JPH08507930A

JPH08507930A - ヒトインターロイキン−１０のアゴニストおよびアンタゴニスト

Info

Publication number: JPH08507930A
Application number: JP7505238A
Authority: JP
Inventors: チョー，チャン−チュー; カイ，シィア−ヤン
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1996-08-27
Also published as: AU681178B2; SG43798A1; IL110413A0; HUT73463A; WO1995003411A1; ZA945434B; CZ23396A3; CA2168110A1; CN1127529A; NO960309L; FI960353A0; NO960309D0; SK8396A3; PL312718A1; AU7399694A; FI960353A; NZ269663A; EP0711346A1; HU9503983D0; SK150596A3

Abstract

(57)【要約】本発明によれば成熟ヒトＩＬ−１０の末端の修飾に基づくヒトＩＬ−１０のアゴニストおよびアンタゴニストが提供される。ヒトＩＬ−１０の生物学的活性を供給または阻害するための組成物および方法も提供される。それらの組成物は不適切なＴｈ応答を特色とする疾患の治療に有用である。アゴニストおよびアンタゴニストをコードする核酸、それらの核酸を含む組換えベクターおよび形質転換宿主細胞、ならびに形質転換宿主細胞を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを製造する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトインターロイキン−１０のアゴニストおよびアンタゴニスト発明の背景本発明は、ヒトインターロイキン−１０のアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに組成物、ならびにそれらを製造および使用するための方法に関するものである。これらのアゴニストおよびアンタゴニストは、成熟ヒトインターロイキン−１０のカルボキシルおよび／またはアミノ末端にアミノ酸置換または欠失を導入することにより製造される。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は多数の作用または効果を仲介しうるサイトカインである。ＩＬ−１０はマウスおよびヒト双方の細胞から単離されており、種々の群または副分類のＣＤ４⁺Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞の免疫応答の制御に関与する。これらのＴｈ細胞はそれらのサイトカイン産生プロフィールにより種々の副分類に分けられる。これらの副分類のうち２つはＴｈ１およびＴｈ２細胞と呼ばれる。Ｔｈ１Ｔ細胞クローンはインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を産生し、これに対しＴｈ２細胞クローンはＩＬ −１０、インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−５（ＩＬ −５）を、一般に抗原またはマイトジェンレクチンによる活性化後に分泌する。両群のＴｈ細胞クローンとも、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ− ＣＳＦ）などのサイトカインをも産生する。第３カテゴリーのＴｈ細胞（Ｔｈ０）はＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦを同時に産生する。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の異なるサイトカイン産生パターンは、一部は種々の病原体に対する応答におけるそれらの役割を反映している。たとえばＴｈ１細胞は、多様な細胞内病原体に対する効果的な細胞仲介応答に関与する。それらは遅延型過敏反応にも関与する。Ｔｈ２細胞は、体液性応答に付随し、これらは抗体産生を特色とする。大部分の状況で免疫系はその特定の抗原または病原体を排除するのに最も有効なＴｈ応答を発現するが、常にそうであるとは限らない。たとえばリーシュマニア症はＴｈ１応答欠陥を特色とする。この欠陥はインビトロアッセイ法、たとえばクレリチ（Ｃｌｅｒｉｃｉ）ら［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１８９２（１９８９）］が記載したアッセイ法により証明することができる。そのようなインビトロアッセイ法の１つを用いて、Ｔｈ１応答欠陥は内因性ＩＬ−１０レベルに起因することが示された。インビトロアッセイにおいてＩＬ−１０に対する中和抗体を添加することによりＴｈ１機能を回復しうるからである。リーシュマニア症および他の疾患は内因性ＩＬ−１０の不適切な作用に起因するＴｈ１応答欠陥を特色とするので、それらの疾患を治療するためのアゴニストおよびアンタゴニストが要望されている。発明の概要本発明は、ヒトＩＬ−１０の生物学的活性を供給または阻害するための組成物および方法を提供することによりこの要望を満たす。より詳細には、本発明は１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストを提供する。それらのうち３態様のアミノ酸配列を配列表中に配列番号：１、２および３により定める。さらに本発明は、１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストをコードする核酸を提供する。それらの核酸を含む組換えベクター、およびそれらの組換えベクターを含む宿主細胞も本発明により提供される。さらにまた本発明は、１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストを製造する方法であって、前記宿主細胞のいずれかを、アンタゴニストをコードする核酸が発現される条件下で培養することを含む方法を提供する。さらにまた本発明は、ＩＬ−１０の生物学的活性を阻害する方法であって、ＩＬ−１０に対する受容体を保有する細胞を、１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストの有効量と接触させることを含む方法を提供する。さらにまた本発明は、１−１１個のアミノ末端アミノ酸残基の欠失により修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアゴニストを提供する。それらのアゴニストをコードする核酸、それらの核酸を含む組換えベクターおよび形質転換された宿主細胞、アゴニストの製造方法、ならびに１種類または２種類以上のＩＬ−１０アゴニストまたはアンタゴニストおよび薬剤学的に許容しうるキャリヤーを含む薬剤組成物も本発明により提供される。発明の説明本明細書に引用された参考文献はすべてそれらの全体が参考として本明細書に含まれるものとする。本発明のアンタゴニストは、内因性ＩＬ−１０に起因するＴｈ１応答欠陥を特色とするリーシュマニア症などの疾患を治療するのに有用である。それらはＩＬ −１０仲介による免疫抑制またはＩＬ−１０の過剰産生に関連する疾患、たとえばＢ細胞リンパ腫の治療にも有用であろう。