SK8396A3

SK8396A3 - Antagonists and agonists of human interleukin-10

Info

Publication number: SK8396A3
Application number: SK83-96A
Authority: SK
Inventors: Chuan-Chu Chou; Xiao-Yan Cai
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1997-03-05
Also published as: AU681178B2; SG43798A1; IL110413A0; HUT73463A; WO1995003411A1; ZA945434B; CZ23396A3; CA2168110A1; CN1127529A; NO960309L; FI960353A0; NO960309D0; PL312718A1; AU7399694A; FI960353A; JPH08507930A; NZ269663A; EP0711346A1; HU9503983D0; SK150596A3

Description

Antagonisti a agonisti ľudského interIeukínu-10

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka antagonistov a agonistov ľudského interieukínu-10 a prostriedkov a spôsobu ich prípravy a použitia. Títo agonisti a antagonisti sa tvoria substitúciou alebo deléciou karboxy- alebo amino-konca aminokyselín v dospelom ľudskom interieukíne-10.

Doterajší stav techniky

Interieukín-10 (IL-10) je cytokín schopný sprostredkovávať množstvo pôsobení alebo účinkov. ID10 bol izolovaný ako z myšacích, tak aj z ľudských buniek a je zapojený do riadenia imunitnej odpovede rôznych tried alebo súborov CD4⁺ T pomocných (Th) buniek. Tieto Th bunky môžu byť rozdelené na rôzne súbory, ktoré sa odlišujú svojimi profilmi tvorby cytokínov. Dva z týchto súborov sa nazývajú Thl a Th2 bunky.

Klony T buniek Thl tvoria interieukín-2 (ILr2) a gama interferón (IFN-γ), zatiaľ čo klony T buniek Th2 secemujú IL-10, interieukín-4 (IL-4) a interleukín-5 (DL-5), všeobecne po aktivácii antigénmi a lektínmi. Obe triedy Th bunkových klonov produkujú cytokíny, ako je nádorový nekrózový faktor-a (TNF-α), interleukín-3 (IL-3) a faktor stimulácie kolónií granúlocytov-makrofágov (GM-CSF). Tretia kategória Th buniek (ThO) tvorí súčasne ID2, IFN-γ, IL-4, IL-5, TNF-α, IL-3 a GM-CSF.

Rozdielne typy produkcie cytokínov Thl a Th2 bunkami sčasti odrážajú ich úlohy v odpovedi na rôzne patogény. Thl bunky sú napríklad zapojené v úspešných bunkových odpovediach na množstvo intercelulámych patogénov. Sú zapojené aj v hypersenzitívnych reakciách oneskoreného typu. Th2 bunky sú spojené s humorálnymi odpoveďami, ktoré sú charakterizované tvorbou protilátok. Vo väčšine situácií vyvinie imunitný systém Th odpoveď, ktorá je na elimináciu konkrétneho antigénu alebo patogénu najúčinnejšia, ale nie je tomu tak vždy.

Napríklad: leishmanióza je charakterizovaná defektnou odpoveďou Thl. Tento defekt môže byť demonštrovaný použitím in vitro testov, ako je test opísaný Clericim et al. [J. Clin. Irrvest. 84:1983 (1$89)]. Použitím jedného takéhoto in vitro testu bolo ukázané, že defekt Thl odpovede možno pripísať endogénnym hladinám JL-1O, pretože funkciu Thl možno napraviť pridaním neutralizujúcich protilátok proti IL-10.

Pretože leishmanióza a iné choroby sú charakterizované defektnou odpoveďou Thl, ktorú možno pripísať nenáležitému pôsobeniu endogénneho IL-10, nastáva potreba agonistov a antagonistov IL-10 na liečbu takýchto chorôb.

Podstata vynálezu

Tento vynález napĺňa túto potrebu tým, že poskytuje prostriedky a spôsoby na poskytnutie alebo inhibovanie biologickej aktivity ľudského IL-10.

Konkrétnejšie, tento vynález poskytuje antagonistov ľudského H^IO, ktorí zahŕňajú dospelý ľudský IL-10 modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v oblasti obsahujúcej asi 12 karboxyterminálnych zvyškov.

Aminokyselinové sekvencie takýchto troch uskutočnení sú definované nasledovnými sekvenciami I, Π a ΙΠ :

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala

5560

Leu	Ser	Glu	Met	íle Gin Phe Tyr Leu Glu	Glu Val	Met Pro Gin Ala
65				70	75	80
Glu	Asn	Gin	Asp	Pro Asp íle Lys Ala His	Val Asn	Ser Leu Gly Glu
				85 90		95
Asn	Leu	Lys	Thr	Leu Arg Leu Arg Leu Ar;	g Arg Cy	s His Arg Phe Leu
			100	105		110
Pro	Cys	Glu	Asn	Lys Ser Lys Ala Val Glu	Gin Val	Lys Asn Ala Phe
		115		120		125
Asn	Lys	Leu	Gin	Glu Lys Gly íle Tyr Lys	Ala Met	Ser Glu Phe Asp
	130			135	140

íle Phe íle Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr Met Glu íle Arg Asn

145 150 155 160(I)

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 15 1015

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

2530

Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 4045

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala

5560

Leu Šer Glu Met íle Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala

70 7580

Glu Asn Gin Asp Pro Asp íle Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

9095

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe

115 120125

Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135140 íle Phe íle Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys

145 150 155(II)

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 15 1015

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 2530

Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 4045

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala 50 5560

Leu Ser Glu Met íle Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala 65 70 7580

Glu Asn Gin Asp Pro Asp íle Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

9095

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe

115 120125

Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135140 íle Phe íle Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr Met

145150

155 (ΠΙ)

Tento vynález ďalej poskytuje nukleovú kyselinu kódujúcu antagonistu ľudského IL-10, zahŕňajúceho dospelý ľudský IL-10 modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v oblasti obsahujúcej asi 12 karboxyterminálnych zvyškov. Rekombinantné vektory obsahujúce takúto nukleovú kyselinu a hostiteľské bunky obsahujúce takýto rekombinantný vektor, sú týmto vynálezom tiež poskytnuté.

Tento vynález ďalej ešte poskytuje spôsob výroby antagonistu ľudského IL-10, zahŕňajúceho dospelýý ľudský IL-10 modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslq aminokyseliny alebo deléciou jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v oblasti obsahujúcej asi 12 karboxyterminálnych zvyškov, pričom tento spôsob zahŕňa kultiváciu vyššie uvedených hostiteľských buniek za podmienok, keď je nukleová kyselina, kódujúca tohto antagonistu, exprimovaná.

Tento vynález ešte ďalej poskytuje spôsob na inhibíciu biologickej aktivity IL-10, ktorý zahŕňa uvedenie buniek, nesúcich receptory pre IL-10, do kontaktu s účinným množstvom antagonistu ľudského IL-10, zahŕňajúceho dospelý ľudský IL-10 modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v oblasti obsahujúcej asi 12 karboxyterminálnych zvyškov.

