CN1127529A

CN1127529A - 人白细胞介素-10的激动剂和拮抗剂

Info

Publication number: CN1127529A
Application number: CN94192880A
Authority: CN
Inventors: C·-C·周; X·-Y·蔡
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1996-07-24
Also published as: AU681178B2; SG43798A1; IL110413A0; HUT73463A; WO1995003411A1; ZA945434B; CZ23396A3; CA2168110A1; NO960309L; FI960353A0; NO960309D0; SK8396A3; PL312718A1; AU7399694A; FI960353A; JPH08507930A; NZ269663A; EP0711346A1; HU9503983D0; SK150596A3

Abstract

本发明提供了人IL-10的激动剂和拮抗剂，这些激动剂和拮抗剂是以成熟人IL-10末端的修饰为基础的。还提供了供给或抑制人IL-10生物活性的组合物和方法。这些组合物可用于治疗以Th反应不当为特征的疾病。还提供了编码这些激动剂和拮抗剂的核酸、含有这些核酸的重组载体和转化宿主细胞，以及利用转化的宿主细胞制备激动剂和拮抗剂的方法。

Description

人白细胞介素-10的激动剂和拮抗剂

发明背景

本发明涉及人白细胞介素-10的激动剂和拮抗剂、其组合物及其制备和使用方法。这些激动剂和拮抗剂是通过在成熟人白细胞介素-10的羧基末端和/或氨基末端引入氨基酸置换或缺失而得到的。

白细胞介素10(IL-10)是能够介导许多作用或效应的细胞素。从小鼠和人细胞中都已分离出IL-10。IL-10参与控制不同类别或亚组的CD4⁺T辅助(Th)细胞的免疫反应。这些Th细胞可分为以其细胞素生产形式来区别的不同亚组。其中的两个亚组称为Th1和Th2细胞。

Th1细胞克隆产生白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)，而Th2细胞克隆则通常在受到抗原或促有丝***的外源凝集素活化后分泌IL-10、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-5(IL-5)。这两种类别的Th细胞克隆还都产生诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-3(IL-3)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞素。第三类Th细胞(Th0)同时产生IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、TNF-α、IL-3和GM-CSF。

Th1和Th2细胞的不同细胞素生产形式部分反映了它们在对各种病原的反应中的作用。例如，Th1细胞参与对各种组胞内病原体作出成功的细胞介导的反应。这些细胞也参与迟发型超敏反应。Th2细胞则与体液反应相联系，而体液反应的特征是抗体的产生。在多数情况下，免疫***产生的Th反应能最有效地清除特定抗原或病原体，但并不总是这样。

例如，利什曼病的特征就是Th1反应有缺陷。这一缺陷可以用体外测定法加以证实，如Clerici等人所述的测定法(J.Clin.Invest.84：1892，1989)。通过使用这样一种体外测定洗证实了Th1反应缺陷与内源性IL-10水平有关，因为在体外测定中，Th1功能可通过加入中和性抗IL-10抗体而得到恢复。

由于利什曼病和其他疾病的特征是Th反应缺陷，而Th反应又与内源性IL-10作用不当有关，所以需要IL-10的激动剂和拮抗剂来治疗这些疾病。

发明概述

本发明通过提供一些组合物和方法而满足了上述需要，这些组合物和方法提供或抑制人IL-10的生物活性。

更具体地说，本发明提供了人IL-10的拮抗剂，该拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

三个上述实施方案的氨基酸顺序由顺序表中的1、2和3号顺序限定。

本发明进一步提供编码一种人IL-10拮抗剂的核酸，该拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。本发明还提供含有所述核酸的重组载体和含有所述重组载体的宿主细胞。

本发明还提供制备一种人IL-10拮抗剂的方法，该拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10，所述方法包括：在表达编码所述拮抗剂的核酸的条件下，培养一种上述的宿主细胞。

本发明进一步提供抑制IL-10生物活性的方法，该方法包括：使带有IL-10受体的细胞与有效量的人IL-10拮抗剂接触，所述拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

本发明进一步提供人IL-10的激动剂，该激动剂包含由于缺失1-11个氨基末端氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

本发明还提供编码所述激动剂的核酸、含有所述核酸的重组载体和转化宿主细胞、制备所述拮抗剂的方法、以及含有一种或更多种IL-10激动剂或拮抗剂及一种可药用载体的药物组合物。

发明详述

本文所引用的所有参考文献都全文引入本文作为参考。

本发明的拮抗剂可用于治疗疾病，例如以与内源性IL-10有关的Th1反应缺陷为特征的利什曼病。这些拮抗剂还可用于治疗与IL-10介导的免疫抑制或IL-10过度产生有关的疾病如B细胞淋巴瘤。此外，这些拮抗剂可用于旨在阐明IL-10作用机理的研究及药物的合理设计，因为它们显示出与效应物功能相分离的强受体结合作用。当固定在固相载体上时，这些拮抗剂可用于亲和纯化已缺失了跨膜区的易溶形式的IL-10受体。

