CN104684408B

CN104684408B - 饲料添加剂组合物

Info

Publication number: CN104684408B
Application number: CN201380051433.3A
Authority: CN
Inventors: L·罗梅罗; P·普勒斯泰德; L·巴尔纳德
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2033-08-02

Abstract

用于改善个体的表现，或用于改善饲料中的原料的消化率(例如营养物消化率，如氨基酸消化率)，或用于改善氮保留，或用于改善饲粮磷吸收和保留，或用于改善肌醇六磷酸酶的功效，或用于改善个体对坏死性肠炎的抗性，或用于改善饲料转化率(FCR)，或用于改善个体中的增重，或用于改善个体中的饲料效率，或用于调节(例如改善)个体的免疫反应，或用于减少个体的胃肠道中的致病菌的种群，或用于减少粪肥中的营养物***的方法，该方法包括对个体施用至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶的组合，其中按超过约1500FTU/kg饲料的剂量对该个体施用该肌醇六磷酸酶。

Description

饲料添加剂组合物

技术领域

本发明涉及用至少一种直接饲喂微生物与一种或多种高剂量肌醇六磷酸酶的组合改善饲料组合物的方法，以及包含至少一种直接饲喂微生物与一种或多种高剂量肌醇六磷酸酶的组合的饲料添加剂组合物。本发明进一步涉及用途和试剂盒。

背景技术

坏死性肠炎是家禽物种中在经济上重要的疾病。它因病原体产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)感染而产生，常伴随球虫病感染。在极端情况下，它导致高水平的死亡率，并在亚临床水平导致肠损伤及对动物表现的有害影响。主要通过饲用抗生素的使用来控制坏死性肠炎及其负面作用。但是，用饲用抗生素作为生长促进剂的禁令及消费者对减少应用于产肉动物的抗生素的使用的压力使生产者更难以防止由产气荚膜梭菌及相关的亚临床或临床坏死性肠炎引起的损失。因此，存在提供限制或阻止由产气荚膜梭菌引起的损伤的解决方案的机会。一个这种解决方案是用益生菌剂来促进健康的肠道微生物区系和稳定的肠病学生态***。但是，已就用诸如蛋白酶和糖酶的酶补充观察到了其他益处。尽管已考虑DFM与一些酶的组合，但从来没有完全了解DFM与酶之间的相互作用。本发明涉及新的特定组合，其令人惊奇地显著改善动物的生产性能特性。

已知单胃动物在胃和小肠中不包含内源肌醇六磷酸酶或包含量可忽略的内源肌醇六磷酸酶，因此依赖于补充的植物和/或微生物或真菌肌醇六磷酸酶来在近端消化道中水解肌醇六磷酸(Pallauf,J.和Rimbach,G.Arch.Anim.Nutr.,1997,50卷,301-319页)。通常向单胃动物的饲料(如家禽和猪饲料)加入额外的肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶是谷类和豆类中磷的主要储存形式。通过肌醇六磷酸酶的作用，肌醇六磷酸通常水解产生低级肌醇磷酸和无机磷酸。

本发明寻求克服与肌醇六磷酸酶在患有临床或亚临床坏死性肠炎的动物中减少的有益作用相关的问题中的一些。

本发明还寻求克服与肌醇六磷酸尤其是在患有临床或亚临床坏死性肠炎的动物中的抗营养特性相关的问题，导致改善营养物、矿物质、维生素和能量的有效性，并因此改善单胃动物的生物物理学特征。

发明概述

本发明的开创性发现是，本发明人发现，至少一种DFM与高水平(>1500FTU/kg饲料)的肌醇六磷酸酶的组合中存在预料之外的协同作用，已显示其将个体的表现改善至高于具有低水平产气荚膜梭菌且无坏死性肠炎的阳性对照的水平的水平。

本发明人已通过考虑例如百分比死亡率、体重增加和FCR证明了此发现。这些正面作用完全是意料之外的。

不希望受限于理论，本发明人认为，这些作用可以由与对照相比由病原体(例如产气荚膜梭菌和/或大肠杆菌(Escherichia coli)攻击)引起的肠损伤水平的降低引起。

动物表现的改善可以通过防止有害细菌在肠道中的定殖和病理学来解释。此外，认为本发明的其他有益作用包括肌醇六磷酸的水解增加，其导致蛋白质和矿物质的回肠消化率提高。除对个体的提高营养物有效性的益处外，这还可以导致较少的底物到达后肠用于细菌发酵，使得肠道中的病原体更难以定殖。本发明的另一益处是，与不补充肌醇六磷酸酶时相比，黏蛋白的产生减少。因此，存在较低水平的内源性丧失，且同样较少的底物用于肠道微生物区系发酵。

具体而言，本发明的开创性发现是至少一种直接饲喂微生物(DFM)与高水平(>1500FTU/kg饲料)的肌醇六磷酸酶的组合对动物的表现具有显著的有益作用，包括改善以下中的一种或多种：饲料转化率(FCR)、消化原料的能力(例如营养物消化率，如氨基酸消化率)、氮保留、存活率、屠宰率、生长速率、增重、饲料效率、动物对坏死性肠炎的抗性、个体的免疫反应。

本发明的另一惊人的作用是，它可以减少粪肥(manure)中的营养物***(例如减少个体的粪肥中的氮和磷含量)。

在本发明的另一方面，提供这样的方法，该方法：

i)用于改善个体的表现；或

ii)用于改善饲料中的原料的消化率(例如营养物消化率，如氨基酸消化率)；或

iii)用于改善磷(例如饲粮磷)吸收和保留；或

iv)用于改善肌醇六磷酸酶的功效；或

v)用于改善氮保留；或

vi)用于改善个体对坏死性肠炎的抗性；或

vii)用于改善饲料转化率(FCR)；或

viii)用于改善个体中的增重；或

ix)用于改善个体中的饲料效率；或

x)用于调节(例如改善)个体的免疫反应；或

xi)用于减少个体的胃肠道中的致病菌的种群；或

xii)减少粪肥中的营养物***；

该方法包括对个体施用至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶的组合，其中按超过约1500FTU/kg饲料的剂量对该个体施用该肌醇六磷酸酶。

本发明的另一方面是至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶的组合的用途，其中按超过约1500FTU/kg饲料的剂量使用该肌醇六磷酸酶：

i)用于改善个体的表现；或

iii)用于改善氮保留；或

iv)用于改善磷(例如饲粮磷)吸收和保留；或

v)用于改善肌醇六磷酸酶的功效；或

vi)用于改善个体对坏死性肠炎的抗性；或

vii)用于改善饲料转化率(FCR)；或

viii)用于改善个体中的增重；或

ix)用于改善个体中的饲料效率；或

x)用于调节(例如改善)个体的免疫反应；或

xi)用于减少个体的胃肠道中的致病菌的种群；或

xii)减少粪肥中的营养物***。

本发明还提供包含至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶的组合的饲料添加剂组合物，其中该肌醇六磷酸酶按以下存在于该饲料添加剂组合物中：

a.在按至少50g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按约30,000FTU/g组合物或更多；

b.在按至少75g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按约20,000FTU/g组合物或更多；

c.在按至少100g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按约15,000FTU/g组合物或更多；

d.在按至少100g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按约15,000FTU/g组合物或更多；

e.在按至少150g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按约10,000FTU/g组合物或更多；

f.在按至少200g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按约7,500FTU/g组合物或更多；

g.在按至少300g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按约5,000FTU/g组合物或更多；

且其中该直接饲喂微生物按从2.5x10³CFU DFM:1FTU酶至6.7x10⁶CFU:1FTU酶的范围存在于该饲料添加剂组合物中。

在本发明的另一方面，提供包含本发明的饲料添加剂组合物和使用说明书的试剂盒。

在本发明的另一方面，提供制备饲料添加剂组合物的方法，其包括将至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶组合，使得该组合物中肌醇六磷酸酶的剂量：

a.在按至少50g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为约30,000FTU/g组合物或更多；

b.在按至少75g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为约20,000FTU/g组合物或更多；

c.在按至少100g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为约15,000FTU/g组合物或更多；

d.在按至少100g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为约15,000FTU/g组合物或更多；

e.在按至少150g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为约10,000FTU/g组合物或更多；

f.在按至少200g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为约7,500FTU/g组合物或更多；

g.在按至少300g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为约5,000FTU/g组合物或更多；

且该饲料添加剂组合物中该直接饲喂微生物的剂量在从2.5x10³CFUDFM:1FTU酶至6.7x10⁶CFU:1FTU酶的范围内，并(可选地)包装。

在本发明的另一方面，提供包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料。

本发明还进一步提供制备饲料(feedstuff)的方法，其包括将饲料成分与本发明的饲料添加剂组合物混合。

在另一方面，本发明提供包含饲料添加剂组合物和至少一种矿物质和/或至少一种维生素的预混物，该饲料添加剂组合物含有至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶的组合，其中该肌醇六磷酸酶按以下存在于该预混物中：

且该直接饲喂微生物按从2.5x10³CFU DFM:1FTU酶至6.7x10⁶CFU:1FTU酶的范围存在于该预混物中。

本发明还提供本发明的饲料添加剂组合物或本发明的预混物或包含本发明的饲料添加剂组合物(或预混物)的饲料，用于在个体中预防和/或治疗球虫病和/或坏死性肠炎。

还在本发明的另一方面，提供预防和/或治疗坏死性肠炎和/或球虫病的方法，其中对个体施用有效量的本发明的饲料添加剂组合物或本发明的预混物或包含本发明的饲料添加剂组合物(或预混物)的饲料。

在本发明的一个大方面，还进一步提供方法或用途：

i)用于改善饲料中的原料的消化率(例如营养物消化率，如氨基酸消化率)；或

ii)用于改善个体的表现；或

iii)用于改善磷(例如饲粮磷)吸收和保留；或

iv)用于改善肌醇六磷酸酶的功效；或

v)用于改善氮保留；或

vi)用于改善个体对坏死性肠炎的抗性；或

vii)用于改善饲料转化率(FCR)；或

viii)用于改善个体中的增重；或

ix)用于改善个体中的饲料效率；或

x)用于调节(例如改善)个体的免疫反应；或

xi)用于减少个体的胃肠道中的致病菌的种群；或

xii)减少粪肥中的营养物***；

该方法包括对个体施用高剂量磷酸，连同降低个体胃肠道(GIT)中的pH的化合物。在此大方面，该化合物可以适宜地是有机酸、精油或抗生素。该有机酸可以选自柠檬酸、延胡索酸、甲酸、丙酸、乳酸和苯甲酸。该抗生素可以选自四环素、氯四环素、土霉素、夹竹桃霉素、螺旋霉素、维吉霉素、杆菌肽锌、默诺霉素、卑霉素和阿佛帕星。该精油(或植物提取物)可以选自cinnemaldehyde、麝香草酚、香芹酚、辣椒碱、丁香油酚(euganol)和alicin。

附图简述

图1显示补充EnvivaPro和高肌醇六磷酸酶剂量(3000FTU/kg)对在坏死性肠炎攻击下饲养至42天的肉鸡(broiler)的体重增加的影响。

图2显示补充EnvivaPro和高肌醇六磷酸酶剂量(3000FTU/kg)对在坏死性肠炎攻击下饲养至42天的肉鸡的FCR的影响。

图3显示EnvivaPro和高肌醇六磷酸酶剂量(3000FTU/kg)对坏死性肠炎攻击引起的死亡率的影响。

图4显示EnvivaPro和高肌醇六磷酸酶剂量(3000FTU/kg)对坏死性肠炎攻击引起的肠损伤的严重度的影响。

图5显示在坏死性肠炎攻击下，在存在和缺乏Enviva Pro的情况下，不同剂量的肌醇六磷酸酶对肉鸡从第0天至第21天的FCR的影响。

图6显示不同剂量的肌醇六磷酸酶对肉鸡从第6天至第35天的FCR的影响。

图7显示在坏死性肠炎攻击下，在有和无Enviva Pro的情况下，不同剂量的HiPhos^TM肌醇六磷酸酶对肉鸡从第0天至第21天的FCR的影响。

图8显示在坏死性肠炎攻击下，在有和无Enviva Pro的情况下，不同水平的HiPhos^TM肌醇六磷酸酶对肉鸡在第21天的胫骨(tibia)骨灰的影响。

发明详述

优选地，用于本发明的酶中的每一个对于DFM而言是外源性的。换言之，优选将酶添加至DFM中或与DFM混合。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton,等,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY,第20版,John Wiley and Sons,New York(1994)及Hale&Marham,THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本公开中所用的许多术语的一般性词典。

本公开并不受限于本文公开的示例性方法和材料，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开的实施方案的实施或测试。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则分别是，任何核酸序列从左至右以5'至3'方向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向写出。

本文提供的标题并非是对本公开的多种方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下文就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考而得到更完全的定义。

氨基酸在本文中用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代。

本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。

本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature,JCBN)的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。

术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。

在提供数值范围时，应理解，除非文中另有明确说明，也明确公开该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位(unit)的十分之一)。所述范围中的任意所述值或中间值与所述范围中的任意其他所述值或中间值之间的每个较小范围也为本公开所涵盖。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或排除在该范围外，且其中任一个、没有一个或两个界限包括在较小范围中的每个范围也为本公开所涵盖，依据所述范围中的任意明确排除的界限而定。在所述范围包括界限中的一个或两个的情况下，排除这些所包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。

必须指出，除非文中另有明确说明，本文和所附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提到“酶”则包括多个这种候选物质，而提到“饲料”则包括提到一种或多种饲料以及本领域技术人员已知的它们的等同物，以此类推。

本文讨论的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。

用于本发明的酶可通过固体培养或深层培养来产生，包括分批方法、补料分批方法和连续流方法。培养在培养基中完成，该培养基包含水性矿物盐培养基、有机生长因子、碳和能源物质、分子氧以及当然还有待使用的一种或多种具体的微生物物种的起始接种物。

用于本发明的直接饲喂微生物(DFM)可以是抗病原体直接饲喂微生物。本文所用的术语“抗病原体DFM”意指抑制(例如减少或阻止)致病微生物(如产气荚膜梭菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)和/或弯曲杆菌属物种(Campylobacterspp.)，优选产气荚膜梭菌和/或大肠杆菌)的肠内定殖的DFM。

下文所教导的“DFM测定”可以用来确定DFM是否是抗病原体DFM。

在一个实施方案中，选择用本文教导的“DFM测定”评估时的抑制性菌株(或抗病原体DFM)作为用于本发明的DFM。

适宜地，用于本发明的DFM可以抑制以下病原体中的一种(或多种)：梭菌属物种(Clostridium spp)，如产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌(Clostridium difficile)，和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种，优选以下病原体中的至少一种(或多种)：梭菌属物种，如产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌，和/或大肠杆菌。

在一个实施方案中，用于本发明的DFM可以抑制以下病原体中的一种(或多种)：产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌和/或大肠杆菌，优选产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌，更优选产气荚膜梭菌。

在一个实施方案中，个体可以受病原体攻击，如以下病原体中的一种或多种：梭菌属物种，如产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌，和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。

在一个实施方案中，个体可以受产气荚膜梭菌和/或大肠杆菌攻击。

用于本发明的DFM适宜地是活细菌。

本发明涉及高肌醇六磷酸酶剂量。

通常，按约500FTU/kg饲料的范围给予肌醇六磷酸酶例如用于肉鸡和火鸡，通常按约300FTU/kg饲料的范围给予用于例如蛋鸡。

相反，在本发明中，按至少1500FTU/kg饲料、适宜地至少2000FTU/kg饲料、适宜地至少3000FTU/kg饲料、适宜地至少5000FTU/kg饲料、如10000FTU/kg饲料的水平将肌醇六磷酸酶加在饲料中(或与饲料加在一起)。

如本领域技术人员将理解，饲料添加剂组合物中的肌醇六磷酸酶的水平必须足以允许按至少1500FTU/kg饲料、适宜地至少2000FTU/kg饲料、适宜地至少3000FTU/kg饲料、适宜地至少5000FTU/kg饲料、如10000FTU/kg饲料的水平将肌醇六磷酸酶加在饲料中。