Tento vynález ďalej ešte poskytuje agonistu ľudského IL-10, ktorý zahŕňa dospelý ľudský IL-10 modifikovaný deléciou jedného až jedenástich amŕnotermálnych aminokyselinových zvyškov.

Nukleové kyseliny kódujúce týchto agonistov, rekombinantné vektory a transformované hostiteľské bunky obsahujúce takéto nukleové kyseliny, spôsoby na prípravu antagonistov a farmaceutické prípravky obsahujúce jeden alebo viac IL-10 agonistov alebo antagonistov a farmaceutický prijateľné nosiče, sú týmto vynálezom tiež poskytnuté.

Všetky odkazy tu citované sú sem v ich úplnosti začlenené odkazom.

Antagonisti podľa tohto vynálezu sú užitoční na liečbu chorôb, ako je leishmanióza, ktoré sú charakterizované defektnou odpoveďou Thl, ktorú možno pripísať endogénnemu IL-10. Môžu byť užitočné aj na liečbu chorôb spojených s imunosupresiou sprostredkovanou IL-10 alebo s nadprodukciou IL-10, ako sú B-bunkové lymfómy. Naviac sú antagonisti užitoční pre štúdie osvetľujúce mechanizmus pôsobenia IL-10 a pre racionálne návrhy liekov, pretože vykazujú silnú väzbu na receptor, oddelenú od efektorovej funkcie. Po imobilizácii na pevnej podložke môžu byť antagonisti použití na afinitné čistenie rozpustných foriem IL10 receptora, v ktorých je del etovaná transmembránová obi asť.

Vírusová IL-10 bielkovina ( BCRFI, alebo vIL-10 ) Epstein Barovho vírusu (EBV ) má tiež biologickú aktivitu IL-10 a predpokladá sa, že sa viaže na IL-10 receptory. Predpokladá sa, že expresia vIL-10 aktivity EBV dáva vírusu určité výhody na prežitie v zmysle jeho schopnosti infekcie, replikácie a udržovania sa v hostiteľskom organizme. Schopnosť vIL-10 negatívne regulovať tvorbu IFN-γ ako bunkami, tak NK bunkami, spolu s jeho posilňujúcim účinkom na životaschopnosť Bbuniek, naznačuje, že vIL-10 môže potláčať protivírusovú imunitu a súčasne podporovať potenciál EBV transformovať ľudské B-bunky.

Antagonisti IL-10 podľa tohto vynálezu môžu byť preto užitoční na účinnú podporu proti vírusovej imunity voči EBV, prípadne ďalším vírusom. Viac o potenciálnom použití IL-10 antagonistov viď napr. v Howard et al. J. Clin. Immunol. 12 : 239 (1992).

Tri reprezentačné prípravy antagonistov, mutantných IL-10, podľa tohto vynálezu, sú uvedené ďalej v Príkladoch . V jednom prípade je lyží nový zvyšok v polohe 157 sekvencie dospelého ľudského IL-10 nahradený zvyškom kyseliny gjutámovej ( sekvencia I). V iných prípadoch sú z karboxylového konca ľudského IL7 deletované tri ( sekvencia II) alebo štyri ( sekvencia III ) aminokyselinové zvyšky. Na týchto antagonistov sa nižšie odkazuje ako na antagonistov K157E, CA3 resp. CA4.

Ako sa tu používa, výraz “matumý ľudský IL-10“ je definovaný ako bielkovina bez zavádzacej sekvencie, ktorá (a) má aminokyselinovú sekvenciu v podstate zhodnú so sekvenciou IV definovanou tu nižšie

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 15 1015

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

2530

Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu

4045

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala

5560

Leu Ser Glu Met íle Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala

70 7580

Glu Asn Gin Asp Pro Asp íle Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

9095

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe

115 120125

Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135140 íle Phe íle Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Asn

145 150 155 160 (IV), a (b) má biologickú aktivitu, ktorá je bežná u natívneho IL-ΙίΟ. Toto zahŕňa prirodzené alelické varianty a iné varianty, majúce jednu alebo viac konzervatívnych a (b) má biologickú aktivitu, ktorá je bežná u natívneho ILrlO. Toto zahŕňa prirodzené alelické varianty a iné varianty, majúce jednu alebo viac konzervatívnych aminokyselinových substitúcií [ Grantham, Science 185\ 862 (1974) ], ktoré v podstate nenarúšajú biologickú aktivitu. Takéto konzervatívne substitúcie zahŕňajú skupiny synonymných aminokyselín, napr. ako je opísané v U.S. patente číslo 5 017 691 pre Leeho et al.

Je pochopiteľné, že aj keď sa v súčasnosti dáva prednosť nasledujúcim vyhotoveniam, možno na vytvorenie iných antagonistov uskutočniť iné modifikácie karboxylového konca ľudského IL-10. Napríklad by bolo možné vytvoriť účinného antagonistu náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyseliny asparágovej namiesto zvyškom kyseliny glutámovej. Ako sa tu používa, výraz “zvyšok kyslej aminokyseliny“ je teda definovaný tak, že zahŕňa ako zvyšok kyseliny asparágovej, tak aj zvyšok kyseliny glutámovej.

Môžu byť tiež uskutočňované viac alebo menej rozsiahle delécie. Deletovaných môže byť jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov, zahŕňajúcich asi 12 karboxyterminálnych zvyškov. Výhodne sa deletuje asi 8 terminálnych zvyškov, výhodnejšie 3 alebo 4 terminálne zvyšky.

Prekvapujúco sa našlo, že môže byť deletovaných až 11 aminokyselinových zvyškov z aminokonca dospelého ľudského IL-10. Tieto skrátené varianty, ktoré môžu mať v porovnaní so samotným ILrlO odlišné farmakokinetické vlastnosti, majú biologickú aktivitu dospelého ľudského IL-10, ako sa zmerala pomocou testu stimulácie MC/9 žírnych buniek. Preto sú užitočné pri liečbe všetkých indikácií vnímavých na liečbu samotným IL-10. Užitočné sú tiež na niektoré účely opísané vyššie pre antagonistov podľa vynálezu, napr. na afinitné čistenie.

Pretože majú biologickú aktivitu ľudského IL-10, ale majú skrátenú aminokyselinovú sekvenciu, odkazuje sa tu na tieto varianty tiež ako na “agonistov ľudského Π^ΙΟ“.

Všeobecne sa prijíma, že cysteínový zvyšok v polohe 12 je esenciálny pre biologickú aktivitu. Skutočne : deléciou prvých 12 zvyškov, včítane tohto

Tieto aminotermálne delécie môžu byť kombinované s vyššie uvedenými karboxyterminálnymi modifikáciami na vytvorenie antagonistov majúcich charakteristiky opísané nižšie, ale možno iné farmakokinetické vlastnosti. Títo antagonisti sú tiež súčasťou tohto vynálezu.

