SK279387B6

SK279387B6 - Spôsob výroby živej atenuovanej bezbunkovej vakcín

Info

Publication number: SK279387B6
Application number: SK1480-94A
Authority: SK
Inventors: Philip J. Provost; David L. Krah; Paul A. Friedmann
Original assignee: Merck & Co.
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-05-26
Publication date: 1998-10-07
Also published as: EP0573107A3; EP1097988A1; CA2097019C; PT1097988E; CN1069216C; RU2126269C1; FI117758B; ES2317869T3; AU673167B2; CZ289690B6; BG62176B1; ATE206311T1; HU9403473D0; AU4003693A; ES2161702T3; RO114906B1; EP1097988B1; AU4392193A; HUT71863A; YU38893A

Description

Doterajší stav techniky

Vírus varicella zoster, VZV, spôsobuje ovčie kiahne a pásový opar. Ovčie kiahne je vysoko nákazlivé ochorenie, ktoré sa vyskytuje u chorých, ktorí nemajú žiadnu imunitu proti tomuto vírusu. Do 20 rokov veku dôjde k expozícii približne u 90 % celej populácie. U dospelých a u ľudí s nedostatočným imunitným systémom však ide o veľmi závažné ochorenie. U veľkého množstva ľudí prežíva VZV bez akýchkoľvek príznakov v bunkách ganglií dorsálnych miechových koreňov. V prípade, že dôjde k reaktivácii vírusu z tohto latentného štádia, vzniká pásový opar ako bolestivé chronické ochorenie.

Bolo by veľmi žiaduce predchádzať ovčím kiahniam vakcináciou, pričom najvýhodnejšou očkovacou látkou pre deti by bola živá vakcína, obsahujúca zoslabený, atenuovaný vírus. Boli už podávané správy o pestovaní tohto vírusu v bunkových kultúrach rôznych typov buniek a tiež o použití živého, atenuovaného, buniek zbaveného vírusu ako vakcíny. V US patentovom spise č. 3 985 615 sa opisuje produkcia primárnych embryonálnych morčacích buniek s obsahom kmeňa Oka tohto vírusu, materiál je vhodný na použitie ako vakcína. V US patentovom spise č. 4 008 317 sa opisuje kultivácia buniek WI-38, materiál je možné použiť ako stabilizátor pre vakcínu. Prostriedky, použiteľné na udržovanie životaschopnosti vírusu VZV, napríklad prostriedok SPGA, sú taktiež už z literatúry známe.

Hlavným obmedzením produkcie vakcíny s obsahom VZV vo veľkom meradle je výťažok bezbunkového VZV zo systému bunkových kultúr, ktoré sú až doteraz známe, tento výťažok je taký nízky, že náklady na výrobu vakcíny sú neúnosne vysoké. Pri použití nového spôsobu podľa vynálezu je možné zvýšiť výťažok bezbunkového VZV približne 5x až 20x.

Vynález si kladie za úlohu navrhnúť spôsob výroby živej, atenuovanej, bezbunkovej vakcíny, obsahujúci VZV, vo vysokom výťažku.

Bunkové kultúry, tvoriace jednu súvislú vrstvu buniek, tak ako sú z literatúry známe, poskytujú približne 80 000 až 160 000 buniek/cm2 podľa Mann, Dev. Biol. Stand, 37, 149 až 152, 1977, Wood a Minor, Biologicals, 18, 143 až 146, 1990. Použitie takýchto jednovrstvových bunkových kultúr na výrobu vírusových antigénov je znevýhodnené ohraničenou hustotou, s ktorou je možné tieto jednovrstvové bunkové kultúry pestovať.

Pokusy zvýšiť hustotu bunkových kultúr boli v minulosti vykonávané s použitím špecializovaných nádobiek pre bunkové kultúry, ktoré boli premývané živnými roztokmi tak, aby bolo možné zvýšiť hustotu buniek až na 1 x 1()6 buniek/cm2 podľa Mann, Dev. Biol. Stand., 37, 149 až 152, 1977. Vynález si kladie za úlohu navrhnúť spôsob, ktorým by bolo možné zvýšiť výťažok buniek s použitím existujúcich systémov bunkových kultúr.

Vynález si teda kladie za úlohu navrhnúť spôsob pestovania buniek do vyššej hustoty, než bolo skôr nutné a tak dosiahnuť oveľa vyššie výťažky vírusov, pestovaných na týchto jednovrstvových bunkových kultúrach na účely výroby vakcíny na ochranu proti týmto vírusom.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí nový spôsob pestovania jednovrstvových bunkových kultúr a nové živné prostredie na použitie na uskutočňovanie tohto postupu. Pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu jc potrebné použiť bohaté živné prostredie v porovnaní s bežne používaným minimálnym prostredím a ešte je nutné toto prostredie doplniť optimalizovanou koncentráciou lipidov. Použitím spôsobu podľa vynálezu sa používa nové rastové prostredie, ktorým je prostredie SRFE-2, doplnené 0,02 až 0,4 g/ml lipidov zo sójových bôbov, čím je možné dosiahnuť podstatné zvýšenie hustoty jednovrstvovej bunkovej kultúry. Takto získaná jednovrstvová kultúra so zvýšenou hustotou je vhodná na zvýšenú produkciu vírusových antigénov na výrobu vakcíny proti vírusu.

Pokiaľ ide o produkciu určitej očkovacej látky, týka sa spôsob podľa vynálezu produkcie veľkých množstiev živej, atenuovanej, bezbunkovej vakcíny s obsahom VZV, vhodnej na prevenciu ovčích kiahní, postup spočíva v tom, že sa na bunkovej kultúre pestuje VZV, ktorý sa potom z kultúry izoluje a pestovanie a izolácia sa vykonávajú za podmienok, pri ktorých je možné dosiahnuť maximálny výťažok a dobrú stálosť VZV. Tento postup spočíva v tom, že sa :

a) pestujú bunky, ktoré môžu byť infikované VZV a to ľudské diploidné bunky, napríklad MRC-5 až do súvislej jednovrstvovej kultúry s použitím vysokého objemu bohatého živného prostredia a za prívodu nemetabolizovateľného disacharidu, napríklad sacharózy,

b) bunky, pestované podľa stupňa a) sa infikujú čo najbližšie k bodu, v ktorom dochádza k vzniku súvislej vrstvy buniek s použitím najvyššieho z praktického hľadiska vhodného počtu buniek, infikovaných VZV,

c) kultúra, infikovaná VZV sa udržuje počas 22 až 96 hodín za prívodu vysokého množstva živín a VZV sa izoluje v okamihu svojej najvyššej produkcie,

d) kultúra, infikovaná VZV sa premyje fyziologickým roztokom chloridu sodného, prípadne s obsahom lyzozomotropného činidla, napríklad chloridu amónneho alebo chlorochinu pred izoláciou buniek, infikovaných VZV,

e) bunkový materiál, infikovaný VZV sa izoluje čo do najmenšieho objemu, potom sa bunkový materiál okamžite rozruší alebo sa lyofilizuje pre neskoršie rozrušenie buniek,

f) bunky, infikované vírusom VZV sa rozrušia na optimálne uvoľnenie VZV, spojeného s bunkami a bunková drvina sa oddelí, čím sa získa bezbunkový VZV.

Podstatu vynálezu teda tvorí spôsob pestovania buniek v súvislej jednovrstvovej kultúre, aby sa dosiahla zvýšená hustota buniek v týchto spojitých bunkových kultúrach Tento cieľ je možné dosiahnuť použitím obohateného živného prostredia, doplneného lipidom v optimalizovanej koncentrácii. Pestovaním jednovrstvových bunkových kultúr spôsobom podľa vynálezu s použitím nového živného prostredia s obsahom lipidov je možné dosiahnuť podstatne vyšší výťažok vírusového antigénu, vyjadreného ako vírusové jednotky, vytvárajúce plaky, PFU. S použitím bunkových kultúr, získaných spôsobom podľa vynálezu je možné dosiahnuť vyššiu produkciu vírusu hepatitídy A, vírusu pásového oparu, vírusu ružienky, vírusu osýpok, det skej obmy, rotavírusu a podobne, čím je možné dosiahnuť vyššiu produkciu vakcíny proti uvedeným chorobám.

Výhodným obohateným prostredím pre toto použitie je prostredie SRFE-2, ktoré sa bežne dodáva (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, S2138 alebo ServaFine Chemicals, Heildclbcrg, SRN, 47523). Toto živné prostredie bolo opísané v publikácii Weiss a ďalší, In Vitro, 16(7), 616 až 628, 1980. Je možné použiť aj ekvivalentné živné prostredia alebo mierne pozmenené živné prostredie SRFE-2 v prípade, že tieto prostredia sú použité rovnakým spôsobom, ako bude podrobnejšie uvedené.

Pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je možné použiť celý rad známych lipidových doplnkov. Je napríklad možné použiť lipidy, bohaté na cholesterol, získané zo séra dospelého hovädzieho dobytka (Sigma Chemical Co., číslo v katalógu L-4646), Lipid EX-CYTE I alebo lipid s veľmi nízkym množstvom endoxínu, VLE (Miles, Inc., číslo katalógu 82-004-7 a 8 a 82-019-1), všetky tieto látky sú veľmi vhodné na doplnenie bohatého prostredia. Vhodným lipidom na toto použitie je bežne dodávaný extrakt lipidov zo sójových bôbov (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, číslo v katalógu 1074-482). Tento materiál a podobné materiály boli opísané v publikácii Tscove a Melchers, J. Al. Exp. Medicíne, 147, 923 až 933, 1979 ako materiály, vhodné na náhradu séra v bunkovej kultúre B-lymfocytov. V uvedenej publikácii sa nikde neuvádza, rovnako ako v katalógu Boehringer Mannheim v opise tohto produktu sa neuvádza, že by lipidy zo sójových bôbov mohli byť použiteľné ako prísady k bohatým živným prostrediam na pestovanie bunkových kultúr. Podľa uvedených literárnych zdrojov sú totiž tieto lipidy určené na náhradu krvného séra v bunkových kultúrach, pestovaných s použitím minimálneho živného prostredia. Pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu sa však uvedené lipidy používajú na doplnenie bohatého živného prostredia. Okrem toho sa podľa uvedených literárnych údajov lipidy používajú v koncentrácii približne 10 až 100 pg/ml, zatiaľ čo pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je optimálna koncentrácia uvedených lipidov dvakrát až trikrát vyššia než koncentrácia, uvedená v literatúre. Navyše sa pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu lipidový doplnok používa spolu so sérom a nie namiesto séra.

