CZ283049B6

CZ283049B6 - Protein BCRF1 viru Epstein-Barr schopný inhibovat syntézu gama-interferonu, expresní vekter pro jeho syntézu a farmaceutický přípravek jej obsahující

Info

Publication number: CZ283049B6
Application number: CS906351A
Authority: CZ
Inventors: Kevin W. Moore; Robert A. Kastelein
Original assignee: Schering Corporation
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-18
Publication date: 1997-12-17
Also published as: MX9203409A; ES2064082T3; AU652732B2; WO1991009127A1; US5736390A; OA09703A; DK0506836T3; FI922770A0; MY107449A; HUT65369A; IE904588A1; IE72203B1; PT96231B; JPH05503846A; CN1057012C; NO922456D0; NZ236512A; IL96715A0; PT96231A; SK279830B6

Abstract

Protein je definovaný sekvencí aminokyselin vzorce III. Epresní vektor je deponován pod depozitním číslem ATCC 68193. Farmaceutický přípravek obsahuje protein BCRF1 ve spojení s přijatelným nosičem nebo excipientem. Je použitelný k léčení nemocí souvisejících s nevhodnými imunními odpovědmi způsobovanými nadměrnými hladinami .gama.-interferonu, jako jsou parazitní a alergické nemoci, poruchy související s MHC, revmatické arthritidy, systémová lupénka, myostenie, cukrovka závislá na inzulínu nebo poruchy štítné žlázy. ŕ

Description

Vynález se týká proteinu BCRF1 viru Epstein-Barr, který je schopný inhibovat syntézu γ-interferonu. Vynález se rovněž týká expresního vektoru pro syntézu proteinu BCRF1 a farmaceutického přípravku jej obsahujícího. Jedná se o prostředky pro léčení onemocnění, která souvisejí s přílišnou produkcí interferonu (IFN-γ) a zvlášť o prostředky, u nichž se pro snížení hladiny IFN-γ používají proteiny BCRF1 viru Epstein-Barr.

Dosavadní stav techniky

Imunní systém obsahuje vysoce interaktivní komplex tkání, buněčných materiálů a rozpustných faktorů. Nedávno bylo navrženo, že některá onemocnění a poruchy imunity mohou mít souvislost s nerovnováhami mezi jistými složkami imunitního systému, zvláště cytokinů: např. Mosmann a spol.: Ann. Rev. Immunol. 7, 145 až 173 (1989), Cher a spol.: J. Immunol. 138. 3688 až 3694 (1987), Mosmann a spol.: Immunol. Today 8, 223 až 227 (1987) a Heinzel a spol.: J. Exp. Med. 169, 59 až 72 (1989).

Mnoho důvodů ukazuje například na to, že nadměrná produkce gama-interferonu (IFN-γ) je zodpovědné za autoimunní onemocnění, která souvisejí s komplexem histokopatibility (MHC): Hooks a spol.: New England J. Med. 301, 5 až 8 (1979) (zvýšení hladiny IFN-γ v séru, uvedené do souvislosti s autoimunitou), Basham a spol.: J. Immunol. 130, 1492 až 1494 (1983) (IFN-γ) může zvýšit expresi genového produktu MHC), Battaso a spol.: Lancet 1115 až 1119 (11. 12. 1983) (změněná exprese MHC genového produktu, korelovaná s některými formami autoimunity), Hooks a spol.: Ann. N.Y. Acad. Sci. 301, 21 až 32 (1980) (vyšší hladiny IFN-γ, korelované k prudším chorobám u SLE pacientů a zvýšené aktivity interferonu, způsobené uvolňováním histaminu, mohou být inhibovány antiinterferonovým sérem), Jacob a spol.: J. Exp. Med. 166, 798 až 803 (1987) (zmírnění a zpoždění nástupu choroby u myších modelů systémové lupénky (lupus erythematosus) blokováním anti-IFN-γ monoklonálních protilátek) a Iwatani a spol.: J. Clin. Endocrinol. and Metabol. 63, 695 až 708 (1986) (anti-IFN-γ monoklonální protilátka eliminovala schopnost leukoglutinem stimulovaných T buněk indukovat expresi HLA-DR). Byla uvedena hypotéza, že nadbytek IFN-γ způsobuje nepatřičnou expresi MHC genových produktů, což dále způsobuje autoimunní reakce proti tkáním, jejichž buňky nepatřičně expresí poskytují MHC produkty a v souvislosti s těmito produkty poskytují autoantigeny. McDevit (Clin. Res. 34, 163 až 175 (1985).) navrhl, že snížení hladin IFN-γ u autoimunních pacientů, například podáváním antagonistů IFN-γ, by mohlo mít příznivé účinky.

