CN103533843A

CN103533843A - 饲料添加剂组合物

Info

Publication number: CN103533843A
Application number: CN201280008891.4A
Authority: CN
Inventors: L·F·R·米兰
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2014-01-22
Also published as: WO2012110778A3; CA2825618A1; TW201234977A; AR084893A1; DK2675286T3; AU2012216898A1; BR112013020684B1; US10695384B2; BR112013020684A2; ES2621137T3; AU2016201761A1; US20140234279A1; US20190076488A1; PL2675286T3; CA2825618C; AU2016201761B2; EP2675286A2; GB201102857D0; ZA201305269B; EP2675286B1

Abstract

本发明公开了包含直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合的饲料添加剂组合物；以及用于改善受试者的性能、或改善饲料中的原料的消化率（例如营养物质消化率，如氨基酸消化率）、或改善氮保留量、或避免坏死性肠炎的负面影响、或改善饲料转化率(FCR)、或改善受试者中的增重、或改善受试者中的饲料效率、或调节（例如改善）所述受试者的免疫应答、或促进受试者的胃肠道中的有益细菌生长，所述方法包含向受试者施用直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合。

Description

饲料添加剂组合物

技术领域

本发明涉及使用直接饲喂微生物与特定酶组合的组合改善饲料组合物的方法，以及涉及包含直接饲喂微生物与特定酶组合的组合的饲料添加剂组合物。本发明进一步涉及用途和试剂盒。

背景技术

补充酶被作为动物饲料（尤其是家禽和猪饲料）的添加剂、用作改善营养物质利用和生产性能特性的手段。酶共混物可用于改善含有大豆粉、动物蛋白粉或高纤维食物副产品的饲粮的营养价值。

直接饲喂微生物(DFM)的概念涉及在动物（例如奶牛）处于长期胁迫（疾病、日粮变化、环境或生产攻击）下时给其饲喂有益微生物。益生菌是该类饲料添加剂的另一术语。在受控研究中已显示益生菌或DFM可改善动物性能。DFM包括直接饲喂细菌和或基于酵母的产品。

尽管已考虑DFM与一些酶的组合，但从来没有完全了解DFM与酶之间的相互作用。本发明涉及新型的特定组合，其令人惊奇地显著改善动物的生产性能特性。

发明内容

本发明的一个开创性发现是，DFM与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合对动物的性能具有显著的有益效果。

具体而言，本发明的开创性发现是DFM与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合对动物的性能具有显著有益效果，包括改善如下中的一者或多者：饲料转化率(FCR)、消化原料的能力（例如营养物质消化率，如氨基酸消化率）、氮保留量、存活率、屠宰率、生长速率、增重、饲料效率、动物对坏死性肠炎的抗性、受试者的免疫应答或有益细菌在受试者胃肠道中的生长。

本发明的另一惊人效果为其可减少粪肥(manure)中的营养***（例如减少受试者的粪肥中的氮和磷含量）。

在一个方面中，本发明提供饲料添加剂组合物，其包含直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合（或基本上由其组成或由其组成）。

在另一方面中，本发明提供用于如下的方法：改善受试者的性能或改善饲料中的原料的消化率（例如营养物质消化率，如氨基酸消化率），或改善氮保留量，或避免坏死性肠炎的负面影响或改善饲料转化率(FCR)或改善受试者的增重或改善受试者中的饲料效率或调节（例如改善）受试者的免疫应答，或促进受试者的胃肠道中的有益细菌生长，或减少受试者胃肠道中的致病菌群体，或减少粪肥中的营养***，该方法包含向受试者施用直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合。

本发明的又一另外方面是直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合的用途，其用于改善受试者的性能或改善饲料中的原料的消化率（例如营养物质消化率，如氨基酸消化率），或改善氮保留量，或避免坏死性肠炎的负面影响，或改善饲料转化率(FCR)，或改善受试者的增重或改善受试者中的饲料效率，或调节（例如改善）受试者的免疫应答，或促进受试者的胃肠道中的有益细菌生长，或减少受试者胃肠道中的致病菌群体，或减少粪肥中的营养***。

在本发明的又一方面中，提供包含直接饲喂微生物、蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶（以及任选的至少一种维生素和/或任选的至少一种矿物质）和施用说明书的试剂盒。

在另一个方面，本发明提供制备饲料添加剂组合物的方法，包括将直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶混合以及（任选地）进行包装。

在又一另外的方面中，本发明提供包含饲料添加剂组合物的饲料(feed,feedstuff)，该饲料添加剂组合物包含直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合（或基本上由其组成或由其组成）。

预混物包含饲料添加剂组合物和至少一种矿物质和/或至少一种维生素，该饲料添加剂组合物包含直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合（或基本上由其组成或由其组成）。

在另一方面中，本发明提供制备饲料的方法，其包括将饲料组分与饲料添加剂组合物混合，该饲料添加剂组合物包含直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合（或基本上由其组成或由其组成）。

在又一个方面，本发明涉及饲料添加剂组合物，其用于预防和/或治疗受试者的球虫病和/或坏死性肠炎。

本发明还进一步提供预防和/或治疗坏死性肠炎和/或球虫病的方法，其中给受试者施用有效量的根据本发明的饲料添加剂组合物。

附图说明

图1显示，DFM（Enviva

可得自丹尼斯克公司(Danisco A/S)）与木聚糖酶（例如来自木霉(Trichoderma)木聚糖酶的内切木聚糖酶）、淀粉酶（例如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶）、蛋白酶（例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蛋白酶）和植酸酶（例如500FTU/kg的Phyzyme XP（大肠杆菌植酸酶），可得自丹尼斯克公司）的组合的组合与攻击对照相比显著改善（降低）了动物肠中的坏死性肠炎损伤评分。在一些实施例中，木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶可一起配制于[含有2000XU木聚糖酶/kg饲料；200AU淀粉酶/kg饲料和4000PU蛋白酶/kg饲料]（也购自丹尼斯克公司）中。

图2显示，（可得自丹尼斯克公司的Enviva

）与木聚糖酶（例如来自木霉木聚糖酶的内切木聚糖酶）、淀粉酶（例如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶）、蛋白酶（例如枯草芽孢杆菌蛋白酶）和植酸酶（例如500FTU/kg的Phyzyme XP（大肠杆菌植酸酶），可得自丹尼斯克公司）的组合的组合与攻击对照相比显著改善了经产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)攻击的肉鸡的体重增加（BW增加）–甚至导致BW增加的改善高于阴性对照（即未攻击对照）。这显著优于任何其他酶组合例如淀粉酶和植酸酶，或蛋白酶和植酸酶，并且显著优于施加于攻击对照的DFM。在一些实施例中，木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶可一起配制于

[含有2000XU木聚糖酶/kg饲料；200AU淀粉酶/kg饲料和4000PU蛋白酶/kg饲料]（也购自丹尼斯克公司）中。合并SEM=28.6

图3显示，（可得自丹尼斯克公司的Enviva

）与木聚糖酶（例如木霉木聚糖酶的内切木聚糖酶）、淀粉酶（例如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶）、蛋白酶（例如枯草芽孢杆菌蛋白酶）和植酸酶（例如500FTU/kg的Phyzyme XP（大肠杆菌植酸酶），得自丹尼斯克公司）的组合的组合使经产气荚膜梭状芽孢杆菌攻击的肉鸡中的饲料转化率(FCR)（g摄取饲料/g BW增加）显著改善至未经攻击的鸡的水平。这显著优于酶与DFM的其他组合，例如淀粉酶和植酸酶，或蛋白酶和植酸酶。在一些实施例中，木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶可一起配制于

[含有2000XU木聚糖酶/kg饲料；200AU淀粉酶/kg饲料和4000PU蛋白酶/kg饲料]（也可得自丹尼斯克公司）中。

图4示出了用作肠炎症的标记的IFN-g的相对mRNA表达，并且显示，DFM(Enviva

)与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶的组合（可得自丹尼斯克公司的Avizyme

+500FTU/kgPhyzyme XP（大肠杆菌植酸酶））的组合在11天时增加了IFN-g的表达，并且在20天时降低IFN-g的表达。

图5示出了表观回肠可消化能(mCal/kg)且显示，DFM(Enviva)与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶（使用两种不同的酶混合物，第一种是得自丹尼斯克公司的Avizyme+500FTU/kg Phyzyme XP（大肠杆菌植酸酶）；第二种是也得自丹尼斯克公司的AxtraXAP[含有2000XU木聚糖酶/kg饲料；200AU淀粉酶/kg饲料和4000PU蛋白酶/kg饲料]+500FTU/kg Phyzyme XP（大肠杆菌植酸酶））的组合显著改善了能量消化率效果。

图6示出了利用DFM(Enviva

)与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶的组合显著改善的氨基酸消化率。利用DMF与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶的组合对回肠水平上氨基酸的未消化部分的消化率的改善大于单独的DFM或无DFM的木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶的组合的改善。

图7示出了利用DFM(Enviva)与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶的组合改善的能量消化率。

图8示出了饲喂给17至21日龄的肉鸡的饲粮处理的氮校正表观代谢能AMEn。

图9显示，DFM(Enviva)与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶（使用两种不同的酶混合物，第一种是可得自丹尼斯克公司的Avizyme

+500FTU/kg Phyzyme XP（大肠杆菌植酸酶）；第二种是也可得自丹尼斯克公司的AxtraXAP+500FTU/kg Phyzyme XP（大肠杆菌植酸酶））的组合显著改善了氮保留量。

图10显示，DFM(Enviva

)与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶（可得自丹尼斯克公司的Avizyme+Phyzyme XP（大肠杆菌植酸酶））的组合与攻击对照处理和未攻击对照处理相比，显著降低了在孵化时用过剂量的球虫疫苗处理的第14天的回肠粘膜刮屑中的MUC-2的mRNA丰度。

图11示出了来自地衣芽孢杆菌的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 1)。

图12示出了来自地衣芽孢杆菌的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的核苷酸序列(SEQ ID No. 2)。

图13示出了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 3)。

图14示出了来自里氏木霉的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的核苷酸序列(SEQ ID No. 4)。

图15示出了48日龄肉鸡的饲料转化率。

图16示出了在23日龄时所有空肠处理的所关注基因的表达谱的热图。

未攻击对照=未攻击对照+植酸酶

CC=攻击对照+植酸酶

CC+淀粉酶=攻击对照+植酸酶+淀粉酶

CC+XAP=攻击对照+植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶

CC+EP=攻击对照+植酸酶+Enviva Pro

CC+EP+淀粉酶=攻击对照+植酸酶+淀粉酶+Enviva Pro

CC+EP+XAP=攻击对照+植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+EnvivaPro。

图17示出了在23日龄时所有胰腺处理的鸡α淀粉酶的表达谱的热图。

未攻击对照=未攻击对照+植酸酶

CC=攻击对照+植酸酶

CC+淀粉酶=攻击对照+植酸酶+淀粉酶

CC+XAP=攻击对照+植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶

CC+EP=攻击对照+植酸酶+Enviva Pro

CC+EP+淀粉酶=攻击对照+植酸酶+淀粉酶+Enviva Pro

CC+EP+XAP=攻击对照+植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+EnvivaPro。

图18示出了21日龄肉鸡的通过氮保留量校正的表观代谢能(AME_n)。DFM的效应；P<0.001；酶的效应；P<0.001；DFM x酶的效应；P=0.27；合并SEM=32kcal。

图19示出了坏死性肠炎攻击模型中肉鸡的饲料转化率(FCR)（合并SEM：0.015）。

图20示出了第21天时肉鸡空肠中的乳杆菌属(Lactobacillus)物种的相对比例，ChSq<0.0001。

具体实施方式

优选地，本发明中所用酶中的每一者对于DFM而言是外源性的。换而言之，优选将酶添加至DFM中或与其混合。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY（《微生物学和分子生物学词典》），第20版，纽约约翰威立国际出版公司(John Wiley and Sons,New York)(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供关于本发明中所用的多个术语的一般性词典。

本公开并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开的实施例的实施或测试。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则分别是，任何核酸序列从左至右以5′至3′取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。

本文提供的标题并非是对本公开的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。

氨基酸在本文中用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代。

本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。

本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission onBiochemical Nomenclature,JCBN)的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。

术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施例的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。

在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值（至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定）也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开中。

必须指出，本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义，除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提到“酶”则包括多个这种候选物质，而提到“饲料”则包括提到一种或多种饲料以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。

本文论述的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不能被解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。

用于本发明的酶可通过固体培养或深层培养来产生，包括分批工艺、补料分批工艺和连续流工艺。培养在培养基中完成，该培养基包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳和能源物质、分子氧以及当然还有待使用的一种或多种特定微生物物种的起始种菌。

直接饲喂微生物(DFM)

本文中的术语“微生物(microbial)”可与“微生物体(microorganism)”互换使用。

优选地，DFM包含活微生物。优选地，DFM包含活细菌或活酵母或活真菌。

在一个优选的实施例中，DFM包含活细菌。

术语“活微生物”意指具有代谢活性或能够分化的微生物。

在一个实施例中，DFM可为孢子形成细菌并因而，术语DFM可由孢子，例如细菌孢子组成或含有孢子，例如细菌孢子。因此，在一个实施例中，本文所用的术语“活微生物”可包括微生物孢子，如内生孢子或分生孢子。

在另一个实施例中，本发明的饲料添加剂组合物中的DFM不由微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子组成，或不含有微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子。

微生物可为天然微生物或其可为转化微生物。微生物也可为合适的微生物的组合。

在一些方面中，根据本发明的DFM可为如下中的一种或多种：细菌、酵母或真菌。

优选地，根据本发明的DFM是益生菌微生物。

在本发明中，术语直接饲喂微生物(DFM)涵盖直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂酵母以及它们的组合。

优选地，DFM是直接饲喂细菌。

优选地，DFM是包含两种或更多种细菌（例如三种或更多种或者四种或更多种）的组合；或者DFM为包含两种或更多种细菌菌株（例如三种或更多种或者四种或更多种）的组合。

优选地，细菌是分离的。

合适地，DFM可包含来自一个或多个如下属的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌(Enterococcus）、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和巨球形菌属(Megasphaera)以及它们的组合。

在一个实施例中，DFM可选自如下芽孢杆菌属物种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

在一个实施例中，DFM可为包含两种或更多种芽孢杆菌属菌株的组合。

在一个实施例中，DFM可为枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)、BS18(NRRL B-50633)和BS278(NRRL B-50634)中的两种或更多种的组合。

菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)和22C-P1(PTA-6508)可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)公开获得。

菌株2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRLB-50105)可从美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural ResearchService Culture Collection,NRRL)公开获得。菌株枯草芽孢杆菌LSSA01有时候称为枯草芽孢杆菌8。

这些菌株在US7,754,469B2中进行了教导。

枯草芽孢杆菌BS18和枯草芽孢杆菌BS278分别以保藏号NRRLB-50633和NRRL B-50634由美国(W227N752Westmound Dr.Waukesha,WI53186)的Andy Madisen或美国(W227N752Westmound Dr.Waukesha,WI53186)的丹尼斯克美国公司(Danisco USA Inc.)于2012年1月9日按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏于美国(1815North UniversityStreet,Peoria,Illinois61604)的美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection,NRRL)。

美国(W227N752Westmound Dr.Waukesha,WI53186)的Andy Madisen和美国(W227N752Westmound Dr.Waukesha,WI53186)的丹尼斯克美国公司授权丹麦的丹尼斯克公司(Langebrogade1,PO Box17,DK-1001,Copenhagen K)在本专利申请中参考这些保藏的生物材料并且无保留地且不可撤销地同意将所述保藏材料成为可公共获得的。

在一些实施例中，DFM可为包含枯草芽孢杆菌菌株的组合，如下表中详细描述：

在一个实施例中，DFM可选自如下乳球菌属：乳脂链球菌(Lactococcuscremoris)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)以及它们的组合。

在一个实施例中，DFM可选自如下乳杆菌属物种：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)、双叉乳酸杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillusparaplantarum)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)以及它们任一者的组合。

在一个实施例中，DFM可选自如下双歧杆菌属物种：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双岐杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacteriumcatenulatum)、假链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)以及它们任一者的组合。

合适地，DFM可包含来自一个或多个如下物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双岐杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、特恩氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)、动物双岐杆菌动物亚种(Bifidobacteriumanimalis ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius ssp.Salivarius)、丙酸杆菌属物种以及它们的组合。

本发明中所用的直接饲喂细菌可属于相同类型（属、种和菌株）或可包含属、种和/或菌株的混合物。

合适地，本发明的DFM可为如下表中的那些产品或包含于那些产品中的微生物中的一种或多种：

在一个实施例中，合适地，DFM可为Enviva

Enviva

可从丹尼斯克公司商购获得并且是登录号为NRRl B-50013的芽孢杆菌属菌株2084、登录号为NRRL B-50104的芽孢杆菌属菌株LSSAO1和ATCC登录号为PTA-6507的芽孢杆菌属菌株15A-P4的组合（如US7,754,469B中所教导的–将该专利以引用方式并入本文）。

