q e, portanto, carece de atividade CDC. Vide, por exemplo, o ensaio ELISA de ligação ao C1q e C3c na WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171 e Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052 e Cragg, M.S. e Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

[0274] Regiões Fc com função efetora reduzida incluem aquelas com a substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc: 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (vide, por exemplo, a Patente US 6.737.056). Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo a Fc mutante denominada “DANA” com a substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (US 7.332.581).

[0275] Certas variantes da região Fc com uma ligação ao FcR melhorada ou diminuída são descritas. (Vide, por exemplo, US 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

[0276] Em determinadas realizações, um polipeptídeo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram ainda mais a função ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).

[0277] Em alguns exemplos de realização, as alterações são feitas na região Fc resultam na alteração (seja ela melhorada ou diminuída) da ligação ao C1q e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente US 6.194.551, WO 99/51642, e em Idusogie, E.E. et al. J. Immunol.164 (2000) 4178-4184.

[0278] Anticorpos com a meia-vida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) melhorada, que são responsáveis pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos na US 2005/0014934A1. Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições neste local que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes da região Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo 434 da região - Fc (US 7.371.826).

[0279] Vide também Duncan, A.R. e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5.648.260; US 5.624.821 e WO 94/29351 referentes a outros exemplos de variantes da Região-Fc.

D) DERIVADOS

[0280] Em determinados exemplos de realização, um complexo fornecido no presente pode ser adicionalmente modificado para conter porções não proteicas adicionais que são conhecidas no estado da técnica e estão prontamente disponíveis. As porções adequadas para a derivatização do complexo incluem, mas não estão limitadas a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitam a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleica anidrido, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli (n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de poli propileno óxido /etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. O polietilenoglicol propionaldeído pode ter vantagens no processo de fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificada ou sem ramificação. O número de polímeros acoplados por anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, os polímeros podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitado a, propriedades específicas ou funções do anticorpo de ser melhorado, se os anticorpos derivados serão utilizados no âmbito de uma terapia, etc.

[0281] Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de um complexo e a porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecidas por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece o grupamento não proteináceo a uma temperatura no qual as células próximas ao conjugado anticorpo-agrupamento não proteináceo são mortas.

B. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES RECOMBINANTES

[0282] Podem ser produzidos complexos utilizando métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.816.567. Em um exemplo de realização, são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam os polipeptídeos do complexo descritos no presente. Em um exemplo de realização adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico são fornecidos. Em outro exemplo de realização, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo tal ácido nucleico. Em tal exemplo de realização, a célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo; ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira eucariótica é, por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula linfóide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp2/0). Em um exemplo de realização, é fornecido um método de fabricação de um complexo, conforme divulgado na presente invenção, em que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificante dos polipeptídeos do complexo, conforme fornecido acima, sob condições adequadas para a expressão dos polipeptídeos e a formação do complexo e, opcionalmente, recuperando o complexo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[0283] Para a produção recombinante de um complexo, o ácido nucleico codificante dos polipeptídeos do complexo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou a expressão em uma célula hospedeira. Tal ácido nucleico variante pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo).

[0284] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou vetores de expressão incluem células procariotas ou eucariotas descritas na presente invenção. Por exemplo, os complexos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora do Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, US 5.648.237, US 5.789.199, US 5.840.523 e.(vide também Charlton, K.A., Em:. Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, BKC (Ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), págs 245-254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli). Após a expressão, o complexo pode ser isolado a partir da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.

[0285] Além de procariotas, micróbios eucarióticos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou vetores de expressão codificantes do polipeptídeo, incluindo fungos e cepas de levedura cuja vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Vide, Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, e Li, H. et al, Nat.. Biotech.24 (2006) 210-215.

[0286] Células hospedeiras adequadas para a expressão de complexos glicosilados podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas diversas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas juntamente com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[0287] Culturas de células vegetais podem também ser utilizadas como hospedeiras. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES® para produção de anticorpos em plantas transgênicas).

[0288] Células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, as linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são: linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de células de rim embrionárias humana (células HEK 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em suspensão de cultura, Graham et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74), células de rim de filhote de hamster bebé (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HeLa), células de rim canino (células MDCK) células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138), células de fígado humano (Hep G2); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., et al, Annals NY Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR- CHO (Urlaub et al, Proc Acad Nat. Sci USA 77 (1980) 4216-4220) e linhagem de células do mieloma, como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki P. e Wu A. M., Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed.), Humana Press, Fairfield, NJ, (2004), págs 255-268.

C. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[0289] As formulações farmacêuticas adequadas de um complexo conforme descrito na presente invenção são preparadas pela mistura do complexo possuindo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são de modo geral atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não estão limitados a: tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, ácool butílico ou benzilíco; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tal como polietileno glicol (PEG). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis na presente invenção incluem ainda agentes de dispersão de fármacos intersticiais tais como glicoproteínas hialuronidase neutro-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 solúveis humanas, como a rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo a rHuPH20, estão descritos na US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com um ou mais glicosaminoglicanos adicionais, tais como condroitinases.

[0290] Formulações de anticorpo liofilizado exemplares estão descritas na US 6.267.958. As formulações aquosas de anticorpo incluem aquelas descritos na US 6.171.586 e WO 2006/044908, as formulações da última incluem um tampão histidina-acetato.

[0291] A presente formulação também pode conter mais de um ingrediente ativo de acordo com a necessidade para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente compostos ativos com atividades complementares que não sejam prejudiciais entre si. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[0292] Ingredientes ativos podem ser armazenados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edição, Osol, A. Ed. (1980).

