JP2019500054A - 飼料添加用組成物 - Google Patents

Abstract

開示されているのは、少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物から本質的になる飼料添加用組成物、および対象の能力を改善する方法または飼料中の原材料の消化率を改善する方法であって、プロテアーゼと組み合わせて直接給与微生物を対象に投与することを含む方法である。
【選択図】図１

Description

本出願は、２０１５年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２５３０８９号明細書の利益を主張するものであり、この明細書はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本分野は、１種または複数種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物を含む飼料添加用組成物、ならびに方法、キットおよびそれらの使用に関する。

直接給与微生物（ＤＦＭ）またはプロバイオティクスは、胃腸感染を抑制し且つ消化管中において最適に調節された微生物環境を提供する栄養補助食品である。動物飼料産業では、抗生物質の使用に対する懸念から、疾患を予防するための代替物を探索するに至っている。ＤＦＭは抗菌剤の代用品として使用され得、そのため動物飼料での抗生物質の必要性を低減し得る。ＤＦＭはまた、病原体の増殖と競合して阻害し得、免疫機能も刺激し得、且つ消化管（ｇａｓｔｒｏｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ）中の微生物バランスも調節し得る。ＤＦＭとして、直接給与される細菌および酵母をベースとする製品が挙げられる。ＤＦＭと１種または複数種の酵素との組み合わせにより、動物における栄養素利用生産能力特性（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）が改善され得ることが分かっている。

２０１３年１２月１２日に公開された米国特許出願公開第２０１３／０３３０３０７号明細書では、プロテアーゼおよびフィターゼと組み合わせて直接給与微生物を含む飼料添加用組成物、ならびに動物の生産能力特性を改善する方法が開示されている。

２０１４年８月２１日に公開された米国特許出願公開第２０１４／０２３４２７９号明細書では、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼおよびフィターゼと組み合わせて直接給与微生物を含む飼料添加用組成物、ならびに動物の生産能力特性を改善する方法が開示されている。

２０１４年５月１３日にＲｅｈｂｅｒｇｅｒ他に付与された米国特許第８，７２２，０５８号明細書では、３Ａ−Ｐ４ ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０６、１５Ａ−Ｐ４ ＡＴＴＣ ＰＴＡ−６５０７および２２Ｃ−Ｐ１ ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０８からなる群から選択される１種または複数種のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ）属の菌株を動物に給与する方法が説明されている。

一態様では、開示されているのは、少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物から本質的になる飼料添加用組成物である。

第２の態様では、この直接給与微生物は抗病原体直接給与微生物である。

第３の態様では、この直接給与微生物は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属およびメガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種の細菌株を含む。

第４の態様では、この直接給与微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）およびペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリア種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種の細菌株を含む。

第５の態様では、この直接給与微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株３ＢＰ５（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５１０）；９１８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０８）および１０１３（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０９）を含む。

第６の態様では、この直接給与微生物は内生胞子の形態であることができる。

第７の態様では、この飼料添加用組成物は、サブチリシン、バシロリシン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、ケラチナーゼまたはノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属プロテアーゼである少なくとも１種のプロテアーゼも含む。

第８の態様では、少なくとも１種のプロテアーゼは、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサブチリシンである。

第９の態様では、この飼料添加用組成物中の少なくとも１種のプロテアーゼは、１０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜２００，０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する。

第１０の態様では、この飼料添加用組成物中のＤＦＭは、１×１０^３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜１×１０^１３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する。

第１１の態様では、開示されているのは、対象の能力を改善する方法、または飼料中の原材料の消化率（例えば、アミノ酸消化率等の栄養素消化率）を改善する方法、または窒素保持を改善する方法、または壊疽性腸炎に対する対象の抵抗性を改善する方法、または飼料転換率（ＦＣＲ）を改善する方法、または屠体もしくは食肉の収率を増加させる方法、または対象の体重増加を改善する方法、または対象の飼料効率を改善する方法、または対象の免疫応答を調節する（例えば改善する）方法、または対象の消化管中での有益細菌の増殖を促進する方法、または対象の消化管中での病原性細菌の集団を低減する方法、または糞尿中での栄養素排出を低減する方法、または糞尿中でのアンモニアの生成を低減する方法、または食物性のヘミセルロースもしくは繊維の消化率もしくは利用を改善する方法であって、少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物を投与することを含む方法である。

第１２の態様では、開示されているのは、本明細書で説明された飼料添加用組成物のいずれかと、投与に関する指示書とを含むキットである。

第１３の態様では、開示されているのは、飼料添加用組成物を調製する方法であって、少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物を混合すること、および包装することを含む方法である。

第１４の態様によれば、開示されているのは、本明細書で説明された飼料添加用組成物のいずれかを含む飼料である。

第１５の態様によれば、開示されているのは、本明細書で説明された飼料添加用組成物のいずれかと、少なくとも１種のミネラルおよび／または少なくとも１種のビタミンとを含むプレミックスである。

３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼ（Ｐ３０００）の、単独でまたは組み合わせて給与した場合のブタの成長能力への効果を示す図である。 ３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合のブタの成長能力への効果を示す図である。 ３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合の糞便へのアンモニア排出への効果を示す図である。 ３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合のブタの成長能力への効果を示す図である。 ３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合の糞便のアンモニア濃度への効果を示す図である。 ３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、組み合わせて給与した場合のまたはＤＦＭ単独の場合のブタの成長能力への効果を示す図である。 ３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合のブタの成長能力への効果を示す図である。 プロテアーゼとの組み合わせでの３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属ＤＦＭの、大豆ミールをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのｉｎ−ｖｉｔｒｏでのタンパク質可容化への効果を示す図である。 プロテアーゼとの組み合わせでの単一菌株のバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＦＭの、大豆ミールをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのｉｎ−ｖｉｔｒｏでのタンパク質可容化への効果を示す図である。 プロテアーゼとの組み合わせでの単一菌株のバチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）ＤＦＭの、大豆ミールをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのｉｎ−ｖｉｔｒｏでのタンパク質可容化への効果を示す図である。 プロテアーゼとの組み合わせでの単一菌株のバチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）ＤＦＭの、コムギをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのｉｎ−ｖｉｔｒｏでのタンパク質可容化への効果を示す図である。 プロテアーゼとの組み合わせでの単一菌株のバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＦＭの、コムギをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのｉｎ−ｖｉｔｒｏでのタンパク質可容化への効果を示す図である。 プロテアーゼとの組み合わせでの単一菌株のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＦＭの、コムギをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのｉｎ−ｖｉｔｒｏでのタンパク質可容化への効果を示す図である。

本明細書で引用する全ての特許、特許出願および刊行物は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

本開示では、多数の用語および略語を使用する。他に特に明記されない限り、下記の定義が当てはまる。

１つの要素もしくは成分に先行する不定冠詞「１つの」は、その要素もしくは成分の事例（すなわち、出現）の数に関して非制限的であることが意図されている。このため「１つの」および「その」は、１つもしくは少なくとも１つを含むと読むべきであり、要素もしくは成分の単数語形はまた、特にその数が明らかに単数であることを意味しない限り複数形も含む。

用語「〜を含む」は、実施形態で言及される既定の特徴、整数、工程もしくは成分の存在を意味するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、成分もしくはそれらの群の存在もしくは添加を排除するものではない。用語「〜を含む」は、用語「〜から本質的になる」および「〜からなる」によって包含される実施形態を含むことが意図されている。同様に、用語「〜から本質的になる」は、用語「〜からなる」によって包含される実施形態を含むことが意図されている。

存在する場合、全ての範囲は、包括的および結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が記載された場合、記載された範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈すべきである。

本明細書において数値と結び付けて使用する用語「約」は、その用語がその状況において他に特に定義されていない限り、数値の±０．５の範囲を指す。例えば、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が他に特に定義されていない限り、５．５〜６．５のｐＨ値を指す。

本明細書を通して示されたあらゆる最高数値限度は、それより低いありとあらゆる数値限度を、そのようなより低い数値限度が本明細書に明示的に記載されたかのように含むことが意図されている。本明細書全体を通して示された数値の下限は全て、それより大きい数値限度が本明細書に明確に記載されているかのように、そのようなより大きい数値限度を全て含む。本明細書全体を通して示された数値範囲は全て、それより狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲に入る全てのより狭い数値範囲を全て含む。

用語「動物」および「対象」は、本明細書において互換的に使用される。動物には、全ての非反芻動物（ヒトを含む）および反芻動物が含まれる。特定の実施形態において、動物は、ウマおよび単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、子ブタ、成長ブタ、雌ブタなどのブタ；ダチョウ、アヒル、ニワトリ、ブロイラー、産卵ニワトリなどの家禽類；サケ、マス、テラピア、ナマズ、コイなどの魚類；およびエビやクルマエビなどの甲殻類が挙げられるが、それらに限定されない。また別の実施形態では、動物は、ウシ、幼ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、アメリカヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーンおよびニルガイを含むがそれらに限定されない反芻動物である。

本明細書において使用する用語「病原体」は、疾患の任意の原因物質を意味する。そのような原因物質としては、細菌性、ウイルス性、真菌性原因物質などを挙げることができるが、それらに限定されない。

「飼料」および「食料」は、それぞれ、非ヒト動物および人間それぞれによって食べられる、摂取される、消化されるために意図される、もしくは好適である任意の天然もしくは人工食物、食事などまたはそのような食物の成分を意味する。

本明細書において使用する用語「食料」は、広義において使用され、ヒトのための食料および食品ならびに非ヒト動物のための食料（すなわち、飼料）に及ぶ。

用語「飼料」は、家畜の飼育において動物に与えられる製品に関して使用される。用語「飼料」および「動物飼料」は、互換的に使用される。

本明細書において使用する用語「直接給与微生物」（「ＤＦＭ」）は、生きている（生育性）天然型微生物の起源である。ＤＦＭには、１種または複数種のそのような天然型微生物（例えば、細菌株）を含み得る。ＤＦＭのカテゴリーには、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、乳酸菌および酵母が含まれる。桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）は、胞子を形成する固有のグラム陽性桿菌である。これらの胞子は極めて安定性であり、例えば熱、水分およびある範囲のｐＨなどの環境条件に抵抗することができる。これらの胞子は、動物に摂取されると活性栄養細胞に成長し、食事およびペレット飼料に使用することができる。乳酸菌は、病原体に対して拮抗性である乳酸を生成するグラム陽性球菌である。乳酸菌はある程度は感熱性であると思われるので、それらはペレット化飼料では使用されない。乳酸菌のタイプには、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属が含まれる。酵母は細菌ではない。これらの微生物は、植物群の真菌に属する。そのため、用語ＤＦＭは、以下のうちの１つまたは複数を包含する：直接給与細菌、直接給与酵母、直接給与酵母およびそれらの組み合わせ。

用語「プレバイオティック」は、１種または限られた数種の有益細菌の増殖および／または活動を選択的に刺激することにより宿主に有益な影響を及ぼす非消化食物成分を意味する。

用語「プロバイオティック培養物」は、本明細書で使用される場合、例えば十分な数で摂取されるまたは局所的に適用される場合に、即ち宿主生物に１つまたは複数の実証可能な健康上の利益を与えることにより、この宿主生物に有益な影響を及ぼす生きた微生物（例えば細菌または酵母等）を定義する。プロバイオティクスは、１つまたは複数の粘膜表面中の微生物バランスを改善することができる。例えば、この粘膜表面は腸、尿路、気道または皮膚であることができる。用語「プロバイオティック」は、本明細書で使用される場合、免疫系の有益な分枝を刺激し得、同時に粘膜表面（例えば腸）での炎症反応を低減し得る生きた微生物も包含する。プロバイオティック摂取に下限または上限はないが、１日用量として少なくとも１０^６〜１０^１２（好ましくは少なくとも１０^６〜１０^１０、好ましくは１０^８〜１０^９）ｃｆｕが対象中で有益な健康効果を達成するのに有効であることが示唆されている。

用語「ＣＦＵ」は、本明細書で使用される場合、「コロニー形成単位」を意味し、単一の前駆細胞に由来する細胞の凝集体をコロニーが表す生存細胞の尺度である。

本明細書において使用する用語「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を開裂できる酵素を指す。用語「プロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」および「プロテイナーゼ」は、互換的に使用できる。プロテアーゼは、動物、植物、細菌、古細菌およびウイルス内で見いだすことができる。タンパク質分解は、現在は６つの幅広い群：アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼおよびメタロプロテアーゼに分類されている酵素によって達成できる。

用語「単離（された）」は、物質が自然には発生しない形態もしくは環境にあることを意味する。単離物質の非限定的例には、（１）任意の非天然型物質、（２）それが自然に結び付いている天然型成分の１つ以上もしくは全部から少なくとも部分的に除去されている任意の宿主細胞、酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子を含むがそれらに限定されない任意の物質；（３）自然に見いだされる物質と比較してヒトの手によって修飾された任意の物質；または（４）それが自然に結び付いている他の成分と比較して物質の量を増加させることによって修飾された任意の物質が含まれる。用語「単離核酸分子」、「単離ポリヌクレオチド」および「単離核酸断片」は、互換的に使用され、一本鎖もしくは二本鎖の、任意選択的に合成、非天然もしくは改変ヌクレオチド塩基であるＲＮＡもしくはＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡのポリマーの形態にある単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成されてよい。

核酸もしくはポリペプチドに適用される用語「精製（された）」は、一般に、当分野において周知の分析技術によって決定した他の成分を本質的に含まない核酸もしくはポリペプチドを示す（例えば、精製ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液および／または密度勾配遠心分離法に供された媒体において個別のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせる核酸もしくはポリペプチドは「精製されて」いる。精製核酸もしくはポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％（例えば、モルベースでの重量％）以上純粋である。これに関連して、組成物は、精製もしくは濃縮技術の適用後に分子濃度が実質的に増加している場合は、分子が濃縮されている。「濃縮（された）」という用語は、組成物中に化合物、ポリペプチド、細胞、核酸もしくは他の特定の材料もしくは成分が出発組成物より高い相対濃度もしくは絶対濃度で存在することを意味する。

本明細書において使用する用語「形質転換」は、核酸分子の宿主生物への移動もしくは導入を意味する。核酸分子は、ＤＮＡの線状形もしくは環状形として導入することができる。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってよい、または核酸分子は生成宿主のゲノム内に組み込まれてよい。形質転換核酸を含有する生成宿主は、「形質転換（された）」もしくは「組換え」もしくは「トランスジェニック」生物もしくは「形質転換体」と呼ばれる。

本明細書において使用する用語「組換え」は、例えば、化学合成によって、または遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作によって、核酸配列の本来なら別々の２つの配列セグメントの人工的組み合わせを意味する。例えば、１つ以上のセグメントもしくは遺伝子が、自然もしくは実験的いずれかの操作によって異なる分子から、同一分子の別の部分から、または人工的配列からその中に挿入されているＤＮＡは、遺伝子内への、および引き続いて生物内への新規な配列の導入を生じさせる。用語「組換え」、「トランスジェニック」、「形質転換（された）」、「遺伝子操作（された）」もしくは「外来遺伝子発現のために修飾された」は、本明細書では互換的に使用される。

用語「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」は本明細書において、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」と互換的に使用される。生存微生物は、代謝的に活性であるものまたは分化し得るものである。

本明細書で説明されたＤＦＭは、少なくとも１種の生存微生物（例えば、生存細菌株または生存酵母または生存真菌）を含む。好ましくは、このＤＦＭは少なくとも１種の生存細菌を含む。

一実施形態では、本ＤＦＭは胞子形成細菌株であり得、従って、用語ＤＦＭは胞子（例えば細菌胞子）で構成され得るか、またはこの胞子を含み得る。そのため、用語「生存微生物」は、本明細書で使用される場合、微生物胞子（例えば内生胞子または分生子）を含むことができる。あるいは、本明細書で説明された飼料添加用組成物中のＤＦＭは、微生物胞子（例えば内生胞子または分生子）で構成されなくてもよいし、この微生物胞子を含まなくてもよい。