Vynález bude ďalej podrobnejšie opísaný v súvislosti s priloženými výkresmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 sú znázornené výťažky VZV v hodnotách PFU na živnom prostredí, doplnené sacharózou. Na obr. 2 je znázornený výťažok bezbunkového antigénneho VZV. Na obr. 3 je znázornená stabilita VZV s použitím stabilizátora SPGA pri teplote -20 °C alebo 4 °C. Na obr. 4 sú znázornené výťažky VZV v hodnotách PFU s použitím rôznych živných prostredí. Na obr. 5 je znázornený vplyv prívodu MOI, spojeného s bunkovým materiálom na výťažok bezbunkového VZV. Na obr. 6 sú uvedené výťažky vírusového antigénu VZV ako funkcie prívodu MOI.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Spôsob podľa vynálezu sa vykonáva tak, že sa do nádoby na pestovanie bunkových kultúr naočkujú bunky MRC-5, WI-38, Vero alebo akýkoľvek iný bunkový materiál, o ktorom je známe, že je vhodný na pestovanie vírusov. Počiatočná fáza pestovania sa vykonáva v minimálnom živnom prostredí, tak ako je známe z literatúry', napríklad v prostredí EMEM alebo EBME, alebo v bohatom živnom prostredí, ako je SRFE-2 bez doplnenia lipidmi. Môže byť tiež výhodné pridať 10 % fetálneho teľacieho séra FCS, antibiotikum, napríklad neomycín v množstve 50 pg/ml a L-glutamín v množstve približne 2 mM. Bunkový materiál sa potom pestuje pri teplote, vhodnej na pestovanie buniek a vírusu, zvyčajne 34 až 37, výhodne približne 35 °C v závislosti od typu vírusu, ktorý má byť získaný, kultúra sa pestuje niekoľko dní.

Hneď ako dôjde k spojení buniek s podkladom a k tvorbe jednovrstvovej bunkovej kultúry, oddelí sa použité minimálne alebo obohatené živné prostredie a nahradí sa čerstvým, bohatým živným prostredím, doplneným optimalizovanou koncentráciou lipidu.

Po ďalšom období rastu môže byť živné prostredie ορόν odstránené a nahradené čerstvým bohatým živným prostredím bez doplnenia lipidmi. V prípade, že sa lipidy pridávajú v okamihu, kedy bunkový materiál dosiahne alebo takmer dosiahne spojité vrstvy, pôsobí tento prídavok proti produkcii buniek a znižuje maximálny výťažok bunkového materiálu.

V okamihu, kedy majú byť bunky v súvislej vrstve infikované vírusovým očkovacím materiálom, odstráni sa lipidový doplnok a pridá sa vírus v čerstvom bohatom živnom prostredí. Neprítomnosť lipidu v tomto okamihu dovolí bunkový rast bez zníženia bunkového rastu, ktoré by v tomto okamihu bolo lipidom spôsobené, ako už bolo uvedené.

Uvedeným spôsobom je možné dosiahnuť podstatné zvýšenie výťažku buniek aj vírusu. Napríklad v prípade vírusu ovčích kiahní na bunkách MRC-5 je možné dosiahnuť podstatné zvýšenie výťažku VZV, vyjadrené v jednotkách PFU v porovnaní s prípadom, kedy sú bunky MRC-5 pestované v minimálnom živnom prostredí alebo v samotnom prostredí SRFE-2. Tiež v prípade buniek WI-38, ktoré sú vhodné na rast vírusu ovčích kiahní alebo ružienky, je možné pozorovať rast do podstatne vyššej hustoty pri pestovaní buniek novým spôsobom.

Pokiaľ ide o produkciu určitých vakcín, spočíva nový spôsob podľa vynálezu v tom, že sa pestuje vírus VZV v bunkovej kultúre a potom sa získaný vírus izoluje za podmienok, pri ktorých dochádza k optimálnemu výťažku a dobrej stálosti získaného vírusu. Výhoda, ktorú možno získať týmto spôsobom pri pestovaní VZV je aplikovateľná aj na produkciu iných vírusov s obalovým materiálom, vrátane vírusu iných oparov než \'ZN, vírusu osýpok, mumpsu a ružienky.

Konečným cieľom vynálezu je spôsob, ktorý dovoľuje účinnú produkciu VZV na použitie vo forme vakcíny. Úspech spôsobu podľa vynálezu sa meria výťažkom bezbunkového \'7N. ktorý je možné dosiahnuť po optimálnom vykonaní každého jednotlivého stupňa postupu. Tento výťažok je možné stanoviť titrom infektivity výsledného bezbunkového vírusu N7N. Titre infektivity pre vírus VZV boli stanovené po prevrstvení agarózou alebo kvapalným prostredím podľa publikácie Krah a ďalší, J. Virol. Met

SK 279387 Β6 hods, 1990, 27 : 319 až 326. Tento postup spočíva v tom, že sa pestuje bunkový materiál MRC-5, ktorý je možné infikovať VZV až do štádia aktívnej replikácie, to znamená do štádia, v ktorom bunkový materiál vytvára jednoduchú vrstvu, spojitú na 50 až 80 %. Potom sa do tejto jednovrstvovej kultúry privedie vírus v minimálnom objeme, nechá sa priľnúť k bunkám a potom sa pridá ďalšie živné prostredie. Po niekoľkých dňoch ďalšieho rastu sa bunkový materiál farbí farbivom pre bielkovinu a počítajú sa číre oblasti v bunkovej kultúre, ktoré je možné považovať sa vzniknuté plaky. Za týchto podmienok je v prípade použitia známeho objemu vírusového očkovacieho materiálu počet jednotiek na tvorbu plakov, PFU, v 1 ml dobrým meradlom pre výťažok vírusu. Táto hodnota sa potom vynásobí celkovým objemom bezbunkového vírusu pre akýkoľvek daný vírusový preparát, čím je možné vypočítať celkové množstvo PFU.

Vzhľadom na variabilitu samotného postupu samého osebe sa zvýšenie množstva PFU, ktoré je možné získať určitým postupom, uvádza v pomere k určitému postupu, ktorý je menej optimálny. Tento postup, pri ktorom sa uvádza násobok zvýšenia výťažku vírusu teda vylučuje vplyv akejkoľvek variability pri stanovení jednotiek PFU. Týmto spôsobom bolo dokázané, že spôsobom podľa vynálezu je možné dosiahnuť 16 až 20-násobné zvýšenie výťažku VZV v porovnaní so známymi postupmi. Tento postup vypočítavania zvýšenia nie je v literatúre uvádzaný a podľa nášho názoru je významným príspevkom na určenie účinnosti produkcie vakcín s obsahom VZV.

Vzhľadom na to, že počítanie plakov VZV je náročné na čas, nejde o zvlášť výhodný postup pri overovaní účinnosti postupu. V tomto prípade jc možné použiť aj rýchlu skúšku ELISA na stanovenie množstva antigénu VZV a tak sledovať rast vírusu v priebehu výroby živej vakcíny s obsahom tohto vírusu. Okrem toho je túto skúšku možné použiť aj na stanovenie množstva antigénu N7N vo vyčerenej vakcíne, spracovanej pôsobením ultrazvuku a potenciálne tiež na stanovenie množstva antigénu v lyofílizovanej vakcíne, naplnenej do príslušných nádobiek. Tento postup spočíva v tom, že sa inkubuje antigén VZV zo skúmanej vzorky v roztoku s obsahom séra proti VZV. Zvyšná voľná protilátka sa môže viazať na antigén VZV, imobilizovaný na mikrotitračných platniach ELISA. Množstvo protilátky, ktoré sa viaže na tieto mikrotitračné platne je nepriamo úmemé množstvu antigénu v skúmanej vzorke. Protilátka, viazaná na mikrotitračné platne sa kvantitatívne stanoví reakciou s enzymaticky viazanou protilátkou proti ľudským tkanivám a reakciou s príslušným substrátom, čím sa získa sfarbený produkt, ktorý je možné kvantitatívne stanoviť spektrofotometricky.

Skúška ELISA na antigén VZV a skúška na počet plakov VZV by mala poskytovať všeobecne zodpovedajúce údaje, je však nutné mať na pamäti, že pri skúške na antigén VZV sa dokazuje tak životaschopný, ako aj usmrtený VZV. Vzhľadom na to, že imunologická odpoveď na usmrtený VZV nie je taká účinná ako odpoveď, ktorú je možné dosiahnuť s použitím živého atenuovaného vírusu, je skúška na počet jednotiek na tvorbu plakov kritickou skúškou, ktorou je možné stanoviť dávku vírusu pre vakcínu s obsahom VZV. Ale skúška na antigén je cenná v tom zmysle, že poskytuje informáciu o celkovom množstve antigénu vo vakcíne s obsahom VZV, je rýchlejšia než stanovenie počtu jednotiek PFU a tým je vhodná na sledovanie produkcie VZV v priebehu postupu, pričom je v zodpove dajúcej korelácii aspoň až do okamihu vrcholnej produkcie jednotiek PFU vírusu VZV, takže je možné pri jej použití odhadnúť optimálny okamih na izoláciu vírusu.

