TW201234977A - Feed additive composition - Google Patents

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TW201234977A
TW201234977A TW101102303A TW101102303A TW201234977A TW 201234977 A TW201234977 A TW 201234977A TW 101102303 A TW101102303 A TW 101102303A TW 101102303 A TW101102303 A TW 101102303A TW 201234977 A TW201234977 A TW 201234977A
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Danisco
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Description

201234977 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用直接飼餵微生物與特定酶組合之組合 改良飼料組合物的方法，及包含直接飼銀微生物與特定_ 組合之組合的飼料添加劑組合物。本發明進一步係關於用 • 途及套組。 1r ' 【先前技術】 使用補充酶作為動物飼料、尤其家禽及豬飼料之添加 〇 劑，作為改良營 養素利用及生產性能特性的方式。酶換人 物可用於改良含有大豆粉、動物蛋白粉或高纖維食物副產 品之飲食的營養價值。 直接飼餵微生物（DFM)之概念涉及在動物（例如乳牛）處 於長期應力（疾病、日糧變化、環境或生產攻毒）下時向其 飼餵有益微生物《益生菌係此類飼料添加劑之另—術扭。 在控制研究中已顯示益生菌或DFM可改良動物性能。dfm 包括直接飼餵細菌及或基於酵母之產物。 Ο Λ* 儘管已涵蓋DFM與一些酶之組合，但從來沒有完全瞭解 DFM與酶間之相互作用。本發明係關於新穎特定組合，其 令人奇地顯著改良動物之生產性能特性。 * 【發明内容】 本發明之有潛力之發現係DFM與蛋白酶、木聚糖酶、殿 粉酶及植酸酶之組合對動物之性能具有顯著有益作用。 具體而言，本發明之有潛力之發現係DFm與蛋白酶、木 聚糖酶、澱粉酶及植酸酶之組合對動物 1王16具有顯著有 161711.doc 201234977 -作用，包括改良以下中之一或多者：飼料轉化率 (FCR)、消化原料之能力(例如營養素消化率，例如胺基酸 消化率)、氮保留量、存活率、屠宰率、生長速率、重量 增加、飼料效率、動物對壞死性腸炎之抗性、個體之免疫 反應、或個體之胃腸道中之有益細菌的生長。 在-個態樣中，本發明提供飼料添加劑組合物，其包含 直接飼餵微生物與蛋白酶、木聚糖酶、澱粉酶及植酸酶之 組合（或基本上由其組成或由其組成）。 在另1、樣中’本發明提供用於以下之方法：改良個體 之性能或改良飼料中之原料的消化率(例如營養素消化 率，例如胺基酸消化率），或改良氣保留量，或避免壞死 性腸炎之負面影響或改良飼料轉化率（fcr)或改良個體之 重量增加或改良個體中之飼料效率或調節（例如改良）個體 之免疫反應或促進個體之胃腸道甲的有益細菌生長該方 法包含向個體投與直接純微生物與蛋白酶、木聚糖酶、 澱粉酶及植酸酶之組合。 本發明之又—態樣係直接飼健微生物與蛋白酶、木聚糖 酶、澱粉酶及植酸酶之組合的料，其用於改良個體之性 能或改良飼料中之原料的消化率(例如營養素消化率，例 如月女基酸/肖化率）’或改良氮保留量’或避免壞死性腸炎 之負面影響或改良飼料轉化率（FCR)或改良個體之重量增 加或改良個體中之飼^丈率或調節（例如改（）個體之免疫 反應或促進個體之胃腸道中的有益細菌生長。 在本發明之又一態樣中，提供包含直接飼餵微生物、蛋 161711.doc 201234977 白酶、木聚糖酶、殿粉酶、植酸酶（及視情況至少—種維 生素及/或視情況至少-種礦物f)及投與說明書的套組。 在另t樣中，本發明提供製備飼料添加劑組合物之方 法’其包含混合直接飼餵微生物與蛋白酶、木聚糖酶、澱 粉酶及植酸酶及（視情況）包裝。 在又-態樣中’本發明提供包含飼料添加劑組合物之飼 料或飼料原料，該飼料添加縣合物包含直接飼厳微生物 與蛋白酶、木聚糖酶、澱粉酶及植酸酶之組合（或基本上 由其組成或由其組成）。 預混合物包含飼料添加劑組合物及至少一種礦物質及/ 或至少一種維生素，該飼料添加劑組合物包含直接飼餵微 生物與蛋白酶、木聚糖酶、澱粉酶及植酸酶之組合（或基 本上由其組成或由其組成）。 在另一態樣中，本發明提供製備飼料原料之方法，其包 含混合飼料組份與飼料添加劑組合物，該飼料添加劑組合 物包含直接飼餵微生物與蛋白酶、木聚糖酶、澱粉酶及植 酸酶之組合（或基本上由其組成或由其組成）。 在又一態樣中，本發明係關於飼料添加劑組合物，其用 於預防及/或治療個體中之球蟲病及/或壞死性腸炎。 本發明又進一步提供預防及/或治療壞死性腸炎及/或球 蟲病之方法，其中向個體投與有效量的本發明之飼料添加 劑組合物。 【實施方式】 較佳地，本發明中所用之每一酶均對DFM係外源性的。 161711.doc 201234977 換言之，較佳將酶添加至DFM中或與其混合。 除非另外定義，否則本文所用所有技術及科學術語皆具 有與熟習本發明所屬領域技術者通常所瞭解意義相同之意 義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第 20版，John Wiley and Sons，New York (1994)，及 Hale及 Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY ， Harper Perennial，NY (1991)為熟習此項技術者提供關於本發明 中所用多個術語之一般性字典。 本發明並不受本文所揭示例示性方法及材料之限制，且 在本發明實施例之實踐或測試中可使用與本文所述方法及 材料類似或等效之任何方法及材料。數字範圍包括界定該 範圍之數字。除非另外指明，否則分別地，任何核酸序列 係在5'之3'定向上自左至右書寫；胺基酸序列係在胺基至 羧基定向上自左至右書寫。 本文提供之標題並不限制可藉由整體參照本說明書具有 之本發明之各個態樣或實施例。因此，藉由整體參照說明 書更全面地定義緊跟下文定義之術語。 本文使用胺基酸之名稱（即三個字母縮寫或單一字母縮 寫）提及胺基酸。 本文所用術語「蛋白質」包括蛋白質、多肽及肽。 本文所用術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術 語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」 與術語「肽」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」 161711.doc 201234977 與術語「酶」同義。 術語「蛋白質」與「多肽」在本文中可互換使用。在本 發明及申請專利範圍中’胺基酸殘基可使用習用單字母及 三字母密碼。胺基酸之3字母密碼係遵照mPACIUB Joint
Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)定義。亦 應瞭解’由於遺傳密碼之具有簡並性，故可藉由一個以上 核苷酸序列編碼多肽。
其他術語定義可貫穿說明書出現。在更詳細闡述例示性 實施例之前，應瞭解，本發明並不限於所述特定實施例， 因此當然可有所變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅出於 闡述特定實施例之目的而非意欲限制本發明之範圍，此乃 因本發明之範圍僅受限於隨附申請專利範圍。 若提供值之範圍，則應瞭解，亦明確揭示該範圍之上限 與下限間之每一中介值（除非上下文有其他明確指示否 則精確至下限單位之十分之_)。本發明内涵蓋所述範圍 中之任-所述值或中介值與所述範Μ之任—其他所述值 或中介值間的每-較小範圍。可在職时獨立地包括或 排除該等較小範園之t m芬π 固之上限及下限，且除了所述範圍令明確 排除之任何限值以外，本發明 、 乃門邳，函羞任一限值、無限值 或兩個限值包括於較小範圍中息 祀固甲之母—範圍。若所述範圍包 括限值之一者或二者，則本發 發月中亦包括排除彼等所包括 限值之任一者或二者的範圍。 必須注意， 申請專利範圍 除非上下文另外明確說明，否則本文及隨附 中所用之單數形式「_(a、⑽）」及「該 161711.doc 201234977 (the)」均包括複數個指示物。因此，例如，在提及「酶 時包括複數個該等候選試劑且在提及「飼料」時包括提1 彼等熱習此項技術者已知之一或多種飼料及其等效物等。 本文所討論公開案僅因為其揭示内容先於本申請案之申 請曰期而提供。本文中之任何事情均不應理解為承認該等 公開案構成隨附申請專利範圍之先前技術。 用於本發明中之酶可藉由固體或浸沒培養（包括分批、 補料分批及連續流動方法）製造。培養係在包含以下之生 長培養基中完成：水性礦物鹽培養基、有機生長因子、碳 及能量來源材料、分子氧及（當然）一或多種欲採用之特定 微生物物質之起始接種物。 直接飼银微生物（DFM) 本文所用術語「微生物（micr〇bial)」可與「微生物 (microorganism)」互換使用。 較佳地，DFM包含活的微生物。較佳地，DFM&含活的 細菌或活的酵母或活的真菌。 在一個較佳實施例中’ DFM包含活的細菌。 術語「活的微生物」意指具有代謝活性或能夠分化之微 生物。 在一個實施例中，DFM可為孢子形成細菌且因此，術語 DFM可包括或含有孢子，例如細菌孢子。因此，在一個實 施例中，本文所用術語「活的微生物」可包括微生物孢 子，例如内生抱子或分生孢子。
在另實施例中，本發明之飼料添加劑組合物中之DFM 161711.doc 201234977 不包括或不含有微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子。 微生物可為天然微生物或其可為轉化微生物。微生物亦 可為適宜微生物之組合。 在一些態樣中，本發明之DFM可為以下中之一或多者： 細菌、酵母或真菌。 ' 較佳地，本發明之DFM係益生菌微生物。 在本發明中，術語直接飼餵微生物（DFM)涵蓋直接飼餵 細菌、直接飼餵酵母、直接飼餵酵母及其組合。 Ο 較佳地，DFM係直接飼餵細菌。 較佳地’ DFM係包含兩種或更多種（例如三種或更多種 或四種或更多種）細菌之組合；或DFM係包含兩種或更多 種（例如三種或更多種或四種或更多種）細菌菌株之組合。 較佳地，細菌係分離的。 適宜地，DFM可包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌 、乳球菌、鏈球菌 (Streptococcus)、芽孢桿菌(Bacillus)、片球菌 〇 、腸球菌、明串球菌 (XeMCOwosioc)、肉桿菌、丙酸桿菌 ' 、雙歧桿菌、梭菌 • TC/osir油'wm)及巨球形菌^及其組合。 在一個實施例中，DFM可選自以下芽孢桿菌屬：枯草芽 孢桿菌（^aci/Zws sw⑽/叫、臘狀芽孢桿菌⑺acH/ws cerews)、地衣芽孢桿菌口ac///WiS 及解殿粉芽 拖桿菌（Bacillus amyloliquefacierts)。 在一個實施例中，DFM可為包含兩種或更多種芽孢桿菌 161711.doc 201234977 菌株之組合。 在一個實施例中，DFM可為兩種或更多種以下枯草芽孢 桿菌菌株之組合：3入-?4(?丁入-6506)、15入-?4(卩丁八- 6507)、22C-P1 (PTA-6508)、2084 (NRRL B-500130)、 LSSA01 (NRRL-B-50104)、BS27 (NRRL B-50105)、BS 18 (NRRL B-50633)及 BS 278 (NRRL B-50634)。 菌株 3A-P4 (PTA-6506)、15A-P4 (PTA-6507)及 22C-P1 (PTA-6508)係自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection)(ATCC)公開購得。 菌株 2084 (NRRL B-500130) ' LSSA01 (NRRL-B-50104)、BS27 (NRRL B-50105)係自美國農業部菌種中心 (Agricultural Research Service Culture Collection) (NRRL) 公開購得。菌株枯草芽孢桿菌LSSa〇i有時稱作枯草芽孢 桿菌8。 該等菌株教示於US 7,754,469 B2中。 在一些實施例中，DFM可為包含枯草芽孢桿菌菌株之組 合，如下表中詳細闡述：
轉4 曝纖驅 二 ·鲴躧V f ί .Bs^ ；(LSs4-Q1) - * 1 Bs 3Λ- Ρ4 Bs 15Α- Ρ^- Bs,220-PI X X X X X X Ί ~X~~ DFM X X 組合 X X X X X X 包含 X Η ~X~~ ~~~X X --—— ~~~X 卜X ~X~~ r7?c X I6171I.doc •10· 201234977 在一個實施例中，DFM可選自以下乳球菌屬：乳脂鏈球 菌（Laciocroccws creworz’W 及雷特氏乳球菌 及其組合。 在一個實施例中，DFM可選自以下乳桿菌屬 (aaciohcz’/Zw^s spp):布赫内氏乳桿菌 、嗜酸乳桿菌（7^eio0iZCz7/w·? aczWop/n’/wW、乾胳 乳桿菌 、開菲爾乳桿菌（7^c?i〇6aci7/wj
A：e/zWJ、雙又乳桿菌「Lacic^ac/Z/w·? △(/'zWwW、短乳桿菌 (Lactobacillus brevis)、瑞士乳辑菌（Lactobacillus /ze/veiicws」、副乾赂乳桿菌「LotcioZjacz_//w·? /^racajez·)、鼠 李糖乳桿菌（Xacic^aci/ZMS r/zamwoswi)、唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius)、臀曲乳桿菌 cwrvaiws)、保加利亞乳桿菌（Tacio^ac/Z/w·? Z>w/gaWcwij、沙 克乳桿菌、羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus rewierz·)、發酵乳桿菌（T^cioftac^/wj /ermewiwm)、香腸乳桿菌〈Lacio6acz7/w·? /arc/’w/w/·?)、乳酸 乳桿菌 fXacio6acz7/Mi /aci/·?)、對德氏乳桿菌 delbreuckii)、胚芽乳桿菌（LactobaciHus plantarum)、類植 物乳桿菌、香腸乳桿菌、鼠 李糖乳桿菌、捲曲乳桿菌（^aci〇&acz•"⑽、加氏 乳桿菌（Xacio办ac/Z/ws gawer/J、約氏乳桿菌（T/aciioijac^/ws /o/mjom’zV及簡氏乳桿菌及其任何組 合0 在一個實施例中，DFM可選自以下雙歧桿菌屬 161711.doc 201234977 spp):雙歧桿菌乳酸 /aei/y、兩歧雙歧桿菌〔·β//ϊβ?ο6α<:ί6γϊ·ι^ 、長雙歧 桿菌 (Bifidobacterium longum)、 動物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animalis)、短雙成择溘（Bifidobacterium ftrevej、嬰兒雙歧桿菌〜/⑽沿）、鍵狀雙 歧桿菌（^(/Vdo^acierz’wm catenulatum)、作支小鏈雙歧桿菌 (Bifidobacterium pseudocatenulatum)、青春雙歧桿菌 (Bifidobacterium adolescentis)及 角形雙 歧桿菌 ('Bifidobacterium angulatum)反矣任 泣合 〇 適宜地’ DFM可包含來自以下一或多種菌種之細菌：枯 草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、腸球菌、 腸球菌屬、及片球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳 桿菌、乳酸片球菌acW/aciz.cz·」、雷特氏乳球 菌、兩歧雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌、特氏丙酸桿菌
Am、香腸乳桿菌、鼠李糖乳桿 函 埃氏巨球形菌心⑴7)、丁酸梭菌 (Clostridium butyricum)、動物雙呔楫 nM(B{fid〇bacteHum ⑽zwa/b ssp. awma/㈨、羅伊氏乳桿菌、臘狀芽孢桿菌、 唾液乳桿菌屬 '丙酸桿菌屬riv〇W〇m.6acien_a及其組 合。 本發明中使用之直接飼餵細菌可屬於相同類型（屬、物 種及菌株）或可包含屬、物種及/或菌株之混合物。 ★適宜地，本發明之DFM可為如下表中之產品或包含於彼 等產品中之微生物中的一或多者： 1617Il.doc 12 201234977 產品名稱 公司 微生物 共生成份 Enviva Pro®. (先前稱作 Avicorr®) Danisco A/S 登錄號為NRR1 B-50013之枯 草芽孢桿菌菌株2084、 登錄號為NRRL B-50104之枯 草芽孢桿菌菌株LSSA01及 ATCC登錄號為PTA-6507之枯 草芽孢桿菌菌株15A-P4 Calsporin® Calpis - Japan 栝草芽孢桿菌菌株C3102 Clostat® Kemin Industries 公 司 枯草芽孢桿菌菌株PB6 Cylactin® DSM 腸球菌 NCIMB 10415 (SF68) Gallipro® 及 GalliproMax® Chr. Hansen A/S 枯草芽孢桿菌菌株C3102 Gallipro® Tect® Chr. Hansen A/S 地衣芽孢桿菌 Poultry star® Biomin公司 腸球菌及片球菌 果·募糖 Protexin® Protexin Int 乳桿菌、雙歧桿菌及另一者 Proflora® Alpharma 公 司 括草芽孢桿菌菌株QST 713 β-Mos β-甘露 寡糖及 β-葡聚 糖 Ecobiol® 及 Ecobiol® Plus Norel S.A. 解澱粉芽孢桿菌CECT-5940 Fortiflora® 原腸球菌 faecium) SF68 BioPlus2B® DSM 枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿 菌 -----. 161711.doc 13 201234977
Lactiferm® Chr. Hansen 乳酸細菌7 原腸球菌 CSI® Danisco A/S 芽抱桿菌菌株 Yea-Sacc® Alltech 酿酒酵母 cerevisiae) Biomin IMB52® Biomin 腸球菌 Biomin C5® Biomin 乳酸片球菌、 腸球菌、 動物雙歧桿菌屬、 羅伊氏乳桿菌 唾液乳桿菌屬 Biacton® ChemVet 香腸乳桿菌 OralinE1707® Chevita GmBH 腸球菌 Probios-pioneer PDFM® Chr Hansen 腸球菌(2株菌株） 雷特氏乳球菌DSM 11037 Sorbiflore® Danisco Animal Nutrition 鼠李糖乳桿菌茨 香腸乳桿菌 Animavit® KRKA 括草芽孢桿菌 Bon vital® Lactosan GmbH 腸球菌 Levucell SB 20® Lallemand 釀酒酵母 Levucell SC 0 &SC10®ME Lallemand 釀酒酵母 Bactocell Lallemand 求菌 ActiSaf®(先前 稱作 BioSaf®) Le Saf&e 釀酒酵母 — 161711.doc -14- 201234977
Actisaf® SC47 Le Saffre 釀酒酵母NCYC Sc47 Miya-Gold® Miyarisan Pharma 丁酸梭菌 Fecinor 及 Fecinor Plus® Norel S.A 腸球菌 InteSwine® ntegro Gida ve Ticaret AS，由 RM Associates 有 限公司代表 釀酒酵母NCYCR-625 BioSprint® ProSol SpA 釀酒酵母 Provita® Provita 腸球菌及 鼠李糖乳桿菌 PepSoyGen-C® Regal BV (Nutraferma) 枯草芽孢桿菌及 糸麵徽(Aspergillus oryzae) Toyocerin® Rubinum 臘狀芽孢桿菌 TOYOCERIN® Rubinum toyoi變種臘狀芽孢桿菌 NCIMB 40112/CNCM1-1012 在一個實施例中，適宜地，DFM可為Enviva Pro®。 Enviva Pro®係購自Danisco A/S且係登錄號為NRR1 B-50013之芽孢桿菌菌株2084、登錄號為NRRL B-50104之芽 孢桿菌菌株LSSAOl及ATCC登錄號為PTA-6507之芽孢桿菌 菌株15A-P4的組合（如US 7,754,469 B中所教示-該案件以 引用方式併入本文中）。 適宜地，DFM可包含來自以下屬之酵母：梦孕·磨雀。 較佳地，欲根據本發明使用之DFM係通常認為安全且較 佳經GRAS批准之微生物。 161711.doc • 15· 201234977 業工業及 物之具體 熟習此項技術者將容易地自用於食品及/或農 通常認為適於動物構取之本文所述屬内瞭解微生 物種及或菌株。 較佳地，㈣本發明使狀贿係適於動物攝取者。 有利地’若產品係飼料或飼料添加劑組合物，則 DFM應貫穿產品之正常「銷售」或「失效」日期在零 提供飼料或飼料添加劑組合物用於銷售之期間仍有效 望時間長度及正常存架壽命將因飼料原料不同*有所變化 且彼等熟習此項技術者應認識到存架#命_將端視飼料 原料類型、匈料原料尺寸、儲存溫度、處理條件、包 料及包裝設備而有所變化。 在-些實施例中，重要的是，贿具有财熱性，即可耐 熱。在將飼料製成丸之情形下尤其如此。因此，在一個實 施例中’ DFM可&财熱微生物，例如对熱細菌， 如）芽孢桿菌屬。 在一些實施例中，DFM係產生抱子之細菌（例如桿菌 咖咖；’例如芽孢桿菌屬）可為較佳。纟生長條件不利 時，桿菌能夠形成穩定内生孢子，且其對熱、pH、水分及 消毒劑具有極強抗性。 在一個實施例中，適宜地，DFM可減少或防止病原體微 生物（例如產氣莢膜梭菌rc/〇wW山·ww 匀及/或埃 希氏大腸桿菌成co⑴及/或沙門氏菌屬（心&⑽e//a spp)及/ 或膏曲桿菌屬spp·))在腸内建立。 本發明之DFM可為任一適宜DFM。在一個實施例中，可 161711.doc -16 - 201234977 使用以下分析「DFM分如 τφ 析」確疋微生物成為dfm之適宜 性。為避免產生疑問，在—個實施例中，根據本文所教示 「顧分析」選擇作為抑制性菌株（或抗病原體DF⑷之 麵係適用於本發明中（即本發明之飼料添加劑組合物 之 DFM。 DFM分析： 將S各自用來自代表性簇之代表性病原體接種。 向接種管中添加以好氧方式或厭氧方式生長之潛在DFM 的上清液並培育》 在培育後，針對每一病原體量測對照及上清液處理之管 的光密度（OD) 將與對照相比產生降低〇D之（潛在DFM)菌株之菌落分類 為抑制性菌株（或抗病原體。 在US2009/0280090(以引用方式併入本文中）中更詳細解 釋如本文所用DFM分析。 較佳地，分析中所用代表性病原體係以下中之一者（或 多者）··梭菌（例如產氣莢膜梭菌及/或難辨梭菌 請入）、及/或埃希氏大腸桿菌及/或沙門 氏菌屬及/或彎曲桿菌屬。在一個較佳實施例中，利用以 下中之一或多者實施分析：產氣莢膜梭菌及/或摩辨瘦次 芽抱桿菌及/或埃希氏大腸桿菌，較佳產氣莢膜梭菌及/或 難辨梭菌，更佳產氣莢膜梭菌。 在一個實施例中，本發明之DFM較佳係抗病原體。 本文所用術語「抗病原體」意指DFM抵消病原體之效應 161711.doc •17· 201234977 (負面影響）。 在一個實施例中，為確定DFM是否為抗病原性DFM，可 使用上述DFM分析。若在上述「DFM分析」中將DFM分類 為抑制性菌株，例如在病原體係產氣莢膜梭菌時，將DFM 視為抗病原體或抗病原性DFM。 在一個實施例中，抗病原體DFM可為以下細菌中之一或 多者： 枯草芽孢桿菌菌株2084，登錄號NRRL B-50013， 枯草芽孢桿菌菌株LSSAOl，登錄號NRRL B-50104， 枯草芽孢桿菌菌株15A-P4 ATCC，登錄號PTA-6507， 枯草芽孢桿菌菌株3A-P4，ATCC登錄號PTA-6506，及 枯草芽孢桿菌菌株BS27，ATCC登錄號NRRL B-5 0105。 為避免產生疑問，該等菌株可獲得且在US 7,754,459 B 中提及。 在一個實施例中，根據本發明使用之DFM並非如 W02008/016214中所教示登錄號為KCTC 10902BP之加氏 乳桿菌BNR 17菌株。 較佳地，DFM並非滅活微生物。 在一個實施例中，此處所用之DFM係包含一或多種如本 文所述DFM微生物之組合物。該組合物可另外包含本發明 之酶。可將該組合物作為直接飼餵微生物（DFM)飼餵給動 物。可向DFM中添加一或多種載劑或其他成份。DFM可以 各種物理形式呈現，例如，以表面加料（top dress)形式， 以用作液體獸用頓服藥或欲添加至代乳品中之水溶性濃縮 161711.doc -18- 201234977 Ο Ο 物、明膠膠囊或凝膠形式。在表面加料形式之—個實施例 中，將冷柬乾燥之發酵產物添加至載劑（例如乳清、麥芽 糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石（碳酸鈣）、稻殼、酵母培養 物、乾燥澱粉及/或矽鋁酸鈉）中。在用於液體獸用頓服藥 或代乳品補充劑之水溶性濃縮物的一個實施例_，將冷凍 乾燥之發酵產物添加至水溶性載劑（例如乳清、麥芽糊 精、蔗糖、右旋糖、乾燥澱粉、矽鋁酸鈉）中；且添加液 體以形成獸用頓服藥或向乳製品或代乳品中添加補充劑。 在明膠膠囊形式之-個實施例中，將冷束乾燥之發酵產物 添加至載劑（例如乳清、麥芽糊精、糖、石灰石（碳_)、 稻殼、酵母培養物乾燥澱粉及/或矽鋁酸鈉）中。在一個實 施例中，將細菌及載劑封閉於可降解明膠膠囊中。在凝膠 形式之-個實施例中，將冷康乾燥之發酵產物添加至載劑 (例如植物油、薦糖、二氧化石夕、聚山梨醇醋80、丙二 醇、丁基化經基苯甲_、擰檬酸、乙氣啥⑽oxyquin)及/ 或人工著色劑）中以形成凝膠。 腦可視情況與添加劑（包括但不限於生長基質、酶、 糖、：水化合物、提取物及促生長之微成份)之乾燥調配 物混合。糖可包括以下：乳糖、麥芽糖、右旋糖、麥芽糊 精、錢糖、果糖、甘露糖、塔蓋糖（tagatose)、山梨糖、 棉子糖及半乳糖。糖單獨 獨次組合之範圍為50%至95%。提 取物可包括酵母或乾燥酵母 ^ 發酵可溶物，範圍為5 %至 5〇%。生長基質可包括 勹5/0至 ， 酶解胳蛋白，範圍為5%至 25 /。，乳酸鈉，範圍為$ %至 0，及Tween 80，範圍為 1〇/〇 161711.doc -19· 201234977 至5%。