微生物は、天然に存在する微生物であってもよいし、形質転換された微生物であってもよい。好ましくは、微生物は、単離され得る少なくとも３種の好適な微生物（例えば細菌）の組み合わせである。

本明細書で説明されたＤＦＭは、以下の属のうちの１種または複数種に由来の微生物を含み得る：ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属およびメガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属ならびにこれらの組み合わせ。

好ましくは、本ＤＦＭは、以下のバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）から選択される１種または複数種の細菌株を含む：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）およびバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）。

「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属は、本明細書で使用される場合、当業者に既知であるように「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての種を含み、以下が挙げられるがこれらに限定されない：枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）およびＢ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類上の再編成を受け続けていることが認識されている。そのため、この属には、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されるバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）または現在は「パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）」と称されるバチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）等の生物が挙げられるがこれらに限定されない再分類されている種が含まれることが意図されている。ストレスに満ちた環境条件下での抵抗性内生胞子の生成がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の決定的な特徴であると考えられるが、この特徴はまた、最近命名されたアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびビルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属にも当てはまる。

好ましくは、本ＤＦＭは、３種以上の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株３ＢＰ５（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５１０）；９１８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０８）および１０１３（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０９）の組み合わせであることができる。
菌株３ＢＰ５（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５１０）；９１８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０８）および１０１３（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０９）は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）から公的に入手可能である。これらの菌株は国際公開第２０１３０２９０１３号パンフレットで教示されている。

別の態様では、本ＤＦＭは、以下のラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）とさらに組み合わされ得る：ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ならびにこれらの組み合わせ。

本ＤＦＭは、以下のラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）とさらに組み合わされ得る：ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバチルス・ビフィダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｅｕｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）およびラクトバチルス・ジェンセニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）ならびにこれらのいずれかの組み合わせ。

さらに別の態様では、本ＤＦＭは、以下のビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｐ：）とさらに組み合わされ得る：ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィジウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）およびビフィドバクテリウム・アングラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｇｕｌａｔｕｍ）ならびにこれらのいずれかの組み合わせ。

以下の種の細菌を言及し得る：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）およびペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、プロピオニバクテリア種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ）ならびにこれらの組み合わせ。

１種または複数種の細菌株を含む、本明細書で説明された直接給与微生物は、同一のタイプ（属、種および菌株）であってもよいし、属、種および／または菌株の混合を含んでもよい。

適切には、本開示に係る組成物は、国際公開第２０１２１１０７７８号パンフレットに開示され且つ以下にまとめられる製品またはこの製品に含まれる微生物のうちの１種または複数種と組み合わされ得る：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株２０８４ アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ−５００１３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＬＳＳＡＯ１ アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０４および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１５Ａ−Ｐ４ ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６５０７（Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）（以前はＡｖｉｃｏｒｒ（登録商標）として知られていた）由来）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株Ｃ３１０２（Ｃａｌｓｐｏｒｉｎ（登録商標）由来）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＰＢ６（Ｃｌｏｓｔａｔ（登録商標）由来）；バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）（８Ｇ−１３４）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＮＣＩＭＢ １０４１５（ＳＦ６８）（Ｃｙｌａｃｔｉｎ（登録商標）由来）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株Ｃ３１０２（Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）＆ＧａｌｌｉｐｒｏＭａｘ（登録商標）由来）；バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）Ｔｅｃｔ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属（Ｐｏｕｌｔｒｙ ｓｔａｒ（登録商標）由来）；ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属および／またはエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属Ｐｒｏｔｅｘｉｎ（登録商標）由来）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ ７１３（Ｐｒｏｆｌｏｒａ（登録商標）由来）；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＣＥＣＴ−５９４０（Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）＆Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ由来）；エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＳＦ６８（Ｆｏｒｔｉｆｌｏｒａ（登録商標）由来）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＢｉｏＰｌｕｓ２Ｂ（登録商標）由来）；乳酸菌７エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（Ｌａｃｔｉｆｅｒｍ（登録商標）由来）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株（ＣＳＩ（登録商標）由来）；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｙｅａ−Ｓａｃｃ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｂｉｏｍｉｎ ＩＭＢ５２（登録商標）由来）；ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム・アニマリス種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、（Ｂｉｏｍｉｎ Ｃ５（登録商標）由来）；ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）（Ｂｉａｃｔｏｎ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（Ｏｒａｌｉｎ Ｅ１７０７（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（２種の菌株）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＤＳＭ １１０３（Ｐｒｏｂｉｏｓ−ｐｉｏｎｅｅｒ ＰＤＦＭ（登録商標）由来）；ラクトバチルス・ラムノサス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）およびラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）（Ｓｏｒｂｉｆｌｏｒｅ（登録商標）由来）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ａｎｉｍａｖｉｔ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（Ｂｏｎｖｉｔａｌ（登録商標）由来）；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｌｅｖｕｃｅｌｌ ＳＢ ２０（登録商標）由来）；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｌｅｖｕｃｅｌｌ ＳＣ ０＆ＳＣ１０（登録商標）ＭＥ由来）；
ペディオコッカス・アシディラクティ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉ）（Ｂａｃｔｏｃｅｌｌ由来）；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡｃｔｉＳａｆ（登録商標）（以前はＢｉｏＳａｆ（登録商標）由来））；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＣＹＣ Ｓｃ４７（Ａｃｔｉｓａｆ（登録商標）ＳＣ４７由来）；クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（Ｍｉｙａ−Ｇｏｌｄ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（Ｆｅｃｉｎｏｒ ａｎｄ Ｆｅｃｉｎｏｒ Ｐｌｕｓ（登録商標）由来）；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＣＹＣ Ｒ−６２５（ＩｎｔｅＳｗｉｎｅ（登録商標）由来）；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（Ｐｒｏｖｉｔａ（登録商標）由来）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＰｅｐＳｏｙＧｅｎ−Ｃ（登録商標）由来）；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（Ｔｏｙｏｃｅｒｉｎ（登録商標）由来）；バチルス・セレウス変種トヨイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｖａｒ．ｔｏｙｏｉ）ＮＣＩＭＢ ４０１１２／ＣＮＣＭ Ｉ−１０１２（ＴＯＹＯＣＥＲＩＮ（登録商標）由来）または他のＤＦＭ、例えばバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＢｉｏＰｌｕｓ（登録商標）ＹＣ由来）ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧａｌｌｉＰｒｏ（登録商標）由来）。

本ＤＦＭを、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから市販されているＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）と組み合わせることができる。Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株２０８４アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ−５００１３、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株ＬＳＳＡＯ１アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０４およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株１５Ａ−Ｐ４ ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６５０７の組み合わせである（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７５４，４６９Ｂ号明細書で教示されている）。

本明細書で説明されたＤＦＭをサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）属の酵母と組み合わせることもできる。

好ましくは、本明細書で説明されたＤＦＭは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）微生物（好ましくはＧＲＡＳ承認されている微生物）を含む。

当業者は、食品産業および／または農産業で使用され且つ動物による消費に適していると一般に考えられている、本明細書で説明された属内の微生物の特定の種および／または菌株を容易に気付くだろう。

有利には、製品が飼料または飼料添加用組成物である場合、本ＤＦＭは、飼料または飼料添加用組成物が小売り業者による販売のために提供される製品の通常の「販売」期限または「有効」期限まで有効のままでなければならない。所望の時間の長さおよび通常の貯蔵寿命は飼料原料によって様々であり、当業者は、貯蔵寿命の時間は飼料原料の種類、飼料原料のサイズ、貯蔵温度、加工条件、包装材料および包装装置によって異なることを認識するだろう。

一部の実施形態では、本ＤＦＭが熱に耐性があることが重要であり、即ち耐熱性であることが重要である。このことは特に、飼料がペレット化される場合である。従って、別の実施形態では、このＤＦＭは、例えばバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）を含む耐熱性細菌等の耐熱性微生物であることができる。

他の態様では、本ＤＦＭが桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）（例えばバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．））等の胞子生成細菌を含むことが望ましい場合がある。桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）は、増殖条件が不都合であり且つ熱、ｐＨ、湿度および殺菌剤に対して非常に耐性である場合に安定した内生胞子を形成することができる。

本明細書で説明されたＤＦＭは、病原性微生物（例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）および／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および／またはサルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）および／またはカンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．））の腸内確立を低減し得る、または予防し得る。換言すると、このＤＦＭは抗病原性であることができる。用語「抗病原性」は、本明細書で使用される場合、ＤＦＭが病原体の効果（負の効果）に対抗することを意味する。

上述したように、本ＤＦＭは任意の好適なＤＦＭであることができる。例えば、以下のアッセイ「ＤＦＭアッセイ」を使用して、微生物のＤＦＭへの適合性を決定することができる。本明細書で使用されるＤＦＭアッセイは、米国特許出願公開第２００９／０２８００９０号明細書でより詳細に説明されている。疑義を避けるために、本明細書で教示される「ＤＦＭアッセイ」に従って阻害株（または抗病原性ＤＦＭ）として選択されるＤＦＭは、本開示に従った使用に好適なＤＦＭであり、即ち本開示に係る飼料添加用組成物での使用に好適なＤＦＭである。

チューブに、代表的なクラスター由来の代表的な病原体（例えば細菌）をそれぞれ播種した。

この播種したチューブに、好気的にまたは嫌気的に増殖させた潜在的ＤＦＭの上清を添加し（但し、コントロールの場合にはチューブに上清を添加しない）、インキュベートする。インキュベーション後、コントロールおよび上清処理済のチューブの光学密度（ＯＤ）を各病原体に関して測定した。

次いで、コントロール（上清を少しも含まない）と比較して低いＯＤを生じる（潜在的ＤＦＭ）菌株のコロニーを、阻害性株（または抗病原性ＤＦＭ）として分類することができる。例えば、本明細書で使用されるＤＦＭアッセイは、米国特許出願公開第２００９／０２８００９０号明細書でより詳細に説明されている。

好ましくは、このＤＦＭアッセイで使用される代表的な病原体は、以下のうちの１つ（または複数）であり得る：クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、例えばクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）および／もしくはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ならびに／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ならびに／またはサルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）ならびに／またはカンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）。好ましい一実施形態では、このアッセイを、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のうちの１つまたは複数で実行し、好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）で実行し、より好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）で実行する。

抗病原性ＤＦＭとして、以下の細菌のうちの１つまたは複数が挙げられ、国際公開第２０１３０２９０１３号パンフレットで説明されている：
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株３ＢＰ５アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０５１０、
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株９１８ ＡＴＣＣアクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０８および
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１０１３ ＡＴＣＣアクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０９。

ＤＦＭは培養物および担体（使用される場合）として調製され得、リボンミキサーまたはパドルミキサーに加えて約１５分にわたり混合され得るが、このタイミングは増減され得る。培養物および担体の均一な混合物が生じるように成分をブレンドする。好ましくは、最終製品は乾燥した流動性粉末である。次いで、１種または複数種の細菌株を含むＤＦＭを（好ましくは、本明細書で説明された酵素と同時に）、動物飼料もしくは飼料プレミックスに添加する、動物用の水に添加する、または当分野で既知の他の方法で投与する。

ＤＦＭ混合物中での個々の菌株の包含は１％〜９９％の割合であり得、好ましくは２５％〜７５％の割合であり得る。

動物飼料でのＤＦＭの好適な投与量は、約１×１０^３ＣＦＵ／飼料１ｇ〜約１×１０^１０ＣＦＵ／飼料１ｇの範囲であり得、好適には約１×１０^４ＣＦＵ／飼料１ｇ〜約１×１０^８ＣＦＵ／飼料１ｇの範囲であり得、好適には約７．５×１０^４ＣＦＵ／飼料１ｇ〜約１×１０^７ＣＦＵ／飼料１ｇの範囲であり得る。

別の態様において、飼料原料では、本ＤＦＭを、約１×１０^３ＣＦＵ／飼料１ｇを超えて投与し得、好適には約１×１０^４ＣＦＵ／飼料１ｇを超えて投与し得、好適には約５×１０^４ＣＦＵ／飼料１ｇを超えて投与し得、好適には約１×１０^５ＣＦＵ／飼料１ｇを超えて投与し得る。

飼料添加用組成物では、本ＤＦＭを約１×１０^３ＣＦＵ／組成物１ｇ〜約１×１０^１３ＣＦＵ／組成物１ｇで投与し得、好ましくは１×１０^５ＣＦＵ／組成物１ｇ〜約１×１０^１３ＣＦＵ／組成物１ｇで投与し得、より好ましくは約１×１０^６ＣＦＵ／組成物１ｇ〜約１×１０^１２ＣＦＵ／組成物１ｇで投与し得、最も好ましくは約３．７５×１０^７ＣＦＵ／組成物１ｇ〜約１×１０^１１ＣＦＵ／組成物１ｇで投与し得る。別の態様において、飼料添加用組成物では、本ＤＦＭを約１×１０^５ＣＦＵ／組成物１ｇを超えて投与し得、好ましくは約１×１０^６ＣＦＵ／組成物１ｇを超えて投与し得、最も好ましくは約３．７５×１０^７ＣＦＵ／組成物１ｇを超えて投与し得る。一実施形態において、飼料添加用組成物では、本ＤＦＭを約２×１０^５ＣＦＵ／組成物１ｇを超えて投与し、好適には約２×１０^６ＣＦＵ／組成物１ｇを超えて投与し、好適には約３．７５×１０^７ＣＦＵ／組成物１ｇを超えて投与する。

本明細書で説明された飼料添加用組成物は、１種または複数種の細菌株を含むＤＦＭと少なくとも１種のプロテアーゼとから本質的になる。このプロテアーゼは、サブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）またはバシロリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２８）またはアルカリ性セリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．ｘ）またはケラチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．ｘ．ｘ）であることができる。好ましいプロテアーゼはサブチリシンである。このプロテアーゼは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来であり得る、またはこのプロテアーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから入手可能なノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属プロテアーゼであり得る。

他の好適なプロテアーゼとして、動物起源、植物起源または微生物起源のものが挙げられる。化学的に改変されたまたはタンパク質操作された変異プロテアーゼも使用することができる。このプロテアーゼはセリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼであり得、例えばアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例はサブチリシンであり、特にバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）に由来するものであり、例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９（例えば、米国特許第６，２８７，８４１号明細書を参照されたい）、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８（例えば国際公開第８９／０６２７９号パンフレットを参照されたい）である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン（例えばブタ起源またはウシ起源）およびフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属プロテアーゼ（例えば、国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５８３号パンフレットを参照されたい）である。有用なプロテアーゼの例として、国際公開第９２／１９７２９号パンフレットおよび国際公開第９８／２０１１５号パンフレットで説明された変異体も挙げられるがこれに限定されない。

以下の商品のうちの１つまたは複数の中のプロテアーゼのうちの１種または複数種を、本明細書で説明された３種の菌株の直接給与微生物と組み合わせて使用することができる。

好ましくは、本プロテアーゼは、飼料原料中に約１０００ＰＵ／ｋｇ〜約２００，０００ＰＵ／飼料１ｋｇの範囲で存在し、より好ましくは約１５００ＰＵ／飼料１ｋｇ〜約１０００００ＰＵ／飼料１ｋｇの範囲で存在し、より好ましくは約２０００ＰＵ／飼料１ｋｇ〜約６００００ＰＵ／飼料１ｋｇの範囲で存在する。より具体的には、このプロテアーゼは、約１０００ＰＵ／飼料１ｋｇを超えて、または約１５００ＰＵ／飼料１ｋｇを超えて、または約２０００ＰＵ／飼料１ｋｇを超えて飼料原料中に存在する。別の態様では、このプロテアーゼは、約２００，０００ＰＵ／飼料１ｋｇ未満で、または約１０００００ＰＵ／飼料１ｋｇ未満で、または約７００００ＰＵ／飼料１ｋｇ未満で、または約６００００ＰＵ／飼料１ｋｇ未満で飼料原料中に存在する。