[0293] Podem ser fabricadas preparações de liberação controlada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas.

[0294] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo geralmente são estéreis. A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

D. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[0295] Qualquer complexo fornecido na presente invenção pode ser usado em métodos terapêuticos.

[0296] Em um aspecto, é fornecido um complexo tal como divulgado na presente invenção para a utilização como um medicamento.

[0297] Em aspectos adicionais, é fornecido um complexo conforme divulgado na presente invenção para uso no tratamento do câncer ou infecção viral.

[0298] Em certos exemplos de realização, é fornecido um complexo conforme divulgado na presente invenção para uso em um método de tratamento.

[0299] Em determinados exemplos de realização, a invenção fornece um complexo conforme divulgado na presente invenção para a utilização em um método de tratamento de um indivíduo que possui câncer ou infecção viral, cujo método compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de tal complexo conforme divulgado na presente invenção. Em tal exemplo de realização, o método compreende ainda a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.

[0300] Em outros exemplos de realização, a invenção fornece um complexo conforme divulgado na presente invenção para a utilização na remoção de células cancerosas ou para a remoção de células infectadas por vírus. Em determinados exemplos de realização, a invenção fornece um complexo conforme divulgado na presente invenção para a utilização em um método de remoção de células cancerosas ou remoção de células infectadas por vírus em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo o complexo de uma forma eficaz conforme divulgado na presente invenção para remover as células cancerosas ou para remover as células infectadas por vírus. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um humano.

[0301] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um complexo conforme divulgado na presente invenção na manufatura ou preparação de um medicamento. Em um exemplo de realização o medicamento é para o tratamento do câncer ou infecção viral. Em um exemplo de realização, o medicamento é para uso em um método para tratar o câncer ou infecções virais, compreendendo a administração a um indivíduo possuindo câncer ou infecção viral crônica de uma quantidade eficaz do medicamento. Em tal exemplo de realização, o método compreende ainda a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em um exemplo de realização adicional, o medicamento é para a remoção de células de câncer ou para a remoção de células infectadas por vírus. Em um exemplo de realização adicional, o medicamento é para uso em um método de remoção de células de câncer ou remoção de células infectadas por vírus em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do medicamento para remover as células cancerosas ou para remover as células infectadas por vírus. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um humano.

[0302] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento do câncer ou infecção viral. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade eficaz do complexo conforme divulgado na presente invenção a um indivíduo possuindo tal câncer ou infecção viral. Em tal exemplo de realização, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um humano.

[0303] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para a remoção de células de câncer ou células infectadas com vírus em um indivíduo. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um complexo conforme divulgado na presente invenção para remover as células de câncer ou células infectadas por vírus. Em um exemplo de realização, o “indivíduo” é um humano.

[0304] Em um aspecto adicional, a invenção fornece formulações farmacêuticas que compreendem qualquer um dos complexos fornecidos no presente, por exemplo, para uso em qualquer dos métodos terapêuticos descritos acima. Em um exemplo de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos complexos fornecidos na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro exemplo de realização, a formulação farmacêutica compreende qualquer um dos complexos, conforme divulgado na presente invenção, e pelo menos um agente terapêutico adicional.

[0305] Os complexos da presente invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um complexo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional.

[0306] Esta terapia combinada referida acima abrange a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou em formulações distintas), e a administração separada, nesse caso a administração do complexo da invenção, pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante Os complexos da invenção podem também ser usados em combinação com a radioterapia.

[0307] Um complexo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer via apropriada, que inclui parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, a administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte se a administração é breve ou crônica. Os esquemas de dosagem, incluindo mas não se limitando a, administração simples ou múltiplas administrações ao longo de vários pontos de tempo, administração em bolus e infusão pulsada, são contemplados na presente invenção.

[0308] Os complexos da invenção podem ser formulados, dosados, e administrados de forma consistente com a boa prática médica. Fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente o local de entrega do agente, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O complexo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar os distúrbios em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de complexo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99 % das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

[0309] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um complexo da invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de complexo, da severidade e do curso da doença, se o complexo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, se houve e qual foi a terapia anterior, o histórico clínico do paciente, a reação ao complexo, e o critério do médico atendente. O complexo é adequadamente administrado ao paciente em uma única vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,5 mg/kg a 10 mg/kg) de complexo é uma possível dose candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar em cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.

[0310] Entende-se quaisquer formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser realizados utilizando um imunoconjugado da invenção em lugar ou em adição a um complexo conforme divulgado no presente.

[0311] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é o complexo, conforme divulgado, para a utilização em um método de tratamento do câncer ou infecção viral em um paciente, cujo complexo será administrado antes, simultaneamente ou após a imunização do paciente com o peptídeo derivado de vírus compreendido no complexo.

[0312] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é a utilização de um complexo tal como divulgado, para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer ou infecção viral, em combinação com a imunização contra o peptídeo derivado do vírus compreendido no complexo.

[0313] Na primeira etapa, o peptídeo derivado do vírus contido no complexo é primeiramente administrado no indivíduo a ser tratado. Em um determinado intervalo de tempo mais adiante, ou seja, entre 4 dias e 28 dias, o complexo divulgado na presente invenção é administrado ao indivíduo.