EB病毒(EBV)病毒IL-10蛋白(BCRFI或vIL-10)也具有IL-10的生物活性，据推测它能与IL-10受体结合。据推测，就在宿主内感染、复制和/或保持的能力而言，EBV所表达的vIL-10活性使该病毒获得某种存活能力上的优势。vIL-10负向调节T细胞和NK细胞IFN-γ生成的能力，以及其B细胞存活力增强效应，提示vIL-10能够抑制抗病毒免疫，同时增强EBV转化人B细胞的潜能。

所以，本发明的IL-10拮抗剂还可用于有效增强针对EBV(有可能还有其他病毒)的抗病毒免疫。有关IL-10拮抗剂潜在用途的更详细的叙述见Howard等(J.Clin.Immuno1.12：239，1992)。

后面的实施例公开了本发明突变IL-10拮抗剂的***性实施方案。在其中一个实施方案中，成熟人IL-10顺序157位的赖氨酸残基被谷氨酸残基置换(1号顺序)。在另一个实施方案中，人IL-10的羧基末端缺失了三个(2号顺序)或四个(3号顺序)氨基酸残基。这些拮抗剂以下分别称为K157E、CΔ3和CΔ4拮抗剂。

本文所用的术语“成熟人IL-10”定义为一种缺少先导顺序的蛋白质，该蛋白(a)具有与4号顺序所定义的顺序基本相同的氨基酸顺序；(b)具有与天然IL-10相同的生物活性。该术语包括具有一个或更多个保守氨基酸置换(Grantham，Science185：862，1974)但基本不影响生物活性的天然等位变异体和其他变异体。这些保守置换涉及若干组同义氨基酸，例如如Lee等人的美国专利5,017,691所述。

应该理解，虽然上述实施方案是目前优选的，但也可对人IL-10的羧基末端进行其他修饰以产生其他拮抗剂。例如，可以用天冬氨酸残基代替谷氨酸残基来置换157位的赖氨酸残基，从而产生有效的拮抗剂。所以，本文所用的术语“酸性氨基酸残基”定义为既包括天冬氨酸残基，也包括谷氨酸残基。

缺失的程度也可以更大或更小。可以缺失包括约12个羧基端残基在内的一个或更多个氨基酸残基。优选缺失约8个末端残基，更为优选的是缺失3个或4个末端残基。

现已意外地发现，也可以从成熟人IL-10的氨基端缺失至多11个氨基酸残基。据下述的MC/9肥大细胞刺激测定法中所测定，这些可能具有与IL-10本身不同的药物动力学性质的截短变异体，具有成熟人IL-10的生物活性。所以，这些变异体可用于治疗对用IL-10本身治疗敏感的任何指征，也可用于前面对本发明的拮抗剂所述的一些目的，如亲和纯化。

因为这些变异体具有人IL-10的生物活性但其氨基酸顺序已缩短，本文也将其称为“人IL-10激动剂”。

但是，据认为12位的半胱氨酸残基对生物活性是必需的。事实上，包括该半胱氨酸残基在内的头12个残基的缺失产生一个无生物活性的变异体。所以，氨基端的缺失限于头11个残基中的一个或更多个残基的缺失。

这种氨基端缺失可以与上述羧基端修饰组合起来，产生具有下述特征但可能具有不同药物动力学性质的拮抗剂。这些拮抗剂也是本发明的一部分。

编码IL-10激动剂和拮抗剂的核酸也是本发明的一部分。当然，本领域技术人员会清楚地意识到，由于遗传密码具有简并性，有许多不同的核酸都能编码每个激动剂和拮抗剂。所用的特定密码子可加以选择以便于进行构建并在原核或真核***中实现最佳表达。

优选的是，如Daugherty等人所述(Nucleic Acids Res.19：2471，1991)修饰编码人IL-10的cDNA，用聚合酶链反应法(PCR)(Saiki等人，Science 239：487，1988)制备编码激动剂和拮抗剂的核酸。这种cDNA是本领域公知的，可以用标准方法来制备，例如如国际专利申请公开WO91/00349所述。包含编码人IL-10顺序的克隆也已保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Maryland)，保藏号为68191和68192。

另外，也可以用公知的定位诱变技术修饰DNA。参见例如Gillman等人，Gene 8：81，1979；Roberts等人，Nature 328：731，1987；或Innis(Ed.)，1990，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplicationS，Academic Press，New YorK，NY。

本发明的核酸也可以化学合成，例如用Matteucci等人的亚磷酰胺(phosphoramidite)固相载体法(J.Am.Chem.Soc.103：3185，1981)、Yoo等人的方法(J.Boil.Chem.764：17078，1989)或其他公知的方法。

含有上述核酸的重组载体、用该载体转化的宿主细胞、以及制备激动剂和拮抗剂的方法，也是本发明的一部分。

如果DNA和载体的末端都含有相容性的限制位点，则很容易将编码激动剂和拮抗剂之一的DNA***许多已知的表达载体之一。如果不能这样做，则必须对DNA和/或载体的末端进行修饰，即，重新消化由限制性核酸内切酶切割产生的单链DNA悬垂部分，产生平末端，或者通过用适当的DNA聚合酶填平单链末端而达到同样的效果。