Nukleové kyseliny, kódujúce agonistov a antagonistov IL-10, sú tiež súčasťou tohto vynálezu.Odbomíci vedia, že v dôsledku degenerácie genetického kódu existuje mnoho rôznych nukleových kyselín, ktoré môžu kódovať každého agonistu a antagonistu. Konkrétne použité kodóny môžu byť vybrané na základe pohodlnej konštrukcie a optimálnej expresie v prokaryotických a eukaryotických systémoch.

Výhodne sa nukleové kyseliny, kódujúce agonistov a antagonistov, pripravujú použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) [Saiki et al., Science 239: 487 (1988)], ako je to podané v príklade Daughertyho et al. [Nucleic Acid Res. 19: 2471 (1991)], na modifikáciu cDNK kódujúcej ľudský IL-10. Takáto cDNK je dobre známa v odbore a možno ju pripravovať použitím štandardných metód opísaných napr. v publikácii medzinárodnej patentovej prihlášky číslo WO 91/00349. Klony obsahujúce sekvencie kódujúce ľudský IL-10 sú tiež deponované v Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, pod číslami 68191 a 68192.

Alternatívne môže byť DNK modifikovaná použitím dobre známych techník riadenej mutagenézy. Viď napr. Gillman et al., Gene 8: 81 (1979), Roberts et al., Náture 328: 731 (1987) alebo Innis (ed.), 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York, NY.

Nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu môžu byť tiež syntetizované chemicky použitím napr. fosfoamidovej metódy na pevnej fáze podľa Matteucciho et al. [J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981)], metódy Yoo et al. [ J. biol. Chem. 764: 17078 (1989)] alebo iných dobre známych metód.

Rekombinantné vektory, obsahujúce predošlé nuldeové kyseliny, sú tiež súčasťou tohto vynálezu, ako aj hostiteľské bunky transformované týmito vektormi a metódy na prípravu agonistov a antagonistov.

Inzercia DNK, kódujúcej jedného z agonistov a antagonistov, do jedného z množstva známych vektorov expresie, sa ľahko uskutoční, ale konce tejto DNK, tak aj vektora, obsahujú kompatibilné reštrikčné miesta. Pokiaľ toto nie je možné uskutočniť, môže byť potrebné modifikovať zakončenia týchto DNK a/alebo vektora spätnou digesciou prečnievajúcich úsekov jednovláknovej DNK, vytvorených štiepením reštrikčnou endonukleázou, na vytvorenie tupého konca alebo na dosiahnutie toho istého výsledku zaplnením jednovláknových zakončení náležitou DNK polymerázou.

Alternatívne, akékoľvek žiadané miesto môže byť vytvorené ligáciou nukleotidových sekvencií (spojok) na tieto zakončenia. Tieto spojky môžu obsahovať špecifické oligonukleotidové sekvencie, ktoré definujú žiadané reštrikčné miesto. Štiepený vektor a fragmenty DNK môžu byť , ak je to potrebné, modifikované aj homopolymémym predĺžením alebo PCR.

Antagonisti podľa tohto vynálezu sú charakterizovaní väzobnými afinitami pre ľudský IL-10 receptor, ktoré sú podobné ako u samotného IL-10, ale sú v podstate zbavení biologickej aktivity. Výhodne budú mať menej ako 10 % biologickej aktivity ľudského IL-10 v štandardnom teste, výhodnejšie menej ako 1 %.

Antagonisti typicky produkujú najmenej asi 25 % inhibície biologickej aktivity IL-10 v bunkách, ktoré nesú IL-10 receptory. Výhodne bude stupeň inhibície najmenej asi 50 %, výhodnejšie najmenej 75 %. Skutočný stupeň inhibície sa môže odlišovať podľa konkrétne nameranej biologickej aktivity.

Agonisti a antagonisti môžu byť chemicky syntetizovaní vhodnou metódou, ako je syntéza výhradne na pevnej fáze, metódami čiastočne na pevnej fáze, kondenzáciou fragmentov alebo klasickou syntézou v roztoku. Chemicky syntetizované polypeptidy sú výhodne pripravované peptidovou syntézou na pevnej fáze, napr. ako je opísaná Merrifieldom [ J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Science 232: 341 (1986) ] a Athertonom el al., (Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, IRL Press, Oxford).

Akýmkoľvek spôsobom pripravených agonistov a antagonistov možno čistiť použitím HPLC, gélovej filtrácie, ionomeničovej a partičnej chromatografie, protiprúdového delenia alebo iných dobre známych spôsobov.

Farmaceutické prostriedky môžu byť pripravené zmiešaním jedného alebo viacerých agonistov alebo antagonistov IL-10 alebo ich farmaceutický prijateľných solí a farmaceutický prijateľného nosiča.

Užitočnými farmaceutickými nosičmi môžu byť akékoľvek kompatibilné netoxické látky, ktoré sú vhodné na podávanie prostriedkov podľa vynálezu pacientovi. Nosič môže obsahovať vodu, alkohol, tuky, vosky a inertné tuhé látky. Do farmaceutického prostriedku môže byť tiež začlenené farmaceutický prijateľné adjuvans ( pufŕačné činidlo, dispergačné činidlo ). Všeobecne sú prostriedky užitočné na parenterálne podávanie takýchto liekov, dobre známe, napr. Remington 's Pharmaceutical Science, 18. vydanie (Mack Publishing Company, Easton, P A, 1990). Balenie po jednotlivých dávkach je často výhodné, napr. v sterilnej forme.

Podávanie agonistov a antagonistov je výhodne parenterálne, pomocou intraperitoneálnych, intravenóznych, subkutánnych alebo mtramuskulámych injekcií alebo infúzií alebo pomocou akéhokoľvek iného prijateľného systémového spôsobu. Alternatívne môže byť antagonista podávaný implantovateľným alebo injikovateľným systémom dodávania lieku, [ viď napr. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199 (1984), Lewis, ed., Controlled Release ofPesticides and Pharmaceuticals, 1981, Plénum Press, New York, New York, U.S. patenty číslo 3 773 991 a 3 270 960 ]. Možno uskutočňovať aj orálné podávanie, podávaním dobre známych prípravkov, ktoré chránia antagonistu pred gastrointestinálnymi proteázami.Viď tiež Langer, Science 249: 1527 (1990).

Agonisti a antagonisti môžu byť podávaní aj štandardnými technikami génovej terapie, včítane napr. priamej injekcie nukleovej kyseliny do tkanív, použitia rekombinantných vírusových vektorov alebo lipozómov a implantácie transfekovaných buniek. Viď napr. Rosenberg, J. Clin. Oncol. 10: (1992).