碳水化合物可包括甘露醇、山梨醇、戊五醇及阿 糖醇。叙水化合物單獨或組合之範圍為5%至观。微成份 可包括以下：碳_，範圍為㈣至5.0% ;氣化好，範圍 為0 · 5 A至5 · 〇 % 酸急—^ 鱗駿虱一鉀’靶圍為0·5〇/。至5〇% ;磷酸 赶，範圍為0.5%至5.0% ;蛋白猛，範圍為〇.25%至 1.00% ’·及錳，範圍為0 25%至J 〇%。 為製備本文所述DFM，可將培養物及載劑（若使用）添加 至帶式或槳式混合器中並混合約15分鐘，但可增加或減少 時間。摻和各組份以便纟生培養物與載劑之均句混合物。 最終產物較佳係乾燥可流動之粉末。隨後可將DFM或包含 其之組合物添加至動物飼料或飼料預混合物中添加至動 物水中，或以業内已知之其他方式投與（較佳與本發明之 酶同時投與）。動物用飼料可補充有本文所述之一或多種 DFM或本文所述組合物。 至少兩種菌株之混合物」意指兩種、三種、四種、五 種、六種或甚至更多種菌株之混合物。在菌株之混合物之 一些實施例中’比例可自1%變化至99%。菌株之混合物之 其他實施例係自25。/。至75% ^菌株之混合物之額外實施例 係母一菌株約為50%。在混合物包含兩種以上菌株時，菌 株可以實質上相等比例或以不同比例存於混合物中。 可適當地給予DFM。 適宜地，飼料中之DFM之劑量可介於約lxl〇3 CFU/g飼 料至約lxlO9 CFU/g飼料之間’適宜地介於約ΐχΐ〇4 cFu/g 飼料至約lxlO8 CFU/g飼料之間，適宜地介於約7.5χ1〇4 16l711.doc •20- 201234977 CFU/g飼料至約ΐχΐ〇7 CFU/g飼料之間。 在一個實施例中，DFM係以超過約lxl〇3 CFU/g飼料、 適宜地超過約lxl〇4 CFU/g飼料、適宜地超過約7.5xl04 CFU/g飼料給予飼料原料中。 適宜地，飼料添加劑組合物中之DFM之劑量可介於約 lxl05 CFU/g組合物至約ΐχίο13 CFU/g組合物之間，適宜地 介於約lxlO6 CFU/g組合物至約lxlO12 CFU/g組合物之間， 適宜地介於約3.75xl07 CFU/g組合物至約1x10" CFU/g組 〇 合物之間。 在一個實施例中’ DFM係以超過約lxlO5 CFU/g組合 物、適宜地超過約lxl06 CFU/g組合物、適宜地超過約 3.75xl〇7 CFU/g組合物給予飼料添加劑組合物中。 在一個實施例中’ DFM係以超過約2x105 CFU/g組合 物、適宜地超過約2xl〇6 CFU/g組合物、適宜地超過約 3 ·75χ1〇7 CFU/g組合物給予飼料添加劑組合物中。 ❹ 本文所用術語「CFU」意指菌落形成單位且係活細胞之 量度，其中菌落代表源自單一祖細胞之細胞聚集物。 木聚糖酶 木聚糖酶係針對酶之類別給出之名稱，該等酶使多糖 1，4-木聚糖降解成木糖，由此使半纖維素（植物細胞壁之主 要組份之一）斷裂。 用於本發明中之木聚糖酶可為任何市售木聚糖酶。 適且地木聚糖酶可為内切]，4·Μ木聚糖酶（分類為 £丄，3.2.1.8)或1，4卜木糖苷酶（分類為艮匕32137)。 161711.doc •21 · 201234977 在一個實施例中，較佳為内切木聚糖酶中之木聚糖酶， 例如内切-1，4-β-(1-木聚糖酶。内切· 1,4-P-d-木聚糖酶之分 類號係 E.C. 3.2.1.8。 在一個實施例中，本發明係關於DFM與内切木聚糖酶 (例如内切-1,4-β-(1-木聚糖酶）及另一酶之組合。 此處提及之所有E.C.酶分類均係關於酶命名法（Enzyme Nomenclature)- Recommendations (1992) of the nomenclature committee of the International Union of Biochemistry 及 Molecular Biology-ISBN 0-12-2261 64-3 中提供之分 類。 適宜地，用於本發明中之木聚糖酶可為來自以下之木聚 糖酶：芽孢桿菌、木黴屬、嗜熱絲孢菌 (Thermomyces)、曲徽菌(Aspergillus)及青徽菌 (Penicillium)。 在一個實施例中’木聚糖酶可為Axtra XAP®或Avizyme 1502®(二者均係來自Danisco A/S之市售產品）中之木聚糖 酶。 在一個較佳實施例中，用於本發明中之木聚糖酶可為以 下商業產品中之一或多者中之木聚糖酶中之一或多者中： 商業名稱® 公司 木聚糖酶類型 木聚糖酶來源 Allzyme PT Alltech 内切木聚糖酶 --------- 黑麯黴 (Aspergillus Niger) Amvlofeed • Andres Pintaluba S.A 内切-Μ-β-木聚糖酶 黑麯黴(phoenicis) 16171l.doc •22- 201234977
Avemix 02 CS Aveve 内切-1，4-β-木聚糖酶 裏氏木黴 (Trichoderma reesei) AveMix XG 10 Aveve, NL 内切-1,4-β-木聚糖酶 裏氏木黴 Avizyme 1100 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 (Trichoderma longibrachiatum) Avizyme 1110 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Avizyme 1202 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Avizyme 1210 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Avizyme 1302 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Avizyme 1500 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Avizyme 1505 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Avizyme SX Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Belfeed MP100 Beldem 内切-1，4-β-木聚糖酶 栝草芽孢桿菌 Biofeed Plus DSM 内切-1，4-β-木聚糖酶 特異腐質黴 (Humicola insolens) Danisco 糖苷 酶(TPT/L) Danisco Animal Nutrition 内切-1，4-β-木聚糖酶 —---- 裏氏木黴 Danisco 木聚 糖酶 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 襄·氏木黴 Econase XT AB Vista 内切-1，4-β-木聚糖酶 裏氏木黴 161711.doc •23 · 201234977
Endofeed® DC Andres Pintaluba S.A. 内切-1，4-β-木聚糖酶 黑麯黴 Feedlyve AXL Lyven 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Grindazym GP Danisco 内切-1，4-β·木聚糖酶 黑麯黴 Grindazym GV Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 ----- --—__ 黑麯黴 Hostazym X Huvqiiarma 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Kemzyme Plus Dry Kemin 内切-1，4-β-木聚糖酶 綠色木黴 (Trichoderma viride) Kemzyme Plus Liquid Kemin 内切-1，4-β-木聚糠酶 綠色木黴 Kemzyme W dry Kemin 内切-1，4-β-木聚糖酶 綠色木黴 Kemzyme W liquid Kemin 内切-1，4-β-木聚糠酶 ------一----—__ 綠色木黴 Natugrain BASF 内切-1，4-β-木聚糖酶 ------- 長枝木黴 Natugrain TS Plus BASF 内切-1，4_β-木聚糖酶 一 ------- 黑麯黴 Natugrain Wheat BASF 内切-1，4-β·木聚糠酶 ------ 黑麯黴 Natugrain® TS/L BASF 内切-ΐ，4_β-木聚糖酶 ^^ —---- 黑麯黴 Natuzyme Bioproton 内切木聚糖酶 長枝木黴 /裏氏木徽 1617ll.doc -24- 201234977
Porzyme 8100 Danisco 内切-1，4-β-木聚糠酶 長枝木黴 Porzyme 8300 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木徽 Porzyme 9102 Danisco 内切-1,4-β-木聚糖酶 長枝木徽 Porzyme 9310/Avizyme 1310 Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Porzyme tplOO Danisco 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Ronozyme AX DSM 内切-1，4-β-木聚糖酶 米麯黴中表現之 疏棉狀嗜熱絲孢 菌(Thermomyces lanuginosus)基因 Ronozyme WX DSM/ Novozymes 内切-1，4-β-木聚糖酶 米麯黴中表現之 疏棉狀嗜熱絲孢 菌基因 Rovabio Excel Adisseo 内切-1，4-β_木聚糖酶 繩狀青黴菌 (Penicillium funiculosum) Roxazyme G2 DSM/ Novozymes 内切-1，4-β-木聚糖酶 長枝木黴 Safizym X Le Saffre ------ 内切-1，4_β-木聚糖酶 長枝木徽 木聚糖酶 Lyven 内切-1，4-β-木聚糖酶 ---------_ 長枝木黴 較佳地’木聚糖酶存於飼料原料中之範圍為約500 XU/kg至約16,000 XU/kg飼料’更佳約750 χυ/kg飼料至約 8000 XU/kg飼料，且甚至更佳約1〇〇〇 χυ/kg飼料至約4000 161711.doc -25- 201234977 XU/kg飼料。 在一個實施例中，木聚糖酶係以超過約500 XU/kg飼 料、適宜地超過約600 XU/kg飼料、適宜地超過約700 XU/kg飼料、適宜地超過約800 XU/kg飼料、適宜地超過約 900 XU/kg飼料、適宜地超過約1000 XU/kg飼料存於飼料 原料中。 在一個實施例中，木聚糖酶係以低於約16,000 XU/kg飼 料、適宜地低於約8000 XU/kg飼料、適宜地低於約7000 XU/kg飼料、適宜地低於約6000 XU/kg飼料、適宜地低於 約5000 XU/kg飼料、適宜地低於約4000 XU/kg飼料存於飼 料原料中。 較佳地，木聚糖酶存於飼料添加劑組合物中之範圍為約 100又11/§至約320,000又1；/邑組合物，更佳約300 乂1；/8組合 物至約160,000 XU/g組合物，且甚至更佳約500 XU/g組合 物至約50,000 XU/g組合物，且甚至更佳約500 XU/g組合 物至約40,000 XU/g組合物。 在一個實施例中，木聚糖酶係以超過約100 XU/g組合 物、適宜地超過約200 XU/g組合物 '適宜地超過約300 XU/g組合物、適宜地超過約400 XU/g組合物、適宜地超過 約500 XU/g組合物存於飼料添加劑組合物中。 在一個實施例中，木聚糖酶係以低於約320,000 XU/g組 合物、適宜地低於約160,000 XU/g組合物、適宜地低於约 50,000 XU/g組合物、適宜地低於約40,000 XU/g組合物、 161711.doc -26- 201234977 適宜地低於約30000 XU/g組合物存於飼料添加劑組合物 中。 應瞭解，一個木聚糖酶單位（XU)係於pH 5.3及50°C下每 分鐘自燕麥-木聚糖基質釋放0.5 μηιοί還原糖等效物（例如 藉由二硝基水揚酸（DNS)分析-還原糖方法產生之木糖）之 酶之量（Bailey, M.J. Biely，Ρ.及 Poutanen，κ.，J〇urnal 〇f
Biotechnology’ 第 23 卷 ’（3)，1992年 5月，257-270)。
在一個實施例中，適宜地，使用上述E.c.分類對酶進行 分類，且E.C.分類指示在本文所教示分析中測試用於測定 1 XU時具有該活性之酶。 澱粉酶 澱粉酶係針對能夠將澱粉水解成較短鏈募糖（例如麥芽 糖）之酶類別給出之名稱。隨後可將葡萄糖部分自麥芽糖 比自原始殿粉分子更容易地轉移至甘油單_或糖基甘油單 術浯澱粉酶包括 ^ ^ 形成性澱 私轉（E.C，3.2.1.60)、β·澱粉酶（E.c. 3 (v r ^ , .^七及丫-澱粉酶 (E.c· 3.2.1.3)。 在個實施例中，較佳地，澱粉酶係α :殿格給八上 尔α -澱粉酶。將〇: · 瓜粉細刀類為（E.C. 3.2.1.1)。 該等酶可包括細菌或真菌起源之澱粉 質或蛋白故_ 酶’包括經化學改 〜震曰改造之突變體。 在一個實施例中，較佳地，澱粉酶 菌之澱輅。， 匈來自地衣芽孢桿 w殿粉酶)及/或來自解极粉芽抱桿菌之殺 161711.doc •27· 201234977 粉酶（例如α_澱粉酶）。 在一個實施例中，α_澱粉酶可為Axtra XAP®或Avizyme 15〇2(§)(一者均係來自Danisco A/S之市售產品）中之α-澱粉 酶。 在另—實施例中，澱粉酶可為耐胃蛋白酶之α_澱粉酶， 耐胃蛋白酶之木徽屬（例如裏氏木黴）α搬粉酶。適宜 财月蛋白酶之α-澱粉酶教示於英國申請案第1011513.7號 (其以引用方式併入本文中）及pCT/IB2〇11/〇53〇1 8(其以引 用方式併入本文中）中。 在一個實施例中’澱粉酶可為包含以下胺基酸序列或由 其組成之耐胃蛋白酶之α-殿粉酶： Ο如 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 3 中所述； 如SEQ id Νο· i或SEQ ID ν〇· 3中所述，只是具有一 或若干胺基酸添加/***、缺失或取代； 出）與SEQ ID No_ 1具有至少85%(較佳至少90%、95%、 97%、98%或99%) —致性或與SEQ ID No. 3具有至少 70%(較佳至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或99%)—致性； iv) 其係藉由包含SEq m No. 2或SEQ ID No. 4之序列之 核苷酸序列之表現產生； v) 其係藉由與SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4不同（由於遺 傳密碼之簡並性）之核苷酸序列之表現產生； vi) 其係藉由與SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4之不同之處 在於一或若干胺基酸添加/***、缺失或取代之核苷酸序 161711.doc -28、 201234977 列的表現產生；或 vii)其係藉由與SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4具有至少 7〇%(較佳至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或99%)—致性之核苷酸序列的表現產生。 耐胃蛋白酶之α澱粉酶亦可由核苷酸序列編碼，在嚴格 或高度嚴格條件下該核苷酸序列與SEQ ID No. 2或SEQ ID • No. 4雜交。 在一個較佳實施例中，用於本發明中之澱粉酶可為以下 〇 商業產品中之一或多者中之澱粉酶中之一或多者中： 商業產品® 公司 澱粉酶類型 澱粉酶來源 Amylofeed Andres Pintaluba S.A (X澱粉酶 米麯黴 Avizyme 1500 Danisco α澱粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Avizyme 1505 Danisco α;殿粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Kemzyme Plus Dry Kemin 澱粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Kemzyme Plus Liquid Kemin α-澱粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Kemzyme W dry Kemin α-》殿粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Kemzyme W liquid Kemin α-澱粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Natuzyme Bioproton α-澱粉酶 長枝木黴/裏氏木黴 Porzyme 8100 Danisco α-澱粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Porzyme tplOO Danisco α-澱粉酶 解澱粉芽孢桿菌 161711.doc -29- 201234977
Ronozyme A DSM/Novozymes a-澱粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Ronozyme ΑΧ DSM a-澱粉酶 解澱粉芽孢桿菌 Ronozyme® RumiStar (L/CT) DSM/Novozymes a-澱粉酶 地衣芽孢桿菌中表現 之嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus) 在一個實施例中，澱粉酶可為來自芽孢桿菌之麥芽糖α-澱粉酶（參見ΕΡ 120 693)。此澱粉酶係以商品名NovamylTM 有市售（Novo Nordisk A/S, Denmark)。Novamyl詳細闡述於 國際專利公開案WO 91/104669中。 較佳地，澱粉酶存於飼料原料中之範圍為約50 AU/kg至 約10,000 AU/kg飼料，更佳約70 AU/kg飼料至約7500 AU/kg飼料，更佳約70 AU/kg飼料至約5000 AU/kg飼料且 甚至更佳約100 AU/kg飼料至約2000 AU/kg飼料。 在一個實施例中，澱粉酶係以超過約50 AU/kg飼料、適 宜地超過約60 AU/kg飼料、適宜地超過約70 AU/kg飼料、 適宜地超過約80 AU/kg飼料、適宜地超過約90 AU/kg飼 料、適宜地超過約100 AU/kg飼料存於飼料原料中。 在一個實施例中，澱粉酶係以低於約10,000 AU/kg飼 料、適宜地低於約8000 AU/kg飼料、適宜地低於約7000 AU/kg飼料、適宜地低於約5000 AU/kg飼料、適宜地低於 約4000 AU/kg飼料、適宜地低於約3000 AU/kg飼料、適宜 地低於約2〇00 AU/kg飼料存於飼料原料中。 161711.doc •30- 201234977 較佳地，澱粉酶存於飼料添加劑組合物中之範圍為約1 ο AU/kg至約200,000 AU/g組合物，更佳約30 AU/g組合物至 約100,000 AU/g組合物，且甚至更佳約40 AU/g組合物至約 50.000 AU/g組合物，且甚至更佳約50 AU/g組合物至約 20.000 AU/g組合物 ° 在一個實施例中，澱粉酶係以超過約10 AU/g組合物、 : 適宜地超過約20 AU/g組合物、適宜地超過約30 AU/g組合 物、適宜地超過約40 AU/g組合物、適宜地超過約50 AU/g 〇 組合物存於飼料添加劑組合物中。 在一個實施例中，澱粉酶係以低於約200,000 AU/g組合 物、適宜地低於約100,000 AU/g組合物、適宜地低於約 50.000 AU/g組合物、適宜地低於約40,000 AU/g組合物、 適宜地低於約30000 AU/g組合物、適宜地低於約20000 AU/g組合物存於飼料添加劑組合物中。 應瞭解，一個澱粉酶單位（AU)係於pH 6.5及37°C下每分 鐘自水不溶***聯澱粉聚合物基質釋放1 mmol糖苷鍵之酶 〇 之量（此在本文中可稱作用於測定1 AU之分析）。 1 TAU(cx-澱粉酶活性）係於pH 8.0及40°C下每分鐘自麥芽 ' 庚糖苷基質釋放（在過量a-葡糖苷酶存在下）0.20 μιηοΐ糖苷 - 鍵（以對硝基苯酚等效物表示）所需酶之量。此在本文中可 稱作用於測定1 TAU之分析。 在一個實施例中，適宜地，使用上述E. C.分類對酶進行 分類，且E.C.分類指示在本文所教示分析中測試用於測定 1 AU時具有該活性之酶。 161711.doc 31 - 201234977 蛋白酶 本文所用術語蛋白酶與肽酶或蛋白質酶同義。 用於本發明中之蛋白酶可為枯草桿菌蛋白酶（E.C. 3.4.21.62)或中性蛋白酶（E_C. 3.4.24.28)或鹼性絲胺酸蛋白 酶（E_C_ 3.4.21.X)或角蛋白酶（E.C. 3.4.X.X)。 較佳地，本發明之蛋白酶係枯草桿菌蛋白酶。 適宜蛋白酶包括動物、植物或微生物起源之蛋白酶。化 學改質或蛋白改造之突變體亦適宜。蛋白酶可為絲胺酸蛋 白酶或金屬蛋白酶，例如鹼性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣 蛋白酶。驗性蛋白酶之實例係枯草桿菌蛋白酶，尤其彼等 源自芽孢桿菌邊（例如Novo型枯草桿菌蛋白酶、嘉士伯枯 草桿菌蛋白酶（subtilisin Carlsberg)、枯草桿菌蛋白酶 309(參見Γ例如）美國專利第6,287,841號）、枯草桿菌蛋白酶 I47及枯草桿菌蛋白酶168(參見Γ例如）WO 89/06279))者。 跋蛋白酶樣蛋白酶之實例係胰蛋白酶（例如豬或牛起源之 胰蛋白酶）及鐮刀菌屬（Fwiariwm)蛋白酶（參見（例如）w〇 89/06270及WO 94/25583)。有用之蛋白酶之實例亦包括但 不限於WO 92/19729及WO 98/20115中所述之變體。 在一個較佳實施例中，用於本發明中之蛋白酶可為以下 商業產品中之一或多者中之蛋白酶中之一或多者中：
Avizyme 1100 Avizyme 1202 Avizyme 1302 Avizyme 1500 Danisco A/S Danisco A/S Danisco A/S Danisco A/S 至与酶來源 ^芽孢桿菌 $芽孢桿菌 .......- I _ ^_芽孢桿菌 旱菌蛋白酶 旱菌蛋白酶_ 旱菌蛋白 菌蛋白酶 16171I.doc •32· 201234977
Avizyme 1505 Danisco A/S 枯草桿菌蛋白酶 枯草芽孢桿菌 Kemzyme Plus Dry Kemin 中性蛋白醮 解搬輪·穿放媒諂 Kemzyme W dry Kemin 中性蛋白_ 解激給穿输媒餡 Natuzyme Bioproton 蛋白酶 長枝木黴/裏氏木黴 Porzyme 8300 Danisco _枯草桿菌蛋白_ 枯草芽孢桿菌 Ronozyme ProAct DSM/ Novozymes 鹼性絲胺酸蛋白酶 地衣芽孢桿菌中表 現之蔥綠擬諾卡氏 菌 {Nocardiopsis prasina)基因 Versazyme/ Cibenza DPI 00 Novus 角蛋白酶 地衣芽孢桿菌 在一個實施例中’蛋白酶可為來自枯草芽孢桿菌之蛋白 酶。 在一個實施例中，蛋白可為自Novozymes Α/S講得之 擬諾卡氏菌蛋白酶。 較佳地，蛋白酶存於飼料原料中之範圍為約1 〇〇〇 U/kg Q 至約20,000 PU/kg飼料，更佳約1500 pu/kg飼料至約10000 PU/kg飼料，更佳約2000 PU/kg飼料至約6000 PU/kg飼料。 在一個實施例中，蛋白酶係以超過約1 〇〇〇 PU/kg飼料、 適宜地超過約1500 PU/kg飼料、適宜地超過約2000 PU/kg 飼料存於飼料原料中。 在一個實施例中，蛋白酶係以低於約20,000 PU/kg飼 料、適宜地低於約10000 PU/kg飼料、適宜地低於約7000 PU/kg飼料、適宜地低於約6000 PU/kg飼料存於飼料原料 161711.doc -33- 201234977 中ο 較佳地，蛋白酶存於飼料添加劑組合物中之範圍為約 200 PU/g至約400,000 PU/g組合物，更佳約300 PU/g組合 物至約200,000 PU/g組合物，且甚至更佳約5000 PU/g組合 物至約100,000 PU/g組合物，且甚至更佳約700 PU/g組合 物至約70,000 PU/g組合物，且甚至更佳約1〇〇〇 PU/g組合 物至約60,000 PU/g組合物。 在一個實施例中，蛋白酶係以超過約200 PU/g組合物、 適宜地超過約300 PU/g組合物、適宜地超過約400 PU/g組 合物、適宜地超過約500 PU/g組合物、適宜地超過約750 PU/g組合物、適宜地超過約1000 PU/g組合物存於飼料添 加劑組合物中。 在一個實施例中，蛋白酶係以低於約400,000 PU/g組合 物、適宜地低於約200,000 PU/g組合物、適宜地低於約 100,000 PU/g組合物、適宜地低於約80,000 PU/g組合物、 適宜地低於約70000 PU/g組合物、適宜地低於約60000 PU/g組合物存於飼料添加劑組合物中。 應瞭解，一個蛋白酶單元（PU)係於pH 7.5(40 mM Na2P04/乳酸缓衝液）及40°C下在一分鐘内自受質（0.6%酪蛋 白溶液）放出1微克酚類化合物（以酪胺酸等效物表示）之酶 之量。此可稱作用於測定1 PU之分析。 在一個實施例中，適宜地，使用上述E.C.分類對酶進行 分類，且E.C.分類指示在本文所教示分析中測試用於測定 1 PU時具有該活性之酶。 161711.doc • 34- 201234977 植睃酶 可將用於本發明中之植酸酶分類為6-植酸酶（分類為E c 3.1.3.26)或 3-植酸酶（分類為 E.C. 3.1.3.8)。 在一個實施例中，植酸酶可為6-植酸酶（e.C. 3.1.3 26)。 在一個較佳實施例中，用於本發明中之植酸酶可為以下 商業產品中之一或多者中之植酸酶中之一或多者中： 商業產品® 公司 植酸酶類型 植酸酶來源 ~1 Finase AB Vista 3-植酸酶 裏氏木黴 ~~~ ~~~ Finase EC AB Vista 6-植酸酶 裏氏木黴中表現 大腸桿菌基因 Natuphos BASF 3-植酸酶 黑麯黴 Natuzyme Bioproton 植酸酶(類型 未指定） 長枝木黴/裏氏木黴 OPTIPHOS® Huvepharma AD 6-植酸酶 ψ 醇酵母(Pichiapast〇rjs) 中表現之埃希氏大腸桿菌 基因 Phytase spl002 DSM 3-植酸酶 多形漢遜酵母菌 、Hansenula polymorpha)今 表現之一致基因 Phyzyme XP Danisco 6-植酸酶 粟酒裂殖酵母 (Schizosaccahomyces 中表現之埃希氏大 腸桿菌基因 Quantum 2500D ， 5000L AB Vista 6-植酸酶 甲醇酵母或木黴屬中表現 之埃希氏大腸桿菌某因 Ronozyme Hi-Phos (M/L) DSM/ Novozymes 6-植酸酶 米麯黴中表現之布氏檸檬 酸样菌(Citrobacter braakii) 基因 161711.doc -35- 201234977