Úspešnosť vykonania spôsobu podľa vynálezu je možné zvýšiť optimalizáciou každého z nasledujúcich kritických parametrov spôsobu podľa vynálezu :

a) bunkový materiál, ktorý môže byť infikovaný VZV, zvolený z ľudských diploidných buniek, napríklad MRC-5 sa pestuje v bunkovej kultúre až do vytvorenia spojitej súvislej vrstvy s použitím veľkého objemu bohatého živného prostredia na dosiahnutie vysokého stupňa replikácie buniek za súčasného prívodu nemetabolizovateľného disacharidu, napríklad sacharózy:

Na produkciu VZV je možné použiť celý rad známych systémov rôznych bunkových kultúr. Je napríklad možné použiť kultúry buniek Vero, WI-38 alebo MRC-5 a rad ďalších bunkových typov. V opísaných pokusoch bol trvalo používaný bunkový materiál MRC-5, ktorý je vhodný na produkciu vakcíny, určenej na použitie u človeka. Je však možné uvažovať aj o tom, že by bolo možné zvýšiť výťažok bezbunkového VZV aj nad uvádzané hodnoty v prípade použitia ešte produktivnejšej bunkovej línie než MRC-5. Vynález zahrnuje aj použitie takýchto bunkových línií, pokiaľ by bolo možné ich upraviť na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu.

Pri porovnávaní výťažkov bezbunkového živého vírusu v bunkových kultúrach buniek MRC-5, pestovaných takmer do vytvorenia alebo až do vytvorenia súvislej vrstvy pri pestovaní pri teplote 35 °C v atmosfére s 5 % oxidu uhličitého v Eaglovom minimálnom základnom prostredí EMEM s prídavkom 2 alebo 10 % fetálneho teľacieho séra FCS, je možné zistiť vplyv vytvorenia skutočne spojitej vrstvy buniek na výťažok bezbunkového VZV vo forme jednotiek pre tvorbu plakov, PFU, ako bude ďalej opísané v príklade 2, v tabuľke I.

Pri použití spojitej jednoduchej vrstvy buniek je možné získať 2 až 3 - krát vyšší výťažok PFU/ml v porovnaní s výťažkom, ktorý je možné dosiahnuť s použitím takmer spojitej vrstvy buniek a to v prípade, že sa použije aktívna proliferácia v prítomnosti 10 % séra a v prípade, že sa použijú len 2 % fetálneho teľacieho séra. Je teda zrejmé, že je potrebné dosiahnuť celkom spojitú vrstvu buniek bez aktívnej proliferácie na dosiahnutie vysokých výťažkov VZV pri výrobe vakcíny s jeho obsahom.

Množstvo fetálneho teľacieho séra v percentách nemá podstatný vplyv na výťažok PFU bezbunkového vírusu v priebehu rastu vírusu. V typických prípadoch sa v priebehu rastovej fázy buniek FCS pridáva v množstve 10 %, zatiaľ čo v priebehu rastu vírusu sa FCS pridáva v množstve 2 % v minimálnom prostredí, napríklad EMEM alebo EBME, alebo v bohatom prostredí, napríklad SRFE-2 na bunkový rast, aj na pestovanie vírusu.

Okrem FCS sa do živného prostredia typicky pridáva ešte antibiotikum, napríklad 50 pg/ml neomycínu a približne 2 mM glutamínu v priebehu rastu bunkovej kultúry, aj v priebehu rastu vírusu.

1. Fáza pestovania buniek

Nádoby na pestovanie bunkových kultúr, napríklad fľaše alebo ich funkčné ekvivalenty sa naočkujú bunkovým materiálom MRC-5 alebo inými diploidnými bunkami tak, že počiatočná koncentrácia buniek sa pohybuje v rozmedzí 10 000 až 40 000 bumek/cm^. K bunkovému materiálu sa privádza rastové prostredie, doplnené približne 10 % fetálneho teľacieho séra a kultúra sa pestuje v prostredí s obsa hom 5 % oxidu uhličitého pri teplote 30 °C až 37 °C, výhodne približne 35 °C.

Bunkový materiál je možné pestovať v malom objeme tak, ako je to potrebné v prípade buniek v stacionárnej kultúre. Prijateľný pomer objemu k povrchu bunkovej kultúry je približne 0,5 ml živného prostredia na cm² povrchu kultúry.

V prípade trepacích kultúr môže byť dostatočné množstvo 125 ml prostredia na 850 cm², výhodné množstvo je však 425 ml živného prostredia na cm² kultúry.

Vo fáze bunkového rastu je možné použiť bežne dodávané známe minimálne živné prostredia na pestovanie bunkových kultúr, napríklad Eaglovo minimálne základné prostredie EMEM alebo Eaglovo bazálne prostredie, doplnené soľami podľa Earleho EBME, vždy spolu s 10 % FCS. V tejto fáze je však možné použiť výhodne aj bohatšie prostredie. Prostredie SRFE, ktoré bolo opísané v publikácii Weiss a ďalší, In Vitro, 16(7), 616 až 628, 1980 (Sigma) je bohaté prostredie, ktoré je možné v tomto stupni použiť, použitie bohatého prostredia v tomto stupni však nie je na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu kritické.

2. Fáza bunkového rastu

Po počiatočnom pestovaní bunkovej kultúry je nevyhnutne potrebné privádzať dostatočné množstvo živín na rast buniek až do vytvorenia súvislej vrstvy. Toto je možné dosiahnuť privádzaním veľkého objemu minimálneho prostredia alebo menšieho objemu bohatého prostredia. Bunkový materiál sa pestuje pri teplote 30 °C až 37 °C, výhodne 32 °C až 35 °C.

Po priľnutí buniek a počiatočnej fáze bunkového rastu je možné prostredie odstrániť a nahradiť čerstvým živným prostredím a potom pokračovať v inkubácii. Prostredie je možné odstrániť odsatím alebo zliatím, alebo akýmkoľvek iným spôsobom, pokiaľ nebude porušená súvislosť bunkovej vrstvy. Použitím buniek MRC-5, pestovaných uvedeným spôsobom je možné živné prostredie vymeniť po 72 hodinách od naočkovania buniek do nádoby.

Objem nového živného prostredia môže byť rovnaký ako počiatočný objem prostredia. Výhodne sa však použije v priebehu rastovej fázy väčší objem živného prostredia než v počiatočnej fáze. To je zvlášť dôležité v prípade, že sa bunkový materiál pestuje v minimálnom prostredí, napríklad v prostredí EMEM alebo EBME s prídavkom FCS. Veľký objem kultúry je jednou z ciest, ktorou je možné zaistiť pre bunkový materiál dostatočnú výživu.

Požiadavku na veľký objem prostredia je možné obmedziť v prípade, že sa v rastovej fáze buniek pridáva bohaté živné prostredie. Zvlášť výhodným živným prostredím na tento účel je prostredie SRFE-2 (Sigma). Použitie bohatého živného prostredia v tomto stupni namiesto minimálneho živného prostredia podstatne podporuje hustotu súvislej spojitej vrstvy buniek. Zvýšená hustota buniek v kultúre potom podporuje zvýšenie výťažku VZV, ktorý je možno získať z infikovanej bunkovej kultúry s použitím bohatého živného prostredia. To znamená, že pri použití obohateného živného prostredia v priebehu rastovej fázy buniek je možné dosiahnuť 2 až 4 - násobné zvýšenie konečného výťažku VZV v porovnaní s bunkovou kultúrou, ktorá bola v tomto stupni pestovaná v minimálnom živnom prostredí. Vo výhodnom uskutočnení sa prostredie SRFE-2 doplní lipidom. Použiť je možné celý rad lipidových materiálov. Ide napríklad o lipidy, bohaté na cholesterol zo séra dospelého hovädzieho dobytka (Sigma Chemical Co.), lipid EXCYTE I alebo lipid s veľmi nízkym obsahom endotoxínu,

VLE (MILES), tieto látky boli veľmi vhodné na doplnenie bohatého prostredia, aj minimálneho živného prostredia. Veľmi vhodným prostriedkom na doplnenie bol lipid zo sójových bôbov (Boehringer Mannheim), ktorý bol opísaný v publikácii Iscove a ďalší, J. Exp. Med., 147, 923 až 933, 1978, tento lipid je veľmi vhodným materiálom pri použití v množstve 0,2 mg/ml. Pri použití živného prostredia SRFE-2 s lipidom a FCS bolo možné dosiahnuť hustotu buniek až približne 500 OOO/cm². Pri použití lipidu je možné dosiahnuť zvýšený výťažok VZV bez ohľadu na to, či je bunkový materiál pestovaný v minimálnom živnom prostredí alebo v obohatenom živnom prostredí. Materiál sa bežne dodáva ako zásobný materiál, ktorý v 100 mg/ml sérového albumínu hovädzieho dobytka obsahuje navyše 20 mg/ml lipidu. Tento materiál sa bežne používa v konečnom riedení 1 : 100. Konečný výťažok VZV bol zvýšený približne deväťkrát v porovnaní s výťažkom, získaným s použitím samotného živného prostredia EMEM a približne 3,3 - krát v porovnaní so samotným prostredím SRFE-2 v prípade, že prostredie SRFE-2 bolo doplnené v priebehu rastovej fázy buniek pridaním 0,2 mg/ml lipidu zo sójových bôbov.

3. Fáza pred infekciou buniek

Bolo zistené, že konečný výťažok VZV je možné ďalej zvýšiť z prípade, že sa bunková kultúra pred infekciou VZV vystaví pôsobeniu nemetabolizovateľného netoxického disacharidu v optimálnej koncentrácii. V jednom z veľmi výhodných uskutočnení sa pridáva približne 20 až 60 mM sacharózy približne 72 hodín po naočkovaní buniek do nádoby a výhodne 24 až 96 hodín pred infikovaním kultúry VZV. Pri praktickom uskutočnení je možné pridať približne 50 mM sacharózy do čerstvého živného prostredia v stupni 2, čím je možné obmedziť počet sterilných manipulácii s kultúrou súčasným pridaním oboch materiálov.