合适地，DFM可包含来自属：酵母菌属(Saccharomyces)物种的酵母。

优选地，待根据本发明使用的DFM是通常认为安全且优选经GRAS批准的微生物。

本领域技术人员将容易地认识到来自用于食品和/或农业工业及通常认为适于动物食用的本文所述属内的微生物的具体物种和或菌株。

优选地，根据本发明使用的DFM是适于动物食用的DFM。

有利的是，若产品是饲料或饲料添加剂组合物，则活的DFM应在零售商提供饲料或饲料添加剂组合物用于销售的整个产品的正常“保质”或“有效”日期期间保持有效。所期望的时间长度以及正常的架存期将因饲料不同而有所变化并且那些本领域技术人员应认识到架存期将视饲料类型、饲料尺寸、储存温度、处理条件、包装材料和包装设备而有所变化。

在一些实施例中，重要的是，DFM能耐受热，即是耐热的。在将饲料制丸(pelleted)的情形下尤其如此。因此，在一个实施例中，DFM可为耐热微生物，例如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。

在一些实施例中，可能优选的是DFM是产孢子细菌，例如杆菌(Bacilli)，如芽孢杆菌属物种。在生长条件不利时，杆菌能够形成稳定的内生孢子，并且其对热、pH、水分和消毒剂具有极强抗性。

在一个实施例中，合适的是，DFM可减少或防止病原体微生物（例如产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属(Salmonella)物种和/或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种）在肠内定植。

根据本发明的DFM可为任何合适的DFM。在一个实施例中，可使用如下测定法“DFM测定法”确定微生物成为DFM的合适性。为避免产生疑问，在一个实施例中，根据本文所教导的“DFM测定法”选择作为抑制性菌株（或抗病原体DFM）的DFM是适用于本发明中（即根据本发明的饲料添加剂组合物中）的DFM。

DFM测定法：

将管各自用来自代表性簇的代表性病原体接种。

向接种管中添加以好氧方式或厌氧方式生长的潜在DFM的上清液并温育。

在温育后，针对每一病原体测量对照和上清液处理的管的光密度(OD)。

将与对照相比产生降低OD的（潜在DFM）菌株的菌落分类为抑制性菌株（或抗病原体DFM）。

US2009/0280090（以引用方式并入本文）中更详细地解释了本文所用的DFM测定法。

优选地，测定法中所用的代表性病原体为如下中的一者（或多者）：梭状芽孢杆菌属，例如产气荚膜梭状芽孢杆菌和/或艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。在一个优选的实施例中，利用如下中的一种或多种进行该测定法：产气荚膜梭状芽孢杆菌和/或艰难梭状芽孢杆菌和/或大肠杆菌，优选产气荚膜梭状芽孢杆菌和/或艰难梭状芽孢杆菌，更优选产气荚膜梭状芽孢杆菌。

在一个实施例中，本发明的DFM优选为抗病原体。

本文所用的术语“抗病原体”意指DFM抵消病原体的效应（负面影响）。

在一个实施例中，要确定DFM是否为抗病原DFM，可使用上述DFM测定法。如果在上述“DFM测定法”中将DFM分类为抑制性菌株，例如在病原体为产气荚膜梭状芽孢杆菌时，则将DFM视为抗病原体或抗病原DFM。

在一个实施例中，抗病原体DFM可以是如下细菌中的一种或多种：枯草芽孢杆菌菌株2084，登录号为NRRL B-50013；

枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1，登录号为NRRL B-50104；

枯草芽孢杆菌菌株15A-P4，ATCC登录号为PTA-6507；

枯草芽孢杆菌3A-P4，ATCC登录号为PTA-6506；和

枯草芽孢杆菌菌株BS27，ATCC登录号为NRRL B-50105。

为避免产生疑问，这些菌株可是可获得的并且在US7,754,459B中提及。

在一个实施例中，根据本发明使用的DFM并非如WO2008/016214中所教导的登录号为KCTC10902BP的加氏乳杆菌BNR17菌株。

优选地，DFM并非灭活微生物。

在一个实施例中，这里所用的DFM是包含一种或多种本文所述DFM微生物的组合物。该组合物可另外包含本发明的酶。可将该组合物作为直接饲喂微生物(DFM)饲喂给动物。可向DFM中添加一种或多种载体或其他成分。DFM可以各种物理形式呈现，例如，以表面加料(top dress)形式，以用作液体兽用顿服药或待添加至代乳品中的水溶性浓缩物、明胶胶囊或凝胶形式。在表面加料形式的一个实施例中，将冷冻干燥的发酵产物添加至载体（例如乳清、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石（碳酸钙）、稻壳、酵母培养物、干燥淀粉和/或硅铝酸钠）中。在用于液体兽用顿服药或代乳品补充剂的水溶性浓缩物的一个实施例中，将冷冻干燥的发酵产物添加至水溶性载体（例如乳清、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、干燥淀粉、硅铝酸钠）中，并且添加液体以形成兽用顿服药或向乳或代乳品中添加补充剂。在明胶胶囊形式的一个实施例中，将冷冻干燥的发酵产物添加至载体（例如乳清、麦芽糖糊精、糖、石灰石（碳酸钙）、稻壳、酵母培养物、干燥淀粉和/或硅铝酸钠）中。在一个实施例中，将细菌和载体封闭于可降解明胶胶囊中。在凝胶形式的一个实施例中，将冷冻干燥的发酵产物添加至载体（例如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨醇酯80、丙二醇、丁基化羟基苯甲醚、柠檬酸、乙氧喹(ethoxyquin)和/或人工着色剂）中以形成凝胶。

DFM可任选与添加剂（包括但不限于生长基质、酶、糖、碳水化合物、提取物和促生长的微成分）的干燥制剂混合。糖可包括如下：乳糖、麦芽糖、右旋糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、果糖、甘露糖、塔格糖(tagatose)、山梨糖、棉子糖和半乳糖。单独的或以组合形式的糖的范围为50-95%。提取物可包括酵母或干燥酵母发酵可溶物，范围为5-50%。生长基质可包括：胰蛋白酶解酪蛋白，范围为5-25%；乳酸钠，范围为5-30%；以及Tween80，范围为1-5%。碳水化合物可包括甘露醇、山梨醇、侧金盏花醇和阿糖醇。单独的或组合形式的碳水化合物的范围为5-50%。微成分可包括如下：碳酸钙，范围为0.5-5.0%；氯化钙，范围为0.5-5.0%；磷酸氢二钾，范围为0.5-5.0%；磷酸钙，范围为0.5-5.0%；蛋白锰，范围为0.25-1.00%；和锰，范围为0.25-1.0%。

为制备本文所述的DFM，可将培养物和载体（若使用的话）添加至带式或桨式混合器中并混合约15分钟，但可增加或减少时间。将各组分共混以使得产生培养物与载体的均匀混合物。最终产物优选为干燥可流动的粉末。然后可将DFM或包含其的组合物添加至动物饲料或饲料预混物中、添加至动物用的水中，或以本领域已知的其他方式施用（优选与本发明的酶同时施用）。可将动物用饲料补充有本文所述的一种或多种DFM或补充有本文所述的组合物。

所谓“至少两种菌株的混合物”，其意指两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种菌株的混合物。在菌株的混合物的一些实施例中，比例可自1%变化至99%。菌株的混合物的其他实施例为25%至75%。菌株的混合物的另外的实施例是每种菌株大约为50%。在混合物包含两种以上菌株时，菌株可以实质上相等的比例或以不同比例存在于混合物中。

可适当地配给DFM。

合适地，饲料中的DFM的剂量可介于约1×10³CFU/g饲料至约1×10⁹CFU/g饲料之间，合适地介于约1×10⁴CFU/g饲料至约1×10⁸CFU/g饲料之间，合适地介于约7.5×10⁴CFU/g饲料至约1×10⁷CFU/g饲料之间。

在一个实施例中，DFM是以超过约1×10³CFU/g饲料、合适地超过约1×10⁴CFU/g饲料、合适地超过约7.5×10⁴CFU/g饲料配给于饲料中。

合适地，饲料添加剂组合物中的DFM的剂量可介于约1×10⁵CFU/g组合物至约1×10¹³CFU/g组合物之间，合适地介于约1×10⁶CFU/g组合物至约1×10¹²CFU/g组合物之间，合适地介于约3.75×10⁷CFU/g组合物至约1×10¹¹CFU/g组合物之间。

在一个实施例中，DFM是以超过约1×10⁵CFU/g组合物、合适地超过约1×10⁶CFU/g组合物、合适地超过约3.75×10⁷CFU/g组合物配给于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，DFM是以超过约2×10⁵CFU/g组合物、合适地超过约2×10⁶CFU/g组合物、合适地超过约3.75×10⁷CFU/g组合物配给于饲料添加剂组合物中。

本文所用的术语“CFU”意指集落形成单位并且是活细胞的量度，其中集落代表源自单一祖细胞的细胞聚集体。

木聚糖酶

木聚糖酶是给予可将直连多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖，因而使半纤维素（植物细胞壁的主要组分之一）分解的酶类型的名称。

用于本发明中的木聚糖酶可为任何市售木聚糖酶。

合适地，木聚糖酶可为内切-1,4-β-d-木聚糖酶（分类为E.C.3.2.1.8）或1,4β-木糖苷酶（分类为E.C.3.2.1.37）。

在一个实施例中，优选为内切木聚糖酶中的木聚糖酶，例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶。内切-1,4-β-d-木聚糖酶的分类号为E.C.3.2.1.8。

在一个实施例中，本发明涉及DFM与内切木聚糖酶（例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶）和另一酶的组合。

这里提及的所有E.C.酶分类均涉及EnzymeNomenclature-Recommendations(1992)of the nomenclature committeeof the International Union of Biochemistry和Molecular Biology（《酶命名–国际生物化学联合会命名委员会的建议》）(ISBN0-12-226164-3)中提供的分类。

合适地，用于本发明中的木聚糖酶可为来自芽孢杆菌属、木霉属、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium）的木聚糖酶。

在一个实施例中，木聚糖酶可为Axtra

或Avizyme（二者均是来自丹尼斯克公司的市售产品）中的木聚糖酶。

在一个优选的实施例中，用于本发明中的木聚糖酶可为如下商业产品中的一者或多者中的一种或多种木聚糖酶：

优选地，木聚糖酶以约500XU/kg至约16,000XU/kg饲料，更优选约750XU/kg饲料至约8000XU/kg饲料，甚至更优选约1000XU/kg饲料至约4000XU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在一个实施例中，木聚糖酶以超过约500XU/kg饲料、合适地超过约600XU/kg饲料、合适地超过约700XU/kg饲料、合适地超过约800XU/kg饲料、合适地超过约900XU/kg饲料、合适地超过约1000XU/kg饲料存在于饲料中。

在一个实施例中，木聚糖酶以低于约16,000XU/kg饲料、合适地低于约8000XU/kg饲料、合适地低于约7000XU/kg饲料、合适地低于约6000XU/kg饲料、合适地低于约5000XU/kg饲料、合适地低于约4000XU/kg饲料存在于饲料中。

优选地，木聚糖酶以约100XU/g至约320,000XU/g组合物，更优选约300XU/g组合物至约160,000XU/g组合物，甚至更优选约500XU/g组合物至约50,000XU/g组合物，甚至更优选约500XU/g组合物至约40,000XU/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，木聚糖酶以超过约100XU/g组合物、合适地超过约200XU/g组合物、合适地超过约300XU/g组合物、合适地超过约400XU/g组合物、合适地超过约500XU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，木聚糖酶以低于约320,000XU/g组合物、合适地低于约160,000XU/g组合物、合适地低于约50,000XU/g组合物、合适地低于约40,000XU/g组合物、合适地低于约30000XU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。

应当理解，一个木聚糖酶单位(XU)是于pH5.3和50℃下每分钟从燕麦木聚糖(oat-spelt-xylan)底物释放0.5μmol还原糖当量（如通过二硝基水杨酸(DNS)测定法-还原糖方法产生的木糖）的酶的量。（Bailey,M.J.Biely,P.和Poutanen,K.,Journal of Biotechnology（《生物技术杂志》），第23卷(3)，1992年5月，257-270）。

在一个实施例中，合适地，使用上述E.C.分类对酶进行分类，并且E.C.分类指示在本文所教导的测定法中进行测试以测定1XU时具有该活性的酶。

淀粉酶

淀粉酶是给予能够将淀粉水解成较短链低聚糖（例如麦芽糖）的酶类别的名称。葡萄糖部分可随后从麦芽糖比从初始的淀粉分子更容易地转移至甘油单酯或糖基甘油单酯。

术语淀粉酶包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成性淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。

在一个实施例中，优选地，淀粉酶是α-淀粉酶。将α-淀粉酶分类为(E.C.3.2.1.1)。

这些可以包括细菌或真菌起源的淀粉酶，也包括化学改性的或蛋白质工程改造的突变体。

在一个实施例中，优选地，淀粉酶可为来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶（例如α-淀粉酶）和/或来自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶（例如α-淀粉酶）。

在一个实施例中，α-淀粉酶可为Axtra

或Avizyme

（二者均是来自丹尼斯克公司的市售产品）中的α-淀粉酶。

在另一实施例中，淀粉酶可为胃蛋白酶耐受性α-淀粉酶，例如胃蛋白酶耐受性木霉（例如里氏木霉）α淀粉酶。合适的胃蛋白酶耐受性α-淀粉酶在英国申请案第1011513.7号（将其以引用方式并入本文中）和PCT/IB2011/053018（将其以引用方式并入本文中）中进行了教导。

在一个实施例中，淀粉酶可为包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的胃蛋白酶耐受性α-淀粉酶：

i)SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；

ii)除一个或数个氨基酸添加/***、缺失或置换外的SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；

iii)与SEQ ID No.1具有至少85%（优选至少90%、95%、97%、98%或99%）同一性或与SEQ ID No.3具有至少70%（优选至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%）同一性的氨基酸序列；

iv)由包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；

v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；

vi)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/***、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或

vii)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4具有至少70%（优选至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%）同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。

胃蛋白酶耐受性α淀粉酶还可以由在严格或高严格条件下与SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4杂交的核苷酸序列编码。

在一个优选的实施例中，用于本发明中的淀粉酶可为如下商业产品中的一者或多者中的一种或多种淀粉酶：

在一个实施例中，淀粉酶可为来自芽孢杆菌属的麦芽糖α-淀粉酶（参见EP 120 693）。该淀粉酶可以商品名

（丹麦诺和诺德公司(NovoNordisk A/S,Denmark)）商购获得。Novamyl在国际专利公布WO 91/104669中有详细描述。

优选地，淀粉酶以约50AU/kg至约10,000AU/kg饲料，更优选约70AU/kg饲料至约7500AU/kg饲料，更优选约70AU/kg饲料至约5000AU/kg饲料且甚至更优选约100AU/kg饲料至约2000AU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在一个实施例中，淀粉酶以超过约50AU/kg饲料、合适地超过约60AU/kg饲料、合适地超过约70AU/kg饲料、合适地超过约80AU/kg饲料、合适地超过约90AU/kg饲料、合适地超过约100AU/kg饲料存在于饲料中。

在一个实施例中，淀粉酶以低于约10,000AU/kg饲料、合适地低于约8000AU/kg饲料、合适地低于约7000AU/kg饲料、合适地低于约5000AU/kg饲料、合适地低于约4000AU/kg饲料、合适地低于约3000AU/kg饲料、合适地低于约2000AU/kg饲料存在于饲料中。

优选地，淀粉酶以约10AU/kg至约200,000AU/g组合物，更优选约30AU/g组合物至约100,000AU/g组合物，甚至更优选约40AU/g组合物至约50,000AU/g组合物，甚至更优选约50AU/g组合物至约20,000AU/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，淀粉酶以超过约10AU/g组合物、合适地超过约20AU/g组合物、合适地超过约30AU/g组合物、合适地超过约40AU/g组合物、合适地超过约50AU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，淀粉酶以低于约200,000AU/g组合物、合适地低于约100,000AU/g组合物、合适地低于约50,000AU/g组合物、合适地低于约40,000AU/g组合物、合适地低于约30000AU/g组合物、合适地低于约20000AU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。

应当理解，一个淀粉酶单位(AU)为在pH6.5和37℃下每分钟从水不溶***联淀粉聚合物底物释放1mmol糖苷键的酶量（这在本文中可称为用于测定1AU的测定法）。

1TAU（α-淀粉酶活性）为在pH8.0和40℃下每分钟从麦芽庚糖苷底物释放（在过量α-葡糖苷酶的存在下）0.20μmol糖苷键（以对硝基苯酚当量表示）所需的酶量。这在本文中可称为用于测定1TAU的测定法。

在一个实施例中，合适地，采用上述E.C.分类对酶进行分类，并且E.C.分类指示在本文所教导用于测定1AU的测定法中测试时具有该活性的酶。

蛋白酶

本文所用的术语蛋白酶与肽酶或蛋白质酶同义。

用于本发明中的蛋白酶可为枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或中性蛋白酶(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x)。

优选地，根据本发明的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。

合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。化学改性的或蛋白质工程改造的突变体也是合适的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，如碱性微生物蛋白酶或胰酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子为枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属物种的那些，如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309（参见，例如美国专利No.6,287,841）、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168（参见，例如WO 89/06279）。胰酶样蛋白酶的例子为胰蛋白酶（如猪或牛起源的胰蛋白酶）和镰刀菌(Fusarium)蛋白酶（参见，例如，WO 89/06270和WO94/25583）。可用的蛋白酶的例子还包括（但不限于）WO 92/19729和WO98/20115中所述的变体。

