SK150596A3

SK150596A3 - Agonists and antagonists of human interleukin-10

Info

Publication number: SK150596A3
Application number: SK1505-96A
Authority: SK
Inventors: Chuan-Chu Chou; Xiao-Yan Cai
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1997-04-09
Also published as: AU681178B2; SG43798A1; IL110413A0; HUT73463A; WO1995003411A1; ZA945434B; CZ23396A3; CA2168110A1; CN1127529A; NO960309L; FI960353A0; NO960309D0; SK8396A3; PL312718A1; AU7399694A; FI960353A; JPH08507930A; NZ269663A; EP0711346A1; HU9503983D0

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka agonistov ľudského interleukínu-10, spôsobu ich prípravy a použitia. Títo agonisti sa tvoria substitúciou alebo deléciou karboxy- alebo aminokouca aminokyselín v dospelom ľudskom interleukíne-10.

Doterajší stav techniky

Interleukín-10 (IL-10) je cytokín schopný sprostredkovávať množstvo pôsobení alebo účinkov. IL-10 bol izolovaný ako z myšacích, tak aj z ľudských buniek a je zapojený do riadenia imunitnej odpovede rôznych tried alebo súborov CD4⁺ T pomocných (Th) buniek. Tieto Th bunky môžu byť rozdelené na rôzne súbory, ktoré sa odbšujú svojimi profilmi tvorby cytokínov. Dva z týchto súborov sa nazývajú Thl a Th2 bunky.

Klony T buniek Thl tvoria interleukín-2 (IL-2) a gama interferón (IFN-γ), zatiaľ čo klony T buniek Th2 secemujú IL-10, interleukín-4 (IL-4) a interleukín-5 (IL-5), všeobecne po aktivácii antigénmi a lektínmi. Obe triedy Th bunkových klonov produkujú cytokíny, ako je nádorový nekrózový faktor-α (TNF'-a), interleukín-3 (IL-3) a faktor stimulácie kolónií granulocytov-makrofágov (GM-CSF). Tretia kategória Th buniek (ThO) tvorí súčasne IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5, TNF-α, IL-3 a GM-CSF.

Rozdielne typy produkcie cytokínov Thl a Th2 bunkami sčasti odrážajú ich úlohy v odpovedi na rôzne patogény. Thl bunky sú napríklad zapojené v úspešných bunkových odpovediach na množstvo intercelulámych patogénov. Sú zapojené aj v hypersenzitívnych reakciách oneskoreného typu. Th2 bunky sú spojené s humorálnymi odpoveďami, ktoré sú charakterizované tvorbou protilátok. Vo väčšine situácií vyvinie imunitný systém Th odpoveď, ktorá je na elimináciu konkrétneho antigénu alebo patogénu najúčinnejšia, ale nie je tomu tak vždy.

Napríklad: leishmanióza je charakterizovaná defektnou odpoveďou Thl. Tento defekt môže byť demonštrovaný použitím in vitro testov, ako je test opísaný Clericim et al. [J. Clin. Invest. 84:1983 (1989)]. Použitím jedného takéhoto in vitro testu bolo ukázané, že defekt Thl odpovede možno pripísať endogénnym hladinám IL-10, pretože funkciu Thl možno napraviť pridaním neutralizujúcich protilátok proti IL-10.

Pretože leishmanióza a iné choroby sú charakterizované defektnou odpoveďou Thl, ktorú možno pripísať nenáležitému pôsobeniu endogénneho IL-10, nastáva potreba agonistov a antagonistov IL-10 na liečbu takýchto chorôb.

Podstata vynálezu

Podstatou tohto vynálezu je agonista ľudského IL-10, ktorý zahŕňa dospelý ľudský IL-10 modifikovaný deléciou jedného až jedenástich aminotermálnych aminokyselinových zvyškov.

Riešenie sa týka tiež nukleových kyselín kódujúcich týchto agonistov, rekombinantných vektorov a transformovaných hostiteľských buniek obsahujúcich takéto nukleové kyseliny, spôsobu prípravy agonistov a ich použitia.