Ronozyme NP DSM/ Novozymes 6-植酸酶 米麯黴中表現之隔孢伏革 M(Peniphom fycii)基因 Ronozyme P DSM/ Novozymes 6-植酸酶 米麯黴中表現之隔孢伏革 菌基因 Rovabio PHY Adisseo 3-植酸酶 繩狀青黴菌 本文所用術語一致基因意指用於轉化有機體之DN A載體 含有基於一致序列之合成植酸酶基因、來自非病原性酵母 釀酒酵母之URA基因及埃希氏大腸桿菌貧歲pBR322之複 製起點。 在一個實施例中，植酸酶係源自以下之檸檬酸桿菌 植酸酶：例如，弗氏檸檬酸桿菌（Chrokcier ，較佳弗氏檸檬酸桿菌NCIMB 41247及其變體， 如（例如）W02006/038062(以引用方式併入本文中）及 W02006/03 8128(以引用方式併入本文中）中所揭示；布氏 檸檬酸桿菌YH-15，如W02004/08 5638中所揭示，有/U寧 檬酸桿菌ATCC 51113，如W02006/037328(以引用方式併 入本文中）中所揭示，以及其變體，如（例 如）WO2007/1 12739(以引用方式併入本文中）及 WO2011/1 17396(以引用方式併入本文中）中所揭示；無丙 二酸擰檬酸桿菌ama/owaiicw·?)，較佳無丙二 酸擰檬酸桿菌ATCC 25405或無丙二酸檸檬酸桿菌ATCC 25407，如W02006037327(以引用方式併入本文中）中所揭 示；吉氏#檬酸桿菌，較佳吉氏檸檬 酸桿菌DSM 13 694，如W020060373 27(以引用方式併入本 161711.doc -36- 201234977 文中）中所揭示；或中間檸檬酸桿菌 z’niermec/z'ws)、柯瑟氏棒檬酸桿菌、鼠 類檸檬酸桿菌fOiroZmcier mwr/im'aej、齧齒類棒檬酸桿菌 、塞拉克氏檸樣酸桿菌 jei//ijArz7)、沃克曼氏棒樣酸桿菌 fC7iro^>acier wer^7wawz’(j、 楊葛氏檸檬酸桿菌(X*办okcier yowngaej、檸檬酸桿菌屬多 肽或其變體。 在一個實施例中，植酸酶可為來自檸檬酸桿菌（例如來 自弗氏檸檬酸桿菌）之植酸酶，例如W02006/038128中教示 之植酸酶，該參考文獻以引用方式併入本文中。 在較佳實施例中，植酸酶較佳係以名稱Phyzyme XPTM由 Danisco A/S出售之埃希氏大腸桿菌植酸酶。 或者，植酸酶可為布丘氏菌植酸酶，例如 鄉間布丘氏菌agresiz’d植酸酶，例如WO 2006/043178 、 W02008/097619 、 W02009/129489 ' W02008/092901 、 PCT/US2009/41011 或 PCT/IB2010/ 051 804中所教示之植酸酶，所有案件均以引用方式併入本 文中。 在一個實施例中，植酸酶可為來自哈夫尼菌（Τ/α/>7叫（例 如來自哈夫尼腸桿菌a/veW之植酸酶，例如 US2008263688中所教示之植酸酶，該參考文獻以引用方式 併入本文中。 在一個實施例中，植酸酶可為來自曲黴菌（例如來自米 麯黴）之植酸酶。 161711.doc -37- 201234977 在一個實施例中，植酸酶可為來自青黴菌（例如來自繩 狀青黴菌）之植酸酶。 較佳地，植酸酶存於飼料原料中之範圍為約200 FTU/kg 至約1000 FTU/kg飼料、更佳約300 FTU/kg飼料至約750 FTU/kg飼料、更佳約400 FTU/kg飼料至約500 FTU/kg飼 料。 在一個實施例中，植酸酶係以超過約200 FTU/kg飼料、 適宜地超過約300 FTU/kg飼料、適宜地超過約400 FTU/kg 飼料存於飼料原料中。 在一個實施例中，植酸酶係以低於約1000 FTU/kg飼 料、適宜地低於約750 FTU/kg飼料存於飼料原料中。 較佳地，植酸酶存於飼料添加劑組合物中之範圍為約40 FTU/g至約40,000 FTU/g組合物，更佳約80 FTU/g組合物 至約20,000 FTU/g組合物，且甚至更佳約1〇〇 FTU/g組合物 至約10,000 FTU/g組合物，且甚至更佳約200 FTU/g組合物 至約10,000 FTU/g組合物。 在一個實施例中，植酸酶係以超過約40 FTU/g組合物、 適宜地超過約60 FTU/g組合物、適宜地超過約1〇〇 FTU/g 組合物、適宜地超過約1 50 FTU/g組合物、適宜地超過約 200 FTU/g組合物存於飼料添加劑組合物中。 在一個實施例中’植酸酶係以低於約40,000 FTU/g組合 物、適宜地低於約20,000 FTU/g組合物 '適宜地低於約 15,000 FTU/g組合物、適宜地低於約1〇,〇〇〇 FTU/g組合物 存於飼料添加劑組合物中。 1617il.doc •38- 201234977
應瞭解，如本文所用1 FTU(植酸酶單位）定義為在ISO 2009植酸酶为析（用於測定植酸酶活性之標準分析）中所定 義反應條件下，在—分鐘㈣受㈣放1 μ·1無機正麟酸 鹽時所需之酶用*且1咖可參見國際標準撕而·心 1-17, 2009 〇 在一個實施財，宜採用上述Ec.分類對酶進行分類， 且E.C.分類所指示之酶在本文所教示用於測定1 FTU之分 析中測試時具有該活性。 〇 優點 職與酶之相互作用較複雜，且在不希望受限於理論 下’極令人驚奇地觀察到個體已改良對壞死性腸炎之抗 性，例如觀察到（例如）損傷評分降低。在本發明之前，尚 未出於此具體目的教示DFM與酶（例如如本文所教示）之組 合0 本發明之一個優點在於本發明之飼料添加劑組合物可避 ) 免壞死性腸炎之負面影響或可用於改良個體對壞死性腸炎 之抗性。 不希望爻限於理論，植酸酶催化植酸鹽（穀物及豆類中 之磷之主要儲存形式）依序水解成磷酸化較低之肌·肌醇衍 生物，同時釋放無機磷酸鹽。植酸鹽之水解使得對於腸腔 之胺基酸之内源性損失減少。腸中之内源性胺基酸損失減 少會降低用於細菌生長之氮的利用度，此有助於dfm抑制 產氣莢膜梭菌及病原性細菌之活性。 不希望受限於理論，蛋白酶使得飲食蛋白非特異性水 161711.doc -39- 201234977 解’從而在腸腔中產生多種多肽。動物使蛋白水解結束且 吸收該等絲酸。然而，在腸病原性攻毒之情形下，病原 性細菌可在空腸及回腸之腔中利用較高肽利用度。dfm藉 由（例如）競爭N源以及藉由直接抑制來抑制腸_病原體生 長。 另外，木聚糖酶將直鏈多糖pq〆—木聚糖降解成木糖。 不希望受限於理論，本發明者在本文中已顯示，利用DFM 與酶之組合之能量消化率增大並非係由澱粉、脂肪或蛋白 質解釋，因此，其必須由非澱粉多糖加以解釋。 澱粉酶活性水解大型《連接多糖（例如澱粉）之01鍵，從而 產生糊精及募糖，其主要在水解成麥芽糖及葡萄糖後在小 腸腸壁中吸收。令人驚奇地，前腸巾之快速殿粉水解及十 一指腸中之較大量吸收葡萄糖可在空腸及回腸中剝奪病原 性細菌之重要能量來源（葡萄糖），此由於針對不能有效利 用戊糖之病原體之競爭性優點而改良DFM活性。 與其他DFM及酶之組合及/或與單獨DFM及/或與單獨酶 相比，四種酶與DFM之組合令人驚奇地在減少病原體及/ 或對壞死性腸炎之抗性上有顯著改良。 本文所教示DFM與酶之特定組合可有利地導致黏蛋白分 泌減少。不希望受限於理論，此減少之黏蛋白分泌可減= 内源性胺基酸損失’及/或可達成改良之性能。 本文所教示DFM與酶之特定組合可有利地減輕回腸中之 發炎。此可藉由下調回腸中之IFR_g表現觀察到。本發明 者已顯示’調節免疫反應可改良性能。 161711.doc -40- 201234977 DFM與酶之調配物 可依任一適宜方式調配DFM與酶，以確保該調配物包含 活的DFM及活性酶。 在—個實施例中，可將DFM與酶調配為液體、乾粉或顆 粒0 乾粉或顆粒可藉由彼等熟習此項技術者已知之方式製 得，如：在槽頂噴霧流化床塗佈器中、在槽底喷霧Wurster
設備中或藉由轉鼓製粒（例如高剪切製粒）、擠出、盤式塗 佈或在微成份混合器中。 對於一些實施例而言，可塗佈（例如囊封）dfm及/或酶。 適宜地，DFM及酶可調配於同—塗層中或囊封於同一膠囊 中或者其中一種或兩種或三種或四種酶可調配於同一 塗層中或囊封於同_膠囊中，且画可與其中一或多種或 t部酶分開調配於塗層中。在-些實施例中，例如若DFM 能夠產生内生孢子時，則可在無任何塗層下提供DFM。在 °亥等情'兄下，可簡單混合DFM内生抱子與一種或兩種或三 種或四種酶。在後一愔 障形下，可塗佈（例如囊封）酶 可塗佈（例如囊封）其中 )其中一或多種或全部酶。酶可呈酶之、、曰 合物（即包含其中一插出鞸之此 種或更多種、兩種或更多種、= 更多種或全部）形式量—種或 、或其可呈（例如）單一酶形式單獨囊 封。在-個較佳實施例中 蜀曩 種酶。 了起塗佈（例如囊封）所有四 在一個實施例中 熱0 塗層保護酶免受熱影響且可視為防 161711.doc 201234977 在一個實施例中，將飼料添加劑組合物調配成乾粉或顆 粒，如W02007/044968(稱作 TPT 顆粒）或 W01997/〇16〇76^ WO 1992/0 12645中所述（每一案件均以引用方式併入本文 中）。 在一個實施例中，可將飼料添加劑組合物調配成用於飼 料組合物之顆粒，其包含：核心；活性劑；及至少一種塗 層，在選自以下中之一或多者之條件後，顆粒之活性劑保 留至少50。/。活性、至少6〇%活性、至少7〇%活性、至少肋％ 活性：a)飼料製丸製程，6)蒸汽加熱之飼料預處理製程， Ο儲存，d)在未經製丸混合物中作為成份儲存，及^在包 3至V S選自以下之化合物之飼料基質混合物或飼料預 混合物中作為成份儲存：痕量礦物質、有機酸、還原糖、 維生素、氣化膽鹼、月容 飼料預混合物之化合物。 驗性飼料基^合物或 關於顆粒’至少—種塗層可包含 的水分水合材料；及/或至 "5 W/W/〇 該兩種塗層可為水八欠人“ &可包含兩種塗層。 施射，水切壁塗層。在一些實 一，且水二：可佔顆粒之介於一與6。 之間。水八^㈣可佔㈣之介於與15% 麥芽糊精且水分VI;塗層可選自無機鹽、薦糖、搬粉及 粉。 障壁塗層可選自聚合物、樹膝、乳清及澱 顆粒可使用飼料繫 °C與95°c間實施* # 生且飼料預處理製程可在70 '達若干分鐘’例如介於85t與95t之 161711.doc •42· 201234977 間。 在一個實施例中，可將飼料添加劑組合物調配成用於動 物飼料之顆粒，其包含：核心；活性劑，在儲存之後及在 顆粒係成份之蒸汽加熱製丸製程之後，顆粒之活性劑保留 至少80%活性；水分障壁塗層；水分水合塗層，其佔顆粒 之至少25 W/W%，在蒸汽加熱製丸製程之前，該顆粒具有 小於0.5之水活性。 顆粒可具有選自聚合物及樹膠之水分障壁塗層且水分水 合材料可為無機鹽。水分水合塗層可佔顆粒之介於25 w/w%與45 w/w%i間且水分障壁塗層可佔顆粒之介於2 w/w%與 10 w/w%之間。 顆粒可使用蒸汽加熱製丸製程產生，該製程可在85<>c與 95 C之間實施南達若干分鐘。 在一些實施例中，可使用稀釋劑（例如澱粉粉末、石灰 石或諸如此類）稀釋DFM(例如DFM内生孢子）。 〇 纟—個實施例中’組合物存於適於攝取之液體調配物 中，較佳地，該液體攝取物含有以下中之一或多者：緩衝 劑、鹽、山梨醇及/或甘油。 在另一實施例中，可藉由將酶施加（例如噴霧）於栽劑基 材（例如碾碎之小麥）上來調配飼料添加劑組合物。 土 在-個實施例中，本發明之飼料添加劑組合物可調配為 預混合物。僅舉例而言，預混合物可包含一或多種飼料組 份，例如一或多種礦物質及/或一或多種維生素。 、 在一個實施例中，可將用於本發明中之DFM及/或酶與 161711,d〇c • 43 - 201234977 至少-種選自以下甲之至少一者之生理學上可接受之载劑 調配在一起：麥芽糊精、石灰石（碳㈣）、環糊精、小麥 或小麥組份、蔑糖、澱粉、Na2S〇4、滑石粉、pvA、山梨 醇:苯:酸鹽、山梨酸醋、甘油、薦糖、丙二醇、ι>3-丙 一醇葡萄糖對备基笨甲酸g旨、氣化納、摔樣酸鹽、乙 酸皿磷酸鹽、鈣、偏亞硫酸氫鹽、甲酸鹽及其混合物。 包裝 在個貫施例中，包裝本發明之飼料添加劑組合物及/ 或預混合物及/或飼料或飼料原料。 在-個較佳實施例中，將飼料添加劑組合物及/或預混 合物及/或飼料或飼料原料包裝於袋（例如紙袋）中。 在替代實施例中，可將飼料添加劑組合物及/或預混合 物及/或飼料或飼料原料密封在容器中。可使用任一 容器。 飼料 本發明之飼料添加劑組合物可用作飼料或用於製備飼 料。 本文所用術語「飼料」與「飼料原料」同義。 端視用途及/或施加模式及/或投與模式而定，飼料可呈 溶液形式或呈固體形式。 在用作飼料（例如功能飼料）或用於其製備時，本發明之 組合物可與以下中之一或多者結合使用：營養上可接受之 載劑、營養上可接受之稀釋劑、營養上可接受之賦形=、 營養上可接受之佐劑、營養活性成份。 161711.doc -44- 201234977 在車乂佳實施例中，將本發明之飼料添加劑組合物與飼 料組份混合以形成飼料原料。 本文所用術語「飼料組份」意指飼料原料之全部或部 分。：料原料之部分可意指飼料原料之一種成份或飼料原 料之種以上（例如2種或3種或4種）成份β在一個實施例 中術飼料組份」涵蓋預混合物或預混合物成份。 較佳地，飼料可為草料或其預混合物、複合飼料或其預 此合物。在一個實施例中，可將本發明之飼料添加劑組合 〇 物與複合飼料、複合飼料組份混合或混合至複合飼料之預 混合物或草料、草料組份或草料之預混合物中。 本文所用術s吾草料意指提供給動物（而非動物必須自己 見食）之任何食物。草料涵蓋經切割之植物。 術語草料包括枯草、稻草、青貯飼料、壓製及製丸飼 料、油及混合日糧亦及發芽榖類及豆類。 草料可自選自以下之植物中之一或多者獲得：紫苜蓿 ❹ （alfalfa、lucerne)大麥、百脈根（birdsfoot trefoil)、葉菜類 (brassicas)、考目裏（Chau moellier)、羽衣甘藍（kale)、油 菜籽（芸苔）、黃色蔓菁（蕪菁甘藍）、蕪菁、三葉草、阿爾 色二葉草、紅色三葉草、地三葉草、白色三葉草、草、燕 麥草、羊茅草、百慕大草（Bermuda grass)、雀麥、三齒稃 屬草（heath grass)、草地早熟禾（meadow grasses)(來自天然 混合草原草地）、果樹草、黑麥草、貓尾草、玉米（c〇rn或 maize) '粟、燕麥、高粱、大豆、樹（用於樹-枯草之截頭 樹秋）、小麥及J3>類。 161711.doc -45- 201234977 術語「複合飼料」意指呈膳食'丸粒、堅果、餅或碎屑 形式之商業飼料。複合飼料可自各種原料及添加劑摻和而 來。根據目標動物之具體需求調配該等摻合物。 複合飼料可為提供所有每日所需營養素之完整飼料、提 供曰糧（蛋白質、能量）之一部分之濃縮物或僅提供額外微 營養素（例如礦物質及維生素）之補充劑。 用於複合飼料中之主要成份係飼料穀物，其包括玉米' 大豆、高粱、燕麥及大麥。 適宜地，本文提及之預混合物可為包括諸如維生素、礦 物質、化學防腐劑、抗生素、發酵產品及其他基本成份等 微成份的組合物。預混合物通常係適於摻和至商業日糧中 之組合物。 本發明之任何飼料原料可包含一或多種選自包含以下之 群之飼料材料、)榖物，例如小粒穀物(例如小麥、大麥、 黑麥、燕麥及其組合）及/或大粒縠物（例如玉米或高粱” b)穀物之副產品，例如玉米榖蛋白粉 '乾燥酒相可溶物 (DDGS)、小麥糠、小麥粗粉' 碎小麥、粳米糠、稻殼、 燕麥殼、棕搁仁及柑橘果肉’· e)自諸如以下等來源獲得之 蛋白質··大豆、向曰葵 '堅果、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉 花 '芸苔 '魚粉、乾燥血槳蛋白f、肉及骨粉、馬鈴薯蛋 ,乳/月乾椰子肖、芝麻’· d)自植物及動物來源獲得 之油及脂肪；e)礦物質及維生素。 本發明之飼料原料可含有至㈣重量％、至少财 二或至少6〇重量%之玉米及大豆粉或玉 ，王曰大丑、或小麥粉或向曰葵粉。 161711.doc • 46 - 201234977 另外或另-選擇為，本發明之飼料 :::r料:料及/或至少-種高纖維飼料二ς種 =產。;:提供高纖維飼料原料。高纖維飼料材 二=、黑麥、燕麥、縠物之副產品(例如玉 粉、：、乾燥酒柏可溶物⑽Gs)、小麥糠、 私、碎小麥、粳米糠、稻殼、燕 肉）。—歧蛋白質來源亦叮，目r、、私櫚仁及柑橘果 Ο ❹ 葵、羽扇：、愛 為高纖維：來自諸如向曰 、、’、蠶且及棉等來源之蛋白質。 預=明二：料可為以τ中之一或多者··複合飼料及 物殘餘物··玉米、大豆…1:)餅，農作物或農作 乾椰子肉、稻草、榖殼'甜:廢:麥、玉米結稈、 :他飼料植物；肉及骨粉；糖蜜；油渣餅及壓滤餅二 ’:守飼料植物··枯草及青貯飼料；海藻；種子及毅 ·’广個或藉由礙麼或研磨等製備；發芽穀類及豆 類，酵母提取物。 。-實施例中’本發明中之術語飼料亦涵蓋寵物食 :。寵物食品係意欲由寵物攝取之植物或動物材料，例如 狗食品或猶食品。宿物今σ「 龍物食(例如狗及貓食品）可呈乾燥形 酸m於狗之食物）或濕罐裝形式。㈣品可含有胺基 备：一些實施例中’本發明中之術語飼料亦涵蓋魚食品。 …民品通常含有使養殖魚保持健康所需之主要營養素、痕 量元素及維生素。魚食品可至小片、丸粒或鍵劑形式。製 161711.doc -47- 201234977 丸形式（其中之-些快速沉降）經常用 種。一 4匕备令口會入‘ 权人魚或底飼物 —…食口口亦含有諸如P胡蘿蔔素 以人工增強觀賞性魚之顏色。 激素等添加劑 在-些實施例中’本發明中之術語 食包括用於鳥籠中及用於飼饒寵物鳥…=食:： 包含基锸接工y 口。通常，鳥食 種種子，但亦可涵蓋板油（牛或羊脂肪）。 本：：用術語「接觸」係指將本發明組 …產品(例如甸料)中。可使用之施 但不限於··在包含^5 4 之實例包括 “飼枓添加劑組合物之材料中處理產品， 猎由混口飼料添加劑組合物與產品直接施加， 劑組合物喷霧至產品表 ’一 物之製劑中。 ，又入飼科添加劑組合 :個實施例中’較佳將本發明之飼料添加劑租 產口口（例如飼㈣料）混合。或者’飼料原料液:好 成份中可包括飼料添加劑組合物。 &或原始 對於一些施加而言， 之著4 & , 重要H組合物在欲影響/處理 之產印表面上可用或可用於欲影響/處理 得組合物可賦予以下有㈣性巾之 2面。此使 發明之飼料添加劑組合物以散佈、塗佈及/或 次潰“控制量之DFM及酶之產品（例 料 原料之原始成份）。 "叶原枓或飼枓 在酶可同時使W例如，在其混合在-起時或甚至 同路徑遞送）在個;^依序使用（例如，其可藉由不
在個實施例中，較隹地，同時施加DFM 161711.doc -48- 201234977 及酶。較佳地，混合DFM與酶，之後將其遞送至飼料原料 或飼料原料之原始成份。 了以適且濃度添加本發明之飼料添加劑組合物中之 DFM-例如最終飼料產品中之濃度可提供介於約2χΐ 〇5cfu 至約2xl〇n CFU之間、適宜地介於約2父1〇6 CFU至約ΐχΐ〇10 CFU之間、適宜地介於約3 75χ1〇7 CFU至約ΐχΐ〇1〇 之 間之曰劑量。 較佳地，本發明之飼料添加劑組合物將對高達約7〇它、 〇 冑達約85t或高達約95〇C之熱處理熱穩定。熱處理可實施 高達約1分鐘、高達約5分鐘、高達約1〇分鐘、高達約3〇分 鐘向達約;鐘。術語熱穩定意指在加熱至指定溫度之 前添加劑中存在/有活性之酶組份及/或DFM中之至少約 75%在冷卻至室溫後仍存在/有活性。較佳地，在加熱至指 定溫度之前添加劑中存在及有活性之酶組份及/或DFM中 之至少約80%在冷卻至室溫後仍存在及有活性。 f》 在尤佳實施例中’將飼料添加劑組合物均質化以產生 U 粉末。 在一替代較佳實施例中，將飼料添加劑組合物調配成顆 粒’如以引用方式併入本文中之W02007/044968中所述（稱 作丁PT顆粒）。 在另一較佳實施例中，在將飼料添加劑組合物調配成顆粒 時，该等顆粒包含蛋白質核心上塗佈之水合障壁鹽。該鹽塗 層之優點係改良耐熱性、改良儲存穩定劑及保護免受原本對 酶及/或DFM具有不利作用之其他飼料添加劑的影響。 161711 ,doc • 49· 201234977 較佳地，用於鹽塗層之鹽於2(TC下具有大於0.25之水活 性或大於60%之恆定濕度。 較佳地，鹽塗層包含Na2S04。 製備飼料添加劑組合物之方法亦可包含將粉末製成丸之 其他步驟。可將粉末與業内已知之其他組份混合。可迫使 粉末或包含粉末之混合物穿過模具且將所得鏈切成不同長 度之適宜丸粒。 視情況，製丸步驟可包括在形成丸粒之前之蒸汽處理或 調節階段，包含粉末之混合物放置於調節器(例如星 有蒸汽注射之混合器）中。將混合物在調節器中加熱至指 定溫度，例如自6(TC至10(rc，典型溫度可為戰' 8〇 、阶、啊或阶。滞留時間可自數秒至數分鐘及甚 至數小時變化。例如5秒、1時、、15秒、3G秒、！分鐘、2 分鐘、5分鐘、1G分鐘' 15分鐘、3()分鐘及時。 應瞭解，本發明之飼料添加劑組合物適於添加 當飼料材料中。 至任何適 本文所用術語飼料材料係指由動物攝取之基本飼料材 料。另外應瞭解，此飼料材料可包含(例如)至少 種未處理穀物、及/或經處理植物及/或動 如 豆粉或骨粉。 π例如大 文所用術語「飼料原料」係指 劑組合物之飼料材料 日，習此項技術者應瞭解，不同動物需要不_料原料 ㈣物之目的而定’即使相同動物亦可需要 1617JI.doc •50· 201234977 同飼料原料。 較佳地，飼料原料可包含飼料材料，該等飼料材料包含 玉米（maize或corn)、小麥、大麥、黑小麥、黑麥、粳米、 木薯、高粱、及/或任何副產品、以及富含蛋白質之組 份’如大豆粉、油菜種子粉、芸苔粉、棉花種子粉、向日 葵種子粉、動物副產品粉及其混合物。更佳地，飼料原料 可包含動物脂肪及/或植物油。
視情況，飼料原料亦可含有額外礦物質（例如鈣）及/或額 外維生素。 較佳地，飼料原料係玉米大豆粉混合物。 在一個實施例中，較佳地，飼料並非寵物食品。 在另一態樣中’提供產生飼料原料之方法。飼料原料通 常係在飼料磨機中產生’其中首_原料研磨成適宜粒徑 且隨後將其與適當添加劑混合。隨後以醇液或丸粒形式產 =料原料；後者通常涉及將溫度升高至目標程度且隨後 卻=過飲食以產生微粒大小之丸粒的方法。使丸粒冷 隨後可添加諸如脂肪等液體添加劑及酶。飼料原料之 尤外步驟’其包括在製丸之前擠出或膨脹-尤其藉由可包括至少使用蒸汽之適宜技術。 雞飼二料可為用於單胃動物(例如家禽(例如肉雞、蛋 別)、寵物(例如狗、猶戈 、豬(所有年齡類 原料用於家禽/ )或魚）之飼料原料，較佳地，飼料 個實施例中’飼料原料並非用於蛋雞。 1617il.doc •51- 201234977 僅舉例而言，用於雞（例如肉雞）之飼料原料可包含下表 中所列舉成份中之一或多者，例如以下表中給出之％表 示： 成份 雛難(％) 肥育難(％) 玉米 46.2 46.7 小麥粗粉 6.7 10.0 玉米DDGS 7.0 7.0 大豆粉，48% CP 32.8 26.2 動物/植物脂肪摻合物 3.0 5.8 L-離胺酸HC1 0.3 0.3 DL-甲硫胺酸 0.3 0.3 L-蘇胺酸 0.1 0.1 鹽 0.3 0.4 石灰石 1.1 1.1 磷酸氫鈣 1.2 1.2 家禽維生素及微礦物質 0.3 0.3 僅舉例而言，雞（例如肉雞）之飲食說明可如下表中所 述： 飲食說明 粗蛋白(％) 23.00 20.40 家禽之代謝能(kcal/kg) 2950 3100 鈣(％) 0.85 0.85 可用磷(°/〇) 0.38 0.38 鈉(％) 0.18 0.19 可消化之離胺酸(％) 1.21 1.07 可消化之曱硫胺酸(％) 0.62 0.57 可消化之曱硫胺酸+半胱胺酸(％) 0.86 0.78 可消化之蘇胺酸(％) 0.76 0.68 161711.doc •52· 201234977 僅舉例而言，用於蛋雞之飼料原料可包含下表中所列舉 成份中之一或多者，例如以下表中給出之°/。表示： 成份 下蛋期(％) 玉米 10.0 小麥 53.6 玉米DDGS 5.0 大豆粉，48% CP 14.9 小麥粗粉 3.0 大豆油 1.8 L-離胺酸HC1 0.2 DL-曱硫胺酸 0.2 L-蘇胺酸 0.1 鹽 0.3 磷酸氫鈣 1.6 石灰石 8.9 家禽維生素及微礦物質 0.6 僅舉例而言，蛋雞之飲食說明可如下表中所述： 飲食說明 粗蛋白(％) 16.10 家禽之代謝能(kcal/kg) 2700 離胺酸(％) 0.85 甲硫胺酸(％) 0.42 甲硫胺酸+半胱胺酸(％) 0.71 蘇胺酸(％) 0.60 鈣(％) 3.85 可用磷(％) 0.42 鈉(％) 0.16 僅舉例而言，用於火雞之飼料原料可包含下表中所列舉 161711.doc -53- 201234977 成份中之一或多者，例如以下表中給出之％表示： 成份 階段1 (%) 階段2 (%) 階段3 (%) 階段4 (%) 小麥 33.6 42.3 52.4 61.6 玉米DDGS 7.0 7.0 7.0 7.0 大豆粉，48°/〇 CP 44.6 36.6 27.2 19.2 油菜種子粉 4.0 4.0 4.0 4.0 大豆油 4.4 4.2 3.9 3.6 L-離胺酸HC1 0.5 0.5 0.4 0.4 DL-曱硫胺酸 0.4 0.4 0.3 0.2 L-蘇胺酸 0.2 0.2 0.1 0.1 rtftS. 