Agonisti a antagonisti môžu byť podávaní samotní alebo v kombinácii s jedným alebo s viacerými inými činidlami bežne používanými na liečenie stavov charakterizovaných defektnou Th odpoveďou. Napríklad lieky, ako interleukín-12 ( IL-12 ) alebo gama interferón (IFN-γ ), môžu byť podávané spolu s antagonistom. Inzulín, cyklosporín, prednizón alebo azatioprín môžu byť podávané spolu s agonistom, napr. ak sa používajú ako náhrada za IL-10 na liečbu alebo prevenciu od inzulínu závislého diabetes mellitus ( viď súčasne podanú U.S. prihlášku číslo 07/955

523 z 1.októbra 1992 ).

Toto spoločné podávanie jedného alebo viacerých činidiel môže byť súbežné (spolu s) alebo postupné (pred alebo po) vzhľadom na podanie agonistu alebo antagonistu. Všetky podávané činidlá musia byť v pacientovi prítomné v dostatočných hladinách, aby boli farmaceutický účinné. Typicky: pokiaľ sa druhé činidlo podá počas asi polčasu prvého činidla, považuje sa podanie týchto dvoch činidiel za spoločné.

Stanovenie príslušného dávkovania agonistu alebo antagonistu pre konkrétnu situáciu spadá pod znalosti v odbore. Všeobecne sa liečba začína menšími dávkami ako je optimum. Potom sa dávkovanie zvyšuje s malými inkrementami, kým sa nedosiahne optimálny účinok pri daných podmienkach. Ak je to žiadúce, môže byť vhodné rozdeliť celkovú dennú dávku a podávať ju po častiach.

Účinným množstvom bude dávka, ktorá vedie k preukázateľnému zlepšeniu jedného alebo viacerých klinických parametrov alebo k štatisticky významnému zlepšeniu odpovede v jednej alebo vo viacerých známych Th funkciách; niektoré z nich, ako tvorba IL-2, sú opísané vyššie. Táto odpoveď môže byť meraná in vitro pri použití krvných buniek odobraných pacientovi, napr. ako je opísané v Clerici et al., ako vyššie. Takýto in vitro test možno uskutočniť pred začiatkom liečby na poskytnutie základnej referenčnej hodnoty, s ktorou sa môže zlepšená odpoveď porovnávať.

Skutočné množstvo a počet dávok agonistov a antagonistov a ich farmaceutický prijateľných solí konkrétnemu pacientovi, bude regulované podľa posúdenia ošetrujúceho lekára, s prihliadnutím na také faktory, ako je vek, stav a veľkosť pacienta a stupeň symptómu(ov), ktorý sa lieči.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Tento vynález môže byť vysvetlený nasledujúcimi príkladmi. Pokiaľ nie je špecifikované inak, percentá udané nižšie pre tuhé látky v tuhých látkach, kvapaliny v kvapalinách resp. tuhé látky v kvapalinách, sú založené na pomeroch hmotnosť/hmotnosť, objem/objem resp. hmotnosť/objem.

Reagencie a všeobecné metódy

Reštrikčné endonukleázy boli získané od Boehringer Mannheim ( Indianopolis, IN ), zatiaľ čo súprava na ligáciu DNK bola obstaraná od Takara Biochem., Inc. (Berkley, CA). Taq polymeráza a Pfu polymeráza boli získané zo Stratagene (La Jolla, CA). Rekombinantný ľudský IL-10 ( hIL-10 ) bol pripravený štandardným spôsobom v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka ( CHC ), ako je to v podstate opísané v Tsujimoto et al. [J. Biochem. 106: 23 (1989)]. Médium na tkanivové kultúry, fetálne bovinné sérum a glutamín boli získané od Gibco-BRL (Gaithesburg, MD). Oligonukleotidové priméry boli syntetizované štandardnými metódami použitím DNK syntetizátora Applied Biosystems 380A, 380B alebo 394 (Foster City, CA).

Štandardné metódy rekombinantnej DNK sa uskutočňovali v podstate tak, ako ich opisuje Sambrook et al. v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York.

Transfekcia

Transientná expresia sa uskutočňovala nasledovne. Bunky COS ( ATCC CRL 1651 ) boli udržiavané v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu ( DMEM ) doplnenom 10 % fetálnym bovinným sérom, 6 mM glutamínom a penicilínom/streptomycínom. Transfekcia sa uskutočnila elektroporáciou s použitím Bio-Rad GENE PULSER* ( Richmond, CA).

Bunky boli uvoľnené z kultivačných misiek pôsobením trypsínu-EDTA a suspendované v čerstvom kultivačnom médiu. Asi 5 x 10⁶ buniek v objeme 250 μΐ bolo zmiešaných s 5 μg plazmidovej DNK a potom elektroporovaných pri napätí nastavenom na 0,2 V a kapacite nastavenej na 960 mFD.

Po elektroporácii boli bunky prenesené do 10 cm kultivačných misiek a kultivované v 5 % CO₂ pri 37 °C počas 6 hodín v 10 ml sérum obsahujúceho DMEM. Keď sa bunky prichytili na misky, médium bolo odstránené odsatím a nahradené bezsérovým médiom. Po 72 hodinách bolo kondicionované médium zobrané na analýzu.

Príprava antagonistov

Rekonštrukcia cDNK ľudského IL-10 divého typu a vektorov expresie

Na umožnenie expresie a manipulácie bola kódujúca oblasť hIL-10 cDNK generovaná PCR za použitia hIL-10 vektora, založeného na pCDSRa [ Viera e t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88'. 1172 (1991); sekvencia deponovaná GenBank pod prístupovým číslom M57627 ] ako templátu, aj keď by bolo možné použiť iné známe zdroje tejto cDNK.

Kozákovej konsentný stavovcový iniciátor translácie [ Kozák, Nucleic Acid Res. 20: 8125 (1987) ] bol zavedený do 5'priméru nazvaného B1789CC (sekvencia V):

GTCGACTGCA GCCGCCACCA TGCACAGCTC AGCACTGCTC TGTTGCCTGG TCCTCCTGAC 60 (V)

PslI miesto resp. EcoRI miesto boli pridané k 5' priméru B1789CC resp. 3' priméru nazvanému A1715CC (sekvencia VI):

ACGTCGAATT CTCAGTTTCG TATCTTCATT GTCATGTAGG C 41 (VI).

S použitím vyššie uvedených primérov, bola hIL-10 cDNK podrobená PCR v reakčnej zmesi objemu 50 μΐ, s prevrstvením 50 μΐ parafínového oleja, v 0,5 ml Eppendorfovej skúmavke. Reakčná zmes typicky obsahovala 26,5 μΐ H₂O, 5 μΐ DNK polymerázového pufra [finálna koncentrácia v reakcii: 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,001 % želatína], 200 μΜ dlNTP, 60 ng templátovej DNK, po 10 pmol 5'priméru B1789CC a 3'priméru nazvaného A1715CC a 0,5 μΐ Taq polymerázy (2 jednotky).