在一个优选的实施例中，用于本发明中的蛋白酶可为如下商业产品中的一者或多者中的一种或多种蛋白酶：

在一个实施例中，蛋白酶可为来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶。

在一个实施例中，蛋白酶可为可得自诺维信公司的拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)蛋白酶。

优选地，蛋白酶以约1000U/kg至约20,000PU/kg饲料，更优选约1500PU/kg饲料至约10000PU/kg饲料，更优选约2000PU/kg饲料至约6000PU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在一个实施例中，蛋白酶以超过约1000PU/kg饲料、合适地超过约1500PU/kg饲料、合适地超过约2000PU/kg饲料存在于饲料中。

在一个实施例中，蛋白酶以低于约20,000PU/kg饲料、合适地低于约10000PU/kg饲料、合适地低于约7000PU/kg饲料、合适地低于约6000PU/kg饲料存在于饲料中。

优选地，蛋白酶以约200PU/g至约400,000PU/g组合物，更优选约300PU/g组合物至约200,000PU/g组合物，甚至更优选约5000PU/g组合物至约100,000PU/g组合物，甚至更优选约700PU/g组合物至约70,000PU/g组合物，甚至更优选约1000PU/g组合物至约60,000PU/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，蛋白酶以超过约200PU/g组合物、合适地超过约300PU/g组合物、合适地超过约400PU/g组合物、合适地超过约500PU/g组合物、合适地超过约750PU/g组合物、合适地超过约1000PU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，蛋白酶以低于约400,000PU/g组合物、合适地低于约200,000PU/g组合物、合适地低于约100,000PU/g组合物、合适地低于约80,000PU/g组合物、合适地低于约70000PU/g组合物、合适地低于约60000PU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。

应当理解，一个蛋白酶单元(PU)为在pH7.5（40mM Na₂PO₄/乳酸缓冲液）和40℃下在一分钟内从底物（0.6%酪蛋白溶液）释放1微克酚类化合物（以酪氨酸当量表示）的酶量。这可称为用于测定1PU的测定法。

在一个实施例中，合适地，采用上述E.C.分类对酶进行分类，并且E.C.分类指示在本文所教导用于测定1PU的测定法中测试时具有该活性的酶。

植酸酶

用于本发明中的植酸酶可分为6-植酸酶（分类为E.C.3.1.3.26）或3-植酸酶（分类为E.C.3.1.3.8）。

在一个实施例中，植酸酶可为6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)。

在一个优选的实施例中，用于本发明中的植酸酶可为如下商业产品中的一者或多者中的一种或多种植酸酶：

本文所用的术语共有基因意指用于转化生物体的DNA载体含有基于共有序列的合成植酸酶基因、来自非病原性酵母酿酒酵母的URA基因和大肠杆菌质粒pBR322的复制起点。

在一个实施例中，植酸酶是源自例如如下的柠檬酸杆菌(Citrobacter)植酸酶：源自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，优选弗氏柠檬酸杆菌NCIMB41247的植酸酶及其变体，如（例如）WO2006/038062（以引用方式并入本文中）和WO2006/038128（以引用方式并入本文中）中所公开的；如WO2004/085638中所公开的源自布氏柠檬酸杆菌YH-15的植酸酶，如WO2006/037328中所公开的源自布氏柠檬酸杆菌ATCC51113的植酸酶（以引用方式并入本文中），以及它们的变体，如（例如）WO2007/112739（以引用方式并入本文中）及WO2011/117396（以引用方式并入本文中）中所公开的；源自无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)，优选无丙二酸柠檬酸杆菌ATCC25405或无丙二酸柠檬酸杆菌ATCC25407的植酸酶，如WO2006037327（以引用方式并入本文中）中所公开的；源自吉氏柠檬酸杆菌(Citrobacter gillenii)，优选吉氏柠檬酸杆菌DSM13694的植酸酶，如WO2006037327（以引用方式并入本文中）中所公开的；或源自中间柠檬酸杆菌(Citrobacter intermedius)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、鼠类柠檬酸杆菌(Citrobactermurliniae)、啮齿类柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、塞拉克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)、沃克曼氏柠檬酸杆菌(Citrobacterwerkmanii)、杨葛氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)、柠檬酸杆菌属物种的多肽或其变体。

在一个实施例中，植酸酶可为来自柠檬酸杆菌，例如来自弗氏柠檬酸杆菌的植酸酶，如WO2006/038128中所教导的植酸酶，将该参考文献以引用方式并入本文中。

在优选的实施例中，植酸酶优选为以名称Phyzyme XP^TM由丹尼斯克公司出售的大肠杆菌植酸酶。

或者，植酸酶可为布丘氏菌(Buttiauxella)植酸酶，如乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)植酸酶，例如WO 2006/043178、WO 2008/097619、WO2009/129489、WO2008/092901、PCT/US2009/41011或PCT/IB2010/051804中所教导的植酸酶，将上述所有案件均以引用方式并入本文中。

在一个实施例中，植酸酶可为来自哈夫尼菌属(Hafnia)，例如来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的植酸酶，如US2008263688中所教导的植酸酶，将该参考文献以引用方式并入本文中。

在一个实施例中，植酸酶可为来自曲霉属（例如来自米曲霉）的植酸酶。

在一个实施例中，植酸酶可为来自青霉属（例如来自绳状青霉菌）的植酸酶。

优选地，植酸酶以约200FTU/kg至约1000FTU/kg饲料、更优选约300FTU/kg饲料至约750FTU/kg饲料、更优选约400FTU/kg饲料至约500FTU/kg饲料的范围存在于饲料中。

在一个实施例中，植酸酶以超过约200FTU/kg饲料、合适地超过约300FTU/kg饲料、合适地超过约400FTU/kg饲料存在于饲料中。

在一个实施例中，植酸酶是以低于约1000FTU/kg饲料、合适地低于约750FTU/kg饲料存在于饲料中。

优选地，植酸酶以约40FTU/g至约40,000FTU/g组合物，更优选约80FTU/g组合物至约20,000FTU/g组合物，且甚至更优选约100FTU/g组合物至约10,000FTU/g组合物，且甚至更优选约200FTU/g组合物至约10,000FTU/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，植酸酶以超过约40FTU/g组合物、合适地超过约60FTU/g组合物、合适地超过约100FTU/g组合物、合适地超过约150FTU/g组合物、合适地超过约200FTU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。

在一个实施例中，植酸酶是以低于约40,000FTU/g组合物、合适地低于约20,000FTU/g组合物、合适地低于约15,000FTU/g组合物、合适地低于约10,000FTU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。

应当理解，如本文所用，1FTU（植酸酶单位）定义为在ISO 2009植酸酶测定法（用于测定植酸酶活性的标准测定法）中所定义的反应条件下，在一分钟内从底物释放1μmol无机正磷酸根时所需的酶量，并且1FTU可参见国际标准ISO/DIS30024:1-17,2009。

在一个实施例中，合适地，采用上述E.C.分类对酶进行分类，并且E.C.分类指示在本文所教导用于测定1FTU的测定法中测试时具有该活性的酶。

优点

DFM与酶的相互作用是复杂的，并且不希望受理论束缚，十分令人惊奇的是，我们可看到受试者对坏死性肠炎的抗性的改善，如我们看到（例如）损伤评分降低。在本发明之前，尚未出于该具体目的而教导DFM与酶的组合（例如，如本文所教导的）。

本发明的一个优点在于，根据本发明的饲料添加剂组合物可避免坏死性肠炎的负面影响或可用于改善受试者对坏死性肠炎的抗性。

不希望受理论的束缚，植酸酶可催化植酸盐（谷类和豆类中的磷的主要储存形式）依序水解成磷酸化较低的肌-肌醇衍生物，同时释放无机磷酸根。植酸盐的水解导致对肠腔的氨基酸的内源性损失减少。肠中的内源性氨基酸损失减少可降低用于细菌生长的氮的可利用率，这有助于DFM抑制产气荚膜梭状芽孢杆菌和其他致病菌的活性。

不希望受理论束缚，蛋白酶可导致饲粮蛋白质非特异性水解，从而在肠腔中产生多种多肽。动物完成蛋白水解并吸收这些氨基酸。然而，在肠病原性攻击的情形下，致病菌可在空肠和回肠的腔中利用较高的肽可利用率。DFM通过（例如）竞争N源以及通过直接抑制来抑制肠病原体的生长。

另外，木聚糖酶将直连多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖。不希望受理论束缚，本发明人在本文中已显示，利用DFM与酶的组合的能量消化率增大并非是由淀粉、脂肪或蛋白质解释，因此，其必须由非淀粉多糖加以解释。

淀粉酶活性可水解大的α连接的多糖（例如淀粉）的α键，从而产生糊精和低聚糖，其主要在水解成麦芽糖和葡萄糖后在小肠肠壁中吸收。令人惊奇的是，前肠中的快速淀粉水解和十二指肠中的较大量吸收葡萄糖可在空肠和回肠中剥夺致病菌的重要能量来源（葡萄糖），由于针对不能有效利用戊糖的病原体的竞争性优点这可改善DFM活性。

与其他DFM与酶的组合和/或与单独的DFM和/或与单独的酶相比，四种酶与DFM的组合令人惊奇地在减少病原体和/或对坏死性肠炎的抗性方面提供显著改善。

本文所教导的DFM与酶的特定组合可有利地导致粘蛋白分泌减少。不希望受理论束缚，此减少的粘蛋白分泌可导致内源性氨基酸损失减少，和/或可造成性能改善。

本文所教导的DFM与酶的特定组合可有利地减轻回肠中的炎症。这可通过回肠中的IFR-g表达下调可见。本发明人已显示，调节免疫应答可改善性能。

DFM与酶的制剂

可以任何合适的方式配制DFM与酶以确保制剂包含活的DFM和活性酶。

在一个实施例中，可将DFM与酶配制为液体、干粉或颗粒。

干粉或颗粒可通过本领域技术人员已知的手段，例如，在顶喷式流化床涂布器中、在Wurster型底喷式流化床(buttom spray Wurster)中或通过转鼓制粒（例如高剪切制粒）、挤出、衣锅包衣或在微成分混合器中制备。

对于一些实施例而言，可涂布（例如囊封）DFM和/或酶。合适地，可将DFM和酶配制于同一涂层内或囊封于同一胶囊中。或者，酶中的一种或两种或三种或四种可配制于同一涂层中或囊封于同一胶囊中，并且DFM可与酶中的一种或多种或全部分开配制于涂层中。在一些实施例中，例如若DFM能够产生内生孢子，则可在无任何涂层的情况下提供DFM。在这些情况下，可将DFM内生孢子与一种或两种或三种或四种酶简单混合。在后一情形下，可涂布（例如囊封）酶，例如可涂布（例如囊封）酶中的一种或多种或全部。酶可以酶的混合物（即包含酶中的一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种或全部）囊封或其可以（例如）单一酶形式单独囊封。在一个优选的实施例中，可将所有四种酶一起涂布（例如囊封）。

在一个实施例中，涂层保护酶免受热影响并且可视为防热剂。

在一个实施例中，将饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO2007/044968（称为TPT颗粒）或WO1997/016076或WO1992/012645中所述（将参考文献中的每一者以引用方式并入本文中）。

在一个实施例中，可将饲料添加剂组合物配制成用于饲料组合物的颗粒，其包括：芯；活性剂；和至少一个涂层，在选自如下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保留至少50%活性、至少60%活性、至少70%活性、至少80%活性：a)饲料制丸工艺，b)蒸汽加热的饲料预处理工艺，c)储存，d)作为未经制丸混合物中的成分储存，和e)作为包含至少一种选自如下的化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：痕量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。

关于颗粒，至少一个涂层可包含构成颗粒的至少55w/w%的水分水合材料；和/或至少一个涂层可包括两个涂层。该两个涂层可为水分水合涂层和水分屏障涂层。在一些实施例中，水分水合涂层可为颗粒的25w/w%至60w/w%之间并且水分屏障涂层可为颗粒的2w/w%至15w/w%之间。水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精而水分屏障涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。

颗粒可使用饲料制丸工艺制备并且饲料预处理工艺可在70℃至95℃之间进行最多数分钟，例如85℃至95℃之间。

在一个实施例中，可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，其包括：芯；活性剂，其在储存之后以及在颗粒为成分的蒸汽加热制丸工艺之后，颗粒的活性剂保留至少80%活性；水分屏障涂层；水分水合涂层，其为颗粒的至少25w/w%，在蒸汽加热制丸工艺之前，该颗粒具有小于0.5的水活性。

颗粒可具有选自聚合物和树胶的水分屏障涂层并且水分水合材料可为无机盐。水分水合涂层可为颗粒的25w/w%至45w/w%之间并且水分屏障涂层可为颗粒的2w/w%至10w/w%之间。

颗粒可使用蒸汽加热制丸工艺制备，该工艺可在85℃至95℃之间进行最多数分钟。

在一些实施例中，可用稀释剂（例如淀粉粉末、石灰石或诸如此类）稀释DFM（例如DFM内生孢子）。

在一个实施例中，组合物处于适于食用的液体制剂中，优选地，该液体食用物含有如下中的一者或多者：缓冲剂、盐、山梨醇和/或甘油。

在另一个实施例中，可通过将酶施加（例如喷涂）于载体基材（例如碾碎的小麦）上来配制饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，根据本发明的饲料添加剂组合物可配制为预混物。仅举个例子，该预混物可包含一种或多种饲料组分，例如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。

在一个实施例中，可将用于本发明的DFM和/或酶与至少一种选自如下中的至少一者的生理学上可接受的载体一起配制：麦芽糖糊精、石灰石（碳酸钙）、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。

包装

在一个实施例中，对根据本发明的饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料进行包装。

在一个优选的实施例中，将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料包装于袋（例如纸袋）中。

在一备选的实施例中，可将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料密封在容器中。可使用任何合适的容器。

饲料

本发明的饲料添加剂组合物可用作饲料或用于制备饲料。

本文所用的术语“饲料(feed)”与“饲料(feedstuff)”同义。

取决于用途和/或应用模式和/或施用模式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式。

在用作饲料（例如功能饲料）或用于饲料（例如功能饲料）制备时，本发明的组合物可与如下中的一者或多者结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。

在一优选的实施例中，将本发明的饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成饲料。

本文所用的术语“饲料组分”意指饲料的全部或部分。饲料的部分可意指饲料的一种成分或饲料的一种以上（例如2种或3种或4种）成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。

优选地，饲料可为草料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可将根据本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至草料(fodder)、草料组分或草料的预混物中。

本文所用的术语草料意指提供给动物（而非动物必须自己觅食）的任何食物。草料涵盖经切割的植物。

术语草料包括干草、稻草、青贮饲料、压制和制丸的饲料、油和混合日粮以及发芽谷物及豆类。

草料可从选自如下的植物中的一者或多者获得：苜蓿（紫苜蓿(lucerne)）、大麦、百脉根、芸苔属植物、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽（卡诺拉）、芜菁甘蓝（瑞典甘蓝）、芜菁、三叶草、杂三叶草、红色三叶草、地三叶草、白色三叶草、草、燕麦草、羊茅草、百慕大草、雀麦草、石南荒原草(heath grass)、草地早熟禾（来自天然混合草原草地）、果树草、黑麦草、猫尾草、玉米（玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树（用于树-干草的截去树梢的树的嫩枝）、小麦和豆类。

术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、坚果、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由各种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的具体需求配制这些共混物。

复合饲料可为提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供日粮（蛋白质、能量）的一部分的浓缩物或仅提供额外的微量营养物质（例如矿物质和维生素）的补充剂。

用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、大豆、高粱、燕麦和大麦。

合适的是，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业日粮内的组合物。

本发明的任何饲料可包含一种或多种选自如下的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物（例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合）和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

本发明的饲料可含有至少30重量%、至少40重量%、至少50重量%或至少60重量%的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。

另外或作为另一选择，本发明的饲料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维饲料。高纤维饲料材料的例子包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦、谷类的副产品（例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦糠、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳）、棕榈仁及柑橘渣。一些蛋白质来源也可以视为高纤维：从诸如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花之类的来源获得的蛋白质。

在本发明中，饲料可为如下中的一者或多者：复合饲料和预混物，其包括丸粒、坚果或（家畜用）饼；农作物或农作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、干椰子肉、稻草、谷壳、甜菜废料；鱼粉；新鲜切割草和其他饲料植物；肉和骨粉；糖蜜；油渣饼和压滤饼；低聚糖；保存的饲料植物：干草和青贮饲料；海藻；种子和谷物，其为整个或通过碾压或研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

在一些实施例中，本发明中的术语饲料也涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物食用的植物或动物材料，例如狗食品或猫食品。宠物食品（例如狗和猫食品）可以为干燥形式（例如用于狗的磨碎食物）或湿罐装形式。猫食品可含有氨基酸牛磺酸。

在一些实施例中，本发明中的术语饲料也涵盖鱼食品。鱼食品通常含有使养殖鱼保持健康所需的主要营养物质、痕量元素和维生素。鱼食品可以是小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式（其中的一些快速沉降）经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食品还含有诸如β胡萝卜素或性激素之类的添加剂，以人工增强观赏性鱼的颜色。

在一些实施例中，本发明中的术语饲料也涵盖鸟食品。鸟食品包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食品。通常，鸟食品由各种种子组成，但也可涵盖板油（牛或羊脂肪）。

本文所用的术语“接触”是指将本发明的组合物间接或直接施加至产品（例如饲料）中。可使用的施加方法的例子包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接施加、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。