Vedle shora uvedených důvodů může IFN-γ hrát roli také při alergii svojí schopností zvýšit počet a hustotu F_cs receptorů na monocytech; to bylo aplikováno při patogenezi sarkoidózy a psoriázy; předpokládá se, že zvyšuje buňkou indukovanou imunitu, což hraje hlavní roli při odmítání tkání u pacientů s transplantovanými allogeny.

Na základě shora uvedeného by dostupnost takových sloučenin, které jsou schopny snižovat hladiny IFN-γ, byla velice výhodná pro léčení onemocnění, souvisejících s nepatřičnými imunitními odpověďmi, jako jsou například některá onemocnění, způsobená parazity, alergie, imunitní poruchy, související s MHC včetně revmatické artritidy, systémové lupénky (lupus erythematosus) (SLE), myosténie (myosthenia gravis), cukrovky (diabetes mellitus) závislé na inzulínu, poruchy štítné žlázy a podobné.

- 1 CZ 283049 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je protein BCRF1 viru Epstein-Barr, schopný inhibovat syntézu γ-interferonu a definovaný sekvencí aminokyselin vzorce III

Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg 5 10 15

Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu 20 25 30

Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys 35 40 45

Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr 50 55 60

Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala (ΙΠ)

70 75

Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg 80 85 90

Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys 95 100 105

Ser Lys Ala Val Glu Gin Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin 110 115 120

Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile 125 130 135

Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg.

140 145

Výhodný je protein BCRF1 viru Epstein-Barr 1 v čisté formě. Protein BCRF1 viru Epstein-Barr podle vynálezu obsahuje dále signální peptid, který je obsažen v sekvenci aminokyselin vzorce I

Met Glu Arg Arg Leu Val Val Thr Leu Gin Cys Leu Val Leu Leu 5 10 15

Tyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe 20 25 30

Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys 35 40 45

Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys 50 55 60

Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala 65 70 75

Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin (I)

85 90

Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu 95 100 105

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His 110 115 120

Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Ile 125 130 135 ?

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala 140 145 150

Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ue Glu Ala Tyr Met 155 160 165

Thr Ile Lys Ala Arg 170

Výhodné provedení představuje protein BCRF1 viru Epstein-Barr, definovaný sekvencí aminokyselin shora uvedeného vzorce I.

Předmětem vynálezu je dále expresní vektor, deponovaný pod depozitním číslem ATCC 68193.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický přípravek pro léčení nemocí, souvisejících s nevhodnými imunitními odpověďmi, způsobovanými nadměrnými hladinami γ-interferonu. Takový přípravek obsahuje účinné množství proteinu BCRF1, který má sekvenci aminokyselin shora uvedeného vzorce III a je schopný inhibovat syntézu γ-interferonu, ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.

Farmaceuticky přípravek podle vynálezu je určen pro léčení parazitních a alergických nemocí, imunitních poruch, souvisejících sMHC, revmatické artritidy, systémové lupénky, myostenie, cukrovky závislé na inzulínu nebo poruchy štítné žlázy.

Ve vzorcích znamenají zkratky L-formy aminokyselin, při čemž tyto aminokyseliny jsou uvedeny od N-konce.

Na obrázku 1 je schematicky znázorněn savčí expresní vektor, použitelný pro produkci BCRF1.

Obrázek 2 představuje schematické znázornění bakteriálního expresního vektoru, použitelného pro produkci BCRF1.