本发明人已发现，通过与DFM组合施用高肌醇六磷酸酶水平可以获得显著的益处。相反，单独增加肌醇六磷酸酶的剂量未产生显著益处(例如，饲料转化率等无显著改善)。形成鲜明的对比，在与至少一种DFM(尤其是至少一种抗病原体DFM)组合增加肌醇六磷酸酶的剂量时，则观察到显著和意料之外的益处。这完全是意料之外的。

适宜地，用于本发明的DFM是至少两种DFM、适宜地至少三种DFM的混合物。

在一个实施方案中，用于本发明的DFM包含来自以下属中的一个或多个的细菌(或基本上由其组成，或由其组成)：芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、酵母属(Saccharomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、曲霉属(Aspergillus)及其组合。

用于本发明的DFM可以包含来自以下物种中的一个或多个的细菌(或基本上由其组成，或由其组成)：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis spp animalis)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivarius ssp salivarius)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、丁基梭菌(Clostridium butyricum)、米曲霉(Aspergillusoryzae)及其组合。

用于本发明的DFM可以包含以下菌株中的一个或多个(或基本上由其组成，或由其组成)：枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)、枯草芽孢杆菌BS278(NRRL 50634)、枯草芽孢杆菌4-7d(NRRL B-50505)、枯草芽孢杆菌3-5h(NRRL B-50507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRLB-50544)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)、枯草芽孢杆菌B27(NRRL B-50105)、枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)、枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)、枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)、枯草芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌3-12a(NRRL B-50504)、地衣芽孢杆菌4-2a(NRRL B-50506)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)P261(NRRL B-50131)、丙酸丙酸杆菌P179(NRRLB-50133)、丙酸丙酸杆菌P169(PTA 5271)、丙酸丙酸杆菌P170(PTA 5272)、詹氏丙酸杆菌(Propionibacteriumjensenii)P63(NRRL B-30979)、詹氏丙酸杆菌P195(NRRL B-50132)、乳酸乳球菌ID7(PTA6103)、乳酸乳球菌JD19(PTA 6104)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)A2020(NRRL B-30977)、嗜酸乳杆菌A4000h(NRRL B-30978)、嗜酸乳杆菌PIBc6(NRRL B-50103)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)LBR 1000(NRRL B-30982)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC222(NRRL B-30983)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)PLCB6(NRRL B-50518)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)o246i33w(NRRL B-50102)、短乳杆菌AJ25(PTA-6099)、短乳杆菌HE17(PTA-6100)、短乳杆菌1E-1(PTA-6509)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)Cl15(PTA-6101)、乳酸乳杆菌DJ6(PTA-6102)、鼠李糖乳杆菌(CNCM I-3698)、香肠乳杆菌(CNCM I-3699)、屎肠球菌EF141(EN-1)(NRRL B-30981)、屎肠球菌2-1d(NRRL B-50519)、乳酸片球菌PIJe3(NRRL B-50101)、乳酸片球菌o246e42(NRRLB-50171)及其组合。

用于本发明的DFM可以包含一种以上、适宜地两种以上、适宜地至少三种芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)。

用于本发明的DFM可以包含以下菌株中的一个或多个(或基本上由其组成，或由其组成)：枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)、BS 18(NRRL B-50633)和BS 278(NRRL B-50634)或其组合。

在一个实施方案中，用于本发明的DFM可以包含以下菌株中的一个或多个(或基本上由其组成，或由其组成)：枯草芽孢杆菌菌株15A-P4(PTA-6507)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)。

在一个实施方案中，用于本发明的肌醇六磷酸酶是6-肌醇六磷酸酶或3-肌醇六磷酸酶，优选6-肌醇六磷酸酶。

在一个实施方案中，用于本发明的肌醇六磷酸酶可以选自：大肠杆菌肌醇六磷酸酶，或布丘氏菌属(Buttiauxella)肌醇六磷酸酶，或柠檬酸细菌属(Citrobacter)肌醇六磷酸酶，或哈夫尼菌属(Hafnia)肌醇六磷酸酶，或曲霉属肌醇六磷酸酶，或青霉属(Penicillium)肌醇六磷酸酶，或木霉属(Trichoderma)肌醇六磷酸酶，或大肠杆菌肌醇六磷酸酶，或汉逊酵母属(Hansenula)肌醇六磷酸酶，或其组合。

在一个实施方案中，用于本发明的肌醇六磷酸酶可以是来自以下中的一种或多种的6-肌醇六磷酸酶：大肠杆菌、布丘氏菌属物种(Buttiauxella spp)或柠檬酸细菌属物种(Citrobacter spp)，例如布氏柠檬酸细菌(Citrobacter braakii)，包括其组合。

适宜地，用于本发明的肌醇六磷酸酶可以是一种或多种PhyzymeXP^TM、AxtraPhy^TM，或Ronozyme HiPhos^TM，或Quantum^TM，或Quantum Blue^TM。

适宜地，肌醇六磷酸酶可以是一种以上肌醇六磷酸酶、如至少2种或至少3种肌醇六磷酸酶的混合物。

在一个实施方案中，优选地，用于本发明的肌醇六磷酸酶在低pH下具有活性(例如，在pH2和pH5.5之间具有活性)。

在一个实施方案中，优选地，用于本发明的肌醇六磷酸酶具有低pH下的最适pH(例如，具有pH2和pH5.5的范围内的最适pH)。

在一个实施方案中，个体中存在临床或亚临床肠病攻击。

在一个实施方案中，临床或亚临床肠病攻击可以由任意病原体或任意致病菌(如产气荚膜梭菌或大肠杆菌)引起。

在一个实施方案中，饲料添加剂组合物中直接饲喂微生物的剂量可以在从3.8x10³CFU DFM:1FTU酶至2.0x10⁵CFU:1FTU酶的范围内。

直接饲喂微生物(DFM)

本文中的术语“微生物(microbial)”可与“微生物体(microorganism)”互换使用。

优选地，DFM包含活微生物。优选地，DFM包含活细菌或活酵母或活真菌。

优选地，DFM包含活细菌。

术语“活微生物”意指具有代谢活性或能够分化的微生物。

在一个实施方案中，DFM可以是孢子形成细菌，因此术语DFM可由孢子，例如细菌孢子组成，或含有孢子，例如细菌孢子。因此，在一个实施方案中，本文所用的术语“活微生物”可以包括微生物孢子，如内生孢子或分生孢子。

在另一个实施方案中，本发明的饲料添加剂组合物中的DFM不由微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子组成，或不含有微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子。

微生物可为天然存在的微生物或其可以是转化微生物。微生物也可以是适宜的微生物的组合。

在一些方面，本发明的DFM可以是以下中的一种或多种：细菌、酵母、真菌。

优选地，本发明的DFM是益生微生物。

在本发明中，术语直接饲喂微生物(DFM)涵盖直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂真菌及其组合。

优选地，DFM是直接饲喂细菌。

优选地，DFM是包含两种或多种细菌(例如三种或多种或者四种或多种)的组合；或者DFM是包含两种或多种细菌菌株(例如三种或多种或者四种或多种)的组合。

优选地，细菌是分离的。

适宜地，DFM可以包含来自以下属中的一个或多个的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属、梭菌属和巨球形菌属(Megasphaera)及其组合。

在一个实施方案中，DFM可以选自以下芽孢杆菌属物种：枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。

在一个实施方案中，DFM可以是芽孢杆菌属菌株。

在一个实施方案中，DFM可以选自：

枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)、枯草芽孢杆菌BS278(NRRL50634)、枯草芽孢杆菌4-7d(NRRL B-50505)、枯草芽孢杆菌3-5h(NRRL B-50507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)、枯草芽孢杆菌B27(NRRL B-50105)、枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)、枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)、枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)、枯草芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)及其组合。

为避免产生疑问，枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)有时称为菌株BS8。

在一个实施方案中，DFM可以选自：

枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS 1068(NRRL B-50543)或短小芽孢杆菌KX11-1(NRRLB-50546)及其组合。

在一个实施方案中，DFM选自：

地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌3-12a(NRRL B-50504)、地衣芽孢杆菌4-2a(NRRL B-50506)和地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)。

在一个实施方案中，DFM可以是包含两种或多种芽孢杆菌属菌株的组合。

在一个实施方案中，DFM可以是两种或多种枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)、BS 18(NRRL B-50633)和BS 278(NRRL B-50634)的组合。

在优选实施方案中，DFM可以包含以下组合之一(或基本上由其组成，或由其组成)：

枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)+枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)+枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)；或

枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)+枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)+枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)；或

枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)+枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)+枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)+枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)；或

枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)+枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)+枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)；或

枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)+枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)+枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)；或

枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)+枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)+枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)；或

枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)+枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)+枯草芽孢杆菌BS278(NRRL 50634)。

菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)和22C-P1(PTA-6508)可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)公开获得。

菌株2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)可从美国农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection,NRRL)公开获得。菌株枯草芽孢杆菌LSSA01有时称为枯草芽孢杆菌8。

这些菌株在US 7,754,469B2中教导。

丹尼斯克美国公司(Danisco USA Inc.)(W227N752Westmound Dr.Waukesha,WI53186,USA)还按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)将以下保藏物保藏于美国农业研究机构保藏中心(1815North University Street,Peoria,Illinois 61604,United States ofAmerica)，下文详述原始保藏物的保藏日期和保藏号：

地衣芽孢杆菌3-12a	NRRL B-50504	2011年5月13日
			地衣芽孢杆菌4-2a	NRRL B-50506	2011年5月13日
地衣芽孢杆菌BL842	NRRL B-50516	2011年5月20日
			短小芽孢杆菌AGTP KXII-1	NRRL B-50546	2011年8月5日
短小芽孢杆菌AGTP BS1068	NRRL B-50543	2011年8月4日
			枯草芽孢杆菌BS18	NRRL B-50633	2012年1月9日
枯草芽孢杆菌BS278	NRRL B-50634	2012年1月9日
			枯草芽孢杆菌4-7d	NRRL B-50505	2011年5月13日
枯草芽孢杆菌3-5h	NRRL B-50507	2011年5月13日
			枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5	NRRL B-50510	2011年5月13日
枯草芽孢杆菌AGTP BS918	NRRL B-50508	2011年5月13日
			枯草芽孢杆菌AGTP BS1013	NRRL B-50509	2011年5月13日
枯草芽孢杆菌AGTP 944	NRRL B-50548	2011年8月11日
			枯草芽孢杆菌AGTP BS442	NRRL B-50542	2011年8月4日
枯草芽孢杆菌AGTP BS1069	NRRL B-50544	2011年8月4日
			枯草芽孢杆菌AGTP BS521	NRRL B-50545	2011年8月4日

丹尼斯克美国公司(Danisco USA Inc.)(W227N752Westmound Waukesha博士,WI53186,美国)授权杜邦营养生物科学有限公司(DuPont Nutrition Biosciences ApS)(Langebrogade 1,PO Box 17,DK-1001,Copenhagen K,丹麦)在本专利申请中参考这些保藏的生物材料，并且无保留地且不可撤销地同意公众可获得所保藏的材料。

在一些实施方案中，DFM可以是包含下表中详述的枯草芽孢杆菌菌株的组合。

在一个实施方案中，DFM可以选自乳球菌属物种(Lactococcus spp)。

在一个实施方案中，DFM可以选自以下乳球菌属物种中的一种或多种：乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)和乳酸乳球菌及其组合。

在一个实施方案中，DFM可以选自以下菌株或其组合：

乳酸乳球菌ID7	PTA 6103
		乳酸乳球菌JD19	PTA 6104

在一个实施方案中，DFM可以是乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)。

在一个实施方案中，DFM可以选自以下乳杆菌属物种：布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双岐乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、路氏乳杆菌、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、香肠乳杆菌、乳酸乳杆菌、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)及其任意组合。

在一个实施方案中，DFM选自以下菌株或其组合：

嗜酸乳杆菌A2020	NRRL B-30977
		嗜酸乳杆菌A4000h	NRRL B-30978
嗜酸乳杆菌PIBc6	NRRL B-50103
		短乳杆菌LBR 1000	NRRL B-30982
干酪乳杆菌LC222	NRRL B-30983
		约氏乳杆菌PLCB6	NRRL B-50518
唾液乳杆菌o246i33w	NRRL B-50102
		短乳杆菌AJ25	PTA-6099
短乳杆菌HE17	PTA-6100
		短乳杆菌1E-1	PTA-6509
乳酸乳杆菌Cl15	PTA-6101
		乳酸乳杆菌DJ6	PTA-6102
鼠李糖乳杆菌	CNCM I-3698
		香肠乳杆菌	CNCM I-3699

在一个实施方案中，DFM可以选自以下菌株中的一个或多个：鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698和香肠乳杆菌CNCM-I-3699。这些菌株由Sorbial(Route de Spay 72700Allonnes,法国)于2006年12月8日保藏在法国微生物保藏中心(Collection Nationale de Culturesde Microorganims)(CNCM)(25,Rue due Docteur Roux,F75724Paris Cedex 15,法国)，保藏物的所有权利、所有权和利益随后转移至Danisco France SAS(20,Rue de Brunel,75017Paris,法国)。

Danisco France SAS授权杜邦营养生物科学有限公司(Langebrogade1,PO Box17,DK-1001,Copenhagen K,丹麦)在本专利申请中参考这些保藏的生物材料，并且无保留地且不可撤销地同意所保藏的材料公众可获得。

在一个实施方案中，DFM可以是可从丹尼斯克动物营养公司(Danisco AnimalNutrition)获得的产品。

在一个实施方案中，DFM可以来自片球菌属。

在一个实施方案中，DFM可以来自以下片球菌属物种：乳酸片球菌，如以下乳酸片球菌菌株PIJe3(NRRL B-50101)或o246e42(NRRL B-50171)中的一种或多种。

在一个实施方案中，DFM可以选自以下双歧杆菌属物种(Bifidobacteria spp)：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双岐杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)及其任意组合。

在一个实施方案中，DFM可以是肠球菌属物种(Enterococcus spp)。

在一个实施方案中，DFM可以来自屎肠球菌物种。

在一个实施方案中，DFM可以选自屎肠球菌EF141(EN-1)(NRRL B-30981)、屎肠球菌2-1d(NRRL B-50519)及其组合。

在一个实施方案中，DFM可以来自丙酸杆菌属。

在一个实施方案中，DFM可以选自以下丙酸杆菌属物种或其组合：丙酸丙酸杆菌和詹氏丙酸杆菌。

在一个实施方案中，DFM可以选自以下丙酸杆菌属物种或其组合：

丙酸丙酸杆菌P261	NRRL B-50131
		丙酸丙酸杆菌P179	NRRL B-50133
丙酸丙酸杆菌P169	PTA 5271
		丙酸丙酸杆菌P170	PTA 5272
詹氏丙酸杆菌P63	NRRL B-30979
		詹氏丙酸杆菌P195	NRRL B-50132

适宜地，DFM可以包含来自以下物种中的一个或多个的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、屎肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种(Pediococcus spp)、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、丁基梭菌、动物双岐杆菌动物亚种、路氏乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种、丙酸杆菌属物种(Propionibacteria sp)及其组合。

用于本发明的直接饲喂细菌可以属于相同类型(属、种和菌株)或可以包含属、种和/或菌株的混合物。

适宜地，本发明的DFM可以是以下表中的那些产品或包含于那些产品中的微生物中的一种或多种：

在一个实施方案中，适宜地，DFM可以是

可从丹尼斯克公司购得，是芽孢杆菌属菌株2084保藏号NRRl B-50013、芽孢杆菌属菌株LSSAO1保藏号NRRL B-50104和芽孢杆菌属菌株15A-P4ATCC保藏号PTA-6507的组合(如US 7,754,469B中所教导——在此引入作为参考)。