[0314] Por meio desta aplicação sucessiva e separada do polipeptídeo derivado do vírus, na primeira etapa sozinha e na segunda etapa com o complexo divulgado na presente invenção, é possível aumentar o número de células-T específicas para o peptídeo derivado do vírus e, desse modo, aumentar a eficácia do tratamento. III. ARTIGOS DE MANUFATURA

[0315] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de manufatura que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos anteriormente. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado a ele. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas (vials), seringas, bolsas para a administração IV e etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que está sozinha (é única), ou que está combinada com outra(s) composição(ões) eficaz(es) para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição; e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um complexo da presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. Além disso, o artigo de manufatura pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição ali contida, em que a composição compreende um complexo da presente invenção, e (b) um segundo recipiente com uma segunda composição ali contida, em que a segunda composição compreende um agente citotóxico adicional ou outro agente terapêutico. O artigo de manufatura neste exemplo de realização pode ainda compreender uma bula indicando que a composição pode ser usada para tratar uma condição específica. Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de manufatura pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[0316] Entende-se que qualquer um dos artigos de manufatura referidos acima pode incluir um imunoconjugado do invento em vez de ou adicionalmente ao complexo aqui divulgado.

IV. EXEMPLOS

[0317] A seguir são descritos exemplos de métodos e composições da presente invenção. Entende-se que diversas outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

EXEMPLO 1 PROCESSO PARA O ISOLAMENTO E ESTIMULAÇÃO DE CÉLULAS T CD8+ POSITIVAS ESPECÍFICAS PARA CMV DE DOADORES HUMANOS ISOLAMENTO DE PBLS

[0318] As PBLs foram isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll a partir do sangue de doadores humanos (Greiner bio-one, Cat. No. 227290). As PBLs foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 5% de soro humano (Sigma cat. No. H2520), 2 mM de L-glutamina (PAN Biotech, cat. No. P04-80100), 100 μg/ml de Penicilina/Estreptomicina (Roche cat. N° 14.001.100).

ESTIMULAÇÃO DE PBLS

[0319] As células (2 x 107 células/mL) foram cultivadas em meio de cultura celular suplementado com 50 μg/mL de peptídeo derivado de pp65 CMV (SEQ ID NO: 1) durante duas horas sob condições de cultura de células (37 °C, 5% de CO2,80% de umidade). Em seguida, a suspensão de células foi diluída 20 vezes com meio de cultura e cultivadas em placas de 96 poços de fundo plano em uma densidade de 2 x 105 células por poço. Após 4 a 5 dias, foram adicionados 20 U/mL de IL-2 (Roche, Cat. No. 11011456001), 25 ng/mL de IL-7 (Peprotech, cat. No. 200-01) e 25 ng/mL de IL-15 (Peprotech, cat. No. 200-15) e as células foram cultivadas durante mais 7-8 dias. A estimulação de células-T é visível ao microscópio como aglomerados de células.

REESTIMULAÇÃO DE PBLS

[0320] As células T foram cocultivadas com células estimuladoras, que são pulsadas com peptídeos PBL primários autólogos do mesmo dador (preparadas frescas ou derivadas de estoques congelados). As células estimuladoras foram pulsadas com o peptídeo, conforme descrito acima. Após as duas horas de incubação com os peptídeos as PBLs foram irradiadas (4000 rad; STS GmbH OB29 Nr.9510-5) e lavadas por duas vezes com meio de cultura sem peptídeo. A reestimulação foi realizada em placas de 96 poços de fundo redondo. 8 a 104 a 1 x 105 células estimuladoras foram usadas nos 96 poços. As células de cultura primária foram lavadas duas vezes com meio de cultura, resuspendidas em 200 μL de meio de cultura e de 80 μL foram transferidos para cada poço das células estimuladoras. Após 3 dias foram adicionados 20 U/mL de IL -2, 25 ng/mL de IL-7 e 25 ng/mL de IL-15. As células proliferaram e expandiram a cada 2 a 3 dias em novos poços com meio fresco.

ANÁLISE DE CÉLULAS T

[0321] As células foram coradas para expressão de CD8 (BD, cat. No. 345.772), e receptores de células T específicas para CMV (ProImmune, cat. No. F008-4A-E) e analisada em FACS.

MEIO DE CULTURA CELULAR

[0322] RPMI1640 (. PAN Biotech, Cat. No. P04-17500), 5% de soro humano (HS,. Sigma Cat. No. H2520), 2 mM de L-glutamina (PAN, Biotech, Cat. No. P04-80100), 100 μg/mL de penicilina/estreptomicina (Roche, Cat. No. 14001100).

RESULTADOS

[0323] Foi realizada a análise por FACS de linfócitos do sangue periférico humano (PBLs) derivadas de quatro doadores. As células foram marcadas com um anticorpo anti-CD8 conjugado com FITC (BD, cat. No. 345.772) combinado com o pentâmero Pro5 conjugado com APC (ProImmune, cat. No. F008-4A-E) para corar células T que transportam um Receptor de células T (TCR) que reconhecem MHC de classe I (HLA-A*0201), carregada com o peptídeo derivado de CMV (NLVPMVATV (SEQ ID NO: 1)). Para resultados vide a Figura 4. No dia 0, o doador 1 e 4 carregavam baixos números de células T CD8+ específicas para CMV (0,08% e 0,1%, respectivamente). O doador 2 e 3 carregavam um maior número de células T CD8+ específicas para CMV no sangue periférico (0,25% e 3,12%, respectivamente). Catorze dias mais tarde, após a estimulação com células autólogas pulsadas com o peptídeo derivado de CMV, apenas os doadores 2 e 3 mostram um aumento significativo nas células T CD8+ específicas para CMV (6,2% e 71,2%, respectivamente), enquanto que os doadores 1 e 4 não mostram aumento do número de células T CD8+ específicas para CMV (0,01% e 0,05%, respectivamente). 14 dias mais tarde, após uma segunda estimulação com células autólogas pulsadas com o peptídeo derivado de CMV, os doadores 2 e 3 mostram um aumento nas células T CD8+ específicas para CMV (15,1% e 96,6%, respectivamente).