Tento vynález se týká prostředků pro léčení onemocnění, která mají souvislost s přílišnou produkcí IFN-γ. Tento vynález je zčásti založen na objevu, že sekvence nukleové kyseliny, kódující nedávno objevený protein, označený jako faktor inhibice syntézy cytokinu (CSIF), je ve vysokém stupni homologní s otevřenou čtecí oblastí EBV BCRF1. EBV je lidský herpesvirus endemický ve všech lidských populacích. Tento virus souvisí s některými onemocněními: např. Dillner a spol.: Adv. Cancer Res. 50, 95 až 158 (1988), Thorley-Lawson: Biochim. Biophys. Acta 948, 263 až 286 (1988) a Tasato: Adv. Cancer Res. 49, 75 až 125 (1987). EBV má genom dvouvláknové DNA o asi 172 000 nukleotidech [Baer a spol.: Nátuře 310, 207 až 211 (1984).]. Genom obsahuje mnoho otevřených čtecích oblastí, očividně odpovídajících proteinům, které jsou produkovány EBV. Jedním z nich je BCRF1.

Tento vynález zahrnuje maturované polypeptidy nebo proteiny s otevřenou čtecí oblasti BCRF1. U sekretovaných proteinů otevřená čtecí oblast obvykle kóduje polypeptid, který sestává z maturovaného nebo sekretovaného produktu, kovalentně navázaného N-koncem k signálnímu peptidu. Signální peptid se odštěpí před sekretováním maturovaného nebo aktivního polypeptidů. Místo štěpení lze předpovědět s velkou přesností na základě empirických pravidel [například von Heijne: Nucleic Acids Research 14, 4683 až 4690 (1986).]. Nezdá se, že by přesné aminokyselinové složení signálního peptidu bylo rozhodující pro jeho funkci [například Randall a spol.: Science 243. 1156 až 1159 (1989), Kaiser a spol.: Science 235, 315 až 317 (1987).]. Maturované proteiny se snadno získávají expresí vektory, kódujícími signální peptidy zcela odlišné od těch, které jsou kódovány otevřenou čtecí oblastí obecného vzorce I.

- j CZ 283049 B6

Pro produkci proteinů podle tohoto vynálezu lze použít rozmanité expresní systémy (tj. kombinace hostitel-expresní vektor). Mezi možné typy hostitelských buněk patří (ale nejsou na ně omezeny) bakteriální, kvasinkové, hmyzí, savčí a podobné buňky. Existuje mnoho přehledných článků, které mají sloužit jako příručka při výběru a/nebo modifikacích specifických expresních systémů, např. (aby byly jmenovány některé) de Boer a Shephard: Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli, str. 205 až 247 v Kroon (red.) Genes: Structure and Expression (John Wiley and Sons, New York 1983), přehledné články několika E.coli expresních systémů: Kucherlapati a spol.: Critical Reviews in Biochemistry 16, (4), 349 až 379 (1984) aBanerji a spol.: Genetic Engineering 5, 19 až 31 (1983), kteří podávají přehled způsobů transfekce a transformace savčích buněk, Reznikoff a Gold (red.) Maximizing Gene Expression (Butterworth, Boston, 1986.), kde je podán přehled vybraných metod při expresi genu v buňkách E. coli, kvasinek a savců, a Thilly: Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston 1986.), který podává přehled savčích expresních vektorů. Existuje mnoho přehledných článků, které popisují techniky a podmínky pro navázání a/nebo manipulaci specifických cDNA-as a expresních kontrolních sekvencí pro vytvoření a/nebo modifikaci expresních vektorů, vhodných pro použití podle tohoto vynálezu, např. Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1989).