鹽 0.3 0.3 0.3 0.3 石灰石 1.0 1.1 1.1 1.0 磷酸氫鈣 3.5 3.0 2.7 2.0 家禽維生素及 微礦物質 0.4 0.4 0.4 0.4 僅舉例而言，火雞之飲食說明可如下表中所述： 飲食說明 粗蛋白(％) 29.35 26.37 22.93 20.00 家禽之代謝能(kcal/kg) 2.850 2.900 2.950 3.001 鈣(％) 1.43 1.33 1.22 1.02 可用填(％) 0.80 0.71 0.65 0.53 納(％) 0.16 0.17 0.17 0.17 可消化之離胺酸(％) 1.77 1.53 1.27 1.04 可消化之甲硫胺酸(％) 0.79 0.71 0.62 0.48 可消化之甲硫胺酸+半胱胺酸(％) 1.12 1.02 0.90 0.74 可消化之蘇胺酸(％) 1.03 0.89 0.73 0.59 僅舉例而言，用於仔豬之飼料原料可包含下表中所列舉 161711.doc -54- 201234977 成份中之一或多者，例如以下表中給出之％表示： 成份 階段1 (%) 階段2 (%) 玉米 20.0 7.0 小麥 25.9 46.6 黑麥 4.0 10.0 小麥粗粉 4.0 4.0 玉米DDGS 6.0 8.0 大豆粉，48% CP 25.7 19.9 乾燥乳清 10.0 0.0 大豆油 1.0 0.7 L-離胺酸HC1 0.4 0.5 DL-甲硫胺酸 0.2 0.2 L-蘇胺酸 0.1 0.2 L-色胺酸 0.03 0.04 石灰石 0.6 0.7 磷酸氫鈣 1.6 1.6 豬維生素及微礦物質 0.2 0.2 鹽 0.2 0.4 僅舉例而言，仔豬之飲食說明可如下表中所述： 飲食說明 粗蛋白(％) 21.50 20.00 豬消化能(kcal/kg) 3380 3320 豬淨能量(kcal/kg) 2270 2230 鈣(％) 0.80 0.75 可消化之磷(°/〇) 0.40 0.35 鈉(％) 0.20 0.20 可消化之離胺酸(％) 1.23 1.14 可消化之曱硫胺酸(％) 0.49 0.44 可消化之曱硫胺酸+半胱胺酸（％) 0.74 0.68 可消化之蘇胺酸(％) 0.80 0.74 僅舉例而言，用於生長豬/肥育豬之飼料原料可包含下 161711.doc •55- 201234977 表中所列舉成份中之一或多者，例如以下表中給出之％表 示： 成份 生長豬/肥育豬(％) 玉米 27.5 大豆粉，48% CP 15.4 玉米DDGS 20.0 小麥糖 11.1 粳米糠 12.0 芸苔種子粉 10.0 石灰石 1.6 磷酸氫鈣 0.01 鹽 0.4 豬維生素及微礦物質 0.3 離胺酸-HC1 0.2 植物油 0.5 僅舉例而言，生長豬/肥育豬之飲食說明可如下表中所 述： 飲食說明 粗蛋白(％) 22.60 豬代謝能(kcal/kg) 3030 鈣(％) 0.75 可用鱗(％) 0.29 可消化之離胺酸(％) 1.01 可消化之甲硫胺酸+半胱胺酸(％) 0.73 可消化之蘇胺酸(％) 0.66 形式 本發明之飼料添加劑組合物及其他組份及/或包含其之 飼料原料可以任一適宜形式使用。 161711.doc •56- 201234977 本發明之飼料添加劑組合物可以固冑或液體製劑或其替 代形式使用。固體製劑之實例包括粉劑、膏糊、大丸劑、 膠囊、丸粒、錠劑、粉末及顆粒，其可潤湯、喷霧乾燥或 冷凍乾燥。液體製劑之實例包括但不限於水性、有機或水 性-有機溶液、懸浮液及乳液。 s 在-些應用巾，本發明之刪或飼料添加劑組合物可與 . ⑽混合或投與飲用水中。在-個實施例中，納人水中之 劑量範圍係約⑽動物/天至約lxlGlQ CFU/動物/ 天’且更佳約lxio7 CFU/動物/天。 適宜形式之實例包括以下中之一或多者：粉劑、膏糊、 〇丸劑、丸粒、㈣、藥丸、黟囊、***检劑、溶液或懸 子液，其可含有矯味劑或著色劑，其用於直接释放、延遲 釋放、改良釋放、持續釋放、脈衝釋放或受控釋放施加。 舉例而言，若本發明之組合物以固體（例如製丸）形式使 用，則其亦可含有以下中之一或多者：賦形劑，例如微晶 〇 =維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣及甘胺酸； 朋解劑，例如殿粉（較佳玉米、馬鈴薯或木薯殿粉）、殿粉 _ 乙醇S文鈉、交聯羧甲基纖維素鈉及某些複合矽酸鹽；製粒 例如聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基曱基纖維素 (HPMC)、㈣基纖維素（則）、餘、明膠及***膠 (咖⑽）；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油山茶酸 酯及滑石粉。 用於製備該等形式之營養上可接受之載劑的實例包括 (例如）水、鹽溶液、醇、聚矽氧、蠟、石油膠、植物油、 161711.doc -57· 201234977 聚乙二醇、丙二醇、脂質體、糖、明膠、乳糖、直鏈澱 粉、硬脂酸鎂、滑石粉、表面活性劑、矽酸、黏性石蠟、 香水油、脂肪酸甘油單酯及甘油二酯、石油醚 (petroethral)脂肪酸酯、羥甲基_纖維素、聚乙烯吡咯啶酮 及諸如此類。 用於該等形式之較佳賦形劑包括乳糖、澱粉、纖維素、 奶糖或高分子量聚乙二酵。 對於水性懸浮液及/或酏劑而言，可合併本發明之組合 物與各種甜味劑或矯味劑、著色物質或染料、乳化劑及/ 或懸浮劑及稀釋劑（例如水、丙二醇及甘油）及其組合。 經常使用不吸水乳清作為DFM(尤其細菌DFM)之載劑且 其係開始生長之良好介質。 含有細菌DFM之膏糊可與植物油及惰性膠凝成份調配在 —起0 真菌產品可與作為載劑之縠物副產品調配在一起。 在一個實施例中，較佳地，本發明之飼料添加劑組合物 並不呈微粒系統（例如W02005/123034中教示之微粒系統） 形式。 本發明之DFM及/或飼料添加劑組合物可經設計以一次 給予或可經設計以每日計飼餵。 欲用於本發明組合中之組合物（及其中之每一組份）之最 佳量將取決於欲處理之產品及/或產品與組合物之接觸方 法及/或其預期用途。 I6171i.doc -58- 201234977 用於組合物中之DFM及酶之量應為該足夠量可有效且仍 足夠有效改良飼餵含有該組合物之飼料產品之動物的性 能。此有效之時間長度應延長至至少採用該產品（例如飼 料添加劑組合物或含有其之飼料）之時間。 飼料中之DFM與每一酶之比率可在下文給出之範圍内： DFM:植酸酶（CFU/FTU):範圍為 5.0xl02CFU DFM: 1 FTU 酶至 5·0χ109 CFU :1 FTU 酶；較佳範圍為 7.5x104CFU DFM: 1 FTU 酶至 2.5xl07 CFU :1 FTU 酶。 Ο DFM:木聚糖酶（CFU/XU):範圍為 6.25Χ101 CFU DFM: 1 XU酶至 2.0x1 09 CFU :1 XU酶；較佳範圍為 1.88x104 CFU DFM: 1 XU酶至 1.0x107 CFU :1 XU酶。 DFM:澱粉酶（CFU/AU):範圍為 l.OxlO2 CFU DFM: 1 AU 酶至 2·0χ101() CFU :1 AU 酶；較佳範圍為 3.7x104CFU DFM: 1 AU酶至 l.OxlO8 CFU :1 AU酶。 DFM:蛋白酶（CFU/PU):範圍為 5.0X101 CFU DFM: 1 PU酶至 l.OxlO9 CFU :1 PU酶；較佳範圍為 1.25x104 CFU O DFM: 1 PU 酶至 5_0xl06 CFU :1 PU 酶。 在一個實施例中，較佳地，飼料原料包含以下物質： 蛋白酶，至少4000 PU/kg飼料； 木聚糖酶，至少1000 XU/kg至2000 XU/kg飼料（例如， Avizyme，1 000 XU/kg飼料或 Axtra XAP，至少 2000 XU/kg 飼料）； 澱粉酶，至少1800 AU/kg或200 TAU/kg飼料（例如， Avizyme，1800 AU/kg 或 Axtra XAP，至少 200 TAU/kg 飼 161711.doc •59- 201234977 料）； 植酸酶，至少500 FTU/kg飼料；及
Envivo Pro (DFM)，至少 75,000 CFU/g至 150,000 CFU/g 飼料。 在一個實施例中，較佳地，飼料原料包含以下物質： 蛋白酶，4000 PU/kg飼料； 木聚糖酶，1000 XU/kg至2000 XU/kg飼料（例如， Avizyme，1000 XU/kg飼料或 Axtra XAP，2000 XU/kg飼 料）； 殿粉酶’ 1800 AU/kg或200 TAU/kg飼料（例如，
Avizyme，1 800 AU/kg或 Axtra XAP，200 TAU/kg飼料）； 植酸酶，500 FTU/kg飼料；及
Envivo Pro (DFM)，75,000 CFU/g 至 150,000 CFU/g飼 料。 在一個實施例中，較佳地，飼料原料包含以下物質： 蛋白酶，5000 PU/kg飼料； 木聚糖酶，1250 XU/kg至2500 XU/kg飼料（例如， Avizyme，1000 XU/kg飼料或 Axtra XAP，2500 XU/kg飼 料）； 澱粉酶，2250 AU/kg或250 TAU/kg飼料（例如， Avizyme，1 800 AU/kg 或 Axtra XAP，250 TAU/kg飼料）； 植酸酶，625 FTU/kg飼料；及
Envivo Pro (DFM)，75,000 CFU/g 至 150,000 CFU/g飼 料。 161711.doc 60- 201234977 在另一實施例中，飼料原料包含以下物質： 蛋白酶，2000 PU/kg飼料； 木聚糖酶，500 XU/kg至1000 XU/kg飼料（例如， Avizyme，500 XU/kg飼料或 Axtra XAP，1000 XU/kg飼 料）； ' 澱粉酶，900 AU/kg或100 TAU/kg飼料（例如，
Avizyme，900 AU/kg或 Axtra XAP，100 TAU/kg飼料）； 植酸酶，500 FTU/kg飼料；及 O Envivo Pro (DFM)，37,500 CFU/g 至 75,000 CFU/g 飼 料。 在一較佳實施例中，飼料添加劑組合物包含足夠給予飼 料原料之酶及DFM，如下所述： 蛋白酶，4000 PU/kg飼料； 木聚糖酶，1000 XU/kg至2000 XU/kg飼料（例如， Avizyme > 1000 XU/kg飼料或 Axtra XAP，2000 XU/kg飼 料）； ο 澱粉酶，1800 AU/kg或200 TAU/kg飼料（例如， Avizyme > 1 800 AU/kg或 Axtra XAP，200 TAU/kg飼料）； 植酸酶，500 FTU/kg飼料；及
Envivo Pro (DFM)，75,000 CFU/g 至 150,000 CFU/g飼 料。 在一較佳實施例中，飼料添加劑組合物包含足夠給予飼 料原料之酶及DFM，如下所述： 蛋白酶，2000 PU/kg飼料； 161711.doc -61 - 201234977 木聚糖酶，500 XU/kg至1000 XU/kg飼料（例如， Avizyme，500 XU/kg飼料或 Axtra XAP，1000 XU/kg飼 料）.； 澱粉酶，900 AU/kg或100 TAU/kg飼料（例如， Avizyme，900 AU/kg或 Axtra XAP，100 TAU/kg飼料）； 植酸酶，500 FTU/kg飼料；及
Envivo Pro (DFM)，37,500 CFU/g 至 75,000 CFU/g 飼 料。 與其他組份之組合 用於本發明中之DFM及酶可與其他組份組合使用。因 此，本發明亦係關於組合。DFM與蛋白酶、木聚糖酶、澱 粉酶及植酸酶之組合在本文中可稱作「本發明之飼料添加 劑組合物」。 本發明之組合包含本發明之飼料添加劑組合物（或其一 或多種成份）及適於動物攝取且能夠為攝取者提供醫學或 生理學益處之另一組份。 在一個實施例中，較佳地，該「另一組份」並非又一酶 或又一 DFM。 該等組份可為益菌素。益菌素通常係不在上消化道中降 解或吸收之非消化性碳水化合物（寡糖或多糖）或糖醇。用 於商業產品中且根據本發明有用之已知益菌素包括菊粉 (果-寡糖或FOS)及反式半乳-募糖（GOS或TOS)。適宜益菌 素包括帕拉金糖募糖（palatinoseoligosaccharide)、大豆寡 糖、海藻酸鹽、黃原膠、果膠、刺槐豆膠（LBG)、菊粉、 161711.doc -62- 201234977 瓜爾丑膠、半乳-募糖（G〇S)、果-募糖（F〇S)、不可降解之 ;殿粉乳蔗糖（lactosaccharose)、乳果糖、拉克替醇、麥芽 糖醇、麥芽糊精、聚右旋糖（即Litesse®)、拉克替醇、乳 蔗糖（lactosucrose)、大豆募糖、帕拉金糖、異麥芽_募糖、 葡糖-募糖及木-募糖、果膠片段、飲食纖維、甘露聚糖-募 糖。 飲食纖維可包括非澱粉多糖（例如***糖木聚糖）、纖 維素及許夕其他植物組份，例如抗性糊精、菊粉、木質 素蠟、甲殼質、果膠、β-葡聚糖及募糖。 在個實施例中，本發明係關於本發明之飼料添加劑組 〇物（或或多種其成份）與益菌素之組合。在另一實施例 中，本發明係關於包含DFM與木聚糖酶、澱粉酶、植酸 酶、蛋白酶及益菌素之組合（或基本上由其組成或由其組 成）之飼料添加劑組合物。 凰菌素可與本發明之飼料添加劑組合物（或其成份）同時 Q (例如，與其一起之混合物或藉由相同或不同路徑同時遞 送）或在其之後（例如藉由相同或不同路徑）投與。 本發明之組合之其他組份包括聚右旋糖（例如Litesse®) 或麥芽糊精及/或拉克替醇。可視情況將該等其他組份
添加至飼料添加劑組合物中以辅助乾燥過程並有助於DFM 存活。 其㈣宜組份之其他實例包括U下中之一或多者：增稠 j膠凝劑、乳化劑、黏合劑、晶體改良劑、甜味劑（包 括人造甜味劑）、流變性改良劑、穩定劑、抗氧化劑、染 161711.doc -63- 201234977 料、酶、載劑、媒劑、賦形劑、稀釋劑、潤滑劑、矯味 劑、著色物質、懸浮劑、崩解劑、製粒黏合劑等。該等其 他組份可為天然組份。該等其他組份可藉由使用化學及/ 或酶技術製得。 在一個實施例中，可囊封DFM及/或酶。在一個實施例 中，將飼料添加劑組合物及或酶調配成乾粉或 顆粒，如W〇2〇07/044968中所述（稱作τρτ顆粒）_該參考文 獻以引用方式併入本文中。 在一個較佳實施例中，用於本發明中之/或酶可f 與一或多種脂質組合使用。 舉例而言，用於本發明令之DFM及/或酶可與一或多種 脂質膠粒組合使用。脂質膠粒可為簡單脂質膠粒或複雜脂 質膠粒。 脂質膠粒可為兩性物質之定向分子之聚集物，例如脂質 及/或油。 本文所用術增稠或膠凝劑」係指藉由減緩或防止粒 子（不可混溶液滴 '空氣或不溶性固體）運動而防止分離之U 產品。在發生增稠時，個別水合分子致使黏度增加，從而 減緩分離。在發生膠凝時，水合分子連接形成捕獲粒子之-二維網絡，藉此使該等粒子固定。 本文所用術語「穩定劑」係定義為保持產品（例如飼料 產品）免於隨時間流逝而變化之成份或成份之組合。 本文所用術語「乳化劑」係指防止乳液分離之成份（例 如飼料成份)。乳液係兩種不混溶物質，-種以小滴形式 I6i711.doc -64 - 201234977 存在，包含於另一者中。乳液可由水中之油（其中小滴或 分散相係油且連續相係水)或油中之水(其中水變為分散相 且連續相係油）組成。亦可經由使用乳化劑使發泡體（其係 液體中之氣體）及懸浮液（其係液體中之固體）穩定。 本文所用術語「黏合劑」係指經由物理或化學反應將產 品結合在一起之成份（例如飼料成份）。例如，在「膠凝」 期間，水被吸收，從而提供結合效應。然而，黏合劑可吸 收其他液體（例如油）’從而將其保持在產品中。在本發明 ° 上下文中，黏合劑通常可用於固體或低水分產品（例如烘 烤產品：麵粉糕餅、炸麵包圈、麵包及其他產品）中。 「載劑」或「媒劑」意指適於投與DFM及/或酶之材料 且包括業内已知之任何該材料，例如任何液體、凝膠、溶 劑、液體稀釋劑、穩定劑或諸如此類，其無毒且並不以有 害方式與組合物之任何組份相互作用。 本發明提供製備飼料添加劑組合物之方法，其包含混合 Q DFM、木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶及澱粉酶與至少一種選 自以下中之至少一者之生理學上可接受之載劑：麥芽糊 精、石灰石（碳酸飼）、環糊精、小麥或小麥組份、蔗糖、 殿粉、NaJO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯曱酸鹽、山梨 酸酯、甘油、蔗糖、丙二醇、丨，3_丙二醇、葡萄糖、對羥 基苯曱酸酯、氯化鈉、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、鈣、 偏亞硫酸氫鹽、甲酸鹽及其混合物。 賦形劑之實例包括以下中之一或多者：微晶纖維素及其 他纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣、甘胺 161711.doc -65- 201234977 酸、澱粉、奶糖及高分子量聚乙二醇。 崩解劑之實例包括以下中之一或多者：澱粉（較佳玉 米、馬鈴薯或木薯澱粉）、澱粉乙醇酸鈉、交聯羧曱基纖 維素鈉及某些複合矽酸鹽。 製粒黏合劑之實例包括以下中之一或多者：》乙稀〇比洛 啶酮、羥丙基甲基纖維素（HPMC)、羥丙基纖維素（Hpc)、 薦糖、麥芽糖、明膠及***膠。 潤滑劑之實例包括以下中 酸、甘油山薔酸酯及滑石粉 稀釋劑之實例包括以下中 醇及甘油及其組合。 之一或多者：硬脂酸鎂、硬脂 〇 之一或多者：水、乙醇、丙二 起時或甚至 其可藉由不 組份混合 劑組合物 劑不含有 其他組份可同時使用（例如，在其混合在— 在其藉由不同路徑遞送時）或依序使用（例如， 同路#遞送）。 時，DFM仍為活的 在一個實施例中 不包含鉻或有機鉻 在一個實施例中 葡聚糖酶。 乂心·地，在本發明之飼料添加劑組合物與 較佳地，本發明之飼料$ 較佳地，本發明之飼料沒 較佳地 劑不含有 在一個實施例中 山梨酸。 本發明之飼料添加 漠縮物 用於本發明中 之DFM可呈濃縮物形式 該等濃縮物通常 161711.doc • 66 · 201234977 包含相當高濃度之DFM。 本發明之飼料添加劑組合物所具有活細胞之含量（菌落 形成單位，CFU)可在至少104 CFU/g(適宜地包括至少1〇5 CFU/g，例如至少1〇6 CFU/g，例如至少i〇7 cFu/g，至少 1〇8 CFU/g，例如至少1()9 CFU/g)至約_ cFu/g(或甚至約 10" CFU/g或約10丨2 cFU/g)範圍内。 在Dm呈濃縮物形式時’本發明之飼料添加劑組合物所 具有活細胞之含量可在至少1G9 CFU/g至約i 2 CFU/g、較 〇 佳至少1〇10 CFU/g至約i〇〗2 CFU/g範圍内。 呈濃縮物形式之粉劑、顆粒及液體組合物可經水稀釋或 再愁浮於水或其他適宜稀釋劑（例如適當生長培養基，例 如乳製品或礦物質或植物油）中，從而產生準備好使用之 組合物。 可根據業内已知方法製備呈濃縮物形式之本發明之dfm 或飼料添加劑組合物或本發明之組合。 在本發明之一個態樣中，由呈濃縮形式之組合物接觸酶 或飼料。 可藉由業内已知之方法喷霧乾燥或冷凍乾燥本發明之組 合物。 使用噴霧乾燥方法製備粒子之典型方法涉及溶解於適當 溶劑中的固體材料（例如，發酵培養基中之DFM之培養 物）或者’可將材料懸浮或乳化於非溶劑中以形成懸浮 液或乳液。可視情況在此階段添加其他成份（如上文所論 述）或諸如抗微生物劑、穩定劑、染料及輔助乾燥過程之 161711.doc •67- 201234977 試劑等組份。 隨後使溶液霧化以形成微 、，液滴。小滴立刻進入乾燥室 中’其中其接觸乾燥氣體。 ,, 將，合劑自小滴4發至乾燥氣體 中以固化小滴’由此形成粒 #山# 隨後自乾煉氣體分離粒子 並收集。 個體 本文所用術語 —」意指欲投與或已投與本發明之飼 料添加劑組合物或包含本發 々效a之该飼枓添加劑組合物之飼 料原料的動物^ 本文所用術語「個體」意 動物、鳥、魚或曱殼類動物 (例如寵物）。 指動物。較佳地，個體係哺乳 ’包括（例如）家畜或馴養動物 在一個實施例中，「個體」係家畜。 本文所用術語「家畜」係餘何農場動物。較佳地，家 畜係以下中之一或多者：母牛或公牛（包括牛犢）、家禽、 豬（包括仔豬）、家禽（包括肉雞、雞及火雞）、鳥、魚（包括 淡水魚(例如鮭魚、鱈魚、鱒魚及鯉魚(例如錦鯉魚;广及 海水魚（例如黑鱸））、曱殼類動物（例如蝦、貽貝及扇貝）、 馬（包括赛馬）、綿羊（包括羔羊）。 、 雞在一個實施例中，術語家畜及/或家禽及/或雞不包括蛋 在另—實施例中，「個體」係馴養動物或寵物或維持於 動物園環境中之動物。 、 本文所用術語「馴養動物或寵物或維持於動物園環境中 361711.doc -68· 201234977 之動物」係指任何相關動物，包括犬科動物（例如 4 1 J、猫 科動物（例如貓）、齧齒類動物（例如豚鼠、大鼠、小氣）、 鳥、魚（包括淡水魚及海水魚）及馬。 在一個實施例中，個體可受腸病原體攻毒。 舉例而言，個體之腸或消化道中可存在一或多 八夕植腸病原 體。舉例而言，個體之腸或消化道中具有之— •^夕種腸病 原體的量係如下：
i)導致動物之性能損失及/或 i i)係6¾床相關量；或 iii)係臨床無症狀量。 腸病原體可為（例如）產氣莢膜梭菌。 性能 本文所用「動物性能」可藉由以下測定：動物之飼料效 率及/或重量增加及/或飼料轉化率及/或飼料中之營養素 消化袖如胺基酸消化率）及/或飼料中之消化^代謝^ 〇 及/或氮保留量及/或動物避免壞死性腸炎之負面影響之: 力及/或個體之免疫反應》 % 較佳地，「動物性能」係藉由動物之飼料效率及/或 增加及/或飼料轉化率測定。 「改良之動物性能」意指與不包含本發明之飼料添加劑 組合物之飼料相比’由於使用該飼 例抖添加劑組合物，個體 中之飼料效率增加及/或重量增加婵 a大及/或飼料轉化率降 低及/或飼料中之營養素或能量之 0 ή n化率改良及/或氮保留 里改良及/或避免壞死性腸炎之t 之負面影響之能力St良及/或 161711.doc -69- 201234977 免疫反應改良。 較佳地，「改良之動物性能」意指飼料效率增加及/或重 量增加增大及/或飼料轉化率降低。 本文所用術語「飼料效率孫指Λ ㈣妓手」係才曰在—段時間期間隨 餵動物或對其飼餵指定量之食物時動物中發生之重量增加 之量。 曰 「增加之飼料效率」意指在飼料中使用本發明之飼料添 加劑：合物與不存在該飼料添加劑組合物下飼餵之動物相 比母早位攝取飼料之增加之重量增加。 飼料轉化率（FCR) 本文所用術語「飼料轉化率」係指使動物重量增 量之飼银給動物之量。 曰 改良之飼料轉化率意指較低飼料轉化率。 「較低飼料轉化率」或「改良之飼料轉化率」意指在飼 料中使用飼料添加劑組合物導致動物達到所指定體重增加 量時所需飼μ給動物之飼料量低於該飼料在不包含該^ 添加劑組合物時使動物達到相同體 X / a刀〇置日寻所需之飼料 量0 營養素消化率 本文所用營養素消化率意指自胃腸道或胃腸道之指定區 段（例如小腸）消失之營養素的部分。營養素消化率可 為所投與個體與個體糞便中出現者之間之差、或所投^ 體與保留在胃腸道之指定區段（例如回腸）上之消化物中者 之間之差。 161711.d〇c -70- 201234977 本文所用營養素消化率可如下量測：在—段時間期間收 集總排池物，量測所攝取營養素與所***營養素之間之 差；或利用不會被動物吸收的惰性標記，容許研究者計算 在整個胃腸道或胃腸道區段中消失之營養素之量。該惰性 心》己可為—氧化鈦、氧化鉻或不溶於酸之灰。消化率可採 用佔飼料中營養素之百分比表示’或採用可消化營養素之 質量單位/飼料中營養素質量單位表示。 〃
本文所用營養素消化率涵蓋澱粉消化率、脂肪消化率、 蛋白質消化率及胺基酸消化率。 本文所用此# >肖化率意指所攝取飼料之總能量減去翼便 之總能量或所攝取飼料之總能量減去動物胃腸道之指定區 段（例如回腸）上剩餘消化物的總能量。本文所用代謝能係 才曰表觀代謝纟b且意指所攝取飼料之總能量減去糞便、尿、 及氣態消化產物中含有之總能量。可由所攝取總能量與翼 便或胃腸道之指定區段中所存在消化物中排泌之總能量之 間的差來量測能量消化率及代謝能，其係使用與量測營養 素之消化率㈣之方法’針對氮***適#校正料算飼料 之代謝能。 氮保留量 本文所用氮保留量意指個體自飲食保留氮作為體重之能 力。在氮之***超過每日攝取時發生負性氮平衡且在損失 肌肉時經常觀察到負性氮平衡。正性氮平衡經常與（尤其） 正生長動物中之肌肉生長相關。 氮保留量可借助在一段時間期間***物及尿之總收集量 161711-doc -71- 201234977 之間之差。應瞭解，所***氮包 質、内源性蛋白質性***物、微 測為所攝取氮與所排泌氮 括來自飼料之未消化蛋白 生物蛋白質及尿氮。 存活率 厂 式 本文所用術語存 改良之存活率」 活率意指保持活著之個體之數量。術語 可為「降低之死亡率」之另一表達方 屠宰率及產肉率 f文所用術語屠宰率意指在商業或實驗屠宰過程後屠體D 之篁’以活的體重之比例表示。術語屠體意指屠宰用於食 物之動物體，移除頭、臟腑、四肢之部分及羽毛或皮膚。 ^文所用術語產肉率意指以活體重之比例表示之食用肉之 量、或以活體重之比例表示之指定肉塊之量。 重量增加 本發明進一步提供增加個體（例如家禽或豬）之重量增加 之方法，其包含向該個體飼餵包含本發明之飼料添加劑組 合物之飼料原料。 u 「增加之重量增加」係指動物在飼银包含飼料添加劑組 合物之飼料時與㈣不存在該飼料添加劑組合物之飼制 . 動物相比體重增加。 壞死性腸炎 壞死性腸炎係在世界範圍内在雞、火雞及鴨中觀察到之 w !·生或慢性腸毒血症，其係由產氣莢膜梭菌引起。壞死性 腸犬之特徵經常在於通常中段小腸之纖維素性壞死性腸 161711.doc -72· 201234977 炎。死亡率可為5%至50 %，通常約1〇%。藉由糞便-口傳播 發生感染。致病有機體之孢子抗性極高。誘病因素包括球 蟲病（coccidiosis/coccidiasis)、飲食（高蛋白）、在鴨中可能 為重應力、高黏度飲食（經常與飲食中之高黑麥及小麥納 入相關）、污染飼料及/或水、其他衰竭性疾病。 本發明係關於增加個體對壞死性腸炎之抗性之方法。換 言之’本發明係關於避免或減輕壞死性腸炎之負面影響。 本文所用術語「抗性」可涵蓋術語「耐受性」。因此， 〇 在一個實施例中，個體可對壞死性腸炎無抗性但個體可能 夠耐受壞死性腸炎，即對個體之性能無負面影響。 在一個實施例中，本發明係關於本發明之飼料添加劑組 合物’其用於治療或預防個體之壞死性腸炎。個體通常可 為已由或將由產氣笑膜梭菌及/或艾美蟲屬（五〜攻毒 者。該攻毒可來自環境，或在飼料或飲用水中活的微生物 之施加，（例如）此時使用活的球蟲疫苗。 〇 在另一實施例中，本發明係關於飼料添加劑組合物，其 用於預防及/或治療個體之球蟲病及/或壞死性腸炎。 本發明又進一步提供預防及/或治療壞死性腸炎及/或球 蟲病之方法’其中向個體投與有效量之本發明之飼料添加 劑組合物。 免疫反應 本文所用免疫反應意指以下多個方式中之一者：其中 DFM調節動物之免疫系統，包括增加抗體產生、上調細胞 調介之免疫、上調促發炎細胞因子及增加類鐸（t〇ll_like)受 161711.doc •73- 201234977 體信號傳導。應瞭解，由DFM對胃腸道進行免疫刺激可有 利於保護宿主抵抗疾病，且對胃腸道進行免疫抑制可對宿 主有利，此乃因使用較少營養素及能量來支持免疫功能。 較佳地’免疫反應係細胞免疫反應。 較佳地，藉由觀察免疫標記量測免疫反應。 益生菌 對於一些應用而言，據信本發明組合物中之可發揮
益生菌培養物效應。向本發明組合物中進一步添加益生菌 及/或盈函素亦在本發明之範圍内。 厂 曰非消化性食物成份，其藉由選擇性刺激一種或限制 量之有益細菌之生長及/或活性有利地影響宿主」。 本文所用術語「益生菌培養物」^義活的微生物（ t’包括細菌或酵母），其在（例如）以足夠數量攝入或局 夺有利地影響宿主有機體，即藉由賦予宿主有機體 ^ . 皿生菌可改良—或多個黏膜·