EXEMPLO 2 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE

[0324] Células de leucemia linfoblástica aguda MN60 carregam o alelo HLA-A A*0201. As células MN60 (1 x 106 células/ml) foram incubadas com 50 μg/mL de peptídeo pp65 de CMV (SEQ ID NO: 1) durante 45 minutos, sob condições cultivo celular (37 °C, 5% de CO2, 80% de umidade). Os resultados da incubação em uma troca de peptídeo na fenda de ligação ao peptídeo HLA-A*0201. As células MN60 com peptídeo trocado foram centrifugadas e diluídas até uma densidade de 1 x 106 células/mL com PBS (PanBiotech, cat. No. P04-36500) e coradas com 1 μM de marcador celular éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE, Invitrogen, cat. No. 34554) durante 15 minutos em temperatura ambiente (RT). As células foram lavadas uma vez com PBS e diluídas para 1 x 105 células/mL com meio AIM-V (Gibco, cat. No. 0870112DK). Para o ensaio as células MN60 (células-alvo) foram cocultivadas em placas de 96 poços de fundo redondo com células T CD8+ específicas para CMV derivadas do doador humano 3 (células efetoras, vide exemplo 1), durante quatro horas, sob condições de cultivo de células. A relação de células efetoras para células-alvo foi de 4:1. As células mortas são coradas com iodeto de propídio 1 μl/100 μl (PI, Sigma, cat. No. P-4864) e foram analisadas por FACS.

RESULTADOS

[0325] A análise por Citometria de fluxo foi realizada para analisar a capacidade citolítica de CTL estimuladas por meio da lise de células tumorais MN60 carregadas com peptídeo CMV.

[0326] Na Figura 5a é mostrada a análise de FACS da cocultura de células MN60 não carregadas com o peptídeo derivado de CMV. As células MN60 são FICT-positivas. As células efetoras são FICT-negativas. As células mortas são PI positivas, as células vivas são PI negativas. Pode-se observar que mais de 85% das células MN60 estão vivas quando não estão carregadas com o peptídeo derivado de CMV (Q2 e Q4).

[0327] Na Figura 5b é mostrada a a análise de FACS de células MN60 carregadas com o peptídeo derivado de CMV. Pode-se observar que mais de 80% das células MN60 estão mortas (Q2 e Q4), enquanto que a proporção de células efetoras vivas e mortas não é alterada de forma notável entre as análises de FACS mostradas na Figura 5a e Figura 5b (compare Q1 e Q3 na Figura 5a e Figura 5b), indicando uma lise específica de célula-alvo carregadas com peptídeo CMV.

[0328] Análise por citometria de fluxo para analisar a capacidade citolítica de CTLs estimuladas por meio de lise de células tumorais MN60 carregadas com peptídeo CMV dependendo da proporção células efetoras:células-alvo: O ensaio de citotoxicidade foi realizado conforme descrito acima. Diferentes proporções células efetoras:células-alvo foram aplicadas variando de 0,5 células efetoras por célula-alvo até quatro células efetoras por célula- alvo (vide a Figura 6). O tempo de incubação foi de quatro horas. As células MN60 que não foram carregadas com o peptídeo derivado de CMV não exibiram um aumento do número de células mortas com um aumento da proporção de relação células efetoras/células-alvo, ou seja, variando entre 8% e 13%, com uma relação 0,5:1 a 4:1.

[0329] Quase 20% das células MN60 carregadas com o peptídeo derivado de CMV são prontamente mortas com uma baixa relação células efetoras/células-alvo de 0,5:1 dentro de quatro horas. O número de células mortas aumenta acentuadamente com o aumento da relação células efetoras/células-alvo, atingindo até 83% para a relação de 4:1 células efetoras/células-alvo.

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE DNA, TRANSFECÇÃO, EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E ANÁLISE PREPARAÇÃO DE DNA

[0330] 250 mL de cultura LB bacteriana cultivada por uma noite foram coletados e o DNA do plasmídeo foi extraído de acordo com o protocolo do fabricante (High speed Maxi kit, Qiagen, cat. No. 12663). O DNA plasmidial resultante foi eluído em 1 mL de tampão TE e a concentração de DNA foi determinada por espectrofotometria (Epoch, Biotek).

[0331] O vetor de expressão final compreende os seguintes elementos: - os sítios de restrição endonucleolíticos HindIII, Nhel, - Um promotor CMV, - uma 5'UTR 1 (derivado do CMV humano), - Íntron A, - uma 5’UTR 2, - um gene de resistência à ampicilina, - um sítio Poli A do BGH (sinal de poliadenilação da hormônio de crescimento bovino), - pUC Ori.