另外，可以通过将核苷酸顺序(接头)连接到末端上而产生任何需要的位点。这些接头可以包含限定所需限制位点的特异寡核苷酸顺序。如果需要，还可以用加均聚物尾的方法或PCR法对切割后的载体和DNA片段进行修饰。

本发明拮抗剂的特征是具有与人IL-10本身相似的人IL-10受体结合亲和性，但基本上不具有生物活性。优选的是，这些拮抗剂以标准测定法测定的生物活性不到人IL-10的约10％，更为优选的是不到约1％。

在带有IL-10受体的细胞中，这些拮抗剂一般至少达到约25％的IL-10生物活性抑制。抑制程度优选至少约50％，更为优选的是至少约75％。实际抑制程度会随着所测的特定生物活性而变化。

激动剂和拮抗剂也可以用适宜的方法化学合成，例如用排除固相合成法、部分固相法、片段缩合法或经典溶液合成法。化学合成的多肽优选用固相肽合成法制备，例如如Merrifield(J.Am.Chem.Soc.85：2149，1963；Science 232：341，1986)和Atherton等人(Solid Phase PeptideSynthesis：A Practical Approach，1989，IRL Press，Oxford)所述。

激动剂和拮抗剂无论是怎样制备的，都可以进行纯化，例如用HPLC法、凝胶过滤法、离子交换和分配色谱法、逆流分布法和/或其他公知方法。

使一种或更多种IL-10激动剂或拮抗剂或其可药用盐与生理上可接受的载体混合，可制得药物组合物。

可用的药物载体可以是适于给患者施用本发明组合物的任何相容性无毒物质。载体中可含有无菌水、醇、脂肪、蜡和惰性固体。药物组合物中还可掺入可药用的助剂(缓冲剂、分散剂)。一般来说，用于肠胃外施用这类药物的组合物是公知的(例如Remington’sPharmaceutical Science，18th Ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)。经常优选单剂量包装，例如无菌形式的单剂量包装。

激动剂和拮抗剂优选肠胃外给药，即腹膜内、静脉内、皮下或肌内注射或输注，或任何可接受的其他全身性方法。此外，也可以用可植入的或可注射的药物释放***施用拮抗剂(参见例如Urquhart等人，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24：199，1984；lewis，Ed.，ControlledRelease of Pesticides and Pharmaceuticals，l981，Plenum Press，New York，New YorK；美国专利3,773,919和3,270,960)。也可以用能保护拮抗剂不受胃肠蛋白酶作用的公知制剂进行口服。另请参阅Langer，Science249：1527，1990。

激动剂和抗拮剂还可以用标准的基因治疗技术来施用，包括在组织内直接注射核酸、使用重组病毒载体或脂质体、以及植入转染细胞(参见例如Rosenberg，J.Clin.Oncol.10：180，1992)。

激动剂和拮抗剂可以单独施用，也可以与一种或更多种常用于治疗以Th反应缺陷为特征的病症的其他药剂配伍施用。例如，诸如白细胞介素-12(IL-12)或γ-干扰素(IFN-γ)等药物可与拮抗剂共同施用。如果用激动剂来代替IL-10治疗或预防胰岛素依赖性糖尿病，则可与胰岛素、环孢菌素、强的松或硫唑嘌呤共同施用(见共同未决的美国申请07/955,523，1992年10月1日提交)。

一种或更多种其他药剂的这种共同施用可以与激动剂或拮抗剂的施用共同(一起)或依次(在其之前或之后)进行。所施用的所有药剂均应以足以产生治疗效果的水平存在于患者体内。一般来说，如果第二种药剂是大约在第一种药剂的半寿期内施用的，则这二种药剂被认为是共同施用的。

对特定病情而言，激动剂或拮抗剂的适当剂量的确定属于本领域的普通技术。一般来说，治疗以低于最佳剂量的较小剂量开始。然后逐渐提高剂量，直到达到具体情况下的最佳效果。为方便起见，需要时可把总日剂量分成若干份在一天内施用。

有效量将是能明显改进一个或更多个临床参数，并且/或者使一个或更多个已知的Th功能的反应在统计上显著改进的剂量，其中有些功能如IL-2的生产已在前面叙述。该反应可以用从患者体内采集的血细胞进行体外测定，例如如Clerici等人(同上)所述。这种体外测定可以在治疗开始前进行，从而提供一个参考基线。改进的反应可与其进行比较。

对特定患者而言，激动剂和拮抗剂及其可药用盐的实际施用量和施用频率，将按照主治医生的判断来调整，并应考虑诸如患者的年龄、身体状况和体重，以及所治疗的症状的严重程度等因素。