さらにこれらのアンタゴニストはエフェクター機能と切り離された強い受容体結合性を示すので、ＩＬ−１０の作用メカニズムの解明および合理的な薬物設計に有用である。アンタゴニストを固体支持体に固定化した状態で、トランスメンブラン領域を欠失した可溶性形態のＩＬ−１０受容体のアフィニティ精製に使用しうる。エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）ウイルス性ＩＬ−１０蛋白質（ＢＣＲＦＩまたはｖＩＬ−１０）もＩＬ−１０の生物学的活性を保有し、恐らくＩＬ −１０受容体に結合するであろう。ＥＢＶによるｖＩＬ−１０活性の発現は、それが感染し、複製し、および／または宿主内で自身を維持することに関してウイルスに何らかの生存上の利点を与えるのであろう。ｖＩＬ−１０がＴ細胞およびＮＫ細胞の双方によるＩＮＦ−γ産生をダウンレギュレーションする効力は、そのＢ細胞生存性増強効果と共に、ｖＩＬ−１０が抗ウイルス免疫性を抑制することができ、一方では同時にＥＢＶがヒトＢ細胞をトランスフォーメーションする効力を増強することを示唆する。従って本発明のＩＬ−１０アンタゴニストは、ＥＢＶおよび恐らく他のウイルスに対する抗ウイルス免疫性を効果的に追加するのにも有用であろう。ＩＬ−１０アンタゴニストの用途の可能性に関する詳細については、たとえばハワード（Ｈｏｗａｒｄ）ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：２３９（１９９２）を参照されたい。本発明の突然変異ＩＬ−１０アンタゴニストの代表的な３態様を、後記の実施例に示す。１態様においては、成熟ヒトＩＬ−１０の配列の１５７位のリシン残基がグルタミン酸残基で置換されている（配列番号：１）。他の態様においては、ヒトＩＬ−１０のカルボキシル末端から３個（配列番号：２）または４個（配列番号：３）のアミノ酸残基が欠失している。これらのアンタゴニストを以下において、それぞれＫ１５７Ｅ、Ｃ△３およびＣ△４アンタゴニストと呼ぶ。本明細書において用いる用語“成熟ヒトＩＬ−１０”は、リーダー配列を欠如した蛋白質であって、（ａ）配列番号：４により定められる配列に実質的に等しいアミノ酸配列をもち、かつ（ｂ）天然ＩＬ−１０と共通な生物学的活性をもつ蛋白質であると定義される。これには実質的に生物学的活性を損なわない１または２以上の保存的アミノ酸置換基を含む天然対立遺伝子変異体または他の変異体が含まれる［グランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ），Ｓｃｉｅｎｃｅ１８５：８６２（１９７４）］。このような保存的置換基には、同義アミノ酸群、たとえば米国特許第５，０１７，６９１号明細書（リーら）に記載されるものが含まれる。以上の態様は現時点で好ましいが、ヒトＩＬ−１０のカルボキシル末端の他の修飾により他のアンタゴニストを製造しうることは理解されるであろう。たとえば１５７位のリシン残基をグルタミン酸残基の代わりにアスパラギン酸残基で置換することによって有効なアンタゴニストを製造することが可能であろう。従って本明細書において用いる用語“酸性アミノ酸残基”はアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を共に包含するものと定義される。より多いか、またはより少ない欠失を行うこともできる。約１２個のカルボキシル末端残基を含む、１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることができる。好ましくは約８個の末端残基、より好ましくは３または４個の末端残基を欠失させることができる。意外にも、成熟ヒトＩＬ−１０のアミノ末端から最高１１個のアミノ酸残基を欠失させうることも見出された。これらのトランケートした変異体はＩＬ−１０自身と比較して異なる薬物動力学的特性をもつ可能性があるが、これらは後記のＭＣ／９マスト細胞剌激アッセイ法により測定して成熟ヒトＩＬ−１０の生物学的活性を保有する。従ってそれらはＩＬ−１０自身による治療に感受性であるいずれの適応症の治療にも有用である。それらは本発明のアンタゴニストにつき先に述べた幾つかの目的、たとえばアフィニティ精製にも有用である。それらはヒトＩＬ−１０の生物学的活性を保有するが、短縮されたアミノ酸配列をもつので、これらの変異体を本明細書において“ヒトＩＬ−１０のアゴニスト”とも呼ぶ。しかし１２位のシステイン残基は生物学的活性にとって必須であると考えられる。事実、このシステイン残基を含めた最初の１２個の残基の欠失は、生物学的活性をもたない変異体を生成した。従ってアミノ末端における欠失は最初の１１個の残基のうち１個または２個以上の欠失に限定される。このようなアミノ末端欠失を前記のカルボキシル末端修飾と組み合わせて、後記の特性をもつ、ただし恐らくは異なる薬物動力学的特性をもつアンタゴニストを製造することもできる。これらのアンタゴニストも本発明の一部である。ＩＬ−１０アゴニストおよびアンタゴニストをコードする核酸も本発明の一部である。もちろん遺伝子コードの縮重のため、それぞれのアゴニストおよびアンタゴニストをコードしうる多数の異なる核酸があることは、当業者は周知である。使用する個々のコドンは、構築の簡便さ、および原核細胞系または真核細胞系における最適発現を得るように選ぶことができる。好ましくはアゴニストおよびアンタゴニストをコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７（１９８８）］を利用して、ドーエルティー（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ）ら［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：２４７１（１９９１）］に例示されるようにヒトＩＬ−１０をコードするｃＤＮＡを修飾することにより調製される。このようなｃＤＮＡは当技術分野で周知であり、たとえば国際特許出願公開第９１／００３４９号明細書に記載される標準法により調製することができる。ヒトＩＬ−１０をコードする配列を含むクローンも、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビルに寄託番号６８１９１および６８１９２で寄託されている。あるいは周知の部位特異的突然変異誘発法を用いてＤＮＡを修飾することができる。たとえばギルマン（Ｇｉｌｌｍａｎ）ら，Ｇｅｎｅ８：８１（１９７９）；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら，Ｎａｔｕｒｅ３２８：７３１（１９８７）、またはイニス（Ｉｎｎｉｓ）（編），１９９０．ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ s，アカデミック・プレス、ニューヨーク州ニューヨークを参照されたい。本発明の核酸は、たとえばマッツーシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）］のホスホルアミダイト固体支持体法、ヨー（Ｙｏｏ）ら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７６４：１７０７８（１９８９）］の方法、または他の周知の方法により化学的に合成することもできる。前記の核酸を含む組換えベクターも本発明の一部であり、それらのベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストを製造する方法も同様である。