在一个实施方案中，DFM可以是地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)。

AgTech Products,Inc.(W227N752Westmound Drive,Waukesha,WI53186,美国)按照布达佩斯条约将以下生物保藏物保藏于美国农业研究机构保藏中心(NRRL)，下文详述原始保藏物的保藏日期和保藏号：

地衣芽孢杆菌BL21	NRRL B-50134	2008年4月15日
			屎肠球菌EF141(EN-1)	NRRL B-30981	2006年10月30日
屎肠球菌2-1d	NRRL B-50519	2011年6月3日
			嗜酸乳杆菌A2020	NRRL B-30977	2006年10月24日
嗜酸乳杆菌A4000h	NRRL B-30978	2006年10月24日
			嗜酸乳杆菌PIBc6	NRRL B-50103	2008年1月18日
短乳杆菌LBR 1000	NRRL B-30982	2006年10月30日
			干酪乳杆菌LC222	NRRL B-30983	2006年10月30日
约氏乳杆菌PLCB6	NRRL B-50518	2011年6月3日
			唾液乳杆菌o246i33w	NRRL B-50102	2008年1月18日
乳酸片球菌PIJe3	NRRL B-50101	2008年1月18日
			乳酸片球菌o246e42	NRRL B-50171	2008年8月29日

AgTech Products,Inc授权杜邦营养生物科学有限公司(Langebrogade 1,PO Box17,DK-1001,Copenhagen K,丹麦)在本专利申请中参考这些保藏的生物材料，并且无保留地且不可撤销地同意所保藏的材料公众可获得。

AgTech Products,Inc.(W227N752Westmound Drive,Waukesha,WI53186,美国)还按照布达佩斯条约将以下生物保藏物保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA 20110-2209,美国)(PTA参考)或美国农业研究机构保藏中心(NRRL参考)，下文详述原始保藏物的保藏日期和保藏号——这些菌株在表格中所列的专利中提到，因此是公开可获得的菌株：

在一个实施方案中，用于本发明的DFM选自：枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)、枯草芽孢杆菌BS278(NRRL 50634)、枯草芽孢杆菌4-7d(NRRL B-50505)、枯草芽孢杆菌3-5h(NRRL B-50507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌BS918(NRRLB-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)、枯草芽孢杆菌B27(NRRL B-50105)、枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)、枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)、枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)、枯草芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌3-12a(NRRL B-50504)、地衣芽孢杆菌4-2a(NRRL B-50506)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、丙酸丙酸杆菌P261(NRRL B-50131)、丙酸丙酸杆菌P179(NRRL B-50133)、丙酸丙酸杆菌P169(PTA 5271)、丙酸丙酸杆菌P170(PTA 5272)、詹氏丙酸杆菌P63(NRRL B-30979)、詹氏丙酸杆菌P195(NRRL B-50132)、乳酸乳球菌ID7(PTA 6103)、乳酸乳球菌JD19(PTA 6104)、嗜酸乳杆菌A2020(NRRL B-30977)、嗜酸乳杆菌A4000h(NRRL B-30978)、嗜酸乳杆菌PIBc6(NRRL B-50103)、短乳杆菌LBR 1000(NRRL B-30982)、干酪乳杆菌LC222(NRRL B-30983)、约氏乳杆菌PLCB6(NRRL B-50518)、唾液乳杆菌o246i33w(NRRL B-50102)、短乳杆菌AJ25(PTA-6099)、短乳杆菌HE17(PTA-6100)、短乳杆菌1E-1(PTA-6509)、乳酸乳杆菌Cl15(PTA-6101)、乳酸乳杆菌DJ6(PTA-6102)、鼠李糖乳杆菌(CNCM I-3698)、香肠乳杆菌(CNCM I-3699)、屎肠球菌EF141(EN-1)(NRRL B-30981)、屎肠球菌2-1d(NRRL B-50519)、乳酸片球菌PIJe3(NRRL B-50101)、乳酸片球菌o246e42(NRRL B-50171)及其组合。

适宜地，DFM可以包含来自酵母菌属物种(Saccharomyces spp)的酵母。

优选地，待按照本发明使用的DFM是通常认为安全且优选经GRAS批准的微生物。

本领域技术人员将容易地认识到来自用于食品和/或农业及通常认为适于动物食用的本文所述属内的微生物的具体物种和/或菌株。

优选地，根据本发明使用的DFM是适于动物食用的DFM。

有利地，若产品是饲料或饲料添加剂组合物，则活的DFM应在零售商提供饲料或饲料添加剂组合物用于销售的整个产品的正常“保质”或“有效”日期期间保持有效。所期望的时间长度以及正常的货架期将因饲料不同而不同，并且本领域技术人员应认识到货架期将取决于饲料类型、饲料尺寸、储存温度、处理条件、包装材料和包装设备而不同。

在一些实施方案中，重要的是，DFM能耐受热，即是耐热的。在将饲料制丸(pelleted)的情形下尤其如此。因此，在一个实施方案中，DFM可以是耐热微生物，例如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。

在一些实施方案中，可以优选的是，DFM是产孢子细菌，如芽孢杆菌，例如芽孢杆菌属物种。在生长条件不利时，芽孢杆菌能够形成稳定的内生孢子，并且其对热、pH、水分和消毒剂具有极强抗性。

在一个实施方案中，适宜地，DFM可减少或防止致病微生物(如产气荚膜梭菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种，优选产气荚膜梭菌和/或大肠杆菌)在肠内定殖。

本发明的DFM可以是任意适宜的DFM。在一个实施方案中，可以用以下测定“DFM测定”来确定微生物成为DFM的适合性。为避免产生疑问，在一个实施方案中，根据本文所教导的“DFM测定”选择作为抑制性菌株(或抗病原体DFM)的DFM是适用于本发明(即根据本发明的饲料添加剂组合物)的DFM。

DFM测定：

将管均由来自代表性簇的代表性病原体接种。

向所接种的管中添加来自以好氧方式或厌氧方式培养的潜在DFM的上清，并孵育。

孵育后，针对每一病原体测量对照管和上清处理管的光密度(OD)。

将与对照相比产生降低OD的(潜在DFM)菌株的菌落分类为抑制性菌株(或抗病原体DFM)。

US2009/0280090(在此引入作为参考)中更详细地解释了本文所用的DFM测定。

优选地，用于测定的代表性病原体是以下中的一个(或多个)：梭菌属，如产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌，和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。在一个优选实施方案中，用以下中的一种或多种进行该测定：产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌和/或大肠杆菌，优选产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌，更优选产气荚膜梭菌。

在一个实施方案中，本发明的DFM优选是抗病原体。

本文所用的术语“抗病原体”意指DFM抵消病原体的效应(例如负面作用)。

在一个实施方案中，为确定DFM是否是本发明的抗病原体，可以使用上述DFM测定。如果在上述“DFM测定”中将DFM分类为抑制性菌株，尤其是在病原体是产气荚膜梭菌时，则将DFM视为抗病原体或抗病原体DFM。

在一个实施方案中，抗病原体DFM可以是以下细菌中的一种或多种：

枯草芽孢杆菌菌株2084，保藏号NRRl B-50013，

枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1，保藏号NRRL B-50104；

枯草芽孢杆菌菌株15A-P4，ATCC保藏号PTA-6507；

枯草芽孢杆菌3A-P4，ATCC保藏号PTA-6506；和

枯草芽孢杆菌菌株BS27，ATCC保藏号NRRL B-50105。

为避免产生疑问，这些菌株是可获得的，并且在US 7,754,459B中提及。

在一个实施方案中，根据本发明使用的DFM不是WO2008/016214中所教导的保藏号为KCTC 10902BP的加氏乳杆菌BNR 17菌株。

优选地，DFM不是灭活微生物。

在一个实施方案中，这里所用的DFM是包含一种或多种本文所述的DFM微生物的组合物。该组合物可另外包含本发明的酶。

可将该组合物作为直接饲喂微生物(DFM)饲喂给动物。

可向DFM中添加一种或多种载体或其他成分。

DFM可以各种物理形式呈现，例如，以表面加料(top dress)形式，以用作液体兽用顿服药或待添加至乳替代品中的水溶性浓缩物、明胶胶囊或凝胶形式。

在表面加料形式的一个实施方案中，将冷冻干燥的发酵产物添加至载体(例如乳清、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干燥淀粉和/或硅铝酸钠)中。

在用于液体兽用顿服药或乳替代品补充剂的水溶性浓缩物的一个实施方案中，将冷冻干燥的发酵产物添加至水溶性载体(如乳清、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、干燥淀粉、硅铝酸钠)中，并且添加液体以形成兽用顿服药或向乳或乳替代品中添加补充剂。

在明胶胶囊形式的一个实施方案中，将冷冻干燥的发酵产物添加至载体(如乳清、麦芽糖糊精、糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干燥淀粉和/或硅铝酸钠)中。

在一个实施方案中，将细菌和载体封闭于可降解明胶胶囊中。在凝胶形式的一个实施方案中，将冷冻干燥的发酵产物添加至载体(如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨醇酯80、丙二醇、丁基化羟基苯甲醚、柠檬酸、乙氧喹(ethoxyquin)和/或人工着色剂)中以形成凝胶。

DFM可以可选地与添加剂(包括但不限于生长基质、酶、糖、糖类、提取物和促生长的微成分)的干燥制剂混合。糖可包括以下：乳糖、麦芽糖、右旋糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、果糖、甘露糖、塔格糖(tagatose)、山梨糖、棉子糖和半乳糖。单独或组合形式的糖的范围为50-95％。提取物可包括酵母或干燥酵母发酵可溶物，范围为5-50％。生长基质可包括：胰蛋白酶解酪蛋白，范围为5-25％；乳酸钠，范围为5-30％；以及Tween 80，范围为1-5％。糖类可包括甘露醇、山梨醇、侧金盏花醇和阿糖醇。单独或组合形式的糖类的范围为5-50％。微成分可包括以下：碳酸钙，范围为0.5-5.0％；氯化钙，范围为0.5-5.0％；磷酸氢二钾，范围为0.5-5.0％；磷酸钙，范围为0.5-5.0％；蛋白锰，范围为0.25-1.00％；和锰，范围为0.25-1.0％。

为制备本文所述的DFM，可将一种或多种培养物和一种或多种载体(若使用的话)添加至带式或桨式混合器，并混合约15分钟，但可增加或减少时间。将各组分混合以使得产生培养物与载体的均匀混合物。最终产物优选为干燥可流动粉末。然后可将DFM或包含DFM的组合物添加至动物饲料或饲料预混物中、添加至动物用的水中，或以本领域已知的其他方式施用(优选与本发明的酶同时施用)。可用本文所述的一种或多种DFM或本文所述的组合物补充动物用饲料。

“至少两种菌株的混合物”意指两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种菌株的混合物。在菌株的混合物的一些实施方案中，比例可自1％变化至99％。菌株的混合物的其他实施方案为25％至75％。菌株的混合物的另外的实施方案是每种菌株大约为50％。在混合物包含两种以上菌株时，菌株可以实质上相等的比例或以不同比例存在于混合物中。

在一个实施方案中，DFM可以是以分离或半分离的形式使用的活的或死的微生物。DFM可以与在其中培养它的生长培养基组合或不组合。

在一个实施方案中，在培养在适当介质上时，DFM能够产生菌落形成单位。该适当介质可以包含饲料或饲料组分(或由其组成)。

在一个实施方案中，在适当介质上培养时，DFM不能产生菌落形成单位。该适当介质可以包含饲料或饲料组分(或由其组成)。

无论DFM在适当介质上培养时是否能够或不能够产生菌落形成单位——细胞仍可以具有代谢活性(例如，即使它们不能分开)。

在一个实施方案中，DFM可以作为死细胞施用。

在一个实施方案中，DFM可以作为活微生物施用。

可适当地加入DFM。

适宜地，饲料中DFM的剂量可介于约1×10³CFU/g饲料至约1×10⁹CFU/g饲料之间，适宜地介于约1×10⁴CFU/g饲料至约1×10⁸CFU/g饲料之间，适宜地介于约7.5×10⁴CFU/g饲料至约1×10⁷CFU/g饲料之间。

在一个实施方案中，DFM是按超过约1×10³CFU/g饲料、适宜地超过约1×10⁴CFU/g饲料、适宜地超过约7.5×10⁴CFU/g饲料加入饲料中。

适宜地，饲料添加剂组合物中DFM的剂量可介于约2×10²CFU/g组合物至约1×10¹⁰CFU/g组合物之间，适宜地介于约1×10³CFU/g组合物至约1×10¹⁰CFU/g组合物之间，适宜地介于约1×10⁴CFU/g组合物至约1×10⁹CFU/g组合物之间，适宜地介于约3.75x10⁴CFU/g组合物至约3x10⁸CFU/g组合物之间。

在一个实施方案中，DFM是按超过约1×10⁵CFU/g组合物、适宜地超过约1×10⁶CFU/g组合物、适宜地超过约3.75×10⁷CFU/g组合物加入饲料添加剂组合物中。

本文所用的术语“CFU”意指菌落形成单位，并且是活细胞的量度，其中菌落代表源自单一祖细胞的细胞聚集体。

肌醇六磷酸酶

本文所用的术语“肌醇六磷酸酶”指催化包括肌醇六磷酸盐和肌醇六磷酸的磷酸酯水解并释放无机磷酸的酶(即具有肌醇六磷酸酶活性的多肽)。

用于本发明的肌醇六磷酸酶可以分为6-肌醇六磷酸酶(分类为E.C.3.1.3.26)或3-肌醇六磷酸酶(分类为E.C.3.1.3.8)。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶可以是6-肌醇六磷酸酶(E.C.3.1.3.26)。

在一个优选实施方案中，用于本发明的肌醇六磷酸酶可以是以下商业产品中的一种或多种中的一种或多种肌醇六磷酸酶：

本文所用的术语共有基因意指用于转化生物体的DNA载体含有基于共有序列的合成肌醇六磷酸酶基因、来自非致病性酵母酿酒酵母的URA基因和大肠杆菌质粒pBR322的复制起点。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶是柠檬酸细菌属肌醇六磷酸酶，其源自：例如WO2006/038062(在此引入作为参考)和WO2006/038128(在此引入作为参考)中所公开的弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter freundii)，优选弗氏柠檬酸细菌NCIMB 41247及其变体；WO2004/085638中所公开的布氏柠檬酸细菌YH-15；WO2006/037328中所公开的布氏柠檬酸细菌ATCC51113(在此引入作为参考)及其在例如WO2007/112739(在此引入作为参考)及WO2011/117396(在此引入作为参考)中所公开的变体；WO2006037327(在此引入作为参考)中所公开的无丙二酸柠檬酸细菌(Citrobacter amalonaticus)，优选无丙二酸柠檬酸细菌ATCC 25405或无丙二酸柠檬酸细菌ATCC 25407；WO2006037327(在此引入作为参考)中所公开的吉氏柠檬酸细菌(Citrobacter gillenii)，优选吉氏柠檬酸细菌DSM13694；或中间柠檬酸细菌(Citrobacter intermedius)、克氏柠檬酸细菌(Citrobacter koseri)、鼠类柠檬酸细菌(Citrobacter murliniae)、啮齿类柠檬酸细菌(Citrobacter rodentium)、塞拉克氏柠檬酸细菌(Citrobacter sedlakii)、沃克曼氏柠檬酸细菌(Citrobacter werkmanii)、杨葛氏柠檬酸细菌(Citrobacter youngae)、柠檬酸细菌属物种的多肽或其变体。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶可以是来自柠檬酸细菌属，例如来自弗氏柠檬酸细菌的肌醇六磷酸酶，如WO2006/038128中所教导的肌醇六磷酸酶，该参考文献在此引入作为参考。