面中之微生物平衡。舉例， «=»黏膜表面可為腸、尿道 呼吸道或皮膚。本文所用彳m “ 床這 物甘 所用術邊益生菌」亦涵蓋活微； 物，其可刺激免疫系統之有益 (例如腸）令之發炎反應。 枝且同時減少黏膜表6 儘管益生菌攝取無下限或上限 1〇12^ 1〇1〇 仁已表明，至少 Ι06 于人f 土王夕i ϋ _ 1 0 1 U、 在個體中有效達成有益健康也作為日劑量將可 分離 4 161711.doc -74- 201234977 在一個態樣中，適宜地，本發明中使用之酶或DFM可呈 刀離形式。術語「分離」意指酶或Dfm至少實質上不含至 少一種其他組份，該組份與酶或DFM天然結合且存於自然 界中。本發明之酶或DFM可以實質上不含一或多種污染物 之形式提供，該等污染物可能原本與物質結合。因此，例 如，其可實質上不含一或多種潛在污染多肽及/或核酸分 〇 純化 在個態樣中，較佳地，本發明之酶及/或DFM係呈純 化形式。術語「純化」意指酶及/或DFM係以高含量存 在。酶及/或DFM合意地係組合物中存在之主要組份。較 2地’其係以至少約9〇%、或至少約95%或至少約卯^之 s量存在，該含量係基於所考慮總組合物之乾重/乾重來 測定。 在本發明範圍内設想可組合本發明之實施例以使本發明 〇 _内包括本文所述特徵中之任一者之組合。具體而言， 在本發明範圍内設想可同時展現細菌之治療效應中之任一 者。 核苷酸序列 本發明之fe圍涵蓋編石馬具有如本文所定義特定性質之蛋 白質之核苷酸序列。 /文所用術語「料酸序列」係指寡核*酸序列或多核 苦酸序列、及其變體、同源物、片段及衍生物（例如其部 分）。核苦酸序列可具有基因組或合成或重組起源，其不 161711.doc •75- 201234977 管疋否代表有義或反義鏈均可為雙鏈或單鏈。 與本發明相關之術語「核苷酸序列」包括基因組dna、 CDNA、合成DNA及RNA。較佳地，其意指編碼本發明之 DNA、更佳cdnA序列。 在一較佳實施例中，與本發明之本身範圍相關或涵蓋於 該範圍中之核普酸序列不包括本發明之如下天然核普酸序 列：處於其自然環境中或與其亦處於天然環境中之天然結 合序列連接。為易於參考，應將此較佳實施例稱作「非天 然核苷酸序列」。就此而言，術語「天然核苷酸序列」意 指處於其天然環境中且以可操作方式與整個啟動子（其與 該核苷酸序列天然結合）連接之整個核苷酸序列，該啟動 子亦處於其天然環境中。然而，由本發明之範圍涵蓋之胺 基酸序列可在核普酸序列在其天然有機冑中表現後加以分 離及/或純化。然而，較佳地，由本發明之範圍涵蓋之胺 基酸序列可由其天然有機體中之核苷酸序列表現，但其中 核芽酸序列並不在啟動子之控制下，在該有機體内該啟動 子與核苷酸序列結合。 通常使用重組DNA技術（即重組DNA)製備由本發明之範 圍涵蓋之核苷酸序列。然而，在本發明之替代實施例中， 可使用業内熟知之化學方法整體或部分合成核苷酸序列 (參見 Caruthers MH 事乂，（198〇) •心心5 办所户 么15 23及 Horn T等人，（1980) dc/办 心"225· 232)。 核苷酸序列之製備 161711.doc •76- 201234977 編碼具有如本文所定義特定性質之蛋白質或適於改質之 蛋白質之核苷酸序列可自產生該蛋白質之任何細胞或有機 體鐘別及/或分離及/或純化而來。業内已熟知用於鑑別及/ 或分離及/或純化核苷酸序列之各種方法。舉例而言，一 旦已鏗別及/或分離及/或純化適宜序列，則可使用PCR擴 ' 增技術製備更多序列。
. 進一步舉例而言，可使用產生酶之有機體之染色體DNA 或信使RNA構建基因組DNA及/或cDNA庫。若已知酶之胺 〇 基I序列，則可合成經標記寡核苷酸探針且使用其從自有 機體製備之基因組庫鑑別編碼酶之純系。或者，可使用含 有與另一已知酶基因同源之序列之經標記寡核苷酸探針鑑 別編碼酶之純系。在後一情形下，使用嚴格性較低之雜交 及洗務條件。 或者，可藉由將基因組DNA之片段***表現載體（例如 質粒）中、用所得基因組DNA庫轉化酶陰性細菌，且隨後 ◎ 將所轉化細菌平鋪於含有酶之基質（即麥芽糖）之瓊脂板上 來鑑別編碼酶之純系，由此鑑別表現該酶之純系。 在又一替代實施例中，可藉由已確立標準方法（例如， 由 Beucage S.L.# 入，（1981) 22，第 1859至1869頁闡述之亞磷醯胺方法，或由事乂， (1984)獅〇 乂 3，第謝至8〇5頁闡述之方法）以合成方式 製備編碼酶之核苷酸序列。在亞磷醯胺方法中，在（例如） 自動DNA合成H中合成寡核普酸，對其進行純化，退火， 連接並在適當載體中選殖。 161711.doc •77- 201234977 核苷酸序列可具有混合基因組及合成起源、混合合成及 cDNA起源、或混合基因組及cDNA起源，其係藉由根據標 準技術連接合成、基因組或cDNA起源（若適當）之片段製 得。每一連接片段對應於整個核苷酸序列之不同部分。 DNA序列亦可使用特定引物藉由聚合酶鏈反應（PCR)製 得，如（例如）US 4,683,202 或 Saiki R K等人(1988) 239 ’第487至491頁）中所述。 胺基酸序列 本發明之範圍亦涵蓋具有如本文所定義特定性質之酶的 胺基酸序列。 本文所用術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術 語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」 與術語「肽」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」 與術語「酶」同義。 胺基酸序列可自適宜來源製備/分 式製得或其可藉由使用重組DNA技術製備 本發明中涵蓋之蛋白質可與其他蛋白質（尤其酶）結合使 用。因此’本發明亦涵蓋蛋白質之組合，纟中該組合包含 本發明之蛋白質/酶及可為本發明之另—蛋白質/酶之另一 蛋白質/酶。 較佳地，與本發明之本身範圍相關時及涵蓋於該範圍中 之胺基酸序列並非天然酶。就此而言，術言吾「天然酶」意 指處於其天然環境中由其天然核㈣序列表現之全 酶。 161711.doc -78· 201234977 序列一致性或序列同源性 本發明亦涵蓋與具有本文所定義特定性質之多肽的胺基 酸序列或編碼該多肽之任何核苷酸序列具有—定程度之序 列一致性或序列同源性的序列（下文稱作「同源序列」）之 用途。此處’術語「同源」意指與個體胺基酸序列及個體 核苦酸序列具有特定同源性之實體。此處，術語「同源 性」可等同於「一致性」。 同源胺基酸序列及/或核苷酸序列應提供及/或編碼保留 功能活性及/或增強酶之活性的多肽。 在本發明上下文中，所取之同源序列包括可與個體序列 至少75% ' 85%或90%—致、較佳至少95°/。或98°/〇—致之胺 基酸序列。同源物通常將包含與個體胺基酸序列相同之活 性位點，等。儘管亦可根據類似性考慮同源性（即具有類 似化學性質/功能之胺基酸殘基），但在本發明之上下文 中’較佳係根據序列一致性表示同源性。 在本發明上下文中，所取之同源序列包括可與編碼本發 明多肽之核苷酸序列（個體序列）至少75%、85〇/。或9〇%一 致、較佳至少95%或98。/。一致之核苷酸序列。同源物通常 將包含編碼與個體序列相同之活性位點等之序列。儘管亦 可根據類似性考慮同源性（即具有類似化學性質/功能之胺 基酸殘基），但在本發明之上下文中，較佳係根據序列一 致性表示同源性。 可藉由眼睛或更通常借助易於獲得之序列比對程式進行 同源性比對。該等市售電腦程式可計算兩個或更多個序列 161711.doc -79- 201234977 間之同源性0/〇。 可在鄰近序列上計算同源性％，亦即，使—個序列與另 -序列排比且直接比對-個序列中之每—胺基酸與另—序 列中之相應胺基酸，-次-個殘基。此稱作「無空位」排 比。通常僅在相對較少數量之殘基上實施該等無空位排 比。 儘管此係極為簡單且連續之方法，但其無法慮及以下情 況：例如，在原本-致之序列對中，—個***或缺失將導 致接下來之胺基酸殘基，由此潛在地導致在實施整 體排比時同源性％大幅降低。因此，A多數序列比較方法 經設計以產生最佳排比，其慮及可能之插人及缺失而不合 過度地損害總體同源性評分。此係藉由在序列排比中插I 「空位」以試圖使局部同源性最大化來達成。 然而，該等更複雜方法為排比中出現之每一空位賦予 「2位罰分」’使得對於相同數量之一致胺基酸，具有盡 可能少之空位-反映在兩個比較序列中具有較高相關性-之 序列排比將達成比具有許多空位者高之評分。通常使用 仿射性空位成本」’其為空位之存在支付相對較高成本 且為空位中之每一後續殘基支付較小罰分。此係最常用空 位評分系統。高空位罰分當然將產生具有較少空位之最佳 排比。大多數排比程式可改良空位罰分。然而，在使用該 軟體進行序列比較時，較佳使用缺設值。 因此，最大同源性％之計算首先需要產生最佳排比，慮 及空位罰分。適於實施該排比之電腦程式係Vect0r 161711.doc -80- 201234977 NTI(Invitrogen公司）。可實施序列比較之軟體之實例包括但不 限於（例如）BLAST包裝（參見Ausubel等人，1999 Short Protocols in Molecular Biology，第 4版，第 18 章）、BLAST 2(參見FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50 ； FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及[email protected])、FASTA(Altschul等 人，1990 J. Mol. Biol. 403-410)及 AlignX。至少 BLAST、 BLAST 2及FASTA可用於離線及在線搜尋（參見Ausubel等 人，1999，第 7-58至 7-60 頁）。 〇 儘管可根據一致性來量測最終同源性％ ’但排比過程本 身通常並非基於全有或全無（all-or-nothing)成對比較。相 反，通常使用成比例之類似性評分矩陣，其基於化學類似 性或演化距離為每一成對比較賦予評分。常用之該矩陣之 實例係BLOSUM62矩陣-適於程式之BLAST之缺設矩陣。 Vector NTI程式通常使用公共缺設值或自定義符號比較表 (若供應）（關於進一步詳細内容參見用戶手冊）。對於一些 應用而言，較佳使用Vector NTI包裝之缺設值。 〇 或者，可基於與 CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1)，237-244)類似之算法使用 Vector NTI(Invitrogen公司）中之多重排比特徵計算同源性百分 比。 一旦軟體產生最佳排比，則可計算同源性％、較佳序列 一致性％。軟體通常將此作為序列比較之一部分來進行並 生成數值結果。 在測定序列一致性時應使用空位罰分，隨後較佳使用以 161711.doc -81 - 201234977 下參數進行成對排比： 對於BLAST 空位開放 0 空位延伸 0 對於 CLUSTAL DNA 蛋白質 字大小 2 1 K三元組(K triple) 空位罰分 15 10 空位延伸 6.66 0.1 在一個實施例中，CLUSTAL可與如上文所定義設定之 空位罰分及空位延伸一起使用。 適宜地，在至少20個鄰近核苷酸上、較佳在至少30個鄰 近核苷酸上、較佳在至少40個鄰近核苷酸上、較佳在至少 5 0個鄰近核苷酸上、較佳在至少60個鄰近核苷酸上、較佳 在至少1 00個鄰近核苷酸上測定關於核苷酸序列之一致性 之程度。 適宜地，可在整個序列上測定關於核苷酸序列之一致性 之程度。 雜交 本發明亦涵蓋與本發明之核酸序列互補之序列或能夠與 本發明之序列或與其互補之序列雜交的序列。 本文所用術語「雜交」應包括「核酸鏈經由鹼基對與互 補鏈結合之方法」以及如聚合酶鏈反應（PCR)技術中所實 施之擴增方法。 本發明亦涵蓋能夠與本文所呈現序列互補之序列雜交之 161711.doc -82 - 201234977 核苷酸序列、或其任何衍生物、片段或衍生物之用途。 術語「變體」亦涵蓋與能夠與本文所呈現核苷酸序列雜 交之序列互補的序列。 較佳地，互補序列係彼等在嚴格條件（例如，50 °C及 0.2xSSC {lxSSC=0.15 M NaCl，0.015 M檸檬酸三鈉，pH . 7.0})下能夠與本文所呈現核苷酸序列雜交者。
' 更佳地，互補序列係彼等在高度嚴格條件（例如，65°C 及 O.lxSSC {lxSSC = 0.15 M NaCl，0.0 1 5 Μ擰檬酸三鈉， 〇 pH 7.0})下能夠與本文所呈現核苷酸序列雜交者。 在一更佳態樣中，本發明涵蓋可在高度嚴格條件（例如 65°C及O.lxSSC)下與本發明之核苷酸序列或其補體雜交之 核苷酸序列 實例 實例1 材料及方法 自商業孵化場購買3600隻1日齡之Cobb雄性雛雞。在研 ❹ 究開始時，分區（block)向每一處理畜舍分派50隻雄性雛 雞。研究由以下處理組成（表1): 表1.實例1之實驗設計 處理 產氣莢膜 梭菌攻毒 植酸酶1 額外酶2 DFM3 1 否 500 FTU/kg 益 無 2 是 500 FTU/kg 無 無 3 是 500 FTU/kg 澱粉酶(200 u/kg) 無 4 是 500 FTU/kg 蛋白酶(5000 u/kg) 無 161711.doc -83- 201234977 5 是 500 FTU/kg 木聚糖酶4 (2000 u/kg) 殿粉酶4 (200 u/kg) 蛋白酶4 (5000 u/kg) 無 6 是 500 FTU/kg 無 Enviva Pro(7.5 x 101 CFU/g) 7 是 500 FTU/kg 澱粉酶(200 u/kg) Enviva Pro(7.5 x 101 CFU/g) 8 是 500 FTU/kg 蛋白酶(5000 u/kg) Enviva Pro(7.5 x 101 CFU/g) 9 是 500 FTU/kg 木聚糖酶4 (2000 u/kg) 殿粉酶4 (200 u/kg) 蛋白酶4 (5000 u/kg) Enviva Pro(7.5 x 101 CFU/g) 植酸酶來自埃希氏大腸桿菌。 2澱粉酶來自地衣芽孢桿菌’木聚糖酶來自裏氏木黴’ 蛋白酶來自枯草芽孢桿菌。 3 Enviva Pro ®係枯草芽抱桿fe痛株Bs2084、LSSA01及 15AP4之組合，由DaniscoA/S提供。 161711.doc -84- 1
Axtra ΧΑΡ ®，由 Danisco A/S提供。 在研究開始、第23天、第35天及結束（第42天）時記錄每 一畜舍之鳥重量。畜舍係量測單元。以碎屑（雛雞）或丸粒 (生長雞及肥育雞）形式飼银肉雞飲食。飲食滿足或超過 NRC標準（表2)。沖洗混合器以防止飲食交叉污染。使用 Davis S-20混合器混合所有處理飼料並使用California製丸 磨（冷丸粒溫度為65。(：至70°C )製丸。自每一批次開始、中 間及結束自每一處理飲食收集試樣並摻和在一起以確認飼 201234977 料中之酶活性及Enviva Pro存在性。 表2.實例1之實驗飲食組成。 成份(％)_ 雛雞 生長雞 肥育雞 玉米 53.62 57.87 59.82 玉米DDGS 10.00 10.00 10.00 大豆粉，49% CP 26.93 23.97 21.36 Ampro 55 5.00 5.00 5.00 大豆油 2.07 0.91 1.74 離胺酸 0.24 0.24 0.24 DL-甲硫胺酸 0.21 0.19 0.18 L-棘胺酸 0.01 0.01 0.01 鹽 0.30 0.34 0.35 石灰石 1.04 1.07 0.94 填酸氫約 0.26 0.11 0.02 維生素及痕量礦物質預混合物 0.33 0.33 0.33 經計算之營養素組成(％) CP 22.60 21.50 20.39 能量，kcal/kg 3060 3025 3100 可消化之離胺酸 1.36 1.26 1.21 可消化之甲硫胺酸 0.58 0.61 0.53 可消化之蘇胺酸 0.83 0.83 0.80
鳥自第0至42天隨意接受適於處理之飼料。用於所有實 驗處理之酶及Enviva Pro皆係由Danisco以適當混合物及含 量提供。在背景中，所有飲食均含有500 FTU埃希氏大腸 桿菌植酸酶。將畜舍佈置在設備内以防止直接接觸以避免 污染。在第23天時自雛雞飲食至生長雞飲食出現變化。在 第35天時用肥育雞飲食替代生長雞飲食。在每次改變飼料 161711.doc -85- 201234977 時’分區自畜舍移除飼餵器，再次稱重，清空並再填充適 當處理飲食。在研究之最後一天對飼料進行稱重。每日針 對死亡率檢查畜舍。在鳥被淘汰或發現死亡時，記錄曰期 及移出重量（kg)。對所有死亡或淘汰之鳥實施肉眼屍檢以 確定性別及可能之死亡原因。注意壞死性腸炎之跡象。 所有畜舍均具有約4英吋厚褥草，其具有新鮮松屑之包 被。 在將所有鳥放置於畜舍之前用商業球蟲病疫苗 (C〇ccivac-B)對其進行噴霧疫苗接種。在第2〇、21及22 fl 天’對所有鳥（處理1除外）投與產氣莢膜梭菌之肉湯培養 物。採用已知引起NE且源自商業肉雞操作之產氣莢膜梭 菌之野外分離株作為攻毒有機體。每天使用新鮮接種物。 滴疋量係約1.0 X 1 〇8·9 ^每一畜舍接受相同量之接種物。 藉由混合至管式飼餵器之基底中發現之飼料中來投與接種 物。在第23天’自每一畜舍選擇5隻鳥，無痛致死，分組 稱重，並檢驗壞死性腸炎損傷之存在程度。評分係基於〇 至3分，其中0係正常且3係最嚴重（〇=無，卜輕微，2=中 υ 度，3 =顯著 /嚴重；Hofacre 等人，2003 J Appl p〇ult Res 12:60-64)。在研究期間不使用伴隨藥物療法。 使用成對〖測試分離平均值。認為在？<〇 〇5下具有顯著差 異。使用畜舍作為實驗單元。 ^顯示壞死性腸炎攻毒模型中之肉雞之壞死性腸炎損 傷評分，以0至3分系統計。合併SEM==〇」5 161711.doc •86- 201234977 經攻毒之對照處理與未經攻毒之對照處理相比損傷評分 增加。添加DFM與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶及植酸酶之 組合與所有其他處理相比會降低損傷評分。添加DFM與酶 之組合與單獨DFM或酶本身相比會降低損傷評分。 圖2顯示壞死性腸炎攻毒模型中之肉雞之體重增加。合 併 SEM=28.6 圖2顯示DFM (Enviva Pro®)與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白 酶及植酸酶之組合的組合與經攻毒之對照相比顯著改良經 產氣莢膜梭菌攻毒之肉雞的體重增加（BW增加）-甚至導致 超過陰性對照（即未經攻毒之對照）改良BW增加。此處理顯 著優於任何其他處理。 圖3顯示壞死性腸炎攻毒模型中之肉雞的飼料轉化率。 合併 SEM=0.016 與經攻毒之對照及酶本身及其他處理相比，Enviva Pro (DFM)與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶及植酸酶之組合顯著 改良（降低）自孵化至第42天之肉雞之FCR(g BW增加/ g攝 取飼料）。 實例2. 材料及方法 自商業畔化場獲得500隻Cobb雄性肉雛雞。每次處理將 總共26隻雛雞隨機分配給8個重複畜舍中的一者。地面畜 舍（16 ft2/畜舍）位於含有控制加熱、通風扇、熱燈及新鮮 木屑之簾布邊房屋中。前四天使鳥暴露於24 h光循環之螢 光照明中且隨後在實驗之剩餘時間實施16小時光循環：8小 161711.doc -87- 201234977 時暗循環。在鐘形飼餵器中提供飼料且經由噴嘴飲水器供 應水，其可隨意獲取。利用注射器向1日齡雛雞之口腔中 人工投與 5X劑量之 Coccivac-B (Intervet)。 表3.實例2之實驗設計 處理 球蟲病 疫苗 植酸酶1 額外酶2 DFM3 1 5X 500 FTU/kg 無 無 2 5X 500 FTU/kg 無 Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g) 3 5X 500 FTU/kg 木聚糖酶4(1000u/kg) 澱粉酶4(1800u/kg) 蛋白酶4(5000u/kg) 無 4 5X 500 FTU/kg 木聚糖酶4(1000u/kg) 澱粉酶4 (1800 u/kg) 蛋白酶4 (5000 u/kg) Enviva Pro (7.5 x 104 CFU/g) 植酸酶，來自埃希氏大腸桿菌。 澱粉酶來自解澱粉芽孢桿菌，木聚糖酶來自裏氏木 黴，蛋白酶來自枯草芽孢桿菌。 3 Enviva Pro ®係枯草芽孢桿菌菌株Bs2084、LSSAOl及 15AP4之組合，由DaniscoA/S提供。 4 Avizyme 1505 ®，由 Danisco A/S提供。 向雛雞飼银具有或無Enviva Pro或木聚糖酶、澱粉酶及 蛋白酶之飼料（Avizyme 1 502 ;表3)。用於所有實驗處理之 酶及Enviva Pro係由Danisco皆係以適當混合物及含量提 供。所有飲食均含有500 FTU埃希氏大腸桿菌植酸酶。將 畜舍佈置在設備内以防止直接接觸以避免污染。 161711.doc -88- 201234977 所有飲食均係基於玉米-大豆粉-DDGS之飲食。在研究 期間（第1至20天）提供雛雞飲食。將飲食製成丸（65 °C至70 °C )並製成碎屑。自每一批次開始、中間及結束自每一處 理飲食收集試樣並摻和在一起以確認飼料中之酶活性及 Enviva Pro存在性。
表4.實例2之實驗飲食組成。 成份(％) 離雞 (第0至20 天） 生長雞 (第20至38 天） 肥育雞 (第38至48 天） 玉米 50.60 52.3 57.40 小麥粗粉 1.33 1.03 1.32 玉米DDGS 7.00 7.00 7.00 大豆粉 34.60 33.50 28.60 植物脂肪 2.50 2.50 2.50 石灰石 1.41 1.38 1.09 MD-磷酸鹽 1.20 1.00 0.84 DL-甲硫胺酸 0.31 0.27 0.27 鹽 0.46 0.46 0.46 L-離胺酸 0.29 0.23 0.28 維生素及痕量礦物質預混合物 1.50 1.50 1.50 經計算之營養素組成(％) ME 家禽，kcal/kg 2950 3000 3040 CP 23.0 22.5 20.4 鈣 0.85 0.81 0.75 有效磷 0.38 0.35 0.32 TSAA 0.98 0.94 0.89 離胺酸 1.36 1.29 1.20 曱硫胺酸 0.62 0.59 0.56 161711.doc -89- 201234977 β在第1、11、20、38及48天記錄體重及飼餵器重量以計 算攝取飼料、體重增加及飼料轉化率。以每曰計監測死亡 率及淘汰率（Culls)並使用其調節飼料攝取及增加。在第11 第〇天時藉由頸椎脫臼使來自6個重複畜舍之一隻鳥 無痛致死以收集黏膜刮屑。自回腸（Meckel憩室至回盲腸 連接處）收集黏膜刮屑。沿回腸之長度切片並切割回腸以 使腔暴露且隨後利用PBS快速並輕柔地沖洗以移除消化 物。使用顯微鏡載玻片之邊緣藉由沿切片組織部分之長度 刮除來移除黏膜層。立刻將黏膜層冷凍夾持在液氮中之鋁 盤之間以保護RNA完整性，並儲存於個別無菌採樣袋(whi小 pack)中。在取樣期間將冷凍組織試樣儲存於液氮中且在 刀析之别儲存於_8〇 C下。使用Trizol試劑（Invitrogen)使用 組織破碎用機械均質器分離來自黏膜刮除之總RNA。根據 製造商之建議使用iScript (Bio-Rad)將總RNA (0.5 μβ)逆轉 錄成互補DNA。使用雞特異性引物評定所分泌發炎細胞因 子基因（介白素-10、干擾素_γ及介白素_17)之mRNA含量。 另外’使用geNorm軟體量測TATA-BP、HPRT-1及β-肌動蛋 白mRNA含量用於數據正規化。使用如由Rudrappa及
Humphrey (2007) J. Nutr. 137: 427-432 所述之經改良 δ_δ Ct 方程測定基因表現中之mRNA含量的倍數變化並進行對數 轉化用於數據分析。 使用成對t測試分離平均值。認為在Ρ<〇·〇5下具有顯著差 異。使用烏作為mRNA數據之實驗單元。 結果 161711.doc •90- 201234977
的干擾素-丫基因之mRNA 圖4顯示肉雞之回腸黏膜刮屑中 含量β 11曰齡：合併SEMsO.i 20曰齡：合併SEM=〇 6 與陰性對照、Enviva Pro +始祕 植酸酶、及木聚糖酶、澱粉 酶、蛋白酶+植酸酶相比，Enviva Pr〇與木聚糖酶、澱粉 酶、蛋白酶+植酸酶之組合上調u曰齡肉雞之回腸中之