Expresní systém E. coli byl popsán Riggsem v USA patentu 4 431 739, který je zde zahrnut jako citace. Zvláště užitečnými eukaryotickými promotory pro vysokou expresi v E. coli jsou promotor tac, popsaný Boerem v USA patentu 4 551 433, který je zde zahrnut jako citace, a promotor p_L, popsaný Remautem a spol.: Gene Γ5, 81 až 93 (1981), který je zde zahrnut jako citace. Pro hostitele E. coli jsou dostupné také sekreční expresní vektory. Zvláště užitečné jsou vektory pIN-IIIompA, popsané Ghrayebem a spol. v EMBO J. 3, 2437 až 2442 (1984), v němž je cDNA, která má byt transkribována, napojena na část genu OmpA E. coli, kódujícího signální peptid proteinu ompA, který způsobuje vylučování maturovaného proteinu do periplazmového prostoru bakterie. USA patenty 4 336 336, 4 411 994, 4 332 892 a 4 338 397 popisují také sekreční expresní vektory pro prokaryoty. Také tyto odkazy jsou zde zahrnuty jako citace. Mezi četné kmeny bakterií, které jsou vhodnými hostiteli prokaryotických expresních vektorů, patří kmeny E. coli, jako je například W3110 (ATCC č. 27 325). JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC č. 31244), X2282, RR1 (ATCC č. 31343) MRCI, kmeny Bacillus subtilis nebo Serratia marcescens a různé druhy Pseudomonas. Obecné způsoby odvozování bakteriálních kmenů, jako je například E. coli K 12 XI776, užitečných pro expresi eukaryotických-proteinů, jsou popsány Curtisem III v USA patentu 4 190 495. Tento patent je zde také zahrnut jako citace. Vedle prokaryotických a eukaiyotických mikroorganismů se mohou pro produkci proteinů podle tohoto vynálezu používat také expresní vektory, které obsahují buňky, odvozené od vícebuněčných organismů. Zvláště zajímavé jsou savčí expresní systémy, protože vzhledem k jejich potranslačnímu opracování je pravděpodobnější, že budou produkovat biologicky aktivní savčí proteiny.

Jako vektory pro savčí hostitele bylo použito několik DNA nádorových virů. Zvláště důležité jsou četné vektory, které obsahují regulační sekvence replikace, transkripce a/nebo translace SV40, napojené na regulační sekvence bakteriální replikace, např. vektory pcD, vyvinuté Okayamou a Bergem (popsané v Mol. Cell Biol. 2, str. 161 až 170 (1982) a Mol. Cell Biol. 3, 280 až 290 (1983).) a vylepšené Tokebem a spol. (Mol. Cell Biol. 8, 466 až 472 (1988).). Také tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkazy. Mezi další na SV40 založené savčí expresní vektory patří takové, které obsahují regulační prvky adenoviru (popsané Kaufamnem a Sharpem: Mol. Cell Biol. 2, 1304 až 1319 (1982) a Clarkem a spol.: USA patent 4 673 285); obě tyto citace jsou zde uvedeny jako odkazy. Výhodnými hostiteli shora uvedených vektorů jsou buňky opic. Takové vektory, obsahující sekvence počátku replikace SV40 a neporušený gen A, se mohou samostatně replikovat v buňkách opic (poskytují větší počet kopií a/nebo stabilnější počet kopií než samostatně se replikující plazmidy). Navíc vektory, obsahující sekvence počátku replikace SV40 bez neporušeného genu A, mohou samostatně replikovat v buňkách opic COS7 ve

-4CZ 283049 B6 vysokém poctu kopií (ale nikoliv stabilně), které popsal Gluzman: Cell 23, 175 až 182 (1981) a které jsou dostupné zATCC (pod č. CRL 1651). Shora uvedené vektory, založené na SV40, jsou schopny transformovat také jiné savčí buňky, jako jsou například myší L buňky, integrací do buněčné DNA hostitele.

Biologická aktivita BCRF1 podle tohoto vynálezu se snadno stanovuje testem inhíbice IFN-γ. Takové testy vyžadují takovou populaci buněčných linií nebo buněk, které syntetizují IFN-γ. Periferní krevní lymfocyty (PBLs), které byly stimulovány mitogenem, jako je například fytohemaglutinin (PHA), mohou sloužit jako taková buněčná populace. Test se provádí přibližně následujícím způsobem: PHA-stimulované PBLs se rozdělí na dvě stejné části. K jedné části se přidá vzorek, obsahující BCRF1. Druhá část slouží jako kontrola. Po několika dnech se supematanty obou kultur testují na IFN-γ. To se s výhodou provádí standardním testem ELIS A s komerčně dostupnými monoklonálními a polyklonálními protilátkami na IFN-γ, např. Genzyme, lne. (Boston, Ma.). Z testu se dá zjistit množství IFN-γ transkribované m-RNA, například měřením RNA-blotů, PCR nebo podobným způsobem. PBLs se získávají standardními technikami, například podle Mishella a spol. (red.): Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, New York 1980.).