アゴニストおよびアンタゴニストのうちいずれかをコードするＤＮＡを多数の既知の発現ベクターのうちいずれかに挿入するのは、ＤＮＡおよびベクター双方の末端が適合性の制限部位を含む場合には容易に行われる。これが行えない場合、制限エンドヌクレアーゼ開裂により形成された一本鎖ＤＮＡオーバーハングを消化することによりＤＮＡおよび／またはベクターの末端を修飾して平滑末端にするか、あるいは一本鎖末端を適宜なＤＮＡポリメラーゼでフィルインして同様な結果を得ることが必要であろう。あるいはヌクレオチド配列（リンカー）を末端にリゲートすることにより、目的とする任意の部位を形成することができる。それらのリンカーは、目的とする制限部位を定める特異的オリゴヌクレオチド配列を含むことができる。開裂したベクターおよびＤＮＡフラグメントを、必要な場合には、ホモポリマーテイル付加またはＰＣＲにより修飾することもできる。本発明のアンタゴニストはヒトＩＬ−１０自身のものに類似するヒトＩＬ−１０受容体結合アフィニティを特色とするが、本質的に生物学的活性をもたない。好ましくはそれらは、標準的アッセイ法においてヒトＩＬ−１０の生物学的活性の約１０％未満、より好ましくは約１％未満をもつであろう。アンタゴニストは、典型的には、ＩＬ−１０受容体を保有する細胞においてＩＬ−１０の生物学的活性の少なくとも約２５％の阻害を生じる。好ましくは阻害度は少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％であろう。実際の阻害度は測定された個々の生物学的活性に応じて異なる可能性がある。アゴニストおよびアンタゴニストは適切な方法により、たとえば全固相合成法、部分固相合成法、フラグメント縮合法、または古典的な溶液合成法により化学的に合成することもできる。化学的に合成されるポリペプチドは、たとえばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：３４１（１９８６）］およびアサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）ら（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，１９８９，ＩＲＬプレス，オクスフォード）の記載に従って固相ペプチド合成法により製造することが好ましい。アゴニストおよびアンタゴニストは、いかなる方法で製造されたとしても、たとえばＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、向流分配および／または他の周知の方法で精製することができる。１種類または２種類以上のＩＬ−１０アゴニストもしくはアンタゴニストまたはその薬剤学的に許容しうる塩、および生理学的に許容しうるキャリヤーを混合することにより、薬剤組成物を調製することができる。有用な薬剤学的キャリヤーは、本発明の組成物を患者に送達するのに適した任意の適合性無毒性物質であってよい。無菌の水、アルコール、脂肪、ろう、および不活性固体がキャリヤーに含まれる。薬剤学的に許容しうるアジュバント（緩衝剤、分散助剤）を薬剤組成物に含有させてもよい。一般にそれらの薬物の非経口投与に有用な組成物は周知である；たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１８版（メルク・パブリシング・カンパニー、ペンシルベニア州イーストン、１９９０）。たとえば無菌形態の１回量包装が好ましい場合が多い。アゴニストおよびアンタゴニストの投与は、非経口的に腹腔内、静脈内、皮下もしくは筋肉内への注射もしくは注入により、または他の許容しうる全身的方法により行うことが好ましい。あるいはアンタゴニストは移植または注入可能なドラッグデリバリーシステムにより投与しうる［たとえばウルカルト（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９（１９８４）；レビス（Ｌｅｗｉｓ）編，ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅｏｆＰｅｓｔｉｃｉｄｅｓａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１９８１，プレナム・プレス、ニューヨーク州ニューヨーク；米国特許第３，７７３，９１９および３，２７０，９６０号明細書を参照されたい］。アンタゴニストを胃腸プロテアーゼから保護する周知の配合物を用いて経口投与を行うこともできる。アゴニストおよびアンタゴニストを標準的な遺伝子療法により送達することもでき、これには組織への直接核酸注射、組換えウイルスベクターまたはリポソームの使用、およびトランスフェクションした細胞の移植が含まれる。たとえばローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：１８０（１９９２）を参照されたい。アゴニストおよびアンタゴニストは単独で、またはＴｈ応答欠陥を特色とする状態の治療に一般に用いられる他の薬剤１種類または２種類以上と組み合わせて投与することができる。たとえばインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）またはガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）をアンタゴニストと組み合わせ投与することができる。インシュリン依存性糖尿病の治療または予防のためにＩＬ−１０の代わりにアゴニストを使用する場合、インシュリン、サイクロスポリン、プレドニソンまたはアザチオプリンをアゴニストと組み合わせ投与することができる（出願中の米国特許出願第０７／９５５，５２３号明細書、１９９２年１０月１日出願を参照されたい）。他の薬剤１種類または２種類以上とのこのような組み合わせ投与は、アゴニストまたはアンタゴニストの併用（同時）または逐次（前または後）投与のいずれであってもよい。投与された薬剤はすべて療法効果をもつのに十分なレベルで患者内に存在しなければならない。典型的には、第１薬剤のほぼ半減期以内に第２薬剤を投与する場合、それら２薬剤は組み合わせ投与されたとみなされる。個々の状況に適切なアゴニストまたはアンタゴニストの投与量の決定は、当業者が容易になしうるものである。一般に、治療は最適量より少ない投与量で開始する。その後、その状況での最適効果が達成されるまで投与量を少量ずつ増加する。所望により全１日量を分割して１日のうちに少量ずつ投与するのが好都合である。有効量は１または２以上の臨床パラメーターの明らかな改善、および／またはＴｈの既知の機能（それらのうち幾つか、たとえばＩＬ−２の産生は前述）のうち１または２以上における統計的に有意に改善された応答を生じる用量である。この応答は患者から採取した血液を用いてインビトロで、たとえばクレリチ（Ｃｌｅｒｉｃｉ）ら（前掲）の記載に従って測定することができる。このようなインビトロアッセイを療法開始の前に実施して、改善した応答を比較しうる参照ベースラインを得ることができる。アゴニストおよびアンタゴニストならびにその薬剤学的に許容しうる塩を個々の患者に投与する実際の量および回数は、患者の年齢、状態および体格、ならびに治療する症状の程度を考慮して、担当医の判断に従って調節されるであろう。実施例本発明を以下の実施例により説明する。別に明記しない限り固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体はそれぞれｗ／ｗ、ｖ／ｖおよびｗ／ｖ基準である。