在一个实施例中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品（例如饲料）混合。或者，饲料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。

对于一些施加而言，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这使得组合物能赋予如下有利特性中的一者或多者：性能益处。

可施加本发明的饲料添加剂组合物以使产品（例如饲料或饲料的原始成分）散布、涂布和/或浸渍有控制量的DFM和酶。

DFM和酶可同时使用（例如，在它们混合在一起时或甚至在它们通过不同途径递送时）或依序使用（例如，它们可通过不同途径递送）。在一个实施例中，优选地，同时施加DFM和酶。优选地，将DFM与酶混合，然后将它们递送至饲料或饲料的原始成分。

根据本发明的饲料添加剂组合物中的DFM可以合适的浓度添加–例如最终饲料产品中的浓度可提供约2×10⁵CFU至约2×10¹¹CFU之间、合适地介于约2×10⁶CFU至约1×10¹⁰CFU之间、合适地介于约3.75×10⁷CFU至约1×10¹⁰CFU之间的日剂量。

优选地，本发明的饲料添加剂组合物将对最高约70℃、最高约85℃或最高约95℃的热处理是热稳定的。热处理可以进行最多约1分钟、最多约5分钟、最多约10分钟、最多约30分钟、最多约60分钟。术语热稳定的意指在加热至指定温度之前添加剂中存在/有活性的酶组分和/或DFM中的至少约75%在冷却至室温后仍存在/有活性。优选地，在加热至指定温度之前添加剂中存在及有活性的酶组分和/或DFM中的至少约80%在冷却至室温后仍存在及有活性。

在一尤其优选的实施例中，将饲料添加剂组合物均质化以产生粉末。

在一备选的优选实施例中，将饲料添加剂组合物配制成如WO2007/044968中所述的颗粒（称作TPT颗粒），将该文献以引用方式并入本文中。

在另一优选的实施例中，在将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含涂布在蛋白质芯上的水合屏障盐。该盐涂层的优点是改善耐热性、改善储存稳定性以及保护免受原本对酶和/或DFM具有不利作用的其他饲料添加剂的影响。

优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或者大于60%的恒定湿度。

优选地，盐涂层包含Na₂SO₄。

制备饲料添加剂组合物的方法还可包括将粉末制丸的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可迫使粉末或包含粉末的混合物通过模具，并将所得的料条切成可变长度的合适丸粒。

任选地，制丸步骤可包括在形成丸粒之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调理机中，例如带蒸汽喷射的混合机。将混合物在调理机中加热至指定温度，例如从60℃至100℃，典型的温度可为70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间不定，可从数秒钟到数分钟甚至数小时。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。

应当理解，本发明的饲料添加剂组合物适于添加至任何适当的饲料材料中。

本文所用的术语饲料材料指待由动物食用的基础饲料材料。还应理解，这可包含例如至少一种或多种未经加工的谷物，和/或经加工的植物和/或动物材料如大豆粉或骨粉。

本文所用的术语“饲料”是指已向其添加一种或多种饲料添加剂组合物的饲料材料。

技术人员会认识到，不同的动物要求不同的饲料，甚至同一种动物也可能要求不同的饲料，这取决于饲养该动物的目的。

优选地，饲料可包含这样的饲料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、大米、木薯、高粱和/或任何副产物，以及富含蛋白质的成分，如大豆粉、油菜籽粉、卡诺拉粉、棉籽粉、葵花籽粉、动物副产物粉和它们的混合物。更优选地，饲料可包含动物脂肪和/或植物油。

任选地，饲料还可含有额外的矿物质（例如钙）和/或额外的维生素。

优选地，饲料为玉米大豆粉混合物。

在一个实施例中，优选地，饲料不是宠物食品。

在另一个方面，提供生产饲料的方法。饲料通常在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。饲料随后可以作为糊料或丸粒制备；后者通常涉及将温度升高至目标水平并随后使饲料通过模具以产生特定尺寸的丸粒的方法。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂如脂肪和酶。饲料的制备还可涉及额外的步骤，其包括在制丸之前的挤出或膨胀–特别是通过可包括至少使用蒸汽的合适技术来进行。

饲料可以是用于单胃动物如家禽（如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽）、猪（所有年龄类别）、宠物（例如犬、猫）或鱼的饲料，优选饲料用于家禽。

在一个实施例中，饲料并非用于蛋鸡。

仅举例而言，用于鸡（例如肉鸡）的饲料可包含下表中所列举成分中的一种或多种，例如以如下表中给出的%表示：

成分	开食料(%)	育肥料(%)
			玉蜀黍	46.2	46.7
小麦粗粉	6.7	10.0
			玉蜀黍DDGS	7.0	7.0
大豆粉48%CP	32.8	26.2
			动物/植物脂肪共混物	3.0	5.8
L-赖氨酸HCl	0.3	0.3
			DL-甲硫氨酸	0.3	0.3
L-苏氨酸	0.1	0.1
			盐	0.3	0.4
石灰石	1.1	1.1
			磷酸二钙	1.2	1.2
家禽维生素和微量矿物质	0.3	0.3

仅举例而言，鸡（例如肉鸡）的饲粮规格可如下表中所述：

饲粮规格
			粗蛋白(%)	23.00	20.40
家禽代谢能(kcal/kg)	2950	3100
			钙(%)	0.85	0.85
可利用磷(%)	0.38	0.38
			钠(%)	0.18	0.19
可消化的赖氨酸(%)	1.21	1.07
			可消化的甲硫氨酸(%)	0.62	0.57
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(%)	0.86	0.78
			可消化的苏氨酸(%)	0.76	0.68

仅举例而言，用于蛋鸡的饲料可由下表中所列举成分中的一种或多种组成，例如以如下表中给出的%表示：

成分	产蛋期(%)
		玉蜀黍	10.0
小麦	53.6
		玉蜀黍DDGS	5.0
大豆粉48%CP	14.9
		小麦粗粉	3.0
大豆油	1.8
		L-赖氨酸HCl	0.2
DL-甲硫氨酸	0.2
		L-苏氨酸	0.1
盐	0.3
		磷酸二钙	1.6
石灰石	8.9
		家禽维生素和微量矿物质	0.6

仅举例而言，蛋鸡的饲粮规格可如下表中所述：

饲粮规格
		粗蛋白(%)	16.10
家禽代谢能(kcal/kg)	2700
		赖氨酸(%)	0.85
甲硫氨酸(%)	0.42
		甲硫氨酸+半胱氨酸(%)	0.71

苏氨酸(%)	0.60
		钙(%)	3.85
可利用的磷(%)	0.42
		钠(%)	0.16

仅举例而言，用于火鸡的饲料可由下表中所列举成分中的一种或多种组成，例如以如下表中给出的%表示：

成分	阶段1(%)	阶段2(%)	阶段3(%)	阶段4(%)
					小麦	33.6	42.3	52.4	61.6
玉蜀黍DDGS	7.0	7.0	7.0	7.0
					大豆粉48%CP	44.6	36.6	27.2	19.2
油菜籽粉	4.0	4.0	4.0	4.0
					大豆油	4.4	4.2	3.9	3.6
L-赖氨酸HCl	0.5	0.5	0.4	0.4
					DL-甲硫氨酸	0.4	0.4	0.3	0.2
L-苏氨酸	0.2	0.2	0.1	0.1
					盐	0.3	0.3	0.3	0.3
石灰石	1.0	1.1	1.1	1.0
					磷酸二钙	3.5	3.0	2.7	2.0
家禽维生素和微量矿物质	0.4	0.4	0.4	0.4

仅举例而言，火鸡的饲粮规格可如下表中所述：

饲粮规格
					粗蛋白(%)	29.35	26.37	22.93	20.00
家禽代谢能(kcal/kg)	2.850	2.900	2.950	3.001

钙(%)	1.43	1.33	1.22	1.02
					可利用磷(%)	0.80	0.71	0.65	0.53
钠(%)	0.16	0.17	0.17	0.17
					可消化的赖氨酸(%)	1.77	1.53	1.27	1.04
可消化的甲硫氨酸(%)	0.79	0.71	0.62	0.48
					可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(%)	1.12	1.02	0.90	0.74
可消化的苏氨酸(%)	1.03	0.89	0.73	0.59

仅举例而言，用于仔猪的饲料可由下表中所列举成分中的一种或多种组成，例如以如下表中给出的%表示：

成分	阶段1(%)	阶段2(%)
			玉蜀黍	20.0	7.0
小麦	25.9	46.6
			黑麦	4.0	10.0
小麦粗粉	4.0	4.0
			玉蜀黍DDGS	6.0	8.0
大豆粉48%CP	25.7	19.9
			干乳清	10.0	0.0
大豆油	1.0	0.7
			L-赖氨酸HCl	0.4	0.5
DL-甲硫氨酸	0.2	0.2
			L-苏氨酸	0.1	0.2
L-色氨酸	0.03	0.04
			石灰石	0.6	0.7
磷酸二钙	1.6	1.6
			猪维生素和微量矿物质	0.2	0.2
盐	0.2	0.4

仅举例而言，仔猪的饲粮规格可如下表中所述：

仅举例而言，用于生长猪/肥育猪的饲料可由下表中所列举成分中的一种或多种组成，例如以如下表中给出的%表示：

成分	生长料/育肥料(%)
		玉蜀黍	27.5
大豆粉48%CP	15.4
		玉蜀黍DDGS	20.0
小麦麸皮	11.1
		米糠	12.0
卡诺拉籽粉	10.0
		石灰石	1.6
磷酸二钙	0.01

盐	0.4
		猪维生素和微量矿物质	0.3
赖氨酸-HCl	0.2
		植物油	0.5

仅举例而言，生长猪/肥育猪的饲粮规格可如下表中所述：

饲粮规格
		粗蛋白(%)	22.60
猪代谢能(kcal/kg)	3030
		钙(%)	0.75
可利用的磷(%)	0.29
		可消化的赖氨酸(%)	1.01
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(%)	0.73
		可消化的苏氨酸(%)	0.66

形式

本发明的饲料添加剂组合物及其他组分和/或包含它们的饲料可以任何合适的形式使用。

本发明的饲料添加剂组合物可以固体或液体制剂或其备选形式使用。固体制剂的例子包括散剂、糊剂、大丸剂、胶囊剂、丸剂、片剂、粉剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的例子包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液剂、混悬剂和乳剂。

在一些应用中，可将本发明的DFM或饲料添加剂组合物与饲料混合或施用于饮用水中。在一个实施例中，包括进水中的剂量范围为约1×10³CFU/动物/天至约1×10¹⁰CFU/动物/天，更优选约1×10⁷CFU/动物/天。

合适的形式的例子包括如下中的一者或多者：散剂、糊剂、大丸剂、丸粒、片剂、丸剂、胶囊剂、***栓剂、溶液剂或混悬剂，其可含有矫味剂或着色剂，用于即刻释放、延迟释放、调节释放、持续释放、脉冲释放或受控释放应用。

举例而言，如果本发明的组合物以固体（例如丸粒形式）使用，则其也可含有如下中的一者或多者：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉（优选玉米、马铃薯或木薯淀粉）、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠及某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶及***胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山萮酸酯及滑石粉。

用于制备这些形式的营养上可接受的载体的例子包括（例如）水、盐溶液、醇、有机硅(silicone)、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。

用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。

对于水性混悬剂和/或酏剂而言，可将本发明的组合物与各种甜味剂或矫味剂、着色物质或染料、与乳化剂和/或助悬剂以及与稀释剂（例如水、丙二醇和甘油）以及它们的组合进行组合。

非吸水乳清经常用作为DFM（尤其细菌DFM）的载体并且为引发生长的良好介质。

含有细菌DFM的糊剂可与植物油和惰性胶凝成分配制在一起。

真菌产品可与作为载体的谷物副产品配制在一起。

在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物并不是微粒***（例如WO2005/123034中所教导的微粒***）形式。

给予(dosing)

根据本发明的DFM和/或饲料添加剂组合物可设计用于一次给予或设计用于以每日计饲喂。

待用于本发明组合中的组合物（及其中的每种组分）的最佳量将取决于待处理的产品和/或产品与组合物的接触方法和/或其预期用途。

用于组合物中的DFM和酶的量应为足以有效用于以及足以保持足够有效用于改善饲喂含有该组合物的饲料产品的动物的性能的量。该有效的时间长度应延伸最多至至少利用该产品（例如饲料添加剂组合物或含有其的饲料）的时间。

饲料中DFM与每种酶的比率可在下面给出的范围内：

DFM：植酸酶(CFU/FTU)：在5.0×10²CFU DFM:1FTU酶至5.0×10⁹CFU:1FTU酶的范围内；优选在7.5×10⁴CFU DFM:1FTU酶至2.5×10⁷CFU:1FTU酶的范围内。

DFM：木聚糖酶(CFU/XU)：范围为6.25×10¹CFU DFM:1XU酶至2.0×10⁹CFU:1XU酶；优选范围为1.88×10⁴CFU DFM:1XU酶至1.0×10⁷CFU:1XU酶。

DFM：淀粉酶(CFU/AU)：范围为1.0×10²CFU DFM:1AU酶至2.0×10¹⁰CFU:1AU酶；优选范围为3.7×10⁴CFU DFM:1AU酶至1.0×10⁸CFU:1AU酶。

DFM：蛋白酶(CFU/PU)：范围为5.0×10¹CFU DFM:1PU酶至1.0×10⁹CFU:1PU酶；优选范围为1.25×10⁴CFU DFM:1PU酶至5.0×10⁶CFU:1PU酶。

在一个实施例中，优选地，饲料包含如下物质：

至少4000PU/kg饲料的蛋白酶；

至少1000XU/kg至2000XU/kg饲料的木聚糖酶（例如，1000XU/kg饲料的Avizyme或至少2000XU/kg饲料的Axtra XAP）；

至少1800AU/kg或200TAU/kg饲料的淀粉酶（例如，1800AU/kg的Avizyme或至少200TAU/kg饲料的Axtra XAP）；

至少500FTU/kg饲料的植酸酶；和

至少75,000CFU/g至150,000CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

在一个实施例中，优选地，饲料包含如下物质：

4000PU/kg饲料的蛋白酶；

1000XU/kg至2000XU/kg饲料的木聚糖酶（例如，1000XU/kg饲料的Avizyme或2000XU/kg饲料的Axtra XAP）；

1800AU/kg或200TAU/kg饲料的淀粉酶（例如，1800AU/kg的Avizyme或200TAU/kg饲料的Axtra XAP）；

500FTU/kg饲料的植酸酶；和

75,000CFU/g至150,000CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

在一个实施例中，优选地，饲料包含如下物质：

5000PU/kg饲料的蛋白酶；

1250XU/kg至2500XU/kg饲料的木聚糖酶（例如，1000XU/kg饲料的Avizyme或2500XU/kg饲料的Axtra XAP）；

2250AU/kg或250TAU/kg饲料的淀粉酶（例如，1800AU/kg的Avizyme或250TAU/kg饲料的Axtra XAP）；

625FTU/kg饲料的植酸酶；和

75,000CFU/g至150,000CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

在另一个实施例中，饲料包含如下物质：

2000PU/kg饲料的蛋白酶；

500XU/kg至1000XU/kg饲料的木聚糖酶（例如，500XU/kg饲料的Avizyme或1000XU/kg饲料的Axtra XAP）；

900AU/kg或100TAU/kg饲料的淀粉酶（例如，900AU/kg的Avizyme或100TAU/kg饲料的Axtra XAP）；

500FTU/kg饲料的植酸酶；和

37,500CFU/g至75,000CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

在一个优选的实施例中，饲料添加剂组合物包含足以如下所述给予饲料的酶和DFM：

4000PU/kg饲料的蛋白酶；

500FTU/kg饲料的植酸酶；和

75,000CFU/g至150,000CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

2000PU/kg饲料的蛋白酶；

500FTU/kg饲料的植酸酶；和

37,500CFU/g至75,000CFU/g饲料的Envivo Pro(DFM)。

与其他组分的组合

用于本发明中的DFM和酶可与其他组分组合使用。因此，本发明也涉及组合。DFM与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合在本文中可称作“本发明的饲料添加剂组合物”。

本发明的组合包含本发明的饲料添加剂组合物（或其一种或多种成分）和适于动物食用且能够为食用者提供医学或生理学益处的另一组分。

在一个实施例中，优选地，该“另一组分”并非另外的酶或另外的DFM。

这些组分可为益生元(prebiotics)。益生元通常是不在上消化道中降解或吸收的非消化性碳水化合物（低聚糖或多糖）或糖醇。用于商业产品中且根据本发明有用的已知益生元包括菊粉（低聚果糖或FOS）和低聚反式半乳糖（GOS或TOS）。合适的益生元包括低聚帕拉金糖、大豆低聚糖、海藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊粉、瓜耳胶、低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、不可降解的淀粉、乳蔗糖、乳果糖、乳糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、聚右旋糖（即

）、乳糖醇、乳蔗糖、大豆低聚糖类、帕拉金糖、低聚异麦芽糖、低聚葡糖糖和低聚木糖、果胶片段、膳食纤维、低聚甘露糖。

膳食纤维可包括非淀粉多糖（例如***糖基木聚糖）、纤维素以及许多其他植物组分，例如抗性糊精、菊粉、木质素、蜡、甲壳质、果胶、β-葡聚糖和低聚糖。

在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的饲料添加剂组合物（或一或多种其成分）与益菌元的组合。在另一个实施例中，本发明涉及包含DFM与木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、蛋白酶和益菌元的组合（或基本上由其组成或由其组成）的饲料添加剂组合物。