Výraz “dospelý ľudský IL-10“ je definovaný ako bielkovina bez zavádzacej sekvencie, ktorá (a) má aminokyselinovú sekvenciu v podstate zhodnú so sekvenciou IV definovanou tu nižšie

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp /da Phe Ser Arg

25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu

40 45

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala

55 60

Leu Ser Glu Met íle Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala

70 75 80

Glu Asn Gin Asp Pro Asp íle Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125

Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140 íle Phe He Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Asn 145 150 155 160 (IV), a (b) má biologickú aktivitu, ktorá je bežná u natívneho IL-10. Toto zahŕňa prirodzené alelické varianty a iné varianty, majúce jednu alebo viac konzervatívnych aminokyselinových substitúcií [ Grantham, Science 185: 862 (1974) ], ktoré v podstate nenarúšajú biologickú aktivitu. Takéto konzervatívne substitúcie zahŕňajú skupiny synonymných aminokyselín, napr. ako je opísané v U.S. patente číslo 5 017 691 Leeho et al.

Môžu byť tiež uskutočňované viac alebo menej rozsiahle delécie. Deletovaných môže byť jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov, zahŕňajúcich asi 12 karboxyterminálnych zvyškov. Výhodne sa deletuje asi 8 terminálnych zvyškov, výhodnejšie 3 alebo 4 terminálne zvyšky.

Prekvapujúco bolo zistené, že môže byť deletovaných až 11 aminokyselinových zvyškov z aminokonca dospelého ľudského IL-10. Tieto skrátené varianty, ktoré môžu mať v porovnaní so samotným IL-10 odlišné farmakokinetické vlastnosti, majú biologickú aktivitu dospelého ľudského IL-10, ako bolo zmerané pomocou testu stimulácie MC/9 žírnych buniek. Preto sú užitočné pri liečbe všetkých indikácií vnímavých na liečbu samotným IL-10. Užitočné sú tiež aj na niektoré iné účely, napr. na afmitné čistenie.

Pretože majú biologickú aktivitu ľudského IL-10, ale majú skrátenú aminokyselinovú sekvenciu, odkazuje sa tu na tieto varianty tiež ako na “agonistov ľudského IL-10“.

Všeobecne sa prijíma, že cysteŕnový zvyšok v polohe 12 je esenciálny pre biologickú aktivitu. Skutočne : deléciou prvých 12 zvyškov, včítane tohto cysteínového zvyšku, vznikla varianta, ktorá nemala žiadnu biologickú aktivitu. Preto sú delécie v aminokonci obmedzené na deléciu jedného alebo viacerých z prvých 11 zvyškov.

Nukleové kyseliny, kódujúce agonistov IL-10, sú tiež súčasťou tohto vynálezu.Odbomíci vedia, že v dôsledku degenerácie genetického kódu existuje mnoho rôznych nukleových kyselín, ktoré môžu kódovať každého agonistu a antagonistu. Konkrétne použité kodóny môžu byť vybrané na základe pohodlnej konštrukcie a optimálnej expresie v prokaryotických a eukaryolických systémoch.

Výhodne sa nukleové kyseliny, kódujúce agonistov, pripravujú použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) [Saiki etal., Science 239: 487 (1988)], ako je to podané v príklade Daughertyho et al. [Nucleic Acid Res. 19: 2471 (1991)], na modifikáciu cDNK kódujúcej ľudský IL-10. Takáto cDNK je dobre známa v odbore a možno ju pripravovať použitím štandardných metód opísaných napr. v publikácii medzinárodnej patentovej prihlášky číslo WO 91/00349. Klony obsahujúce sekvencie kódujúce ľudský IL-10 sú tiež deponované v American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, pod číslami 68191 a 68192.

Alternatívne môže byť DNK modifikovaná použitím dobre známych techník riadenej mutagenézy. Viď napr. Gillman et al., Gene 8: 81 (1979), Roberts et al., Náture 328: 731 (1987) alebo Innis (ed.), 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York, N Y.

Nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu môžu byť tiež syntetizované chemicky použitím napr. fosfoamidovej metódy na pevnej fáze podľa Matteucciho et al. [J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981)], metódy Yoo et al. [J. biol. Chem. 764: 17078 (1989)] alebo iných dobre známych metód.

Rekombinantné vektory, obsahujúce tieto nukleové kyseliny, sú tiež súčasťou tohto vynálezu, ako aj hostiteľské bunky transformované týmito vektormi a spôsob prípravy agonistov.