Reakcia sa uskutočňovala v termocyklére PHC-1 (Techne, Princeton, NJ) s 30 cyklami 95 °C, 2 minúty na denaturáciu; 42 °C, 2 minúty na tvorbu duplexu [annealingj·, a 70 °C, 1 minúta na syntézu. Na konci tridsiateho cyklu bola reakčná zmes inkubovaná ďalších 9 minút pri 72 °C na predĺženie.

PCR zmes bola podrobená elektroforéze v 1,2 % agarózovom Tris-acetátovom géle, obsahujúcom 0,5 pg/ml etídiumbromidu. DNK fragmenty, majúce očakávané veľkosti, boli vyrezané z gélu a purifikované súpravou GENEČLEAN^R (La Jolla, CA). Po získaní z gélu bol DNK produkt digerovaný Pst\ a EcoRI, izolovaný pomocou spracovania gélovou elektroforézou a GENECLEAN^R a klonovaný ako Pstl/EcoRl reštrikčný fragment do vektora expresie pDSRG (ATCC 68233) a následne prenesený do vektora expresie pSC.Šport (Gibco-BRL, Gaithesburg, MD).

Vektory, obsahujúce hIL-10 cDNK, boli namnožené v E. coli kmeňa DH5a (Gibco-BRL) a sekvencia DNK bola overená sekvenovaním DNK. Vektor expresie hIL-10, založený na pSC.Sport, bol použitý na transfekciu COS buniek, ako aj na konštrukciu vektorov s mutantným hIL-10.

Resyntetizovaná hIL-10 cDNK si udržala unikátne BgBI miesto a unikátne Äs/EII miesto, obe prítomné v cDNK divého typu. Tieto dve vnútorné reštrikčné miesta, ktorých relatívne pozície sú schématicky znázornené nižšie, boli potom použité na generovanie mutantných hIL-10 cDNK pomocou náhrady kaziet.

PstI----BgM--ÄvZEII-------------------------EcoRI

Karboxyterminálna modifikácia

Na vytvorenie C-koncového mutantného antagonistu ML-10 boli pomocou PCR syntetizované mutantné cDNK fragmenty zodpovedajúce ÄriEII/FcoRI oblasti hIL-10 cDNK divého typu a použité na náhradu zodpovedajúcej oblasti v pSV. Šport hIL-10 cDNK opísanej vyššie.

Mutantní K157E, CA3 a CA4 antagonisti ľudského hIL-10 cDNK boli pripravení PCR s použitím oligonukleotidových primérov, komplementárnych k sekvencii resyntetizovanej hIL-10 cDNK, opísanej vyššie, s navrhnutými mutáciami vopred zavedenými do primérov 3'-konca.

Na vytvorenie troch mutantných antagonistov bol použitý 5' primér nazvaný B3351CC, majúci aminokyselinovú sekvenciu definovanú sékvenciou VH:

GGACTTTAAG GGTTACCTGG GTTGCCAAGC CTTGTCTGAG ATGATCCAGT TTTATCTAGA 60 GGAGGTGATG CCCCAAGCTG AGAAC 85 (VH)

Sekvencia tohto 5' priméru bola komplementárna k internej sekvencii ľudského hIL-10 cDNK, zahŕňajúcej unikátne ÄsíEII reštrikčné miesto hIL-10 cDNK divého typu. 3' priméiy, použité na vytvorenie antagonistov, mali sekvencie komplementárne k 3' koncovej sekvencii cDNK kódujúcej hIL-10. Tieto priméry, s následným číslom sekvencie definujúcim ich sekvenciu, boli tieto:

Mutant:	Primér:	Číslo sekvencie
K157E	C3481CC	VIII
CA3	C3482CC	IX
CA4	B3350CC	X

AGCTGAATTC AGTTTCGTAT CTCCATTGTC ATGTAGGCTT CTATGTAGT 49 (vni)

AGCTGAATTC ACTTCATTGT CATGTAGGCT TCTATGTAGT 40 (IX)

AGCTGAATTC ACATTGTCAT GTAGGCTTCT ATGTAGT 37 (X).

S použitím vyššie uvedených primárov, bola cDNK ľudského IL-10 podrobená PCR v reakčnej zmesi objemu 50 μΐ, s prevrstvením 50 μΐ parafínového oleja, v 0,5 ml Eppendorfovej skúmavke. Reakčná zmes typicky obsahovala 26,5 μΐ H₂O, 5 μΐ DNK polymerázového pufra [finálna koncentrácia v reakcii: 20 mM Tris-HCl, pH 8,2, 10 mM KC1, 2 mM MgCl₂, 6 mM (NH4)₂SO, 0,1 % Triton X-100 a 10 pg/ml bovinného sérového albumínu (BSA) bez nukleázy ], 200 μΜ dNTP, 40 ng templátovej DNK, po 10 pmol 5' priméru B3351CC a jedného z 3' primérov a 0,5 μΐ pfu polymerázy (2,5 jednotky).

Reakcia sa uskutočňovala v termocyklére PHC-1 (Techne, Princeton, NJ) s 22 cyklami 94 °C, 2 minúty na denaturáciu; 50 °C, 2 minúty na tvorbu duplexu; a 72 °C, 1 minúta na syntézu. Na konci 22. cyklu bola reakčná zmes inkubovaná d’aľších

7,5 minút pri 72 °C na predĺženie.

PCR zmes bola spracovaná extrakciou fenolom-CHCh, zrazením etanolom a potom postupne digerovaná fe/EII a EcoRI. Produkty reštrikčnej digescie boli podrobené elektroforéze v 1 % agarózovom/Tris-acetátovoín géle obsahujúcom 0,5 μg/ml etídiumbromidu. DNK fragmenty majúce očakávané veľkosti, boli vyrezané z gélu a získané extrakciou fenolom-CHCl₃ a vyzrážaním etanolom.

Po získaní z gélu boli BslEWEcoRl fragmenty hIL-10 mutantov použité na náhradu zodpovedajúcej oblasti hIL-10 DNK divého typu v pSV.Sport vektore. hIL-10 mutantnej cDNK vo vektore založenom na pSV.Sport, boli namnožené v E. coli kmeňa DH5a a overené sekvenovaním DNK. Tie isté vektory expresie boli použité na transfekciu COS buniek tak, ako je to opísané vyššie.