在优选的实施方案中，肌醇六磷酸酶优选是由丹尼斯克公司以商品名PhyzymeXP^TM销售的大肠杆菌肌醇六磷酸酶。

备选地，肌醇六磷酸酶可以是布丘氏菌属肌醇六磷酸酶，例如乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)肌醇六磷酸酶，例如WO 2006/043178、WO2008/097619、WO2009/129489、WO2006/038128、WO2008/092901、PCT/US2009/41011或PCT/IB2010/051804中所教导的肌醇六磷酸酶，所有专利在此引入作为参考。

在一方面，所用的酶是BP17或SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中所示的多肽或其变体，如与之具有至少70％同一性、优选与之具有至少75％同一性、优选与之具有至少80％同一性、优选与之具有至少85％同一性、优选与之具有至少90％同一性、优选与之具有至少95％同一性、优选与之具有至少96％同一性、优选与之具有至少97％同一性、优选与之具有至少98％同一性、优选与之具有至少99％同一性的序列。BP17是布丘氏菌属物种肌醇六磷酸酶的酶变体，且描述于例如WO2008/097619中，该参考文献在此引入作为参考。

在一个实施方案中，所用的酶是BP17，且描述于例如WO2008/097619中。BP17是布丘氏菌属物种肌醇六磷酸酶的酶变体。

BP17的序列(排除信号肽)显示为SEQ ID No.1。BP17的包括信号肽(下划线)的序列显示为SEQ ID No.2。

SEQ ID NO：1：

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

SEQ ID NO：2：

MTISAFNRKKLTLHPGLFVALSAIFSLGSTAYANDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶是AxtraPHY^TM肌醇六磷酸酶。

AxtraPHY^TM肌醇六磷酸酶在本文中也称为BP17肌醇六磷酸酶。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶可以是来自哈夫尼菌属，例如来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的肌醇六磷酸酶，如US2008263688中所教导的肌醇六磷酸酶，该参考文献在此引入作为参考。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶可以是来自曲霉属，例如来自米曲霉的肌醇六磷酸酶。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶可以是来自青霉属，例如来自绳状青霉的肌醇六磷酸酶。

除非文中另有明确说明，术语“肌醇六磷酸酶”可以是一种肌醇六磷酸酶或肌醇六磷酸酶的组合。

优选地，肌醇六磷酸酶以约1500FTU/kg至约20000FTU/kg饲料、适宜地约1500FTU/kg至约10000FTU/kg饲料、适宜地约1500FTU/kg饲料至约5000FTU/kg饲料、适宜地约1500FTU/kg饲料至约3000FTU/kg饲料、更优选约2000FTU/kg饲料至约20000FTU/kg饲料、适宜地约2000FTU/kg饲料至约10000FTU/kg饲料、适宜地约2000FTU/kg饲料至约5000FTU/kg饲料、适宜地约2000FTU/kg饲料至约3500FTU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶按超过约1500FTU/kg饲料、适宜地超过约2000FTU/kg饲料、适宜地超过约3000FTU/kg饲料存在于饲料中。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶按少于约15000FTU/kg饲料、适宜地少于约12000FTU/kg饲料存在于饲料中。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶以约1500FTU/kg至约5000FTU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶以约2000FTU/kg至约5000FTU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在优选实施方案中，肌醇六磷酸酶以约1500FTU/kg至约3000FTU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在更优选的实施方案中，肌醇六磷酸酶以约2000FTU/kg至约3000FTU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶可以按以下存在于饲料添加剂组合物中：

a.在加至(例如厂家推荐的剂量)饲料中的组合物等于或大于50g/公吨(MT)饲料时，按约30,000FTU/g组合物或更多；

b.在加至(例如厂家推荐的剂量)饲料中的组合物等于或大于75g/公吨(MT)饲料时，按约20,000FTU/g组合物或更多；

c.在加至(例如厂家推荐的剂量)饲料中的组合物等于或大于100g/公吨(MT)饲料时，按约15,000FTU/g组合物或更多；

d.在加至(例如厂家推荐的剂量)饲料中的组合物等于或大于100g/公吨(MT)饲料时，按约15,000FTU/g组合物或更多；

e.在加至(例如厂家推荐的剂量)饲料中的组合物等于或大于150g/公吨(MT)饲料时，按约10,000FTU/g组合物或更多；

f.在加至(例如厂家推荐的剂量)饲料中的组合物等于或大于200g/公吨(MT)饲料时，按约7,500FTU/g组合物或更多；

g.在加至(例如厂家推荐的剂量)饲料中的组合物等于或大于300g/公吨(MT)饲料时，按约5,000FTU/g组合物或更多。

适宜地，在肌醇六磷酸酶以上文给出的剂量存在于饲料添加剂组合物中时，直接饲喂微生物以从2.5x10³CFU DFM:1FTU酶至6.7x10⁶CFU:1FTU酶的范围、适宜地以从3.8x10³CFU DFM:1FTU酶至2.0x10⁵CFU:1FTU酶的范围存在于饲料添加剂组合物中。

应理解，如本文所用，1FTU(肌醇六磷酸酶单位)定义为在ISO 2009肌醇六磷酸酶测定(用于测定肌醇六磷酸酶活性的标准测定)中所定义的反应条件下，在一分钟内从底物释放1μmol无机正磷酸所需的酶量，并且1FTU可参见国际标准ISO/DIS 30024:1-17,2009。

在一个实施方案中，适宜地，采用上述E.C.分类对酶进行分类，并且E.C.分类指示在本文所教导的用于测定1FTU的测定中测试时具有该活性的酶。

优势

DFM与酶的相互作用是复杂的，并且不希望受限于理论，十分令人惊奇的是，我们可看到个体对坏死性肠炎的抗性的改善。在本发明之前，尚未出于该具体目的而教导DFM与高肌醇六磷酸酶(例如，如本文所教导)的具体组合。

此外或备选地，就动物表现(例如饲料转化率)而言，在按1500FTU/kg饲料以上加入肌醇六磷酸酶时，DFM(例如抗病原体DFM)与肌醇六磷酸酶的组合存在协同作用。在单独补充肌醇六磷酸酶时，在500和1500FTU/kg饲料下存在表现的提高(即FCR的降低)，在肌醇六磷酸酶剂量超过约1500FTU/kg饲料时存在表现的降低(即FCR的提高)。这在坏死性肠炎攻击的条件下尤其正确。

但是，在将DFM与1500FTU/kg饲料以上的肌醇六磷酸酶组合时，与仅用肌醇六磷酸酶处理相比，表现存在一致的数值增加(即FCR的降低)。在3000FTU/kg饲料和10,000FTU/kg饲料的水平之间，存在大的数值减少，导致所有处理组中最低的FCR。令人惊奇地，DFM(尤其是抗病原体DFM)与超过1500FTU/kg饲料的肌醇六磷酸酶的组合产生协同组合。

本发明的一个优势在于，DFM(例如抗病原体DFM)与高剂量肌醇六磷酸酶的组合显著改善肌醇六磷酸酶在个体中改善动物表现和/或磷保留的功效。

本发明的另一优势在于，DFM(例如抗病原体DFM)与高剂量肌醇六磷酸酶的组合改善了个体中的磷(例如饲粮磷)吸收和保留。此组合作用完全是意料之外的。

本发明的一个优势在于，本发明的饲料添加剂组合物可以避免坏死性肠炎的负面作用或可以用于改善个体对坏死性肠炎的抗性。

不希望受限于理论，肌醇六磷酸酶催化肌醇六磷酸盐(谷类和豆类中的磷的主要储存形式)依序水解成磷酸化程度较低的肌-肌醇衍生物，同时释放无机磷酸。肌醇六磷酸盐的水解导致对肠腔的氨基酸的内源性损失减少。肠中的内源性氨基酸损失减少降低了用于细菌生长的氮的可利用率，这有助于DFM抑制产气荚膜梭菌和其他致病菌的活性。

不希望受限于理论，加入肌醇六磷酸酶并水解肌醇六磷酸盐可以导致小肠(十二指肠、jejenum和/或回肠)的pH提高。肌醇六磷酸酶实际上还可以增加物种大肠杆菌和产气荚膜梭菌的细菌量。这可以与更高的pH相关。本发明已发现，随高剂量肌醇六磷酸酶加入DFM(尤其是抗病原体DFM)可以抵消致病菌的增加。

高剂量肌醇六磷酸酶增加了动物肠道中肌醇六磷酸的水解，其可以对提高磷、钙、能量、蛋白质和其他营养物的消化率及可能对动物表现有利。但是，令人惊奇地，本发明人已发现，在存在临床或亚临床肠病攻击(例如肉鸡中的坏死性肠炎，其常在商业动物生产中发生)时，高剂量的肌醇六磷酸酶不能达到对营养物消化率和动物表现的潜在改善。通过将高剂量肌醇六磷酸酶与抗病原体DFM组合，本发明人惊奇地发现，即使在非常高的肌醇六磷酸酶水平(例如10,000FTU/kg饲料)，动物表现也进一步增强。

与DFM与标准(低)肌醇六磷酸酶剂量的组合和/或DFM单独和/或酶(甚至高剂量肌醇六磷酸酶)单独相比，高剂量肌醇六磷酸酶与DFM的组合令人惊奇地提供了对病原体减少和/或坏死性肠炎和/或饲料转化率、和/或体重增加和/或个体表现和/或减少粪肥中的营养物***的显著改善。

DFM与酶的制剂

可以任意适宜的方式配制DFM和一种或多种酶，以确保制剂包含活的DFM和一种或多种活性酶。

在一个实施方案中，可将DFM和一种或多种酶配制为液体、干粉或颗粒。

干粉或颗粒可通过本领域技术人员已知的手段，例如，在顶喷式流化床涂布器中、在Wurster型底喷式流化床(buttom spray Wurster)中或通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、衣锅包衣或在微成分混合器中制备。

对于一些实施方案，可涂布(例如囊封)DFM和/或酶。适宜地，可将DFM和酶配制于同一涂层内或囊封于同一胶囊中。备选地，可将一种或多种酶配制于一个涂层内或囊封于一个胶囊中，并且可将DFM与一种或多种酶分开配制于涂层中。在一些实施方案中，例如若DFM能够产生内生孢子，则可在无任何涂层的情况下提供DFM。在这些情况下，可简单地将DFM内生孢子与一种或多种酶混合。在后一种情况下，可涂布(例如囊封)一种或多种酶。

在一个实施方案中，涂层保护该一种或多种酶免受热影响并且可视为防热剂。

在一个实施方案中，将饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO2007/044968(称为TPT颗粒)或WO1997/016076或WO1992/012645中所述(每个专利在此引入作为参考)。

在一个实施方案中，可将饲料添加剂组合物配制成用于饲料组合物的颗粒，其包括：芯；活性剂；和至少一个涂层，在选自如下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保留至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制丸方法，b)蒸汽加热的饲料预处理方法，c)储存，d)作为未经制丸的混合物中的成分储存，和e)作为包含至少一种选自如下的化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：痕量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。

关于颗粒，至少一个涂层可包含构成颗粒的至少55w/w％的水分水合材料；和/或至少一个涂层可包括两个涂层。该两个涂层可以是水分水合涂层和水分屏障涂层。在一些实施方案中，水分水合涂层可为颗粒的25w/w％至60w/w％之间并且水分屏障涂层可为颗粒的2w/w％至15w/w％之间。水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精而水分屏障涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。

颗粒可使用饲料制丸方法制备并且饲料预处理方法可在70℃至95℃之间进行至多数分钟，例如85℃至95℃之间。

在一个实施方案中，可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，其包括：芯；活性剂，颗粒的活性剂在储存之后以及在颗粒为成分的蒸汽加热制丸方法之后保留至少80％活性；水分屏障涂层；水分水合涂层，其为颗粒的至少25w/w％，在蒸汽加热制丸方法之前，该颗粒具有小于0.5的水活性。

颗粒可具有选自聚合物和树胶的水分屏障涂层并且水分水合材料可为无机盐。水分水合涂层可为颗粒的25w/w％至45w/w％之间并且水分屏障涂层可为颗粒的2w/w％至10w/w％之间。

颗粒可使用蒸汽加热制丸方法制备，该方法可在85℃至95℃之间进行至多数分钟。

在一些实施方案中，可用稀释剂(例如淀粉粉末、石灰石或诸如此类)稀释DFM(例如DFM内生孢子)。

在一个实施方案中，组合物处于适于食用的液体制剂中，优选地，这种液体食用物含有如下中的一种或多种：缓冲剂、盐、山梨醇和/或甘油。

在另一个实施方案中，可通过将一种或多种酶施加(例如喷涂)于载体基材(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。

在一个实施方案中，本发明的饲料添加剂组合物可配制为预混物。仅作为实例，该预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。

在一个实施方案中，可将用于本发明的DFM和/或一种或多种酶与至少一种选自如下中的至少一者的生理学上可接受的载体一起配制：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及其混合物。

包装

在一个实施方案中，对本发明的饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料进行包装。

在一个优选实施方案中，将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料包装于袋(如纸袋)中。

在备选实施方案中，可将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料密封在容器中。可使用任意适宜的容器。

饲料

本发明的饲料添加剂组合物可用作饲料或用于制备饲料。

术语“饲料(feed)”与“饲料(feedstuff)”在本文中作为同义词使用。

取决于用途和/或应用模式和/或施用方式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式。

在用作(或用于制备)饲料(如功能性饲料)时，本发明组合物可以与下列物质中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅助剂、营养活性成分。

在优选实施方案中，将本发明的饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成饲料。

本文所用的术语“饲料组分”意指饲料的全部或部分。饲料的部分可意指饲料的一种成分或饲料的一种以上(例如2种或3种或4种)成分。在一个实施方案中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。

优选地，饲料可为草料(fodder)或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施方案中，可将本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至草料、草料组分或草料的预混物中。

本文所用的术语草料意指提供给动物(而非动物必须自己觅食)的任意食物。草料涵盖经切割的植物。

术语草料包括青贮饲料、压制和制丸的饲料、油和混合日粮以及发芽谷物和豆类。

草料可从选自如下的植物中的一种或多种获得：大麦、油菜(卡诺拉)、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、小麦和豆类。

术语“复合饲料”意指粗粉、丸粒、坚果、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的具体需求配制这些共混物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养物的完全饲料、提供日粮(ration)(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供附加的微量营养物(如矿物质和维生素)的补充剂。

用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、大豆、高粱、小麦、燕麦和大麦。

适宜地，本文所提及的预混物可以是由微量成分组成的组合物，该微量成分是例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混入商业日粮内的组合物。

本发明的任意饲料可包含一种或多种选自如下的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、湿饼(尤其是基于玉米的湿饼)、干酒糟(DDG)(尤其是基于玉米的干酒糟(cDDG))、干酒糟可溶物(DDGS)(尤其是基于玉米的干酒糟可溶物(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获自如下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

本发明的饲料可含有至少10wt％、至少20wt％、至少30wt％或至少50wt％的玉米和大豆粉或玉米和全脂大豆，或者小麦粉或向日葵粉。

本发明的饲料可以包含约0％至约40％之间的玉米DDGS。如果饲料包含任意玉米DDGS，则它可以包含约5％至约40％之间的玉米DDGS。对于家禽，在存在玉米DDGS时，饲料平均可以包含约7％至约15％之间的玉米DDGS。对于猪，在存在玉米DDGS时，饲料平均可以包含5％至40％的玉米DDGS。

本发明的饲料可以包含玉米作为单种谷物，在这种情况下，饲料可以包含约35％至约80％玉米。

在本发明中，饲料可以是如下中的一种或多种：复合饲料和预混物，其包括丸粒、坚果或(家畜用)饼；农作物或农作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、干椰子肉、谷壳、甜菜废料；鱼粉；肉和骨粉；糖蜜；油渣饼和压滤饼；低聚糖；保存的饲料植物：青贮饲料；海藻；种子和谷物，其为整个或通过碾压或研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

在一些实施方案中，本发明中的术语饲料也涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物食用的植物或动物材料，例如狗食品或猫食品。宠物食品(例如狗和猫食品)可以是干燥形式(如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食品可含有氨基酸牛磺酸。