Iné disacharidy, napríklad laktóza, cellobióza a maltóza taktiež zvyšujú konečný výťažok VZV, ale výhodná je najmä sacharóza. Boli skúmané tiež monosacharidy, ako fruktóza a ribóza, tieto látky však nezvyšovali výťažok VZV, pričom ribóza bola dokonca toxická. Je zrejmé, že disacharidy sa hromadia v lyzozómoch rastúcich buniek a zväčšujú tieto útvary za vzniku vakuol podľa publikácie DeCourcy a Storrie, Exp. Celí. Res., 192, 52 až 60, 1991. Vplyv disacharidov na výťažok VZV teda môže byť vyvolaný zmiernením poškodenia bunkových lyzozómov vírusom VZV. Okrem disacharidov je možné očakávať, že aj trisacharidy a tetrasacharidy budú mať v uvedenom zmysle priaznivý účinok, aj vzhľadom na to, že v publikácii Cohn a Ehrenreich, J. Exp. Med., 129, 201 až 222, 1969 sa opisuje takáto vákuolizácia v prípade, že tieto vyššie cukry alebo sacharóza sú privádzané do živného prostredia makrofágov, pokiaľ tieto cukry nie sú bunkami metabolizované.

b) Infekcia buniek, získaných v stupni a) v okamihu, čo najbližšom vytvoreniu spojitej vrstvy buniek s použitím čo najvyššieho množstva infikovaných buniek

Opakovanými pokusmi bolo dokázané, že po uplynutí 48 hodín po dosiahnutí súvislej vrstvy buniek sa vytvára už len 50 % PFU/ml v porovnaní s výťažkom, ktorý je možné dosiahnuť v prípade, že sú vírusom VZV infikované bunky, ktoré práve vytvorili spojitú vrstvu. To znamená, že je veľmi dôležité privádzať očkovací vírus VZV v okamihu, ktorý' je čo najbližšie okamihu vytvorenia súvislej vrstvy buniek. Nanešťastie je tvorba spojitej vrstvy buniek parametrom, ktorý sa môže meniť v závislosti od typu použité

SK 279387 Β6 ho živného prostredia, od použitého typu buniek a od ďalších podmienok. V prípade buniek MRC-5, pestovaných podľa uvedeného stupňa al) je možné v typických prípadoch bunkový materiál infikovať práve v okamihu tvorby súvislej vrstvy.

Ako vírus VZV sa výhodne použije kmeň Oka atenuovaného vírusu, ktorý bol opísaný v US patentovom spise č. 3 985 615 a ktorý je uložený vo verejnej zbierke kultúr ATCC. Tento vírus je upravený na rast na bunkových kultúrach embryonálnych buniek morčaťa a na ľudských bunkových kultúrach diploidných fibroplastov z pľúcnych tkanív, napríklad môže ísť o bunky MRC-5.

Zásobný materiál životaschopných infikovaných buniek uvedeným kmeňom je možné pripraviť tak, že sa bunky MRC-5 infikujú pri MOI približne 1 : 125, infikované bunky sa pestujú tak, aby došlo k replikácii vírusu, potom sa bunkový materiál spracuje pôsobením trypsínu a uvoľnené bunky sa okamžite použijú na očkovanie alebo sa skladujú na neskoršie použitie a na stanovenie PFU pomalým zmrazením s použitím ochranných látok, ako DMSO alebo glycerolu v množstve líP buniek/ml. Zmrazené zásobné bunky, infikované VZV je potom možné kedykoľvek nechať roztopiť a pridať k spojitej vrstve bunkovej kultúry na infikovanie tejto kultúry VZV.

Bunkový materiál, infikovaný VZV je tiež možné lyofilizovať spôsobom, opísaným v publikácii Hondo a ďalší, Archív fúr die gesamte Virusforschung, 40, 397 až 399, 1973, tento postup dovoľuje dlhodobé uloženie lyofilizovaného očkovacieho materiálu pri teplote 4 °C. Ako očkovací materiál je tiež možné použiť bezbunkový vírus VZV, ale vzhľadom na straty výťažku pri izolácii je výhodnejšie použiť vírus, viazaný na bunkový materiál.

Ďalšou možnosťou, ako získať zásobný bunkový materiál, infikovaný vírusom je infekcia bunkového materiálu pred začiatkom jeho pestovania. Potom je možné naočkovať infikované bunky a tieto bunky pestovať, čím je možné dosiahnuť tvorbu spojitej vrstvy buniek približne v tom istom okamihu, kedy sa dosahuje aj najvyšší titer VZV. Je tiež možné súčasne naočkovať infikované a neinfikované bunky do malého objemu živného prostredia, napríklad s použitím 125 ml živného prostredia v trepacej fľaši s plochou 850 cm². Po 2 až 3 dňoch rastu sa množstvo živného prostredia zvýši až na 425 ml alebo sa prostredie nahradí bohatým živným prostredím a potom sa bunkový materiál pestuje až do vytvorenia spojitej vrstvy buniek. Produkčné bunky sa ponechajú v malom množstve minimálneho prostredia s obsahom 10 % FCS až do času 2 dni pred infekciou naočkovaných buniek pomocou buniek, infikovaných VZV. V tomto okamihu sa objem živného prostredia pre produkčné bunky zvýši na 425 ml alebo sa vymení prostredie za bohaté prostredie, napríklad prostredie SRFE-2 s lipidom zo sójových bôbov a s fetálnym teľacím sérom. Produkčný materiál sa potom pestuje až do dosiahnutia celkom spojitej vrstvy buniek. Dva dni pred výmenou živného prostredia sa spojitá vrstva produkčných buniek naočkuje s použitím buniek, infikovaných VZV s použitím MOI 1 : 125 alebo vyšším a nechá sa prebiehať replikácia vírusu ďalšie 2 až 3 dni. Hneď ako je dosiahnutá produkcia VZV v očkovacej kultúre, dosiahnu produkčné bunky celkom spojité vrstvy. V tomto okamihu sa bunky z očkovacej kultúry pridajú k produkčnej kultúre.

Pri akomkoľvek načasovaní produkcie očkovacieho materiálu sa v príslušnom čase po infekcii VZV živné prostredie z očkovacej kultúry, infikované VZV, odsaje, bunkový materiál infikovaný VZV sa podrobí pôsobeniu trypsínu v koncentrácii približne 0,25 % alebo pôsobením iného prostriedku a produkčná kultúra buniek sa infikuje s použitím známeho MOI.

V publikácii Schmidt N. S. a Lennette E. H., Infection and Immunity, 14, 709 až 715, 1976 sa uvádza dôležitosť vysokej hodnoty MOI na dosiahnutie vysokého výťažku VZV, ale neuvádza sa žiadne presné porovnanie s prípadmi, pri ktorých boli použité nízke hodnoty MOI. V tomto prípade bude toto porovnanie uskutočnené.

Bunkový materiál sa infikuje VZV tak, že sa rastové prostredie z bunkovej kultúry odstráni a nahradí sa čerstvým živným prostredím, ktoré obsahuje známe množstvo buniek, infikovaných VZV a pripravených uvedeným spôsobom. Zásobný vírus sa výhodne titruje a stanoví sa tak počet jednotiek na tvorbu plakov, PFU a bunkový materiál, určený na infekciu sa spočíta tak, aby bolo možné určiť počet infikovaných buniek na neinfikované bunky, MOI. Hodnota MOI teda vyjadruje pomer buniek, infikovaných VZV v očkovacom materiáli k počtu neinfikovaných buniek v spojitej vrstve buniek v bunkovej kultúre. To znamená, že hodnota MOI 1 : 10 je vysoká, zatiaľ čo hodnota 1 : 625 je nízka. Vysoká hodnota MOI je žiaduca, ale z praktického hľadiska je možné dobré výťažky VZV dosiahnuť aj pri nižších hodnotách MOI, napríklad 1 : 125.

Pri hodnotách MOI v rozmedzí 1 : 7 až 1 : 625 je možné dosiahnuť výťažok v rozmedzí 500 000 PFU/ml pri vyšších hodnotách MOI až 100 000 PFU/ml pri nízkych hodnotách MOI, ako je zrejmé z tabulky 3 z príkladu 5. Čím vyššia je hodnota MOI, tým kratší inkubačný čas je treba na dosiahnutie vysokých hodnôt PFU a tým je vyšší aj výťažok. Znamená to, že v závislosti od hodnoty MOI a od času ukončenia kultúry je možné získať približne päťnásobné rozdiely v konečných dosiahnutých hodnotách PFU.

c) Udržovanie kultúr, infikovaných VZV v živnom prostredí s vysokým obsahom živín počas 22 až 96 hodín a izolácia materiálu v okamihu vrcholnej produkcie VZV.

Bunkový materiál, infikovaný N7.N sa po infekcii pestuje ešte približne 22 až 96 hodín. Je dôležité zachovať dostatočný prívod živín v tomto stupni rastu vírusu. Je žiaduce uchovať vysoký objem živného prostredia v prípade, že sa použije minimálne živné prostredie, ako EMEM s 2 až 10 % FCS alebo je možné použiť menší objem bohatého živného prostredia. Najvýhodnejšie je použiť živné prostredie SRFE-2 s 2 až 10 % FCS bez prídavku lipidu. Ako už bolo uvedené, pridanie lipidu v tomto stupni bunkovej kultúry' už znižuje výťažok N7N.