Ο ㈣_g表現，在孵化時該等肉雞接受5倍活球蟲病疫苗。在 第21天’與陰性對照相比，pr〇+植酸酶、及Enviva ΡΓ〇與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶+植酸酶之組合下調回腸 中之IFR-g表現。該等數據表明，免疫反應之調節可為肉 雞中DFM與4種酶組合之改良性能之機制中的一者。 圖15顯示48曰齡肉雞之飼料轉化率。48曰齡：合併 SEM=0.〇41 實例3 材料及方法 利用肉雞實施-個消化率試驗以測定飲食酶及Β·處理 對s養素利用之效應。將蘢子圈在環境控制室中。鳥接受 2〇小時螢光照明且其可自由獲得飲食及水。在第丄天，經 由飲用水給予所㈣雞肉雞活球蟲病疫苗。在前三天在籠 子鐵’用地面上提供紙以使艾美球蟲⑻赌& 〇。〒如)再循 環。研究由以下處理組成（表5)。 161711.doc -91- 201234977 表5.實例3之實驗設計 處理 植酸酶1 額外酶2 DFM3 1 500 FTU/kg 無 無 2 500 FTU/kg 木聚糖酶4(1000u/kg) 澱粉酶l4 (1800 u/kg) 蛋白酶4(5000u/kg) 無 3 500 FTU/kg 木聚糖酶(2000 u/kg) 澱粉酶2 (200 u/kg) 無 4 500 FTU/kg 木聚糖酶5 (2000 u/kg) 澱粉酶25 (200 u/kg) 蛋白酶5 (5000 u/kg) 益 5 500 FTU/kg 無 Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g) 6 500 FTU/kg 木聚糠酶4 (1000 u/kg) 澱粉酶I4 (1800 u/kg) 蛋白酶4 (5000 u/kg) Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g) 7 500 FTU/kg 木聚糖酶(2000 u/kg) 澱粉酶2 (200 u/kg) Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g) 8 500 FTU/kg 木聚糖酶5 (2000 u/kg) 澱粉酶25 (200 u/kg) 蛋白酶5 (5000 u/kg) Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g) 植酸酶’來自埃希氏大腸桿菌。 殿粉酶1來自解殿粉芽抱桿菌，殿粉酶2來自地衣芽抱 桿菌’木聚糖酶來自裏氏木黴，蛋白酶來自枯草芽孢桿 菌。 3 Enviva Pro ®係枯草芽孢桿菌菌株bs2084、LSSAOl及 15AP4之組合，由Danisc〇A/S提供0 4 Avizyme 1505 ®，由 Danisco A/S提供。 5 Axtra ΧΑΡ ®，由 Danisco A/S提供。 161711.doc -92- 201234977 個別地稱重總共192隻鳥並以體重計分配給48個籠子（4 隻鳥/籠子）。隨後將8個飲食處理隨機分配給六個籠子之每 一者。鳥自第0至21天隨意接受適於處理之雛雞飼料。用 於所有實驗處理之酶及Enviva Pro皆係由Danisco以適當混 合物及含量提供。所有飲食均含有500 FTU埃希氏大腸桿 菌植酸酶。將畜舍佈置在設備内以防止直接接觸以避免污 染。在整個實驗期間對鳥飼餵呈醪液形式之離雞飲食（表 6) 〇 表6·實例3之實驗飲食組成。 成份(％) 離雞 玉米 46.22 小麥粗粉 6.73 玉米DDGS 7.00 大豆粉，48% CP 32.81 玉米澱粉/酶/DFM預混合物 0.30 動物/植物脂肪摻合物(50:50) 3.00 L-離胺酸 0.27 DL-曱硫胺酸 0.30 L-蘇胺酸 0.11 二氧化鈦 0.30 鹽 0.34 石灰石 1.12 磷酸氫鈣 1.20 維生素及痕量礦物質預混合物 0.30 經計算之營養素組成(％) CP 23.00 ME j kcal/kg 2950 161711.doc •93- 201234977 鈣 0.85 可用磷 0.38 鈉 0.18 可消化之離胺酸 1.21 可消化之曱硫胺酸 0.62 可消化之TSAA 0.86 可消化之蘇胺酸 0.76 在第21天，藉由心臟内注射戊巴比妥納（sodium pentobarbitone)使每個籠子中之四隻鳥無痛致死並藉由用 蒸餾水輕柔沖洗使較低回腸之内容物表現。彙集籠子内之 鳥的消化物，從而每個飲食處理產生6個試樣。收集後立 刻冷凍、凍乾並處理消化物試樣。根據標準程序分析消化 物試樣及飲食之Ti、DM、GE、澱粉、脂肪、N及胺基酸 (不包括色胺酸）。如由Ravindran等人（2005)所報告基於不 可消化之Ti之濃度實施回腸消化率係數之計算。基於澱粉 之平均總能量（4·2 kcal/g)、脂肪之平均總能量（9.4 kcal/g) 或蛋白質之平均總能量（5.5 kcal/kg)計算澱粉、脂肪及蛋 白質對回腸消化能之能量貢獻。因應於酶及DFM之可消化 之胺基酸的改良表現為與回腸層面之非消化胺基酸的量相 關；使用該線性函數之斜率來指示添加劑對胺基酸消化率 之效應。 使用成對t測試分離平均值。認為在P<0.05下具有顯著差 異。使用籠子作為實驗單元。 結果 圖5顯示2 1日齡肉雞之表觀回腸消化能。 161711.doc -94- 201234977 合併 SEM=0.027 添加Enviva Pro(—種DFM)與澱粉酶、木聚糖酶、蛋白 酶及植酸酶之組合與該等酶本身及陰性對照相比，展現回 腸消化能之商業相關增量。該等數據指示DFM改良該等外 源性酶對家禽飲食之能量消化率的效應。為避免產生疑 問’澱粉酶2係利用AxtraXAP中之;殿粉酶且澱粉酶^利用 Avizyme 1502中之殿粉酶。 圖6顯示三個飲食處理相對於對照處理之回腸胺基酸消 化率的增量，其隨使用2 1日齡肉雞之對照處理中之回腸未 消化胺基酸變化。 該圖給出飲食處理之回腸胺基酸消化率相對於對照處理 中之肉雞之回腸中之胺基酸的未消化部分的改良。處理内 之每一點代表所量測胺基酸中之一者。在木聚糖酶、澱粉 酶2、蛋白酶+植酸酶上面添MEnvivap⑺+植 酸酶（+3.6%)及木聚糖酶、澱粉酶2、蛋白酶+植酸酶本身 Q (即無DFM)( + 4.7%)相比增加胺基酸之回腸消化率 (+11.3%)。該等數據指示DFM改良該等外源性酶用以增加 家禽飲食之胺基酸消化率的功效。 圖7顯示使用21日齡肉雞之相對於對照處理之回腸消化 能的改良。 該圖給出每一飲食處理與利用植酸酶之陰性對照處理相 比之回腸消化能的增量。另外，呈現所計算之澱粉、脂肪 或蛋白質之能量貢獻。添加Enviva Pro與木聚糖酶、澱粉 柄2、蛋白酶+植酸酶之組合與Enviva pr〇+植酸酶處理及木 161711.doc •95- 201234977 聚糖酶1粉酶2、蛋白酶+植酸酶本身處理相比增加回腸 肩化此添加Enviva Pr〇與木聚糖酶、澱粉酶1、蛋白酶+ 植酼酶之組合相對於酶本身產生商業上重要之回腸消化能 增量。該等數據指示在DFM存在下4種酶增加肉雞飲食之 回腸消化能的改良能力。 實例4 材料及方法 到用肉雞貫施一個消化率試驗以測定飲食酶及dfm處理 對營養素利用之效應。將€子圈在環境控制室中。鳥接受 20小時勞光照明且其可自由獲得飲食及水。在第R，經 由飲用水給予所有離雞肉雞活球蟲病疫苗。在前三天在籠 子鐵網地面上提供紙以使艾美球蟲（Eimeria 〇〇cystes)再循 環。研究由以下處理組成（表7) 表7·實例4之實驗設計 處理 - - 植酸酶1 1 無 2 500 FTU/kg 3 500 FTU/kg 4 無 5 500 FTU/kg 木聚糖酶4{；l〇〇〇u/kg) 搬粉酶I4 (1800 u/kg) —(5000 u/kg) 木聚糖酶5 (2000 u/kg) 殿粉酶25 (200 u/kg) .¾^5 (5000 u/kg) 無 木聚糖酶4 (1000 u/kg) i^ll4(1800iVkg) 額外酶2
DFMJ 無 無 無
Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g)
Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g) 161711.doc -96- 201234977 蛋白酶4(5000u/kg) 6 500 FTU/kg 木聚糖酶5 (2000 u/kg) 澱粉酶25 (200 u/kg) 蛋白酶5(5000u/kg) Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g) 植酸酶’來自埃希氏大腸桿菌。 2殿粉酶1來自解澱粉芽孢桿菌，澱粉酶2來自地衣芽孢 桿菌’木聚糖酶來自裏氏木黴，蛋白酶來自枯草芽孢桿 菌。 3 Enviva Pro ®係栝草芽孢桿菌菌株Bs2〇84、LSSAOl及 15AP4之組合’由DaniscoA/S提供。 4 Avizyme 1505 ® ,由 Danisc〇 A/s提供。 5 Axtra ΧΑΡ ®，由 Danisc〇 A/s提供。 個別地稱重總共144隻鳥並以體重計分配給36個籠子（4 隻鳥/籠子）。隨後將6個飲食處理隨機分配給六個籠子之每 一者。鳥自第0至21天隨意接受適於處理之離雞飼料。用 於所有實驗處理之酶及Enviva Pro皆係由Danisco以適當混 合物及含量提供。將畜舍佈置在設備内以防止直接接觸以 避免污染。在整個實驗期間對鳥飼餵呈醪液形式之離雞飲 食（表6)。 表8.實例4之實驗飲食組成。 成份(％) 雛雞 玉米 46.22 小麥粗粉 6.73 玉米DDGS 7.00 大豆粉，48% CP 32.81 玉米澱粉/酶/DFM預混合物 0.30 161711.doc -97- 201234977 動物/植物脂肪摻合物(50:50) 3.00 L-離胺酸.HC1 0.27 DL-甲硫胺酸 0.30 L-蘇胺酸 0.11 二氧化鈦 0.30 鹽 0.34 石灰石 1.12 磷酸氫鈣 1.20 維生素及痕量礦物質預混合物0.30 經計算之營養素組成(％) CP 23.00 ME，kcal/kg 2950 鈣 0.85 可用磷 0.38 納 0.18 可消化之離胺酸 1.21 可消化之曱硫胺酸 0.62 可消化之TSAA 0.86 可消化之蘇胺酸 0.76 經連續4天（自第1 7至20天）以定量方式量測每個籠子之 飼料攝取量及總***物輸出量用以測定氮校正之表觀代謝 能（AMEn)及氮保留量。將每日***收集物彙集在籠子 中，在摻和器中混合並子取樣。將每一子試樣凍乾，研磨 至穿過0.5 mm篩並在分析之前於-4°C下儲存於氣密塑膠容 器中。使用標準程序針對DM、GE及N分析處理試樣。 使用成對t測試分離平均值。認為在P<0.05下具有顯著差 異。使用籠子作為實驗單元。 161711.doc -98· 201234977 結果 圖8顯示飼餵給17至21日齡之肉雞之飲食處理的氮校正 表觀代謝能AMEn。合併SEM=0.015 添加Enviva Pro與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶 +植酸 酶之組合與陰性對照飲食相比增加因應於酶之飲食之 AMEn。具體而言，添加Enviva Pro與木聚糖酶、澱粉酶 2、蛋白酶+植酸酶之組合與僅具有Enviva Pro之飲食相比 增加因應於酶之飲食之AMEn。 Ο 圖9顯示17至21日齡肉雞之氮保留量。合併SEM=0.006 添加Enviva Pro與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶+植酸酶之 組合與陰性對照飲食相比增加因應於酶之肉雞之氮保留 量。具體而言，在木聚糖酶、澱粉酶2、蛋白酶+植酸酶上 面添加Enviva Pro與飼餵僅具有Enviva Pro之飲食之肉雞相 比增加因應於酶之肉雞之氮保留量。 實例5 π、 材料及方法 ❹ 自商業孵化場獲得308隻Ross雄性肉雛雞。每次處理將 總共10隻離雞隨機分配給6個重複籠子中的一者。前四天 使鳥暴露於24 h光循環之螢光照明中且隨後在實驗之剩餘 時間實施16小時光循環：8小時暗循環。隨意供應飼料及 水。實驗設計由以下處理組成。 161711.doc -99- 201234977 表9.實例5之實驗設計 處理 球蟲病 疫苗 球蟲抑制藥 植酸酶1 額外酶2 DFM3 1 無 無 500 FTU/kg 無 無 2 5X 無 500 FTU/kg 無 無 3 5X 沙利黴素 (Salinomycin) 500 FTU/kg 無 無 4 5X 無 500 FTU/kg 無 Enviva Pro(7.5 xlO4 CFU/g) 5 5X 無 500 FTU/kg 木聚糖酶4 (1000 u/kg) 澱粉酶4 (1800 u/kg) 蛋白酶4 (5000 u/kg) 無 6 5X 無 500 FTU/kg 木聚糖酶4 (1000 u/kg) 澱粉酶4 (1800 u/kg) 蛋白酶4 (5000 u/kg) Enviva Pro(7.5 x 104 CFU/g) 植酸酶，來自埃希氏大腸桿菌。 澱粉酶來自解澱粉芽孢桿菌，木聚糖酶來自裏氏木 黴，蛋白酶來自枯草芽孢桿菌。 3 Enviva Pro㊣係枯草芽孢桿菌菌株Bs2084、LSSA01及 15AP4之組合，由DaniscoA/S提供。 4 Avizyme 1505 ®，由 Danisco A/S提供。 161711.doc -100- 201234977 在處理2至6中，利用注射器向1日齡雛雞之口腔中人工 投與劑量過度（推薦劑量x5)球蟲病疫苗（B，Intervet)。在處 理2中，以批准量（60 g/MT)使用沙利黴素（Bio-cox)作為球 蟲抑制藥。將畜舍佈置在設備内以防止直接接觸，從而避 免與艾美球蟲（Eimeria oocystes)及DFM之交叉污染。用於 所有實驗處理之酶及Enviva Pro皆係由Danisco A/S以適當 混合物及含量提供。在背景中，所有飲食均含有500 FTU 埃希氏大腸桿菌植酸酶。
表10.實例5之實驗飲食組成。 成份(％)_雛雞 玉米 53.18 玉米 DDGS 10.00 大豆粉，48% CP 32.05 大豆油 1.07 L-離胺酸HC1 0.31 DL-曱硫胺酸 0.31 L-蘇胺酸 0.12 鹽 0.33 石灰石 1.14 磷酸氫鈣 1.19 維生素及痕量礦物質預混合物 0.30 經計算之營養素組成(％) CP 23.00 ME，kcal/kg 2950 鈣 0.85 可用磷 0.38 161711.doc 101 - 201234977 鈉 0.18 可消化之離胺酸 1.21 可消化之甲硫胺酸 0.63 可消化之TSAA 0.86 可消化之蘇胺酸 0.76 使每個重複籠子之總共2隻14日齡之鳥無痛致死以自中 段回腸收集黏膜刮屑。將回腸用蒸餾水沖洗並用一把剪刀 剪開。將剪開之部分在清潔玻璃板上放平。利用載玻片之 長邊緣自回腸之中部區小心地刮除黏膜。將每一試樣儲存 於2 ml RNA later (Ambion)中並在-80°C冷冻·機中冷凉·。使 試樣在冰上解凍。根據標準方案利用Trizol試劑分離總 RNA。在瓊脂糖凝膠上測定RNA之完整性。利用MMLV逆 轉錄酶逆轉錄RNA。藉由實時PCR在Biorad實時MylQ機器 上測定黏蛋白（MUC2)之表現。 使用成對t測試分離平均值。認為在P<0.05下具有顯著差 異。使用鳥作為mRNA數據之實驗單元。 結果 圖10顯示14日齡肉雞之回腸黏膜刮屑中的MUC2基因之 mRNA含量。合併 SEM=0.14 添加Enviva Pro與木聚糖酶、殿粉酶、蛋白酶 +植酸 酶之組合與經攻毒之對照相比下調經5 X劑量之球蟲病疫 苗攻毒之肉雞之回腸中的MUC 2的表現。該等數據表明， 由於黏蛋白分泌減少之内源性胺基酸損失減少可負責接受 DFM與4種酶之組合之肉雞的改良性能。 實例6 161711.doc -102- 201234977 材料及方法 在23曰齡時自來自實例i呈現之試驗的肉雛雞取組織試 樣。在表1中呈現處理說明。自每個畜舍之2隻鳥移除空 腸、胰腺及肝並彙集黏膜，從而每次處理產生8個試樣。 將試樣在緩衝液溶液（PBS)中清洗，根據製造商之方案浸 沒於組織儲存試劑（RNAlater)中並於-8(TC下儲存。使用如 由 Chomczynski及 Saachi (1987; Anal. Biochem. 162:156-9) 所述之單步酚-氯仿提取方法自每一組織試樣分離總 RNA。藉由量測260 nm下之吸光率（Nanodrop)測定RNA之 濃度並藉由在1.2%瓊脂糖凝膠上凝膠電泳監測完整性。僅 考慮使用具有足夠純度且在260 nm對280 nm下之吸光率之 比大於1.87的RNA。 使用70個鹼基對之寡核苦酸（Opereon Biotechnologies公 司）根據由 Druyan 等人（2008; Poult. Sci. 87:2418-29)闡述 之方案製造微陣列。陣列之實驗設計係如由Garosi等人 (2005 ; Br. J. Nutr. 93:425-32)闡述之完整交織環設計，其 中以容許比較所有處理之多個成對方式直接比較每一試樣 與其他試樣。根據由Druyan等人（2008 ; Poult. Sci. 87:2418-29)闡述之方法標記試樣，其中一半試樣可用Cy3 標記且一半試樣用Cy5標記，Cy3及Cy5係酞菁之螢光染 料。在添加Cy3及Cy5標記之cDNA探針之前使用Pronto Plus!微陣列雜交套組（Pronto Plus! Microarray Hybridisation Kit)進 行雜交，並用清潔的玻璃蓋玻片（Lifterslip)覆蓋並使其雜 交16小時。隨後在設定至65%雷射功率之Scan Array Gx 161711.doc -103- 201234977 PLUS微陣列掃描儀上掃描微陣列以獲得影像。 使來自個別試樣之總RNA逆轉錄以產生CDNA，隨後將 其用作qPCR擴增之模板，如由Druyan等人（2008 ; Poult. Sci. 87:2418-29)所述。針對每一基因優化熱循環參數且一 式兩份地使每一基因在單一儀器運行中獨立地擴增。 自微陣列之掃描影像產生數據文件，但使用ScanAlyze 軟體提取每一載玻片及染料組合之強度原始數據。隨後使 用JMP Genomics來分析強度數據文件，包括及初始1〇§2轉 換。使用局部加權回歸來實施數據正規化，且首先在陣列 内進行平滑處理，且跨越所有陣列進行平滑處理。使用混 &模型ANOVA分析所得正規化i〇g2強度。 使用基於P=〇.〇5之Bongerroni校正之顯著性閾值比較平 均強度。對於完整陣列（包括所有重複）而言，使用3個並排 探針計算每一基因之格柵強度之平均值，每個基因產生總 共四個重複平均值（每一格柵產生一個平均值）。對取決於 處理之一式兩份試樣的Ct比的數據（試樣基因ct :試樣空 位DH Ct)實施單向ANOVA。 結果 使用微陣列平臺收集表現數據並產生「熱圖（heat map)」以觀察空腸（圖16)及胰腺（圖17)之數據。將6個目標 土因之相對表現程度轉化為基於圖丨6中所見之等級的視覺 暗不。用減號（「-」）標記低表現基因，且用加號（「+」） 才丁己咼表現基因，而灰色強度越大，繪示偏離處理之平均 表現程度之差別就越大。經量測基因及其據說功能參見表 16171 l.doc •104- 201234977 11。使用實時PCR確認蔗糖酶-異麥芽糖酶ΝΤ、 及澱粉酶2八 (AMY2a)之熱圖中所示之基因表現且其與陣 巧數據高度相 表11.所量測基因之據說功能 基因 標識 ΡΕΡΤ1 寡肽轉運蛋白1 營養素轉運
GCK
SI 葡糖激酶 蔗糖酶異麥芽糖酶 葡萄糖代謝 Ο Ζ01 緊密連接蛋白1 CD3d T細胞抗原CD3 τ細胞標記
AMY2A 澂粉及蔗糖代謝
澱粉酶2A 圖16顯不在23日齡時所有空腸處理之所關注式因的表 圖言普的熱圖。 圖17顯示在23日齡時所有騰腺處理之雞α极粉酶的表現 圖譜的熱圖。 在圖16及17中，注釋係如下：
未經攻毒之對照=未經攻毒之對照+植酸酶 CC =經攻毒之對照+植酸酶 CC +澱粉酶=經攻毒之對照+植酸酶+澱粉酶 CC+XAP=經攻毒之對照+植酸酶+木聚糖酶+澱粉酶+蛋 白酶 CC+EP=經攻毒之對照+植酸酶+Enviva Pro CC+EP+澱粉酶=經攻毒之對照+植酸酶+澱粉酶+Enviva Pro CC+EP+XAP==經攻毒之對照+植酸酶+木聚糖酶+澱粉酶+ 蛋白酶+Enviva Pro 161711.doc -105- 201234977 木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+植酸酶會增加寡肽轉運蛋白^ (PEPT1)之表現，且在與EnWva pr〇組合時進一步增加此表 現。PEPT1係肽轉運系統之部分且負責攝取寬範圍之二肤 及三狀。 經攻毒之對照使葡糖激酶(GCK)之表現下調，但搬粉酶 +植酸酶或木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+植酸酶與如^^ p⑺ 之組合產生類似於未經攻毒之對照的上調。在木聚糖酶+ 澱粉酶+蛋白酶+植酸酶與Enviva Pr〇 一起使用時，上調程 度較大。 利用蔗糖酶異麥芽糖酶（SI)亦觀察到類似圖案，其中 Enviva Pro與澱粉酶+植酸酶或木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+ 植酸酶之組合產生比經攻毒及未經攻毒之對照二者均大的 j調。GCK係葡萄糖代謝中之關鍵酶且㈣責薦糖及異麥 芽糖之水解，且因此在動物中之碳水化合物之消化及吸收 中具有重要作用。 緊密連接蛋白1 (Z01)最高表J見於經攻毒之對照中。利 用酶處理觀察到降低，但在使用Enviva pro時觀察到表現 之較大下調且在與木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+植酸酶組合 時尤其如此’該組合產生與未經攻毒之對照類似之下調程 度。ZOl係位於緊密連接處之細胞質面上的蛋白質，此蛋 白質具有各種作用’範圍為緊密連接總成之信號轉導至緊 密連接處本身之穩定性。 T細胞抗原CD3 (CD3D)高度表現於經攻毒之對照中。單 獨酶處理使表現稍微降低，但在與Enviva Pr0組合時使其 161711.doc •106- 201234977 顯著下調。木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+植酸酶之組合產生 酶處理之最大下調，且在與Enviva Pro組合時產生接近未 經攻毒之對照所觀察到之下調的甚至更大下調。CD3D係 於T細胞上發現之表面分子且在T細胞受體結合期間起重要 作用且係T細胞受體/CD3複合物之部分。 α澱粉酶（AMY2A)高度表現於未經攻毒及經攻毒之對照 中，但添加澱粉酶+植酸酶或木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+植 酸酶會導致表現降低，在尤其針對木聚糖酶+澱粉酶+蛋白 酶+植酸酶組合使用Enviva Pro時，其進一步降低。雞α殿 粉酶主要在胰腺中產生且在澱粉消化中具有主要作用。 討論 在給予木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+植酸酶、尤其與 Enviva Pro組合時，肽轉運蛋白寡肽轉運蛋白1 (PEPT1)之 表現的增加表明肽之利用度增加且因此肽轉運蛋白之需求 增加，此指示酶及DFM對於增加動物之肽之吸收具有協同 效用，此提供更大生長。實例1之動物性能結果支持此結 論。葡糖激酶及蔗糖酶異構酶與澱粉酶+植酸酶或木聚糖 酶+澱粉酶+蛋白酶+植酸酶及Enviva Pro之組合的表現增加 表明，刷狀緣中之葡萄糖吸收增加且蔗糖及異麥芽糖之利 用度增加，此指示酶與DFM間具有正性相互作用以增加小 腸中之碳水化合物吸收且因此增加來自飲食之能量利用 度。經攻毒之對照之葡糖激酶表現降低表明，產氣莢膜梭 菌攻毒對黏膜造成損害且添加Enviva Pro及木聚糖酶+澱粉 酶+蛋白酶+植酸酶可減輕此損害。 161711.doc -107- 201234977
Enviva Pro對降低緊密連接蛋白】之表現的效應指示對腸 中之蛋白質轉換的需求較低，此可與高度腸完整性相關。 然而j經攻毒之對照中之表現增加表明，蛋白質之轉換/ 需求係尚度由於缺乏腸完整性，此可能係由於球蟲及產氣 莢膜梭g感染。酶單獨収善此情況具有—定效應，但利 用Enviva Pro觀察到之加性效應表明自組合獲得更大益 處。此指示Enviva Pro用於增大腸完整性且因此有益於動 物之健康。增大之腸完整性及因此增大之吸收能力可為在 DFM存在時外源性酶之效率增加的機制之一。 經攻毒之對照中之丁細胞抗原（：〇3£1的表現增加指示，由 於攻毒，細胞調介之免疫反應增加。在該等情況下，鳥將 經歷次優性能，此乃因免疫反應將需要可用於生長之能 量，且由於一些鳥將經歷全身性疾病反應。在EnvWa p二 單獨或與酶組合使用時’明顯逆轉此免疫標記增加之表 現。腸中之免疫反應的下調可為在DFM存在時外源性酶在 營養素吸收及性能中之效率增加的機制之一。 利用澱粉酶+植酸酶或木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+植酸酶 之組合時觀察到之α澱粉酶（AMY2A)產生之丁調表明，雞 因應所供應之外源性酶而降低其内源性澱粉酶之產生。= 用Enviva Pr〇及木聚糖酶+澱粉酶+蛋白酶+植酸酶時觀察到 之加性效應表明，DFM與外源性酶協同作用以使鳥可=用 原本需消耗以產生用於消化飲食中之殺粉之酶的能量 利用酶與DFM之組合的下調免疫反應及較高腸完^性、 及較好營養素消化及吸收之淨效應清楚地確定肉 ' <增強 161711.doc -108- 201234977 生產性能。 實例7 材料及方法 利用肉雞實施消化率試驗以測定飲食酶及DFM處理對能 量利用之效應。自商業孵化場獲得總共288隻1日齡（day-old) 雄性 Ross 308 雛雞 並在具 有懸空 鐵絲網 的成排 畜舍中 孵育直至第14天。在孵化時用活球蟲疫苗（Coccivac-B)對 鳥進行接種。對雛雞飼餵基於玉米-SBM-DDGS之雛雞飲 〇 食。自第14天直至第21天為雛雞提供實驗飲食。在整個21 天時段内隨意提供飼料及飲食。在環境控制室中之成排畜 舍中，每個畜舍圈養6隻雛雞，其中其自35°C開始每曰接 受補充熱且每週降低2°C。以23L:1D提供光。在第15天， 對雛雞個別地稱重，分選，綁緊翅膀並使用完全隨機設計 隨機分派至實驗單元。每一處理由8個畜舍/處理組成。研 究由以下處理組成（表12)。 表12.實例7之實驗設計 處理 植酸酶1 額外酶2 DFM3,4 1 無 無 無 2 500 FTU/kg 木聚糖酶(2000 u/kg) 澱粉酶（200u/kg) 蛋白酶(5000 u/kg) 無 3 益 無 EnvivaPro(1.5 x 105 FTU/g) 4 500 FTU/kg 木聚糖酶(2000 u/kg) 澱粉酶(200 u/kg) 蛋白酶(5000 u/kg) EnvivaPro(1.5 x 105 FTU/g) 161711.doc •109- 201234977 5 無 無 GalliPro Tect (8 x 105 FTU/g) 6 500 FTU/kg 木聚糖酶(2000 u/kg) 殿粉酶(200 u/kg) 蛋白酶(5000 u/kg) GalliPro Tect (8 x 105 FTU/g) 植酸酶，來自布丘氏菌。 2澱粉酶來自地衣芽抱桿菌’木聚糖酶來自裏氏木徽， 蛋白酶來自枯草芽抱桿菌。 3 Enviva Pro ®係枯草芽抱桿菌菌株Bs2084、LSSA01及 15AP4之組合，由DaniscoA/S提供。 4 GalliPro Tect係由地衣芽孢桿菌之一種菌株包含之 DFM (DSM17236)。 用於所有實驗處理之酶及DFM皆係由Danisco以適當混 合物及含量供應及提供。將畜舍佈置在設備内以防止直接 接觸以避免交叉污染。在整個實驗時段内對鳥飼餵呈醪液 形式之雛雞飲食（表13)。 表13·實例7之實驗飲食組成。 成份(％)_雛雞 玉米 52.94 玉米-DDGS 12.00 大豆粉48% 29.38 動物/植物脂肪摻合物 1.08 鹽 0.40 DL曱硫胺酸 0.22
Bio-Lys 0.44 石灰石 1.30 磷酸氫鈣 1.27 I61711.doc - 110- 201234977 氯化膽鹼60 0.10 維生素/礦物質預混合物 0.63 Ti02 0.25 經計算之營養素組成(％) CP 22.25 ME，kcal/kg 2925 鈣 0.90 可用磷 0.38 鈉 0.18 可消化之離胺酸 1.20 可消化之曱硫胺酸 0.52 可消化之TSAA 0.85 可消化之蘇胺酸 0.75