Jestliže dochází k expresi polypeptidů podle tohoto vynálezu v rozpustné formě, například jako sekretovaný produkt transformovaných kvasinkových nebo savčích buněk, mohou se vyčistit standardními postupy, známými odborníkům, například vysrážením síranem amonným, chromatografií na iontoměniči, gelovou filtrací, elektroforézou, afinitní chromatografií a/nebo podobnými: návody takových čisticích postupů jsou uvedeny například v: Enzyme Purification and Related Techniques v Methods in Enzymology 22, 233 až 577 (1977) nebo Scopesem Protein Purification Principles and Practise (Springer-Verlag, New York 1982.). Jestliže dochází k expresi polypeptidů podle vynálezu v nerozpustné formě, například jako agregáty, inkluzní tělesa a podobné, mohou se vyčistit standardními způsoby, známými odborníkům, včetně dělení inkluzních těles od rozbitých hostitelských buněk odstřeďováním, uvedením inkluzního tělesa do roztoku působením chaotropních činidel a redukčních činidel, zředěním solubilizované směsi a snížením koncentrace chaotropního činidla a redukčního činidla natolik, že poskytuje biologicky aktivní konformaci polypeptidů. Tyto poslední postupy jsou popsány v následujících citacích, které jsou zde zahrnuty jako odkazy: Winkler a spol.: Biochemistry 25, 4041 až 4045 (1986), Winkler a spol.: Biotechnology 3, 992 až 988 (1985), Koths a spol.: USA patent 4 569 790 a Evropská patentová přihláška č. 86306917.5 a Evropská patentová přihláška č. 86306353.3.

Pojem efektivní množství, jak je zde používán, znamená množství, které je dostatečné pro zlepšení příznaků choroby, vyvolané přílišným IFN-γ. Efektivní množství se u jednotlivých pacientů mohou měnit v závislosti na takových faktorech, jako je stav onemocněni, které má být léčeno, celkový zdravotní stav pacienta, způsob podávání, vedlejší účinky a podobně. Obvykle se BCRF1 podává jako farmaceutický prostředek, obsahující efektivní množství BCRF1 a farmaceutický nosič nebo excipient. Farmaceutickým nosičem může být jakákoliv slučitelná, netoxická látka, která je vhodná pro podávání prostředků podle vynálezu pacientovi. Prostředky, použitelné pro parenterální podávání takových léčiv, jsou obecně velmi dobře známy, například Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1980. Prostředky podle tohoto vynálezu se mohou do těla pacienta zavádět také jako implantovatelné léčivo (například Urquhart a spol.: Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24, 199 až 236 (1984), Lewis (red.) Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (plenům Press, New York 1981.), USA patent č. 3 773 919, USA patent 3 270 960 a podobné.

Jestliže se podává parenterálně, pak se BCRF1 formuluje jako jednodávková injektovatelná forma (například roztok, suspenze nebo emulze) společně s farmaceutickým nosičem. Takové nosiče jsou přirozeně netoxické a neterapeutické. Příklady takových nosičů jsou normální solný

- 5 CZ 283049 B6 roztok, Ringerův roztok, dextrózový roztok a Hankův roztok. Mohou se používat také nevodné nosiče, jako jsou například vázané oleje a oleát ethylnatý. Výhodným nosičem je 5% dextróza v solném roztoku. Nosič může obsahovat menší množství aditiv (přísad), jako jsou například látky, které zvyšují isotoničnost a chemickou stabilitu, např. pufry a ochranná činidla. BCRF1 se s výhodou formuje v čisté formě v podstatě bez agregátů a dalších proteinů v koncentraci v rozmezí asi 5 až 20 pg/ml. BCRF1 se s výhodou podává kontinuálně infuzí tak, ze se dodává v množství od asi 50 do 800 mikrogramů denně (tj. asi 1 až 16 mikrogramů na kg a den). Denní infuzní dávka se může měnit. Závisí na sledování vedlejších účinků, počtu krevních buněk a podobných faktorech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese BCRF1 v buňkách COS7 opic