本プロテアーゼは、飼料添加用組成物中に約２００ＰＵ／ｇ〜約４００，０００ＰＵ／組成物１ｇの範囲で存在し得、より好ましくは約３００ＰＵ／組成物１ｇ〜約２００，０００ＰＵ／組成物１ｇの範囲で存在し得、さらにより好ましくは約５０００ＰＵ／組成物１ｇ〜約１００，０００ＰＵ／組成物１ｇの範囲で存在し得、さらにより好ましくは約７００ＰＵ／組成物１ｇ〜約７０，０００ＰＵ／組成物１ｇの範囲で存在し得、さらにより好ましくは約１０００ＰＵ／組成物１ｇ〜約６０，０００ＰＵ／組成物１ｇの範囲で存在し得る。

別の態様では、本プロテアーゼは、約２００ＰＵ／組成物１ｇを超えて、または約３００ＰＵ／組成物１ｇを超えて、または約４００ＰＵ／組成物１ｇを超えて、または約５００ＰＵ／組成物１ｇを超えて、または約７５０ＰＵ／組成物１ｇを超えて、または約１０００ＰＵ／組成物１ｇを超えて飼料添加用組成物中に存在する。

さらに別の態様では、本プロテアーゼは、約４００，０００ＰＵ／組成物１ｇ未満で、または約２００，０００ＰＵ／組成物１ｇ未満で、または約１００，０００ＰＵ／組成物１ｇ未満で、または約８０，０００ＰＵ／組成物１ｇ未満で、または約７００００ＰＵ／組成物１ｇ未満で、または約６００００ＰＵ／組成物１ｇ未満で飼料添加用組成物中に存在する。

１プロテアーゼ単位（ＰＵ）は、約５０℃でｐＨ１０．０にて１分当たりにカゼイン基質からフェノール性化合物（チロシン当量として表されれる）２．３マイクログラムを遊離させる酵素の量であることが理解されるだろう。これを、１ＰＵを決定するためのアッセイと称することができる。

理論に束縛されることを望まないが、プロテアーゼは食物タンパク質の非特異的加水分解を引き起こし、腸管腔中で様々なポリペプチドが生じる。動物はタンパク質加水分解を終了させ、そのようなアミノ酸を吸収する。しかしながら、腸内病原性チャレンジの場合、病原性細菌は、空腸および回腸の管腔中でのより高いペプチド利用可能性を利用する場合がある。ＤＦＭは、例えばＮ個の供給源と競合することによりおよび直接的な阻害により、腸内病原体の増殖を阻害する。

有利には、１種または複数種の細菌（ｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ）を含むＤＦＭと本明細書で教示した少なくとも１種のプロテアーゼとの特定の組み合わせにより、ムチン分泌を低減することができる。この低減されたムチン分泌は内因性のアミノ酸損失の低減をもたらし得るおよび／または改善された能力の原因となり得ると考えられる。

有利には、１種または複数種の細菌（ｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ）を含むＤＦＭと本明細書で教示した少なくとも１種のプロテアーゼとの特定の組み合わせにより、回腸中の炎症を低減することができる。これは、回腸中でのインターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）の発現の下方制御により見られ得る。

本明細書で説明された飼料添加用組成物を、直接給与微生物（ＤＦＭ）として動物に給与することができる。このＤＦＭに、１種または複数種の担体または他の成分を添加することができる。このＤＦＭは様々な物理的形態で存在し得、例えば、トップドレス（ｔｏｐ ｄｒｅｓｓ）として、液体水薬（ｌｉｑｕｉｄ ｄｒｅｎｃｈ）として使用するためのまたは乳代替物、ゼラチンカプセルまたはゲルに添加する水溶性濃縮物として存在し得る。トップドレス形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を担体（例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、石灰石（炭酸カルシウム）、籾殻、酵母培養物、乾燥デンプンおよび／または珪アルミン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｉｌｉｃｏ ａｌｕｍｉｎａｔｅ））に添加する。液体水薬用のまたは乳代替物栄養補助剤用の水溶性濃縮物の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を水溶性担体（例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、デキストロース、乾燥デンプン、珪アルミン酸ナトリウム）に添加し、液体を添加して液体水薬を形成する、またはこの栄養補助剤を乳もしくは乳代替物に添加する。ゼラチンカプセル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を担体（例えば、乳清、マルトデキストリン、糖、石灰石（炭酸カルシウム）、籾殻、酵母培養物乾燥デンプンおよび／または珪アルミン酸ナトリウム）に添加する。一実施形態では、細菌および担体を分解性ゼラチンカプセルに封入する。ゲル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を担体（例えば、植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキンおよび／または人工着色料）に添加してゲルを形成する。

本ＤＦＭを添加剤の乾燥製剤と任意選択で混合させることができ、この添加剤として、増殖基質、酵素、糖、炭水化物、抽出物および増殖促進微量成分が挙げられるがこれらに限定されない。この糖として、ラクトース、マルトース、ブドウ糖、マルトデキストリン、グルコース、フルクトース、マンノース、タガトース、ソルボース、ラフィノースおよびガラクトースを挙げることができる。これらの糖は、個々にまたは組み合わせて５０〜９５％の範囲である。この抽出物は、５〜５０％の範囲で酵母または乾燥酵母発酵可容物を含むことができる。この増殖基質として、トリプチケース（５〜２５％の範囲）、乳酸ナトリウム（５〜３０％の範囲）およびＴｗｅｅｎ８０（１〜５％の範囲）を挙げることができる。この炭水化物として、マニトール、ソルビトール、アドニトールおよびアラビトールを挙げることができる。これらの炭水化物は、個々にまたは組み合わせて５〜５０％の範囲である。この微量成分として、炭酸カルシウム（０．５〜５．０％の範囲）、塩化カルシウム（０．５〜５．０％の範囲）、リン酸二カリウム（０．５〜５．０％の範囲）、リン酸カルシウム（０．５〜５．０％の範囲）、マンガンタンパク化合物（０．２５〜１．００％の範囲）およびマンガン（０．２５〜１．０％の範囲）を挙げることができる。

１種または複数種の細菌株を含むＤＦＭと少なくとも１種のプロテアーゼとを、製剤が、生存ＤＦＭおよび少なくとも１種の活性なプロテアーゼを含むことを確実にする任意の適切な方法で製剤化することができる。一実施形態では、１種または複数種の細菌株を含むＤＦＭと少なくとも１種のプロテアーゼとを、液体、乾燥粉末または顆粒として製剤化することができる。

乾燥粉末または顆粒を、当業者に既知の手段（例えば、トップスプレー流動床コーター、バトムスプレーウースター（ｂｕｔｔｏｍ ｓｐｒａｙ Ｗｕｒｓｔｅｒ）、またはドラム造粒（例えば高剪断造粒）、押し出し、パンコーティング、または微量成分ミキサー）により調製することができる。

一部の実施形態の場合、本ＤＦＭおよび／または少なくとも１種のプロテアーゼをコーティングすることができ、例えばカプセル封入することができる。好適には、このＤＦＭおよび少なくとも１種のプロテアーゼを、同一のコーティング内で配合することができる、または同一のカプセルでカプセル封入することができる。あるいは、酵素のうちの１種または２種または３種または４種を同一のコーティング内で配合することができ、または同一のカプセルでカプセル封入することができ、このＤＦＭを、酵素のうちの１種または複数種または全てとは別にコーティング中に配合することができる。

例えば本ＤＦＭが内生胞子を生成することができる一部の実施形態では、このＤＦＭを、全くコーティングすることなく提供することができる。そのような状況下では、ＤＦＭ内生胞子を少なくとも１種のプロテアーゼと単に混合することができる。後者の場合では、少なくとも１種のプロテアーゼをコーティングすることができ、例えばカプセル化することができる。

１つの実施形態では、コーティングは酵素（例えば、少なくとも１種のプロテアーゼ）を熱から防護し、熱防護材であると見なすことができる。

別の態様において、飼料添加用組成物は、国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット（ＴＰＴ顆粒と呼ばれる）もしくは同第１９９７／０１６０７６号パンフレットもしくは同第１９９２／０１２６４５号パンフレットに記載された乾燥粉末もしくは顆粒に調製される（それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。

飼料添加用組成物は、次いで飼料に添加される顆粒に調製することができ、その顆粒は、コア；活性物質；および少なくとも１つのコーティングを含み、その顆粒の活性物質は、ａ）飼料ペレット化プロセス、ｂ）蒸気加熱飼料前処理プロセス、ｃ）貯蔵、ｄ）非ペレット化混合物中の成分としての貯蔵、およびｅ）微量ミネラル、有機酸、還元糖、ビタミン類、塩化コリン、および酸性もしくは塩基性飼料基剤ミックスもしくは飼料プレミックスを結果として生じさせる化合物から選択される少なくとも１つの化合物を含む飼料基剤ミックスもしくは飼料プレミックス中の成分としての貯蔵の１つ以上から選択された条件後に少なくとも５０％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも８０％の活性を維持している。

顆粒に関して、少なくとも１種のコーティングは、少なくとも５５重量／重量％の顆粒を構成する水分水和材料を含むことができる；および／または少なくとも１種のコーティングは２種のコーティングを含むことができる。これら２種のコーティングは、水分水和コーティングおよび水分障壁コーティングであってよい。一部の実施形態では、水分水和コーティングは、顆粒の２５重量／重量％〜６０重量／重量％であってよく、水分障壁コーティングは顆粒の２重量／重量％〜１５重量／重量％であってよい。水分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプンおよびマルトデキストリンから選択されてよく、水分障壁コーティングは、ポリマー、ガム、ホエイおよびデンプンから選択されてよい。

本飼料添加用組成物を含む飼料は、飼料ペレット化プロセスを使用して生成することができ、飼料前処理プロセスは、７０℃〜９５℃で少なくとも３０秒〜数分にわたり８５℃〜９５℃の温度で実施されてよい。

本飼料添加用組成物を含む飼料を、約３０秒〜数分の範囲にわたり８５℃〜９５℃で実施し得る蒸気加熱ペレット化プロセスを使用して製造することができる。

一部の実施形態では、本ＤＦＭ（例えばＤＦＭ内生胞子）を、希釈剤（例えば、デンプン粉末、石灰石等）を使用して希釈することができる。

１つの実施形態では、本組成物は、好ましくは消費のために好適な液体調製物中に含まれ、そのような液体消費は次の：バッファー、塩、ソルビトールおよび／またはグリセロールの１つ以上を含有する。

別の実施形態では、飼料添加用組成物は、例えば粉砕コムギなどの担体基質上に酵素をスプレーする工程などの適用する工程によって調製することができる。

１つの実施形態では、飼料添加用組成物は、プレミックスとして調製することができる。一例として、プレミックスだけが例えば１種以上のミネラル類および／または１種以上のビタミン類などの１種以上の飼料成分を含むことができる。

別の実施形態では、１種もしくは複数種の細菌株を含むＤＦＭおよび／または少なくとも１つのプロテアーゼは、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギもしくはコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ_２ＳＯ_４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビエート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩およびそれらの混合物から選択される少なくとも１種の生理学上許容される担体を用いて処方され得る。

一実施形態では、本飼料添加用組成物および／またはプレミックスおよび／または飼料もしくは飼料原料を包装する。

好ましい一実施形態では、本飼料添加用組成物および／またはプレミックスおよび／または飼料もしくは飼料原料を袋（例えば紙袋）で包装する。

代替実施形態では、本飼料添加用組成物および／またはプレミックスおよび／または飼料もしくは飼料原料を容器に密封することができる。あらゆる好適な容器を使用することができる。

本明細書で説明された飼料添加用組成物を、飼料としてまたは飼料の調製時に使用することができる。

用語「飼料」は用語「飼料原料」と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「飼料原料」は、１種または複数種の飼料添加用組成物が添加されている飼料材料を指す。

飼料は、用途および／または適用様式および／または投与様式に応じて、溶液の形態または固体であることができる。

飼料として使用される場合、または飼料（例えば機能的飼料）の調製で使用される場合、本明細書で説明された飼料添加用組成物を、以下のうちの１つまたは複数と共に使用し得る：栄養上許容される担体、栄養上許容される希釈剤、栄養上許容される賦形剤、栄養上許容されるアジュバント、栄養的に有効な成分。

好ましい実施形態では、本飼料添加用組成物を飼料成分と混合して飼料原料を形成することができる。

用語「飼料成分」は、本明細書で使用される場合、飼料原料の全体または一部を意味する。飼料原料の一部は、この飼料原料の１種の成分またはこの飼料原料の複数種（例えば２種もしくは３種もしくは４種）の成分を意味することができる。一実施形態では、用語「飼料成分」はプレミックスまたはプレミックス成分を包含する。

好ましくは、飼料は家畜飼料またはそのプレミックス、配合飼料またはそのプレミックスであることができる。一実施形態では、本飼料添加用組成物を、配合飼料、配合飼料成分と混合してもよいし、配合飼料のプレミックスに混合してもよいし、家畜飼料、家畜飼料成分または家畜飼料のプレミックスに混合してもよい。

用語家畜飼料は、本明細書で使用される場合、（動物が自身で探しまわる必要なくむしろ）動物に提供されるあらゆる飼料を意味する。家畜飼料は、刈り取られた植物を包含する。

用語家畜飼料は、干し草、わら、サイレージ、圧縮されたおよびペレット化された飼料、油および混合食料を含み、発芽穀物およびマメ類も含む。

家畜飼料を、以下から選択される植物のうちの１つまたは複数から得ることができる：アルファルファ（ルーサン）、オオムギ、ミヤコグサ、アブラナ、キャベツ（Ｃｈａｕ ｍｏｅｌｌｉｅｒ）、ケール、ナタネ（カノーラ）、ルタバガ（スウェーデンカブ）、チューリップ、クローバー、タチクローバー、レッドクローバー、地下クローバー、シロツメクサ、イネ科草本、偽エンバク（ｆａｌｓｅ ｏａｔ ｇｒａｓｓ）、ウシノケグサ、ギョウギシバ、スズメノチャヒキ、ヒースグラス（ｈｅａｔｈ ｇｒａｓｓ）、牧草（自然と混ざった牧草地、草地に由来する、カモガヤ、ドクムギ、チモシー牧草、コーン（トウモロコシ）、キビ、カラスムギ、ソルガム、大豆、樹木（まぐさ（ｔｒｅｅ−ｈａｙ）用に刈り込まれた樹木の若枝）、コムギおよびマメ類。

用語「配合飼料」は、ミール、ペレット、ナッツ、ケーキまたはクランブルの形態の市販の飼料を意味する。配合飼料を様々な原材料および添加剤からブレンドすることができる。このブレンドは、標的動物の規定の要件に従って配合される。

配合飼料は、１日に必要な栄養素を全て提供する完全飼料、食料の一部（タンパク質、エネルギー）を提供する濃縮物、または追加の微量栄養素（例えばミネラルおよびビタミン）のみを提供する栄養補助剤であることができる。

配合飼料で使用される主成分は飼料用穀物であり、この飼料用穀物として、コーン、大豆、ソルガム、カラスムギおよびオオムギが挙げられる。

好適には、本明細書で言及したプレミックスは、微量成分（例えば、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵産物および他の必須成分）で構成される組成物であることができる。プレミックスは通常、市販の食料にブレンドするのに好適な組成物である。