实施例

本发明可用下列实施例来说明。除非另外指明，以下给出的固固混合物、液液混合物和固液混合物中的百分比分别以重量/重量、体积/体积和重量/体积表示。

试剂和一般方法

限制性核酸内切酶得自Boerhringer Mannheim(Indianapolis，IN)，而DNA连接试剂盒则购自Takara Biochem.，Inc.(Berkeley，CA)。Taq聚合酶和Pfu聚合酶得自Stratagene(La Jolla，CA)。基本上如Tsujimoto等人所述(J.Biochem.106：23，1989)，用标准方法在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产重组人IL-10(hIL-10)。组织培养基、胎牛血清和谷氨酰胺购自Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)。利用Applied Biosystems380A、380B或394型DNA合成仪(Foster City，CA)用标准方法合成寡核苷酸引物。

标准重组DNA方法基本按Sambrook等人所述进行(MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)。

转染

如下进行瞬时表达。将COS细胞(ATCC CRL 1651)保持在Dulbecco改进的伊格耳氏培养基(DMEM)中，该培养基中添加有10％胎牛血清、6mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素。利用BioRad GENEPULSER^(Richmond，CA)，用电穿孔法进行转染。

通过胰蛋白酶-EDTA处理使细胞从培养皿上脱落，并将细胞悬浮于新鲜培养基中。使250μl体积中的约5×10⁶个细胞与5μg质粒DNA混合，然后进行电穿孔。电压和电容分别设定在0.2伏和960mFD。

电穿孔后，将细胞转移到10cm培养皿中，在10ml含血清的DMEM中，在5％CO₂中于37℃下培养6小时。细胞已附着在培养皿上之后，吸出培养基，换上无血清培养基。72小时后，收集条件培养基进行分析。

拮抗剂的制备

野生型人IL-10cDNA和表达载体的重建

为便于表达和操作，用以pCDSRα为基础的hIL-10载体(Vieira等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1172,1991；保藏在GenBank，保藏号为M57627的顺序)作模板，以PCR法产生hIL-10cDNA的编码区。但可能也使用了其他已知的cDNA源。

在定名为B1789CC的5’引物(5号顺序)中引入一个Kozak脊椎动物共同转译起始区(Kozak，Nucleic Acids Res.20：8125，1987)。在5’引物B1789CC和定名为A1715CC的3’引物(6号顺序)中，分别引入一个PstI位点和一个EcoRI位点。

利用上述引物，在0.5ml Eppendorf管中对hIL-10cDNA进行PCR，反应混合物体积为50μl，并有一个50μl的石蜡油上层。反应混合物一般含有26.5μl H₂O、5μl Taq(水生栖热菌)DNA聚合酶缓冲液(反应液中的终浓度是：10mM Tris-HCl，pH8.8，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.001％(W/V)明胶)、200μM dNTP、60ng模板DNA、5’引物B1789CC和3’引物A1715CC各10皮摩尔、0.5μl Taq聚合酶(2单位)。

反应在PHC-1热循环仪(Techne，Princeton，NJ)中进行30次如下循环：95℃变性2分钟；42℃退火2分钟；70℃合成1分钟。第30次循环结束后，反应混合物再于72℃下保温9分钟进行伸长反应。

在含有0.5μg/ml溴乙锭的1.2％琼脂糖Tris-乙酸盐凝胶中对PCR混合物进行电泳。从凝胶上切下具有预期大小的DNA片段，并用GENECLEAN^试剂盒(La Jolla，CA)进行纯化。从凝胶中回收后，产物DNA用PstI和EcoRI消化，通过凝胶电泳和GENECLEAN^处理进行分离，并作为PstI/EcoRI限制片段克隆到表达载体pDSRG(ATCC68233)中，然后转移到表达载体pSV.Sport(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)中。

使含有hIL-10cDNA的载体在大肠杆菌DH5α株(Gibco-BRL)中增殖，DNA顺序用DNA顺序测定法来确认。用以pSV.Sport为基础的hIL-10表达载体进行COS转染及突变hIL-10载体的构建。

再合成的hIL-10cDNA保留了独特的BglII位点和独特的BstEII位点，这两个位点都存在于野生型cDNA中。这两个内部限制位点以后用于通过盒置换产生突变hIL-10cDNA，这两个位点的相对位置图示如下：

PstI----------BgIII-----------BstEII--------------EcoRI

羧基端修饰

为产生hIL-10的C末端突变拮抗剂，用PCR法合成相应于野生型hIL-10cDNA的BstEII/EcoRI区域的突变cDNA片段，并用这些片段置换上述pSV.Sport hIL-10DNA中的相应区域。

利用与上述再合成的hIL-10cDNA顺序互补的寡核苷酸引物，并在3’端引物中预先引入指定的突变，用PCR法产生人IL-10的K157E、CΔ3和CΔ4突变拮抗剂。

用定名为B3351CC的5’引物产生三个突变拮抗剂，该引物具有7号顺序所限定的氨基酸顺序。该5’引物的顺序与包含野生型hIL-10cDNA的独特BstEII限制位点的人IL-10cDNA内部顺序互补。用于制备拮抗剂的3’引物的顺序与hIL-10编码cDNA的3’端顺序互补。这些引物及限定其顺序的顺序号如下：