益生元可与根据本发明的饲料添加剂组合物（或其成分）同时（例如，与其一起的混合物或通过相同或不同途径同时递送）或在其之后（例如通过相同或不同途径）施用。

本发明的组合的其他组分包括聚右旋糖（例如

）和/或麦芽糖糊精和/或乳糖醇。可任选将这些其他组分添加至饲料添加剂组合物中以辅助干燥过程以及帮助DFM存活。

其他合适组分的另外的例子包括如下中的一者或多者：增稠剂、胶凝剂、乳化剂、粘合剂、结晶改良剂、甜味剂（包括人造甜味料）、流变改性剂、稳定剂、抗氧化剂、染料、酶、载体、媒介物、赋形剂、稀释剂、润滑剂、矫味剂、着色物质、助悬剂、崩解剂、制粒粘合剂等。这些其他组分可以是天然的。这些其他的组分可通过使用化学和/或酶学技术来制备。

在一个实施例中，可囊封DFM和/或酶。在一个实施例中，将饲料添加剂组合物和/或DFM和/或酶配制成干粉或如WO2007/044968中所述的颗粒（称为TPT颗粒）-将该参考文献以引用方式并入本文中。

在一个优选的实施例中，用于本发明中的DFM和/或酶可与一种或多种脂质组合使用。

例如，用于本发明中的DFM和/或酶可与一种或多种脂质微胶粒组合使用。脂质微胶粒可为简单脂质微胶粒或复杂脂质微胶粒。

脂质微胶粒可为两性物质（例如脂质和/或油）的取向分子的聚集体。

本文所用的术语“增稠剂或胶凝剂”是指通过减缓或防止粒子（不可混溶液的小滴、空气或不溶性固体）运动而防止分离的产品。在单独的水合分子引起粘度增加，从而减缓分离时，发生增稠。当水合的分子连接而形成可捕获粒子的三维网络，由此使这些粒子固定时发生胶凝。

本文所用的术语“稳定剂”定义为保持产品（例如饲料产品）免于随时间推移而变化的成分或成分的组合。

本文所用的术语“乳化剂”是指防止乳液分离的成分（例如饲料成分）。乳液是两种不混溶的物质，一种以小滴存在，包含于另一者中。乳液可由水包油（其中小滴或分散相是油而连续相是水）或油包水（其中水变成分散相而连续相是油）组成。也可通过使用乳化剂使泡沫（其是液包气）和混悬液（其为液固混悬液）稳定。

本文所用的术语“粘合剂”是指经通过物理或化学反应将产品结合在一起的成分（例如饲料成分）。例如，在“胶凝”期间，水被吸收，从而提供结合效果。然而，粘合剂可吸收其他液体（例如油），从而将其保持在产品中。在本发明上下文中，粘合剂将通常用于固体或低水分产品（例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包等等）中。

“载体”或“媒介物”意指适于施用DFM和/或酶的材料且包括本领域已知的任何该材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、稳定剂等等，其为无毒的并且并不以有害方式与组合物的任何组分相互作用。

本发明提供制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括将DFM、木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶和淀粉酶与至少一种选自如下中的至少一者的生理学上可接受的载体混合：麦芽糖糊精、石灰石（碳酸钙）、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。

赋形剂的例子包括如下中的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milksugar)和高分子量聚乙二醇。

崩解剂的例子包括如下中的一种或多种：淀粉（优选玉米、马铃薯或木薯淀粉）、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。

制粒粘合剂的例子包括如下中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和***胶。

润滑剂的例子包括如下中的一种或多种：硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。

稀释剂的例子包括如下中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及它们的组合。

其他的组分可同时使用（例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时）或者依序使用（例如它们可通过不同的途径递送）。

优选地，在将本发明的饲料添加剂组合物与另一组分混合时，DFM保持为活的。

在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物不包含铬或有机铬。

在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂不含有葡聚糖酶。

在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂不含有山梨酸。

浓缩物

用于本发明中的DFM可以为浓缩物形式。通常，这些浓缩物包含相当高浓度的DFM。

根据本发明的饲料添加剂组合物可具有的活细胞的含量（集落形成单位，CFU）在至少10⁴CFU/g（合适地包括至少10⁵CFU/g，例如至少10⁶CFU/g，例如至少10⁷CFU/g，至少10⁸CFU/g，例如至少10⁹CFU/g）至约10¹⁰CFU/g（或甚至约10¹¹CFU/g或约10¹²CFU/g）的范围内。

在DFM是浓缩物形式时，根据本发明的饲料添加剂组合物可具有的活细胞的含量在至少10⁹CFU/g至约10¹²CFU/g、优选至少10¹⁰CFU/g至约10¹²CFU/g的范围内。

浓缩物形式的散剂、颗粒剂和液体组合物可用水稀释或再悬浮于水或其他合适的稀释剂（例如适当的生长培养基，例如乳或矿物质或植物油）中，以产生可供使用的组合物。

可根据本领域已知的方法制备浓缩物形式的本发明的DFM或饲料添加剂组合物或本发明的组合。

在本发明的一个方面中，以浓缩形式的组合物接触酶或饲料。

可通过本领域已知的方法喷雾干燥或冷冻干燥本发明的组合物。

使用喷雾干燥方法制备粒子的典型方法涉及溶解于适当溶剂中的固体材料（例如，发酵培养基中的DFM的培养物）。或者，可将材料悬浮或乳化于非溶剂中以形成混悬液或乳液。可任选在该阶段添加其他成分（如上文所论述的）或诸如抗微生物剂、稳定剂、染料和辅助干燥过程的试剂之类的组分。

然后使溶液雾化以形成小滴的细雾。小滴立刻进入干燥室中，在其中其接触干燥气体。溶剂由小滴蒸发进干燥气体中而固化小滴，从而形成粒子。随后从干燥气体分离粒子并收集。

受试者

本文所用的术语“受试者”意指待施用或已施用根据本发明的饲料添加剂组合物或包含所述根据本发明的饲料添加剂组合物的饲料的动物。

本文所用的术语“受试者”意指动物。优选地，受试者是哺乳动物、鸟、鱼或甲壳类动物，包括（例如）家畜或驯养动物（例如宠物）。

在一个实施例中，“受试者”是家畜。

本文所用的术语“家畜”是指任何农场动物。优选地，家畜是如下中的一种或多种：奶牛或公牛（包括牛犊）、家禽、猪（包括仔猪）、家禽（包括肉鸡、鸡及火鸡）、鸟、鱼（包括淡水鱼，例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼如锦鲤鱼，以及海鱼如黑鲈）、甲壳类动物（例如虾、贻贝和扇贝）、马（包括赛马）、绵羊（包括羔羊）。

在一个实施例中，术语家畜和/或家禽和/或鸡不包括蛋鸡。

在另一个实施例中，“受试者”是驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物。

本文所用的术语“驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物”是指任何相关动物，包括犬科动物（例如狗）、猫科动物（例如猫）、啮齿类动物（例如豚鼠、大鼠、小鼠）、鸟、鱼（包括淡水鱼和海鱼）和马。

在一个实施例中，受试者可能受肠病原体攻击。

举例而言，受试者的肠或消化道中可存在一种或多种肠病原体。例如，受试者的肠或消化道中可具有的一种或多种肠病原体的量：

i)可导致动物的性能损失和/或

ii)为临床相关水平；或

iii)为亚临床水平。

肠病原体可为（例如）产气荚膜梭状芽孢杆菌。

性能

本文所用的“动物性能”可通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养物质的消化率（例如氨基酸消化率）和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留量和/或通过动物避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来测定。

优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物的增重和/或饲料转化率来测定。

所谓“改善的动物性能”，其意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用所述饲料添加剂组合物，受试者中的饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养物质或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或避免坏死性肠炎的负面影响的能力改善和/或免疫应答改善。

优选地，所谓“改善的动物性能”，其意指饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低。

本文所用的术语“饲料效率”是指在一段时间期间不限量饲喂动物或对其饲喂指定量的食物时动物中发生的增重的量。

所谓“增加的饲料效率”，其意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用所述饲料添加剂组合物导致每单位摄入饲料的增重增加。

饲料转化率(FCR)

本文所用的术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物重量增加规定量的饲料量。

改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。

所谓“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”，其意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物体重增加指定量时所需饲喂给动物的饲料量低于在该饲料不包含所述饲料添加剂组合物时使动物体重增加相同量时所需的饲料量。

营养物质消化率

本文所用的营养物质消化率意指从胃肠道或胃肠道的指定区段（例如小肠）消失的营养物质的分数。营养物质消化率可测量为所施用给受试者的与受试者粪便中所出来的之间的差值、或所施用给受试者的与所保留在胃肠道指定区段（例如回肠）上的消化物中的之间的差值。

本文所用的营养物质消化率可通过在一段时间期间收集总***物，测量所摄入营养物质与所***的营养物质之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃肠道或胃肠道区段中所消失的营养物质的量的惰性标记来测量。这种惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为营养物质在饲料中的百分比，或表示为可消化的营养物质的质量单位/饲料中的营养物质的质量单位。

本文所用的营养物质消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

本文所用的能量消化率意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段（例如回肠）上的剩余消化物的总能量。本文所用的代谢能是指表观代谢能，且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中含有的总能量。能量消化率和代谢能可测量为总能量的摄取与粪便中***的或胃肠道指定区段中存在的消化物中的总能量之间的差值，其使用与测量营养物质的消化率相同的方法，针对氮***进行适当校正以计算饲料的代谢能。

氮保留量

本文所用的氮保留量意指受试者从饲粮保留氮作为体重的能力。在氮的***超过每日的摄取时发生负氮平衡并且在损失肌肉时经常观察到该负氮平衡。正氮平衡经常与肌肉生长相关，尤其是与正生长的动物中的肌肉生长相关。

氮保留量可借助于在一段时间期间***物和尿的总集测量为所摄取的氮与所***的氮之间的差值。应了解，所***的氮包括来自饲料的未消化蛋白质、内源性蛋白质性***物、微生物蛋白质和尿氮。

存活率

如本文所用的术语存活率意指仍活着的受试者的数目。术语“改善的存活率”可以是“减少的死亡率”的另一种说法。

屠宰率和产肉率

本文所用的术语屠宰率意指在商业或实验的屠宰过程后，作为活体重量的比例的胴体量。术语胴体意指已因食物而屠宰的动物身体，其中头、内脏、四肢的部分和羽毛或皮肤被去除。本文所用的术语产肉率意指作为活体重量的比例的可食用肉的量，或作为活体重量的比例的切割的指定肉的量。

增重

本发明还提供增加受试者（例如家禽或猪）中的增重的方法，其包括给所述受试者饲喂包含根据本发明的饲料添加剂组合物的饲料。

“增加的增重”指与饲喂不存在饲料添加剂组合物的饲料的动物相比较，在饲喂包含所述饲料添加剂组合物的饲料时动物具有增加的体重。

坏死性肠炎

坏死性肠炎是世界范围内在鸡、火鸡和鸭中观察到的急性或慢性肠毒血症，其由产气荚膜梭状芽孢杆菌引起。坏死性肠炎常表征为通常是中段小肠的纤维素性坏死性肠炎。死亡率可为5%至50%，通常约10%。感染通过粪便-口传播发生。致病生物体的孢子抗性极高。诱病因素包括球虫病(coccidiosis/coccidiasis)、饲粮（高蛋白）、在鸭中可能为重应力、高粘度饲粮（经常与饲粮中包括大量的黑麦和小麦相关）、污染的饲料和/或水、其他衰竭性疾病。

本发明涉及增加受试者对坏死性肠炎的抗性的方法。换而言之，本发明涉及避免或减轻坏死性肠炎的负面影响。

本文所用的术语“抗性”可涵盖术语“耐受性”。因此，在一个实施例中，受试者可对坏死性肠炎无抗性但受试者可能够耐受坏死性肠炎，即对受试者的性能无负面影响。

在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的饲料添加剂组合物，其用于治疗或预防受试者的坏死性肠炎。受试者通常可为已被或将被产气荚膜梭状芽孢杆菌和/或艾美球虫属(Eimeria)物种攻击者。这种攻击可来自环境，或在饲料或饮用水中施加活微生物，例如在使用活的球虫疫苗时。

在另一个实施例中，本发明涉及饲料添加剂组合物，其用于预防和/或治疗受试者的球虫病和/或坏死性肠炎。

免疫应答

本文所用的免疫应答意指DFM调节动物的免疫***的多个方式中的一者，包括增加抗体产生、上调细胞介导的免疫、上调促炎细胞因子和增加toll样受体信号传导。应当了解，由DFM对胃肠道进行免疫刺激可有利于保护宿主抵抗疾病，并且对胃肠道进行免疫抑制可对宿主有利，这是因为较少的营养物质和能量被用来支持免疫功能。

优选地，免疫应答是细胞免疫应答。

优选地，通过观察免疫标记测量免疫应答。

致病菌

本文所用的术语致病菌意指例如产毒性梭状芽孢杆菌物种如产气荚膜梭状芽孢杆菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。在一个实施例中，致病菌可以是禽致病性大肠杆菌物种。

本发明可减少受试者胃肠道中的致病菌群体。

营养***

在一个实施例中，本发明涉及减少粪肥中的营养***。这对减少环境危害具有积极作用。例如，在一个优选的实施例中，本发明涉及减少受试者粪肥中的氮和/或磷含量。因而，这可减少环境中的氮和/或磷的量，这可能是有利的。

益生菌

对于一些应用而言，据信本发明组合物中的DFM可发挥益生菌培养物效应。向本发明的组合物添加另外的益生菌和/或益生元也在本发明的范畴内。

这里，益生元为：

“非消化性食物成分，其通过选择性刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性而有利地影响宿主”。

本文所用的术语“益生菌培养物”定义活微生物（例如，包括细菌或酵母），其在（例如）以足够数量摄入或局部施加时可有利地影响宿主生物体，即通过赋予宿主生物体一种或多种可证实的健康益处。益生菌可改善一种或多种粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可为肠、尿道、呼吸道或皮肤。本文所用的术语“益生菌”也涵盖可刺激免疫***的有益分枝且同时减少粘膜表面（例如肠）中的炎性反应的活微生物。

尽管对于益生菌摄取无下限或上限，但已提出，至少10⁶-10¹²、优选至少10⁶-10¹⁰、优选10⁸-10⁹cfu作为日剂量将可在受试者中有效实现有益健康效果。

分离的

在一个方面，合适的是，本发明中使用的酶或DFM可为分离的形式。术语“分离的”意指酶或DFM至少实质上不含所述酶或DFM在自然界中天然与之相关联或在自然界中存在的至少一种其他组分。本发明的酶或DFM可以实质上不含所述物质原本与之相关联的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可实质上不含一或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。

纯化的

在一个方面，优选地，根据本发明的酶和/或DFM为纯化的形式。术语“纯化的”意指酶和/或DFM是以高水平存在。酶和/或DFM有利地是组合物中存在的主要组分。优选地，其是以至少约90%、或至少约95%或至少约98%的水平存在，所述水平是相对于所考虑总组合物以干重/干重计来测定。

在本发明范围内设想可组合本发明的实施例使得本发明范围内包括本文所述特征中的任一者的组合。具体而言，在本发明范围内设想可同时展现细菌的治疗效果中的任一者。

核苷酸序列

本发明的范围涵盖编码具有本文所限定的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。

本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物（如其部分）。核苷酸序列可为基因组起源的或者合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。

与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。

在一个优选的实施例中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括处于其天然环境中时或其连接至其也存在于其/它们的天然环境中的天然相关的序列时的天然的根据本发明的核苷酸序列。为便于说明，我们应将这个优选的实施例称为“非天然核苷酸序列”。为此，术语“天然核苷酸序列”意指处于它的天然环境中且当与和它天然结合的整个启动子有效连接时的整个核苷酸序列，所述启动子也处于它的天然环境中。然而，由本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物体中表达后分离和/或纯化。然而，优选地，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可由核苷酸序列在其天然生物体中表达，但其中该核苷酸序列不处于在该生物体中其天然与之相关联的启动子的控制之下。

通常，由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列使用重组DNA技术制备（即重组DNA）。然而，在本发明的备选实施例中，核苷酸序列可用本领域所熟知的化学方法整体或分部分地合成（参见Caruthers MH等人，(1980)NucAcids Res Symp Ser215-23和Horn T等人，(1980)Nuc Acids Res SympSer225-232）。

核苷酸序列的制备

编码具有本文所定义的特定性质的蛋白质或适于修饰的蛋白质的核苷酸序列可从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴别和/或分离和/或纯化。多种方法是核苷酸序列鉴别和/或分离和/或纯化领域所熟知的。举个例子，一旦已鉴别和/或分离和/或纯化合适的序列后即可使用PCR扩增技术来制备更多条序列。

举另一个例子，可用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记的寡核苷酸探针并用于从该由生物体制备的基因组文库鉴别酶编码克隆。作为另外一种选择，可将含有与另一已知酶基因同源的序列的标记的寡核苷酸探针用于鉴别酶编码克隆。在后一种情况中，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。