本明細書で説明したあらやる飼料原料は、以下を含む群から選択される１種または複数種の飼料材料を含み得る：ａ）穀物類、例えば、小穀類（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギおよびそれらの組み合わせ）ならびに／または大穀類、例えばトウモロコシもしくはソルガム；ｂ）穀物類からの副生成物、例えば、コーングルテンミール、可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）、ふすま、コムギミドリングス（ｗｈｅａｔ ｍｉｄｄｌｉｎｇｓ）、コムギショーツ、米ヌカ、籾殻、カラスムギ殻、パーム核および柑橘パルプ；ｃ）例えば大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、綿、カノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク、ホエイ、コプラ、ゴマ等の起源から得られるタンパク質；ｄ）植物源および動物源から得られる油脂；ｅ）ミネラルおよびビタミン。

さらに、そのような飼料原料は、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％または少なくとも６０重量％のコーンおよび大豆ミールまたはコーンおよび高脂肪大豆またはコムギミールもしくはヒマワリミールを含むことができる。これに加えて、またはこれに代えて、飼料原料は、高繊維飼料原料を提供するために、少なくとも１種の高繊維飼料材料および／または少なくとも１種の高繊維飼料材料の少なくとも１種の副生成物を含むことができる。高繊維飼料材料の例として、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、穀粒類からの副生成物、例えばコーングルテンミール、可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）、フスマ、コムギミドリングス、コムギショーツ、米ヌカ、籾殻、カラスムギ殻、パーム核および柑橘類パルプが挙げられる。一部のタンパク質源を高繊維（ヒマワリ、ルーピン、ソラマメおよび綿等の起源から得られるタンパク質）とみなすこともできる。

本明細書で説明されているように、飼料は以下のうちの１つまたは複数であり得る：配合飼料およびプレミックス、例えばペレット、ナッツもしくは（ウシ用）ケーキ；作物または作物残渣：コーン、大豆、ソルガム、カラスムギ、オオムギ、コーンわら、コプラ、ムギワラ、籾殻、サトウダイコン廃棄物；魚粉；刈り取ったばかりのイネ科草本および他の飼料植物；肉骨粉ミール；糖蜜；油かすおよび圧搾ケーキ；オリゴ糖；保存飼料植物：干し草およびサイレージ；海草；全粒または粉砕、製粉等により調製された種子および穀物；発芽穀物およびマメ類；酵母抽出物。

用語飼料は、本明細書で使用される場合、一部の実施形態ではペットフードも包含する。ペットフードは、ペットによる消費が意図されている植物材料または動物材料であり、例えばドッグフードまたはキャットフードである。ペットフード（例えばドッグフードおよびキャットフード）は、乾燥形態（例えば犬用粗挽き穀物）であってもよいし、ウェットタイプの缶詰形態であってもよい。キャットフードは、アミノ酸タウリンを含むことができる。

用語飼料はまた、一部の実施形態では魚餌も包含することができる。魚餌は通常、飼育魚の健康を良好に保つために必要とされる多量栄養素、微量元素およびビタミンを含む。魚餌は、フレークの形態であってもよいし、ペレットの形態であってもよいし、錠剤の形態であってもよい。一部が急速に沈降するペレット化形態は、大型魚または底で餌を取る種に使用されることが多い。一部の魚餌は、観賞魚の発色を人工的に増強するために添加剤（例えばベータカロテンまたは性ホルモン）も含む。

また、用語「飼料」に包含されるのは鳥の餌であり、この鳥の餌には、バードフィーダーで使用される餌およびペットの鳥に給餌するために使用される餌の両方が含まれる。典型的には、鳥の餌は様々な種子を含むが、スエット（牛脂もしくは羊脂）も包含することができる。

本明細書で使用される場合、「接触した」は、本飼料添加用組成物の製品（例えば飼料）への間接的なまたは直接的な適用を意味する。使用され得る適用方法の例として以下が挙げられるがこれらに限定されない：この飼料添加用組成物を含む材料で製品を処理すること、この飼料添加用組成物と製品とを混合することによる直接適用、この飼料添加用組成物を製品表面上に噴霧すること、またはこの飼料添加用組成物の調製物中に製品を浸漬すること。

本飼料添加用組成物を好ましくは製品（例えば飼料原料）と混合する。あるいは、この飼料添加用組成物を、飼料原料のエマルジョンまたは生成分に含めることができる。

一部の用途では、本組成物が、影響を受ける／処理される製品の表面上でまたは表面に利用可能にされることが重要である。これにより、この組成物は、以下の有利な特徴のうちの１つまたは複数を付与することが可能になる：能力利益。

本飼料添加用組成物を適用して、制御された量のＤＦＭおよび酵素を製品（例えば飼料原料または飼料原料の生成分）に散在させ得る、このＤＦＭおよび酵素で製品を被覆し得る、および／またはこのＤＦＭおよび酵素を製品に含浸させ得る。

少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭと少なくとも１種のプロテアーゼとを、同時に使用してもよいし（例えば、これらが一緒に混合される場合、またはこれらが異なる経路で送達される場合でも）、連続的に使用してもよい（例えば、これらが異なる経路により送達され得る）。一実施形態では、好ましくは、このＤＦＭおよび酵素を同時に適用する。好ましくは、少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭと少なくとも１種のプロテアーゼとを、飼料原料に送達する前に混合する、または飼料原料の生成分に混合する。

少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭと少なくとも１種のプロテアーゼとを好適な濃度で添加し得、例えば、約２×１０^３ＣＦＵ／飼料１ｇ〜約２×１０^１１ＣＦＵ／飼料１ｇの１日用量を提供し、好適には約２×１０^６〜約１×１０^１０の１日用量を提供し、好適には約３．７５×１０^７ＣＦＵ／飼料１ｇ〜約１×１０^１０ＣＦＵ／飼料１ｇの１日用量を提供する最終飼料製品中の濃度で添加し得る。

好ましくは、本飼料添加用組成物は最大約７０℃、最大約８５℃または最大約９５℃の熱処理に対して熱的に安定である。この熱処理を約３０秒〜数分まで実施することができる。用語熱的に安定は、特定の温度までの加熱前に添加剤中に存在した／添加剤中で活性であった酵素化合物および／またはＤＦＭの少なくとも約５０％が、室温まで冷却した後に依然として存在する／活性であることを意味する。特に好ましい実施形態では、この飼料添加用組成物を均質化して粉末を生成する。

あるいは、本飼料添加用組成物は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号パフレットで説明された顆粒（ＴＰＴ顆粒と称される）に製剤化される。

別の好ましい実施形態では、本飼料添加用組成物が顆粒に製剤化される場合、この顆粒は、タンパク質コアの全体を覆う水和障壁塩を含む。そのような塩コーティングの利点は、熱耐性の改善、貯蔵安定性の改善、ならびに少なくとも１種のプロテアーゼおよび／または１種もしくは複数種の細菌株を含むＤＦＭへの有害効果を有する他の飼料用添加剤からの保護である。好ましくは、この塩コーティングに使用される塩は、０．２５超の水分活性または２０℃で６０％超の恒湿を有する。好ましくは、この塩コーティングはＮａ_２ＳＯ_４を含む。

本飼料添加用組成物を含む飼料を、飼料ペレット化プロセスを使用して生成することができる。任意選択的に、このペレット化工程は、ペレットの形成前に蒸気処理またはコンディショニング段階を含むことができる。粉末を含む混合物を、コンディショナー（例えば蒸気噴射装置を備えるミキサー）内に配置することができる。この混合物をコンディショナー内で規定温度（例えば６０〜１００℃、典型的な温度は７０℃、８０℃、８５℃、９０℃または９５℃であろう）まで加熱する。滞留時間は、秒単位から分単位、および時間単位さえで変動する可能性がある。例えば、５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間および１時間。

本明細書で開示された飼料添加用組成物は、あらゆる適切な飼料材料への添加に好適であることが理解されるだろう。

本明細書で使用される場合、用語飼料材料は、動物により消費される基本的な飼料材料を指す。この飼料材料は、例えば少なくとも１種または複数種の未処理の穀物および／または処理済みの植物材料および／または動物材料（例えば大豆ミールもしくは骨粉）を含み得ることがさらに理解されるだろう。

当業者は、異なる動物は異なる飼料原料を必要とすること、および同じ動物であっても、その動物の飼育目的に応じて異なる飼料原料を必要とする可能性があることを理解するだろう。

好ましくは、飼料原料は、トウモロコシもしくはコーン、コムギ、オオムギ、ライコムギ、ライムギ、コメ、タピオカ、ソルガムおよび／または副産物のいずれか、ならびに大豆ミール（ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｎ）、ナタネミール、カノーラミール、綿実ミール、ヒマワリ種子ミール（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｍｅａｎ）、動物性副産物ミール（ａｎｉｍａｌ−ｂｙ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｍｅａｌ）のようなタンパク質リッチ成分、ならびにこれらの混合物を含む飼料材料を含むことができる。より好ましくは、飼料原料は動物油脂および／または植物油を含むことができる。

任意選択的に、飼料原料はまた、追加のミネラル（例えばカルシウム）および／または追加のビタミンも含むことができる。好ましくは、飼料原料は、コーン大豆ミールミックスである。

別の態様では、飼料原料を製造する方法が提供される。飼料原料を概して、原材料を最初に好適な粒経に粉砕し、次いで適切な添加物と混合する飼料粉砕機中で製造する。次いで、飼料原料をマッシュまたはペレットとして製造し得、後者は概して、温度を標的レベルまで上昇させ、次いで飼料をダイに通して特定のサイズのペレットを製造する方法を含む。このペレットを冷却する。続いて、脂肪および酵素等の液体添加剤を添加することができる。飼料原料の製造は、特に少なくとも蒸気の使用を含み得る好適な技術によって、ペレット化の前に押出または膨張を含む追加の工程も含むことができる。

飼料原料は、単胃動物、例えば家禽類（例えば、ブロイラー、産卵ニワトリ、ブロイラー種鳥、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、水鳥）、ブタ（全年齢カテゴリー）、ペット（例えばイヌ、ネコ）または魚のための飼料原料であり得る、好ましくは、飼料原料は家禽類用である。

一実施形態では、飼料原料は産卵ニワトリ用ではない。

ほんの一例として、ニワトリ（例えばブロイラーニワトリ）用の飼料原料は、例えば以下の表に示す％齢で、以下の表に列挙する成分のうちの１つまたは複数で構成され得る。

ほんの一例として、ニワトリ（例えばブロイラーニワトリ）用の常用飼料の仕様は、以下の表に記載した通りであることができる。

ほんの一例として、産卵ニワトリ用の飼料原料は、例えば以下の表に示す％齢で、以下の表に列挙する成分のうちの１つまたは複数で構成され得る。

ほんの一例として、産卵ニワトリ用の常用飼料の仕様は、以下の表に記載した通りであることができる。

ほんの一例として、シチメンチョウ用の飼料原料は、例えば以下の表に示す％齢で、以下の表に列挙する成分のうちの１つまたは複数で構成され得る。

ほんの一例として、シチメンチョウ用の常用飼料の仕様は、以下の表に記載した通りであることができる。

ほんの一例として、子ブタ用の飼料原料は、例えば以下の表に示す％齢で、以下の表に列挙する成分のうちの１つまたは複数で構成され得る。

ほんの一例として、子ブタ用の常用飼料の仕様は、以下の表に記載した通りであることができる。

ほんの一例として、育成／仕上げのブタ用の飼料原料は、例えば以下の表に示す％齢で、以下の表に列挙する成分のうちの１つまたは複数で構成され得る。

ほんの一例として、育成／仕上げのブタ用の常用飼料の仕様は、以下の表に記載した通りであることができる。

本明細書で説明された飼料添加用組成物および他の成分ならびに／またはこれらを含む飼料原料を、任意の好適な形態（例えば、固体もしくは液体の調製物またはそれらの代替物）で使用することができる。固体調製物の例として、粉末、ペースト、ボーラス、カプセル、ペレット、錠剤、ダストおよび顆粒（これらは湿潤型、噴霧乾燥型または凍結乾燥型であり得る）が挙げられる。液体調製物の例として、水溶の、有機性のまたは水性有機性の溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられるがこれらに限定されない。

一部の用途では、飼料添加用組成物を、飼料と混合してもよいし、飲用水で投与してもよい。一実施形態では、水に含有される場合の投与量範囲は約１×１０^３ＣＦＵ／動物／日〜約１×１０^１０ＣＦＵ／動物／日であり、より好ましくは約１×１０^７ＣＦＵ／動物／日である。

形態の好適な例として、以下のうちの１つまたは複数が挙げられ：粉末、ペースト、ボーラス、ペレット、錠剤、丸剤、カプセル、腔坐剤（ｏｖｕｌｅ）、溶液または懸濁液、これらは、即時放出性の、遅延放出性の、変更された放出性の、持続放出性の、パルス放出性または制御放出性の適用のために着香剤または着色剤を含むこともできる。

例えば、本明細書で説明した飼料添加用組成物を固体形態で使用する場合、この飼料添加用組成物は、以下のうちの１つまたは複数も含み得る：賦形剤、例えば微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム、およびグリシン；崩壊剤、例えばデンプン（好ましくは、コーンデンプン、ジャガイモデンプンおよびタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定のケイ酸塩複合体；造粒結合剤、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシア；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、およびタルク。

成形での使用に栄養上許容される担体の例として、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよび脂肪酸ジグリセリド、ペトロエトラル脂肪酸エステル（ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

成形に好ましい賦形剤として、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。

水性懸濁液および／またはエリキシル剤の場合には、本飼料添加用組成物を、様々な甘味料または香味料、着色料または色素、乳化剤および／または懸濁剤、ならびに希釈剤（例えば、水、プロピレングリコールおよびグリセリン）、ならびにこれらの組み合わせと組み合わせることができる。

非吸湿性乳清は、ＤＦＭ（特に細菌ＤＦＭ）用の担体として使用されることが多く、増殖を開始させるのに良好な培地である。

細菌ＤＦＭ含有ペーストを、植物油および不活性なゲル化成分と配合することができる。

真菌製品を、担体としての穀類副産物と配合することができる。

一実施形態では、好ましくは、本飼料添加用組成物は、国際公開第２００５／１２３０３４号パンフレットで教示された微粒子系等の微粒子系の形態ではない。

本ＤＦＭおよび／または本飼料添加用組成物を、単回投与用に設計してもよいし、毎日の給与を目的として設計してもよい。

組み合わせ使用する本飼料添加用組成物（およびこの組成物中の各成分）の最適量は、処理する製品、および／または製品と組成物とを接触させる方法、および／または製品の使用目的によって決まる。

本組成物で使用するＤＦＭおよび酵素の量は、有効であるのに且つ前記組成物を含む飼料製品が給与された動物の能力の改善で十分な有効性を維持するのに十分な量でなければならない。この有効時間の長さは、少なくとも製品（例えば、飼料添加用組成物またはこの飼料添加用組成物を含む飼料）の少なくとも利用時間まで延びるである。

本明細書で説明された飼料添加用組成物（またはその成分のうちの１種もしくは複数種）を、動物による消費に適しており且つ消費者に医学的なまたは生理学的な利益を提供することができる別の成分と組み合わせることができる。

一実施形態では、好ましい「別の成分」は、さらなる酵素またはさらなるＤＦＭではない。

この成分はプレバイオティクスであることができる。プレバイオティクスは概して、非消化炭水化物（オリゴ糖もしくは多糖）、または上部消化管中では分解も吸収もされない糖アルコールである。市販品で使用され且つ有用な既知のプレバイオティクスとして、イヌリン（フルクトオリゴ糖、即ちＦＯＳ）およびトランスガラクトオリゴ糖（ＧＯＳまたはＴＯＳ）が挙げられる。好適なプレバイオティクスとして以下が挙げられる：パラチノースオリゴ糖、大豆オリゴ糖、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、非分解性デンプン、ラクトサッカロース、ラクツロース、ラクチトール、マルチトール、マルトデキストリン、ポリデキストロース（即ちＬｉｔｅｓｓｅ（登録商標））、ラクチトール、ラクトスクロース、大豆オリゴ糖、パラチノース、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖およびキシロオリゴ糖、ペクチン断片、食物繊維、マンナンオリゴ糖。