V priebehu 22 až 96 hodín pestovania bunkovej kultúry po infekcii dochádza k replikácii vírusu VZV v infikovaných bunkách a vírus tiež infikuje susedný bunkový materiál. Bunky, ktoré boli infikované na začiatku, však už neposkytnú izolovateľný bezbunkový vírus. Rastová krivka vírusu a následná zostupná vetva tejto krivky môže byť veľmi strmá. To znamená, že presné načasovanie času izolácie je kritickým parametrom na získanie čo najväčšieho množstva infekčného VZV, tento údaj je možné presne reprodukovať len prísnym riadením použitej hodnoty MOI, použitým prostredím a časom inkubácie. Okrem toho je možné použiť rýchlu skúšku ELISA na antigén VZV tak, aby bolo možné čo najpresnejšie stanoviť čas izolácie ako okamih, kedy produkcia infekčného VZV je v korelácii s produkciou antigénu VZV do okamihu, kedy už začína dochádzať k uhynutiu vírusu, ako je zrejmé z obr. 5 a 6.

V prípade infikovaných buniek MRC-5, ktorých kultúra bola ukončená 72 hodín po infekcii a každý z uvedených stupňov bol optimalizovaný (rast bol uskutočnený v bohatom prostredí a pred infekciou boli bunky vystavené na 72 hodín pôsobeniu 50 mM sacharózy), bol konečný výťažok bezbunkového vírusu N7.X zvýšený približne šestnásťkrát v porovnaní s kultúrou, pestovanou v minimálnom živnom prostredí a ukončenou po 48 hodinách, ešte väčší rozdiel je možné pozorovať pri ukončení kultúry po 96 hodinách, ako je zrejmé z obr. 1 a príkladu 8. Výťažok VZV za optimalizovaných podmienok bol len štvornásobný v porovnaní s použitím minimálneho živného prostredia v prípade, že vírus bol izolovaný 48 hodín po infekcii, ale stále ešte vysoké zlepšenie v porovnaní s použitím minimálneho živného prostredia bolo možné pozorovať pri izolácii vírusu po 96 hodinách od infekcie buniek. To znamená, že výťažok vírusu je oveľa vyšší a uhynutie vírusu je podstatne nižšie s použitím bohatšieho živného prostredia, pričom súčasne nedochádza k prudkému poklesu výťažku vírusu v priebehu času. Použitím bohatšieho živného prostredia sa tiež znižuje význam použitej hodnoty MOI.

d) Premytie kultúry, infikovanej VZV fyziologickým roztokom chloridu sodného, prípadne s obsahom lyzozomotropnej látky, ako chloridu amónneho alebo chlorochinu pred izoláciou buniek, infikovaných VZV

Aby bolo možné odstrániť sérum, lipidy a bunkovú drvinu z kultúry, premyje sa súvislá vrstva kultúry fyziologickým pufrom, ktorý nerozruší bunkový materiál. Na tento účel je vhodný fyziologický roztok chloridu sodného s obsahom fosfátového pufra, PBS. Bunkový materiál je možné premyť niekoľkokrát, premývací roztok sa zleje, odsaje alebo odstráni akýmkoľvek iným spôsobom, ktorým sa neporuší integrita súvislej vrstvy buniek.

V prípade, že sa bunkový materiál chemicky uvoľní z nádoby, mal by byť zahustený odstredením a fyziologicky pufer by mal byť nahradený stabilizačným roztokom.

Bolo dokázané, že pridanie chloridu amónneho alebo chlorochinu pred uvoľnením buniek zvyšuje konečný výťažok VZV. V publikácii Kielian a ďalší, EMBO J. 5, 3103 až 3109, 1986 sa opisuje použitie chloridu amónneho na riadenie vnútorného pH bunkových endozómov, v ktorých infikujúci vírus zrejmé strávi určitú časť vnútrobunkového života. Je možné, že zvýšenie výťažku VZV po použití tohto lyzozomotropného prostriedku je spôsobené menej tvrdými podmienkami vnútri endozómu. Použitie netoxických, nemetabolizovateľných disacharidov, napríklad sacharózy v období pred infekciou buniek a pôsobenie chloridu amónneho alebo chlorochinu na bunkový materiál môže teda mať podobný mechanizmus účinku. Vo všetkých prípadoch bolo empiricky pozorovaním potvrdené, že k zvýšeniu výťažku dochádza v prípade, že sa chlorid amónny použije v konečnej koncentrácii v rozmedzí 1 až 100 mM, najvýhodnejšie v rozmedzí 20 až 50 mM, pričom sa touto koncentráciou pôsobí výhodne pri teplote 4 °C počas približne 25 až 50 minút pred rozrušením buniek. V prípade, že sa použije druhý lyzozomotropný prostriedok, chlorochin, v koncentrácii približne 230 μΜ, dochádza taktiež k zvýšeniu výťažku vírusu \7N, vyjadrené v jednotkách PFU/ml.

c) Oddelenie buniek, infikovaných vírusom VZV do čo najmenšieho objemu stabilizačného roztoku s okamžitým následným rozrušením týchto buniek alebo s lyofilizáciou buniek na neskoršie rozrušenie

Hneď ako bol bunkový materiál, infikovaný VZV premytý’, je možné ho oddeliť mechanicky v prípade, že to použitá nádoba dovoľuje, alebo aj chemickým spôsobom. Uvoľnenie bunkového materiálu pôsobením enzýmu je menej žiaduce vzhľadom na to, že zvyšky enzýmu môžu znižovať celkový výťažok vírusu po rozrušení bunkového materiálu. Ako už bolo uvedené, v prípade uvoľnenia buniek do fyziologického roztoku chloridu sodného je nutné bunkový materiál zahustiť odstredením a fyziologický roztok chloridu sodného nahradiť čo najmenším objemom stabilizačného roztoku pre N7N. Zvyčajne sa na tento účel používa približne 40 ml stabilizačného roztoku na 850 cm2 súvislej vrstvy buniek.

Stabilizátory pre vírusy sú v danej oblasti techniky známe. Napríklad v US patentovom spise č. 3 985 615 sa navrhuje stabilizácia 5% sacharózou vo fyziologickom roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrom, v ďalších publikáciách sa doporučujú zložitejšie stabilizačné roztoky, napríklad SPGA.

Po opätovnom uvedení buniek, infikovaných VZV do suspenzie v stabilizačnom roztoku pre vírus je možné bunkový materiál okamžite rozrušiť alebo v prípade, že sa súčasne pripravuje veľké množstvo VZV, je možné bunkový materiál zmraziť na teplotu -70 °C na neskoršie spracovanie. Výťažok vírusu VZV na cm^ pestovaných buniek bude síce o niečo vyšší v prípade, že sa bunky rozrušia okamžite, ale po zmrazení zvyčajne nedochádza k väčšiemu zníženiu výťažku než o 10 % v porovnaní s okamžitým spracovaním buniek.

f) Rozrušenie buniek, infikovaných \’7N na optimálne uvoľnenie VZV, spojeného z bunkovým materiálom a odstránenie bunkovej drviny za získania prostriedku s obsahom voľného bezbunkového VZV

Ako už bolo opísané, pred rozrušením buniek sa výhodne odstráni živné prostredie a nahradí sa čo najmenším objemom stabilizačného roztoku pre VZV, do tohto roztoku sa bunkový materiál uvoľní mechanicky alebo iným spôsobom. Suspenzia buniek sa potom ochladí na teplotu 0 až °C a bunkový materiál sa rozruší bežným spôsobom, napríklad pôsobením ultrazvuku, homogenizáciou (Dounce) alebo inými typmi homogenizátorov s lepšie nastaviteľným strihovým namáhaním alebo je možné použiť kombináciu týchto postupov.

Bolo potvrdené, že pri samotnom použití ultrazvuku nedochádza k získaniu najvyšších výťažkov bezbunkového VZV. V prípade, že sa ako počiatočný stupeň pri rozrušení použije homogenizácia (Dounce), potom sa bunkový materiál odstredí, supematant sa uchová ako supematant I, potom sa usadenina buniek spracuje pôsobením ultrazvuku a opäť sa odstredí, čím sa získa supematant II, týmto spôsobom je možné uvoľniť čo najvyššie množstvo \'ZN. Výťažok zo spojených supematantov I, II je približne štyrikrát vyšší než celkový výťažok v prípade, že sa ako jediný spôsob rozrušenia buniek použije ultrazvuk.

Po rozrušení bunkového materiálu sa bunková drvina odstráni odstredením, filtráciou alebo akýmkoľvek iným známym spôsobom, pri ktorom VZV zostáva nepoškodený. Bezbunkový vírus sa potom riedi stabilizačným roztokom a delí na menšie podiely na použitie ako vakcína. Na dlhodobé skladovanie sa vírus výhodne lyofilizuje niektorým zo známych postupov.

Je teda možné uzavrieť, že celkový výťažok vírusu je možné zvýšiť nasledujúcimi optimalizovanými stupňami tohto postupu v porovnaní s produkciou VZV s použitím minimálneho živného prostredia pre bunkovú kultúru :

Stupeň zvýšenie PFU (násobky) prostredie/doplnky

1. MOI2-5

2. tvorba spojitej vrstvy buniek2-3

3. prostredie SRFE-2 + lipid2-3

4. pôsobenie sacharózy pred infekciou2-5

5. optimálny objem živného prostredia1 - 2 celkový potenciálny vzostup pre kombináciu použitia doplnkov živného prostredia a stabilizátorov a optimálne podmienky infekcie >8 pozorovaný vzostup pre kombináciu opatrení z bodov 3,4 a 5 v trepacích fľašiach16

6. kombinované pôsobenie strihového namáhania a ultrazvuku na uvoľnenie VZV, viazaného na bunky1,5 celkové zvýšenie v porovnaní s bežným postupom> 18

Využitie postupu na výrobu vakcíny

Bola dokázaná použiteľnosť atenuovaného bezbunkového VZV ako vakcíny na prevenciu ovčích kiahní. Celý rad klinických skúšok postupne dokázal túto použiteľnosť, výsledok skúšok bol opísaný napríklad v Pediatrics 88 (3), 604 až 607, 1991 a Pediatrics 87 (5), 604 až 610, 1991. Príspevok vynálezu na výrobu takýchto vakcín je teda vysoko účinný postup, ktorý dovoľuje vysoký výťažok živého, atenuovaného \’ZN. Vírus, pripravený spôsobom podľa vynálezu je možné spracovať na vakcínu známymi postupmi a potom podávať zvyčajným spôsobom. Je napríklad možné postupovať tak, že sa živný, atenuovaný, bezbunkový VZV, získaný spôsobom podľa vynálezu zriedi stabilizačným roztokom, plní do fliaš, lyofilizuje po jednotlivých dávkach tak, že po skladovaní pri teplote približne 4 °C alebo pri nižšej teplote je v okamihu podávania vakcíny k dispozícii dávka o veľkosti približne 1000 PFU. Vakcína s obsahom VZV, pripraveného spôsobom podľa vynálezu môže byť vo forme jednotlivých dávok použitá na očkovanie v ľudskom lekárstve na vyvolanie odpovede imunitného systému, takže vznikne ochrana proti infekcii virulentnými kmeňmi VZV. Výhodne sa postupuje tak, že sa podkožné alebo vnútrosvalovo podáva roztok, obsahujúci minimálnu dávku 2000 PFU/ml, to znamená 1000 PFU/0,5 ml. Celkovo je možné podávať dávky až do veľkosti

000 až 20 000 PFU.