在一些实施方案中，本发明中的术语饲料也涵盖鱼食品。鱼食品通常含有使养殖鱼保持健康所需的主要营养物、痕量元素和维生素。鱼食品可以是小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大的鱼或底饲物种。一些鱼食品还含有诸如β胡萝卜素或性激素之类的添加剂，以人工增强观赏性鱼的颜色。

在一些实施方案中，本发明中的术语饲料也涵盖鸟食品。鸟食品包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食品。通常，鸟食品由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。

本文所用的术语“接触”是指将本发明的组合物间接或直接施加至产品(例如饲料)中。可使用的施加方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接施加、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。

在一个实施方案中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如饲料)混合。备选地，饲料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。

对于一些应用，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这使得组合物能赋予如下有利特性中的一种或多种：表现益处。

可施加本发明的饲料添加剂组合物以使产品(例如饲料或饲料的原始成分)散布、涂布和/或浸渍有控制量的DFM和一种或多种酶。

DFM和一种或多种酶可同时使用(例如，在它们混合在一起时或甚至在它们通过不同途径递送时)或依序使用(例如，它们可通过不同途径递送)。在一个实施方案中，优选地，同时施加DFM和一种或多种酶。优选地，将DFM与一种或多种酶混合，然后将它们递送至饲料或饲料的原始成分。

本发明的饲料添加剂组合物中的DFM可以适宜的浓度添加——例如最终饲料产品中的浓度可提供约2×10⁵CFU至约2×10¹¹CFU之间、适宜地介于约2×10⁶CFU至约1×10¹⁰CFU之间、适宜地介于约3.75×10⁷CFU至约1×10¹⁰CFU之间的日剂量。

优选地，本发明的饲料添加剂组合物将对最高约70℃、最高约85℃或最高约95℃的热处理是热稳定的。热处理可以进行最多约1分钟、最多约5分钟、最多约10分钟、最多约30分钟、最多约60分钟。术语热稳定的意指在加热至指定温度之前添加剂中存在/有活性的酶成分和/或DFM中的至少约75％在冷却至室温后仍存在/有活性。优选地，在加热至指定温度之前添加剂中存在及有活性的酶组分和/或DFM中的至少约80％在冷却至室温后仍存在及有活性。

在尤其优选的实施方案中，将饲料添加剂组合物均质化以产生粉末。

在备选的优选实施方案中，将饲料添加剂组合物配制成如WO2007/044968中所述的颗粒(称作TPT颗粒)，该专利在此引入作为参考。

在另一优选实施方案中，在将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含涂布在蛋白质芯上的水合屏障盐。这种盐涂层的优势是改善耐热性、改善储存稳定性以及保护免受原本对酶和/或DFM具有不利作用的其他饲料添加剂的影响。

优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或者大于60％的恒定湿度。

优选地，盐涂层包含Na₂SO₄。

制备饲料添加剂组合物的方法还可包括将粉末制丸的另一步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可迫使粉末或包含粉末的混合物通过模具，并将所得到的料条切成可变长度的适宜丸粒。

可选地，制丸步骤可包括在形成丸粒之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调理机中，例如带蒸汽喷射的混合机。将混合物在调理机中加热至指定温度，如从60℃至100℃，典型的温度可为70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间不定，可从数秒钟到数分钟甚至数小时。如5秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。

应当理解，本发明的饲料添加剂组合物适于添加至任意适当的饲料材料中。

本文所用的术语饲料材料指待由动物食用的基础饲料材料。还应理解，这可包含例如至少一种或多种未经加工的谷物，和/或经加工的植物和/或动物材料，如大豆粉或骨粉。

本文所用的术语“饲料”是指已向其添加一种或多种饲料添加剂组合物的饲料材料。

技术人员会认识到，不同的动物需要不同的饲料，甚至同一种动物也可以需要不同的饲料，这取决于饲养该动物的目的。

优选地，饲料可包含这样的饲料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、大米、木薯、高粱和/或任意副产物，以及富含蛋白质的成分，如大豆粉、油菜粉、卡诺拉粉、棉籽粉、葵花籽粉、动物副产物粉及其混合物。更优选地，饲料可包含动物脂肪和/或植物油。

可选地，饲料还可含有附加的矿物质(例如钙)和/或附加的维生素。

优选地，饲料为玉米大豆粉混合物。

在一个实施方案中，优选地，饲料不是宠物食品。

在另一方面，提供用于生产饲料的方法。饲料通常在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成适宜的粒度，然后与适当的添加剂混合。饲料随后可以作为糊料或丸粒制备；后者通常涉及将温度升高至目标水平并随后使饲料通过模具以产生特定尺寸的丸粒的方法。使丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂如脂肪和酶。饲料的制备还可涉及附加的步骤，其包括在制丸之前的挤出或膨胀——特别是通过可包括至少使用蒸汽的适宜技术来进行。

饲料可以是用于单胃动物如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)、猪(所有年龄类别)、宠物(例如犬、猫)或鱼的饲料，优选饲料用于家禽。

在一个实施方案中，饲料并非用于蛋鸡。

仅作为实例，用于鸡(例如肉鸡)的饲料可例如按下表中给出的％包含下表中所列成分中的一种或多种：

成分	开食料(％)	育肥料(％)
			玉蜀黍	46.2	46.7
小麦粗粉	6.7	10.0
			玉蜀黍DDGS	7.0	7.0
大豆粉48％CP	32.8	26.2
			动物/植物脂肪共混物	3.0	5.8
L-赖氨酸HCl	0.3	0.3
			DL-甲硫氨酸	0.3	0.3
L-苏氨酸	0.1	0.1
			盐	0.3	0.4
石灰石	1.1	1.1
			磷酸二钙	1.2	1.2
家禽维生素和微量矿物质	0.3	0.3

仅作为实例，用于鸡(例如肉鸡)的饲粮规格可如下表中所示：

饲粮规格
			粗蛋白(％)	23.00	20.40
家禽代谢能(kcal/kg)	2950	3100
			钙(％)	0.85	0.85
可利用的磷(％)	0.38	0.38
			钠(％)	0.18	0.19
可消化的赖氨酸(％)	1.21	1.07
			可消化的甲硫氨酸(％)	0.62	0.57
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	0.86	0.78
			可消化的苏氨酸(％)	0.76	0.68

仅作为实例，用于蛋鸡的饲料可由下表中所列成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的％：

成分	产蛋期(％)
		玉蜀黍	10.0
小麦	53.6
		玉蜀黍DDGS	5.0
大豆粉48％CP	14.9
		小麦粗粉	3.0
大豆油	1.8
		L-赖氨酸HCl	0.2
DL-甲硫氨酸	0.2
		L-苏氨酸	0.1
盐	0.3
		磷酸二钙	1.6
石灰石	8.9
		家禽维生素和微量矿物质	0.6

仅作为实例，用于蛋鸡的饲粮规格可如下表中所示：

饲粮规格
		粗蛋白(％)	16.10
家禽代谢能(kcal/kg)	2700
		赖氨酸(％)	0.85
甲硫氨酸(％)	0.42
		甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	0.71
苏氨酸(％)	0.60
		钙(％)	3.85
可利用的磷(％)	0.42
		钠(％)	0.16

仅作为实例，用于火鸡的饲料可由下表中所列成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的％：

仅作为实例，用于火鸡的饲粮规格可如下表中所示：

饲粮规格
					粗蛋白(％)	29.35	26.37	22.93	20.00
家禽代谢能(kcal/kg)	2.850	2.900	2.950	3.001
					钙(％)	1.43	1.33	1.22	1.02
可利用的磷(％)	0.80	0.71	0.65	0.53
					钠(％)	0.16	0.17	0.17	0.17
可消化的赖氨酸(％)	1.77	1.53	1.27	1.04
					可消化的甲硫氨酸(％)	0.79	0.71	0.62	0.48
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	1.12	1.02	0.90	0.74
					可消化的苏氨酸(％)	1.03	0.89	0.73	0.59

仅作为实例，用于仔猪的饲料可由下表中所列成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的％：

成分	阶段1(％)	阶段2(％)
			玉蜀黍	20.0	7.0
小麦	25.9	46.6
			黑麦	4.0	10.0
小麦粗粉	4.0	4.0
			玉蜀黍DDGS	6.0	8.0
大豆粉48％CP	25.7	19.9
			干乳清	10.0	0.0
大豆油	1.0	0.7
			L-赖氨酸HCl	0.4	0.5
DL-甲硫氨酸	0.2	0.2
			L-苏氨酸	0.1	0.2
L-色氨酸	0.03	0.04
			石灰石	0.6	0.7
磷酸二钙	1.6	1.6
			猪维生素和微量矿物质	0.2	0.2
盐	0.2	0.4

仅作为实例，用于仔猪的饲粮规格可如下表中所示：

饲粮规格
			粗蛋白(％)	21.50	20.00
猪可消化能(kcal/kg)	3380	3320
			猪净能(kcal/kg)	2270	2230
钙(％)	0.80	0.75
			可消化的磷(％)	0.40	0.35
钠(％)	0.20	0.20
			可消化的赖氨酸(％)	1.23	1.14
可消化的甲硫氨酸(％)	0.49	0.44
			可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	0.74	0.68
可消化的苏氨酸(％)	0.80	0.74

仅作为实例，用于生长猪/肥育猪的饲料可由下表中所列成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的％：

成分	生长料/育肥料(％)
		玉蜀黍	27.5
大豆粉48％CP	15.4
		玉蜀黍DDGS	20.0
麦麸	11.1
		米糠	12.0
卡诺拉籽粉	10.0
		石灰石	1.6
磷酸二钙	0.01
		盐	0.4
猪维生素和微量矿物质	0.3
		赖氨酸-HCl	0.2
植物油	0.5

仅作为实例，用于生长猪/肥育猪的饲粮规格可如下表中所示：

饲粮规格
		粗蛋白(％)	22.60
猪代谢能(kcal/kg)	3030
		钙(％)	0.75
可利用的磷(％)	0.29
		可消化的赖氨酸(％)	1.01
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	0.73
		可消化的苏氨酸(％)	0.66

形式

本发明的饲料添加剂组合物及其他组分和/或包含它们的饲料可以任何合适的形式使用。

本发明的饲料添加剂组合物可以固体或液体制剂或其备选形式使用。固体制剂的例子包括散剂、糊剂、大丸剂、胶囊剂、丸剂、片剂、粉剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的例子包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液剂、混悬剂和乳剂。

在一些应用中，可将本发明的DFM或饲料添加剂组合物与饲料混合或施用于饮用水中。在一个实施方案中，包括进水中的剂量范围为约1×10³CFU/动物/天至约1×10¹⁰CFU/动物/天，更优选约1×10⁷CFU/动物/天。

合适的形式的例子包括如下中的一种或多种：散剂、糊剂、大丸剂、丸粒、片剂、丸剂、胶囊剂、***栓剂、溶液剂或混悬剂，其可含有矫味剂或着色剂，用于即刻释放、延迟释放、调节释放、持续释放、脉冲释放或受控释放应用。

举例而言，如果本发明的组合物以固体(例如丸粒形式)使用，则其也可含有如下中的一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠及某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶及***胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山萮酸酯及滑石粉。

用于制备这些形式的营养上可接受的载体的例子包括(例如)水、盐溶液、醇、有机硅(silicone)、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。

用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。

对于水性混悬剂和/或酏剂而言，可将本发明的组合物与各种甜味剂或矫味剂、着色物质或染料、与乳化剂和/或助悬剂以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油)以及它们的组合进行组合。

非吸水乳清经常用作为DFM(尤其细菌DFM)的载体并且为引发生长的良好介质。

含有细菌DFM的糊剂可与植物油和惰性胶凝成分配制在一起。

真菌产品可与作为载体的谷物副产品配制在一起。

在一个实施方案中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物并不是微粒***(例如WO2005/123034中所教导的微粒***)形式。

给予

本发明的DFM和/或饲料添加剂组合物可设计用于一次给予或设计用于以每日计饲喂。

待用于本发明组合中的组合物(及其中的每种组分)的最佳量将取决于待处理的产品和/或使产品与组合物接触的方法和/或其预期用途。

用于组合物中的DFM和一种或多种酶的量应为足以有效用于以及足以保持足够有效用于改善饲喂含有该组合物的饲料产品的动物的表现的量。

有效性的时间长度应延伸最多至至少利用该产品(例如饲料添加剂组合物或含有其的饲料)的时间。

饲料中DFM与酶的比率可在下面给出的范围内：

DFM：肌醇六磷酸酶(CFU/FTU)：在从2.5x10³CFU DFM:1FTU酶至6.7x10⁶CFU:1FTU酶的范围内；优选在从3.8x10³CFU DFM:1FTU酶至2.0x10⁵CFU:1FTU酶的范围内。

在一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：

(至少)1500FTU/kg饲料的肌醇六磷酸酶；和

至少7.5x10⁴CFU/g至3.0x10⁵CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

在一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：

(至少)2000FTU/kg饲料的肌醇六磷酸酶；和

至少7.5x10⁴CFU/g至3.0x10⁵CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

在一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：

(至少)3000FTU/kg饲料的肌醇六磷酸酶；和

至少7.5x10⁴CFU/g至3.0x10⁵CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

在一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：

(至少)1500FTU/kg饲料的肌醇六磷酸酶；和

至少5x10⁴CFU/g至1x10⁷CFU/g饲料的DFM。

在一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：

(至少)2000FTU/kg饲料的肌醇六磷酸酶；和

至少5x10⁴CFU/g至1x10⁷CFU/g饲料的DFM。

在一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：

(至少)3000FTU/kg饲料的肌醇六磷酸酶；和

至少5x10⁴CFU/g至1x10⁷CFU/g饲料的DFM。

在一个实施方案中，饲料包含以下：

在优选实施方案中，饲料添加剂组合物包含足够的酶和DFM来加入饲料如下：

(至少)1500FTU/kg(例如(至少)2000FTU/kg)饲料的肌醇六磷酸酶；和

75,000CFU/g至150,000CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

(至少)1500FTU/kg(例如(至少)2000FTU/kg)饲料的肌醇六磷酸酶；和

37,500CFU/g至75,000CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

与其他成分的组合

用于本发明中的DFM和一种或多种酶可与其他成分组合使用。因此，本发明还涉及组合。DFM与肌醇六磷酸酶的组合在本文中可称为“本发明的饲料添加剂组合物”。

本发明的组合包含本发明的饲料添加剂组合物(或其一种或多种组分)和适于动物食用且能够为食用者提供医学或生理学益处的另一成分。

在一个实施方案中，优选地，该“另一缝份”并非其他酶或其他DFM。

这些成分可以是益生菌剂。益生菌剂通常是不在上消化道中降解或吸收的非消化性碳水化合物(低聚糖或多糖)或糖醇。用于商业产品中和用于本发明的已知益生菌剂包括菊粉(低聚果糖或FOS)和低聚反式半乳糖(GOS或TOS)。适宜的益生菌剂包括低聚帕拉金糖、大豆低聚糖、海藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊粉、瓜耳胶、低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、不可降解的淀粉、乳蔗糖、乳果糖、乳糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、聚右旋糖(即)、乳糖醇、乳蔗糖、大豆低聚糖、帕拉金糖、低聚异麦芽糖、低聚葡糖糖和低聚木糖、果胶片段、膳食纤维、低聚甘露糖。

膳食纤维可包括非淀粉多糖(例如***糖基木聚糖)、纤维素以及许多其他植物成分，例如抗性糊精、菊粉、木质素、蜡、甲壳质、果胶、β-葡聚糖和低聚糖。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的饲料添加剂组合物(或一种或多种其组分)与益生菌的组合。在另一实施方案中，本发明涉及包含DFM与高剂量肌醇六磷酸酶和益菌元的组合(或基本上由其组成或由其组成)的饲料添加剂组合物。