Inzercia DNK, kódujúcej jedného z agonistov, do jedného z množstva známych vektorov expresie, sa ľahko uskutoční, ak konce tejto DNK, tak aj vektora, obsahujú kompatibilné reštrikčné miesta. Pokiaľ toto nie je možné uskutočniť, môže byť potrebné modifikovať zakončenia týchto DNK a/alebo vektora spätnou digesciou prečnievajúcich úsekov jednovláknovej DNK, vytvorených Štiepením reštrikčnou endonukleázou, na vytvorenie tupého konca alebo na dosiahnutie toho istého výsledku zaplnením jednovláknových zakončení náležitou DNK polymerázou.

Alternatívne, akékoľvek žiadané miesto môže byť vytvorené ligáciou nukleotidových sekvencii (spojok) na tieto zakončenia. Tieto spojky môžu obsahovať špecifické oligonukleotidové sekvencie, ktoré definujú žiadané reštrikčné miesto. Štiepený vektor a fragmenty DNK môžu byť , ak je to potrebné, modifikované aj homopolymémym predĺžením alebo PCR.

Agonisti môžu byť chemicky syntetizovaní vhodnou metódou, ako je syntéza výhradne na pevnej fáze, metódami čiastočne na pevnej fáze, kondenzáciou fragmentov alebo klasickou syntézou v roztoku. Chemicky syntetizované polypeptidy sú výhodne pripravované peptidovou syntézou na pevnej fáze, napr. ako je opísaná Merrifieldom [ J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Science 232: 341 (1986) ] a Athertonom et al., (Solid Phase Peptíde Synthesis: A Practical Approach, 1989, IRL Press, Oxford ).

Akýmkoľvek spôsobom pripravených agonistov možno čistiť použitím HPLC, gélovej filtrácie, ionomeničovej a partičnej chromatografie, protiprúdového delenia alebo iných dobre známych spôsobov.

Farmaceutické prostriedky môžu byť pripravené zmiešaním jedného alebo viacerých agonistov IL-10 alebo ich farmaceutický prijateľných solí s farmaceutický prijateľným nosičom.

Vhodnými farmaceutickými nosičmi môžu byť akékoľvek kompatibilné netoxické látky, ktoré sú vhodné na podávanie prostriedkov podľa vynálezu pacientovi.

Nosič môže obsahovať vodu, alkohol, tuky, vosky a inertné tuhé látky. Do farmaceutického prostriedku môže byť tiež začlenené farmaceutický prijateľné adjuvans ( pufŕačné činidlo, dispergačné činidlo ). Všeobecne sú prostriedky užitočné na parenterálne podávanie takýchto liekov, dobre známe, napr. Remington 's Pharmaceutical Science, 18. vydanie (Mack Publishing Company, Easton, P A, 1990). Balenie po jednotlivých dávkach je často výhodné, napr. v sterilnej forme.

Podávanie agonistov je výhodne parenterálne, pomocou intraperitoneálnych, intravenóznych, subkutánnych alebo intramuskulámych injekcií alebo infúzií alebo pomocou akéhokoľvek iného prijateľného systémového spôsobu. Alternatívne môže byť agonista podávaný implantovateľným alebo injikovateľným systémom dodávania lieku, [ viď napr. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199 (1984), Lewis, ed., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, 1981, Plénum Press, New York, New York, U.S. patenty číslo 3 773 991 a 3 270 960 ]. Možno uskutočňovať aj orálné podávanie, podávaním dobre známych prípravkov, ktoré chránia agonistu pred gastrointestinálnymi proteázami.Viď tiež Langer, Science 249: 1527 (1990).

Agonisti môžu byť podávaní aj štandardnými technikami génovej terapie, včítane napr. priamej injekcie nukleovej kyseliny do tkanív, použitia rekombinantných vírusových vektorov alebo lipozómov a implantácie transfekovaných buniek. Viď napr. Rosenberg, J. Clin. Oncol. 10: (1992).

Agonisti môžu byť podávaní samotní alebo v kombinácii s jedným alebo s viacerými inými činidlami bežne používanými na liečenie stavov charakterizovaných defektnou Th odpoveďou. Inzulín, cyklosporin, prednizón alebo azatioprm môžu byť podávané spolu s agonistom, napr. ak sa používajú ako náhrada za IL-10 na liečbu alebo prevenciu od inzulínu závislého diabetes mellitus ( viď súčasne podanú U.S. prihlášku číslo 07/955 523 z l.októbra 1992 ).