試薬および一般法制限エンドヌクレアーゼはベーリンガー・マンハイム（インディアナ州インディアナポリス）から入手され、一方ＤＮＡリゲーションキットはタカラ・バイオケムＩｎｃ．（カリフォルニア州バークレー）から購入された。ＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼはストラタジーン（カリフォルニア州ラジョラ）から入手された。組換えヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）は、標準法によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において、本質的にツジモト（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ）ら［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６：２３（１９８９）］の記載に従って製造された。組織培養培地、ウシ胎児血清およびグルタミンはギブコ−ＢＲＬ（メリーランド州ゲイタースバーグ）から購入された。オリゴヌクレオチドプライマーは標準法により、アプライド・バイオシステムズ３８０Ａ、３８０Ｂまたは３９４ＤＮＡ合成装置（カリフォルニア州フォスター・シティー）を用いて合成された。標準的な組換えＤＮＡ法は、本質的にサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，１９８９，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，ニューヨーク州プレインビューの記載に従って実施された。トランスフェクション過渡的発現を下記により実施した。ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）を、１０％ウシ胎児血清、６ｍＭグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコのの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。トランスフェクションはバイオラド、ジーン・パルサー（ＧＥＮＥＰＵＬＳＥＲ、登録商標）（カリフォルニア州リッチモンド）を用いるエレクトロポレーションにより実施された。トリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を培養皿から脱着し、新鮮な培養培地に懸濁した。容量２５０μｌ中、約５×１０⁶の細胞を５μｇのプラスミドＤＮＡと混合し、次いで電圧およびキャパシタンスをそれぞれ０．２Ｖおよび９６０ｍＦＤに設定してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後に細胞を１０ｃｍの培養皿に移し、３７℃で５％ＣＯ₂において６時間、１０ｍｌの血清含有ＤＭＥＭ中で培養した。細胞が皿に付着したのち、培地を吸引により除去し、無血清培地と交換した。７２時間後に調整培地を分析用に採集した。アンタゴニストの調製野生型ヒトＩＬ−１０ｃＤＮＡおよび発現ベクターの再構築発現および操作を容易にするために、ＰＣＲによりｐＣＤＳＲα−系ｈＩＬ− １０ベクターを鋳型として用いて、ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡのコード領域を形成した［ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１１７２（１９９１）；配列はジーンバンクに受託番号Ｎｏ．Ｍ５７６２７で寄託された］。ただし他の既知のｃＤＮＡ源も使用しうる。コザク脊椎動物共通翻訳イニシエーター［Ｋｏｚａｋ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：８１２５（１９８７）］をＢ１７８９ＣＣと表示される５′プライマー（配列番号：５）に導入した。ＰｓｔＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位をそれぞれ５′プライマーＢ１７８９ＣＣおよびＡ１７１５ＣＣと表示される３′プライマー（配列番号：６）に付加した。上記プライマーを用いて、ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡを５０μｌ容量の反応混合物中において５０μｌパラフィン油を積層して、０．５ｍｌのエッペンドルフ試験管内でＰＣＲ処理した。反応混合物は典型的には下記を含有していた：２６．５μｌのＨ₂Ｏ，５μｌのＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液［反応中の最終濃度：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．８，５０ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭＭｇＣｌ₂，０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］，２００μＭｄＮＴＰ，６０ｎｇの鋳型ＤＮＡ，各１０ｐｍｏｌの５′ プライマーＢ１７８９ＣＣおよび３′プライマーＡ１７１５ＣＣ，ならびに０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（２単位）。反応をＰＨＣ−１サーモサイクラー（テクネ、ニュージャージー州プリンストン）により実施した；３０サイクル：変性のために９５℃で２分；アニーリングのために４２℃で２分；および合成のために７０℃で１分。３０回目のサイクルが終了した時点で、反応混合物を延長のために７２℃でさらに９分間インキュベートした。ＰＣＲ混合物を、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する１．２％アガローストリス−アセテートゲル中で電気泳動した。予想サイズのＤＮＡフラグメントをゲルから切り取り、ジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ、登録商標）キット（カリフォルニア州ラホヤ）により精製した。ゲルから回収したのち生成物ＤＮＡをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ゲル電気泳動により単離し、ジーンクリーン処理し、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントとして発現ベクターｐＤＳＲＧ（ＡＴＣＣ６８２３３）中へクローニングし、次いで発現ベクターｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔ（ギブコ−ＢＲＬ、メリーランド州ゲイタースバーグ）中へ移した。このｈＩＬ−１０含有ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株（ギブコ −ＢＲＬ）中で増殖させ、ＤＮＡの配列をＤＮＡ配列決定により確認した。このｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔ系ｈＩＬ−１０をＣＯＳトランスフェクションおよび突然変異ｈＩＬ−１０ベクターの構築に用いた。再合成されたｈＩＬ−１０ｃＤＮＡはユニークＢｇｌＩＩ部位およびユニークＢｓｔＥＩＩ部位を保有し、それらは両方とも野生型ｃＤＮＡ中に存在していた。