在最後2天將清潔***物托盤放置於適當位置且在第21 天自畜舍收集***物試樣。將所收集***物試樣於-20°C 下冷凍，之後將其於65 °C下在烘箱中乾燥3天以測定乾物 質（AOAC International，2005 ;方法934.01)。亦將飼料試 樣校正至以乾物質計，量測5.0 g之每一試樣且將其在100 °C下之烘箱中乾燥24 hr。隨後經由Ι-mm篩研磨***物試 樣，而經由0.5-mm篩研磨飼料試樣。根據標準程序針對 Ti、DM、GE及N分析***物試樣及飲食。表觀代謝能 (ΑΜΕ)計算係基於不可消化之標記（Ti)之濃度及飲食及排 泄物之總能量。針對水分含量之差別進行適當校正。針對 零氮保留量藉由與8.22 kcal/克保留於體内之氮相乘測定N-校正之 AME (AMEn)(Hill 及 Anderson，1958 ; J. Nutr. 64:587-603) ° 161711.doc • 111 - 201234977 使用成對t測試分離平均值。認為在P<0.05下具有顯著差 異。使用籠子作為實驗單元。 結果 圖18顯示21日齡肉雞之由氮保留量校正之表觀代謝能 (AMEn)。DFM之效應；PC0.001 ;酶之效應；Ρ<0·001 ; DFM X酶之效應；Ρ=0.27 ;合併 SEM=32 kcal。 添加木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶及植酸酶與Enviva Pro 或GalliPro Tect之組合相對於對照處理可改良AMEn，其與 酶或DFM本身相比顯著更大。與陰性對照相比，由於木聚 糖酶、澱粉酶、蛋白酶、植酸酶與Enviva Pro (235 kcal/kg)或 GalliPro Tect (215 kcal/kg)之組合的 AMEn 增量 比在單獨施加時添加酶及DFM之效應大（Enviva Pro為1 52 kcal/kg，或 GalliPro Tect為 120 kcal/kg)。 實例8 材料及方法 自商業孵化場購買1400隻1日齡之Cobb雄性雛雞。在研 究開始時，分區向每次處理之7個畜舍中的一者分派50隻 雄性雛雞。研究由以下處理組成（表1): 表1.實例8之實驗設計 處理 產氣莢膜 梭菌攻毒 植酸酶1 額外酶2 DFM3 1 否 500 FTU/kg 無 無 2 是 500 FTU/kg 無 無 161711.doc -112- 201234977 3 是 500 FTU/kg 無 Enviva Pro(7.5 x 104 FTU/g) 4 是 500 FTU/kg 木聚糖酶4(2〇〇〇u/kg) 澱粉酶4 (200 u/kg) 蛋白酶4(5000u/kg) Enviva Pro(7.5 xl04FTU/g) 植酸酶，來自埃希氏大腸桿菌。 2澱粉酶來自地衣芽孢桿菌，木聚糖酶來自裏氏木黴， 蛋白酶來自枯草芽孢桿菌。 3 Enviva Pro ®係枯草芽抱桿菌菌株Bs2084、LSSAOl及 Ο 15AP4之組合，由Danisco A/S提供。 4 Axtra ΧΑΡ ®，由 Danisco A/S提供。 在研究開始、第21天及結束（第42天）時記錄每一畜舍之 鳥重量。畜舍係量測單元。以碎屑（雛雞）或丸粒（生長雞及 肥育雞）形式飼餵肉雞飲食。飲食滿足或超過NRC標準（表 2)。沖洗混合器以防止飲食交叉污染。使用Davis S-20混 合器混合所有處理飼料並使用California製丸磨（冷丸粒溫 度為65°C至70。(：）製丸。自每一批次開始、中間及結束自 〇 每一處理飲食收集試樣並摻和在一起以確認飼料中之酶活 性及Enviva Pro存在性。 表2.實例8之實驗飲食組成。 成份(％) 離雞 生長雞 肥育雞 玉米 50.959 59.6156 62.7488 玉米DDGS 12 12 12 大豆粉，49% CP 30.7176 22.5873 19.4 氣化膽驗 0.06 0.06 0.06 大豆油 3.0693 2.7035 2.84841 161711.doc 113· 201234977 離胺酸 0.21 0.2426 0.244 DL-甲硫胺酸 0.1723 0.1566 0.1341 L-蘇胺酸 0.0387 0.0551 0.0564 鹽 0.4668 0.4692 0.47 石灰石 1.4467 1.4501 1.33389 磷酸氫鈣 0.7346 0.5349 0.571 維生素及痕量礦物質預混合物 0.125 0.125 0.125 經計算之營養素組成(％) CP 22.642 19.45 19.45 能量，mcal/kg 12.761 12.012 12.012 可消化之離胺酸 1.327 1.124778 1.124778 可消化之曱硫胺酸 0.53142 0.475425 0.475425 可消化之蘇胺酸 0.89401 0.78494 0.78494 鳥自第0至42天隨意接受適於處理之飼料。用於所有實 驗處理之酶及Enviva Pro皆係由Danisco以適當混合物及含 量提供。在背景中，所有飲食均含有500 FTU埃希氏大腸 桿菌植酸酶。將畜舍佈置在設備内以防止直接接觸以避免 污染。 在第21天時自雛雞飲食至生長雞飲食出現變化。在第35 天時用肥育雞飲食替代生長雞飲食。在每次改變飼料時， 分區自畜舍移除飼餵器，再次稱重，清空並再填充適當處 理飲食。在研究之最後一天對飼料進行稱重。每日針對死 亡率檢查畜舍。在鳥被淘汰或發現死亡時，記錄日期及移 出重量（kg)。對所有死亡或淘汰之鳥實施肉眼屍檢以確定 性別及可能之死亡原因。注意壞死性腸炎之跡象。 所有畜舍均具有約4英吋厚褥草，其具有新鮮松屑之包 161711.doc -114· 201234977 被。 在將所有烏放置於畜舍之前用商業球蟲病疫苗 (Coccivac-B)對其進行噴霧疫苗接種。在第18、19及2〇 天，對所有鳥（處理丨除外）投與產氣莢膜梭菌之肉湯培養 物。採用已知引起壞死性腸炎且源自商業肉雞操作之產氣 爽膜梭菌之野外分離株作為攻毒有機體。每天使用新鮮接 種物。滴疋置係約1〇 χ 1〇8-9。每一畜舍接受相同量之接 種物。藉由混合至管式飼餵器之基底中發現之飼料中來投 與接種物。 試樣收集 在第21天，每次處理使總共8隻鳥（1至2隻鳥/畜舍）無痛 致死且自每—鳥收集自砂囊下方至回盲腸連接處的總胃腸 乙並送至實驗至在冰上過夜。在實驗室中進一步解剖試樣 以獲得Meckle憩室周圍之空腸的2〇 cm部分；丟棄腸道之 剩餘4刀。將该等部分用Q」％蛋白脒清洗以移除腸内容物 並縱向打開以暴露上皮内層。將該等部分以次衝程h在 99 ml 〇. ι〇/0蛋白腺中粉碎6〇 s以釋放黏膜結合之細菌細 胞。藉由以12,000 x g離心1〇分鐘自粉碎溶液收穫細菌。 將所侍細菌丸粒再懸浮於1〇 ml MRS肉湯+ 1〇%甘油中，在 液氮中快速冷凍，並儲存於_2〇t下直至進一步分析為 止。 DNA分離 藉由酚氣仿提取自所有試樣分離基因組DNA並使用 Roche Applied Science High pure PCR模板純化套組（R〇che 161711.doc 201234977
Diagnostics公司，Indianapolis, IN)進行純化。在提取之後 於DNA程度下隨機成對彙集試樣，每個處理總共四個試 樣。 焦磷酸測序 如由 Dowd(Dowd等人 ’ 2008 ; BMC Microbiol. 8 ’ 125) 所述實施細菌標籤編碼之FLX擴增子焦磷酸測序。在含有 兩隻烏之DNA的彙集試樣中分析相等量之自每一鳥之腸黏 膜分離的DNA。在每一試樣中使用引物28 F (5'-GAGTTTGATCNTGGCTCAG)及 519R (5，- GTNTTACNGCGGCKGCTG) 使10S rRNA基因之V1-V3區擴增。測序後，基於品質篩選 並修整原始數據。基於條碼序列藉由個別試樣對序列進行 分選。移除條碼標藏並移除非細菌核糖體序列。使用與得 自NCBI之經品質控制及人工審核之數據庫之BlastN比較來 測定細菌群落組成。針對每一試樣測定每一細菌ID之相對 含量。使用NCBI命名法以每—分類學等級編輯數據。 統計分析 對於性能而言’使用成對t測試分離數據平均數。認為 在P<0.05下具有顯著差異。使用畜舍作為實驗單元。 屬等級鑑別用於分析焦磷酸測序數據。計算每一屬之相 對含量並使用其進行分析。使用分類模型分析對結果進行 分析且隨後使用JMP 8.0.2 (SAS institute，Cary, NC)計算卡 方（Chi-square)概率，其中將代表兩隻鳥之每一試樣視為實 驗單元。 結果： 161711.doc "116- 201234977 圖19顯示壞死性腸炎攻毒模型中肉雞之飼料轉化率 (FCR)(合併 SEM : 0.015)。
Enviva Pro與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶+植酸酶之组人 與經攻毒之對照處理及僅制Enviva pr。及植酸酶相轉 低FCR(g BW增加/g攝取飼料）。該組合將飼料轉化率降低 至未經攻毒之對照+植酸酶之程度。 圖20顯示第21天時肉雞空腸黏膜中之乳桿菌屬的相對含 量，ChSq <〇.〇〇〇1 〇 圖20顯示壞死性腸炎攻毒模型中第以天時肉雞空腸黏膜 中之乳桿菌屬與其他物種相比之相對含量。與未經攻毒之 對照相比，經攻毒之對照中之乳桿菌之比例降低。ΕηΜπ Pro、木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶+植酸酶之組合比單獨 Enviva Pro及植酸酶及經攻毒之對照更大地增加乳桿菌之 比例。 乳桿菌作為益生菌廣泛用於人類及動物用途（Patters〇n 及Burkeholder，2003 ; Pom"細 82 (4) 627-31)且經文獻 記載可將腸健康改良至可與抗生素生長促進劑相當之程度 (Awad等人，2009 Poult Sci 88 (1) 49-56)。因此，Enviva
Pro '木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶+植酸酶之組合藉由增加 腸菌群中之乳桿菌比例可改良腸健康並對飼料效率產生積 極影響。 上述說明書中提及之所有公開案均以引用方式併入本文 中。彼等熟習此項技術者應明瞭本發明所述方法及系統之 各種修改及變化，此並不背離本發明之範圍及精神。儘管 161711.doc -117- 201234977 已結合具體較佳實施例對本發明進行了闡述，但應瞭解所 主張之本發明不應過度地限於該等具體實施例。實際上， 彼等熟習生物化學及生物技術或相關領域者顯而易見之用 於實施本發明之所述方式的多種修改意欲涵蓋於以下申請 專利範圍之範圍内。 【圖式簡單說明】 圖 1顯示，DFM(Enviva Pro®，購自 Danisco Α/S)與木聚 糖酶（例如木黴屬木聚糖酶之内切木聚糖酶）、澱粉酶（例如 地衣芽孢桿菌α-澱粉酶）、蛋白酶（例如枯草芽孢桿菌蛋白 酶）及植酸酶（例如5 00 FTU/kg Phyzyme ΧΡ(埃希氏大腸桿 菌植酸酶），購自Danisco Α/S)之組合的組合與經攻毒對照 相比顯著改良（減少）動物之腸中的壞死性腸炎損傷評分。 在一些實施例中，木聚糖酶、澱粉酶及蛋白酶可一起調配 於AxtraXAP®中[含有2000 XU木聚糖酶/kg飼料；200 AU 澱粉酶/kg飼料及4000 PU蛋白酶/kg飼料](亦購自Danisco Α/S)。 圖2顯示，（Enviva Pro®，購自Danisco Α/S)與木聚糖酶 (例如木黴屬木聚糖酶之内切木聚糖酶）、澱粉酶（例如地衣 芽孢桿菌α-澱粉酶）、蛋白酶（例如枯草芽孢桿菌蛋白酶）及 植酸酶（例如500 FTU/kg Phyzyme ΧΡ(埃希氏大腸桿菌植酸 酶），講自Danisco Α/S)之組合的組合與經攻毒之對照相比 顯著改良經產氣莢膜梭菌攻毒之肉雞的體重增加（BW增 加）（即使經攻毒之對照產生優於陰性對照（即未經攻毒之對 照）之BW增加）。此顯著優於任何其他酶組合（例如澱粉酶 161711.doc -118- 201234977 及植酸酶，或蛋白酶及植酸酶），且顯著優於施加於經攻 毒對照上之DFM。在一些實施例中，木聚糖酶、澱粉酶及 蛋白酶可一起調配於AxtraXAP®中[含有2000 XU木聚糖酶 /kg飼料；200 AU澱粉酶/kg飼料及4000 PU蛋白酶/kg飼 料](亦購自 Danisco A/S)。合併 SEM=28.6 圖3顯示，（Enviva Pro® ’購自Danisco A/S)與木聚糖酶 (例如木黴屬木聚糖酶之内切木聚糖酶）、澱粉酶（例如地衣 芽孢桿菌α-澱粉酶）、蛋白酶（例如枯草芽孢桿菌蛋白酶）及 植酸酶（例如5〇0 FTU/kg Phyzyme ΧΡ(埃希氏大腸桿菌植酸 酶），購自Danisco A/S)之組合的組合將經產氣莢膜梭菌攻 毒之肉雞中之飼料轉化率（FCR)(g攝取飼料/g BW增加）顯 著改良至未經攻毒之鳥之程度。此顯著優於酶與DFM之其 他組合（例如澱粉酶及植酸酶，或蛋白酶及植酸酶）。在一 些實施例中，木聚糖酶、殿粉酶及蛋白酶可一起調配於 AxtraXAP®中[含有2000 XU木聚糖酶/kg飼料；200 AU澱 粉酶/kg飼料及4000 PU蛋白酶/kg飼料](亦購自Danisco A/S)。 圖4顯示用作腸發炎之標記之IFN-g的相對mRNA表現， 且顯示，DFM (Enviva Pro®)與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白 酶及植酸酶之組合（購自Danisco A/S之Avizyme 1502®+500 FTU/kg Phyzyme XP(埃希氏大腸桿菌植酸酶））之組合在 11天時增加IFN-g之表現，且在20天時降低IFN-g之表 現。
圖5顯示表觀回腸消化能（mCal/kg)且顯示，DFM 161711.doc -119- 201234977 (Enviva Pro®)與木聚糖酶、殿粉酶、蛋白酶及植酸酶（使 用兩種不同酶混合物’第一者係購自Danisco A/S之 Avizyme 1 502®+50〇 FTU/kg Phyzyme XP(埃希氏大腸桿菌 植酸酶）；且第二者係AxtraXAP [含有2000 XU木聚糠酶/kg 飼料；200 AU澱粉酶/kg飼料及4000 PU蛋白酶/kg飼料](亦 購自 Danisco A/S) + 500 FTU/kg Phyzyme XP(埃希氏大腸桿 菌植酸酶））之組合顯著改良能量消化率效應。 圖6顯示利用DFM (Enviva Pro®)與木聚糖酶、澱粉酶、 蛋白酶及植酸酶之組合顯著改良之胺基酸消化率。回腸層 面利用DMF與木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶及植酸酶之組合 對胺基酸之未消化部分的消化率之改良大於單獨之DFM或 無DFM之木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶及植酸酶之組合的改 良。 圖7顯示利用DFM (Enviva Pro®)與木聚糖酶、殿粉酶、 蛋白酶及植酸酶之組合改良之能量消化率。 圖8顯示飼餵給1 7至21日齡之肉雞之飲食處理的氮校正 表觀代謝能AMEn。 圖9顯示，DFM (Enviva Pro®)與木聚糖酶、澱粉酶、蛋 白酶及植酸酶（使用兩種不同酶混合物，第一者係購自 Danisco A/S之Avizyme 1502®+500 FTU/kg Phyzyme XP(埃 希氏大腸桿菌植酸酶）；且第二者係亦購自Danisco A/S之 AxtraXAP + 500 FTU/kg Phyzyme XP(埃希氏大腸桿菌植酸 酶））之組合顯著改良氮保留量。 圖10顯示，DFM (Enviva Pro®)與木聚糖酶、殿粉酶、 161711.doc •120、 201234977 蛋白酶及植酸酶（購自.Danisco A/S之Avizyme 1 502®+Phyzyme XP(埃希氏大腸桿菌植酸酶））之組合與經 攻毒及未經攻毒之對照處理相比，顯著降低在孵化時用劑 量過度之球蟲疫苗處理之第14天之回腸黏膜刮屑中之 MUC-2 的 mRNA含量。 圖11顯示地衣芽孢桿菌之耐胃蛋白酶之α澱粉酶的胺基 酸序列（SEQ ID Νο_ 1)。 圖12顯示地衣芽孢桿菌之耐胃蛋白酶之α澱粉酶的核苷 〇 酸序列（SEQ ID No. 2)。 圖13顯示裏氏木黴之耐胃蛋白酶之α澱粉酶的胺基酸序 列（SEQ ID No. 3)。 圖14顯示裏氏木黴之耐胃蛋白酶之α澱粉酶的核苷酸序 列（SEQ ID No. 4)。 圖15顯示48日齡肉雞的飼料轉化率。 圖16顯示在23日齡時所有空腸處理之所關注基因的表現 圖譜的熱圖。 ❾ 未經攻毒之對照=未經攻毒之對照+植酸酶 CC=經攻毒之對照+植酸酶 CC +澱粉酶=經攻毒之對照+植酸酶+澱粉酶 CC+XAP =經攻毒之對照+植酸酶+木聚糖酶+澱粉酶+蛋 白酶 CC+EP =經攻毒之對照+植酸酶+Enviva Pro CC+EP+澱粉酶=經攻毒之對照+植酸酶+澱粉酶+Enviva Pro 161711.doc -121 - 201234977 CC+EP+XAP =經攻毒之對照+植酸酶+木聚糖酶+澱粉酶+ 蛋白酶+Enviva Pro。 圖1 7顯示在23日齡時所有胰腺處理之雞α澱粉酶的表現 圖譜的熱圖。 未經攻毒之對照=未經攻毒之對照+植酸酶 CC =經攻毒之對照+植酸酶 CC +澱粉酶=經攻毒之對照+植酸酶+澱粉酶 CC+XAP =經攻毒之對照+植酸酶+木聚糖酶+澱粉酶+蛋 白酶 '1_ CC+EP=經攻毒之對照+植酸酶+Enviva Pro CC+EP+澱粉酶=經攻毒之對照+植酸酶+澱粉酶+Enviva Pro CC+EP+XAP =經攻毒之對照+植酸酶+木聚糖酶+澱粉酶+ 蛋白酶+Enviva Pro。 圖1 8顯示21日齡肉雞之由氮保留量校正之表觀代謝能 (AMEn)。DFM之效應；Ρ<0·001 ;酶之效應；P<0.001 ;
| I DFM X酶之效應；Ρ=0·27 ;合併 SEM=32 kcal。 圖19顯示壞死性腸炎攻毒模型中肉雞之飼料轉化率 (FCR)(合併 SEM : 0.015)。 圖20顯示第21天時肉雞空腸中之乳桿菌屬的相對比例，
ChSq <0.0001。 161711.doc -122- 201234977 序 列 表 <110> Danisco A/S <12G>飼料添加劑組合物 <140> 101102303 <141> 2012-OM9 <150> GB 1102857.8 <151> 2011-02-18 <160> 6 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 483 <212> PRT <213>地衣芽孢桿菌 <400> 1
Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gin Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro 15 10 15 ❹
Asn Asp Gly Gin His Trp Lys Arg Leu Gin Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30
Ala Glu His Gly lie Thr Ala Val Trp lie Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45
Thr Ser Gin Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60
Gly Glu Phe His Gin Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80
Gly Glu Leu Gin Ser Ala lie Lys Ser Leu His Ser Arg Asp lie Asn 85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val lie Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 lie Ser Gly Glu His Leu He Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg lie Tyr Lys 165 170 175
Phe Gin Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp lie Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205
Ala Ala Glu lie Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gin 16171卜序列表.doc 201234977 210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His lie Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Gly Lys Glu Met
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gin Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285
His Tyr Gin Phe His Ala Ala Ser Thr Gin Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser 305 310 315 320
Va】Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gin Pro Gly Gin Ser Leu Glu 325 330 335
Ser Thr Val Gin Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe lie Leu 340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gla Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gin Arg Glu lie Pro Ala Leu Lys His Lys lie 370 375 380
Glu Pro lie Leu Lys Ala Arg Lys Gin Tyr Ala Tyr Gly Ala Gin His 385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp lie Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu lie Thr Asp Gly Pro 420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gin Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445
Trp His Asp lie Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val lie Asn Ser 450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser lie Tyr 465 470 475 480
Val Gin Arg <210> 2 <211> 1452 <212> DNA <213>地衣芽孢桿菌 161711-序列表.doc
201234977 <400> 2 gcaaatctta atgggacgct gatgcagtat tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa cattggaagc gtttgcaaaa cgactcggca tatttggctg aacacggtat tactgccgtc tggattcccc cggcatataa gggaacgagc caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac ctttatgatt taggggagtt tcatcaaaaa gggacggttc ggacaaagta cggcacaaaa ggagagctgc aatctgcgat caaaagtctt cattcccgcg acattaacgt ttacggggat gtggtcatca accacaaagg cggcgctgat gcgaccgaag atgtaaccgc ggttgaagtc gatcccgctg accgcaaccg cgtaatttca ggagaacacc taattaaagc ctggacacat tttcattttc cggggcgcgg cagcacatac agcgatttta aatggcattg gtaccatttt gacggaaccg attgggacga gtcccgaaag ctgaaccgca tctataagtt tcaaggaaag gcttgggatt gggaagtttc caatgaaaac ggcaactatg attatttgat gtatgccgac atcgattatg accatcctga tgtcgcagca gaaattaaga gatggggcac ttggtatgcc aatgaactgc aattggacgg tttccgtctt gatgctgtca aacacattaa attttctttt ttgcgggatt gggttaatca tgtcagggaa aaaacgggga aggaaatgtt tacggtagct gaatattggc agaatgactt gggcgcgctg gaaaactatt tgaacaaaac aaattttaat cattcagtgt ttgacgtgcc gcttcattat cagttccatg ctgcatcgac acagggaggc ggctatgata tgaggaaatt gctgaacggt acggtcgttt ccaagcatcc gttgaaatcg gttacatttg tcgataacca tgatacacag ccggggcaat cgcttgagtc gactgtccaa acatggttta agccgcttgc ttacgctttt attctcacaa gggaatctgg ataccctcag gttttctacg gggatatgta cgggacgaaa ggagactccc agcgcgaaat tcctgccttg aaacacaaaa ttgaaccgat cttaaaagcg agaaaacagt atgcgtacgg agcacagcat gattatttcg accaccatga cattgtcggc tggacaaggg aaggcgacag ctcggttgca aattcaggtt tggcggcatt aataacagac ggacccggtg gggcaaagcg aatgtatgtc ggccggcaaa acgccggtga gacatggcat gacattaccg gaaaccgttc ggagccggtt gtcatcaatt cggaaggctg gggagagttl cacgtaaacg gcgggtcggt ttcaalttat gttcaaagat ga <210> 3 <211> 463 <212> PRT <213>裏氏木黴 <400> 3
Met Lys Leu Arg Tyr Ala Leu Pro Leu Leu Leu Gin Leu Ser Leu Pro 15 10 15
Val Leu Ser Ala Asp Thr Ala Ala Trp Arg Ser Arg Thr lie Tyr Phe 20 25 30
Ala Leu TTir Asp Arg lie Ala Arg Gly Scr Gly Asp Thr Gly Gly Ser 35 40 45
Ala Cys Gly Asn Leu Gly Asp Tyr Cys Gly Gly Thr Phe Gin Gly Leu 50 55 60
Glu Ser Lys Leu Asp Tyr lie Lys Gly Met Gly Phe Asp Ala lie Trp 161711-序列表.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1452 201234977 65 70 75 80 I]e Thr Pro Val Val Thr Ser Asp Asp Gly Gty Tyr His Gly Tyr Trp 85 90 95
Ala Glu Asp lie Asp Ser lie Asn Ser His Tyr Gly Ser Ala Asp Asp 100 105 110