突变体引物顺序号

K157E C3481CC 8

CΔ3 C3482CC 9

CΔ4 B3350CC 10

利用上述引物，在0.5ml Eppendorf管中对hIL-10cDNA进行PCR，反应混合物体积为50μl，并有一个50μl的石蜡油上层。反应混合物一般含有26.5μl H₂O、5μl Pfu DNA聚合酶缓冲液(反应液中的终浓度是：20mM Tris-HCl，pH8.2，10mM KCl，2mMMgCl₂，6mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton x-100，10μg/ml不含核酸酶的牛血清清蛋白(BSA))、200μM dNTP、40ng模板DNA、5’引物B3351CC和一种3’引物各10皮摩尔、0.5μ1 pfu聚合酶(2.5单位)。

反应在PHC-1热循环仪(Techne，Phnceton，NJ)中进行22次如下循环：94℃变性2分钟；50℃退火2分钟；72℃合成2分钟。第22次循环结束后，反应混合物再于72℃下保温7.5分钟进行伸长反应。

通过苯酚-CHCl₃提取和乙醇沉淀对PCR混合物进行处理，然后依次用BstEII和EcoRI消化。在含有0.5μg/ml溴乙锭的1％琼脂糖/Tris-乙酸盐凝胶中对限制消化产物进行电泳。从凝胶上切下预期大小的DNA片段，并通过苯酚-CHCl₃提取和乙醇沉淀进行回收。

从凝胶中回收后，用hIL-10突变体的BstEII/EcoRI限制片段置换pSV.Sport载体中的野生型hIL-10DNA的相应区域。使以pSV.Sport为基础的hIL-10突变体cDNA在大肠杆菌DH5α株中增殖，并用DNA顺序测定法加以确认。如上所述用相同的表达载体转染COS细胞。

氨基端修饰

为产生人IL-10的N末端变异体，利用引物对但不用DNA模板，用PCR法合成相应于野生型hIL-10cDNA的PstI/BglII区的修饰cDNA片段。用所得片段置换pSV.Sport载体中野生型hIL-10DNA的相应区域。这样得到一些变异体，在这些变异体中，从野生型hIL-10的N末端缺失了7(变异体NΔ7)、10(变异体NΔ10)、11(变异体NΔ11)或12(变异体NΔ12)个残基。用于制备每个变异体的引物对及限定其顺序的顺序号如下：

变异体引物(末端) 顺序号

NΔ7 C3352CC(5’) 11

C3355CC(3’) 12

NΔ10 C3353CC(5’) 13

C3354CC(3’) 14

NΔ11 C3483CC(5’) 15

C3485CC(3’) 16

NΔ12 C3484CC(5’) 17

C3486CC(3’) 18

如前面对C末端突变拮抗剂的合成所述，用指定引物对的每个引物各10皮摩尔进行PCR。通过苯酚-CHCl₃提取和乙醇沉淀对PCR混合物进行处理，然后依次用BglII和PstI消化。如上所述在琼脂糖凝胶中对限制消化产物进行电泳，从凝胶上切下预期大小的DNA片段，并通过苯酚-CHCl₃提取和乙醇沉淀进行回收。

从凝胶中回收后，通过PstI/BglII消化切下pSV.Sport载体中野生型hIL-10DNA的相应区域，并连入hIL-10变异体的PstI/BglII限制片段，从而用这些片段置换野生型hIL-10DNA中的相应区域。如上所述增殖、确认和使用以pSV.Sport为基础的hIL-10突变体cDNA。

所得的NΔ7、NΔ10、NΔ11和NΔ12变异体分别具有4号顺序的8-160、11-160、12-160和13-160残基所限定的氨基酸顺序。

具有N末端修饰的人IL-10拮抗剂

把上述方法组合起来则易于制备氨基端和羧基端都有修饰的拮抗剂。例如，NΔ7/K157E拮抗剂可用以下方法制备：如上所述用5’引物B3351CC和3’引物C3481CC进行PCR，产生含编码K157E拮抗剂的cDNA的pSV.Sport。如上所述用5’引物C3352CC和3’引物C3355CC制备并分离出NΔ7变异体片段后，用该变异体的PstI/BglII限制片段置换pSV.Sport载体中K157E突变DNA的相应区域，方法是通过PstI/BglI消化切下该区域，并连入置换片段。

代谢标记

用携有编码人IL-10；拮抗剂K157E、CΔ3或CΔ4；或激动剂变异体NΔ7、NΔ10、NΔ11或NΔ12的cDNA***片段的表达载体pSV.Sport，如上所述转染COS细胞。然后将细胞在10cm培养皿中在含血清培养基中培养48-72小时。此次培养后，培养皿用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，再于37℃下在5％CO₂中培养30分钟，此次培养使用8ml/培养皿的添加有透析FBS和谷氨酰胺的无甲硫氨酸DMEM培养基。吸出每个培养皿中的培养基，换用500μl含有250-300μCi³⁵S-甲硫氨酸(DuPont NEN，Boston，MA；比活43.3mCi/ml)的无甲硫氨酸培养基。