Aminoterminálna modifikácia

Na vytvorenie N-koncových variantov ľudského IL-10 boli pomocou PCR syntetizované modifikované cDNK fragmenty zodpovedajúce PsfUBglQ. oblasti hIL-10 cDNA divého typu, s použitím páru primérov bez DNK templátu. Výsledné fragmenty boli použité na náhradu zodpovedajúcej oblasti hIL-10 DNK divého typu vo vektore pSV.Sport. Takto boli vytvorené varianty, v ktorých bolo z N-konca hIL-10 divého typu deletovaných 7 (variant ΝΔ7), 10 (variant ΝΔ10), 11 (variant ΝΔ11) a 12 (variant ΝΔ12) aminokyselín. Páry primérov, použité na vytvorenie každého variantu s následnými číslami sekvencií definujúcimi ich sekvencie, boli nasledovné:

Mutant: ΝΔ7	Primér (koniec): C3352CC (5') C3355CC (3')	Číslo sekvencie XI XII
ΝΔ10	C3353CC (5')	XIII
	C3354CC(3')	XIV

ΝΔ11	C3483CC (5') C3485CC (3')	XV XVI
ΝΔ12	C3484CC (5')	XVII
	C3486CC (3 )	XVIII

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60

CCTGACTGGG GTGAGGGCCT CTGAGAACAG C 91 (XI)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60

CTCAGAGGCC CTCACCCCAG TCAGGAGGAC 90 (ΧΠ)

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60

CCTGACTGGG GTGAGGGCCA GC 82 (XIII)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60

CCTCACCCCA GTCAGGAGGA C 81 (XIV)

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60

CCTGACTGGG GTGAGGGCCT GC 82 (XV)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60

CACCCCAGTC AGGAGGAC 78 (xvi)

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60

CCTGACTGGG GTGAGGGCCA C 81 (XVII)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60 CCCAGTCAGG AGGAC 75 ( XVIII).

PCR sa uskutočňovala s použitím 10 pmol každého priméru z uvedených primérových párov, ako je to opísané vyššie pre syntézu C-terminálnych mutantných antagonistov. PCR zmes bola spracovaná extrakciou fenolom-CHCh, zrazením etanolom a potom postupne digerovaná Bgltt. a Psíl. Produkty reštrikčnej digescie boli podrobené elektroforéze v agarózovom géle tak, ako je to opísané vyššie a DNK fragmenty majúce očakávané veľkosti boli vyrezané z gélu a získané extrakciou fenolom-CHCh a vyzrážaním etanolom.

Po získaní z gélu boli PstI/ BgM reštrikčné fragmenty hIL-10 variantov použité na náhradu zodpovedajúcej oblasti hIL-10 DNK divého typu vo pSV.Sport vektore po vyštiepení tejto oblasti PstI/ Bglll digesciou a ligáciu nahrádzajúceho fragmentu. hlL10 mutantnej cDNK vo vektore založenom na pSV.Sport boli namnožené, overené a použité tak, ako je to opísané vyššie.

Výsledné varianty ΝΔ7, ΝΔ10, ΝΔ11 resp. ΝΔ12 mali amonikyselinové sekvencie definované zvyškami 8 - 160, 11 - 160, 12 - 160 resp. 13 - 160 sekvencie IV, vyššie.

Antagonisti ľudského IL-10 majúci N-koncové modifikácie

Antagonisti, ktorí majú modifikácie ako v amino, tak v karboxy konci, môžu byť ľahko pripravení kombináciou predchádzajúcich metód. Napríklad, antagonista ΝΔ7/Κ157Ε môže byť vytvorený prípravou vektora pSV.Sport,obsahujúceho cDNK, kódujúcu K157E antagonistu, prevedením PCR s použitím 5' priméru B3351CC a 3' priméru C3481CC tak, ako je to opísané vyššie. Po príprave a izolovaní ΝΔ7 variantu pomocou 5' priméru B3352CC a 3' priméru C3355CC, ako je to opísané vyššie, sa použije Pst!/ Bgl\l reštrikčný fragment tohto variantu na náhradu zodpovedajúcej oblasti K157E mutantnej DNK v pSV.Sport vektore, po vyštiepení tejto oblasti PstU Bglíl digesciou a ligáciu nahrádzajúceho fragmentu.

Metabolické označovanie

COS bunky boli transfekované tak, ako je to opísané vyššie, vektorom expresie pSV.Sport, ktorý nesie cDNK inzerty kódujúce ľudský IL-10; antagonistami K157E, CA3 alebo CA4; alebo variantmi agonistov ΝΔ7, ΝΔ10, ΝΔ11 alebo ΝΔ12. Bunky boli potom inkubované v 10 cm kultivačných miskách v 5 % COj pri 37 °C počas 48 až 72 hodín v sérum obsahujúcom kultivačnom médiu. Po tejto inkubácii boli kultivačné misky dvakrát premyté fosfátovým soľným pufrom (PBS) a inkubované v 5 % CO₂ pri 37 °C po dobu 30 minút s 8 ml/miskú média DMEM bez metionínu a doplneného dialyzovaným FBS a glutamínom. Médium bolo z každej misky odstránené odsatím a nahradené 500 μΐ média bez metionínu a obsahujúceho 250-300 pCi ³⁵S-metionínu (DuPontNEN, Boston, MA; špecifická aktivita 43.3 mCi/ml).

Bunky boli inkubované v 5 % CO₂ pri 37 °C 5 hodín, potom sa do misiek pridalo 10 μΐ zo zásobného roztoku 1,5 mg/ml L- metionínu a vykonala sa 30 minútová inkubácia. Označené kondicionované médium bolo odobrané a podrobené elektroforéze na polyakrylamidovom géle s dodecylsulfátom sodným [SDS PAGÉ; Laemmli, Náture 227\ 680 (1970)] v 10 až 20 % géloch pri neredukujúcich podmienkach a gély boli vysušené a autorádiografované použitím štandardných metód a filmu Kodak XAR.

Autorádiografia ukázala rôzne značkované pruhy pre ľudský IL-10; antagonistov K157E, CA3 a CA4; a pre agonistov ΝΔ7 a ΝΔ10, ktorí všetci migrovali so zdanlivými molekulovými hmotnosťami asi 16 až 18 kilodaltonov. Pri identických

22’ podmienkach transfekcie a kultivovania buniek boli všetci traja antagonisti, karboxytenninálni mutanti ľudského IL-10, exprimovaní na trocha zníženej úrovni asi 2 až 4 krát menej ako IL-10. Expresia aminoterminálneho agonistového variantu ΝΔ7 bola porovnateľná s IL-10, zatiaľ čo ΝΔ10 variant bol exprimovaný na úrovni asi štyrikrát nižšej ako IL-10. Expresia variantov ΝΔ11 a ΝΔ12 bola príliš nízka na to, aby bola detegovaná touto metódou.