[0332] As sequências de aminoácidos dos elementos do complexo: Peptídeo CMV pp65: SEQ ID NO: 1 NLVPMVATV Ligante (linker)1: SEQ ID NO: 21 GGGGSGGGGSGGGGS β2-microglobulina: SEQ ID NO: 10 IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDL SFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM Ligante 2: SEQ ID NO: 22 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS HLA-A*0201 α1 - α3: SEQ ID NO: 11 GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPW IEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCD VGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVA EQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCW ALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQ RYTCHVQHEGLPKPLTLRW Ligante 3: SEQ ID NO: 12 GS Ligante 4: SEQ ID NO: 22 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Cadeia leve de Ig: SEQ ID NO: 41 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASK RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSKWPPWTFGQGTKV ESKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC Cadeia Pesada de Ig (IgG1-mutante L234A, L235A): SEQ ID NO: 42 QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAII WFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRR YFDLWGRGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia Pesada de Ig (IgG1-mutante L234A, L235A com variação knob): SEQ ID NO: 43 QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAII WFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRR YFDLWGRGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVS LWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia Pesada de Ig (IgG1-mutante L234A, L235A com variação hole): SEQ ID NO: 44 QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAII WFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRR YFDLWGRGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVS LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia Pesada da Região-Fc de Ig (IgG1-mutante L234A, L235A variante knob na Região-Fc): SEQ ID NO: 45 EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK scFv: SEQ ID NO: 46 QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAII WFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRR YFDLWGRGTLVSVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSP GERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARFSGSGS GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSKWPPWTFGCGTKVESK TRANSFECÇÃO

[0333] As células HEK 293 foram diluídas até 8 x 105 células/mL no dia antes da transfecção. Cerca de 1 a 1,6 x 106 células/mL foram transfectadas de acordo com o protocolo do fabricante. Para um volume final de transfecção de 30 mL, 30 μg de DNA foram diluídos para um volume final de 1 mL com meio com soro reduzido “Opti-MEM® I Reduced Serum Medium” (Gibco, cat. No. 31.985.070). 2 μL de Reagente 293fectin® (Invitrogen, cat. No. 12.347.019) para 1 μg de DNA foram igualmente diluídos em um volume final de 1 mL com meio Opti-MEM® e incubados durante 5 minutos. Após a incubação, o DNA diluído foi adicionado ao reagente 293fectin® diluído, misturados suavemente e incubado por mais 20-30 minutos e depois, pipetado gota a gota em 28 mL de células HEK293 para se obter um volume final de 30 mL. As células foram incubadas sob condições de cultura de células (37 °C, 8% de CO2, 80% de umidade) em um agitador orbital rotativo a 125 rpm e coletadas após 72 horas. Os células coletadas foram centrifugadas durante 10 minutos a 1000 rpm, durante 10 minutos a 3000 rpm e filtradas através de um filtro de 22 μm estéril (Millipore, cat. No. SCGPU05RE).

WESTERN BLOTTING

[0334] 500 μL de sobrenadante de cultura de células foi concentrado com um dispositivo para centrífuga Pall Nanosep OmegaMembran 30Kd (Pall, cat. No. OD030C33) até um volume de 50 μL. 17,5 μL de cada concentrado foi diluído para um volume final de 25 μL com tampão de amostra XT 4x (Bio Rad, cat. No. 161-0791) e Agente Redutor XT 20x (BioRad, Cat.. No. 161-0792), aquecido a 96 °C durante 8 minutos e aplicado sobre gel 4-12% Criterion XT Precast Gel (Cat. No. 345-0124). O Blotting foi realizado com um dispositivo Trans-Blot SD semi-dry Transfer Cell (Biorad) a 20 V durante 30 minutos sobre uma membrana de nitrocelulose Trans-blot Pure Nitrocellulose membrane (0,45 μm) (BioRad, Cat. No. 162-0117). O bloqueio da membrana foi realizado com reagente de bloqueio para Western 1x (Roche, Cat. No. 11921681001) durante uma hora em temperatura ambiente. A coloração foi realizada com a policlonal de coelho conjugado com peroxidase anti-cadeia leve K humana (DAKO, Cat. No. P0129, diluído 1:3000) e anticorpo policlonal de coelho anti-IgG humana conjugado com HRP (DAKO, Cat. No. P0214, diluído 1:5000) durante uma hora em temperatura ambiente. A detecção da luminescência foi realizada com Lumi-Imager F1 (Roche). PURIFICAÇÃO

[0335] As células foram removidas do meio de cultura por centrifugação. Os complexos foram purificados a partir dos sobrenadantes por cromatografia de afinidade com Proteína A (MabSelect-Sepharose sobre um AKTA-Avant). Complexos eluídos foram concentrados com tubos de centrifugação Amicon até uma concentração de proteína de 3 mg/mL. Uma alíquota foi analisada por cromatografia de exclusão por tamanho (HPLC TSKgel GFC300 Sys89). Uma SEC preparativa em coluna Superdex 200 foi realizada para remover agregados e tamponar as proteínas de fusão em 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0. Os complexos eluídos foram concentrados com um tubo de centrifugação Amicon até uma concentração de proteína de 1 mg/mL e esterilizados por filtração (tamanho de poro 0,2 μm).