これら２つの内部制限部位（それらの相対位置を模式的に下記に示す）をのちにカセット式置換による突然変異ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡの形成に使用した。カルボキシル末端修飾ｈＩＬ−１０のＣ−末端突然変異アンタゴニストを形成するために、野生型ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡのＢｓｔＥＩＩ／ＥｃｏＲＩ領域に対応する突然変異ｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより合成し、前記ｐＳＶ．ＳｐｏｒｔｈＩＬ−１０ＤＮＡ中の対応する領域の置換に用いた。ヒトＩＬ−１０の、Ｋ１５７Ｅ、Ｃ△３およびＣ△４突然変異アンタゴニストを、これらの突然変異が３′末端プライマーに予め導入された、前記の再合成ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡの配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより製造した。配列番号：７により定められるアミノ酸配列をもつＢ３３５１ＣＣと表示される５′プライマーを用いて、３種類の突然変異アンタゴニストを製造した。この５′プライマーの配列は、野生型ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡのユニークＢｓｔＥＩＩ制限部位を包含するヒトＩＬ−１０ｃＤＮＡ内部配列に対して相補的であった。アンタゴニストを形成するために用いた３′プライマーは、ｈＩＬ−１０をコードするｃＤＮＡの３′末端配列に対して相補的な配列をもっていた。これらのプライマーは下記のものであり、それらの配列を定める配列番号を付記する：上記プライマーを用いて、ヒトＩＬ−１０ｃＤＮＡを５０μｌ容量の反応混合物中において５０μｌパラフィン油を積層して、０．５ｍｌのエッペンドルフ試験管内でＰＣＲ処理した。反応混合物は典型的には下記を含有していた：２６．５μｌのＨ₂Ｏ，５μｌのｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ緩衝液［反応中の最終濃度：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．２，１０ｍＭＫＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ₂，６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，０．１％トリトンＸ−１００，および１０μｇ／ｍｌの無ヌクレアーゼ−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］，２００μＭｄＮＴＰ，４０ｎｇの鋳型ＤＮＡ，各１０ｐｍｏｌの５′プライマーＢ３３５１ＣＣおよび３′プライマーのうちの１つ，ならびに０．５μｌのｐｆｕポリメラーゼ（２．５単位）。反応をＰＨＣ−１サーモサイクラー（テクネ、ニュージャージー州プリンストン）で実施した；２２サイクル：変性のために９４℃で２分；アニーリングのために５０℃で２分；および合成のために７２℃で２分。２２回目のサイクルが終了した時点で、反応混合物を延長のために７２℃でさらに７．５分間インキュベートした。ＰＣＲ混合物を、フェノール−ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿により処理し、次いで順次ＢｓｔＥＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。この制限消化生成物を、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する１％アガロース／トリス−アセテートゲル中で電気泳動した。予想サイズのＤＮＡフラグメントをゲルから切り取り、フェノール−ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿により回収した。ゲルから回収したのち、ｈＩＬ−１０突然変異体のＢｓｔＥＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを用いて、ｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔベクター中の野生型ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡの対応する領域を置換した。ｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔ系ｈＩＬ−１０突然変異ｃＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α株中で増殖させ、ＤＮＡ配列決定により確認した。同じ発現ベクターを前記に従ってＣＯＳ細胞のトランスフェクションに用いた。アミノ末端修飾ヒトＩＬ−１０のＮ末端変異体を形成するために、野生型ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡのＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩ領域に対応する修飾ｃＤＮＡフラグメントを、プライマー対を用いてＤＮＡ鋳型なしにＰＣＲにより合成した。得られたフラグメントを用いて、ｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔベクター中の野生型ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡの対応する領域を置換した。こうして、野生型ｈＩＬ−１０のＮ末端から７個（変異体Ｎ△７）、１０個（変異体Ｎ△１０）、１１個（変異体Ｎ△１１）、または１２個（変異体Ｎ△１２）の残基を欠失した変異体が形成された。それぞれの変異体を形成するために用いたプライマー対は下記のものであり、それらの配列を定める配列番号を付記する：上記プライマー対のそれぞれのプライマー１０ｐｍｏｌを用いて、Ｃ末端突然変異アンタゴニストの合成につき先に記載したと同様にＰＣＲを実施した。ＰＣＲ混合物を、フェノール−ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿により処理し、順次ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩで消化した。この制限消化生成物を前記に従ってアガロースゲル中で電気泳動し、予想サイズのＤＮＡフラグメントをゲルから切り取り、フェノール−ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿により回収した。ゲルから回収したのち、ｈＩＬ−１０変異体のＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントを用いて、ｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔベクター中の野生型ｈＩＬ−１０ｃＤＮＡの対応する領域を、ＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩ消化によるその領域の切除および置換フラグメントのリゲーションにより置換した。ｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔ系ｈＩＬ −１０突然変異ｃＤＮＡを前記に従って増殖させ、確認し、使用した。得られたＮ△７、Ｎ△１０、Ｎ△１１およびＮ△１２変異体は、それぞれ配列番号：４の残基８−１６０、１１−１６０、１２−１６０、および１３−１６０で定められるアミノ酸配列をもっていた。Ｎ末端修飾を含むヒトＩＬ−１０アンタゴニストアミノ末端およびカルボキシル末端の両方に修飾を含むアンタゴニストは、前記方法を組み合わせることによって容易に調製しうる。たとえばＮ△７／Ｋ１５７Ｅアンタゴニストは、下記により形成しうる：前記の５′プライマーＢ３３５１ＣＣおよび３′プライマーＣ３４８１ＣＣを用いてＰＣＲを実施することにより、Ｋ１５７ＥアンタゴニストをコードするｃＤＮＡを含むｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔを製造する。前記に従って５′プライマーＣ３３５２ＣＣおよび３′プライマーＣ３３５５ＣＣを用いてＮ△７変異体フラグメントを調製し、単離したのち、変異体のＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントを用いてｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔベクター中のＫ１５７Ｅ突然変異ＤＮＡの対応する領域を、ＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩ消化による切除および置換フラグメントのリゲーションにより置換する。代謝標識ＣＯＳ細胞を前記に従って、ヒトＩＬ−１０をコードするｃＤＮＡ挿入配列；アンタゴニストＫ１５７Ｅ、Ｃ△３もしくはＣ△４；またはアゴニスト変異体Ｎ △７、Ｎ△１０、Ｎ△１１およびＮ△１２を保有する発現ベクターｐＳＶ．Ｓｐｏｒｔでトランスフェクションした。次いで細胞を１０ｃｍの培養皿内で血清含有培養培地中において４８−７２時間インキュベートした。このインキュベーション後に培養皿をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、３７℃で５％ＣＯ₂ 中において３０分間、透析ＦＢＳおよびグルタミンを補充した８ｍｌ／皿の無メチオニン−ＤＭＥＭ培地と共にインキュベートした。各皿の培地を吸引により除去し、２５０−３００μＣｉの³²Ｓ−メチオニン（デュポンＮＥＮ、マサチュセッツ州ボストン；比放射能４３．３ｍＣｉ／ｍｌ）を含有する無メチオニン− 培地５００μｌと交換した。細胞を３７℃で５％ＣＯ₂中において５時間インキュベートしたのち、１０μ ｌの１．５ｍｇ／ｍｌＬ−メチオニン原液を皿に添加し、３０分間のチェイスを行った。標識された調整培地を採集し、１０−２０％ゲル中で非還元性条件下にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動［ＳＤＳＰＡＧＥ；レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ），Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０（１９７０）］し、ゲルを乾燥させ、標準法およびコダックＸＡＲフィルムを用いてオートラジオグラフィー処理した。オートラジオグラフィーによりヒトＩＬ−１０；アンタゴニストＫ１５７Ｅ、Ｃ△３およびＣ△４；ならびにアゴニストＮ△７およびＮ△１０についての明瞭な標識バンドが見られ、これらはすべて見掛け分子量約１６−１８キロダルトンで移動した。同等なトランスフェクションおよび細胞培養条件下で３種類すべてのヒトＩＬ−１０カルボキシル末端突然変異アンタゴニストが若干低いレベルで発現した（ＩＬ−１０のものより約２−４倍低い）。アミノ末端アゴニスト変異体Ｎ△７の発現はＩＬ−１０のものに匹敵し、一方Ｎ△１０変異体はＩＬ−１０のレベルより約４倍低いレベルで発現した。変異体Ｎ△１１およびＮ△１２の発現はこの方法で検出するには低すぎた。ＥＬＩＳＡ分析突然変異アンタゴニストおよびヒトＩＬ−１０のレベルをＣＯＳ細胞調整培地においてさらに定量するために、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を本質的にアブラムス（Ａｂｒａｍｓ）ら［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１２７：５（１９９２）］の記載に従って実施した。ヒトＩＬ−１０上の異なるエピトープに対する２種類のモノクローナル抗体（９Ｄ７および１２Ｇ８と表示される）を標準法により調製し、それぞれ捕獲剤および検出剤として用いた。系列希釈した調整培地を、精製した組換えヒトＩＬ−１０を基準として用いるこのアッセイにおいて試験した。このアッセイの検出限界は約１ｎｇ／ｍｌであり、典型的には１００−３００ｎｇ／ｍｌの範囲のＩＬ−１０レベルが７２時間のインキュベーション後の培養培地中に測定された。これにより、ＩＬ−１０とアンタゴニストの相対レベルは代謝標識法により得られた結果と良好に相関することが認められ、このことは使用したモノクローナル抗体により認識されたエピトープは突然変異領域には存在しないことを示唆した。典型的なアッセイにおいて、ヒトＩＬ−１０、Ｋ１５７Ｅ、Ｃ△３、Ｃ△４、Ｎ△７、Ｎ△１０、Ｎ△１１およびＮ△１２につき測定された発現レベルはそれぞれ１３３、８０、６３、４８、１３９、２８、２３および６．５ｎｇ／ｍｌであった。バイオアッセイヒトＩＬ−１０および代表的ＩＬ−１０突然変異アンタゴニストを、マウスマスト細胞およびヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて活性につき試験した。マスト細胞刺激アッセイ法は本質的にオガラ（Ｏ’Ｇａｒａ）ら［Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：８２１（１９９０）］およびトンプソン−スナイプス（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｓｎｉｐｅｓ）ら［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：５０７（１９９１）］の記載に従って実施された。要約すると、ウェル当たり５×１０³のＭＣ／９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ８３０６）を、９６ウェルミクロタイタープレート中で１００μｌのアッセイ培地［１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），５０μＭ β−メルカプトエタノール，２ｍＭグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０］中において種々の量のヒトＩＬ−１０またはいずれかのＩＬ−１０アンタゴニストで４８時間処理した。次いで２５μｌの５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を各ウェルに添加し、プレートを３−５時間インキュベートした。次いで１０ｍＭＨＣｌを含む１０％ＳＤＳを用いて細胞を溶解し、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。ヒトＩＬ−１０ならびに変異体Ｎ△７、Ｎ△１０およびＮ△１１はこのアッセイにおいて活性であったが、変異体Ｎ△１２については活性が見られなかった。