Leu Lys Ser Leu Val Asn Ala Ala His Ser Lys Gly Phe Tyr Met Met 115 120 125
Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Tyr Ala Asn lie Ser Asp Asp 130 135 140
Ser Pro Ser Pro Leu Asn Gin Ala Ser Ser Tyr His Pro Glu Cys Asp 145 150 155 160 lie Asp Tyr Asn Asn Gin Thr Ser Val Glu Asn Cys 丁rp lie Ser Gly 165 170 175
Leu Pro Asp Leu Asn Thr Gin Ser Ser Thr lie Arg Ser Leu Tyr Gin 180 185 190
Asp Trp Val Ser Asn Leu Val Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Gly Val Arg 195 200 205 lie Asp Thr Val Lys His Val Glu Gin Asp Tyr Trp Pro Gly Phe Val 210 215 220
Asn Ala Thr Gly Val Tyr Cys lie Gly Glu Val Phe Asp Gly Asp Pro 225 230 235 240
Asn Tyr Leu Leu Pro Tyr Ala Ser Leu Met Pro Gly Leu Leu Asn Tyr 245 250 255
Ala lie Tyr Tyr Pro Met Thr Arg Phe Phe Leu Gin Gin Gly Ser Ser 260 265 270
Gin Asp Met Val Asn Met His Asp Gin lie Gly Ser Met Phe Pro Asp 275 280 285
Pro Thr Ala Leu Gly Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe 290 295 300
Leu Ser lie Lys Asn Asp Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ala Leu Thr Tyr 305 310 315 320
Thr lie Leu Ser Arg Gly He Pro lie Val Tyr Tyr Gly Thr Glu Gin 325 330 335
Ala Phe Ser Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Asp Leu Trp Arg 340 345 350
Ser Gly Phe Asn Ala Gin Ser Asp Met Tyr Asp Ala He Ser Lys Leu 355 360 365
Thr Tyr Ala Lys His Ala Val Gly Gly Leu Ala Asp Asn Asp His Lys -4- 161711-序列表.doc
O
201234977 370 375 380
His Leu Tyr Val Ala Asp Thr Ala Tyr Ala Phc Ser Arg Ala Gly Gly 385 390 395 400
Asn Met Val Ala Leu Thr Thr Asn Ser Gly Scr Gly Ser Ser Ala Gin 405 410 415
His Cys Phe Gly Thr Gin Val Pro Asn Gly Arg Trp Gin Asn Val Phc 420 425 430
Asp Glu Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Scr Ala Asp Gly Asn Gly Gin Leu ： 435 440 445
Cys Leu Asn Val Ser Asn Gly Gin Pro lie Val Leu Leu Scr Scr 450 455 460 <210> 4 <211> 1392 <212> DNA <213>裏氏木擻 <400> 4 atgaagctcc ggtaegetet cccgctgctc ttgeagetet ctttgccggt cctctccgca gacaccgccg cctggaggtc ccgcaccatc tactttgccc tgacagaccg catcgctcgt ggaagcggtg acacgggggg cagtgcgtgt gggaacctgg gggactactg cggtggcacg ttccagggct tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacacctg ttgtgacgag tgatgatggg ggctaccatg gctattgggc ggaggacatc gactccatca actctcatta tggctctgcg gaegatetea agagtetegt caacgccgcg catagcaagg gettetatat gatggtggac gtcgtggcca accacatggg ctacgccaat atctctgacg atagtccctc tccactgaac caggcctcgt cgtatcaccc cgagtgtgat atcgactaca acaaccaaac cagcgtcgag aactgctgga tcagcggcct cccggatctc aacacgcaga gctcaaccat ccgcagcctc taccaggact gggtctccaa cctcgtgtcc aegtaegget tegaeggegt ccgcatcgac accgtcaagc aegtegagea agactactgg cccggcttcg tcaacgccac cggcgtctac tgcatcggcg aggtctttga cggagaccca aactacctgc tgccctacgc cagcctcatg ccgggcctgc tcaactacgc catctactac cccatgacgc gcttcttcct ccagcagggc tcctcgcagg acatggtcaa catgcacgac cagatcggca gcatgttccc cgacccgacc gcgctcggca cctttgtcga caaccacgac aacccgcgct tcctgagcat caagaacgac acggccctgc tcaagaacgc gctgacgtac accatcctct cgcgcggcat ccccatcgtc tactacggca ccgagcaggc cttctcgggc ggcaacgacc cggccaacag ggaggacctc tggcgcagcg gcttcaacgc ccagtccgac atgtacgacg ccatctccaa gctcacctac gccaagcacg ccgtcggcgg cctcgccgac aacgaccaca agcacctgta cgtcgccgac acggcctacg ccttcagccg cgccggcggc aacatggtgg ccctgaccac caacagcggc agegggaget cggcccagca ctgcttcggc acgcaggtgc ccaacggccg ct£gcagaat gtctttgacg agggcaatgg geegaegtat tccgccgacg gcaacggcca gctttgcttg aatgtgtcca acggtcagcc cattgtctts ctgtcttcgt ga 161711·序列表.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1392 201234977 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 引物 28F <220> <221> misc.feature <222> (11)..(11) <223> η 係 a、c、g 或 t <400> 5 gagtttgatc ntggctcag <210> 6 <211> 18 <212> DNA <2Π>人工序列 <220> <223> 引物 519R <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) η 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222〉 （8)..(8) η 係 a、c、g 或 t <400> 6 gtnttacngc ggckgctg -6- 16171丨-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201234977 七、申請專利範圍： 1. 一種飼料添加劑組合物，其包含直接飼餵微生物與蛋白 酶、木聚糖酶、澱粉酶及植酸酶之組合。 2. 如4求項1之飼料添加劑組合物，其中該直接飼假微生 物係抗病原體直接飼餵微生物。 3 ·如凊求項1或2之飼料添加劑組合物，其中該直接飼顧微 • 生物係活的細菌。 4. 如請求項1至3中任一項之飼料添加劑組合物，其中該直 〇 接飼餵微生物包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌 (Lactobacillus)、乳球菌（Xacioeoccwjj 、鏈球菌 (Streptococcus)、芽孢桿菌、片球菌 、腸球菌、明串球菌 (Xewcowosiocj、肉桿菌、丙酸桿菌 (Propionibacterium)、雙成辑菌（Bifidobacterium)、後菌 (C/ojirzW/wm」及巨球形菌（Megasp/zaeraj及其組合。 5. 如前述請求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該直 〇 接飼餵微生物包含以下一或多種菌種的細菌：枯草芽孢 桿菌⑽ 、地衣芽孢桿菌 licheniformis)、解澱粉芽孢桿菌（Bacmus 、腸球菌「五价erococcwd、腸球菌屬 CEWerococcwj spp)、及片球菌屬（户e山·ococcw spp)、乳 得儀 M (Lactobacillus spp)、雙成得溘魇（Bifidobacterum 、嗜酸乳桿菌aczWo/p/n'/wW、乳酸片球 菌（Pe山’ocoaMJ acii/i/acizW)、雷特氏乳球菌 161711.doc 201234977 lactis)、兩成雙皮辑蛰（Bifidobacteria bifidium) ' 特氏丙 酸桿菌（7Vo/7io«z‘Z)acierz_Mm 、香腸乳桿菌 (Lactobacillus farciminus)、良车螗乳稈蛰（lact〇bacillus rhamnosus)、了 酸後蛰（ci〇stridium butyricum) ' 動蜘隻 也大干議 M (Bifidobacterium animalis ssp· animalis)、蘇伊 氏乳桿菌（LactobaciHus reuteri)、臘狀芽孢桿菌（Bacinus cereus)、’ 液乳缉儀屣（Lact〇bacinus saiivarius SSp 、埃氏巨球形菌「杨如印、丙酸 才干菌屬（T;-〇pi〇m’6i7cierz’a 及其組合。 6. 8. 如前述請求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該直 接飼餵微生物係呈内生孢子形式。 如前述請求項中任一項之飼料添加劑組合物其中該木 聚糖酶係内切_1，4-β-(ΐ-木聚糖酶或丨，4 β —木糖苷酶，較佳 為内切-1，4-β-(ΐ-木聚糖酶。 如前述請求項中任—項之飼料添加劑組合物，其中該木 聚糖酶係來自芽孢桿菌、木黴屬 Γ choderma)、嗜熱轉'抱菌、油徽菌 (spergillus)、青’飯菌心nici出臟）反腐質黴屬 (Humicola)。 蛋白酶 9.如刖述明求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該蛋 白酶係枯草桿菌蛋白酶、中性蛋白酶(―⑴。…⑷、鹼 I糸胺酸蛋白_、角蛋白酶或擬諾卡氏_ (版―·叩❿） 10. 如前述請求項中任一 員之飼料添加劑組合物 其中該植 161711.doc 201234977 酸酶係6-植酸酶或3-植酸酶。 11.如請求項10之飼料添加劑組合物，其中該植酸酶係6_植 酸酶。 12·如前述請求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該植 酸酶係埃希氏大腸桿菌（五.c〇/〇植酸酶或布丘氏菌 匀植酸酶或哈夫尼菌介⑷植酸酶或檸檬酸 才干菌（Cz7ro6<acieT^_|_ fee酶或曲黴菌（乂甲⑷植酸酶或青 黴菌（&此册《㈣植酸酶或木黴屬（7Wc/z〇ifemW植酸酶或埃希 氏大腸桿菌植酸酶或漢遜酵母菌（//奶％⑽/β;植酸酶。 13. 如別述喷求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該澱 _刀酶係選自由以下組成之群中之一或多者：以殺粉酶、 G4-形成性澱粉酶、ρ·澱粉酶及澱粉酶。 14. 如凊求項13之飼料添加劑組合物，其中該澱粉酶係&澱 粉酶。 Α述叫求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該澱 籾酶係來自地衣芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、木黴屬或 曲黴菌屬。 1 6.如刖述叫求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該植 酸酶係以介於2〇〇 FTU/g飼料添加劑組合物與1〇〇〇〇 FTU/g飼料添加劑組合物間之劑量存在。 和述凊求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該澱 私酶係以介於5〇 AU/g飼料添加劑組合物與AW飼 料添加劑組合物間之劑量存在。 月J述μ求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該木 161711.doc 201234977 聚糖酶係以介於500 xu/g飼料添加劑組合物與4〇〇〇〇 XU/g飼料添加劑組合物間之劑量存在。 19.如前述請求項中任一項之飼料添加劑組合物，其中該蛋 白酶係以介於1000 PU/g飼料添加劑組合物與6〇〇〇() 飼料添加劑組合物間之劑量存在。 20·如前述請求項甲任一項之飼料添加劑組合物其中該 DFM係以介於3·75χ1〇7 CFU/g飼料添加劑組合物與 CFU/g飼料添加劑組合物間之劑量存在。 21. -種以下方法：改良個體之性能或改良飼料中原料的消 化率（例如營養素消化率，如：胺基酸消化率）、或改良 氮保留量、或改良該等個體對壞死性腸炎之抗性、或改 良飼料轉化率(FCR)、或改良個體之體重增加、或改良 個體中之飼料效率、或調節（例如改良）該個體之免疫反 應、或促進個體之胃腸道中的有益細菌生長，該方法包 括向個體投與直接飼餵微生物與蛋白酶、木聚糖酶、澱 粉酶及植酸酶之組合。 22·如請求項21之方法，其包含投與如請求項！至2〇中任一 項之飼料添加劑組合物。 23. 如清求項21或22之方法，其中該直接铜傲微生物係抗病 原體直接飼餵微生物。 24. 如請求項21至23中任-項之方法，其中該直接飼傲微生 物係活的細菌。 25·如請求項21至24中任一項之方法，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌、乳球菌、鏈 161711.doc 201234977 球菌、芽孢桿菌、片球菌、腸球菌、明串球菌、肉桿 菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌及巨球形菌及其組合。 26·如請求項21至25中任一項之方法，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌種的細菌：枯草芽孢桿菌、地衣 芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、腸球菌、腸球菌屬、及片 球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸片 球菌、雷特氏乳球菌、兩歧雙歧桿菌、特氏丙酸桿菌、 香腸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、丁酸梭菌、動物雙歧桿菌 屬、羅伊氏乳桿菌、臘狀芽孢桿菌、唾液乳桿菌屬、埃 氏巨球形菌、丙酸桿菌屬及其組合。 27. 如請求項21至26中任一項之方法，其中該直接飼餵微生 物係呈内生孢子形式。 28. 如請求項21至27中任一項之方法，其中該木聚糖酶係内 切-l，4-p-d-木聚糖酶或M卜木糖苷酶，較佳為内切_丨，4_ β-d-木聚糖酶。 29. 如請求項21至28中任一項之方法，其中該木聚糖酶係來 自芽孢桿菌、木黴屬、嗜熱絲孢菌、曲黴菌、青黴菌及 腐質黴屬。 30. 如請求項21至29中任一項之方法，其中該蛋白酶係栝草 杯菌蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性絲胺酸蛋白酶或角蛋白 酶或擬諾卡氏菌蛋白酶。 31_如請求項21至30中任一項之方法，其中該植酸酶係。植 酸酶或3_植酸酶。 32.如凊求項3 1之方法，其中該植酸酶係6_植酸酶。 161711.doc 201234977 33·如請求項21至32中任一項之方法，其中該植酸酶係埃希 氏大腸桿菌植酸酶或布丘氏菌植酸酶或哈夫尼菌植酸酶 或檸檬酸桿菌植酸酶或曲黴菌植酸酶或青黴菌植酸酶或 木黴屬植酸酶或埃希氏大腸桿菌植酸酶或漢遜酵母菌植 酸酶。 3 4 _如睛求項21至3 3中任一項之方法’其中該殿粉酶係選自 由以下組成之群中之一或多者：心澱粉酶、G4-形成性澱 粉酶、β-殿粉酶及γ_殿粉酶。 3 5.如請求項21至34中任一項之方法，其中該澱粉酶係心澱 粉酶。 3 6.如請求項21至35中任一項之方法，其中該澱粉酶係來自 地衣芽抱桿菌、解澱粉芽孢桿菌、木黴屬或曲黴菌屬。 37. 種直接飼傲微生物與蛋白酶、木聚糖酶、殿粉酶及植 酸酶之組合的用途’其用於改良個體之性能、或改良飼 料中原料的消化率（例如營養素消化率，如：胺基酸消化 率）、或改良氮保留量 '或改良該等個體對壞死性腸炎之 抗性、或改良飼料轉化率（FCR)、或改良個體之重量增 加、或改良個體中飼料效率、或調節（例如改良）該個體 之免疫反應、或促進個體之胃腸道中的有益細菌生長。 38. 如請求項37之用途，其中使用如請求項1至2〇中任一項 之飼料添加劑組合物。 39. 如明求項37至38中任一項之用途其中該直接飼餵微生 物係抗病原體直接飼餵微生物。 4〇_如清求項37至39中任一項之用途’其中該直接飼餵微生 161711.doc 201234977 物係活的細菌。 41. 42 Ο 43 44. ❹ 45. 46. 如凊求項37至40中任一項之用途，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌、乳球菌、鏈 球菌、芽抱桿菌、片球菌、腸球菌、明串球菌、肉桿 菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌及巨球形菌及其組合。 如凊求項37至41中任一項之用途，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌種的細菌：枯草芽孢桿菌、地衣 芽孢和·菌、解澱粉芽孢桿菌、腸球菌、腸球菌屬、及片 球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸片 求菌雷特氏乳球菌、兩歧雙歧桿菌、特氏丙酸桿菌、 香腸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、丁酸梭菌、動物雙歧桿菌 屬羅伊氏乳桿菌、臘狀芽孢桿菌、唾液乳桿菌屬、埃 氏巨球形菌、丙酸桿菌屬及其組合。 I 上 如睛求項37至42中 物係呈内生孢子形式。 月长項37至43中任一項之用途，其中該木聚糖酶係内 切-Μ-β-d-木聚糖酶或Μ β_木糖苷酶，較佳為内切-丨，^ β-d-木聚糖酶。 如請求項37至44巾任-項之料，其巾該木聚糖酶係來 自芽孢桿菌、木黴屬、嗜熱絲孢菌、曲黴菌、青黴菌及 腐質黴屬。 =請求項37至45中任-項之用途，其中該蛋白酶係枯草 才干菌蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性絲胺酸蛋白酶或角蛋白 酶或擬諾卡氏菌蛋白酶。 1617II.doc 201234977 47_如請求項37至46中任一項之用途，其中該植酸酶係& 酸酶或3-植酸酶。 48. 如請求項47之用途，其中該植酸酶係6_植酸酶。 49. 如請求項37至48中任一項之用途’其中該植酸酶係埃希 氏大腸桿菌植酸酶或布丘氏菌植酸酶或哈夫尼菌植酸酶 或擦檬酸桿菌植酸酶或曲黴菌植酸酶或青黴菌植酸酶或 木徽屬植酸酶或埃希氏大腸桿菌植酸酶或漢遜酵母菌植 酸酶。 50. 如請求項37至49中任一項之用途，其中該澱粉酶係選自 由以下組成之群中之一或多者：…澱粉酶、G4_形成性殿 粉酶、β-澱粉酶及γ-澱粉酶。 51. 如請求項37至5〇中任一項之用途，其中該澱粉酶係“澱 粉酶。 52. 如請求項37至51中任一項之用途，其中該澱粉酶係來自 地衣芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、木黴屬或曲黴菌屬。 53. —種套組’其包含直接飼餵微生物、蛋白酶、木聚糖 酶、澂粉酶、植酸酶及投與說明書。 54·如請求項53之套組’其中該套组包含如請求項1至2〇中 任一項之飼料添加劑組合物。 55如睛求項53至54中任一項之套組，其中該直接飼餵微生 物係抗病原體直接飼餵微生物。 56. 如請求項53至55中任一項之套組，其中該直接飼餵微生 物係活的細菌。 57. 如請求項53至56中任一項之套組，其中該直接飼餵微生 161711.doc 201234977 物包含以下一或多種菌屬的細菌：乳桿菌、乳球菌、鏈 球菌、芽孢桿菌、片球菌、腸球菌、明串球菌、肉桿 菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌及巨球形菌及其組合。 58.如請求項53至57中任一項之套組，其中該直接飼餵微生 物包含以下一或多種菌種的細菌：栝草芽孢桿菌、地衣 芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、腸球菌、腸球菌屬、及片 球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸片 球菌、雷特氏乳球菌、兩歧雙歧桿菌、特氏丙酸桿菌、 香腸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、丁酸梭菌、動物雙歧桿菌 屬、羅伊氏乳桿菌、臘狀芽抱桿菌、唾液乳桿菌屬、埃 氏巨球形菌、丙酸桿菌屬及其組合。 59·如請求項53至58中任一項之套組，其中該直接飼飯微生 物係呈内生孢子形式。 60.如請求項53至59中任一項之套組，其中該木聚糖酶係内 切-l’4-p-d-木聚糖酶或1，4 β-木糖苷酶，較佳為内 4 夏 5 Η · β-d-木聚糖酶。 61·如請求項53至60中任一項之套組，其中該木聚糖酶係來 自芽孢桿菌、木黴屬、嗜熱絲孢菌、曲黴菌、青徽菌 腐質黴屬。 62. 如請求項53至61中任一項之套組，其中該蛋白酶係枯草 桿菌蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性絲胺酸蛋白酶或角蛋 酶或擬諾卡氏菌蛋白酶。 63. 如請求項53至62中任一項之套組，其中該植酸酶係植 酸酶或3-植酸酶》 161711.doc 201234977 64. 如請求項63之套組，其中該植酸酶係6_植酸酶。 65. 如請求項53至64中任一項之套組，其中該植酸酶係埃希 氏大腸桿菌植酸酶或布丘氏菌植酸酶或哈夫尼菌植酸酶 或檸檬酸桿菌植酸酶或曲黴菌植酸酶或青黴菌植酸酶或 木黴屬植酸酶或埃希氏大腸桿菌植酸酶或漢遜酵母菌植 酸酶。 66. 如請求項53至65中任一項之套組，其中該澱粉酶係選自 由以下組成之群中之一或多者：心澱粉酶、G4_形成性澱 粉酶、β-澱粉酶及γ-澱粉酶。 67. 如請求項53至66中任一項之套組，其中該澱粉酶係心澱 粉酶。 68. 如請求項53至67中任一項之套組，其中該搬粉酶係來自 地衣芽孢桿菌或解澱粉芽孢桿菌、木黴屬或曲黴菌屬。 69· —種製備飼料添加劑組合物之方法，其包括混合直接飼 餵微生物與蛋白酶、木聚糖酶、殿粉酶及植酸酶，及（視 情況）包裝。 70. —種飼料，其包含如請求項1至2〇中任一項之飼料添加 劑組合物。 71. 如請求項70之飼料，其中該植酸酶係以介於4〇〇 FTu/kg 飼料與1000 FTU/kg飼料間之劑量存在。 72. 如請求項70或71之飼料，其中該澱粉酶係以介於 AU/kg飼料與2000 AU/kg飼料間之劑量存在。 73. 如請求項70至72中任一項之飼料，其中該木聚糖酶係以 介於1000 xu/kg飼料與4000 XU/kg飼料間之劑量存在。 161711.doc • 10- 201234977 74. 如請求項70至73中任一項之飼料，其中該蛋白酶係以介 於2000 PU/kg飼料至6〇〇〇 pu/kg飼料間之劑量存在。 75. 如請求項70至74中任一項之铜料，其中該dfm係以介於 7.5x1 04 CFU/kg飼料與lxl07 CFU/kg飼料間之劑量存在。 76. -種製備飼料原料之方法，其包含混合飼料組份與如請 求項1至20中任一項之飼料添加劑組合物。 77_ -種預混合物，其包含含有直接飼餵微生物與蛋白酶、 木聚糖酶、澱粉酶及植酸酶之組合的飼料添加劑組合物 U 及至少一種礦物質及/或至少一種維生素。 78. —種預混合物，其包含如 月不項1至20中任一項之飼料 添加劑組合物與至少一種礦物皙 續㈣及/或至少一種維生素的 組合。 79.如請求W至辦任-項之飼料添加劑組合物，其用於 預防及/或治療個體中之球蟲病及/或壞死性腸炎/ 8〇. 一種預防及/或治療壞死性腸炎及/或球蟲病 中向個體投與有效量之如請求項β2〇中杯法其 ϋ ⑨加齡合物。 2G中任—項之飼料 81. -種飼料添加劑組合物或飼料或套組或 混合物，其係如本文參照附圖及實例之—般定義 161711.doc • 1】·
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