Analýzy ELISA

Pre d’aľšiu kvantifikáciu hladín mutantných antagonistov ľudského IL-10 v kondicionovaných médiách COS buniek sa uskutočňovali stanovenia imunosorpčnou enzymatickou analýzou (ELISA), ako je to v podstate opísané Abramsom et al. [Immunol. Rev. 127: 5 (1992)]. Dve monoklonálne protilátky, špecifické pre rôzne epitopy ľudského IL-10, označené 9D7 a 12G8, boh pripravené štandardnými metódami a použité ako zachytávacie resp. detekčné činidlo. Sériovo riedené kondicionované médiá boli testované v týchto stanoveniach použitím purifikovaného ľudského IL-10 ako štandardy. Hranica detekcie v tomto stanovení bola asi 1 ng/ml a v kultivačných médiách po 72 hodinách inkubácie boh typicky namerané hladiny IL-10 v rozmedzí 100 až 300 ng/ml.

Takto sa našlo, že relatívne hladiny IL-10 a antagonistov dobre korelujú s výsledkami získanými metabolickým označovaním, čo napovedá, že epitopy rozoznávané použitými monoklonálnymi protilátkami, nie sú v mutovaných oblastiach. V typických stanoveniach boh pre ľudský IL-10, K157E, CA3, CA4, ΝΔ7, ΝΔ10, ΝΔ11 resp. ΝΔ12 hladiny expresie 133, 80, 63, 48, 139, 28, 23 resp. 6,5 ng/ml.

Biologické testy

Ľudský IL-10 a reprezentatívni IL-10 mutantní antagonisti boli skúšaní na aktivitu použitím myšacích žírnych buniek a ľudských periférnych mononukleámych buniek (PBMC).

Test na stimuláciu žírnych buniek bol uskutočnený v podstate tak, ako je opísaný O'Garrom etal. [Iní. Immunol. 2\ 821 (1990)] a Thompson-Snipesom et al. [J. Exp. Med. 173\ 507 (1991)]. V stručností : na 5 x 10³ MC/9 buniek (ATCC CRL 8306) na jamku v 100 μΐ testovacieho média [RPMI-1640 s obsahom 10 % fetálneho bovinného séra (FBS), 50 μΜ β-merkaptoetanolu, 2 mM glutamínu a penicilín/streptomycín] v 96-jamkovej mikrotitračnej doštičke, sa pôsobilo 48 hodín s rôznym množstvom IL-10 alebo jedného z IL-10 antagonistov. Potom sa pridalo 25 mikrolitrov 5 mg/ml MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazólium bromidu] (Sigma, St. Louis, MO) do každej jamky a doštička bola inkubovaná počas 3 až 5 hodín. Bunky potom boli lýzované použitím 10 % SDS s 10 mM HC1 a merala sa absorbancia pri 570 nm.

Ľudský IL-10 a varianty ΝΔ7, ΝΔ10 a ΝΔ11 boli v tomto teste aktívne, ale žiadna aktivita nebola pozorovaná u variantu ΝΔ12. Žiaden z karboxytermmálne mutantných antagonistov nebol aktívny, ani keď sa testoval v koncentrácii až do 375 ng/ml (asi 100 násobok množstva IL-10, ktorý vykazuje veľkú aktivitu).

Na meranie, ako IL-10 antagonisti inhibujú syntézu cytokínov indikovanú lipopolysacharidom (LPS), boli získané ľudské periférne mononukleáme bunky (PBMC) od zdravých darcov a izolované centrifúgáciou na gradiente FICOLLe^R[Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl: 77 (1966)]. Alikvoty PBMC boli prenesené do jamiek (10⁵ buniek na jamku v 200 μΐ RPMI-1640 média obsahujúceho 5 % FBS, penicilín/streptomycín, neesenciálne aminokyseliny, pyruvát sodný a 2 mM glutamínu) 96 jamkových mikrotitračných doštičiek.

Ľudský IL-10 bol pridaný do niektorých jamiek v konštantnej 100 pM koncentrácii s alebo bez 100-násobného molámeho nadbytku (10 nM) IL-10 antagonistu (ako je namerané pomocou ELISA). Potom okamžite nasledovalo pridanie

LPS (Sigma) do každej jamky na finálnu koncentráciu 80ng/ml. Pozitívne a negatívne IL-10 kontroly boli inkubované paralelne pomocou média kondicionovaného COS bunkami transfekovanými vektorom exprimujúcim IL-10 resp. plazmidom pSV.Sport. Posledné uvedené kontrolné kondicionované médium sa používalo na riedenie všetkých vzoriek. Všetky stanovenia sa robili duplicitne a overovali sa v nasledujúcich testoch použitím iných šarží buniek.

Doštičky boli inkubované vo zvlhčovanej atmosfére 5 % CO2 pri 37 °C počas 24 hodín, potom sa supematantové kvapaliny odobrali a uschovali pri -20 °C na neskoršiu analýzu. Hladiny IL-6, IL-Ια a TNFa boli v odobraných vzorkách merané pomocou súprav ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) podľa inštrukcií výrobcu.

U všetkých antagonistov sa našlo, že v tomto teste zvrátia inhibičnú aktivitu IL10 na syntézu cytokínov, ako ukazuje Tabuľka 1.

Tabuľka 1

Percento reziduálnej aktivity IL-10*

Vzorka	IL-6	IL-la	TNF-a
Pufer	100	100	100
Protilátka	0	0	0
K157E	21	27	51
CA3	12	13	39
CA4	19	27	61

* Inhibičný účinok ľudského IL-10 na syntézu vyznačených cytokínov bol meraný za prítomnosti kontrolného pufŕa, saturačného množstva neutralizujúcej anti-IL-10 monoklonálnej protilátky a 100 násobného molámeho prebytku troch IL-10 antagonistov.

Podobné testy uskutočnené s rôznymi množstvami IL-10 mutantných antagonistov za neprítomnosti IL-10 ukázali, že žiaden antagonista nemá inhibičnú aktivitu na syntézu cytokínov. Žiadnu inhibičnú aktivitu nebolo možné detegovať so žiadnym z antagonistov pri koncentráciách do 100 pM, včítane.

Na skúšanie účinku IL-10 antagonistov na aktivitu T buniek bol uskutočňovaný test so zmiešanou lymfocytovou odpoveďou (MLR, mixed lymphocyte response). Ľudské PBMC boli izolované, ako je opísané vyššie. Stimulátorové PBMC boli pripravené pôsobením 50 mg/ml mitomycínu C (Sigma, St. Louis, MO) na tieto bunky počas 20 minút pri 37 °C.

x 10⁵ zodpovedajúcich PBMC a stimulátorových buniek bolo zmiešaných v každej jamke 96-jamkovej mikrotitračnej doštičky spolu s rôznymi množstvami ľudského IL-10 alebo jedného z K157E, CA3 alebo CA4 antagonistov v celkovom množstve 200 μΐ (v triplikátoch). Bunky boli inkubované s 5 % CO₂ pri 37 °C počas 6 dní, potom kultúry dostali pulz 1 pCi tríciovaného tymidínu ([³H]-TdR; 15,6 Ci/mmol, NEN, Boston, MA) na jamku počas 16 hodín. Lyzáty boli odobrané na filter použitím zariadenia pre 96 jamiek (Skatron, Inc., Sterline, VA) a merané v β-počítači (Pharmacia LKB Nuclear Inc., Gaithesburg, MD).