Gen, kódující otevřenou čtecí oblast BCRF1, byl amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí s použitím primerů, které umožňují pozdější inzerci amplifikovaného fragmentu do vektoru pcD(SRa), rozštěpeného působením EcoRI (obrázek 1).

Kódující vlákno vloženého fragmentu je ukázáno níže (otevřená Čtecí oblast je dána velkými písmeny):

aattc ATG GAG CGA AGG TTA GTG GTC ACT CTG CAG TGC CTG GTG CTG 47

CTT TAC CTG GCA CCT GAG TGT GGA GGT ACA GAC CAA TGT GAC AAT 92

TTT CCC CAG ACC TAA GAG ATG CCT TCA GTC GTG TTA AAA CCT TTT 137

TCC AGA CAA AGG ACG AGG TAG ATA ACC TTT TGC TCA AGG AGT CTC 182

TGC TAG AGG ACT TTA AGG ATG CCA GGC CCT GTC AGA AAT GAT CCA 227

ATT CTA CCT GGA GGA AGT CAT GCC ACA GGC TGA AAC CAG GAC CCT 272

GAA GCC AAA GAC CAT GTC AAT TCT TTG GGT GAA AAT CTA AAG ACC 317

CTA CGG CTC CGC CTG CGC AGG TGC CAC AGG TTC CTG CCG TGT GAG 362

AAC AAG AGT AAA GCT GTG GAA CAG ATA AAA AAT GCC TTT AAC AAG 407

CTG CAG GAA AAA GGA ATT TAC AAA GCC ATG AGT GAA TTT GAC ATT 452

TTT ATT AAC TAC ATA GAA GCA TAC ATG ACA ATT AAA GCC AGG TGA g 498

Klony, nesoucí inzert o příslušné orientaci, byly identifikovány expresí BCRF1 a/nebo elektroforézou restrikčních štěpů. Jeden takový vektor, nesoucí gen BCRF1, byl označen pBCRFl(SRa) a byl uložen v ATCC pod číslem 68 193. Plazmid pBCRFl(SRa) byl

-6CZ 283049 B6 amplifikován v E. coli MCI061, izolován standardními technikami a použit pro transfekci buněk COS 7 opice následujícím způsobem: Jeden den před transfekci bylo přibližně 1,5.10⁶ buněk COS 7 opice vyseto na jednotlivé lOOmm desky v Eagleho médiu, modifikovaném podle Dulbecca (DME), které obsahovalo 5 % plodového telecího séra (FCS) a 2 mM glutaminu. Transfekce se provádí tak, že buňky COS 7 byly z misek odebrány inkubací s trypsinem, promyty dvakrát v DME bez séra a suspendovány v DME bez séra na hustotu 10⁷ buněk/ml. Podíl (0,75 ml) se smíchá s 20 pg DNA a přenese se do sterilní 0,4cm elektroporační kyvety. Po 10 minutách se buňky v jednotce BioRad Gene Pulser vystaví pulzům při 200 Voltech a 960 pF. Po dalších 10 minutách se buňky odeberou zkyvet, přidají se ke 20 ml DME, které obsahuje 5 % FCS, 2 mM glutaminu, penicilín, streptomycin a gentamycin. Směs byla rozdělena na čtyři podíly na čtyři lOOmm misky pro kultivaci tkání. Po 12 až 24 hodinách při 37 °C a 5 % CO₂ se médium nahradí podobným mediem, které obsahuje pouze 1 % FCS. V inkubaci se pokračuje dalších 72 hodin při 37 °C a 5 % CO₂. Potom se médium odebere a analyzuje se na schopnost inhibovat syntézu IFN-γ.