益生菌可与本发明的饲料添加剂组合物(或其组分)同时(例如，与其一起的混合物或通过相同或不同途径同时递送)或在其之后(例如通过相同或不同途径)施用。

本发明的组合的其他成分包括聚右旋糖(如)和/或麦芽糖糊精和/或乳糖醇。这些其他成分可以可选地添加至饲料添加剂组合物中以辅助干燥过程以及帮助DFM存活。

其他适宜的成分的其他实例包括以下中的一种或多种：增稠剂、胶凝剂、乳化剂、粘合剂、结晶改良剂、甜味剂(包括人造甜味料)、流变改性剂、稳定剂、抗氧化剂、染料、酶、载体、媒介物、赋形剂、稀释剂、润滑剂、矫味剂、着色物质、助悬剂、崩解剂、制粒粘合剂等。这些其他成分可以是天然的。这些其他的成分可通过使用化学和/或酶学技术来制备。

在一个优选实施方案中，用于本发明中的DFM和/或酶可以与一种或多种脂质组合使用。

例如，用于本发明中的DFM和/或酶可以与一种或多种脂质微胶粒组合使用。脂质微胶粒可以是简单脂质微胶粒或复杂脂质微胶粒。

脂质微胶粒可以是两性物质(如脂质和/或油)的取向分子的聚集体。

本文所用的术语“增稠剂或胶凝剂”是指通过减缓或防止粒子(不可混溶液的小滴、空气或不溶性固体)运动而防止分离的产品。在单独的水合分子引起粘度增加，从而减缓分离时，发生增稠。当水合的分子连接而形成可捕获粒子的三维网络，由此使这些粒子固定时发生胶凝。

本文所用的术语“稳定剂”定义为保持产品(例如饲料产品)免于随时间推移而变化的成分或成分的组合。

本文所用的术语“乳化剂”是指防止乳液分离的成分(例如饲料成分)。乳液是两种不混溶的物质，一种以小滴存在，包含于另一者中。乳液可由水包油(其中小滴或分散相是油而连续相是水)或油包水(其中水变成分散相而连续相是油)组成。也可通过使用乳化剂来使泡沫(其是液包气)和混悬液(其为液固混悬液)稳定。

本文所用的术语“粘合剂”是指通过物理或化学反应将产品结合在一起的成分(例如饲料成分)。例如，在“胶凝”期间，水被吸收，从而提供结合效果。然而，粘合剂可吸收其他液体(例如油)，从而将其保持在产品中。在本发明的背景中，粘合剂将通常用于固体或低水分产品(例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包等等)中。

“载体”或“媒介物”意指适合用于施用DFM和/或酶的材料，且包括本领域已知的任意这种材料，例如任意液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、稳定剂等等，其无毒且不以有害方式与组合物的任意成分相互作用。

本发明提供用于制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括将DFM和肌醇六磷酸酶与至少一种选自以下中的至少一者的生理学上可接受的载体混合：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦成分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。

赋形剂的实例包括以下中的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖和高分子量聚乙二醇。

崩解剂的实例包括以下中的一种或多种：淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。

制粒粘合剂的实例包括以下中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和***胶。

润滑剂的实例包括以下中的一种或多种：硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。

稀释剂的实例包括以下中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和丙三醇及其组合。

其他成分可以同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同途径递送)。

优选地，在将本发明的饲料添加剂组合物与另一成分混合时，DFM保持为活的。

在一个实施方案中，优选地，本发明的饲料添加剂组合物不包含铬或有机铬。

浓缩物

用于本发明中的DFM可以是浓缩物形式。通常，这些浓缩物包含相当高浓度的DFM。

本发明的饲料添加剂组合物可具有的活细胞的含量(集落形成单位，CFU)在至少10⁴CFU/g(适宜地包括至少10⁵CFU/g，如至少10⁶CFU/g，例如至少10⁷CFU/g，至少10⁸CFU/g)至约10¹⁰CFU/g(或甚至约10¹¹CFU/g或约10¹²CFU/g)的范围内。

在DFM是浓缩物形式时，本发明的饲料添加剂组合物可具有的活细胞的含量在至少10⁹CFU/g至约10¹²CFU/g、优选至少10¹⁰CFU/g至约10¹²CFU/g的范围内。

浓缩物形式的散剂、颗粒剂和液体组合物可用水稀释或重悬在水或其他适宜的稀释剂(例如适当的生长培养基，如乳或矿物质或植物油)中，以产生可供使用的组合物。

可按照本领域已知的方法制备浓缩物形式的本发明的DFM或饲料添加剂组合物或本发明的组合。

在本发明的一个方面，以浓缩形式的组合物接触酶或饲料。

可通过本领域已知的方法喷雾干燥或冷冻干燥本发明的组合物。

用喷雾干燥方法制备粒子的典型方法涉及溶解于适当溶剂中的固体材料(例如，发酵培养基中的DFM培养物)。备选地，可将材料悬浮或乳化于非溶剂中以形成混悬液或乳液。可以可选地在该阶段添加其他成分(如上文所论述)或诸如抗微生物剂、稳定剂、染料和辅助干燥过程的物质之类的成分。

然后使溶液雾化以形成小滴的细雾。小滴立即进入干燥室中，在其中其接触干燥气体。溶剂从小滴蒸发进入干燥气体中而固化小滴，从而形成粒子。随后从干燥气体分离粒子并收集。

个体

本文所用的术语“个体”意指待施用或已施用本发明的饲料添加剂组合物或包含该本发明的饲料添加剂组合物的饲料的动物。

本文所用的术语“个体”意指动物。

优选地，个体是哺乳动物、鸟、鱼或甲壳类动物，包括例如家畜或驯养动物(例如宠物)。

在一个实施方案中，“个体”是家畜。

本文所用的术语“家畜”是指任意农场动物。优选地，家畜是以下中的一种或多种：反刍动物，如牛(例如奶牛或公牛(包括牛犊))；单胃动物，如家禽(包括肉鸡、鸡和火鸡)、猪(包括仔猪)、鸟；水生动物，如鱼、无胃鱼、有胃鱼、淡水鱼(如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼，例如锦鲤鱼)、海鱼(如海鲈)、甲壳类动物(如虾、贻贝和扇贝)、马(包括赛马)、绵羊(包括羔羊)。

在另一实施方案中，“个体”是驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物。

本文所用的术语“驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物”是指任意相关动物，包括犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、啮齿类动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、鸟、鱼(包括淡水鱼和海鱼)和马。

在一个实施方案中，个体可以受肠病原体攻击。

作为实例，个体的肠或消化道中可以存在一种或多种肠病原体。例如，个体的肠或消化道中可以按这样的水平具有的一种或多种肠病原体，该水平：

i)导致动物的表现的损失；和/或

ii)为临床相关水平；或

iii)为亚临床水平。

肠病原体可以是例如产气荚膜梭菌。

表现

本文所用的“动物表现”可通过饲料效率和/或动物的增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养物的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留和/或通过动物避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过个体的免疫反应来测定。

优选地，“动物表现”通过饲料效率和/或动物的增重和/或饲料转化率来测定。

“改善的动物表现”意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用该饲料添加剂组合物，个体中的饲料效率提高和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养物或能量的消化率改善和/或氮保留改善和/或避免坏死性肠炎的负面影响的能力改善和/或免疫反应改善。

优选地，“改善的动物表现”意指饲料效率提高和/或增重增加和/或饲料转化率降低。

本文所用的术语“饲料效率”是指在一段时间期间不限量饲喂动物或对其饲喂指定量的食物时动物中发生的增重的量。

“提高的饲料效率”意指与在不存在本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用该饲料添加剂组合物导致每单位摄入饲料的增重增加。

饲料转化率(FCR)

本文所用的术语“饲料转化率”是指饲喂给动物来使动物的体重增加规定的量的饲料量。

改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。

“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物体重增加指定量时所需饲喂给动物的饲料量低于在该饲料不包含该饲料添加剂组合物时使动物体重增加相同量时所需的饲料量。

营养物消化率

本文所用的营养物消化率意指从胃肠道或胃肠道的指定区段(例如小肠)消失的营养物的分数。营养物消化率可测量为施用于个体的与从个体粪便中出来的之间的差值，或施用于个体的与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的之间的差值。

本文所用的营养物消化率可通过在一段时间期间收集总***物，测量所摄入营养物与所***的营养物之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃肠道或胃肠道区段中所消失的营养物的量的惰性标记来测量。这种惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为营养物在饲料中的百分比，或表示为可消化的营养物的质量单位/饲料中的营养物的质量单位。

本文所用的营养物消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

本文所用的能量消化率意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)上的剩余消化物的总能量。本文所用的代谢能是指表观代谢能，且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中含有的总能量。能量消化率和代谢能可测量为总能量的摄取与粪便中***的或胃肠道指定区段中存在的消化物中的总能量之间的差值，其使用与测量营养物的消化率相同的方法，针对氮***进行适当校正以计算饲料的代谢能。

氮保留

本文所用的氮保留意指个体从饲粮保留氮作为体重的能力。在氮的***超过每日的摄取时发生负氮平衡并且在损失肌肉时经常观察到该负氮平衡。正氮平衡经常与肌肉生长相关，尤其是与正生长的动物中的肌肉生长相关。

氮保留可借助于在一段时间期间***物和尿的总集测量为所摄取的氮与所***的氮之间的差值。应理解，所***的氮包括来自饲料的未消化蛋白质、内源性蛋白质性***物、微生物蛋白质和尿氮。

存活率

本文所用的术语存活率意指仍活着的个体的数目。术语“改善的存活率”可以是“减少的死亡率”的另一种说法。

屠宰率和产肉率

本文所用的术语屠宰率意指在商业或实验的屠宰过程后，作为活体重量的比例的胴体量。术语胴体意指已因食物而屠宰的动物身体，其中头、内脏、四肢的部分和羽毛或皮肤已去除。本文所用的术语产肉率意指作为活体重量的比例的可食用肉的量，或作为活体重量的比例的切割的指定肉的量。

增重

本发明还提供增加个体(例如家禽或猪)中的增重的方法，其包括给该个体饲喂包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料。

“增加的增重”指与饲喂不存在饲料添加剂组合物的饲料的动物相比较，在饲喂包含该饲料添加剂组合物的饲料时动物具有增加的体重。

增加的增重可以是至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％或至少30％。在一些实施方案中，该改善可以是至少50％或至少100％。

增重的增加可以是就对照而言，在该对照中，所使用的饲料不包含DMF和高剂量(即>1500FTU/kg饲料)肌醇六磷酸酶。在另一方面，增重的增加可以是就包含另一种肌醇六磷酸酶的饲料的使用而言，其中该肌醇六磷酸酶以低剂量(例如<1000FTU/kg饲料)使用。

临床或亚临床肠病攻击

在一个实施方案中，个体中存在临床或亚临床肠病攻击。

术语“临床疾病”意指以足以产生可识别的疾病迹象和症状的解剖学或生理学改变开始的病理条件的历程的阶段。

术语“亚临床疾病”意指或涉及首次注意到症状之前的病程阶段。

肠病可以是个体可以患上的任意肠感染。

在一个实例中，肠病可以由致病生物体(如致病菌)引起。

在一个实施方案中，肠病可以由以下生物体中的一种或多种引起：致病性梭菌属物种，如产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌，和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。

在一个实施方案中，肠病可以由以下病原体中的一种或多种引起：产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌和/或大肠杆菌，优选产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌，更优选产气荚膜梭菌。

坏死性肠炎

坏死性肠炎是世界范围内在鸡、火鸡和鸭中观察到的急性或慢性肠毒血症，其由产气荚膜梭菌引起。坏死性肠炎常表征为通常是中段小肠的纤维素性坏死性肠炎。死亡率可为5％至50％，通常约10％。感染通过粪便-口传播发生。致病生物体的孢子抗性极高。诱病因素包括球虫病、饲粮(高蛋白)、在鸭中可能为重应力、高粘度饲粮(经常与饲粮中包括大量的黑麦和小麦相关)、污染的饲料和/或水、其他衰竭性疾病。

本发明涉及增加个体对坏死性肠炎的抗性的方法。换言之，本发明涉及避免或减轻坏死性肠炎的负面影响。

本文所用的术语“抗性”可涵盖术语“耐受性”。因此，在一个实施方案中，个体可以对坏死性肠炎无抗性但个体可以能够耐受坏死性肠炎，即对个体的表现无负面影响。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的饲料添加剂组合物，其用于在个体中治疗或预防坏死性肠炎。通常，个体可以是已受或将受产气荚膜梭菌和/或艾美球虫属(Eimeria)物种攻击的个体。这种攻击可来自环境，或在饲料或饮用水中施加活微生物，例如在使用活的球虫疫苗时。

在另一个实施方案中，本发明涉及饲料添加剂组合物，其用于在个体中预防和/或治疗球虫病。

本发明还进一步提供预防和/或治疗坏死性肠炎和/或球虫病的方法，其中对个体施用有效量的本发明的饲料添加剂组合物。

免疫反应

本文所用的免疫反应意指DFM调节动物的免疫***的多个方式中之一，包括增加抗体产生、上调细胞介导的免疫、上调促炎细胞因子和增加toll样受体信号发放。应理解，DFM对胃肠道的免疫刺激可以有利于保护宿主抵抗疾病，并且对胃肠道的免疫抑制可以对宿主有利，这是因为较少的营养物和能量被用于支持免疫功能。

优选地，免疫反应是细胞免疫反应。

优选地，通过观察免疫标记来测量免疫反应。

致病菌

本文所用的术语致病菌意指例如产毒性梭菌物种，例如产气荚膜梭菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。在一个实施方案中，致病菌可以是禽致病性大肠杆菌物种。

本发明可减少个体胃肠道中的致病菌种群。

营养物***

在一个实施方案中，本发明涉及减少粪肥中的营养物***。这对减少环境危害具有积极作用。例如，在优选实施方案中，本发明涉及减少个体粪肥中的氮和/或磷含量。因此，这可减少环境中的氮和/或磷的量，这可以是有利的。

益生菌(probiotic)

对于一些应用，认为本发明组合物中的DFM可发挥益生菌培养物效应。向本发明的组合物添加其他益生菌和/或益生菌剂也在本发明的范围之内。

这里，益生菌是：

“非消化性食物成分，其通过选择性刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性而有利地影响宿主”。

本文所用的术语“益生菌培养物”定义活微生物(例如，包括细菌或酵母)，其在例如以足够数量摄入或局部施加时可有利地影响宿主生物体，即通过赋予宿主生物体一种或多种可证实的健康益处。益生菌剂可改善一种或多种粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可为肠、尿道、呼吸道或皮肤。本文所用的术语“益生菌”也涵盖可刺激免疫***的有益分枝且同时减少粘膜表面(例如肠)中的炎性反应的活微生物。

尽管对于益生菌摄取而言，不存在下限或上限，但已提出，至少10⁶-10¹²、优选至少10⁶-10¹⁰、优选10⁸-10⁹cfu作为日剂量将对在个体中达到有益的健康效果有效。

分离的

在一方面，适宜地，本发明中所用的酶或DFM可以是分离的形式。术语“分离的”意指酶或DFM至少实质上不含该酶或DFM在自然界中天然与之相关或见于自然界中的至少一种其他成分。本发明的酶或DFM可以实质上不含该物质原本与之相关的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可实质上不含一或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。

纯化的

在一方面，优选地，本发明的酶和/或DFM是纯化的形式。术语“纯化的”意指酶和/或DFM以高水平存在。酶和/或DFM有利地是组合物中存在的主要成分。优选地，它以至少约90％，或至少约95％或至少约98％的水平存在，该水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重为基础来测定。

在本发明的范围内设想，可以组合本发明的实施方案，使得本文所述的任意特征的组合包括在本发明的范围之内。具体而言，在本发明的范围内设想，可以同时展现细菌的治疗效果中的任一种。