将细胞于37℃下在5％CO₂中培养5小时，然后在培养皿中加入10μl1.5mg/ml L-甲硫氨酸贮液，并进行30分钟的追踪。收集标记的条件培养基，并在非还原条件下在10-20％凝胶中进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE；Laemmli，Nature227：680，1970)，凝胶干燥后用标准方法和Kodak XAR胶片进行放射自显影。

放射自显影显示出人IL-10；拮抗剂K157E、CΔ3和CΔ4及激动剂NΔ7和NΔ10的不同标记条带，所有条带都迁移在表观分子量约16-18千道尔顿处。在相同的转染和细胞培养条件下，三个人IL-10羧基端突变拮抗剂的表达水平都略低，比IL-10约低2-4倍。氨基端激动剂变异体NΔ7的表达与IL-10差不多，而NΔ10变异体的表达水平比IL-10低约4倍。变异体NΔ11和NΔ12的表达太低，用本方法检测不出。

ELISA分析

为进一步定量分析突变拮抗剂和人IL-10在COS细胞条件培养基中的水平，基本如Abrams等人所述(Immunol.Rev.127：5，1992)进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。用标准方法制得特异于人IL-10上不同抗原决定基的两种单克隆抗体，这两种抗体分别定名为9D7和12G8，并分别用作捕获剂和检测剂。在该测定中测试连续稀释的条件培养基，并用纯化的重组人IL-10作标准物。该测定法的检测极限约为1ng/ml，培养72小时后，在培养基中一般测出IL-10水平在100-300ng/ml范围内。

用上述方法发现IL-10和拮抗剂的相对水平与代谢标记所得的结果有良好的相关性，表明由所用的单克隆抗体识别的抗原决定基不在突变区中。在一个典型的测定中，所测得的人IL-10、K157E、CΔ3、CΔ4、NΔ7、NΔ10、NΔ11和NΔ12的表达水平分别为133、80、63、48、139、28、23和6.5ng/ml。

生物测定

利用小鼠肥大细胞和人外周血单核细胞(PBMC)，研究了人IL-10和代表性IL-10突变拮抗剂。

基本如O’Garra等人(Int.Immunol.2：821，1990)和Thompson-Snipes等人(J.Exp.Med.173：507，1991)所述进行肥大细胞刺激测定。简单地说，在96孔微量滴定板上，每孔加5×10³个MC/9细胞(ATCCCRL8306)于100μl测定培养基中(RPMI-1640，含有10％胎牛血清(FBS)、50μMβ-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素)，用不同量的人IL-10或一种IL-10拮抗剂处理48小时。然后在每孔中加入25μ15mg/ml MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)(Sigma，St.Louis，MO)，并将滴定板保温3-5小时。然后用含10mMHCl的10％SDS溶解细胞，并在570nm处测定光吸收。

在该测定中人IL-10和变异体NΔ7、NΔ10和NΔ11有活性，但未观察到变异体NΔ12有活性。羧基端突变拮抗剂都没有活性，即使在高达375ng/ml的浓度(大约是产生强活性的IL-10量的100倍)下测试时也是如此。

为了测定IL-10拮抗剂对由脂多糖(LPS)诱导的细胞素合成的抑制作用，由健康供体得到人外周血单核细胞(PBMC)，并用FICOLL梯度离心法加以分离(Boyum，Scand.J.Clin.Invest.Supp1：77，1966)。将PBMC等份试样转移到96孔微量滴定板的各小孔中(10⁵个细胞/小孔，200μl RPMI-1640培养基，其中含有5％FBS、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、丙酮酸钠和2mM谷氨酰胺)。

在某些小孔中以固定的100pM浓度加入人IL-10，同时加或不加100倍摩尔过量(10nM)的IL-10拮抗剂(由ELISA测定)。然后立即在每小孔中加入LPS(Sigma)至终浓度为80ng/ml。利用已培养过分别用表达IL-10的载体或质粒pSV.Sport转染的COS细胞的培养基，对阳性和阴性IL-10对照平行进行保温。用后一对照的条件培养基作为所有样品的稀释剂。所有测定都平行进行二次，并用不同批次的细胞以接续的测定加以证实。

将滴定板置于5％CO₂的潮湿气氛中于37℃下保温24小时，然后收集上清液，于-20℃下贮存供以后进行分析。利用ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)按制造商的说明书测定所收集的样品中IL-6、IL-1α和TNFα的水平。

在该测定中发现，所有拮抗剂都使IL-10对细胞素合成的抑制活性逆转，如表1所示。

表1

残余IL-10活性百分比^*

样品 IL-6 IL-1α TNF-α

缓冲液 100 100 100

抗体 0 0 0

K157E 21 27 51

CΔ3 12 13 39

CΔ4 19 27 61

*在对照缓冲液、饱和量的中和性抗IL-10单克隆抗体及100倍摩尔过量的三种IL-10拮抗剂存在下，测定人IL-10对指定细胞素合成的抑制作用。

在不存在IL-10条件下用不同量的IL-10突变拮抗剂进行的类似测定表明，所有拮抗剂都不具有细胞素合成抑制活性。浓度高达100pM(包括100pM)的任何拮抗剂都检测不出抑制活性。