作为另外一种选择，酶编码克隆可通过这样来鉴别：将基因组DNA的片段***表达载体（如质粒）中，用所得的基因组DNA文库转染酶阴性细菌，然后将转化细菌接种于含有酶底物（即麦芽糖）的琼脂板上，从而使得表达该酶的克隆能被鉴别。

在又一个备选方案中，编码该酶的核苷酸序列可通过确立的标准方法，例如由Beucage S.L.等人，(1981)Tetrahedron Letters（《四面体通讯》）22，第1859-1869页描述的亚磷酰胺方法，或由Matthes等人，(1984)EMBO J.3，第801-805页描述的方法合成制备。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接并克隆进适当的载体中。

核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备（视情况而定）。每一连接的片段对应整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如如US 4,683,202或Saiki R K等人（Science（《科学》）(1988)239，第487-491页）中所述。

氨基酸序列

本发明的范围还涵盖具有本文所限定的特定性质的酶的氨基酸序列。

如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。

本发明中所涵盖的蛋白质可与其他蛋白质，特别是酶结合使用。因而，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白质/酶和其他蛋白质/酶，所述其他蛋白质/酶可以是根据本发明的其他蛋白质/酶。

优选地，当与本发明的本身范围有关或当为本发明的本身范围所涵盖时氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且在其已由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。

序列同一性或序列同源性

本发明还涵盖与具有本文所限定的特定性质的多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列（下文称为“同源序列”）的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。

该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。

在本说明书的语境中，同源序列意指包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列有至少75、85或90%同一性、优选至少95或98%同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性（即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能）来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。

在本说明书的语境中，同源序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列（主题序列）有至少75、85或90%同一性，优选至少95或98%同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性（即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能）来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。

同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的%同源性。

%同源性可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。

尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个***或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致%同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的***和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中***“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对（反映两条比较序列之间相关性较高）将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位打分***。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。

最大%同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这种比对的合适计算机程序是Vector NTI（英杰公司(Invitrogen Corp.)）。可实施序列比较的软件的例子包括但不限于（例如）BLAST软件包（参见Ausubel等人，1999Short Protocols in MolecularBiology（《分子生物学简明方法》），第4版，第18章）、BLAST2（参见FEMS Microbiol Lett（《FEMS微生物学通讯》）1999174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett（《FEMS微生物学通讯》）1999177(1):187-8以及tatianancbi.nlm.nih.gov）、FASTA（Altschul等人，1990J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）403-410）及AlignX。至少BLAST、BLAST2和FASTA可用于离线和在线搜索（参见Ausubel等人，1999，第7-58页至7-60页）。

尽管最终的同源性百分数(%)也可以同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表（如果提供的话）（对于进一步的细节请参见用户手册）。对于一些应用而言，优选的是使用Vector NTI软件包的各默认值。

作为另外一种选择，同源性百分数可用Vector NTI（英杰公司）中的多比对特征来计算，该特征基于类似于CLUSTAL（Higgins DG和Sharp PM(1988)，Gene（《基因》）73(1),237-244）。

一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算%同源性，优选%序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。

当测定序列同一性时应该使用空位罚分，然后优选地将如下参数用于双序列比对：

对于BLAST
		空位开放(GAP OPEN)	0
空位延伸(GAP EXTENSION)	0

对于CLUSTAL	DNA	蛋白质
			字长(WORD SIZE)	2	1	K triple
空位罚分	15	10
			空位延伸	6.66	0.1

在一个实施例中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。

合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸测定。

合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。

杂交

本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与本发明序列互补的序列的序列。

本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。

本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列互补的序列的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。

术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。

优选地，互补序列是那些在严格条件（例如，50℃和0.2xSSC{1xSSC=0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0}）下能够与本文所给出的核苷酸序列杂交的那些。

更优选地，互补序列是那些在高严格条件（例如，65℃和0.1xSSC{1xSSC=0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0}）下能够与本文所给出的核苷酸序列杂交的那些。

在一更优选的方面中，本发明涵盖可在高严格条件（例如65℃和0.1xSSC）下与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。

实例

实例1

材料和方法

从商业孵化场购买3600只1日龄的Cobb雄性雏鸡。在研究开始时，分区(block)向每一处理鸡舍(pen)分配50只雄性雏鸡。研究由如下处理组成（表1）：

表1.实例1的实验设计。

¹来自大肠杆菌的植酸酶

²来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶、来自里氏木霉的木聚糖酶、来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶。

³Enviva为枯草芽孢杆菌菌株Bs2084、LSSAO1和15AP4的组合，由丹尼斯克公司提供。

⁴由丹尼斯克公司提供的Axtra

在研究开始、第23天、第35天和结束（第42天）时记录每一鸡舍的鸡重量。鸡舍为测量单元。以碎屑（开食料）或丸粒（生长料和肥育料）形式饲喂肉鸡饲粮。饲粮满足或超过NRC标准（表2）。冲洗混合器以防止饲粮交叉污染。使用Davis S-20混合器混合所有处理饲料并使用California制丸磨制丸（冷丸粒温度为65℃至70℃）。自每一批次开始、中间以及结束从每一处理饲粮收集样品并共混在一起以确认饲料中的酶活性和Enviva Pro存在性。

表2.实例1的实验饲粮组成。

鸡自第0至42天不限量接受适于处理的饲料。用于所有实验处理的酶和Enviva Pro均由丹尼斯克公司以适当混合物和水平提供。在背景中，所有饲粮均含有500FTU大肠杆菌植酸酶。将鸡舍布置在设备内以防止直接接触以避免污染。在第23天时由开食料换为生长料。在第35天时用肥育料替代生长料。在每次改变饲料时，分区从鸡舍移取饲喂器，再次称重，清空并重新装填适当的处理饲粮。在研究的最后一天对饲料进行称重。每日针对死亡率检查鸡舍。在鸡被淘汰或发现死亡时，记录日期和移出重量(Kg)。对所有死亡或淘汰的鸡实施肉眼尸检以确定性别和可能的死亡原因。注意坏死性肠炎的迹象。

所有鸡舍均具有大约4英寸厚褥草，其具有一层新鲜松屑。

在将所有鸡放置于鸡舍之前用商业球虫病疫苗(Coccivac-B)对其进行喷雾疫苗接种。在第20、21和22天，对所有鸡（处理1除外）给予产气荚膜梭状芽孢杆菌的肉汤培养物。采用已知引起NE且源自商业肉鸡操作的产气荚膜梭状芽孢杆菌的野外分离株作为攻击生物体。每天使用新鲜接种物。滴定水平为大约1.0×10^8-9。每一鸡舍接受相同量的接种物。通过混合进管式饲喂器基部中存在的饲料中来施用接种物。在第23天，从每一鸡舍选择5只鸡，实施安乐死，分组称重，并检验坏死性肠炎损伤的存在程度。评分是基于0至3分，其中0是正常，而3是最严重（0=无，1=轻微，2=中度，3=显著/严重；Hofacre等人，2003J.Appl.Poult.Res.（《应用家禽研究杂志》）12:60–64）。在研究期间不使用伴随的药物疗法。

用配对t检验分离平均值。认为在P<0.05下具有显著差异。使用鸡舍作为实验单元。

结果

图1示出了坏死性肠炎攻击模型中肉鸡的坏死性肠炎损伤评分，以0至3分***计。合并SEM=0.15

攻击对照处理与未攻击对照处理相比损伤评分增加。添加DFM与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶的组合与所有其他处理相比降低了损伤评分。与单独的DFM或酶本身相比添加DFM与酶的组合降低了损伤评分。

图2示出了坏死性肠炎攻击模型中肉鸡的体重增加。合并SEM=28.6

图2显示，与攻击对照相比DFM(Enviva)与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶的组合的组合显著改善了经产气荚膜梭状芽孢杆菌攻击的肉鸡的体重增加（BW增加）–甚至导致BW增加的改善超过阴性对照（即未攻击对照）。该处理显著优于任何其他处理。

图3示出了坏死性肠炎攻击模型中肉鸡的饲料转化率。合并SEM=0.016

与攻击对照和酶本身及其他处理相比，Enviva Pro(DFM)与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶的组合显著改善（降低）了从孵化至第42天的肉鸡的FCR（g BW增加/g摄取饲料）。

实例2

材料和方法

从商业孵化场获得500只Cobb雄性肉雏鸡。每次处理将总共26只雏鸡随机分配给8个重复鸡舍中的一者。地面鸡舍（16ft²/鸡舍）位于含有控制加热、排风扇、热灯和新鲜木屑的帘布边房屋中。前四天使鸡暴露于24小时光循环的荧光照明中，随后在实验的剩余时间实施16小时光：8小时暗循环。在钟形饲喂器中提供饲料并经由***饮水器供应水，其可不限量获取。利用注射器向1日龄雏鸡的口腔中人工施用5X剂量的Coccivac-B（英特威公司(Intervet)）。

表3.实例2的实验设计。

¹来自大肠杆菌的植酸酶

²来自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶、来自里氏木霉的木聚糖酶、来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶。

³Enviva

为枯草芽孢杆菌菌株Bs2084、LSSAO1和15AP4的组合，由丹尼斯克公司提供。

⁴由丹尼斯克公司提供的Avizyme

给雏鸡饲喂含有或不含有Enviva Pro或木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶（Avizyme1502；表3）的饲粮。用于所有实验处理的酶和Enviva Pro均由丹尼斯克公司以适当混合物和水平提供。所有饲粮均含有500FTU大肠杆菌植酸酶。将鸡舍布置在设备内以防止直接接触以避免污染。

所有饲粮均是基于玉米-大豆粉-DDGS的饲粮。在研究期间（第1至20天）提供开食料。将饲粮制丸(65–70℃)并制成碎屑。自每一批次开始、中间以及结束从每一处理饲粮收集样品并共混在一起以确认饲料中的酶活性和Enviva Pro存在性。

表4 实例2的实验饲粮组成。

在第1、11、20、38和48天记录体重和饲喂器重量以计算饲料摄取、体重增加和饲料转化率。以每日计监测死亡率及淘汰率(culls)并用其调节饲料消耗和增加。在第11天和第20天通过颈脱位法使来自6个重复鸡舍的一只鸡安乐死以收集粘膜刮屑。从回肠（麦克尔憩室至回肠-盲肠连接处）收集粘膜刮屑。切离回肠并沿其长度切开以使腔暴露，随后用PBS快速并轻柔地冲洗以移除消化物。使用显微镜载玻片的边缘通过沿切离的组织切片的长度刮削来移出粘膜层。立刻将粘膜层冷冻夹持在液氮中的铝盘之间以保护RNA完整性，并储存于单独的无菌采样袋(whirl-pack)中。在采样期间将冷冻组织样品储存于液氮中并在分析之前储存于-80℃下。使用Trizol试剂（英杰公司）使用用于组织破碎的机械均质器分离来自粘膜刮屑的总RNA。使用iScript（伯乐公司(Bio-Rad)）根据制造商的建议将总RNA(0.5μg)逆转录成互补DNA。使用鸡特异性引物评估所分泌的炎性细胞因子基因（白介素-10、干扰素-γ和白介素-17）的mRNA丰度。另外，测量TATA-BP、HPRT-1和β-肌动蛋白mRNA丰度用于使用geNorm软件进行数据归一化。使用如由Rudrappa和Humphrey(2007)J.Nutr.（《营养学杂志》）137:427-432所述的改良delta-delta Ct方程测定基因表达中mRNA丰度的倍数变化并进行对数转换用于数据分析。

用配对t检验分离平均值。认为在P<0.05下具有显著差异。使用鸡作为mRNA数据的实验单元。

结果

图4示出了肉鸡的回肠粘膜刮屑中的干扰素-γ基因的mRNA丰度。

11日龄：合并SEM=0.1

20日龄：合并SEM=0.6

与阴性对照、Enviva Pro+植酸酶、以及木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶相比，Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶的组合上调了11日龄肉鸡（在孵化时接受了5倍活球虫病疫苗）的回肠中的IFR-g表达。在第21天，与阴性对照相比，Enviva Pro+植酸酶、以及Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶的组合下调了回肠中的IFR-g表达。这些数据表明，免疫应答的调节可能是肉鸡中DFM与4种酶组合的性能改善的机制之一。

图15示出了48日龄肉鸡的饲料转化率。48日龄：合并SEM=0.041

实例3

材料和方法

用肉鸡进行一个消化率试验以测定膳食酶和DFM处理对营养物质利用的效果。将笼子封闭在环境控制室中。鸡接受20小时荧光照明并且让其自由地获得饲粮和水。在第1天，经由饮用水将肉鸡活球虫病疫苗给予所有雏鸡。在前三天在笼子铁网底板上提供纸以使得循环利用艾美球虫卵囊。研究由如下处理组成（表5）。

表5.实例3的实验设计。

¹来自大肠杆菌的植酸酶

²来自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶1、来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶2、来自里氏木霉的木聚糖酶、来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶。

³Enviva

⁴由丹尼斯克公司提供的Avizyme

⁵由丹尼斯克公司提供的Axtra

单独地称重总共192只鸡并基于体重分配给48个笼子（4只鸡/笼）。随后将8个饲粮处理随机分配给六个笼子每一者。鸡从第0至21天不限量接受对处理而言适当的开食料。用于所有实验处理的酶和Enviva Pro均由丹尼斯克公司以适当混合物和水平提供。所有饲粮均含有500FTU的大肠杆菌植酸酶。将鸡舍布置在设备内以防止直接接触以避免污染。在整个实验期间对鸡饲喂糊料形式的开食料（表6）。

表6.实例3的实验饲粮组成。

在第21天，通过心脏内注射戊巴比妥钠使每个笼子中的四只鸡安乐死并通过用蒸馏水轻柔冲洗使较下部回肠的内容物表现。汇集笼子内的鸡的消化物，从而每个饲粮处理有6份样品。将消化物收集后立刻冷冻，冻干并进行处理。根据标准程序，分析消化物样品和饲粮的Ti、DM、GE、淀粉、脂肪、N和氨基酸（不包括色氨酸）。如由Ravindran等人(2005)所报告，基于不可消化的Ti的浓度进行回肠消化率系数的计算。基于淀粉的平均总能量(4.2kcal/g)、脂肪的平均总能量(9.4kcal/g)或蛋白质的平均总能量(5.5kcal/kg)计算淀粉、脂肪和蛋白质对回肠可消化能的能量贡献。响应于酶和DFM的可消化氨基酸的改善表现为与回肠水平的非消化氨基酸的量相关；将该线性函数的斜率用作添加剂对氨基酸消化率的效应的指标。

用配对t检验分离平均值。认为在P<0.05下具有显著差异。使用笼子作为实验单元。

结果

图5示出了21日龄肉鸡的表观回肠可消化能。

合并SEM=0.027

添加Enviva Pro(DFM)与淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和植酸酶的组合与这些酶本身和阴性对照相比，展现出回肠可消化能的商业相关增加。这些数据指示DFM改善了这些外源性酶对家禽饲粮的能量消化率的效果。为避免产生疑问，淀粉酶2是通过使用AxtraXAP中的淀粉酶而淀粉酶1是通过使用Avizyme1502中的淀粉酶。

图6示出了三个饲粮处理相对于对照处理的回肠氨基酸消化率增加，其随使用21日龄肉鸡的对照处理中回肠未消化氨基酸而变化。

该图显示了饲粮处理的回肠氨基酸消化率相对于对照处理中肉鸡回肠中的氨基酸的未消化部分的改善。处理内的每个点代表所测量氨基酸中的一者。与Enviva Pro+植酸酶(+3.6%)及与木聚糖酶、淀粉酶2、蛋白酶+植酸酶本身（即无DFM）(+4.7%)相比，在木聚糖酶、淀粉酶2、蛋白酶+植酸酶的基础上添加Enviva Pro增加了氨基酸的回肠消化率(+11.3%)。这些数据指示DFM改善了这些外源性酶用以增加家禽饲粮的氨基酸消化率的功效。

图7示出了使用21日龄肉鸡的相对于对照处理的回肠可消化能的改善。

该图给出了每一饲粮处理与使用植酸酶的阴性对照处理相比的回肠可消化能的增量。另外，给出了所计算的淀粉、脂肪或蛋白质的能量贡献。添加Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶2、蛋白酶+植酸酶的组合与EnvivaPro+植酸酶处理及木聚糖酶、淀粉酶2、蛋白酶+植酸酶本身处理相比增加了回肠可消化能。添加Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶1、蛋白酶+植酸酶的组合相对于酶本身产生了商业上重要的回肠可消化能增量。这些数据表明了在DFM存在下4种酶增加肉鸡饲粮的回肠可消化能的改善能力。

实例4

材料和方法

用肉鸡进行一个消化率试验以测定膳食酶和DFM处理对营养物质利用的效果。将笼子封闭在环境控制室中。鸡接受20小时荧光照明并且让其自由地获得饲粮和水。在第1天，经由饮用水将肉鸡活球虫病疫苗给予所有雏鸡。在前三天在笼子铁网底板上提供纸以使得循环利用艾美球虫卵囊。研究由如下处理组成（表7）：

表7.实例4的实验设计。

¹来自大肠杆菌的植酸酶

³Enviva

⁴由丹尼斯克公司提供的Avizyme

⁵由丹尼斯克公司提供的Axtra

单独地称重总共144只鸡并基于体重分配给36个笼子（4只鸡/笼）。随后将6个饲粮处理随机分配给六个笼子每一者。鸡从第0至21天不限量接受对处理而言适当的开食料。用于所有实验处理的酶和Enviva Pro均由丹尼斯克公司以适当混合物和水平提供。将鸡舍布置在设备内以防止直接接触以避免污染。在整个实验期间对鸡饲喂糊料形式的开食料（表6）。