ANALÍTICA

[0336] As amostras de complexo foram analisadas por OD280 utilizando um espectrofotômetro de UV para determinar a concentração de proteína na solução. O coeficiente de extinção necessário para isto foi calculado a partir da sequência de aminoácidos de acordo com Pace (Pace et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423). Uma cromatografia de exclusão por tamanho (SE-HPLC) foi realizada em colunas TSK-Gel300SWXL ou Superdex 200 com um tampão fosfato de potássio 0,2 M, compreendendo 0,25 M de KCl, pH 7,0 como fase móvel, a fim de determinar o teor de espécies monoméricas, espécies agregadas e degradadas nas amostras. Uma eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS) (condições de redução e não redução) foi realizada para analisar a pureza das preparações de complexos com relação aos produtos da degradação relacionados com o produto e impurezas não relacionadas. Uma espectrometria de massa com ionização por eletrospray (ESI-MS) foi efetuada com amostras reduzidas (TCEP) e desglicosiladas (N-glicosidase F) para confirmar a massa correta/identidade de cada cadeia e detectar modificações químicas. A ESI-MS das amostras deglicosiladas foi realizada para analisar a natureza e qualidade da proteína totalmente montada e detectar potenciais produtos secundários relacionados com o produto. MÉTODO DE SDS-PAGE E COLORAÇÃO COM COOMASSIE Dispositivo: Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell Gel: 4-20% de gel Tris-Glicina, Invitrogen EC6025BOX Tampão: Tampão de corrida Tris-glicina SDS (10x), Invitrogen LC2675-5 Tampão de Amostra: Tampão de amostra Tris-Glicina SDS (2x), Invitrogen LC2676 Tampão de redução: Agente de Redução de Amostra NuPAGE (10x), Invitrogen NP0004 Marcador de peso molecular: Mark 12, Padrão de PM, Invitrogen LC5677

PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PROTEÍNA

[0337] A amostra foi ajustada a uma concentração de proteína de 1 mg/mL com tampão. Para a redução da amostra o seguinte procedimento foi realizado: - Tampão de Redução: 4 mL de tampão de amostra (2x) e 1 mL de tampão de redução (10x) - Diluir a amostra 1:1 com tampão de redução - Incubar durante 5 minutos a 70 °C

[0338] A eletroforese em gel foi realizada a 125 V durante 90 minutos. Os géis foram corados com SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, cat. No LC6065). RESULTADOS TABELA

[0339] O gel de SDS com coloração por Coomassie e os cromatogramas SEC correspondentes dos complexos selecionados de número 1 e 2a de acordo com a tabela acima estão apresentados na Figura 7 e 8. Pode ser observado que os complexos definidos podem ser obtidos.

EXEMPLO 4 LIGAÇÃO DA FUSÃO-MHC-ANTICORPOS À LINHAGEM DE CÉLULAS HUMANA IGF-1R POSITIVAS

[0340] Células H460M2 foram diluídas até 8 x 105 células/mL em meio AIM-V (Gibco, cat. No. 0870112DK). 500 μL da suspensão de células foram corados com 10 μg de um complexo conforme divulgado na presente invenção, com 4 °C ou 37 °C durante uma hora. Em seguida as células foram lavadas uma vez com meio AIM-V gelado e coradas com um segundo anticorpo, que era F(ab')2 de cabra anti-IgG (H+L) humano conjugado com R- PE (Dianova, cat. No. 109-116-088, diluição 1:50) durante 30 minutos a 4 °C. Em seguida as células foram lavadas uma vez com meio AIM-V gelado e a fluorescência foi mensurada por meio de FACS Canto II (BD Bioscience) com seleção usando a estratégia de “gating” sobre células vivas. Um anticorpo biespecífico serviu como controle isotípico, um anticorpo anti-IGF-1R (vide, por exemplo, os documentos WO 2004/087756 e WO 2007/115814) serviu como controle positivo. RESULTADOS

[0341] Os resultados são exibidos na Figura 9. Considerando a alteração na medição de fluorescência PE (eixo X), o complexo, tal como divulgado na presente invenção, não exibe nenhuma diferença visível na ligação com as células-alvo H460M2 (Figura 9-2), em comparação com o anticorpo controle (Figura 9-6). Também não há diferença se a incubação com o complexo, tal como divulgado na presente invenção, é realizada a 4 °C ou 37 °C (vide a Figura 9-2 vs Figura 9-3). Nem a incubação com o controle isotípico (Figura 9-4), nem com o anticorpo secundário marcado por fluorescência sozinho (Figura 9.5) mostra qualquer alteração na medição da fluorescência PE. Apesar da fusão da molécula MHC classe I, o domínio variável do anticorpo do complexo, conforme divulgado na presente invenção, ainda se liga às células-alvo H460M2.

[0342] Embora a invenção acima divulgada tenha sido descrita em detalhes por meio de ilustrações e exemplos para fins de clareza de entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas no presente são expressamente e integralmente incorporadas pela referência.

EXEMPLO 5 REMOÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS EXPRESSANDO O ANTÍGENO

[0343] Células-alvo I24 (1x105 células/mL) foram semeadas em meio de cultura celular (RPMI 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, NEAA 0,1 mM, e 10% (v/p) de FCS) em placas de fundo de vidro Willco (FA. Willco Wells BV, REF GWST-3522) durante 24 a 48 horas. As placas Willco foram pré-revestidas com 50 μg/mL de cloridrato de poli-L-lisina (Sigma Aldrich, Cat # P2658) por placa durante 30 min. Após o revestimento as placas foram cuidadosamente lavadas com água estéril de grau de cultura de tecido, e secadas durante duas horas.