Optimalizáciou spôsobu podľa vynálezu na produkciu atenuovaného VZV je možné pripraviť známym spôsobom vakcínu, použiteľnú na vyvolanie tvorby protilátok proti VZV na ochranu proti ovčím kiahniam.

Praktické uskutočnenie vynálezu bude vysvetlené nasledujúcimi príkladmi.

Príklad 1

Stanovenie výťažku VZV

Titre aktivity pre vírus varicella zoster, N7N je možné stanoviť pri prevrstvení agarózou alebo inou kvapalinou podľa publikácie Krah a ďalší, J. Virol. Methods., 1990, 27 : 319 až 326, skúška sa vykonáva nasledujúcim spôsobom:

Bunky MRC-5 sa naočkujú na platne na pestovanie tkanivových kultúr s priemerom 60 mm, použije sa 6 x 10$ buniek v 5 ml prostredia BME (základné Eaglovo prostredie s Hanksovým vyváženým roztokom solí) so 100 mg/1 galaktózy, 50 pg/ml neomycínu a 2 mM L-glutamínu a platne sa inkubujú pri teplote 35 °C v atmosfére s obsahom 5 % oxidu uhličitého. Po inkubácii, trvajúcej 24 až 48 hodín, vytvorí bunkový materiál vrstvu, spojitú na 50 až 80 %. Rastové prostredie sa odstráni odsatím a bunkový materiál sa infikuje s použitím 100 μΐ roztoku VZV, zriedeného vhodným riedidlom pre vírus, napríklad pufrom SPGA alebo kvapalným udržiavacím prostredím, napríklad LMM. Pufer SPGA obsahuje 7,5 % hmotn. sacharózy, 11 mM fosforečnanu draselného, 0,1 % hmotnostných glutamátu sodného a 1 % ľudského sérového albumínu. Vírus sa nechá priľnúť k bunkovému materiálu počas najmenej jednej hodiny pri teplote 35 °C v atmosfére s obsahom 5 % oxidu uhličitého. Bunkové kultúry, infikované VZV sa potom prevrstvia 5 ml prostredia s obsahom agarózy, AOM alebo kvapalným udržovacim prostredím LMM. Prostredie, obsahujúce agarózu je zmesou dvoch roztokov a obsahuje kvapalné prostredie na prevrstvenie kultúry, LOM a roztok agarózy. Prostredie LOM obsahuje minimálne základné prostredie s Earlovou zmesou solí, MEM, 2 % fetálneho teľacieho séra, inaktivovaného pôsobením tepla, 50 μg/ml neomycínu a 2 mM L-glutamínu. Roztok agarózy sa pripraví zohriatím 4,5 g agarózy s nízkou teplotou tvorby gélu v 100 ml MEM na 15 minút pri teplote 121 °C s následným ochladením roztoku na 45 °C. Prostredie AOM sa pripraví zmiešaním jedného objemu roztoku agarózy so 4 objemami l,25x koncentrovaného prostredia LOM pri 45 °C. Platne sa ochladia na teplotu 23 °C až 25 °C, aby došlo k stuhnutiu prostredia AOM. Kultúry sa potom inkubujú, aby mohlo dôjsť k vývoju plakov. Po 6 až 7 dňoch sa platne s prostredím LOM prevrstvia 5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrom, PBS a pomocou sklenenej Pasteurovej pipety sa uvoľní a odstráni agaróza. Potom sa odsaje prostredie z platní, ktoré obsahovali LMM, čim je možné pozorovať vytvorené plaky po sfarbení buniek pomocou roztoku, obsahujúceho 0,2 % hmotnostných Coomassieovej modrej R-250 v etanole s 1 % kyseliny octovej. Počet plakov je priemerom zo 4 až 5 platní a vyjadrí sa vo forme jednotiek pre tvorbu plakov na ml, PFU/ml.

Vzhľadom na to, že pri tomto stanovení môže dochádzať k určitej variabilite, uvádza sa výťažok VZV v porovnaní so súčasne vykonávaným postupom za neoptimalizovaných podmienok.

Príklad 2

Výťažok VZV ako funkcia spojitosti bunkovej vrstvy v okamihu infekcie

Bunky MRC-5 boli naočkované s použitím 4 x 10^ buniek/150 cm^ a boli pestované celkom 3 dni v Eaglovom základnom prostredí, doplnenom Earlovou zmesou solí, EBME sa prítomnosti 10 % fetálneho teľacieho séra, FCS. Po dosiahnutí takmer spojitej vrstvy buniek s hustotou pri blížne 2 x lí)6 buniek/150 cm2 sa k bunkovému materiálu pridá čerstvé prostredie EBME, doplnené 2 % FCS alebo 10 % FCS. V tomto okamihu sa nechajú bunky, takmer tvoriace spojitú vrstvu ďalej rásť v neprítomnosti alebo v prítomnosti infikujúceho VZV pri MOI 1 : 125 a sleduje sa zvýšenie hustoty buniek a výťažok vírusu po 48 hodinách. Bolo dokázané, že sa hustota neinfikovaných buniek s použitím 2 % FCS zvýšila len o 33 %, zatiaľ čo hustota buniek, rastúcich v prítomnosti 10 % FCS sa zvýšila o 92 %. Hustota buniek v infikovaných kultúrach sa nezvýšila. Ako je zrejmé z tabuľky I, výťažky vírusu s použitím takmer spojitej vrstvy buniek neboli ovplyvnené replikáciou v kultúrach, či už tieto kultúry boli doplnené malým množstvom 2 % FCS alebo maximálnym množstvom 10 % FCS.

Iné bunkové kultúry boli pestované ďalšie dva dni v prítomnosti 10 % FCS až do hustoty približne 20 x 10^ buniek/150 cnA to znamená až do vytvorenia celkom spojitej vrstvy a potom bolo pridané čerstvé prostredie EBME, doplnené 2 % FCS alebo 10 % FCS a bunkový materiál bol infikovaný VZV pri MOI 1 : 125 alebo nebol infikovaný. Vzostup hustoty buniek a výťažok vírusu bol sledovaný po ďalších 48 hodinách. Bolo dokázané, že hustota neinfikovaných buniek v prostredí s obsahom 2 % FCS sa nezvýšila, zatiaľ čo hustota buniek v prostredí s obsahom 10 % FCS sa zvýšila o 15 %. Znamená to však, že v žiadnom prípade už nedošlo k väčšej replikácii buniek. Výťažky vírusu v prostredí s obsahom 2 % FCS a 10 % FCS boli podobné a výťažok bol zvýšený približne trikrát v porovnaní s výťažkom vírusu z buniek, infikovaných po vytvorení takmer spojitej vrstvy, ako je zrejmé z tabuľky I. To potvrdzuje výhodu použitia práve vytvorenej spojitej vrstvy v porovnaní s použitím takmer spojitej vrstvy buniek, pri ktorej ešte dochádza k replikácii na dosiahnutie optimálneho výťažku bezbunkového vírusu VZV.

Tabuľka I stav buniek v čase infekcie	%FCS počas rastu vírusu	bezbunkový materiál PFU/ml, pokus	replikáda buniek pri raste vírusu
A	B
takmer spojitá	2	44 000	30 000	33%
vrstva	10	33 000	27 OOO	92%
čerstvo spojitá	2	119000	117 000	0%
vrstva	10	123 000	100000	1FÍ5

Príklad 3

Porovnanie výťažku VZV použitím čerstvo vytvorenej spojitej vrstvy a staršej kultúry so spojitou vrstvou

Trepacie fľaše s plochou kultúry 850 crr|2 boli naočkované bunkami MRC-5 v koncentrácii približne 26 500 buniek/ml. Všetky bunky boli pestované v prostredí EBME s obsahom 10 % objemových fetálneho teľacieho séra, FCS iQ v atmosfére s obsahom 5 % oxidu uhličitého pri teplote 35 °C. Fľaše boli rozdelené do dvoch skupín v závislosti od času infekcie vírusom VZV. Bunkový materiál v skupine I bol pestovaný 5 dní, po tomto čase sa vytvorila spojitá vrstva. Prostredie bolo odstránené a bunky boli infikované VZV, viazaným na bunkový materiál s použitím MOI 1 : 125, bola použitá suspenzia buniek v prostredí a bunkový materiál bol inkubovaný ešte ďalších 48 hodín pred infekciou vírusom, viazaným na bunkový materiál pri použití hodnoty MOI 1 : 125.