Toto spoločné podávanie jedného alebo viacerých činidiel môže byť súbežné (spolu s) alebo postupné (pred alebo po) vzhľadom na podanie agonistu alebo antagonistu. Všetky podávané činidlá musí mať pacient v dostatočných hladinách, aby boli farmaceutický účinné. Typicky: pokiaľ sa druhé činidlo podá počas asi polčasu prvého činidla, považuje sa podanie týchto dvoch činidiel za spoločné.

Stanovenie príslušného dávkovania agonistu pre konkrétnu situáciu spadá pod znalosti v odbore. Všeobecne sa liečba začína menšími dávkami ako je optimum. Potom sa dávkovanie zvyšuje s malými odchýlkami, kým sa nedosiahne optimálny účinok pri daných podmienkach. Ak je to žiadúce, môže byť vhodné rozdeliť celkovú dennú dávku a podávať ju po častiach.

Účinným množstvom je dávka, ktorá vedie k preukázateľnému zlepšeniu jedného alebo viacerých klinických parametrov alebo k štatisticky významnému zlepšeniu odpovede v jednej alebo vo viacerých známych Th funkciách; niektoré z nich, ako tvorba ĽL-2, sú opísané vyššie. Táto odpoveď môže byť meraná in vitro pri použití krvných buniek odobraných pacientovi, napr. ako je opísané v Clerici et al., ako vyššie. Takýto in vitro test možno uskutočniť pred začiatkom liečby na poskytnutie základnej referenčnej hodnoty, s ktorou sa môže zlepšená odpoveď porovnávať.

Skutočné množstvo a počet dávok agonistov a ich farmaceutický prijateľných solí konkrétnemu pacientovi, je regulované podľa posúdenia ošetrujúceho lekára, s prihliadnutím na také faktory, ako je vek, stav a veľkosť pacienta a stupeň symptómu(ov), ktorý sa lieči.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Tento vynález môže byť vysvetlený nasledujúcimi príkladmi. Pokiaľ nie je špecifikované inak, percentá udané nižšie pre tuhé látky v tuhých látkach, kvapaliny v kvapalinách resp. tuhé látky v kvapalinách, sú založené na pomeroch hmotnosť/hmotnosť, objem/objem, resp. hmotnosť/objem.

Reagencie a všeobecné metódy

Reštrikčné endonukleázy boli získané od Boehringer Mannheim (Indianopobs, IN ), zatiaľ čo súprava na ligáciu DNK bola obstaraná od Takara Biochem., Inc. (Berkley, CA). Taq polymeráza a Pfu polymeráza boli získané zo Stratagene (La Jóba, CA). Rekombinantný ľudský IL-10 ( hIL-10 ) bol pripravený štandardným spôsobom v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka ( CHO ), ako je to v podstate opísané v Tsujimoto et al. [ J. Biochem. 106: 23 (1989)]. Médium na tkanivové kultúry, fetálne bovinné sérum a glutamín boli získané od Gibco-BRL (Gaithesburg, MD). Oligonukleotidové priméry boli syntetizované štandardm/mi metódami použitím DNK syntetizátora Applied Biosystems 380A, 380B alebo 394 (Foster City, CA).

Štandardné metódy rekombinantnej DNK sa uskutočôovab v podstate tak, ako ich opisuje Sambrook et al. n Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York.

Transfekcia

Transientná expresia sa uskutočňovala nasledovne. Bunky COS ( ATCC CRL 1651 ) bob udržiavané v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu ( DMEM ) doplnenom 10 % fetálnym bo vinným sérom, 6 mM glutamínom a penicilínom/streptomycínom. Transfekcia sa uskutočnila elektroporáciou s použitím Bio-Rad GENE PULSER^r ( Richmond, CA ).