食物繊維として、非デンプン性多糖、例えばアラビノキシラン、セルロース、ならびに多くの他の植物成分、例えば難消化性デキストリン（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｄｅｘｔｒｉｎ）、イヌリン、リグニン、ワックス、キチン、ペクチン、ベータ−グルカンおよびオリゴ糖を挙げることができる。

一実施形態では、本明細書で開示されているのは、本食品添加用組成物（またはその成分のうちの１つもしくは複数）とプレバイオティクとの組み合わせである。このプレバイオティクを、本飼料添加用組成物（またはその成分）と同時に（例えば、一緒の混合物で、もしくは同一もしくは異なる経路により同時に到達される）、または連続的に（例えば同一のもしくは異なる経路による）投与することができる。

この組み合わせの他の成分として、ポリデキストロース、例えばＬｉｔｅｓｓｅ（登録商標）および／またはマルトデキストリンおよび／またはラクチトールが挙げられる。これら他の成分を本飼料添加用組成物に任意選択で添加して、乾燥プロセスを補助することができ且つＤＦＭの生存を助けることができる。

他の好適な成分のさらなる例として、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶調整剤、甘味料（例えば人工甘味料）、レオロジー改質剤、安定化剤、酸化防止剤、色素、酵素、担体、ビヒクル、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、着香剤、着色剤、懸濁剤、崩壊剤、造粒結合剤等。これらの他の成分は天然であることができる。これらの他の成分を、化学的技術および／または酵素的技術の使用により調製することができる。

一実施形態では、少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭおよび／または少なくとも１種のプロテアーゼをカプセル封入することができる。一実施形態では、本飼料添加用組成物および／またはＤＦＭおよび／または酵素を、参照により本明細書に組み込まれる参考文献である国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレットで説明された乾燥粉末または顆粒（ＴＰＴ顆粒と称される）として製剤化する。

好ましい一実施形態では、少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭおよび／または少なくとも１種のプロテアーゼを、１種または複数種の脂質と組み合わせて使用することができる。

例えば、少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭおよび／または少なくとも１種のプロテアーゼを、１種または複数種の脂質ミセルと組み合わせて使用することができる。この脂質ミセルは、単純脂質ミセルであってもよいし、脂質ミセル複合体であってもよい。この脂質ミセルは、両親媒性物質（例えば脂質および／または油）の配向分子の凝集体であることができる。

本明細書で使用される場合、用語「増粘剤またはゲル化剤」は、非混和性液体の液滴、空気または不溶性固体のいずれかである粒子の移動を緩慢にさせることによりまたは防止することにより分離を防止する製品を指す。増粘は、個々の水和分子の粘度が上昇する場合に起こり、分離が緩慢になる。ゲル化は、水和分子が結合して粒子を捕捉する３次元ネットワークが形成される場合に起こり、それにより粒子が固定される。

用語「安定化剤」は、本明細書で使用される場合、製品（例えば飼料製品）が経時変化するのを防ぐ成分または成分の組み合わせとして定義される。

用語「乳化剤」は、本明細書で使用される場合、エマルジョンの分離を防止する成分（例えば飼料成分）を指す。エマルジョンは２種の非混和性物質であり、一方が液滴形態で存在して他方に含有される。エマルジョンは、水中油型（液滴もしくは分散相は油であり、連続相は水である）または油中水型（水が分散相になり、連続相は油である）からなり得る。液体中空気である発泡体および液体中固体である懸濁液も、乳化剤の使用により安定化させることができる。

本明細書で使用される場合、用語「結合剤」は、物理的なまたは化学的な反応により製品を互いに結合する成分（例えば飼料成分）を指す。例えば「ゲル化」の最中に、水が吸収されて結合効果が生じる。しかしながら、結合剤は他の液体（油）を吸収し得、この液体は製品中に保持される。結合剤は概して例えば焼成製品、ペストリー、ドーナツ、パン等の固体または低湿製品で使用されるだろう。

「担体」または「ビヒクル」は、ＤＦＭおよび／または酵素の投与に好適な材料を意味し、当分野で既知の任意のそのような材料（例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤等）が挙げられ、そのような材料は、非毒性であり且つ有害な様式で本組成物の任意の成分と相互作用しない。

賦形剤の例として、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：微結晶性セルロースおよび他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム、グリシン、デンプン、乳糖、および高分子量ポリエチレングリコール。

崩壊剤の例として、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：デンプン（好ましくは、コーンデンプン、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定のケイ酸塩複合体。

造粒結合剤の例として、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチンおよびアカシア。

潤滑剤の例として、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルク。

希釈剤の例として、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンならびにこれらの組み合わせ。

他の成分を、同時に使用してもよいし（例えば、これらが一緒に混合されている場合、またはこれらが異なる経路で送達される場合でも）、連続的に使用してもよい（例えば、これらが異なる経路により送達され得る）。

好ましくは、本飼料添加用組成物を別の成分と混合する場合、少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭは生存能力を保持する。

一実施形態では、好ましくは、本飼料添加用組成物はクロムまたは有機クロムを含まない。

一実施形態では、好ましくは、本飼料添加剤はグルカナーゼを含まない。

別の実施形態では、好ましくは、本飼料添加剤はソルビン酸を含まない。

少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭは濃縮物の形態であることができる。典型的には、この濃縮物は、実質的に高濃度のＤＦＭを含む。

本明細書で説明した飼料添加用組成物は、少なくとも１０^３ＣＦＵ／ｇ（好適には、例えば少なくとも１０^５ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^６ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０^７ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０^８ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^９ＣＦＵ／ｇ）〜約１０^１０ＣＦＵ／ｇ（またはさらには約１０^１１ＣＦＵ／ｇもしくは約１０^１２ＣＦＵ／ｇ）の範囲である生存細胞（コロニー形成単位、ＣＦＵ）の含有量を有することができる。

本ＤＦＭが濃縮物の形態である場合、本飼料添加用組成物は、少なくとも１０^９ＣＦＵ／ｇ〜約１０^１２ＣＦＵ／ｇの範囲の、好ましくは少なくとも１０^１０ＣＦＵ／ｇ〜約１０^１２ＣＦＵ／ｇの範囲の生存細胞の含有量を有することができる。

濃縮物の形態での粉末、顆粒および液体組成物を水で希釈して、または水もしくは他の好適な希釈剤（例えば、ミルクもしくはミネラルもしくは植物油等の好適な増殖培地）に再懸濁して、すぐに使用される組成物が得られる。

本飼料添加用組成物は、当分野で既知方法に従って調製され得る濃縮物の形態であることができる。本明細書で説明した飼料添加用組成物は、当分野で既知の方法により噴霧乾燥されてもよいし凍結乾燥されてもよい。

噴霧乾燥プロセスを使用して粒子を製造する典型的なプロセスは、適切な溶媒に溶解させる固体材料（例えば、発酵培地中でのＤＦＭの培養物）を含む。あるいは、この材料を非溶媒に懸濁させて、または乳化させて、懸濁液またはエマルジョンを形成することができる。他の成分（上記で論じている）または構成成分、例えば抗菌剤、安定化剤、色素、および乾燥プロセスの助剤をこの段階で任意選択的に添加することができる。

次いで、この溶液を霧化して、液滴の微細な霧を形成する。この液滴を直ちに乾燥チャンバに入れて、乾燥ガスと接触させる。この液滴から乾燥ガス中に溶媒を蒸発させて液滴を凝固させ、それにより粒子が形成される。次いで、この粒子を乾燥ガスから分離させて回収する。

用語「対象」は、本明細書で使用される場合、飼料添加用組成物または前記飼料添加用組成物を含む飼料原料が投与されるまたは投与されている動物を意味する。

用語「対象」は、本明細書で使用される場合、動物を意味する。好ましくは、対象は、例えば家畜または飼い慣らされた動物（例えばペット）を含む哺乳類、鳥類、魚類または甲殻類である。

一実施形態では、対象は腸内病原体に曝露されている場合がある。

例として、対象は、その腸内または消化管内に１種または複数種の腸内病原体が存在している場合がある。例えば、対象は、その腸内または消化管内に、以下のレベルで１種または複数種の腸内病原体が存在している場合がある：
ｉ）動物の能力が喪失するレベル；および／または
ｉｉ）臨床的に関連するレベル；または
ｉｉｉ）無症状のレベル。

例えば、この腸内病原体はクロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）であり得る。

本明細書で使用される場合、「動物の能力」を、飼料効率および／または動物の体重増加および／または飼料転換率および／または飼料中の栄養素の消化率（例えば、アミノ酸消化率）および／または飼料中の可消化エネルギーもしくは代謝エネルギーおよび／または窒素保持および／または動物が壊疽性腸炎の悪影響を回避する能力および／または対象の免疫応答により決定することができる。

好ましくは、「動物の能力」を、飼料効率および／または動物の体重増加および／または飼料転換率により決定する。

「動物の能力の改善」が意味するのは、飼料中での飼料添加用組成物の使用による生じる、前記飼料添加用組成物を含まない飼料と比較した飼料効率の増加および／または体重増加の増加および／または飼料転換率の減少および／または飼料中の栄養素もしくはエネルギーの消化率の改善および／または窒素保持の改善および／または壊疽性腸炎の悪影響を回避する能力の改善および／または対象の免疫応答の改善である。

好ましくは、「動物の能力の改善」が意味するのは、飼料効率の増加および／または体重増加の増加および／または飼料転換率の減少である。

本明細書で使用される場合、用語「飼料効率」は、ある期間の最中に動物に適宜給与した場合にまたは規定量の食物を給与した場合に起こる動物の体重増加の量を指す。

「飼料効率の増加」が意味するのは、飼料中での飼料添加用組成物の使用による、前記飼料添加用組成物が存在することなく給与した動物と比較した飼料摂取の単位当たりの体重増加の増加である。

本明細書で使用される場合、用語「飼料転換率」は、動物の体重を規定量だけ増加させるために動物に給与される飼料の量を指す。

飼料転換率の改善は、より低い飼料転換率を意味する。

「より低い飼料転換率」または「飼料転換率の改善」が意味するのは、飼料中での飼料添加用組成物の使用により、飼料が前記飼料添加用組成物を含まない場合に動物の体重を同量だけ増加させるために必要とされる飼料の量と比較して、動物の体重を規定量だけ増加させるために動物に給与する必要がある飼料の量が低いことである。

栄養素消化率は、本明細書で使用される場合、消化管または消化管の特定の区域（例えば小腸）から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素消化率を、対象に投与されたものと対象の糞便中に出るものとの差異として測定してもよいし、対象に投与されたものと消化管の特定の区域（例えば回腸）の消化管内容物中に残存するものと差異として測定してもよい。

栄養素消化率は、本明細書で使用される場合、ある期間の最中の栄養素の摂取と***物の総回収量により排出された栄養素との差異により、または動物により吸収されず且つ全消化管もしくは消化管のある区域で消失した栄養素の量を研究者が算出することを可能にする不活性マーカーの使用により測定され得る。そのような不活性マーカーは、二酸化チタン、酸化クロムまたは酸不溶性灰分であることができる。消化率を、飼料中の栄養素のパーセンテージとして、または飼料中の栄養素の質量単位当たりの可消化栄養素の質量単位として表すことができる。

栄養素消化率は、本明細書で使用される場合、デンプン消化率、脂肪消化率、タンパク質消化率およびアミノ酸消化率を包含する。

エネルギー消化率は、本明細書で使用される場合、（消費された飼料の総エネルギー）−（糞便の総エネルギー）または（消費された飼料の総エネルギー）−（動物の消化管の特定の区域（例えば回腸）で残存する消化管内容物の総エネルギー）を意味する。

代謝エネルギーは、本明細書で使用される場合、見かけ上の代謝エネルギーを指し、（消費された飼料の総エネルギー）−（糞便、尿および消化によるガス状生成物に含まれる総エネルギー）を意味する。エネルギー消化率および代謝エネルギーを、飼料の代謝エネルギーを算出するために窒素排出に関して適切な補正を行ない、栄養素の消化率の測定と同じ方法を使用して、総エネルギーの摂取と糞便中にまたは消化管の特定の区域に存在する消化管内容物中に***された総エネルギーとの差異として測定することができる。一部の実施形態では、本飼料添加用組成物は、対象中の食物性のヘミセルロースまたは繊維の消化率または利用を改善することができる。一部の実施形態では、この対象はブタである。

窒素保持は、本明細書で使用される場合、対象の、常用飼料由来の窒素を体重として保持する能力を意味する。窒素の排出が１日摂取量を超える場合に負の窒素バランスが生じ、筋肉の減少が見られることが多い。正の窒素バランスは筋肉の成長と関連付けられることが多く、特に成長期の動物において筋肉の成長と関連付けられることが多い。窒素保持を、ある期間の最中の糞尿の総回収量による窒素の摂取と排出された窒素との差異として測定することができる。排出された窒素には、飼料由来の未消化タンパク質、内因性のタンパク様分泌物、微生物タンパク質および尿窒素が含まれることが理解される。

用語「生存率」は、本明細書で使用される場合、生存している対象の数を意味する。用語「生存率の改善」を「死亡率の低減」と言い換えることができる。

用語「屠体収率」は、本明細書で使用される場合、食肉処理の商業プロセスまたは試験プロセスの後の生体重に占める割合としての屠体の量を意味する。用語屠体は、頭部、内臓、肢の一部および羽または皮膚が除去された、食物用に食肉処理されている動物の身体を意味する。用語「屠体収率」は、本明細書で使用される場合、生体重に占める割合としての食肉の量または生体重に占める割合としての特定の肉切れの量を意味する。

本実施形態は、対象（例えば家禽またはブタ）の体重増加を増加させる方法であって、飼料添加用組成物を含む飼料材料を前記対象に給与することを含む方法をさらに提供する。

「体重増加の増加」は、飼料添加用組成物が存在しない飼料を給与する動物と比較した、前記飼料添加用組成物を含む飼料の給与時の動物の体重増加を指す。

免疫応答は、本明細書で使用される場合、ＤＦＭが動物の免疫系を調節する複数の経路（例えば、抗体産生の増加、細胞媒介性免疫の上方制御、炎症性サイトカインの上方制御、およびｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の増大）のうちの１つを意味する。ＤＦＭによる消化管の免疫刺激は疾患から宿主を保護するのに有利であり得ること、および消化管の免疫抑制は、免疫機能の支持に使用される栄養素およびエネルギーがより少ないことから宿主に有利であり得ることが理解される。

好ましくは、免疫応答は、免疫マーカーの観察により測定され得る細胞免疫応答である。別の態様では、対象の消化管中の病原体の集団を減少させることができる。

一実施形態では、糞尿中での栄養素排出の低減または糞尿中のアンモニア生成の低減が達成され得る。このことは、環境ハザードの低減に正の影響を及ぼす。例えば、好ましい実施形態では、対象の糞尿中の窒素および／またはリンの含有量を低減する方法が開示される。従って、これにより、環境中の窒素および／またはリンの量が減少し、この減少は有利であり得る。一部の用途の場合、本明細書で説明された飼料添加用組成物中の、少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭは、プロバイオティック培養効果を発揮することができる。また、この飼料添加用組成物に、さらなるプロバイオティックおよび／またはプレバイオティクスを添加することも可能である。