Produkcia VZV kultúrou v skupine I a II bola stanovená nasledujúcim spôsobom. Živné prostredie bolo z fliaš odstránené a bunkový materiál bol premytý fyziologickým roztokom chloridu sodného s fosfátovým puftom, mechanicky oddelený pomocou sklenených guľôčok v rovnakých objemoch stabilizačného roztoku a roztoky boli ochladené na 4 °C. Ochladené suspenzie boli rozrušené ultrazvukom. Bunková drvina bola odstránená odstredením pri nízkej rýchlosti, 10 minút pri 325 g a supematant s obsahom vírusu bol uchovaný. Produkcia VZV bola meraná uvedenou skúškou na tvorbu plakov. Ako je uvedené v tabuľke 2, bolo možné dosiahnuť približne dvojnásobné zvýšenie výťažku vírusu v prípade, že boli infikované vírusom bunky, ktoré práve vytvorili spojitú vrstvu.

Tabuľka 2 stav buniek	pokus 1 PFU/ml	pokus 2 PFU/ml
čerstvá spojitá vrstva	121 000	190 000
staršia spojitá vrstva	82 000	85 000

Príklad 4

Vplyv objemu živného prostredia na výťažok VZV v PFU/ml miliónov buniek MRC-5 bolo naočkovaných do objemu 125 ml prostredia EBME s obsahom 10 % FCS, 50 pg/ml neomycínu a 2 mM L-glutamínu v trepacích fľašiach s plochou 850 cm2 a materiál bol inkubovaný 3 dni pri teplote 35 °C. Potom bolo pridaných 300 ml čerstvého živného prostredia a kultúry boli inkubované ešte 4 dni pri teplote 35 °C. Potom bolo prostredie odstránené a nahradené 125 alebo 425 ml prostredia EBME s obsahom 2 % FCS, inaktivovaného teplom, 50 pg/ml neomycínu a 2 mM L-glutamínu. Potom bol pridaný bunkový materiál MRC-5, infikovaný VZV pri MOI približne 1 : 125, kultúry boli ďalej inkubované 46 hodín pri teplote 35 °C v atmosfére s obsahom 5 % oxidu uhličitého. Potom bolo prostredie odstránené, bunkový materiál bol štyrikrát premytý vždy 100 ml PBS a potom mechanicky pomocou sklenených guľôčok uvoľnený do 43 ml stabilizačného roztoku. Potom bol materiál zmrazený na -70 °C. Bezbunkový virus bol pripravený pôsobením ultrazvuku. Množstvo infekčného vírusu v materiáli po pôsobení ultrazvuku, vyčereného odstredením bolo merané uvedenou metódou sledovania tvorby plakov.

Výsledky : objem prostredia v ml	VZV v	PFU/ml^x
125	55 000,	45 000
425	153 000,	103 000

^x Sú uvedené výsledky z dvoch kultúr

Je teda možné uzavrieť, že použitím väčšieho objemu živného prostredia je možné dosiahnuť dvojnásobný výťažok infekčného vírusu VZV z bunkových kultúr buniek MRC-5.

Príklad 5

Vplyv použitého MOI VZV na výťažok VZV v PFU/ml

Trepacie fľaše boli naočkované bunkami MRC-5 a materiál bol pestovaný až do vytvorenia spojitej vrstvy buniek. Potom bolo rastové prostredie odstránené a bunkový materiál bol infikovaný s použitím VZV s rôznou hodnotou MOI. Produkcia VZV infikovanými bunkovými kultúrami bola sledovaná metódou tvorby plakov pri periodickej izo9 lácii buniek rovnakým spôsobom ako v príklade 1. Ako je zrejmé z tabuľky 3 a z obr. 5, bolo možné izolovať väčšie množstvo infekčného vírusu VZV v kratšom čase inkubácie v prípade použitia vyšších hodnôt MOI. Maximálne hodnoty antigénov bolo možné pri použití vyšších hodnôt MOI dosiahnuť rýchlejšie. Pri veľmi nízkych hodnotách MOI, napríklad 1 : 625 dochádza k tvorbe antigénu neskoršie a jeho množstvo nie je optimálne, ako je zrejmé z obr. 6.

Tabuľka 3

Vplyv hodnoty MOI na výťažok bezbunkového VZV s použitím bunkovej kultúry MRC-5 v spojitej vrstve

MOI 42 h 60 h	22 h	titer bezbunkového vírusu PFU/ml x 10-3 okamih izolácie	VZV 37 h
1:25	100	450	50	nd*
1:125	nd	150	325	100
TB25	M	ŕid	—twj—	---9U----
^x nd = nebolo stanovené

Príklad 6

Zvýšená stabilita VZV v stabilizačnom roztoku pri -20 °C

Infikované bunkové kultúry boli spracované ultrazvukom v prostredí SPGA a premyté fyziologickým roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom. Vírus, viazaný na bunkový materiál bol potom uvoľnený ultrazvukom a bunková drvina bola odstránená odstredením. Koncentrácia bezbunkového vírusu bola upravená na známu hodnotu PFU/ml a podiely vírusu v prítomnosti stabilizátora boli lyofilizované a uložené pri teplote 4 °C alebo -20 °C. Po jednomesačných intervaloch počas celkom 14 mesiacov boli vzorky rekonštituované a bol stanovený zvyšný obsah vírusu v PFU/ml. Výsledky tohto pokusu sú znázornené na obr. 3.

Z výkresu je zrejmá výhodnosť skladovania vírusu pri teplote -20 °C v porovnaní so skladovaním pri 4 °C.

Príklad 7

Vplyv množstva a času pridania sacharózy pred infekciou buniek na konečný výťažok VZV

1. Fáza očkovania a počiatočného pestovania buniek ml buniek MRC-5 bolo naočkovaných v koncentrácii 120 000 buniek/ml, celkom 600 000 buniek na platne s priemerom 60 mm v prostredí EBME s obsahom 10 % FCS, 50 pg/ml neomycínu, 2 mM L-glutamínu a potom bol bunkový materiál inkubovaný pri teplote 35 °C v atmosfére s obsahom 5 % oxidu uhličitého.

2. Fáza bunkového rastu pred infekciou

Bunkový materiál vytvoril spojitú vrstvu buniek 3 dni po naočkovaní. Živné prostredie bolo odsaté zo 48 platní a bolo nahradené vždy 8 ml rastového živného prostredia, ktorým bolo prostredie EBME alebo SRFE-2, doplnené 10 % FCS, 50 μΐ/ml neomycínu, 2 mM L-glutamínu a 0,2 mg/ml lipidu zo sójových bôbov v 1 mg/ml BSA, do živného prostredia bolo okrem toho pridaných 50 mM sacharózy, kontrolné kultúry boli ponechané bez sacharózy. Po pridaní čerstvého rastového prostredia bol bunkový materiál inkubovaný ďalšie 3 dni pri teplote 35 °C v atmosfére s 5 % oxidu uhličitého.

3. Infekcia VZV

Z platní bolo odstránené živné prostredie a bolo nahradené 8 ml prostredia EMEM namiesto prostredia EBME a 8 ml prostredia SRFE-2 namiesto prostredia SRFE-2 s li pidmi zo sójových bôbov. Obsah FCS bol znížený na 2 % pri všetkých platniach, ale ostatné doplnky, to znamená neomycín, glutamín a sacharóza boli použité rovnako ako v rastovej fáze. Do každej platne potom bolo pridaných 333 μΐ buniek, infikovaných VZV v zriedení 1 : 16, to znamená 47 000 PFU/ml v prostredí EMEM s 2 % FCS, neomycínom a glutamínom.

Replikácia vírusu VZV bola udržiavaná 2 dni pri teplote 35 °C v atmosfére s 5 % oxidu uhličitého a potom bolo odstránené živné prostredie vždy z dvoch platní s rozdielnymi podmienkami. Bunkový materiál bol štyrikrát premytý PBS, bunkový materiál bol uvoľnený do 1,2 ml ľadového roztoku stabilizátora z každej platne a materiál, uvoľnený vždy z dvoch platní bol spojený do kónických skúmaviek pre odstredivky s objemom 50 ml a zmrazený na-70 °C.

Ten istý postup, aký bol opísaný, bol použitý vždy pre dve platne, pestované za rôznych podmienok tretieho, štvrtého a piateho dňa po infekcii VZV a spojený materiál vždy z dvoch platní bol uložený pri -70 °C.

Každý materiál, pripravený uvedeným spôsobom sa neskoršie nechal roztopiť, bol spracovaný ultrazvukom v ľade počas 30 sekúnd v každej zo skúmaviek a potom bol materiál vycerený odstredením pri 1000 x g celkom 10 minút pri 4 °C. Podiely supematantov potom boli odobrané na skúšku na tvorbu plakov. Výsledky tejto skúšky, vykonávanej rovnakým spôsobom ako v príklade 1, sú uvedené na obr. 1.

Údaje, ktoré sú uvedené na obr. 1 potvrdzujú niekoľko skutočností:

1. Inkubácia buniek pred infekciou v prostredí s obsahom 50 mM sacharózy môže veľmi priaznivo ovplyvniť konečný výťažok N7N. V prostredí EMEM a SRFE-2 boli výťažky VZV vyššie v prípade, že bunkový materiál bol pred infekciou pestovaný v prítomnosti sacharózy. V čase 72 hodín po infekcii bol výťažok VZV pri bunkách v prostredí SRFE-2 s obsahom sacharózy približne 16X vyšší než výťažok VZV pri bunkách, pestovaných v minimálnom živnom prostredí bez sacharózy, výťažky sú uvedené v PFU.

2. Pestovanie buniek v bohatom živnom prostredí SRFE-2 s lipidmi zo sójových bôbov v priebehu rastu buniek a SRFE-2 v priebehu rastu vírusu má priaznivý vplyv na výťažok VZV, v spojení s použitím sacharózy umožní toto opatrenie získať množstvo VZV, ktoré je o rád vyššie než bez týchto opatrení. To znamená, že vplyv bohatého prostredia je synergické za pôsobenia sacharózy.