Bunky bob uvoľnené z kultivačných misiek pôsobením trypsínu-EDTA a suspendované v čerstvom kultivačnom médiu. Asi 5 x 10⁶ buniek v objeme 250 μΐ bolo zmiešaných s 5 pg plazmidovej DNK a potom elektroporovaných pri napätí nastavenom na 0,2 V a kapacite nastavenej na 960 mFD:

Po elektroporácii bob bunky prenesené do 10 cm kultivačných misiek a kultivované v 5 % CO2 pri 37 °C počas 6 hodín v 10 ml sérum obsahujúceho DMEM. Keď sa bunky prichytib na misky, médium bolo odstránené odsatím a nahradené bezsérovým médiom. Po 72 hodinách bolo kondicionované médium zobrané na analýzu.

Aminoterminálna modifikácia

Na vytvorenie N-koncových variantov ľudského IL-10 boli pomocou PCR syntetizované modifikované cDNK fragmenty zodpovedajúce Pstl/Bglll oblasti hIL-10 cDNA divého typu, s použitím páru primérov bez DNK templátu. Výsledné fragmenty bob použité na náhradu zodpovedajúcej oblasti hIL-10 DNK divého typu vo vektore pSV. Šport. Takto bob vytvorené varianty, v ktorých bolo z N-konca hIL-10 divého typu deletovaných 7 (variant ΝΔ7), 10 (variant ΝΔ10), 11 (variant ΝΔ11) a 12 (variant ΝΔ12) aminokyselín. Páry primérov, použité na vytvorenie každého variantu s následnými číslami sekvencií definujúcimi ich sekvencie, bob nasledovné:

Mutant:	Primér (koniec):	Číslo sekvencie
ΝΔ7	C3352CC (5')	XI
	C3355CC(3')	XII
ΝΔ10	C3353CC(5')	XIII
	C3354CC(3')	XIV
ΝΔ11	C3483CC (5')	XV
	C3485CC (3')	XVI
ΝΔ12	C3484CC (5')	XVII
	C3486CC (3')	XVIII

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60 CCTGACTGGG GTGAGGGCCT CTGAGAACAG C 91 (XI)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60 CTCAGAGGCC CTCACCCCAG TCAGGAGGAC 90 (ΧΠ)

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60 CCTGÁCTGGG GTGAGGGCCA GC 82 (ΧΙΠ)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60 CCTCACCCCA GTCAGGAGGA C 81 (XIV)

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60 CCTGÁCTGGG GTGAGGGCCT GC 82 (XV)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60 CACCCCAGTC AGGAGGAC 78 (xvi)

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60 CCTGÁCTGGG GTGAGGGCCA C 81 (XVII)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60 CCCAGTCAGG AGGAC 75 (xvni).

PCR sa uskutočňovala s použitím 10 pmol každého priméru z uvedených primérových párov, ako je to opísané vyššie pre syntézu C-tenninálnych mutantných antagonistov. PCR zmes bola spracovaná extrakciou fenolom-CHCb, zrazením etanolom a potom postupne digerovaná Bgffl. a Psň. Produkty reštrikčnej digescie boli podrobené elektroforéze v agarovom géli tak, ako je to opísané vyššie a DNK fragmenty majúce očakávané veľkosti boli vyrezané z gélu a získané extrakciou fenolom-CHCb a vyzrážaním etanolom.

Po získaní z gélu boli Psň! Bglň reštrikčné fragmenty hIL-10 variantov použité na náhradu zodpovedajúcej oblasti hIL-10 DNK divého typu vo pSV. Šport vektore po vyštiepení tejto oblasti Psň/ Bgňl digesciou a ligáciu nahrádzajúceho fragmentu. hlL10 mutantnej cDNK vo vektore založenom na pSV.Sport boli namnožené, overené a použité tak, ako je to opísané vyššie.

Výsledné varianty ΝΔ7, ΝΔ10, ΝΔ11 resp. ΝΔ12 mali amonikyselinové sekvencie definované zvyškami 8 - 160, 11 - 160, 12 - 160 resp. 13 - 160 sekvencie IV, vyššie.