[0344] Após o meio de cultura ter sido removido e o complexo de ligação ao antígeno compreendendo um polipeptídeo de fusão [peptídeo-CMV- pp65] - [ligante 1] - [β2-microglobulina] - [ligante 2] - [HLA-A-α1-α2-α3] - [ligante 3] - [IgG1-L234A, L235A mutante com variação hole], um polipeptídeo ligado por dissulfeto IgG1-L234A, L235A mutante com variante knob na região Fc e uma cadeia leve de Ig, cujo complexo se liga especificamente ao IGF-1R humano conforme divulgado na presente invenção (vide, por exemplo, o Exemplo 3) foi adicionado numa concentração final de 5 μg/mL em 3 mM de tampão Krebs Ringer Hepes + K+, pH 7,3 (suplementado com 0,5 mM de DL- ditiotreitol, 1 mM de ácido ascórbico, e 4 mM glutationa).

[0345] As células T foram adicionadas em uma relação de células efetoras / células-alvo de 1:10. As imagens foram obtidas durante 4 horas em um microscópio Zeiss Axiovert 135. RESULTADOS

[0346] Na Figura 10 são mostradas imagens por microscopia da incubação do complexo de ligação ao antígeno compreendendo um polipeptídeo de fusão [peptídeo-CMV-pp65] - [ligante 1] - [β2-microglobulina] - [ligante 2] - [HLA-A-α1-α2-α3] - [ligante 3] - [IgG1-L234A, L235A mutante com variação hole], uma IgG1-L234A, L235A mutante ligada por dissulfeto com região Fc com variação knob e uma cadeia leve de Ig, cujo complexo se liga especificamente ao IGF-1R humano. Pode ser observada a lise mediada pelo complexo das células I24 3T3 expressando IGF-1R (células grandes crescendo de modo aderente, seta branca). A lise é mediada por células T humanas específicas para CMV (pequenas células em forma redonda - setas brancas, ou células ameboides que migram, seta preta). As células I24 são incubadas com o complexo a uma concentração de 5 μg/mL e as células T humanas específicas para CMV (pré-ativadas com APCs HLA-A0201+/pulsadas com peptídeo CMV). O lapso de tempo está indicado abaixo da respectiva imagem. Observe a interação das células I24 com as células-T a 56 min e 76 min e, posteriormente, o colapso de células I24 após 125 min.

[0347] Na figura 11 a imagem obtida por microscopia de um controle exibe a ausência de lise de células I24 3T3 (células grandes crescendo de modo aderente, cabeça de seta branca) incubadas com células T humanas específicas para CMV (células pequenas em forma arredondada, seta branca, ou células migrantes ameboide - seta negra) na ausência de um complexo de ligação ao antígeno conforme divulgado na presente invenção. As células I24 são incubadas com células T citotóxicas específicas (pré-ativadas com APCs HLA-A0201+/pulsadas com peptídeo CMV). O lapso de tempo está indicado abaixo da respectiva imagem.

EXEMPLO 6 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE

[0348] O meio de cultura celular (50 μL) foi pipetado para cada poço de uma placa xCELLigence de 96 poços (Roche, Cat. # 05232368001) para executar a medição de fundo.

[0349] As células I24 foram diluídas para 1x106 células/mL em meio de cultura de células (RPMI 1640, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, NEAA 0,1 mM, 10% (v/p)) e 50 μl (2x104 células por poço) foram pipetados em cada poço de uma placa xCELLigence de 96 poços até um volume final de 100 μL e as células foram cultivadas durante 24 horas (37 °C, 8% de CO2, 80% de umidade). Após 24 horas o meio foi removido e as células foram lavadas com 200 μL de meio de células T “AIM-V” (meio sem soro (Invitrogen), (Cat: 12055-083). O complexo de ligação ao antígeno compreendendo um polipeptídeo de fusão [peptídeo-CMV-pp65] - [ligante 1] - [β2-microglobulina] - [ligante 2] - [HLA-A-α1-α2-α3] - [ligante 3] - [IgG1-L234A, L235A mutante com variação hole], uma IgG1-L234A, L235A mutante ligada por dissulfeto com região Fc com variação knob e uma cadeia leve de Ig, cujo complexo se liga especificamente ao IGF-1R humano, conforme divulgado na presente invenção, foi adicionado às células-alvo lavadas em uma concentração final de 1 μg/mL em meio AIM-V. As células efetoras na proporção respeitável foram adicionadas ao meio AIM-V para um volume final de 150 μl. Um anticorpo monoclonal humano IgG1 afucosilado direcionado contra IGF-1R (anticorpo anti-IGF-1R-afucosilado) e anticorpo anti-digoxigenina humano não-ligante (anticorpo anti-digoxigenina) serviu como controle isotípico e controle de anticorpo específico, respectivamente. A medição foi realizada durante 6 a 9 horas, respectivamente, com o Sistema xCELLigence (Roche). RESULTADOS

[0350] O complexo tal como é divulgado na presente invenção provoca lise de células tumorais H460M2 por meio das células-T específicas para CMV humanas.

[0351] As células tumorais foram incubadas por quatro horas com 1 μg/mL do complexo compreendendo um polipeptídeo de fusão [peptídeo- CMV-pp65] - [ligante 1] - [β2-microglobulina] - [ligante 2] - [HLA-A-α1-α2-α3] - [ligante 3] - [IgG1-L234A, L235A mutante com variação hole], uma IgG1-L234A, L235A mutante ligada por dissulfeto com região Fc com variação knob e uma cadeia leve de Ig, em que o complexo se liga especificamente ao IGF-1R humano, e as células T específicas na respectiva relação (1:1,5 a 1:0,5) (vide a Figura 12). A percentagem de lise é representada acima das respectivas barras. O anticorpo monoclonal humano IgG1 afucosilado direcionado contra IGF-1R (Mab IGF-1R-afu) não desencadeia uma lise significativa das células tumorais.