Našlo sa, že antagonisti nemajú schopnosť inhibovať MLR pri koncentrácii 1 ng/ml. Oproti tomu, ľudský IL-10 vykazoval pri tejto koncentrácii 82 % inhibície MLR.

Testy väzby na receptor

Čistý ľudský IL-10 (čistý asi na 99 %) bol rádiojódovaný metódou ENZYMOBEAD^r (Bio-Rad, Richmond, CA) podľa inštrukcií výrobcu. Približne 4 x 10⁵ transfekovaných COS buniek, exprimujúcich cDNK ľudského IL-10 receptora, bolo peletovaných centrifúgáciou pri 200 x g počas 10 minúť premytých vo väzbovom pufŕe (PBS, 10 % fetálneho bovinného séra, 0,1 % NaN₃) a resuspendovaných v 200 μΐ väzbového pufra obsahujúceho [¹²⁵I]-ľudský IL-10 (špecifická rádioaktivita 225 pCi/pg) v 150 pM koncentrácii, s postupne riedeným kondicionovaným médiom z COS buniek exprimujúcich cDNK kódujúce ľudský IL-10 alebo jedného z mutantných antagonistov podľa vynálezu.

Po inkubácii pri 4 °C počas 2 hodín boli bunky centrifiigované pri 200 x g 10 minút, každá bunková peleta bola resuspendovaná v 100 μΐ väzbového pufŕa bez označeného IL-10, navrstvená nad 200 ml 10 % glycerolu vo väzbovom pufre v predĺžených centrifúgačných skúmavkách, centrifúgovaná pri 200 x g 10 minút pri 4 °C a skúmavky boli rýchlo zamrazené v kvapalnom dusíku. Bunkové pelety potom boli odstrihnuté do meracích skúmaviek a merané v počítači CLINGAMMA^R 1272 (Pharmacia LKB). Nešpecifická väzba bola stanovená prevedením väzby za prítomnosti 500 až 1000 násobného molámeho prebytku neoznačeného ľudského IL-

10.

Výsledky sú uvedené v Tabuľke 2, kde je možné vidieť, že všetci IL-10 antagonisti boli v kompetícii väzby na receptor skoro tak účinní, ako IL-10 samotný.

Tabuľka 2	Inhibícia väzbv rádioaktívne označeného IL-10*
Vzorka	IC₅o (pM)
Ľudský IL-10	100
K157E	136 ±65
CA3	172 ±28
CA4	120 ± 9

♦ Uvedené údaje , ktoré sú priemermi z 2 nezávislých testov, sú koncentrácie neoznačeného ľudského IL-10 alebo uvedeného IL-10 antagonistu, ktoré produkovali 50 % inhibíciu väzby rádioaktívne označeného IL-10 na bunkové receptory.

Mnohé modifikácie a obmeny tohto patentu sa môžu uskutočniť bez odklonenia od jeho obsahu a rozsahu, ako to bude zrejmé všetkým odborníkom. Konkrétne uskutočnenia tu opísané sú poskytnuté len cestou príkladov a vynález je obmedzený len podmienkami pripojených nárokov.

Claims

1. Antagonista ľudského IL^IO, ktorý zahŕňa dospelý ľudský Ib-lO modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou troch alebo štyroch aminokyselinových zvyškov v karboxyterminálnej oblasti.

2. Antagonista podľa nároku 1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou I, Π alebo m

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr lEfis Phe Pro 15 1015

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 2530

Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 4045

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala

50 5560

Leu Ser Glu Met He Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala

65 70 7580

Glu Asn Gin Asp Pro Asp He Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys Hi s Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly He Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135140

He Phe Íle Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr Met Glu He Arg Asn

145 150 155160

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr Hís Phe Pro

1 5 1015

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 2530

Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu (I)

35 4045

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala

50 55 60 Leu Ser Glu Met He Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gin Asp Pro Asp He Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys Hís Arg Phe Leu

100 105110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe

115 120125

Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly He tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135140

Íle Phe He Asn lýr De Glu Ala 'tyr Met Thr Met Lys

145 150 155(Π)

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr Hís Phe Pro 15 1015

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 2530

Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly ' Tyi Leu Gly Cys Gin Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met De Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gin Asp Pro Asp He Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly Íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 He Phe He Asn Tyr De Glu A1 a Tyr Met Thr Met 145 150 155 (m)

3. Nukleová kyselina kódujúca antagonistu ľudského IL-10, ktorý zahŕňa dospelý ľudský 11^10 modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou troch alebo štyroch ammokyselinových zvyškov v karboxyterminálnej oblasti.

4. Nukleová kyselina podľa nároku 3, kódujúca antagonistu ľudského IL-10, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou I, Π alebo ΙΠ, uvedenou v nároku 2.

5. Rekombinantný vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa nároku 3, ktorý je schopný riadiť expresiu tejto nukleovej kyseliny.

6. Hostiteľská bunka obsahujúca rekombinantný vektor podľa nároku 5.

3.1

7. Spôsob prípravy antagonistu ľudského IL-10, zahŕňajúceho dospelý ľudský IL10 modifikovaný náhradou lyží nového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v oblasti obsahujúcej 12 karboxyterminálnych zvyškov, vyznačujúci sa tým , že zahŕňa kultiváciu hostiteľských buniek podľa nároku 8 za podmienok, kedy sa nukleová kyselina exprimuje.

8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujú c i sa t ý m , že nukleová kyselina kóduje antagonistu ľudského IL-10, v ktorom bolo z aminokonca deletovaných 1 až 11 aminokyselinových zvyškov.

9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujú c i sa t ý m , že nukleová kyselina kóduje antagonistu ľudského IL-10, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou I, Π alebo Πζ uvedenou v nároku 3.

10. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým , že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a účinné množstvo antagonistu ľudského IL-10, zahŕňajúceho dospelý ľudský IL-10 modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou troch alebo štyroch aminokyselinových zvyškov v karboxyterminálnei oblastí.

11. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 10 a 3, vy z n a č u j ú c i sa t ý m, že antagonista má aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou I, Π alebo UL

12. Použitie antagonistu ľudského IL-10, ktorý zahŕňa dospelý ľudský IL-10 modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou troch alebo štyroch aminokyselinových zvyškov v karboxytemrinálnej oblasti, na výrobu liečebného prostriedku na inhibíciu biologickej aktivity IL-10.