ml podíly čerstvě izolovaných PBL (asi 2.10⁶ buněk/ml) se inkubují při 37 °C s PHA (100 ng/ml) v médiu, které sestává z i) 90% DME, doplněného 5 % FCS a 2 mM glutaminu a ii) 10 % supematantu z buněk COS 7 předem transfektovaných pBCRFl(SRa). Po 24 hodinách se buňky asupematanty izolují a analyzují na přítomnost buď IFN-γ mRNA nebo proteinu IFN-γ. Kontroly byly zpracovány stejným způsobem vyjma toho, že 10 % supematantu pocházelo z kultury COS 7 předem transfektované plazmidem, nesoucím nepříbuzný cDNA inzert. Vzorky, které byly zpracovány sBCRFl, vykazovaly asi 50% inhibicí syntézy IFN-γ vzhledem ke kontrole.

Příklad 2

Exprese BCRF1 v Escherichia coli

Expresí v E.coli může být získán gen, kódující maturovaný BCRF 1, jehož sekvence je uvedena níže:

Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg 5 10 15

Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu 20 25 30

Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys 35 40 45

Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr 50 55 60

Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala 65 70 75

Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg 80 85 90

Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys 95 100 105

Ser Lys Ala Val Glu Gin Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin 110 115 120

Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile 125 130 135

Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg.

140 145

-7CZ 283049 B6 cDNA inzert plazmidu pBCRFl(SRa) se reklonuje do plazmidu Ml3, v němž se dvakrát změní místně-řízenou mutagenezí: Nejdříve se vytvoří místo Clal na 5'-konci kódující oblasti maturovaného polypeptidů BCRF1, a potom se vytvoří místo BamHI na 3'-konci kódující oblasti maturovaného polypeptidů BCRF1.

Mutované sekvence se pak snadno vloží do níže popsaného expresního vektoru TRPCÍ 1.

Vektor TRPCÍ 1 se zkonstruuje ligací syntetického souhlasného fragmentu RBS s linkery Clal (ATGCAT) a klonováním výsledných fragmentů vpMTllhc rozštěpením působením Clal (pMTllhc byl předem upraven tak, aby obsahoval místo Clal). pMTllhc je malý (2300 nukleotidů) AMP¹¹ TET^S derivát pBR322 o vysokém počtu kopií, který nese plazmid 7tVX polylinkerové oblasti EcoRI-HindlII (jiVX je popsán Maniatisem a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.). Tento derivát byl modifikován tak, aby obsahoval místo Clal: pMTllhc se rozštěpí působením EcoRI a BamHI, 5'-přečnívající konce se doplní a ligují linkerem Clal (CATCGATG), čímž se restaurují místa EcoRI a BAmHI a místo Smál se nahradí místem Clal. Jeden transformant z konstrukce TRPCÍ 1 měl tandemovou sekvenci RBS lemovanou místy Clal. Jedno z míst Clal a část druhé kopie sekvence RBS se odstraní rozštěpením tohoto plazmidu působením Pstl, zreagováním s nukleázou Bal31, rozštěpením působením EcoRI a zreagováním s T4 DNA polymerázou za přítomnosti všech čtyř deoxynukleotid-trifosfátů. Výsledné fragmenty se 30 až 40 páry nukleotidů byly izolovány na PAGE a klonovány do pUC12 rozštěpeného působením Smál. Fragment E. coli trp P-nesoucí EcoRI o 248 párech nukleotidů, odvozený od pKCIOl (popsaný Nicholsem a spol. v Methods in Enzymology 101, 155 (Academie Press, New York 1983.).) byl pak klonován do místa EcoRI. Tím se získala konstrukce TRPCÍ 1, která je ilustrována na obrázku 2. TRPCÍ 1 se používá jako vektor pro BCRF1 nejdříve rozštěpením působením Clal a BamHI, vyčištěním a potom smícháním se standardním ligačním roztokem s Clal-BamHI fragmentem M13, obsahujícím nukleotidovou sekvenci, kódující maturovaný BCRF1. TRPCÍ 1 obsahující inzert, označovaný jako TRPCÍ 1-BCRF1, se množí v E. coli K.12 kmen JM101, například dostupném z ATCC pod číslem 33 876.