[0352] O complexo tal como é divulgado na presente invenção desencadeia a lise de células-alvo I24 3T3 por meio das células-T específicas para CMV.

[0353] As células-alvo foram incubadas por 4 horas com 1 μg/mL do complexo de ligação ao antígeno compreendendo um polipeptídeo de fusão [peptídeo-CMV-pp65] - [ligante 1] - [β2-microglobulina] - [ligante 2] - [HLA-A-α1- α2-α3] - [ligante 3] - [IgG1-L234A, L235A mutante com variação hole], uma IgG1-L234A, L235A mutante ligada por dissulfeto com região Fc com variação knob e uma cadeia leve de Ig, em que o complexo se liga especificamente ao IGF-1R humano, e as células T específicas na respectiva relação (1:1,5 a 1:0,5) (vide a Figura 13). A percentagem de lise é representada acima das respectivas barras. Um anticorpo monoclonal humano IgG1 afucosilado direcionado contra IGF-1R (anticorpo anti-IGF-1R-afucosilado) e anticorpo anti- digoxigenina humano não ligante (anticorpo anti-digoxigenina) não desencadeou uma significante lise celular.

EXEMPLO 7 EFICÁCIA IN VITRO

[0354] Uma linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão H460M2 IGF-1R positiva foi incubada com 1 μg/mL de um complexo compreendendo um peptídeo derivado da hCMV e um anticorpo anti-IGF-1R e células T CD8 positivas específicas para CMV em uma relação baixa de célula efetora para células-alvo (1,5 a 0,5 células T específicas por célula tumoral). O anticorpo controle foi um anticorpo anti-IGF-1R desenvolvido por glico- engenharia. O tempo de incubação foi de 6 horas. A incubação com o complexo resultou na potente remoção de células tumorais H460M2.

Claims

1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UM COMPLEXO, compreendendo: - ) um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- terminal para C-terminal: - um peptídeo derivado de vírus que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 9, - um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22, e 23; - uma β2-microglobulina que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; - um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; - os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC classe I que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e - um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 12, 16, 17, 18, 21, 22 e 23; - i) um par de cadeias polipeptídicas ligadas por dissulfeto derivadas de uma região de dobradiça do anticorpo, em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto e a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreenderem um domínio CH2 da IgG1 humana, compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31, 32 e 33, e um domínio CH3 da IgG1 humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 34, 35, e 36; e - ii) pelo menos um par de um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo em uma célula eucariótica, caracterizado por compreender as seguintes etapas: - cultivar uma célula eucariótica compreendendo um ou mais ácidos nucleicos codificantes do complexo, e - recuperar o complexo a partir da célula ou do meio de cultura; em que o complexo compreende exatamente um do referido polipeptídeo de fusão, e em que o polipeptídeo de fusão é: - covalentemente ligado, tanto no C-terminal quanto no N- terminal, a uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por dissulfeto; - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é complementar ao domínio variável de cadeia pesada ou leve ao compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto; - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante da cadeia pesada ou leve complementar ao compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo complexo ser obtido com uma concentração de 1 mg/mL ou mais no meio de cultivo.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela célula eucariótica ser uma célula de mamífero.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela célula de mamífero ser uma célula de rim embrionário humano, ou uma célula de ovário de hamster chinês, ou uma célula de rim filhotes de hamster, ou uma célula de mieloma de camundongo.

5. COMPLEXO, caracterizado por compreender: - um polipeptídeo de fusão que compreende na direção N- terminal para C-terminal: (i) um peptídeo derivado de vírus que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 9, (ii) um primeiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22, e 23; (iii) uma β2-microglobulina que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (iv) um segundo peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 21, 22 e 23; (v) os domínios extracelulares α1, α2 e α3 de uma molécula MHC classe I que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e (vi) um terceiro peptídeo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 12, 16, 17, 18, 21, 22 e 23, e - duas cadeias de polipeptídeos, que estão ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto, em que a primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende, na direção N-terminal para C-terminal: (i) um domínio variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, (ii) um domínio constante da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, e (iii) um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos selecionada da partir da SEQ ID NO: 24-30 ou 47-51, em que a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto compreende um polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo, em que ambas, a primeira e a segunda cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, compreendem um domínio CH2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31, 32 e 33 e um domínio CH3 de origem humana compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 34, 35 e 36; em que o polipeptídeo de fusão está: - covalentemente ligado à extremidade C-terminal ou à extremidade N-terminal de uma das cadeias de polipeptídeos ligadas por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao N-terminal de um domínio variável de anticorpo que é o domínio variável de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto, ou - covalentemente ligado ao C-terminal de um domínio constante de anticorpo que é o domínio constante de cadeia leve ou pesada complementar àquele compreendido na primeira cadeia polipeptídica ligada por dissulfeto; com a condição de que o complexo compreenda exatamente um polipeptídeo de fusão.

6. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o complexo, conforme definido na reivindicação 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

7. USO DO COMPLEXO, conforme definido na reivindicação 5, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer ou infecção viral crônica.

8. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo medicamento ser para atrair células T citotóxicas vírus-específicas de um indivíduo para um alvo.

9. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo medicamento ser para a remoção de células de câncer ou células infectadas por vírus.