カルボキシル末端突然変異アンタゴニストは、最高３７５ｎｇ／ｍｌ（強い活性を生じたＩＬ−１０の量の約１００倍）において試験した場合ですら活性ではなかった。リポ多糖類（ＬＰＳ）により誘発されたサイトカイン合成のＩＬ−１０アンタゴニストによる阻害を測定するために、ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なドナーから採取し、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ、登録商標）密度勾配遠心分離により単離した［ボユム（Ｂｏｙｕｍ），Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ：７７（１９６６）］。ＰＢＭＣのアリコートを９６ウェルミクロタイタープレートのウェル（１０⁵細胞／ウェル；５％ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地２００μｌ中）に移した。ヒトＩＬ−１０を一定の１００ｐＭ濃度で、幾つかのウェルに１００倍過剰モル（１０ｎＭ）のＩＬ−１０アンタゴニスト（ＥＬＩＳＡにより測定）と共に、またはアンタゴニストなしで添加した。その直後にＬＰＳ（シグマ）を各ウェルに最終濃度８０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。それぞれＩＬ−１０発現ベクターまたはプラスミドｐＳＶ．ＳｐｏｒｔでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞により調整した培地を用いて、陽性および陰性のＩＬ−１０対照を平行してインキュベートした。後者の対照調整培地をすべての試料に対する希釈剤として用いた。測定はすべて二重に実施され、異なる細胞バッチを用いる追跡アッセイにより確認された。プレートを３７℃で５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中において２４時間インキュベートしたのち、上澄液を採取し、後の分析のために−２０℃に貯蔵した。採取した試料においてＩＬ−６、ＩＬ−１αおよびＴＮＦαのレベルを、ＥＬＩＳＡキット（ＲアンドＤシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）により製造業者の指示に従って測定した。表１に示すように、すべてのアンタゴニストがこのアッセイにおいてサイトカイン合成に対するＩＬ−１０の阻害活性を逆転させることが認められた。種々の量のＩＬ−１０突然変異アンタゴニストをＩＬ−１０の不在下で用いた同様なアッセイは、いずれのアンタゴニストもサイトカイン合成阻害活性をもたないことを示した。いずれのアンタゴニストについても最高１００ｐＭの濃度で阻害活性が検出されなかった。Ｔ細胞活性に対するＩＬ−１０の作用を調べるために、混合リンパ球応答（ＭＬＲ）アッセイを実施した。ヒトＰＢＭＣを前記に従って単離した。細胞を５０ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）で３７℃において２０分間処理することにより、刺激ＰＢＭＣを調製した。それぞれ約１×１０⁵の応答ＰＢＭＣと刺激細胞を９６ウェルミクロタイターディッシュの各ウェル内で、種々の量のヒトＩＬ−１０またはＫ１５７Ｅ、Ｃ△ ３もしくはＣ△４アンタゴニストのうちのいずれかと共に合計２００μｌで混合した（三重試験で）。細胞を３７℃で５％ＣＯ₂において６日間インキュベートしたのち、ウェル当たり１μＣｉのトリチウム化チミジン（［³Ｈ］−ＴｄＲ；１５．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ、マサチュセッツ州ボストン）で培養物を１６時間パルスした。細胞溶解物を９６ウェル細胞ハーベスター（スカトロン・インコーポレーテッド、バージニア州スターライン）によりフィルター上に採集し、 β−カウンター（ファルマシアＬＫＢニュークリアー・インコーポレーテッド、メリーランド州ゲイタースバーグ）で計数した。アンタゴニストはＭＬＲを１ｎｇ／ｍｌの濃度で阻害し得ないことが認められた。これに対しヒトＩＬ−１０はその濃度で８２％のＭＬＲ阻害を生じた。受容体結合アッセイ精製ヒトＩＬ−１０（純度約９９％）をエンザイモビーズ（ＥＮＺＹＭＯＢＥＡＤ、登録商標）法（バイオラド、カリフォルニア州リッチモンド）により、製造業者の指示に従って放射性ヨウ素化した。ヒトＩＬ−１０受容体ｃＤＮＡを発現するトランスフェクションしたＣＯＳ細胞約４×１０⁵個を２００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化し、結合用緩衝液（ＰＢＳ，１０％ウシ胎児血清，０．１％ＮａＮ₃）で洗浄し、［¹²⁵Ｉ］−ヒトＩＬ−１０（比放射能２２５ μＣｉ／μｇ）を含有する結合用緩衝液２００μｌに１５０ｐＭの濃度で、ヒトＩＬ−１０または本発明の突然変異アンタゴニストのいずれかをコードするｃＤＮＡを発現するＣＯＳ細胞からの系列希釈した調整培地と共に再懸濁した。４℃で２時間のインキュベーション後に、細胞を同温度において２００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで上澄液を除去し、標識ＩＬ−１０を含有しない結合用緩衝液１００μｌに各細胞ペレットを再懸濁し、長いミクロ遠心管内で結合用緩衝液中の１０％グリセリン２００μｌ上に積層し、４℃において２００×ｇで１０分間遠心分離し、液体窒素中で急速凍結した。次いで細胞ペレットを切り取って計数用試験管に装入し、クリニガンマ（ＣＬＩＮＩＧＡＭＭＡ、登録商標）１２７２カウンター（ファルマシアＬＫＢ）で計数した。５００−１０００倍モル過剰の非標識ヒトＩＬ−１０の存在下で結合を実施することにより、非特異的結合を測定した。結果を表２に示す。表においてすべてのＩＬ−１０アンタゴニストが受容体結合競合においてＩＬ−１０自身とほとんど同程度に有効であったことが分かる。当業者に自明のとおり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の多数の修正および変更をなしうる。本明細書に記載した具体的態様は例示のために提示したにすぎず、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。