表8.实例4的实验饲粮组成。

经连续4天（第17至20天）定量测量每个笼子的饲料摄取量和总***物输出量用以测定氮校正的表观代谢能(AMEn)和氮保留量。将每日***收集物汇集在笼子中，在共混器中混合并次级取样。将每次级样品冻干，研磨至通过0.5mm筛并在-4℃下储存于气密塑胶容器中待分析。使用标准程序针对DM、GE和N分析处理过的样品。

结果

图8示出了饲喂给17至21日龄的肉鸡的饲粮处理的氮校正表观代谢能AMEn。合并SEM=0.015

添加Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶的组合与阴性对照饲粮相比增加了响应酶的饲粮AMEn。具体而言，添加Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶2、蛋白酶+植酸酶的组合与仅具有Enviva Pro的饲粮相比增加了响应酶的饲粮AMEn。

图9示出了17至21日龄肉鸡的氮保留量。合并SEM=0.006

添加Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶的组合与阴性对照饲粮相比增加了肉鸡响应酶的氮保留量。具体而言，在木聚糖酶、淀粉酶2、蛋白酶+植酸酶的基础上添加Enviva Pro与饲喂仅具有Enviva Pro的饲粮的肉鸡相比增加了肉鸡响应酶的氮保留量。

实例5

材料和方法

从商业孵化场获得308只Ross雄性肉雏鸡。每个处理将总共10只雏鸡随机分配给6个重复笼子中的一者。前四天使鸡暴露于24小时光循环的荧光照明中，随后在实验的剩余时间实施16小时光：8小时暗循环。不限量供应饲料和水。实验设计由如下处理组成。

表9.实例5的实验设计。

¹来自大肠杆菌的植酸酶

⁴由丹尼斯克公司提供的Avizyme

在处理2至6中，利用注射器向1日龄雏鸡的口腔中人工施用过剂量（推荐剂量x5）的球虫病疫苗（B，英特威公司）。在处理2中，以批准水平(60g/MT)使用沙利霉素(Bio-cox)作为抗球虫药。将鸡舍布置在设备内以防止直接接触，从而避免与艾美球虫卵囊及DFM的交叉污染。用于所有实验处理的酶和Enviva Pro均由丹尼斯克公司以适当混合物和水平提供。在背景中，所有饲粮均含有500FTU大肠杆菌植酸酶。

表10.实例5的实验饲粮组成。

使每个重复笼子的总共2只14日龄的鸡安乐死以从中段回肠收集粘膜刮屑。将回肠用蒸馏水冲洗并用一把剪刀剪开。将剪开的部分在清洁玻璃板上放平。利用载玻片的长边缘从回肠的中部区小心地刮取粘膜。将每份样品储存于2ml RNA later（Ambion公司）中并在-80℃冷冻冰箱中冷冻。使样品在冰上解冻。根据标准方案利用Trizol试剂分离总RNA。在琼脂糖凝胶上测定RNA的完整性。利用MMLV逆转录酶逆转录RNA。通过实时PCR在Biorad实时MyIQ机上测定粘蛋白(MUC2)的表达。

结果

图10示出了14日龄肉鸡的回肠粘膜刮屑中的MUC2基因的mRNA丰度。合并SEM=0.14

添加Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶的组合与攻击对照相比下调了用5X剂量活球虫病疫苗攻击的肉鸡的回肠中的MUC2表达。这些数据表明，由于粘蛋白分泌减少引起的内源性氨基酸损失减少可能是接受DFM与4种酶的组合的肉鸡性能改善的原因。

实例6

材料和方法

在23日龄时从来自实例1给出的试验的肉雏鸡提取组织样品。处理说明在表1中给出。从每个鸡舍的2只鸡移出空肠、胰腺和肝脏并汇集粘膜，从而每次处理得到8份样品。将样品在缓冲溶液(PBS)中清洗，根据制造商的方案浸没于组织储存试剂(RNAlater)中并于-80℃下储存。使用如由Chomczynski和Saachi（1987；Anal.Biochem.（《分析生物化学》）162:156-9）所述的单步酚-氯彷提取方法从每份组织样品分离总RNA。通过测量260nm下的吸光度(Nanodrop)测定RNA的浓度并通过在1.2%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳来监测完整性。仅考虑使用具有足够纯度且260nm对280nm下的吸光度之比大于1.87的RNA。

使用70个碱基对的寡核苷酸（Opereon Biotechnologies公司）根据由Druyan等人（2008；Poult.Sci.（《家禽科学》）87:2418-29）描述的方案制造微阵列。阵列的实验设计为如Garosi等人（2005;Br.J.Nutr.（《英国营养学杂志》）93:425-32）所述的完整交织环(completeinterwoven loop)设计，其中以容许比较所有处理的多个成对方式将每一样品与其他样品直接比较。根据由Druyan等人（2008；Poult.Sci.（《家禽科学》）87:2418-29）描述的方法标记样品，其中一半样品将用Cy3标记而一半样品用Cy5标记，Cy3和Cy5是花菁的荧光染料。在添加Cy3和Cy5标记的cDNA探针之前使用Pronto Plus!微阵列杂交试剂盒(ProntoPlus!Microarray Hybridisation Kit)进行杂交，并用清洁的玻璃盖玻片(Lifterslip)覆盖并使其杂交16小时。随后在设定至65%激光功率的Scan Array Gx PLUS微阵列扫描仪(Scan Array Gx PLUS MicroarrayScanner)上扫描微阵列以获取图像。

使来自独立样品的总RNA逆转录以产生cDNA，随后将其用作qPCR扩增的模板，如Druyan等人（2008；Poult.Sci.（《家禽科学》）87:2418-29）所述的。针对每一基因优化热循环参数并且一式两份地使每一基因在单个仪器运行中独立扩增。

从微阵列的扫描图像产生数据文件，但使用ScanAlyze软件提取每个载玻片及染料组合的强度原始数据。然后用JMP Genomics来分析强度数据文件，包括及初始log2转换。使用局部加权回归来进行数据归一化，并且首先在阵列内进行平滑处理，以及在所有阵列上进行平滑处理。使用混合模型ANOVA分析所得的归一化log2强度。

使用基于P=0.05的Bongerroni校正的显著性阈值比较平均强度。对于完整阵列（包括所有重复）而言，使用3个并排探针计算每个基因的格栅强度的平均值，每个基因产生总共四个重复平均值（每一格栅产生一个平均值）。对取决于处理的一式两份样品的Ct比的数据（样品基因Ct：样品GAPDH Ct）实施单向ANOVA。

结果

使用微阵列平台收集表达数据并产生“热图(heat map)”以可视化空肠的数据（图16）和胰腺的数据（图17）。将六个所关注基因的相对表达水平转化为基于图16中所见的标度的视觉提示。用减号（“-”）标记低表达基因，用加号（“+”）标记高表达基因；而较大的灰色强度描绘较大的偏离处理的平均表达水平的差别。所测量的基因及其潜在功能（purported function）可参见表11。使用实时PCR验证蔗糖酶-异麦芽糖酶(SI)及淀粉酶2A(AMY2a)的热图中所示的基因表达并且其与阵列数据高度相关。

表11.所测基因的潜在功能。

基因	种类	功能
			PEPT1	寡肽转运蛋白1	营养物质转运
GCK	葡糖激酶	葡萄糖代谢中的初始步骤
			SI	蔗糖酶异麦芽糖酶	葡萄糖代谢
ZO1	紧密连接蛋白1	紧密连接形成，肠完整性
			CD3d	T-细胞抗原CD3	T-细胞标记
AMY2A	淀粉酶2A	淀粉和蔗糖代谢

在图16和17中，注释如下：

未攻击对照=未攻击对照+植酸酶

CC=攻击对照+植酸酶

CC+淀粉酶=攻击对照+植酸酶+淀粉酶

CC+XAP=攻击对照+植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶

CC+EP=攻击对照+植酸酶+Enviva Pro

CC+EP+淀粉酶=攻击对照+植酸酶+淀粉酶+Enviva Pro

CC+EP+XAP=攻击对照+植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+EnvivaPro

木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶增加了寡肽转运蛋白1(PEPT1)的表达，并且在与Enviva Pro组合时进一步增加了该表达。PEPT1是肽转运***的一部分并且负责摄取宽泛范围的二肽和三肽。

攻击对照使葡糖激酶(GCK)的表达下调，但淀粉酶+植酸酶或木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶与Enviva Pro的组合产生了类似于未攻击对照的上调。在木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶与Enviva Pro一起使用时，上调程度较大。

利用蔗糖酶异麦芽糖酶(SI)也观察到类似模式，其中Enviva Pro与淀粉酶+植酸酶或木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶的组合产生了比攻击对照及未攻击对照二者均大的上调。GCK是葡萄糖代谢中的关键酶而SI负责蔗糖和异麦芽糖的水解，因此在动物中的碳水化合物的消化和吸收中具有重要作用。

紧密连接蛋白1(ZO1)在攻击对照中最高表达。利用酶处理观察到降低，但在使用Enviva Pro时观察到表达的较大下调且在与木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶组合时尤其如此，该组合产生与未攻击对照类似的下调水平。ZO1是位于紧密连接处的胞质面上的蛋白质，该蛋白质具有多种作用，范围为紧密连接组装的信号转导至紧密连接本身的稳定性。

T细胞抗原CD3(CD3D)在攻击对照中高度表达。单独酶处理的确使表达稍微降低，但在与Enviva Pro组合时使其显著下调。木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶的组合产生酶处理的最大下调，并且在与Enviva Pro组合时产生甚至更大下调，接近未攻击对照所观察到的下调。CD3D是存在于T细胞的表面分子并且在T细胞结合期间起重要作用且是T细胞受体/CD3复合物的一部分。

α淀粉酶(AMY2A)在未攻击对照及攻击对照中高度表达，但添加淀粉酶+植酸酶或木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶导致表达降低，在尤其针对木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶组合使用Enviva Pro时，其进一步降低。鸡α淀粉酶主要在胰腺中产生且在淀粉消化中具有主要作用。

讨论

在给予木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶、尤其与Enviva Pro组合时，肽转运蛋白寡肽转运蛋白1(PEPT1)的表达增加表明肽的可利用率增加并因而肽转运蛋白的需求增加，这指示酶和DFM对于增加动物的肽吸收具有协同效应，这使得能更大生长。实例1的动物性能结果支持该结论。使用淀粉酶+植酸酶或木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶与Enviva Pro的组合时葡糖激酶和蔗糖酶异构酶的表达增加表明，刷状缘中的葡萄糖吸收增加且蔗糖及异麦芽糖的可利用率增加，这指示酶与DFM之间具有正相互作用而增加小肠中的碳水化合物吸收并因而增加来自饲粮的能量可利用率。攻击对照的葡糖激酶表达降低表明，产气荚膜梭状芽孢杆菌攻击对粘膜造成损害且添加Enviva Pro及木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶减轻了该损害。

Enviva Pro对降低紧密连接蛋白1的表达的效果指示对肠中的蛋白质转换的需求较低，这可与高度肠完整性相关。然而，攻击对照中的表达增加表明，蛋白质的转换/需求是高度由于缺乏肠完整性，这可能是由于球虫和产气荚膜梭状芽孢杆菌感染。酶单独对改善该情况具有一定效果，但使用Enviva Pro时观察到的累加效应表明了来自该组合的更大有益效果。这指示Enviva Pro起到增加肠完整性并因而有益于动物的健康的作用。增加的肠完整性及因而增加的吸收能力可能是在DFM存在时外源性酶的有效性增加的机制之一。

攻击对照中的T细胞抗原CD3d的表达增加表明，由于攻击，细胞介导的免疫应答增加。在这些情况下，鸡将经历次优性能，因为免疫应答将需要可用于生长的能量，并且因为一些鸡将经历全身性疾病响应。在Enviva Pro单独使用或与酶组合使用时，该免疫标记增加的表达明显被逆转。肠中的免疫应答的下调可能是在DFM存在时外源性酶在营养物质吸收及性能中有效性增加的机制之一。

利用淀粉酶+植酸酶或木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶的组合时观察到的α淀粉酶(AMY2A)产生的下调表明，鸡响应所供应的外源性酶而降低其内源性淀粉酶的产生。利用Enviva Pro及木聚糖酶+淀粉酶+蛋白酶+植酸酶时观察到的累加效应表明，DFM与外源性酶协同作用以使鸡可利用原本需消耗以产生用于消化饲粮中的淀粉的酶的能量。

利用酶与DFM的组合时下调的免疫应答和较高的肠完整性以及较好的营养物质消化和吸收的净效应明显地决定了肉鸡的增强的生产性能。

实例7

材料和方法

利用肉鸡进行消化率试验以测定饲粮酶和DFM处理对能量利用的效果。从商业孵化场获得总共288只一日龄雄性Ross308雏鸡并在具有悬空铁丝网的成排鸡舍中孵育直至第14天。鸡在孵化时用活球虫疫苗(Coccivac-B)接种。给雏鸡饲喂基于玉米-SBM-DDGS的开食料。第14天直至第21天为雏鸡提供实验饲粮。在整个21天时段内不限量提供饲料和水。在环境控制室中的成排鸡舍中，每个鸡舍圈养6只雏鸡，其中它们从一日龄的35℃开始每日接受补充热且每周降低2℃。以23L:1D提供光。在第15天，对雏鸡单独称重，分选，绑住翅膀并使用完全随机设计随机分配给实验单元。每个处理由8个鸡舍/处理组成。研究由如下处理组成（表12）。

表12.实例7的实验设计。

¹来自布丘氏菌的植酸酶。

³Enviva

⁴GalliPro Tect为包含地衣芽孢杆菌的一个菌株(DSM17236)的DFM。

用于所有实验处理的酶和DFM均由丹尼斯克公司以适当混合物和水平供应及提供。将鸡舍布置在设备内以防止直接接触以避免交叉污染。在整个实验时段内对鸡饲喂糊料形式的开食料（表13）。

表13.实例7的实验饲粮组成。

在最后2天将清洁***物托盘放置于适当位置并在第21天从鸡舍收集***物样品。将所收集***物样品于-20℃下冷冻，之后将其于65℃下在烘箱中干燥3天以测定干物质（AOAC International，2005；方法934.01）。还将饲料样品校正至以干物质计，测量5.0g的每份样品并将其在100℃下的烘箱中干燥24小时。随后研磨***物样品通过1mm筛，研磨饲料样品通过0.5mm筛。根据标准程序针对Ti、DM、GE和N分析***物样品和饲粮。表观代谢能(AME)计算是基于不可消化的标记(Ti)的浓度和饲粮及***物的总能量。针对水分含量的差异进行适当校正。针对零氮保留量通过与8.22kcal/克保留于体内的氮相乘测定N-校正的AME(AMEn)（Hill和Anderson，1958；J.Nutr.（《营养学杂志》）64:587–603）。

结果

图18示出了21日龄肉鸡的由氮保留量校正的表观代谢能(AME_n)。DFM的效果：P<0.001；酶的效果：P<0.001；DFM x酶的效果：P=0.27；合并SEM=32kcal。

添加木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和植酸酶与Enviva Pro或GalliProTect的组合相对于对照处理可改善AME_n，其与酶或DFM本身相比显著更大。与阴性对照处理相比，由于木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、植酸酶与EnvivaPro的组合(235kcal/kg)或与GalliPro Tect的组合(215kcal/kg)的AME_n增量，比在单独施加时添加酶及DFM的效果大（对于Enviva Pro为152kcal/kg，或对于GalliPro Tect为120kcal/kg）。

实例8

材料和方法

从商业孵化场购买1400只1日龄的Cobb雄性雏鸡。在研究开始时，分区向每个处理的7个鸡舍中的一者分配50只雄性雏鸡。研究由如下处理组成（表1）：

表1.实例8的实验设计。

¹来自大肠杆菌的植酸酶

³Enviva

⁴由丹尼斯克公司提供的Axtra

在研究开始、第21天和结束（第42天）时记录每一鸡舍的鸡重量。鸡舍为测量单元。以碎屑（开食料）或丸粒（生长料和肥育料）形式饲喂肉鸡饲粮。饲粮满足或超过NRC标准（表2）。冲洗混合器以防止饲粮交叉污染。使用Davis S-20混合器混合所有处理饲料并使用California制丸磨制丸（冷丸粒温度为65℃至70℃）。自每一批次开始、中间以及结束从每一处理饲粮收集样品并共混在一起以确认饲料中的酶活性和Enviva Pro存在性。

表2.实例8的实验饲粮组成。

鸡自第0至42天不限量接受对于处理而言适当的饲料。用于所有实验处理的酶和Enviva Pro均由丹尼斯克公司以适当混合物和水平提供。在背景中，所有饲粮均含有500FTU大肠杆菌植酸酶。将鸡舍布置在设备内以防止直接接触以避免污染。

在第21天时由开食料换为生长料。在第35天时用肥育料替代生长料。在每次改变饲料时，分区从鸡舍移取饲喂器，再次称重，清空并重新装填适当的处理饲粮。在研究的最后一天对饲料进行称重。每日针对死亡率检查鸡舍。在鸡被淘汰或发现死亡时，记录日期和移出重量(Kg)。对所有死亡或淘汰的鸡实施肉眼尸检以确定性别和可能的死亡原因。注意坏死性肠炎的迹象。