现将参考以下附图和实施例仅以实例的方式描述描述本发明。

实施例

实施例1

方法

从商业孵化场购买总计1600只1日龄Cobb雄性雏鸡。在研究开始时，分区(block)向每一处理鸡舍(pen)分配50只雄性雏鸡。研究由以下处理组成(表1)：

表1.实施例1的实验设计

饲粮处理	产气荚膜梭菌攻击	Phyzyme XP¹	DFM(CFU/g饲料)²
				1	否	500FTU/kg	无
2	是	500FTU/kg	无
				3	是	500FTU/kg	Enviva Pro(7.5x 10⁴CFU/g)
4	是	3000FTU/kg	Enviva Pro(7.5x 10⁴CFU/g)

¹Phyzyme XP是由丹尼斯克公司提供的来自大肠杆菌的6-肌醇六磷酸酶。

²Enviva是由丹尼斯克公司提供的枯草芽孢杆菌菌株Bs2084、LSSAO1和15AP4的组合。

在研究开始、第23天、第35天和结束(第42天)时记录每一鸡舍的鸡重量。鸡舍为测量单元。以碎屑(开食料)或丸粒(生长料和肥育料)形式饲喂肉鸡饲粮。饲粮满足或超过NRC标准(表2)。冲洗混合器以防止饲粮交叉污染。用Davis S-20混合器混合所有处理饲料并用California制丸磨制丸(冷丸粒温度为65℃至70℃)。自每一批次开始、中间以及结束从每一处理饲粮收集样品并共混在一起以确认饲料中的酶活性和Enviva Pro存在。

表2.实施例1的试验饲粮组成

鸡从第0至42天不限量接受适于该处理的饲料。酶和Enviva Pro由Danisco以适合用于所有实验处理的混合物和水平提供。鸡舍排列在设施内防止直接接触，以避免污染。在第23天时由开食料换为生长料。在第35天时用肥育料替代生长料。在每次改变饲料时，分区从鸡舍移取饲喂器，再次称重，清空并重新装入适当的处理饲粮。在研究的最后一天对饲料进行称重。每日针对死亡率检查鸡舍。在鸡被淘汰或发现死亡时，记录日期和移出重量(Kg)。对所有死亡或淘汰的鸡实施肉眼尸检以确定性别和可能的死亡原因。注意坏死性肠炎的迹象。

所有鸡舍均具有大约4英寸厚褥草，其具有一层新鲜松屑。

在将所有鸡放置于鸡舍之前用商业球虫病疫苗(Coccivac-B)对其进行喷雾疫苗接种。在第20、21和22天，除处理1外，对所有鸡给予产气荚膜梭菌的肉汤培养物。采用已知可引起NE且源自商业肉鸡操作的产气荚膜梭菌的野外分离株作为攻击生物体。每天使用新鲜接种物。滴定水平为大约1.0×10^8-9。每一鸡舍接受相同量的接种物。通过混合进管式饲喂器基部中存在的饲料中来施用接种物。在第23天，从每一鸡舍选择5只鸡，实施安乐死，分组称重，并检查坏死性肠炎损伤的存在程度。评分基于0至3分，其中0是正常，而3是最严重(0＝无，1＝轻微，2＝中度，3＝显著/严重；Hofacre等,2003J.Appl.Poult.Res.12:60–64)。在研究期间不使用伴随的药物疗法。

用配对t检验分离平均值。认为在P<0.05下具有显著差异。使用鸡舍作为实验单元。

结果

如从第23天直至试验结束所显示(图1)，产气荚膜梭菌攻击显著减少体重增加。补充Enviva Pro显著改善每个样品日的体重增加至阳性对照的水平。但是，进一步补充高肌醇六磷酸酶剂量(处理10)改善体重至第12、23和35天的显著高于阳性对照的水平和第42天的数值上更大的水平。

如从第23天直至试验结束所示(图2)，产气荚膜梭菌攻击显著提高饲料转化率(FCR)。向饲粮中加入Enviva Pro导致FCR从阴性对照显著降低。但是，补充高肌醇六磷酸酶剂量降低FCR至与阳性对照中所见相同的水平。

补充Enviva Pro使观察到的死亡率降低(图3)，补充高肌醇六磷酸酶剂量使其进一步在数值上降低。这可以解释为产气荚膜梭菌攻击的严重度降低，这为补充高肌醇六磷酸酶剂量时所见的数值上减小的损伤评分所支持(图4)，该评分显著不同于阳性对照的损伤评分。

与使用Enviva Pro与标准(500FTU)剂量的肌醇六磷酸酶相比，利用高肌醇六磷酸酶剂量(3000FTU/kg)与Enviva Pro的组合具有明显的益处，这为降低的FCR和增加的增重所证明。这些益处解释为减少的肠损伤。

实施例2

材料和方法

从商业孵化场购买总计1040只1日龄Cobb x Cobb 500雄性雏鸡。在研究开始时，分区按各处理随机分配10只雏鸡至Petersime鸡笼。仅选择健康鸡用于实验，且在整个研究过程中未替换鸡。研究由以下处理组成(表1)：

表1.实施例2的实验设计

¹Enviva Pro是枯草芽孢杆菌菌株Bs2084、LSSAO1和15AP4的组合，由丹尼斯克公司提供，按75,000CFU/g饲料加入。

²AxtraPhy^TM是来自布丘氏菌属的6-肌醇六磷酸酶，由丹尼斯克公司提供。

在研究开始(第0天)及第13天、第21天和研究结束(第28天)时记录鸡重量。鸡笼为测量单元。饲粮以糊料形式饲喂，并配制为符合或超过NRC标准(表2)。冲洗混合器以防止日粮间交叉污染。自每一批次开始、中间以及结束从每一处理饲粮收集样品并混合在一起用于分析饲料中的酶活性和DFM存在。

表2.实施例2的实验饲粮组成

所有鸡饲喂“商业风格”日粮直至第9天；从第10天起，饲喂处理日粮。在改变饲料时，从鸡舍移取饲喂器，再次称重，清空并重新装入适当的处理饲粮。在研究的最后一天对饲料进行称重。每日针对死亡率检查鸡舍。在鸡被淘汰或发现死亡时，记录日期和移出重量(Kg)。对所有死亡或淘汰的鸡实施肉眼尸检以确定可能的死亡原因。记录坏死性肠炎的迹象。鸡在整个研究期间可获得适当处理的不限量饲料。

按照研究地点标准操作流程(SOP)进行疾病诱导。简言之，在第13天，所有鸡都用巨型艾美球虫(Eimeria maxima)口服接种，接种物含有每只鸡约5,000个卵囊。在第18天，除处理1和3外，所有鸡都接受产气荚膜梭菌的肉汤培养物，该培养物含有约10⁸cfu/ml。所有处理鸡舍接受相同量的接种物。通过混合入饲喂器基部中的饲料中来每天施用一次新鲜产气荚膜梭菌接种物，施用三天(第18、19和20天)。在第21天，从每一鸡舍选择3只鸡，实施安乐死，分组称重，并检查坏死性肠炎损伤的存在程度。评分基于0至3分，其中0是正常，而3是最严重(0＝无，1＝轻微，2＝中度，3＝显著/严重；Hofacre等,2003J.Appl.Poult.Res.12:60–64)。在研究期间不使用伴随的药物疗法。

对于表现数据，使用JMP软件，用ANOVA检验处理的作用，并用配对t检验分离平均值。认为在P<0.05下具有显著差异。使用鸡笼作为实验单元。对于pH和器官重量数据，每只鸡为实验单元。

为了检验相互作用，使用包括肌醇六磷酸酶和Enviva Pro的主效应以及它们的相互作用的因素排列，用ANOVA分析处理(处理4至13)的亚组。

结果

与未受攻击的对照相比，就第21天和第28天的增重(BWG)和饲料转化率(FCR)而言，产气荚膜梭菌显著降低鸡的表现(T1对T2，T3对T4)(表3)。在缺乏产气荚膜梭菌攻击的情况下，饲粮P的减少对第21天或第28天的BWG没有影响。但是，在存在产气荚膜梭菌攻击的情况下，BWG在高P饲粮和低P饲粮间存在显著的数值减少。这些观察结果与FCR的数据一致。

在单独补充肌醇六磷酸酶时，对鸡的表现具有可变影响；但是，在所有情况下，第21天BWG存在数值改善至高于受攻击的低P饲粮(T4)的水平的水平。所获得的结果显示，在坏死性肠炎攻击的条件下，高肌醇六磷酸酶剂量未进一步改善鸡的表现；因为在10,000FTU剂量的肌醇六磷酸酶(T8)下发现仅用肌醇六磷酸酶处理的最低BWG，这显著不同于受攻击的低P饲粮(T4)。同样，在第28天，在单独补充肌醇六磷酸酶时，BWG在高于1500FTU的肌醇六磷酸酶水平下存在数值减小。

在单独补充Enviva Pro(T9)时，第21天BWG从受攻击的低P饲粮(T4)显著改善，并在第28天进一步改善至与未受攻击的低P饲粮无显著差异的水平。就FCR而言，Enviva Pro补充存在从受攻击的对照的显著降低，但不足以完全对抗攻击的负面影响。

组合时，与单独补充肌醇六磷酸酶时相比，在第21天和第28天，高剂量的肌醇六磷酸酶和Enviva Pro均导致就BWG而言更均一的反应。就FCR而言，该组合在第21天(图5)存在协同作用。在单独补充肌醇六磷酸酶时，在500、1500(T7)和3000FTU/kg水平下存在表现的提高(FCR的降低)，而在坏死性肠炎攻击的条件下超过肌醇六磷酸酶剂量时存在表现的降低。但是，在组合中加入益生菌时，与仅用至多且包括3000FTU的水平处理(T12)相比，FCR一致地存在数值减小。但是，在10,000FTU(T13)下，存在大的显著减小，其导致所有处理组中最低的FCR。在具体考察组合的作用(即排除阳性对照T1、T2和T3)时，存在组合对第21天FCR的显著影响(P＝0.0319)(表4)。

饲粮AvP的减少导致胫骨骨灰的显著减少(表3)，胫骨骨灰是磷生物利用率的指示物。产气荚膜梭菌攻击导致胫骨骨灰含量的小的数值减小，这可能是由于感染引起的肠损伤降低了肠有效吸收营养物的能力。单独补充肌醇六磷酸酶导致胫骨骨灰％恢复至与未受攻击的高P饲粮(T1)无显著差异的水平。在单独补充Enviva Pro(T9)时，胫骨骨灰％数值增加至高于未受攻击的低P饲粮(T3)的水平，这证明了该产品就胫骨骨灰的减少而言对抗产气荚膜梭菌攻击的影响的能力，这可以表明肠功能的恢复。在补充该组合时，存在对肌醇六磷酸酶的剂量反应，在3000FTU下达到高于未受攻击的高P饲粮(T1)的水平，在单独补充肌醇六磷酸酶时未观察到这种改善。

表3.处理对表现参数、饲料摄取、增重、饲料转化率和第21天的骨灰数据的影响

表4.肌醇六磷酸酶+Enviva Pro的组合对第21天的FCR的显著影响

产气荚膜梭菌攻击对死亡率和损伤评分具有显著影响(表4)。未受攻击组中死亡率的缺乏和损伤评分的缺乏表明，受攻击组和未受攻击组之间不存在污染。就损伤评分而言，肌醇六磷酸酶和EnvivaPro+肌醇六磷酸酶之间在任意肌醇六磷酸酶水平下都不存在显著差异(T4-8对T9-13)。但是，对于1500(T6)和3000FTU(T7)处理，在仅用肌醇六磷酸酶处理的受攻击的低P饲粮的水平之上存在死亡率的数值增加。EnvivaPro的加入导致死亡率从受攻击的低P饲粮显著降低，与仅用肌醇六磷酸酶处理相比，还降低了组合的肌醇六磷酸酶剂量之间死亡率的变异。

表5.处理对死亡率(％)和坏死性肠炎(NE)损伤评分的影响

实施例3

方法

从商业孵化场购买总计1080只1日龄雏鸡。在研究开始时，分区向每个鸡舍随机分配15只雏鸡。研究由以下处理组成(表1)，每种处理有8个重复鸡舍。

表1：实验设计

¹Enviva是枯草芽孢杆菌菌株Bs2084、LSSAO1和15AP4的组合，由丹尼斯克公司提供。

²Axtra Phy是可从丹尼斯克动物营养公司获得的来自布丘氏菌属的6-肌醇六磷酸酶。

在研究开始(第0天)、第6天、第21天和研究结束(第35天)时记录鸡重量。鸡舍为测量单位。配制饲粮以符合NRC指导(表2)。所有处理饲料均用Davis S-20混合器混合。在饲粮之间冲洗混合器以防止饲粮的交叉污染。自每一批次开始、中间以及结束从每一处理饲粮收集样品，混合，并分析，以确认饲料中的酶活性和DFM存在。饲粮以糊料形式饲喂。

所有鸡舍均具有大约4英寸厚褥草，其具有一层新鲜松屑。所有鸡在放入鸡舍前口服接受商业球虫病疫苗。

表2：实验饲粮组成

所有鸡从第0-6天饲喂商业风格开食料日粮。从第7天起，饲喂适于处理的生长料饲粮直至第21天。从第21天至研究结束(第35天)饲喂适于处理的育肥料饲粮。在改变饲料时，从鸡舍移取饲喂器，再次称重，清空并重新装入适当的处理饲粮。在研究的最后一天对饲料进行称重。每日针对死亡率检查鸡舍。在鸡被淘汰或发现死亡时，记录日期和移出重量(Kg)。

对于表现数据，用配对t检验分离平均值。认为在P<0.05下具有显著差异。使用鸡舍作为实验单元。

结果

单独增加肌醇六磷酸酶的剂量未导致35日龄时饲料转化率(FCR)显著改善。在所有肌醇六磷酸酶水平下加入Enviva Pro降低了FCR。随着肌醇六磷酸酶剂量增加，来自加入Enviva Pro的益处也增加。包含最高水平的肌醇六磷酸酶产生含和不含Enviva Pro的饲粮之间FCR的最大差异。

表3：表现结果

在较高的肌醇六磷酸酶剂量下，与单独补充肌醇六磷酸酶时相比，补充EnvivaPro时存在增重(BWG)的数值增加(表3)。在最低的肌醇六磷酸酶剂量(500FTU)下未观察到此作用。

实施例4

材料和方法

从商业孵化场购买1日龄Cobb雄性雏鸡。在研究开始时，分区向每个鸡笼随机分配10只雄性。每种处理有8个重复鸡笼。研究由以下处理组成(表1)。

表1：实施例4的实验设计

¹HiPhos是Ronozyme HiPhos，包含来自布氏柠檬酸细菌的肌醇六磷酸酶，可从帝斯曼/诺维信公司获得。

²Enviva是枯草芽孢杆菌菌株Bs2084、LSSAO1和15AP4的组合，由丹尼斯克公司提供。

在研究开始(第0天)、第21天和研究结束(第28天)时记录鸡重量。鸡笼为测量单位。饲粮符合或超过NRC标准(表2)。所有处理饲料均用Davis S-20混合器混合。在饲粮之间冲洗混合器以防止饲粮的交叉污染。自每一批次开始、中间以及结束从每一处理饲粮收集样品并共混在一起，以确认饲料中的酶活性和Enviva Pro存在。

表2：实施例4的实验饲粮组成

所有鸡饲喂商业开食料前日粮直至第9天；从第10天起，饲喂处理日粮。在改变饲料时，从鸡笼移取饲喂器，再次称重，清空并重新装入适当的处理饲粮。在研究的最后一天对饲料进行称重。每日针对死亡率检查鸡笼。在鸡被淘汰或发现死亡时，记录日期和移出重量(Kg)。对所有死亡或淘汰的鸡进行肉眼尸检以确定可能的死亡原因。记录坏死性肠炎的迹象。鸡在整个研究期间可获得适当处理的不限量饲料。