配列表配列番号：１配列の長さ：１６０アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列：配列番号：２配列の長さ：１５７アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列：配列番号：３配列の長さ：１５６アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列：配列番号：４配列の長さ：１６０アミノ酸配列の型：アミノ酸卜ポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列：配列番号：５配列の長さ：６０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：６配列の長さ：４１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：７配列の長さ：８５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：８配列の長さ：４９塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：９配列の長さ：４０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１０配列の長さ：３７塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１１配列の長さ：９１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１２配列の長さ：９０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１３配列の長さ：８２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１４配列の長さ：８１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１５配列の長さ：８２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１６配列の長さ：７８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１７配列の長さ：８１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：配列番号：１８配列の長さ：７５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：

【手続補正書】【提出日】１９９６年１月２６日【補正内容】請求の範囲１．１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニスト。２．１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含むヒトＩＬ−１０のアンタゴニストをコードする核酸。３．１−１１個のアミノ末端アミノ酸残基の欠失により修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアゴニスト。４．１−１１個のアミノ末端アミノ酸残基の欠失により修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含むヒトＩＬ−１０のアゴニストをコードする核酸。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニスト２．アミノ末端から１−１１個のアミノ酸残基が欠失した、請求項１に記載のアンタゴニスト。３．配列番号：１、２または３により定められるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のアンタゴニスト。４．１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含むヒトＩＬ−１０のアンタゴニストをコードする核酸。５．アミノ末端から１−１１個のアミノ酸残基が欠失したアンタゴニストをコードする、請求項４に記載の核酸。６．配列番号：１、２または３により定められるアミノ酸配列を有する、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストをコードする、請求項４に記載の核酸。７．請求項４に記載の核酸を含む組換えベクターであって、該核酸の発現を指示しうるベクター。８．請求項７に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。９．１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストを製造する方法であって、請求項８に記載の宿主細胞を該核酸が発現される条件下で培養することを含む方法。１０．核酸がアミノ末端から１−１１個のアミノ酸残基が欠失したアンタゴニストをコードする、請求項９に記載の方法。１１．核酸が配列番号：１、２または３により定められるアミノ酸配列を有するアンタゴニストをコードする、請求項９に記載の方法。１２．ヒトＩＬ−１０の生物学的活性を阻害する方法であって、ヒトＩＬ−１０に対する受容体を保有する細胞を、１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ −１０を含むヒトＩＬ−１０のアンタゴニストの有効量と接触させることを含む方法。１３．アンタゴニストのアミノ末端から１−１１個のアミノ酸残基が欠失した、請求項１２に記載の方法。１４．アンタゴニストが配列番号：１、２または３により定められるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。１５．１−１１個のアミノ末端アミノ酸残基の欠失により修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアゴニスト。１６．７、１０または１１個のアミノ酸残基が欠失した、請求項１５に記載のアンタゴニスト。１７．１−１１個のアミノ末端アミノ酸残基の欠失により修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含むヒトＩＬ−１０のアゴニストをコードする核酸。１８．７、１０または１１個のアミノ酸残基が欠失したアゴニストをコードする、請求項１７に記載の核酸。１９．請求項１７に記載の核酸を含む組換えベクターであって、該核酸の発現を指示しうるベクター。２０．請求項１９に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。２１．１−１１個のアミノ末端アミノ酸残基の欠失により修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含むヒトＩＬ−１０のアゴニストを製造する方法であって、請求項２０に記載の宿主細胞を該核酸が発現される条件下で培養することを含む方法。２２．核酸が、７、１０または１１個のアミノ酸残基が欠失したアゴニストをコードする、請求項２１に記載の方法。２３．薬剤学的に許容しうるキャリヤー、および有効量の（ａ）１−１１個のアミノ末端アミノ酸残基の欠失により修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアゴニスト、または（ｂ）１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストを含む薬剤組成物。２４．アンタゴニストのアミノ末端から１−１１個のアミノ酸残基が欠失した、請求項２３に記載の薬剤組成物。２５．アンタゴニストが配列番号：１、２または３により定められるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の薬剤組成物。２６．アゴニストにおいて７、１０または１１個のアミノ酸残基が欠失した、請求項２３に記載の薬剤組成物。２７．１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストを、ＩＬ−１０の生物学的活性を阻害するために使用する用途。２８．１５７位のリシン残基を酸性アミノ酸残基で置換するか、または約１２個のカルボキシル末端残基を含む領域において１個または２個以上のアミノ酸残基を欠失させることにより修飾された成熟ヒトＩＬ−１０を含む、ヒトＩＬ−１０のアンタゴニストを、ＩＬ−１０の生物学的活性を阻害する薬剤の製造に使用する用途。