所有鸡舍均具有大约4英寸厚褥草，其具有一层新鲜松屑。

在将所有鸡放置于鸡舍之前用商业球虫病疫苗(Coccivac-B)对其进行喷雾疫苗接种。在第18、19和20天，对所有鸡（处理1除外）给予产气荚膜梭状芽孢杆菌的肉汤培养物。采用已知引起坏死性肠炎且源自商业肉鸡操作的产气荚膜梭状芽孢杆菌的野外分离株作为攻击生物体。每天使用新鲜接种物。滴定水平为大约1.0×10^8-9。每一鸡舍接受相同量的接种物。通过混合进管式饲喂器基部中存在的饲料中来施用接种物。

样品收集

在第21天，每种处理使总共8只鸡（1-2只鸡/鸡舍）安乐死并且从每只鸡收集砂囊下方至回肠盲肠连接处的总胃肠道并送至实验室在冰上过夜。在实验室中进一步解剖样品以获得麦克尔憩室周围的20cm的一部分空肠；弃去肠道的剩余部分。将该部分用0.1%蛋白胨冲洗以移除肠内容物并纵向打开以暴露上皮内层。将该部分以7.0次冲程/秒在99ml0.1%蛋白胨中粉碎60秒以释放粘膜缔合的细菌细胞。通过以12,000x g离心10分钟从粉碎溶液收获细菌。将所得细菌沉淀颗粒重悬浮于10ml MRS肉汤+10%甘油中，在液氮中快速冷冻，并储存于-20℃下直至进一步分析。

DNA分离

通过酚氯仿提取从所有样品分离基因组DNA并使用罗氏应用科学高纯度PCR模板纯化试剂盒(Roche Applied Science High Pure PCR TemplatePurification Kit)（印地安那州印第安纳波利斯的罗氏诊断产品公司(Roche Diagnostics Corp.,Indianapolis,IN)）进行纯化。在提取之后在DNA水平上随机成对汇集样品，每个处理总共四份样品。

焦磷酸测序

如由Dowd（Dowd等人，2008；BMC Microbiol.（《BMC微生物学杂志》）8,125）所述进行细菌标签编码的FLX扩增焦磷酸测序。在含有来自两只鸡的DNA的汇集样品中分析相等量的从每只鸡的肠粘膜分离的DNA。在每份样品中使用引物28F(5’-GAGTTTGATCNTGGCTCAG)和519R(5’-GTNTTACNGCGGCKGCTG)扩增16S rRNA基因的V1-V3区。测序后，基于品质筛选并修整原始数据。基于条码序列通过单独样品对序列进行分选。移除条码标签并移除非细菌核糖体序列。使用与源于NCBI的经品质控制和人工审核的数据库的BlastN比较来确定细菌群落组成。针对每份样品测定每一细菌ID的相对丰度。使用NCBI命名法以每一分类水平编辑数据。

统计分析

对于性能而言，使用配对t检验分离数据平均值。认为在P<0.05下具有显著差异。使用鸡舍作为实验单元。

将属水平鉴别用于分析焦磷酸测序数据。计算每个属的相对丰度并使用其进行分析。使用绝对模型(categorical model)分析对结果进行分析并随后使用JMP8.0.2（北卡罗来纳州卡瑞的司赛仕软件研究所(SASinstitute,Cary,NC)）计算卡方概率，其中将代表两只鸡的每一样品视为实验单元。

结果：

Enviva Pro与木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶的组合与攻击对照处理以及仅使用Enviva Pro和植酸酶相比降低了FCR（g BW增加/g摄取饲料）。该组合将饲料转化率降低至未攻击对照+植酸酶的水平。

图20示出了第21天时肉鸡空肠粘膜中的乳杆菌属物种的相对丰度，ChSq<0.0001。

图20示出了坏死性肠炎攻击模型中第21天时肉鸡空肠粘膜中的乳杆菌属物种与其他物种相比的相对丰度。与未攻击对照相比，攻击对照中的乳杆菌的比例降低。Enviva Pro、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶的组合比单独的Enviva Pro和植酸酶以及攻击对照更大地增加了乳杆菌的比例。

乳杆菌作为益生菌广泛用于人类和动物用途（Patterson和Burkeholder2003；Poult Sci（《家禽科学》）82(4)627-31）并且经文献记载可将肠健康改善至可与抗生素生长促进剂相当的水平（Awad等人，2009Poult Sci（《家禽科学》）88(1)49-56）。因此，Enviva Pro、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶+植酸酶的组合通过增加肠微生物群中的乳杆菌比例可改善肠健康并对饲料效率产生积极影响。

上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的条件下对所描述的本发明方法和***作出多种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施例进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施例。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。

Claims

1.一种饲料添加剂组合物，其包含直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合。

2.根据权利要求1所述的饲料添加剂组合物，其中所述直接饲喂微生物为抗病原体直接饲喂微生物。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的饲料添加剂组合物，其中所述直接饲喂微生物为活细菌。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述直接饲喂微生物包含来自一个或多个如下属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭状芽孢杆菌属和巨球形菌属、以及它们的组合。

5.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述直接饲喂微生物包含来自一个或多个如下物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双岐杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特恩氏丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、动物双岐杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种、埃氏巨球形菌、丙酸杆菌属物种、以及它们的组合。

6.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述直接饲喂微生物为如下菌株中的一者或多者：枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRLB-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)、BS18(NRRLB-50633)和BS278(NRRL B-50634)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述直接饲喂微生物为内生孢子的形式。

8.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述木聚糖酶为内切-1,4-β-d-木聚糖酶或1,4β-木糖苷酶，优选内切-1,4-β-d-木聚糖酶。

9.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述木聚糖酶来自芽孢杆菌属、木霉属、嗜热丝孢菌属、曲霉属、青霉属和腐质霉属。

10.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶或拟诺卡氏菌蛋白酶。

11.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述植酸酶为6-植酸酶或3-植酸酶。

12.根据权利要求11所述的饲料添加剂组合物，其中所述植酸酶为6-植酸酶。

13.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述植酸酶为大肠杆菌植酸酶或布丘氏菌植酸酶或哈夫尼菌植酸酶或柠檬酸杆菌植酸酶或曲霉植酸酶或青霉植酸酶或木霉植酸酶或汉逊酵母植酸酶。

14.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述淀粉酶选自由如下组成的组中的一者或多者：α-淀粉酶、G4形成性淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。

15.根据权利要求14所述的饲料添加剂组合物，其中所述淀粉酶为α-淀粉酶。

16.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述淀粉酶来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉属物种或曲霉属物种。

17.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述植酸酶以200FTU/g饲料添加剂组合物至10000FTU/g饲料添加剂组合物之间的剂量存在。

18.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述淀粉酶以50AU/g饲料添加剂组合物至20000AU/g饲料添加剂组合物之间的剂量存在。

19.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述木聚糖酶以500XU/g饲料添加剂组合物至40000XU/g饲料添加剂组合物之间的剂量存在。

20.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述蛋白酶以1000PU/g饲料添加剂组合物至60000PU/g饲料添加剂组合物之间的剂量存在。

21.根据前述权利要求中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述DFM以3.75×10⁷CFU/g饲料添加剂组合物至1×10¹¹CFU/g饲料添加剂组合物之间的剂量存在。

22.一种改善受试者的性能或改善饲料中的原料的消化率（例如营养物质消化率，如氨基酸消化率）、或改善氮保留量、或改善所述受试者对坏死性肠炎的抗性、或改善饲料转化率(FCR)、或改善受试者中的体重增加、或改善受试者中的饲料效率、或调节（例如改善）所述受试者的免疫应答、或促进受试者的胃肠道中的有益细菌生长、或减少受试者的胃肠道中的致病菌群体、或减少粪肥中的营养***的方法，所述方法包括向受试者施用直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合。

23.根据权利要求22所述的方法，所述方法包括施用根据权利要求1-21中任一项所述的饲料添加剂组合物。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述直接饲喂微生物为抗病原体直接饲喂微生物。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述直接饲喂微生物为活细菌。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述直接饲喂微生物包含来自一个或多个如下属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭状芽孢杆菌和巨球形菌属以及它们的组合。

27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述直接饲喂微生物包含来自一个或多个如下物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双岐杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特恩氏丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、动物双岐杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种、埃氏巨球形菌、丙酸杆菌属物种以及它们的组合。

28.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述直接饲喂微生物为如下菌株中的一者或多者：枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)、BS18(NRRL B-50633)和BS278(NRRL B-50634)。

29.根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述直接饲喂微生物为内生孢子的形式。

30.根据权利要求22-29中任一项所述的方法，其中所述木聚糖酶为内切-1,4-β-d-木聚糖酶或1,4β-木糖苷酶，优选内切-1,4-β-d-木聚糖酶。

31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述木聚糖酶来自芽孢杆菌属、木霉属、嗜热丝孢菌属、曲霉属、青霉属和腐质霉属。

32.根据权利要求22-31中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶或角蛋白酶或拟诺卡氏菌蛋白酶。

33.根据权利要求22-32中任一项所述的方法，其中所述植酸酶为6-植酸酶或3-植酸酶。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述植酸酶为6-植酸酶。

35.根据权利要求22-34中任一项所述的方法，其中所述植酸酶为大肠杆菌植酸酶或布丘氏菌植酸酶或哈夫尼菌植酸酶或柠檬酸杆菌植酸酶或曲霉植酸酶或青霉植酸酶或木霉植酸酶或汉逊酵母植酸酶。

36.根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述淀粉酶选自由如下组成的组中的一者或多者：α-淀粉酶、G4形成性淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。

37.根据权利要求22-36中任一项所述的方法，其中所述淀粉酶为α-淀粉酶。

38.根据权利要求22-37中任一项所述的方法，其中所述淀粉酶来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉属物种或曲霉属物种。

39.直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合的用途，其用于改善受试者的性能、或改善饲料中的原料的消化率（例如营养物质消化率，如氨基酸消化率）、或改善氮保留量、或改善所述受试者对坏死性肠炎的抗性、或改善饲料转化率(FCR)或改善受试者中的增重、或改善受试者中的饲料效率、或调节（例如改善）所述受试者的免疫应答、或促进受试者的胃肠道中的有益细菌生长、或减少受试者的胃肠道中的致病菌群体、或减少粪肥中的营养***。

40.根据权利要求39所述的用途，其中使用根据权利要求1-21中任一项所述的饲料添加剂组合物。

41.根据权利要求39-40中任一项所述的用途，其中所述直接饲喂微生物为抗病原体直接饲喂微生物。

42.根据权利要求39-41中任一项所述的用途，其中所述直接饲喂微生物为活细菌。

43.根据权利要求39-42中任一项所述的用途，其中所述直接饲喂微生物包含来自一个或多个如下属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭状芽孢杆菌属和巨球形菌属以及它们的组合。

44.根据权利要求39-43中任一项所述的用途，其中所述直接饲喂微生物包含来自一个或多个如下物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双岐杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特恩氏丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、动物双岐杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种、埃氏巨球形菌、丙酸杆菌属物种以及它们的组合。

45.根据权利要求39-44中任一项所述的用途，其中所述直接饲喂微生物为如下菌株中的一者或多者：枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)、BS18(NRRL B-50633)和BS278(NRRL B-50634)。

46.根据权利要求39-45中任一项所述的用途，其中所述直接饲喂微生物为内生孢子的形式。

47.根据权利要求39-46中任一项所述的用途，其中所述木聚糖酶为内切-1,4-β-d-木聚糖酶或1,4β-木糖苷酶，优选内切-1,4-β-d-木聚糖酶。

48.根据权利要求39-47中任一项所述的用途，其中所述木聚糖酶来自芽孢杆菌属、木霉属、嗜热丝孢菌属、曲霉属、青霉属和腐质霉属。

49.根据权利要求39-48中任一项所述的用途，其中所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶或角蛋白酶或拟诺卡氏菌蛋白酶。

50.根据权利要求39-49中任一项所述的用途，其中所述植酸酶为6-植酸酶或3-植酸酶。

51.根据权利要求50所述的用途，其中所述植酸酶为6-植酸酶。

52.根据权利要求39-51中任一项所述的用途，其中所述植酸酶为大肠杆菌植酸酶或布丘氏菌植酸酶或哈夫尼菌植酸酶或柠檬酸杆菌植酸酶或曲霉植酸酶或青霉植酸酶或木霉植酸酶或汉逊酵母植酸酶。

53.根据权利要求39-52中任一项所述的用途，其中所述淀粉酶选自由如下组成的组中的一者或多者：α-淀粉酶、G4形成性淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。

54.根据权利要求39-53中任一项所述的用途，其中所述淀粉酶为α-淀粉酶。

55.根据权利要求39-54中任一项所述的用途，其中所述淀粉酶来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉属物种或曲霉属物种。

56.一种试剂盒，其包含直接饲喂微生物、蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶和施用说明书。

57.根据权利要求56所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据权利要求1-21中任一项所述的饲料添加剂组合物。

58.根据权利要求56-57中任一项所述的试剂盒，其中所述直接饲喂微生物为抗病原体直接饲喂微生物。

59.根据权利要求56-58中任一项所述的试剂盒，其中所述直接饲喂微生物为活细菌。

60.根据权利要求56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述直接饲喂微生物包含来自一个或多个如下属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭状芽孢杆菌属和巨球形菌属以及它们的组合。

61.根据权利要求56-60中任一项所述的试剂盒，其中所述直接饲喂微生物包含来自一个或多个如下物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双岐杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特恩氏丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、动物双岐杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种、埃氏巨球形菌、丙酸杆菌属物种以及它们的组合。

62.根据权利要求56-61中任一项所述的试剂盒，其中所述直接饲喂微生物为如下菌株中的一者或多者：枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)、BS18(NRRL B-50633)和BS278(NRRL B-50634)。

63.根据权利要求56-62中任一项所述的试剂盒，其中所述直接饲喂微生物为内生孢子的形式。

64.根据权利要求56-63中任一项所述的试剂盒，其中所述木聚糖酶为内切-1,4-β-d-木聚糖酶或1,4β-木糖苷酶，优选内切-1,4-β-d-木聚糖酶。

65.根据权利要求56-64中任一项所述的试剂盒，其中所述木聚糖酶来自芽孢杆菌属、木霉属、嗜热丝孢菌属、曲霉属、青霉属和腐质霉属。

66.根据权利要求56-65中任一项所述的试剂盒，其中所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶或角蛋白酶或拟诺卡氏菌蛋白酶。

67.根据权利要求56-66中任一项所述的试剂盒，其中所述植酸酶为6-植酸酶或3-植酸酶。

68.根据权利要求67所述的试剂盒，其中所述植酸酶为6-植酸酶。

69.根据权利要求56-68中任一项所述的试剂盒，其中所述植酸酶为大肠杆菌植酸酶或布丘氏菌植酸酶或哈夫尼菌植酸酶或柠檬酸杆菌植酸酶或曲霉植酸酶或青霉植酸酶或木霉植酸酶或汉逊酵母植酸酶。

70.根据权利要求56-69中任一项所述的试剂盒，其中所述淀粉酶选自由如下组成的组中的一者或多者：α-淀粉酶、G4形成性淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。

71.根据权利要求56-70中任一项所述的试剂盒，其中所述淀粉酶为α-淀粉酶。

72.根据权利要求56-71中任一项所述的试剂盒，其中所述淀粉酶来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉属物种或曲霉属物种。

73.一种制备饲料添加剂组合物的方法，其包括将直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶混合以及（任选地）进行包装。

74.一种饲料，其包含根据权利要求1-21中任一项所述的饲料添加剂组合物。

75.根据权利要求74所述的饲料，其中所述植酸酶以400FTU/kg饲料至1000FTU//kg饲料之间的剂量存在。

76.根据权利要求74或75所述的饲料，其中所述淀粉酶以100AU/kg饲料至2000AU/kg饲料之间的剂量存在。

77.根据权利要求74-76中任一项所述的饲料，其中所述木聚糖酶以1000XU/kg饲料至4000XU/kg饲料之间的剂量存在。

78.根据权利要求74-77中任一项所述的饲料，其中所述蛋白酶以2000PU/kg饲料至6000PU/kg饲料之间的剂量存在。

79.根据权利要求74-77中任一项所述的饲料，其中DFM以7.5×10⁴CFU/kg饲料至1×10⁷CFU/kg饲料之间的剂量存在。

80.一种制备饲料的方法，所述方法包括将饲料组分与根据权利要求1-21中任一项所述的饲料添加剂组合物混合。

81.一种预混物，其包含饲料添加剂组合物和至少一种矿物质和/或至少一种维生素，所述饲料添加剂组合物包含直接饲喂微生物与蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶的组合。

82.一种预混物，其包含根据权利要求1-21中任一项所述的饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素的组合。

83.根据权利要求1-21中任一项所述的饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物用于预防和/或治疗受试者中的球虫病和/或坏死性肠炎。

84.一种预防和/或治疗坏死性肠炎和/或球虫病的方法，其中将有效量的根据权利要求1-21中任一项所述的饲料添加剂组合物施用给受试者。

85.一种饲料添加剂组合物或饲料或试剂盒或方法或用途或预混物，其是如本文中参考附图和实例总体上限定的。