为研究IL-10拮抗剂对T细胞活性的影响，进行了混合淋巴细胞反应(MLR)测定。如上所述分离人PBMC。将细胞于37℃下用50mg/ml丝裂霉素C(Sigma，St.Louis，MO)处理20分钟，制得刺激PBMC。

在96孔微量滴定板的每个小孔中，混合应答PBMC和刺激细胞各约1×10⁵个，同时加入不同量的人IL-10或K157E、CΔ3或CΔ4拮抗剂中的一种，总体积为200μl(三份平行试验)。将细胞于37℃下用5％CO₂培养6天，然后在每小孔的培养物中脉冲式加入1μCi氚化胸苷([³H]-TdR，15.6Ci/mmol，NEN，Boston，MA)，历时16小时。用96孔细胞收集器(Skatron，Inc.，Sterline，VA)将溶解液收集到滤膜上，并用β-计数器(Pharmacia LKB Nuclear Inc.，Gaithersburg，MD)计数。

发现这些拮抗剂在1ng/ml的浓度下不能抑制MLR。相反，人IL-10在该浓度下使MLR达到82％抑制。

受体结合测定

用ENZYMOBEAD^方法(BioRad，Richmond，CA)，按照制造商的说明书使纯化的人IL-10(纯度约99％)放射碘化。通过以200×g离心10分钟使约4×10⁵个表达人IL-10受体cDNA的转染COS细胞沉降，用结合缓冲液(PBS，10％胎牛血清，0.1％NaN₃)洗涤，并以150pM的浓度重新悬浮于200μl含有[¹²⁵I]人IL-10(比放射为225μCi/μg)的结合缓冲液中，同时加入连续稀释的COS细胞条件培养基，该COS细胞表达编码人IL-10或本发明的突变拮抗剂之一的cDNA。

于4℃下培养2小时后，在相同温度下将细胞以200×g离心10分钟。然后移出上清液，将每个细胞沉淀重新悬浮于不含标记IL-10的结合缓冲液中，铺在装在加长小离心管中的200μl含10％甘油的结合缓冲液中，于4℃下以200×g离心1O分钟，在液氮中快速冷冻。然后将细胞沉淀切入计数管中，在CLINIGAMMA^1272计数器(PharmaciaLKB)中计数。在500至1000倍摩尔过量的未标记人IL-10存下下进行结合，从而测定非特异性结合。

结果示于表2。从表2可以看出，在受体结合竞争中，所有IL-10拮抗剂几乎都和IL-10本身一样有效。

表2

放射标记IL-10结合的抑制^*

样品 IC₅₀(pM)

人IL-10 100

K157E 136±65

CΔ3 172±28

CΔ4 120±9

*所示数据是2次独立测定的平均值，给出使放射标记的人IL-10与细胞受体的结合达到50％抑制的未标记人IL-10或指定IL-10拮抗剂的浓度。

本领域技术人员将会明白，在不违背本发明要旨和范围的前提下可以对本发明作出许多修改和变动。这里所述的具体实施方案仅仅是以举例方式给出的，本发明只由所附的权利要求书来限定。

顺序表

(1)一般信息

(i)申请人：先灵公司

(ii)发明名称：人白细胞介素-10的激动剂和拮抗剂

(iii)顺序数：18

(iv)通信地址：

(A)收信人：Schering-Plough Corporation

(B)街道：One Giralda Farms

(C)城市：Madison

(D)州：New Jersey

(E)国家：USA

(F)邮政编码：07940

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：Apple Macintosh

(C)操作***：Macintosh 7.1

(D)软件：Microsoft Word5.1a

(vi)本申请数据

(A)申请号：(B)申请日(C)分类：(vii)在先申请数据：美国专利申请08/098,943(viii)代理人信息：(A)姓名：Lunn，Paul，G.(2)1号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：160个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)顺序描述：1号顺序：Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro1 5 10 15Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

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50 55 60Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala65 70 75 80Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

85 90 95Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Glu Ile Arg Asn145 150 155 160(2)2号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：157个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)顺序描述：2号顺序：Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro1 5 10 15Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

85 90 95Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys145 150 155(2)3号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：156个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)顺序描述：3号顺序：Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro1 5 10 15Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

85 90 95Asn Leu Lys Thr Leu Arq Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110Pro Cys Glu Asn Lys Set Lys Ala VaL Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met145 150 155(2)4号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：160个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)顺序描述：4号顺序：Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro1 5 10 15Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

50 55 60Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala65 70 75 80Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val ASh Ser Leu Gly Glu