本明細書で開示された組成物および方法の非限定的な例として、以下が挙げられる：
１．少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物から本質的になる飼料添加用組成物。

２．前記直接給与微生物は抗病原体直接給与微生物である、実施形態１に記載の飼料添加用組成物。

３．前記直接給与微生物は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属およびメガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種の細菌株を含む、実施形態１または２に記載の飼料添加用組成物。

４．前記直接給与微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）およびペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリア種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種の細菌株を含む、実施形態３に記載の飼料添加用組成物。

５．前記直接給与微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株３ＢＰ５（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５１０）；９１８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０８）および１０１３（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０９）を含む、実施形態１、２または４に記載の飼料添加用組成物。

６．前記直接給与微生物は内生胞子の形態である、実施形態１、２または４に記載の飼料添加用組成物。

７．前記直接給与微生物は内生胞子の形態である、実施形態５に記載の飼料添加用組成物。

８．前記プロテアーゼは、サブチリシン、バシロリシン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、ケラチナーゼまたはノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属プロテアーゼである、実施形態１、２、４または７に記載の飼料添加用組成物。

９．前記プロテアーゼは、サブチリシン、バシロリシン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、ケラチナーゼまたはノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属プロテアーゼである、実施形態６に記載の飼料添加用組成物。

１０．前記プロテアーゼは、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサブチリシンである、請求項１、２、４または７に記載の飼料添加用組成物。

１１．前記プロテアーゼは、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサブチリシンである、実施形態６に記載の飼料添加用組成物。

１２．前記プロテアーゼは１０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜２００，０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する、実施形態１、２、４または７に記載の飼料添加用組成物。

１３．前記プロテアーゼは１０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜２００，０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する、実施形態６に記載の飼料添加用組成物。

１４．前記ＤＦＭは１×１０^３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜１×１０^１３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する、実施形態１、２、４または７に記載の飼料添加用組成物。

１５．前記ＤＦＭは１×１０^３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜１×１０^１３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する、請求項６に記載の飼料添加用組成物。

１６．対象の能力を改善する方法、または飼料中の原材料の消化率（例えば、アミノ酸消化率等の栄養素消化率）を改善する方法、または窒素保持を改善する方法、または壊疽性腸炎に対する対象の抵抗性を改善する方法、または飼料転換率（ＦＣＲ）を改善する方法、または屠体もしくは食肉の収率を増加させる方法、または対象の体重増加を改善する方法、または対象の飼料効率を改善する方法、または対象の免疫応答を調節する（例えば改善する）方法、または対象の消化管中での有益細菌の増殖を促進する方法、または対象の消化管中での病原性細菌の集団を低減する方法、または糞尿中での栄養素排出を低減する方法、または糞尿中でのアンモニアの生成を低減する方法、または食物性のヘミセルロースもしくは繊維の消化率もしくは利用を改善する方法であって、少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物を投与することを含む方法。

１７．実施形態１に記載の飼料添加用組成物と、投与に関する指示書とを含むキット。

１８．飼料添加用組成物を調製する方法であって、少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物を混合すること、および包装することを含む方法。

１９．実施形態１、２、４または７に記載の飼料添加用組成物を含む飼料。

２０．実施形態６に記載の飼料添加用組成物を含む飼料。

２１．実施形態１に記載の飼料添加用組成物と、少なくとも１種のミネラルおよび／または少なくとも１種のビタミンとを含むプレミックス。

他に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本開示で使用する用語の多数についての一般的辞書を当業者に提供する。

下記の実施例において本開示をさらに定義する。これらの実施例は、所定の実施形態を示しているが、単に説明のためにのみ提供されていると理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確証することができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適応させるために本開示を様々に変化させて、修飾を加えることができる。

実施例１
３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合の、コーンをベースとする常用飼料を給与したブタの成長能力および栄養素の総消化管消化率（ｔｏｔａｌ ｔｒａｃｔ ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ）への効果
材料および方法
飼育および環境
動物および実験プロトコルの使用は、Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されている。基礎常用飼料を、給与時に、エネルギーとタンパク質とのバランスが取れているように且つＮＲＣの勧告（２０１２）に沿って、この年齢の成長期のブタの栄養素要求量を満たすか上回るように配合する（表１）。一般的な消化率マーカー（酸化クロム）は０．３０％で含まれており、常用飼料成分の消化率の決定を可能にする。

この基礎常用飼料を、表２に示すように、酵素または直接給与微生物（ＤＦＭ）で処理される一部と両方の組み合わせで処理される一部とに分ける。飼料混合の最中では、ミキサーを洗い流して常用飼料の交差汚染を防止する。各バッチの開始、中間および終了の各処理常用飼料からサンプルを採取して一緒にブレンドし、飼料中の酵素活性およびＤＦＭカウントを確認する。各処理常用飼料からのサンプルを、混合の最中に−２０℃で保持し、必要となるまで−２０℃で貯蔵した。

この実験を、成長期（≦２５〜６０ｋｇの体重）に対応するように計画して実行する。

実験デザイン
４２日間の実験で、平均ＢＷが２２．６±１．９ｋｇの合計９６匹の成長期のブタ［（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ×Ｌａｎｄｒａｃｅ）×Ｄｕｒｏｃ］を使用する。ブタを、その最初のＢＷに従って４種の実験用常用飼料に無作為に割り当てる。１つの檻当たり３匹のブタで１種の処理当たり８つのレプリケートペン（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ ｐｅｎ）が存在する。去勢ブタおよび未経産ブタを、各処理において去勢ブタの４つの檻および未経産ブタの４つの檻に分ける。全てのブタを、環境管理した部屋で飼育する。各檻の片側には、ブタが飼料および水を自由に摂取することが可能であるステンレス鋼製の自動給餌器および乳首給水器が備えられている。

成長能力および糞便サンプルの採取および分析
体重および飼料消費量を毎週測定し、平均１日増体量（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）および飼料転換率（ＦＣＲ）をモニタリングする。常用飼料中で不活性指示薬としての酸化クロム（０．３％）を添加することにより、ＧＥおよびＮの見かけ上の総消化管消化率（ＡＴＴＤ、％）を決定する。試験の終了の１週間前（３５日目）に、酸化クロムと混合した常用飼料をブタに給与する。直腸マッサージ（４０日目、４１日目および４２日目）により、１つの檻当たり少なくとも２匹のブタから新鮮な糞便サンプルをつかみ取り、分析するまで−２０℃にて冷凍庫で保存する。化学分析の前に、この糞便サンプルを解凍し、７２時間にわたり６０℃で乾燥させ、その後、１ｍｍのスクリーンを通過することができるサイズまで細かく粉砕する。次いで、全ての飼料および糞便サンプルを、ＡＯＡＣ（２０００）で概説されている手順に従って乾物、総エネルギー、窒素、酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）および中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）に関して分析する。Ｗｉｌｌｉａｍｓ他（１９６２）により説明されている方法に従って、ＵＶ吸光光度法（株式会社島津製作所、ＵＶ−１２０１、日本、京都、島津）によりクロムを分析する。粗タンパク質の見かけ上の総消化管消化率を、窒素に６．２５の変換係数を乗算して算出する。陰性コントロールと比較した、各飼料添加剤の添加による可消化エネルギー（ｋｃａｌ）の改善を、以下の方程式により算出した。
１．エネルギーの分析した常用飼料のＧＥ（ｋｃａｌ／ｋｇ）／１００^＊ＡＴＴＤ＝給与時の可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）
２．可消化エネルギーの改善（ｋｃａｌ／ｋｇ）＝ＮＣ群の給与時の平均可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）−ＤＦＭ＋プロテアーゼレプリケートの給与時の平均可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）

全てのデータを、ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）のＭｉｘｅｄ手順を使用する無作為化完全ブロック設計としての統計分析にかけ、檻を実験単位として使用した。最初のＢＷをＡＤＦＩおよびＡＤＧの共変数として使用した。Ｐ＜０．０５で有意性ありとする。

成長能力：ＤＦＭ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属）とプロテアーゼとを組み合わせてコーンをベースとする常用飼料に補充すると、いかなる飼料添加剤も含まない陰性コントロールの基礎常用飼料と比較して、平均１日増体量および飼料転換効率比が有意に改善される（Ｐ＜０．０５、図１）。ＤＦＭ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属）およびプロテアーゼを単独でコーンをベースとする常用飼料に添加しても、陰性コントロールの常用飼料と比較して平均１日増体量または飼料転換効率比は有意に改善されなかった。

栄養素の見かけ上の総消化管消化率：乾物、窒素、可消化エネルギー、酸性デタージェント繊維および中性デタージェント繊維の見かけ上の総消化管消化率は全て、陰性コントロールの常用飼料と比較して、プロテアーゼと組み合わせたＤＦＭの補充により有意に改善される（表３；Ｐ＜０．０５）。ＤＦＭ＋プロテーゼの組み合わせの給与の結果としての栄養素消化率のこの改善は、陰性コントロールの常用飼料と比較して、窒素に関して３％、ＡＤＦに関して９％およびＮＤＦに関して３．５％に等しかった。しかしながら、単独で補充した場合、陰性コントロールの常用飼料とＤＦＭ処理またはプロテアーゼ処理のいずれかとの間に、乾物、窒素、可消化エネルギー、酸性デタージェント繊維および中性デタージェント繊維の見かけ上の総消化管消化率に差異はない。ＤＦＭおよびプロテアーゼの組み合わせは、陰性コントロールの常用飼料と比較して常用飼料の可消化エネルギーを５６．８ｋｃａｌ／ｋｇ増加させたが（Ｐ＜０．０５）、これらの添加剤は、単独で添加された場合には、常用飼料のエネルギー消化率を低下させた。

実施例２
３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合の、コーンをベースとする常用飼料を給与したブタの成長能力、栄養素の総消化管消化率および糞便へのアンモニア排出への効果
材料および方法
飼育および環境
動物および実験プロトコルの使用は、Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されている。基礎常用飼料は、給与時に、エネルギーとタンパク質とのバランスが取れているように且つＮＲＣの勧告（２０１２）に沿って、この年齢の成長期のブタの栄養素要求量を満たすか上回るように配合されている（表２．１）。一般的な消化率マーカー（酸化クロム）は３ｇ／ｋｇで含まれており、常用飼料成分の消化率の決定を可能にする。

この基礎常用飼料を、表２．２に示すように、酵素または直接給与微生物（ＤＦＭ）で処理される一部と両方の組み合わせで処理される一部とに分ける。飼料混合の最中では、ミキサーを洗い流して常用飼料の交差汚染を防止する。各バッチの開始、中間および終了の各処理常用飼料からサンプルを採取して一緒にブレンドし、飼料中の酵素活性およびＤＦＭカウントを確認する。各処理常用飼料からのサンプルを、混合の最中に−２０℃で保持し、必要となるまで−２０℃で貯蔵した。

この実験を、成長期（≦２５〜６０ｋｇの体重）に対応するように計画して実行する。

実験デザイン
４２日間の実験で、平均ＢＷが２４．９９±１．８４ｋｇの合計１２８匹の成長期のブタ［（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ×Ｌａｎｄｒａｃｅ）×Ｄｕｒｏｃ］を使用する。ブタを、その最初のＢＷに従って４種の実験用常用飼料に無作為に割り当てる。１つの檻当たり４匹のブタで１種の処理当たり８つのレプリケートペンが存在する。去勢ブタおよび未経産ブタを、各処理において去勢ブタの４つの檻および未経産ブタの４つの檻に分ける。全てのブタを、環境管理した部屋で飼育する。各檻の片側には、ブタが飼料および水を自由に摂取することが可能であるステンレス鋼製の自動給餌器および乳首給水器が備えられている。

成長能力および糞便サンプルの採取および分析
体重および飼料消費量を毎週測定し、平均１日増体量（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）および飼料転換率（ＦＣＲ）をモニタリングする。常用飼料中で不活性指示薬としての酸化クロム（０．３％）を添加することにより、ＧＥおよびＮの見かけ上の総消化管消化率（ＡＴＴＤ）を決定する。試験の間中、酸化クロムと混合した常用飼料をブタに給与する。直腸マッサージ（２１日目および４２日目）により、１つの檻当たり少なくとも２匹のブタから新鮮な糞便サンプルをつかみ取り、分析するまで−２０℃にて冷凍庫で保存する。化学分析の前に、この糞便サンプルを解凍し、７２時間にわたり６０℃で乾燥させ、その後、１ｍｍのスクリーンを通過することができるサイズまで細かく粉砕する。次いで、全ての飼料および糞便サンプルを、ＡＯＡＣ（２０００）で概説されている手順に従って乾物、総エネルギー、窒素、酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）および中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）に関して分析する。Ｗｉｌｌｉａｍｓ他（１９６２）により説明されている方法に従って、ＵＶ吸光光度法（株式会社島津製作所、ＵＶ−１２０１、日本、京都、島津）によりクロムを分析する。粗タンパク質の見かけ上の総消化管消化率を、窒素に６．２５の変換係数を乗算して算出した。陰性コントロールと比較した、各飼料添加剤の添加による可消化エネルギー（ｋｃａｌ）の改善を、以下の方程式により算出した。
１．エネルギーの分析した常用飼料のＧＥ（ｋｃａｌ／ｋｇ）／１００^＊ＡＴＴＤ＝給与時の可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）
２．可消化エネルギーの改善（ｋｃａｌ／ｋｇ）＝ＮＣ群の給与時の平均可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）−ＤＦＭ＋プロテアーゼレプリケートの給与時の平均可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）

糞便へのアンモニア排出
糞便のＮＨ_３濃度の分析のために、１つの檻当たり少なくとも２匹のブタから新鮮な糞便サンプル３００ｇを採取し、密閉ボックスに移し、インキュベーター（３５℃）中で発酵させる。次いで、７日目にガス探索プローブ（株式会社ガステック、日本、神奈川）を使用してＮＨ_３濃度を分析する。

統計分析
全てのデータを、ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）のＭｉｘｅｄ手順を使用する無作為化完全ブロック設計としての統計分析にかけ、檻を実験単位として使用した。最初のＢＷをＡＤＦＩおよびＡＤＧの共変数として使用した。Ｐ＜０．０５で有意性ありとする。

結果
成長能力：ＤＦＭ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属）とプロテアーゼとを組み合わせてコーンをベースとする常用飼料に補充すると、あらゆる飼料添加剤を含まない陰性コントロールの基礎常用飼料と比較して、平均１日増体量および飼料転換効率比が有意に改善される（Ｐ＜０．０５、図２）。ＤＦＭ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属）およびプロテアーゼを単独でコーンをベースとする常用飼料に添加しても、陰性コントロールの常用飼料と比較して平均１日増体量および飼料転換効率比は改善されるが（Ｐ＜０．０５）、この改善の大きさは、プロテアーゼ＋ＤＦＭの組み合わせの場合に見られたのと比べて小さかった。

栄養素の見かけ上の総消化管消化率：２１日目および４２日目の両方で、乾物および粗タンパク質の見かけ上の総消化管消化率は、陰性コントロールの常用飼料と比較して、プロテアーゼと組み合わせたＤＦＭの補充により有意に改善される（表２．３；Ｐ＜０．０５）。ＤＦＭ＋プロテーゼの組み合わせの給与の結果としての栄養素消化率のこの改善は、２１日目に陰性コントロールの常用飼料と比較して、乾物に関して５％、窒素に関して５％、ならびにＮＤＦおよびＡＤＦの両方に関して２％に等しく、４２日目に陰性コントロールの常用飼料と比較して、乾物に関して５％、窒素に関して６％、ＡＤＦに関して６％、およびＮＤＦに関して２％に等しかった。しかしながら、単独で補充した場合、陰性コントロールの常用飼料とＤＦＭ処理またはプロテアーゼ処理のいずれかとの間に、乾物および窒素の見かけ上の総消化管消化率に差異はない（Ｐ＞０．０５）。２１日目に、プロテアーゼおよびＤＦＭの処理により、全ての他の処理と比べて可消化エネルギー、ＡＤＦおよびＮＤＦの見かけ上の総消化管消化率は数値的に高い結果となった。４２日目に、プロテアーゼおよびＤＦＭの組み合わせにより、可消化エネルギー、ＮＤＦおよびＡＤＦの見かけ上の総消化管消化率が数値的に増加した。プロテアーゼとＤＦＭとの間に可消化エネルギーの相乗反応を観察し、この組み合わせにより、陰性コントロールの常用飼料と比較してさらに１８１．３ｋｃａｌ／ｋｇが放出され、この値は、ＤＦＭ単独またはプロテアーゼ単独に起因し得る追加の可消化エネルギーの合計と比べて大きかった。