Metabolické označovanie

COS bunky boli transfekované tak, ako je to opísané vyššie, vektorom expresie pSV.Sport, ktorý nesie cDNK inzerty kódujúce ľudský IL-10; antagonistami K157E, CA3 alebo ΟΔ4; alebo variantmi agonistov ΝΔ7, ΝΔ10, ΝΔ11 alebo ΝΔ12. Bunky bob potom inkubované v 10 cm kultivačných miskách v 5 % CO2 pri 37 °C počas 48 až 72 hodín v sérum obsahujúcom kultivačnom médiu. Po tejto inkubách bob kultivačné misky dvakrát premyté fosfátovým soľným pufrom (PBS) a inkubované v 5 % CO₂ pri 37 °C po dobu 30 minút s 8 ml/misku média DMEM bez metionínu a doplneného dialyzovaným FBS a glutamínom. Médium bolo z každej misky odstránené odsatím a <3 ŕ nahradené 500 μΐ média bez metionínu a obsahujúceho 250-300 pCi S-metionínu (DuPont NEN, Boston, MA; špecifická aktivita 43.3 mCi/ml).

Bunky bob inkubované v 5 % CO₂ pri 37 °C 5 hodín, potom sa do misiek pridalo 10 μΐ zo zásobného roztoku 1,5 mg/ml L- metionínu a vykonala sa 30 minútová inkubácia. Označené kondicionované médium bolo odobrané a podrobené elektroforéze na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným [SDS PAGE; Laemmli, Náture 227\ 680 (1970)] v 10 až 20 % géloch pri neredukujúcich podmienkach a gély bob vysušené a autorádiografované použitím štandardných metód a filmu Kodak XAR.

Autorádiografia ukázala rôzne značkované pruhy pre ľudský EL-10; antagonistov K157E, ΟΔ3 a ΟΔ4; a pre agonistov ΝΔ7 a ΝΔ10, ktorí všetci migrovab so zdanlivými molekulovými hmotnosťami asi 16 až 18 kilodaltonov. Pri identických podmienkach transfekcie a kultivovania buniek boli všetci traja antagonisti, karboxyterminálm mutanti ľudského IL-10, exprimovaní na trocha zníženej úrovni asi 2 až 4 krát menej ako IL-10. Expresia aminoterminálneho agonistového variantu ΝΔ7 bola porovnateľná s IL-10, zatiaľ čo ΝΔ10 variant bol exprimovaný na úrovni asi štyrikrát nižšej ako IL-10. Expresia variantov ΝΔ11 a ΝΔ12 bola príliš nízka na to, aby bola detegovaná touto metódou.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Agonista ľudského IL-10, ktorý zahŕňa dospelý ľudský IL-10 modifikovaný deléciou od jedného do jedenástich z aminotermináluych zvyškov.
2. Agonista podľa nároku 1, v ktorom bolo deletovaných 7, 10 alebo 11 aminokyselinových zvyškov.
3. Nukleová kyselina kódujúca agonistu ľudského IL-10, ktorý zahŕňa dospelý ľudský 11-10 modifikovaný deléciou od jedného do jedenástich z aminoterminálnych zvyškov.
4. Nukleová kyselina podľa nároku 3, kódujúca agonistu ľudského IL-10, v ktorom bolo deletovaných 7, 10 alebo 11 aminokyselinových zvyškov.
5. Rekombinantný vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa nároku 3, ktorý je schopný riadiť expresiu tejto nukleovej kyseliny.
6. Hostiteľská bunka obsahujúca rekombinantný vektor podľa nároku 5.
7. Spôsob prípravy agonistu ľudského IL-10, zahŕňajúceho dospelý ľudský IL-10 modifikovaný deléciou od jedného do jedenástich z aminoterminálnych zvyškov, v y z načujúci sa tým, že hostiteľské bunky podľa nároku 6 sa kultivujú v podmienkach, kedy sa nukleová kyselina exprimuje.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina kóduje agonistu ľudského IL-10, v ktorom bolo deletovaných 7, 10 alebo 11 aminokyselinových zvyškov.
9. Farmaceutický prostriedok , vyznačujúci sa tým , že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a účinné množstvo agonistu ľudského IL-10, zahŕňajúceho dospelý ľudský IL-10 modifikovaný deléciou od jedného do jedenástich z aminoteiminálnych aminokyselinových zvyškov.
10; Použitie agonistu ľudského IL-10, ktorý zahŕňa dospelý ľudský IL-10 modifikovaný náhradou lyzínového zvyšku v polohe 157 zvyškom kyslej aminokyseliny alebo deléciou troch alebo štyroch aminokyselinových zvyškov v karboxyterminálnej oblasti, na výrobu liečebného prostriedku na inhibíciu biologickej aktivity IL-10.