85 90 95Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

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115 120 125Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn145 150 155 160(2)5号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：60个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：5号顺序：GTCGACTGCA GCCGCCACCA TGCACAGCTC AGCACTGCTC TGTTGCCCTGG TGTTGCCTGG TCCTCCTGAC 60(2)6号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：41个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：6号顺序：ACGTCGAATT CTCAGTTTCG TATCTTCATT GTCATGTAGG C 41(2)7号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：85个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：7号顺序：GGACTTTAAG GGTTACCTGG GTTGCCAAGC CTTGTCTGAG ATGATCCAGT TTTATCTAGA 60GGAGGTGATG CCCCAAGCTG AGAAC 85(2)8号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：49个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：8号顺序：AGCTGAATTC AGTTTCGTAT CTCCATTGTC ATGTAGGCTT CTATGTAGT 49(2)9号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：40个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：9号顺序：AGCTGAATTC ACTTCATTGT CATGTAGGCT TCTATGTAGT 40(2)10号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：37个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：10号顺序：AGCTGAATTC ACATTGTCAT GTAGGCTTCT ATGTAGT 37(2)11号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：91个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：11号顺序：GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60CCTGACTGGG GTGAGGGCCT CTGAGAACAG C 91(2)12号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：90个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：12号顺序：GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60CTCAGAGGCC CTCACCCCAG TCAGGAGGAC 90(2)13号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：82个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：13号顺序：GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60CCTGACTGGG GTGAGGGCCA GC 82(2)14号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：81个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：14号顺序：GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGGC 60CCTCACCCCA GTCAGGAGGA C 81(2)15号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：82个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：15号顺序：GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60CCTGACTGGG GTGAGGGCCT GC 82(2)16号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：78个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：16号顺序GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGA AGTGGG TGCAGGCCCT 60CACCCCAGTC AGGAGGAC 78(2)17号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：81个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：17号顺序：GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60CCTGACTGGG GTGAGGGCCA C 81(2)18号顺序信息：(i)顺序特征：(A)长度：75个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(xi)顺序描述：18号顺序：GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGGCCCTCAC 60CCCAGTCAGG AGGAC 75

Claims

1.一种人IL-10的拮抗剂，该拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

2.权利要求1的拮抗剂，其中氨基末端已缺失了1-11个氨基酸残基。

3.权利要求1的拮抗剂，该拮抗剂具有由1、2或3号顺序限定的氨基酸顺序。

4.一种编码人IL-10的拮抗剂的核酸，所述拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

5.权利要求4的核酸，该核酸编码一种氨基端已缺失了1-11个氨基酸残基的拮抗剂。

6.权利要求4的核酸，该核酸编码的人IL-10拮抗剂具有由1、2或3号顺序限定的氨基酸顺序。

7.一种包含权利要求4的核酸的重组载体，该载体能够指导所述核酸的表达。

8.一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求7的重组载体。

9.一种生产人IL-10的拮抗剂的方法，所述拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10，所述方法包括：在表达核酸的条件下培养权利要求8的宿主细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述核酸编码一种氨基端已缺失1-11个氨基酸残基的拮抗剂。

11.权利要求9的方法，其中所述核酸所编码的拮抗剂具有由1、2或3号顺序限定的氨基酸顺序。

12.一种抑制人IL-10生物活性的方法，该方法包括：使带有人IL-10受体的细胞与有效量的一种人IL-10拮抗剂接触，拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

13.权利要求12的方法，其中拮抗剂的氨基端已缺失了1-11个氨基酸残基。

14.权利要求12的方法，其中拮抗剂具有由1、2或3号顺序限定的氨基酸顺序。

15.一种人IL-10的拮抗剂，该拮抗剂包含由于缺失了1-11个氨基端氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

16.权利要求15的拮抗剂，其中已缺失了7、10或11个氧基酸残基。

17.一种编码人IL-10拮抗剂的核酸，该拮抗剂包含由于缺失1-11个氨基端氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

18.权利要求17的核酸，该核酸编码已缺失了7、10或11个氨基酸残基的拮抗剂。

19.一种包含权利要求17的核酸的重组载体，该载体能够指导核酸的表达。

20.一种宿主细胞，该宿主细胞包含权利要求19的重组载体。

21.一种生产人IL-10激动剂的方法，该激动剂包含由于缺失1-11个氨基端氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10，所述方法包括：在表达核酸的条件下培养权利要求20的宿主细胞。

22.权利要求21的方法，其中所述核酸编码已缺失7、10或11个氨基酸残基的激动剂。

23.一种药物组合物，该组合物包含一种可药用载体和有效量的(a)一种人IL-10的激动剂，该激动剂包含由于缺失1-11个氨基端氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10，或(b)一种人IL-10的拮抗剂，该拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

24.权利要求23的药物组合物，其中拮抗剂的氨基端已缺失了1-11个氨基酸残基。

25.权利要求23的药物组合物，其中拮抗剂具有由1、2或3号顺序限定的氨基酸顺序。

26.权利要求23的药物组合物，其中激动剂中已缺失了7、10或11个氨基酸残基。

27.一种人IL-10的拮抗剂在抑制IL-10生物活性中的应用，该拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。

28.一种人IL-10的拮抗剂在制备用于抑制IL-10生物活性的药物中的应用，所述拮抗剂包含由于157位的赖氨酸残基被酸性氨基酸残基置换，或由于含约12个羧基末端残基的区域中缺失一个或更多个氨基酸残基而得到修饰的成熟人IL-10。