糞便へのアンモニア排出
コーンをベースとする常用飼料にプロテアーゼを単独で添加しても、陰性コントロールまたはＤＦＭ単独処理と比較して、糞便へのアンモニア排出は減少しなかった（図３）。陰性コントロールの処理と比較して、ＤＦＭ単独の給与によりアンモニア排出が減少した（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、プロテアーゼおよびＤＦＭの組み合わせをブタに給与した場合には、相乗反応が明白であり、アンモニア排出の減少の大きさは、個々の処理のみに起因し得る減少の合計と比べて大きかった（陰性コントロールと比較してアンモニア濃度の１７％の減少）（Ｐ＜０．０５）。

実施例３
３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合の、コーンをベースとする常用飼料を給与したブタの成長能力および栄養素の総消化管消化率への効果
材料および方法
飼育および環境
動物および実験プロトコルの使用は、Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されている。基礎常用飼料は、給与時に、エネルギーとタンパク質とのバランスが取れているように且つＮＲＣの勧告（２０１２）に沿って、この年齢の成長期のブタの栄養素要求量を満たすか上回るように配合されている（表３．１）。一般的な消化率マーカー（酸化クロム）は３ｇ／ｋｇで含まれており、常用飼料成分の消化率の決定を可能にする。

この基礎常用飼料を、表３．２に示すように、酵素または直接給与微生物（ＤＦＭ）で処理される一部と両方の組み合わせで処理される一部とに分ける。飼料混合の最中では、ミキサーを洗い流して常用飼料の交差汚染を防止する。各バッチの開始、中間および終了の各処理常用飼料からサンプルを採取して一緒にブレンドし、飼料中の酵素活性およびＤＦＭカウントを確認する。

この実験を、成長期（≦２５〜６０ｋｇの体重）に対応するように計画して実行する。

実験デザイン
４２日間の実験で、合計１２８匹の成長期のブタ［（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ×Ｌａｎｄｒａｃｅ）×Ｄｕｒｏｃ］を使用する。ブタを、その最初のＢＷに従って４種の実験用常用飼料に無作為に割り当てる。１つの檻当たり３匹のブタで１種の処理当たり８つのレプリケートペンが存在する。去勢ブタおよび未経産ブタを、各処理において去勢ブタの４つの檻および未経産ブタの４つの檻に分ける。全てのブタを、環境管理した部屋で飼育する。各檻の片側には、ブタが飼料および水を自由に摂取することが可能であるステンレス鋼製の自動給餌器および乳首給水器が備えられている。

成長能力および糞便サンプルの採取および分析
体重および飼料消費量を毎週測定し、平均１日増体量（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）および飼料転換率（ＦＣＲ）をモニタリングする。常用飼料中で不活性指示薬としての酸化クロム（０．３％）を添加することにより、ＧＥおよびＮの見かけ上の総消化管消化率（ＡＴＴＤ）を決定する。試験の継続時間中、酸化クロムと混合した常用飼料をブタに給与する。直腸マッサージ（２１日目および４２日目）により、１つの檻当たり少なくとも２匹のブタから新鮮な糞便サンプルをつかみ取り、分析するまで−２０℃にて冷凍庫で保存する。化学分析の前に、この糞便サンプルを解凍し、７２時間にわたり６０℃で乾燥させ、その後、１ｍｍのスクリーンを通過することができるサイズまで細かく粉砕する。次いで、全ての飼料および糞便サンプルを、ＡＯＡＣ（２０００）で概説されている手順に従って乾物、総エネルギー、窒素、酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）および中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）に関して分析する。Ｗｉｌｌｉａｍｓ他（１９６２）により説明されている方法に従って、ＵＶ吸光光度法（株式会社島津製作所、ＵＶ−１２０１、日本、京都、島津）によりクロムを分析する。粗タンパク質の見かけ上の総消化管消化率を、窒素に６．２５の変換係数を乗算して算出した。陰性コントロールと比較した、各飼料添加剤の添加による可消化エネルギー（ｋｃａｌ）の改善を、以下の方程式により算出した。
１．エネルギーの分析した常用飼料のＧＥ（ｋｃａｌ／ｋｇ）／１００^＊ＡＴＴＤ＝給与時の可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）
２．可消化エネルギーの改善（ｋｃａｌ／ｋｇ）＝ＮＣ群の給与時の平均可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）−ＤＦＭ＋プロテアーゼレプリケートの給与時の平均可消化エネルギー（ｋｃａｌ／ｋｇ）

糞便のアンモニア濃度
糞便のＮＨ_３濃度の分析のために、１つの檻当たり少なくとも２匹のブタから新鮮な糞便サンプル３００ｇを採取し、密閉ボックスに移し、インキュベーター（３５℃）中で発酵させる。次いで、７日目にガス探索プローブ（株式会社ガステック、日本、神奈川）を使用してＮＨ_３濃度を分析する。

統計分析
全てのデータを、ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）のＭｉｘｅｄ手順を使用する無作為化完全ブロック設計としての統計分析にかけ、檻を実験単位として使用した。最初のＢＷをＡＤＦＩおよびＡＤＧの共変数として使用した。Ｐ＜０．０５で有意性ありとする。

結果
成長能力：ＤＦＭ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属）とプロテアーゼとを組み合わせてコーンをベースとする常用飼料に補充すると、あらゆる飼料添加剤を含まない陰性コントロールの基礎常用飼料と比較して、平均１日増体量および飼料転換効率比が有意に改善される（Ｐ＜０．０５、図４）。ＤＦＭ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属）およびプロテアーゼを単独でコーンをベースとする常用飼料に添加しても、陰性コントロールの常用飼料と比較して平均１日増体量および飼料転換効率比は改善されるが（Ｐ＜０．０５）、この改善の大きさは、プロテアーゼ＋ＤＦＭの組み合わせの場合に見られたのと比べて有意に小さかった（Ｐ＜０．０５）。

栄養素の見かけ上の総消化管消化率：２１日目および４２日目の両方で、乾物および窒素の見かけ上の総消化管消化率は、陰性コントロールの常用飼料および単独で給与した添加剤と比較して、プロテアーゼと組み合わせたＤＦＭの補充により改善される（表３．３；Ｐ＜０．０５）。ＤＦＭ＋プロテーゼの組み合わせの給与の結果としての栄養素消化率のこの改善は、２１日目に陰性コントロールの常用飼料と比較して、乾物に関して３％、ＡＤＦに関して５．５％、ならびにＮＤＦおよび窒素の両方に関して４．５％に等しく、４２日目に陰性コントロールの常用飼料と比較して、乾物に関して３％、窒素に関して４％、ＡＤＦに関して６％、およびＮＤＦに関して３．５％に等しかった。２１日目に、プロテアーゼおよびＤＦＭの処理により、全ての他の処理と比べて可消化エネルギーおよびＡＤＦの見かけ上の総消化管消化率は数値的に高い結果となった。また、２１日目に、ＤＦＭ＋プロテアーゼの組み合わせにより、陰性コントロールおよびプロテアーゼ単独処理と比較して、ＮＤＦの見かけ上の総消化管消化率も有意に増加した。４２日目に、プロテアーゼおよびＤＦＭの組み合わせにより、全ての他の処理と比較してＮＤＦおよびＡＤＦの見かけ上の総消化管消化率が数値的に増加した。加えて、ＤＦＭ＋プロテアーゼの組み合わせにより、陰性コントロールおよびプロテアーゼ単独処理と比較して、エネルギーの見かけ上の総消化管消化率が有意に増加する（Ｐ＜０．０５）。ＤＦＭ＋プロテアーゼ処理により放出される追加の可消化エネルギー（Ｋｃａｌ／ｋｇ）は、ＤＦＭ単独処理またはプロテアーゼ単独処理で放出される可消化エネルギーと比べて大きかった。

糞便へのアンモニア排出：コーンをベースとする常用飼料へのプロテアーゼ＋ＤＦＭの組み合わせの添加により、陰性コントロールと比較して糞便へのアンモニア排出が有意に減少した（図５）。ＤＦＭおよびプロテアーゼを単独で給与すると、このコントロールと比較して糞便へのアンモニア排出が数値的に減少したが、プロテアーゼおよびＤＦＭを一緒に組み合わせることにより、糞便のアンモニア濃度が最も大きく減少する結果となった（陰性コントロールと比較して１１％の減少）。

ＰＫＹ１３１２−実施例４
３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの組み合わせの、コーンをベースとする常用飼料を給与したブタの成長能力への効果
材料および方法
飼育および環境
同等の去勢ブタおよび未経産ブタからなる合計１８０匹のブタ（ＢＷ＝２３．１５±２．６６ｋｇ）を、以下の３つの常用飼料処理のうちの１つに割り当てた：１）陰性コントロール（ＮＣ）、２）ＮＣ＋ＤＦＭ、および３）ＮＣ＋プロテアーゼ＋ＤＦＭ（表４．１）。１種の処理当たり１５個の檻（８個の未経産ブタの檻および７個の去勢ブタの檻）で１つの檻当たり４匹のブタが存在した。ブタに飼料おび水を自由に摂取させた。ＮＲＣ２０１２の栄養素およびエネルギーの要求量を満たすか上回るように常用飼料を配合し、３つのフェーズを配合した（表４．２）。フェーズ２および３の常用飼料の算出した化学組成を表４．３で概説する。フェーズ１、２および３をそれぞれ、１０９日の総実験期間にわたり４１日間、４５日間および２３日間給与した。ブタおよび給餌器を毎週秤量し、平均１日増体量（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）および飼料転換率（ＦＣＲ）を算出した。

統計分析
データを、ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）のＭＩＸＥＤ手順を使用して分析した。成長能力に関して、檻を実験単位として使用した。全てのデータに関して、モデルは、固定効果としての処理とランダム効果としての檻とを含んだ。異常値を、ＵＮＩＶＡＲＩＡＴＥ手順を使用して決定した。Ｐ＜０．０５で有意性を決定した。

結果
プロテアーゼ＋ＤＦＭ処理を給与したブタは、コントロールと比較して高いＡＤＧを有する傾向があった（Ｐ＝０．０９）。ＤＦＭの単独給与と比較して、ＤＦＭを組み合わせて給与するとＡＤＧが高く且つＦＣＲが低いという結果となった（図６）。

実施例５
３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて給与した場合の、コーンをベースとする常用飼料を給与したブタの成長能力および栄養素の総消化管消化率への効果
材料および方法
４２日間の実験で、最初の体重（ＢＷ）が２５．９６±０．５７ｋｇである合計６４匹のブタ（Ｄａｎｂｒｅｄ ＤＢ９０、ｄａｍｓ ｘ Ａｇｒｏｃｅｒｅｓ ＰＩＣ ３３７、雄親）を利用した。これらの動物を、それぞれ２匹のブタの３２個の檻に割り当て、これらの檻を、８個の檻／処理の均等化した性比で構成した。この檻を試験の実験単位と見なした。ブタに飼料おび水を自由に摂取させた。ＮＲＣ２０１２の栄養素およびエネルギーの要求量を満たすか上回るように常用飼料を配合し（表５．１）、檻を４種の処理のうちの１つに無作為に割り当てた（表５．２）。

成長能力：
体重および飼料消費量を毎週測定し、平均１日増体量（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）および飼料転換率（ＦＣＲ）をモニタリングする。

結果
成長能力：ＤＦＭ＋プロテアーゼを常用飼料に添加した場合には、ＤＦＭまたはプロテアーゼの個々の給与と比較して、コーンをベースとする常用飼料を給与したブタのＡＤＧが改善された（図７）。

実施例６
単一または複数の菌株の直接給与微生物（ＤＦＭ）およびプロテアーゼの、これらの、ブタに給与するコムギまたは大豆ミールをベースとする基質からのタンパク質を可容化する能力への効果のｉｎ−ｖｉｔｒｏでの評価
材料および方法
合計８匹の回腸カニューレ装着去勢ブタ（最初のＢＷ ３０ｋｇ）に、８×２のラテン方格法で２種の実験用常用飼料のうちの一方を給与した。それぞれ７日からなる２つの連続期間が存在した。主にコムギまたはＳＢＭからなる半精製常用飼料を、各期間中に、順応のための５日間および回腸採取のため２日間で７日にわたり給与した。ブタを、第１期の開始時（０日目）に２種の実験用常用飼料のうちの１つに無作為に割り当て、第２期の開始時（７日目）にもう１つの常用飼料へと変更した。これらの常用飼料は、粗タンパク質の見かけ上の回腸消化率を算出するために使用する酸化クロムを含み、母集団平均に最も近い粗タンパク質の見かけ上の回腸消化率を有するブタからのサンプルを、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験のために選択した。ブタを、環境管理した部屋で飼育した。各檻の片側には、ブタが飼料および水を自由に摂取することが可能であるステンレス鋼製の自動給餌器および乳首給水器が備えられていた。基礎常用飼料を、ＮＲＣの勧告（２０１２）に沿って、この年齢の成長期のブタの栄養素要求量を満たすか上回るように配合した（表６．１）。

ブタから消化管内容物を採取すると直ちに−２０℃で凍結し、続いて凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥させた消化管内容物サンプルを、ＤＦＭおよびプロテアーゼの単独または組み合わせのいずれかと共にｉｎ−ｖｉｔｒｏでのインキュベーションで使用した。この試験で使用したＤＦＭは、バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）（８Ｇ−１３４）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＡＥＥ３）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）（ＡＮＣ１）の単一の菌株、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の３種の菌株（９１８、１０１３および３ＢＰ５）からなる３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の組み合わせを含んだ。

嫌気性細菌の培養
凍結保存した細菌が表面に付着している１つのビーズを、製造業者の指示に従って調製し且つ滅菌したＭＲＳ（ｄｅＭａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅ）培地（ＯＸＯＩＤ、ＣＭＳ３５９）３ｍＬが入った１３ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ６２．５１５．００６）に移すことにより、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）（ＡＮＣ１）の一晩培養物を播種した。このチューブを、２つの活性化嫌気性ガス発生小袋（Ｏｘｏｉｄ ＡｎａｅｒｏＧｅｎ ２．５Ｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を保持する、締めた嫌気性ジャー（Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ（登録商標））に入れた。このジャーにＡｎａｅｒｏｔｅｓｔストリップ（Ｍｅｒｃｋ １１５１１２）を挿入し、このストリップは、インキュベーション中では雰囲気が嫌気性であること（白色）を示した。５０ｒｐｍで振盪しつつ３７℃で１８時間にわたり細菌をインキュベートした。

一晩培養物３０μＬを新たな１３ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ６２．５１５．００６）中の新たなＭＲＳ培地３ｍＬに移すことにより、継代培養を行なった。このチューブを、新たな活性化嫌気性ガス発生小袋（Ｏｘｏｉｄ ＡｎａｅｒｏＧｅｎ ２．５Ｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒に、締めた嫌気性ジャー（Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ（登録商標））に入れた。この継代培養物が０．２〜０．４の６００ｍでの光学密度（ＯＤ６００）に達するまで、この培養物を、５０ｒｐｍで振盪しつつ３７℃でインキュベートした。この培養物をＯＤ６００＝０．１までＭＲＳ培地で希釈し、続いて１００ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液ｐＨ６．２で１０倍に希釈した。その後、この回腸サンプルの処理を直ちに開始した。