Autoři uložili E, coli MCI061, nesoucí pBCRFl(SRa), v American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC) pod číslem 68 193. K tomuto uložení došlo 20. prosince 1989 za podmínek dohody ATCC o ukládání kultur pro patentové účely (ATCC’s Agreement for Culture Deposit for Patent Purposes), která zajišťuje, že uložená kultura bude dostupná USA úřadu pro patenty a obchodní značky (US Commisioner of Patents and Trademarks) (podle 35 USC 122 a 37 CFR 1.14) a bude dostupná veřejnosti po vydání USA patentu. To vyžaduje, aby uložená kultura byla uchovávána; dostupnost uloženého kmenu však neznamená licenci k praktickému využívání vynálezu při porušování práv, garantovaných úřadem jakékoliv vlády v souladu s patentovými zákony.

Dohoda o uložení byla modifikována tak, aby odpovídala požadavkům Budapešťské dohody o ukládání mikroorganismů (Budapest Treaty on the deposit of Microorganisms.

Popis předcházejících uspořádání tohoto vynálezu byl uveden jako ilustrace a popis tohoto vynálezu. Není zamýšlen jako vyčerpávající nebo omezující vynález na přesné formy. Na základě toho, co zde bylo uvedeno, je zřejmé, že existuje mnoho modifikací a variací. Tato uspořádání byla vybrána tak, aby nejlépe vysvětlila principy vynálezu a tím umožnila zručným odborníkům nejlépe využít vynález v různých uspořádáních a s různými úpravami, které jsou vhodné pro to které zamýšlené použití. Rozsah tohoto vynálezu je definován připojenými body patentových nároků.

Claims

1. Protein BCRF1 viru Epstein-Barr, schopný inhibovat syntézu-interferonu a definovaný sekvencí aminokyselin vzorce III

Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg 5 10 15

Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu 20 25 30

Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys 35 40 45

Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr 50 55 60

Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala (III)

65 70 75

Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg 80 85 90

Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys 95 100 105

Ser Lys Ala Val Glu Gin Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin 110 115 120

Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile 125 130 135

Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg.

140 145

2. Protein BCRF1 viru Epstein-Barr podle nároku 1 v čisté formě.

3. Protein BCRF1 viru Epstein-Barr podle nároku 2, obsahující dále signální peptid.

4. Protein BCRF1 viru Epstein-Barr podle nároku 3, v němž signální peptid je obsažen v sekvenci aminokyselin vzorce I

Met Glu Arg Arg Leu Val Val Thr Leu Gin Cys Leu Val Leu Leu 5 10 15

Tyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe 20 25 30

Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys 35 40 45

Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys 50 55 60

Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala 65 70 75

Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin (I)

80 85 90

-9CZ 283049 B6

Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu 95 100 105

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His 110 115 120

Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Ile 125 130 135

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala 140 145 150

Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met 155 160 165

Thr Ile Lys Ala Arg 170

5. Protein BCRF1 viru Epstein-Barr podle nároku 4, definovaný sekvencí aminokyselin shora uvedeného vzorce I.

6. Expresní vektor, deponovaný pod depozitním číslem ATCC 68193.

7. Farmaceutický přípravek pro léčení nemocí, souvisejících s nevhodnými imunitními odpověďmi, způsobovanými nadměrnými hladinami γ-interferonu, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství proteinu BCRF1, který má sekvenci aminokyselin shora uvedeného vzorce III a je schopný inhibovat syntézu γ-interferonu, ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.

8. Farmaceutický přípravek podle nároku 7 pro léčení parazitních nemocí.

9. Farmaceutický přípravek podle nároku 7 pro léčení alergických nemocí.

10. Farmaceutický přípravek podle nároku 7 pro léčení imunitních poruch, souvisejících sMHC.

11. Farmaceutický přípravek podle nároku 9 pro léčení revmatické artritidy, systémové lupénky, myostenie, cukrovky závislé na inzulínu, nebo poruchy štítné žlázy.