按照研究地点标准操作流程(SOP)进行疾病诱导。简言之，在第13天，所有鸡都用巨型艾美球虫口服接种，接种物含有每只鸡约5,000个卵囊。在第18天，除处理1和3外，所有鸡都接受产气荚膜梭菌的肉汤培养物，该培养物含有约10⁸cfu/ml。所有处理鸡舍接受相同量的接种物。通过混合入饲喂器基部中的饲料中来每天施用一次新鲜产气荚膜梭菌接种物，施用三天(第18、19和20天)。在第21天，从每一鸡舍选择3只鸡，实施安乐死，分组称重，并检查坏死性肠炎损伤的存在程度。评分基于0至3分，其中0是正常，而3是最严重(0＝无，1＝轻微，2＝中度，3＝显著/严重；Hofacre等,2003J.Appl.Poult.Res.12:60–64)。在研究期间不使用伴随的药物疗法。

在第21天每个鸡笼测量2只鸡的回肠消化物的pH。通过将Sensorex长矛穿刺pH探针***各节段来测定消化物的pH。在两只鸡中，还取出砂囊，并称重。在第21天，取出两只鸡的右胫骨，在100℃下过夜干燥并称重；然后对样品进行脂肪提取，并在马弗炉中600℃燃烧16小时，以测定不含脂肪的骨灰。然后将百分比骨灰计算为剩余骨灰肿瘤与干燥的无脂肪骨重量的比值乘以100。

统计学分析

对于表现数据，用配对t检验分离平均值。认为在P<0.05下具有显著差异。使用鸡笼作为实验单元。

结果

在坏死性肠炎攻击的情况下，增加HiPhos的剂量导致21日龄饲料转化率提高(图7；每单位增重更多的饲料)。在包含肌醇六磷酸酶的所有水平下加入Enviva Pro导致降低(改善的FCR)。在包含最高水平的肌醇六磷酸酶(3000FTU/kg)下，Enviva Pro的加入逐渐减弱在1500FTU/kg剂量下观察到的FCR提高。

表3：来自实施例4的表现结果

Enviva Pro在肌醇六磷酸酶上的增重作用在高肌醇六磷酸酶剂量(3000FTU/kg)下更显著，其中与未受攻击的对照处理相比，增重无显著差异。

肌醇六磷酸酶对胫骨骨灰百分比的影响与阴性受攻击对照无显著差异，表明甚至在高剂量下，肌醇六磷酸酶对攻击情况下的胫骨骨灰也无显著影响(图8)。但是，如表4中所见，Enviva Pro的加入显著改善胫骨骨灰百分比，使它接近在最高肌醇六磷酸酶剂量(3000FTU/kg)下在阳性未受攻击对照中观察到的百分比。

表4：来自实施例5的其他生理学测量结果

高水平肌醇六磷酸酶(3000FTU/kg)提高第21天的回肠pH超过相关对照，而EnvivaPro的加入使它降低，用Enviva Pro单独处理观察到最低pH。在受攻击阴性对照和最高剂量的Hi Phos(3000FTU/kg)中观察到最低砂囊重量。Enviva Pro的加入在3000FTU/kg剂量下在数值上增加了砂囊重量，但不显著。

攻击显著提高死亡率，肌醇六磷酸酶的加入降低死亡率。与Enviva Pro的组合进一步降低死亡率。

以上说明书中提到的所有出版物在此引入作为参考。对本领域技术人员而言，显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的情况下对所描述的本发明方法和***作出多种修改和变化。尽管已结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应理解，所要求保护的发明不应不当地受限于这类具体实施方案。实际上，所述用于实施本发明的方式的对生物化学和生物技术或相关领域技术人员而言显而易见的多种修改旨在处于以下权利要求的范围之内。

Claims

1.用于改善个体的表现，或用于改善饲料中的原料的消化率，或用于改善氮保留，或用于改善饲粮磷吸收和保留，或用于改善肌醇六磷酸酶的功效，或用于改善饲料转化率(FCR)，或用于改善个体中的增重，或用于改善个体中的饲料效率，或用于调节个体的免疫反应，或用于减少个体的胃肠道中的致病菌的种群，或用于减少粪肥中的营养物***的方法，所述方法包括对个体施用至少一种直接饲喂微生物(DFM)与肌醇六磷酸酶的组合，其中按超过1500FTU/kg饲料的剂量对所述个体施用所述肌醇六磷酸酶。

2.至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶的组合的用途，其中肌醇六磷酸酶按超过1500FTU/kg饲料的剂量使用，用于改善个体的表现，或用于改善饲料中的原料的消化率，或用于改善氮保留，或用于改善饲粮磷吸收和保留，或用于改善肌醇六磷酸酶的功效，或用于改善饲料转化率(FCR)，或用于改善个体中的增重，或用于改善个体中的饲料效率，或用于调节个体的免疫反应，或用于减少个体的胃肠道中的致病菌的种群，或用于减少粪肥中的营养物***。

3.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中直接饲喂微生物是抗病原体直接饲喂微生物。

4.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中直接饲喂微生物是活细菌。

5.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中按超过2000FTU/kg饲料的剂量对所述个体施用所述肌醇六磷酸酶。

6.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中按超过3000FTU/kg饲料的剂量对所述个体施用所述肌醇六磷酸酶。

7.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中组合物包含至少三种直接饲喂微生物。

8.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中直接饲喂微生物是抑制致病微生物的肠内定殖的菌株。

9.权利要求8的方法或用途，其中所述致病微生物是产气荚膜梭菌或大肠杆菌，或两者的组合。

10.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中直接饲喂微生物包含来自以下属中的一个或多个的细菌：芽孢杆菌属、肠球菌属、片球菌属、酵母属、双歧杆菌属、丙酸杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、曲霉属及其组合。

11.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中直接饲喂微生物包含来自以下物种中的一个或多个的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、酿酒酵母、动物双歧杆菌动物亚种、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种、香肠乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、米曲霉、产丙酸丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌及其组合。

12.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中直接饲喂微生物是以下菌株中的一个或多个：枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)、枯草芽孢杆菌BS278(NRRL 50634)、枯草芽孢杆菌4-7d(NRRL B-50505)、枯草芽孢杆菌3-5h(NRRL B-50507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)、枯草芽孢杆菌B27(NRRL B-50105)、枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)、枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)、枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)、枯草芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌3-12a(NRRL B-50504)、地衣芽孢杆菌4-2a(NRRL B-50506)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、产丙酸丙酸杆菌P261 (NRRL B-50131)、产丙酸丙酸杆菌P179(NRRL B-50133)、产丙酸丙酸杆菌P169(PTA 5271)、产丙酸丙酸杆菌P170(PTA 5272)、詹氏丙酸杆菌P63(NRRL B-30979)、詹氏丙酸杆菌P195(NRRL B-50132)、乳酸乳球菌ID7(PTA 6103)、乳酸乳球菌JD19(PTA 6104)、嗜酸乳杆菌A2020(NRRL B-30977)、嗜酸乳杆菌A4000h(NRRL B-30978)、嗜酸乳杆菌PIBc6(NRRL B-50103)、短乳杆菌LBR 1000(NRRL B-30982)、干酪乳杆菌LC222(NRRL B-30983)、氏乳杆菌PLCB6(NRRL B-50518)、唾液乳杆菌o246i33w(NRRL B-50102)、短乳杆菌AJ25(PTA-6099)、短乳杆菌HE17(PTA-6100)、短乳杆菌1E-1(PTA-6509)、乳酸乳杆菌Cl15(PTA-6101)、乳酸乳杆菌DJ6(PTA-6102)、鼠李糖乳杆菌(CNCM I-3698)、香肠乳杆菌(CNCM I-3699)、屎肠球菌EF141(EN-1)(NRRL B-30981)、屎肠球菌2-1d(NRRL B-50519)、乳酸片球菌PIJe3(NRRL B-50101)、乳酸片球菌o246e42(NRRL B-50171)及其组合。

13.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中肌醇六磷酸酶是6-肌醇六磷酸酶或3-肌醇六磷酸酶。

14.权利要求13的方法或用途，其中肌醇六磷酸酶是6-肌醇六磷酸酶。

15.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中肌醇六磷酸酶是大肠杆菌肌醇六磷酸酶，或布丘氏菌属肌醇六磷酸酶，或柠檬酸细菌属肌醇六磷酸酶，或哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶，或曲霉属肌醇六磷酸酶，或青霉属肌醇六磷酸酶，或木霉属肌醇六磷酸酶，或大肠杆菌肌醇六磷酸酶，或汉逊酵母属肌醇六磷酸酶，或隔孢伏革菌属(Peniphora)肌醇六磷酸酶。

16.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中DFM按3.75x10⁷CFU/g饲料至1x10¹¹CFU/g饲料的剂量存在。

17.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中个体中存在临床或亚临床肠病攻击。

18.权利要求17的方法或用途，其中临床或亚临床肠病攻击由致病菌引起。

19.权利要求18的方法或用途，其中所述致病菌是产气荚膜梭菌或大肠杆菌。

20.权利要求1或权利要求2的方法或用途，其中所述消化率是营养物消化率，所述调节个体的免疫反应是改善个体的免疫反应。

21.权利要求20的方法或用途，其中所述营养物消化率是氨基酸消化率。

22.饲料添加剂组合物，其包含至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶的组合，其中肌醇六磷酸酶按以下存在于所述饲料添加剂组合物中：

a.在按至少50g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按30,000FTU/g组合物或更多；

b.在按至少75g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按20,000FTU/g组合物或更多；

c.在按至少100g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按15,000FTU/g组合物或更多；

d.在按至少100g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按15,000FTU/g组合物或更多；

e.在按至少150g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按10,000FTU/g组合物或更多；

f.在按至少200g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按7,500FTU/g组合物或更多；

g.在按至少300g/公吨(MT)饲料加在饲料中时，按5,000FTU/g组合物或更多；

且其中直接饲喂微生物按从2.5x10³CFU DFM:1FTU酶至6.7x10⁶CFU:1FTU酶的范围存在于所述饲料添加剂组合物中。

23.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中直接饲喂微生物按从3.8x10³CFU DFM:1FTU酶至2.0x10⁵CFU:1FTU酶的范围存在于所述饲料添加剂组合物中。

24.权利要求22或权利要求23的饲料添加剂组合物，其中直接饲喂微生物是抗病原体直接饲喂微生物。

25.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中直接饲喂微生物是活细菌。

26.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中组合物包含至少三种直接饲喂微生物。

27.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中直接饲喂微生物是抑制致病微生物的肠内定殖的菌株。

28.权利要求27的饲料添加剂组合物，其中致病微生物是产气荚膜梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌属物种或弯曲杆菌属物种，或其组合。

29.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中直接饲喂微生物包含来自以下属中的一个或多个的细菌：芽孢杆菌属、肠球菌属、片球菌属、酵母属、双歧杆菌属、丙酸杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、曲霉属及其组合。

30.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中直接饲喂微生物包含来自以下物种中的一个或多个的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、酿酒酵母、动物双歧杆菌动物亚种、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种、香肠乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、米曲霉、产丙酸丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌及其组合。

31.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中直接饲喂微生物是以下菌株中的一个或多个：枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)、枯草芽孢杆菌BS278(NRRL 50634)、枯草芽孢杆菌4-7d(NRRL B-50505)、枯草芽孢杆菌3-5h(NRRL B-50507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌LSSA01(NRRL B-50104)、枯草芽孢杆菌B27(NRRL B-50105)、枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)、枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)、枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)、枯草芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、地衣芽孢杆菌3-12a(NRRL B-50504)、地衣芽孢杆菌4-2a(NRRL B-50506)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、产丙酸丙酸杆菌P261(NRRL B-50131)、产丙酸丙酸杆菌P179(NRRL B-50133)、产丙酸丙酸杆菌P169(PTA 5271)、产丙酸丙酸杆菌P170(PTA 5272)、詹氏丙酸杆菌P63(NRRL B-30979)、詹氏丙酸杆菌P195(NRRL B-50132)、乳酸乳球菌ID7(PTA 6103)、乳酸乳球菌JD19(PTA 6104)、嗜酸乳杆菌A2020(NRRL B-30977)、嗜酸乳杆菌A4000h(NRRL B-30978)、嗜酸乳杆菌PIBc6(NRRL B-50103)、短乳杆菌LBR 1000(NRRL B-30982)、干酪乳杆菌LC222(NRRL B-30983)、氏乳杆菌PLCB6(NRRL B-50518)、唾液乳杆菌o246i33w(NRRL B-50102)、短乳杆菌AJ25(PTA-6099)、短乳杆菌HE17(PTA-6100)、短乳杆菌1E-1(PTA-6509)、乳酸乳杆菌Cl15(PTA-6101)、乳酸乳杆菌DJ6(PTA-6102)、鼠李糖乳杆菌(CNCM I-3698)、香肠乳杆菌(CNCM I-3699)、屎肠球菌EF141(EN-1)(NRRL B-30981)、屎肠球菌2-1d(NRRL B-50519)、乳酸片球菌PIJe3(NRRL B-50101)、乳酸片球菌o246e42(NRRL B-50171)及其组合。

32.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中肌醇六磷酸酶是6-肌醇六磷酸酶或3-肌醇六磷酸酶。

33.权利要求32的饲料添加剂组合物，其中肌醇六磷酸酶是6-肌醇六磷酸酶。

34.权利要求22的饲料添加剂组合物，其中肌醇六磷酸酶是大肠杆菌肌醇六磷酸酶，或布丘氏菌属肌醇六磷酸酶，或柠檬酸细菌属肌醇六磷酸酶，或哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶，或曲霉属肌醇六磷酸酶，或青霉属肌醇六磷酸酶，或木霉属肌醇六磷酸酶，或大肠杆菌肌醇六磷酸酶，或汉逊酵母属肌醇六磷酸酶，或隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶。

35.试剂盒，其包含权利要求22至34中任一项的饲料添加剂组合物和使用说明书。

36.制备饲料添加剂组合物的方法，其包括将至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶组合，使得所述组合物中肌醇六磷酸酶的剂量：

a.在按至少50g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为30,000FTU/g组合物或更多；

b.在按至少75g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为20,000FTU/g组合物或更多；

c.在按至少100g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为15,000FTU/g组合物或更多；

d.在按至少100g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为15,000FTU/g组合物或更多；

e.在按至少150g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为10,000FTU/g组合物或更多；

f.在按至少200g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为7,500FTU/g组合物或更多；

g.在按至少300g/公吨(MT)饲料加在饲料中时为5,000FTU/g组合物或更多；

且所述饲料添加剂组合物中所述直接饲喂微生物的剂量在从2.5x10³CFU DFM:1FTU酶至6.7x10⁶CFU:1FTU酶的范围内。

37.权利要求36的方法，其中所述方法还包括包装步骤。

38.权利要求36的方法，其中饲料添加剂组合物中所述直接饲喂微生物的剂量在从3.8x10³CFU DFM:1FTU酶至2.0x10⁵CFU:1FTU酶的范围内。

39.饲料，其包含权利要求22-34中任一项的饲料添加剂组合物。

40.权利要求39的饲料，其中肌醇六磷酸酶按1500FTU/kg饲料和20,000FTU//kg饲料之间的剂量存在。

41.权利要求39或权利要求40的饲料，其中DFM按7.5x10⁴CFU/kg饲料和1x10⁷CFU/kg饲料的剂量存在。

42.制备饲料的方法，其包括将饲料成分与权利要求22-34中任一项的饲料添加剂组合物混合。

43.预混物，其包含饲料添加剂组合物和至少一种矿物质和/或至少一种维生素，所述饲料添加剂组合物含有至少一种直接饲喂微生物与肌醇六磷酸酶的组合，其中肌醇六磷酸酶按以下存在于所述预混物中：

且所述直接饲喂微生物按从2.5x10³CFU DFM:1FTU酶至6.7x10⁶CFU:1FTU酶的范围存在于所述预混物中。

44.预混物，其包含权利要求22-34中任一项的饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素的组合。

45.权利要求22-34中任一项的饲料添加剂组合物、权利要求43或44的预混物或权利要求39-41中任一项的饲料在制备用于预防和/或治疗坏死性肠炎和/或球虫病的药物中的用途。