好気性細菌の培養
凍結保存した細菌が表面に付着している１つのビーズを、製造業者の指示に従って調製し且つ滅菌したＴＳＢ（トリプシン大豆ブロス）培地（Ｍｅｒｃｋ １．０５４５９）３ｍＬが入った１３ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ６２．５１５．００６）に移すことにより、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（３ＢＰ５、９１８および１０１３）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＡＥＥ３）ならびにＢ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）（８Ｇ−１３４）の一晩培養物を播種した。このチューブを、振盪しつつ（２００ｒｐｍ）１８時間にわたりインキュベートした。Ｂ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）菌株を３２℃でインキュベートし、菌株の残りを３７℃インキュベートした。

一晩培養物３００μＬを、３つの整流装置を備えた２５０ｍＬのガラスフラスコ中の新たなＴＳＢ培地３０ｍＬに移すことにより、継代培養を行なった。０．３および０．７の範囲のＯＤ６００値を得るまで、激しい振盪下で、Ｂ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）菌株を３２℃でインキュベートし、菌株の残りを３７℃でインキュベートした。この培養物をＯＤ６００＝０．１までＴＳＢ培地で希釈し、続いて１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．２で１０倍に希釈した。その後、この回腸サンプルの処理を直ちに開始した。

細菌およびプロテアーゼの組み合わせによる回腸サンプルの処理
凍結乾燥させた回腸サンプルを、個々の細菌培養物の単独でまたはプロテアーゼとの組み合わせで処理した。全ての処理を二重で試験した。凍結乾燥させた回腸サンプル０．０９７〜０．１０３ｇを２ｍＬのマイクロ遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．２ ８５０μＬを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０ ２０μＬまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中のプロテアーゼ（Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）プロテアーゼＰ３０００、５５Ｕ／ｍＬ）と一緒に添加した。全ての材料が濡れるまでサンプルを完全に混合した。１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．２ ３０μＬ、またはＭＥＳ緩衝液で希釈した細菌培養物を添加した。３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の組み合わせ（菌株９１８、１０１３および３ＢＰ５）の場合、３種の菌株のそれぞれ１０μＬを添加した（合計体積を３０μＬにした）。全てのチューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で振盪しつつ（１１５０ｒｐｍ）３７℃で２時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの２時間後、全てのサンプルを氷に移し、５分にわたり放置した。チューブを２分にわたり１７０００×ｇで遠心分離した。遠心分離により、ＡｃｒｏＰｒｅｐ（商標）Ａｄｖａｎｃｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓ（３μｍガラス繊維／０．２μｍ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）膜）を使用して上清を回収してろ過した。サンプルをさらなる分析まで−２０℃で保存した。

タンパク質の定量
１０μＬのサンプル体積で、製造業者が提供するプロトコルを使用して、ＢＳＡ標準曲線（０〜３００μｇ／ｍＬ）に対してＱｕａｎｔ−ｉＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒプローブＱ３３２１０）を使用して溶液中のタンパク質を定量した。

結果
タンパク質の可容化：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の３種の菌株の組み合わせとプロテアーゼとを組み合わせることにより、個々のＤＦＭまたはプロテアーゼ成分単独と比較して、大豆ミールをベースとするブタ回腸消化管内容物からのタンパク質の可容化が増加した（図８．１）。

単一菌株のバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）とプロテアーゼとを組み合わせることによっても、プロテアーゼまたはＤＦＭ単独の個々の成分と比べて、大豆ミールをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのタンパク質の可容化が高い結果となった（図８．２）。

単一菌株のバチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）とプロテアーゼとを組み合わせることによっても、プロテアーゼまたはＤＦＭ単独の個々の成分と比べて、大豆ミールをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのタンパク質の可容化が高い結果となった（図８．３）。

単一菌株のバチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）とプロテアーゼとを組み合わせることによって、プロテアーゼまたはＤＦＭ単独の個々の成分と比べて、コムギをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのタンパク質の可容化が高い結果となった（図８．４）。

単一菌株のバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）とプロテアーゼとを組み合わせることによって、プロテアーゼまたはＤＦＭ単独の個々の成分と比べて、コムギをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのタンパク質の可容化が高い結果となった（図８．５）。

単一菌株のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）とプロテアーゼとを組み合わせることによって、プロテアーゼまたはＤＦＭ単独の個々の成分と比べて、コムギをベースとする常用飼料を給与したブタの回腸消化管内容物からのタンパク質の可容化が高い結果となった（図８．６）。

実施例７
３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、組み合わせて給与した場合の、コーンをベースとする常用飼料を給与したブタの屠体特性への効果
材料および方法
この実験を、オランダのＡｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ／Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｓｅ Ｃｏｄｅｓに従って行なった。基礎常用飼料を、給与時に、約２００ｋｃａｌ／ｋｇ減少した正味エネルギー（ＮＥ）を除いて、ＮＲＣの勧告（２０１２）に沿って、この年齢の成長期のブタの栄養素要求量を満たすか上回るように配合した（表７．１）。この基礎常用飼料を、表７．２に示すように、酵素および直接給与微生物（ＤＦＭ）の組み合わせで処理する一部に分けた。飼料混合の最中では、ミキサーを洗い流して常用飼料の交差汚染を防止した。各バッチの開始、中間および終了の各処理常用飼料からサンプルを採取して一緒にブレンドし、飼料中の酵素活性およびＤＦＭカウントを確認した。

この実験を、成長期（≦２３〜１１６ｋｇの体重）に対応するように計画して実行する。

実験デザイン
９６〜１１３日の実験で、平均体重が２３ｋｇの合計１８０匹の成長期ブタ［Ｇｒｅａｔ Ｙｏｒｋ×Ｌａｎｄｒａｃｅ］を使用した。ブタを、その最初の体重に従って２種の実験用常用飼料に無作為に割り当てた。１つの檻当たり９匹のブタで１種の処理当たり１０個のレプリケートペンが存在した。去勢ブタおよび未経産ブタを、各処理において去勢ブタの５つの檻および未経産ブタの５つの檻に分けた。全てのブタを、環境管理した部屋で飼育する。各檻の片側には、ブタが飼料および水を自由に摂取することが可能であるステンレス鋼製の自動給餌器および乳首給水器が備えられている。

屠体特性の測定および分析
実験の最終日に、ブタを約１１６ｋｇの体重と秤量した場合（９６日または１１６日のいずれか）、ブタを屠殺し、屠殺データから屠体品質を決定した。背部の脂肪の深さ（ｍｍ）を、プローブを有する最後のリブのレベルで背部の中央線から６５ｍｍに位置するＰ２部位で測定した。屠体の痩せを推定するために日常的に使用される尺度である食肉百分率を、以下のように算出した。

統計分析
全てのデータを、ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）のＭｉｘｅｄ手順を使用する無作為化完全ブロック設計としての統計分析にかけ、檻を実験単位として使用した。データをＰ＜０．０５で有意性とみなした。

結果
ＤＦＭ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属）とプロテアーゼとを組み合わせてコーンをベースとする常用飼料に補充すると、あらゆる飼料添加剤を含まない陰性コントロールの基礎常用飼料と比較して、食肉百分率および背部の脂肪の深さが有意に改善された（Ｐ＜０．０５、表７．３）。

実施例８
３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をベースとする直接給与微生物（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株３ＢＰ５、９１８、１０１３）およびプロテアーゼの、単独でまたは組み合わせて適用した場合の、成長期のブタに給与するコムギまたは大豆ミールをベースとする常用飼料からのタンパク質の可容化への効果のｉｎ−ｖｉｔｒｏでの評価
材料および方法
合計８匹の回腸カニューレ装着去勢ブタ（最初のＢＷ ３０ｋｇ）に、８×２のラテン方格法で２種の実験用常用飼料のうちの一方を給与した。それぞれ７日からなる２つの連続期間が存在した。主にコムビまたはＳＢＭからなる半精製常用飼料を、各期間中に、順応のための５日間および回腸採取のため２日間で７日にわたり給与した。ブタを、第１期の開始時（０日目）に２つの実験用常用飼料のうちの１つに無作為に割り当て、第２期の開始時（７日目）にもう１つの常用飼料へと変更した。これらの常用飼料は、粗タンパク質の見かけ上の回腸消化率を算出するために使用する酸化クロムを含み、母集団平均に最も近い粗タンパク質の見かけ上の回腸消化率を有するブタからのサンプルを、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験のために選択した。ブタを、環境管理した部屋で飼育した。各檻の片側には、ブタが飼料および水を自由に摂取することが可能であるステンレス鋼製の自動給餌器および乳首給水器が備えられていた。基礎常用飼料を、ＮＲＣの勧告（２０１２）に沿って、この年齢の成長期のブタの栄養素要求量を満たすか上回るように配合した（表８．１）。

ブタから消化管内容物を採取すると直ちに−２０℃で凍結し、続いて凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥させた消化管内容物サンプルを、ＤＦＭおよびプロテアーゼの単独または組み合わせと共にｉｎ−ｖｉｔｒｏでのインキュベーションで使用した。この試験で使用したＤＦＭは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の３種の菌株（３ＢＰ５、９１８および１０１３）（）からなる３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の組み合わせを含んだ。

好気性細菌の培養 凍結保存した細菌が表面に付着している１つのビーズを、製造業者の指示に従って調製し且つ滅菌したＴＳＢ（トリプシン大豆ブロス）培地（Ｍｅｒｃｋ １．０５４５９）３ｍＬが入った１３ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ６２．５１５．００６）に移すことにより、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（３ＢＰ５、９１８および１０１３）の一晩培養物を播種した。このチューブを、振盪しつつ（２００ｒｐｍ）１８時間にわたりインキュベートした。全てのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株を３７℃インキュベートした。

一晩培養物３００μＬを、３つの整流装置を備えた２５０ｍＬのガラスフラスコ中の新たなＴＳＢ培地３０ｍＬに移すことにより、継代培養を行なった。０．３および０．７の範囲のＯＤ６００値を得るまで、激しい振盪下で、全てのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株を３７℃でインキュベートした。この培養物をＯＤ６００＝０．１までＴＳＢ培地で希釈し、続いて１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．２で１０倍に希釈した。その後、この回腸サンプルの処理を直ちに開始した。

細菌およびプロテアーゼの組み合わせによる回腸サンプルの処理
凍結乾燥させた回腸サンプルを、個々の細菌培養物の単独でまたはプロテアーゼとの組み合わせで処理した。全ての処理を二重で試験した。凍結乾燥させた回腸サンプル０．０９７〜０．１０３ｇを２ｍＬのマイクロ遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．２ ８５０μＬを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０ ２０μＬまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中のプロテアーゼ（Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）プロテアーゼＰ３０００、５５Ｕ／ｍＬ）と一緒に添加した。全ての材料が濡れるまでサンプルを完全に混合した。１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．２ ３０μＬ、またはＭＥＳ緩衝液で希釈した細菌培養物を添加した。３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の組み合わせ（菌株９１８、１０１３および３ＢＰ５）の場合、３種の菌株のそれぞれ１０μＬを添加した（合計体積を３０μＬにした）。全てのチューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で振盪しつつ（１１５０ｒｐｍ）３７℃で２時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの２時間後、全てのサンプルを氷に移し、５分にわたり放置した。チューブを２分にわたり１７０００×ｇで遠心分離した。遠心分離により、ＡｃｒｏＰｒｅｐ（商標）Ａｄｖａｎｃｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓ（３μｍガラス繊維／０．２μｍ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）膜）を使用して上清を回収してろ過した。サンプルをさらなる分析まで−２０℃で保存した。

タンパク質の定量
１０μＬのサンプル体積で、製造業者が提供するプロトコルを使用して、ＢＳＡ標準曲線（０〜３００μｇ／ｍＬ）に対してＱｕａｎｔ−ｉＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒプローブＱ３３２１０）を使用して溶液中のタンパク質を定量した。

結果
プロテアーゼまたはＤＦＭの単一適用により、添加剤を含まない陰性コントロールと比較して、コムギおよび大豆ミールのサンプルから可容化したタンパク質の量が数値的に増加した。しかしながら、プロテアーゼと３種の菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のＤＦＭとを組み合わせた場合、コントロールおよびプロテアーゼまたはＤＦＭ単独と比較して、コムギおよび大豆ミールのサンプルから溶解したタンパク質の量が増加した（表８．３）。

Claims (21)

1. 少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物から本質的になる飼料添加用組成物。
2. 前記直接給与微生物は抗病原体直接給与微生物である、請求項１に記載の飼料添加用組成物。
3. 前記直接給与微生物は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属およびメガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種の細菌株を含む、請求項１または２に記載の飼料添加用組成物。
4. 前記直接給与微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）およびペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリア種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種の細菌株を含む、請求項３に記載の飼料添加用組成物。
5. 前記直接給与微生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株３ＢＰ５（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５１０）；９１８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０８）および１０１３（ＮＲＲＬ Ｂ−５０５０９）を含む、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
6. 前記直接給与微生物は内生胞子の形態である、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
7. 前記直接給与微生物は内生胞子の形態である、請求項５に記載の飼料添加用組成物。
8. 前記プロテアーゼは、サブチリシン、バシロリシン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、ケラチナーゼまたはノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属プロテアーゼである、請求項１、２、４または７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
9. 前記プロテアーゼは、サブチリシン、バシロリシン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、ケラチナーゼまたはノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属プロテアーゼである、請求項６に記載の飼料添加用組成物。
10. 前記プロテアーゼは、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサブチリシンである、請求項１、２、４または７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
11. 前記プロテアーゼは、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサブチリシンである、請求項６に記載の飼料添加用組成物。
12. 前記プロテアーゼは１０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜２００，０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する、請求項１、２、４または７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
13. 前記プロテアーゼは１０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜２００，０００ＰＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する、請求項６に記載の飼料添加用組成物。
14. 前記ＤＦＭは１×１０^３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜１×１０^１３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する、請求項１、２、４または７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
15. 前記ＤＦＭは１×１０^３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇ〜１×１０^１３ＣＦＵ／飼料添加用組成物１ｇの投与量で存在する、請求項６に記載の飼料添加用組成物。
16. 対象の能力を改善する方法、または飼料中の原材料の消化率（例えば、アミノ酸消化率等の栄養素消化率）を改善する方法、または窒素保持を改善する方法、または壊疽性腸炎に対する前記対象の抵抗性を改善する方法、または飼料転換率（ＦＣＲ）を改善する方法、または屠体もしくは食肉の収率を増加させる方法、または対象の体重増加を改善する方法、または対象の飼料効率を改善する方法、または前記対象の免疫応答を調節する（例えば改善する）方法、または対象の消化管中での有益細菌の増殖を促進する方法、または対象の前記消化管中での病原性細菌の集団を低減する方法、または糞尿中での栄養素排出を低減する方法、または糞尿中でのアンモニアの生成を低減する方法、または食物性のヘミセルロースもしくは繊維の消化率もしくは利用を改善する方法であって、少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物を投与することを含む方法。
17. 請求項１に記載の飼料添加用組成物と、投与に関する指示書とを含むキット。
18. 飼料添加用組成物を調製する方法であって、少なくとも１種のプロテアーゼと組み合わせて、１種または複数種の細菌株を含む直接給与微生物を混合すること、および包装することを含む方法。
19. 請求項１、２、４または７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む飼料。
20. 請求項６に記載の飼料添加用組成物を含む飼料。
21. 請求項１に記載の飼料添加用組成物と、少なくとも１種のミネラルおよび／または少なくとも１種のビタミンとを含むプレミックス。

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