3. Čas izolácie vírusu VZV je veľmi významným faktorom. Aj za optimálnych podmienok pestovania buniek v prostredí SRFE-2 s použitím sacharózy a podobne, nie je najvyšší výťažok dosiahnutý 48 hodín po infekcii. V tomto čase je možné dosiahnuť len štvornásobný vzostup v porovnaní s pestovaním buniek v minimálnom živnom prostredí. Ale v čase 72 hodín po infekcii je možné dosiahnuť až šesťnásobok celkového množstva VZV.

V jednotlivých pokusoch nebol výťažok vírusu o toľko vyšší v prípade, že 50 mM sacharózy bolo pridaných v čase infekcie a nie 72 hodín pred infekciou. Tieto pokusy ukazujú na dôležitosť ďalšieho pestovania buniek pred infekciou tak, aby mohlo dôjsť k nahromadeniu sacharózy vnútri buniek. Bolo tiež dokázané, že pridanie 25 mM alebo 100 mM sacharózy má menej priaznivý vplyv než pridanie 50 mM sacharózy. Tie isté približné koncentrácie platia aj pri použití laktózy, cellobiózy alebo maltózy.

Príklad 8

Vplyv celého radu optimalizovaných parametrov postupu na celkový výťažok VZV

Pokusy boli vykonávané v trepacích fľašiach tak, aby bolo možné stanoviť vplyv rôznych zmien, vykonaných v celkovom postupe, napríklad zmien v živnom prostredí, doplnenie prostredia sacharózou, pridanie chloridu amónneho k stabilizátoru, uvoľnenie vírusu z buniek homogenizáciou alebo pôsobením ultrazvuku na celkový výťažok bezbunkového vírusu v jednotkách PFU. Kultúry boli založené s použitím 80 x 10³ buniek/ml v 125 ml EBME s 10 % FCS na jednu trepaciu fľašu. Potom bolo živné prostredie upravené na množstvo 425 ml s použitím EBME alebo SRFE s lipidom zo sójových bôbov a infikované VZV v 120 (malý objem) alebo 425 (vysoký objem) ml prostredia EMEM alebo SRFE bez lipidu zo sójových bôbov. Časové údaje pre zmeny prostredia a pre čas infekcie boli rovnaké ako v príklade 7. V rôznych časoch pred infekciou, 96 alebo 24 hodín pred infekciou alebo v čase infekcie bola pridaná sacharóza (suc) v množstve 50 mM. Do kultúr, do ktorých bola pridaná sacharóza pred infekciou, bola pridaná sacharóza spolu s infikujúcim vírusom. Všetky kultúry boli infikované s použitím MO1 1:15 pomocou buniek, infikovaných vírusom, 46 hodín po infekcii boli kultúry uvoľnené do stabilizačného roztoku s obsahom 20 mM chloridu amónneho (N) alebo do prostredia bez akejkoľvek prísady. Všetky vzorky boli zmrazené na -70 °C a vírus bol z buniek uvoľnený pôsobením ultrazvuku alebo homogenizáciou. Všetky vzorky boli vycerené odstredením 10 minút pri 1000 x g.

Výťažok vírusu vo vzorkách, spracovaných ultrazvukom, vyjadrené v PFU, viedol k nasledujúcim záverom:

1. Použitie väčšieho objemu živného prostredia vedie v prípade prostredia EMEM k dvojnásobnému zvýšeniu výťažku vírusu. Použitím prostredia SRFE je možné optimálny výťažok vírusu dosiahnuť už pri nižšom objeme živného prostredia. V niektorých prípadoch došlo dokonca pri použití väčšieho objemu živného prostredia k zníženiu výťažku.

2. Prítomnosť chloridu amónneho nie je pre vysoký výťažok VZV v PFU kritickým faktorom.

3. Prítomnosť sacharózy zvyšuje výťažok vírusu v PFU dvojnásobne s použitím prostredia EBME/EMEM a päťnásobne v prostredí SRFE. Je zrejmé, že je tiež dôležité, v akom čase sa pridá sacharóza. V ďalších pokusoch bolo dokázané, že množstvo PFU bolo 94 x 10³ pre kultúry, pestované v prostredí SRFE + sójový lipid/SRFE bez sacharózy a 296 x 10³, 427 x 10³ a 671 x 10³ v prípade kultúr, do ktorých bola sacharóza pridaná v okamihu infekcie, 24 hodín pred infekciou a 96 hodín pred infekciou.

4. Pri kultúrach, pestovaných v prítomnosti sacharózy bolo možné pozorovať podstatne menšie množstvo cytopatických účinkov než pri kultúrach, ku ktorým nebola sacharóza pridaná. V ďalšom pokuse sa pri kultúrach, pestovaných v prostredí so sacharózou, do jedného týždňa po infekcii stále ešte neprejavili degeneratívne cytopatické účinky, zatiaľ čo kontrolné kultúry bez sacharózy boli už celkom rozrušené. Je preto možné, že bunkový materiál v prítomnosti sacharózy môže nahromadiť väčšie množstvo VZV vo forme antigénu a najmä ako PFU pri predĺženom inkubačnom čase, zvlášť viac než 46 hodín v prípade trepacích fliaš.

5. Hodnota MO1 nebola v tomto pokuse upravovaná pre vyššie koncentrácie buniek v čase infekcie v prostredí SR

FE. To znamená, že by bolo možné získať ešte vyššie výťažky PFU v prípade, že by tento parameter bol optimalizovaný.

Príklad 9

Výťažok bezbunkového VZV s použitím mechanického strihu, ultrazvuku a kombinácie týchto postupov

Boli vykonané pokusy vo veľkom meradle, s použitím rôznych podmienok na produkciu VZV, podmienky boli menené podobným spôsobom ako v príklade 8. V tomto pokuse bol navyše analyzovaný ešte vplyv ďalšieho parametra, ktorým bol spôsob rozrušenia buniek. Výsledky týchto pokusov budú ďalej uvedené porovnaním výťažkov bezbunkového VZV pri samotnej homogenizácii, samotnom pôsobení ultrazvuku a v prípade kombinácie homogenizácie (Dounce) a pôsobenia ultrazvuku. Podmienky produkcie VZV, tak ako sú uvedené, sú zhrnuté pre bunkový materiál, pestovaný v minimálnom prostredí EBME/EMEM alebo pri vysokom prívode živín, SRFE-2 so sójovými lipidmi/SRFE-2 s 50 mM sacharózy v období pred infekciou. Bunkový materiál bol pestovaný a izolovaný rovnakým spôsobom ako v príklade 8 a hodnoty PFU/ml pre VZV boli stanovené skúškou podľa príkladu 1. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4

Množstvo bezbunkového vírusu v PFU/ml x 10³

prostredie	Dounoe	ultrazvuk + Dounce	celkom	len ultrazvuk
EBME/EMEM	42	7	49	36
EBME/EMEM	64	4	66	46
SRFE-2-*-secheróza 154	47	201	42

Z uvedených údajov je zrejmé, že maximálne zvýšenie VZV je možné dosiahnuť v prípade, že sa mechanické strihové namáhanie pri rozrušovaní bunkového materiálu kombinuje s pôsobením ultrazvuku.

Príklad 10

Použitie prostredia SRFE-2 a lipidu zo sójových bôbov ako doplnkov na dosiahnutie výťažku živého vírusu ako vakcíny z buniek MRC-5

Bunky MRC-5 boli naočkované do T-fliaš s plochou 25 cm² s použitím prostredia EBME a kultúra bola inkubovaná tri dni pri teplote 35 °C. Potom bolo živné prostredie odstránené a nahradené 12,5 ml čerstvého prostredia EMEM alebo prostredím SRFE-2 s 10 % FCS, neomycínom, glutamínom a do prostredia buď nebol pridaný žiadny lipid, alebo bol lipid pridaný v pomere 1 : 200. Kultúry boli inkubovaná ešte tri dni pri teplote 35 °C. Potom bolo prostredie odstránené a boli pridané bunky MRC-5, infikované VZV a 12,5 ml 2% fetálneho teľacieho séra a neomycin a glutamín v prostredí EMEM alebo SRFE-2. Kultúry, označené SRFE-2 boli pestované v prostredí SRFE-2 pred infekciou a po infekcii. Kultúry SRFE + soy označujú vzorky, ktoré boli pestované v prostredí SRFE-2 so sójovým lipidom v zriedení 1 : 200 pri pestovaní buniek, ale len v prostredí SRFE-2 po infekcii vírusom. Po 48 hodinách pestovania bolo živné prostredie odstránené, bunkový materiál bol štyrikrát premytý vždy 5 ml PBS a potom boli bunky uvoľnené v 1,2 ml stabilizátora. Vzorky z dvoch fliaš boli spojené a zmrazené na teplotu -70 °C. Po roztopení bol bunkový materiál rozložený ultrazvukom, vyčerený odstredením 10 minút pri 1000 x g a supematanty boli zmrazené na -70 °C na stanovenie infekčného titra vírusu. Výsledky sú znázornené na obr. 4. Je možné uzavrieť, že pro použití prostredia SRFE-2 namiesto EMEM došlo k 2,5-násobnému vzostupu výťažku živého vírusu. Pri použití lipidu zo sójových bôbov v prostredí SRFE-2 v priebehu rastu kultúry bolo možné dosiahnuť ďalšie 2,7-násobné zvýšenie výťažku vírusu, celkom teda bolo dosiahnuté sedemnásobné zvýšenie v porovnaní s použitím prostredia EMEM.

Príklad 11

Kompetitívna skúška ELISA na kvantitatívne stanovenie antigénu VZV

Vzhľadom na to, že skúška na tvorbu plakov vírusom je náročná na čas, nie je vhodná na kontrolu priebehu postupu. Rýchla skúška ELISA na antigén VZV dovoľuje meranie množstva antigénu VZV a tým sledovanie rastu vírusu v priebehu výroby živej vakcíny VZV. Okrem toho je tento postup možné použiť na stanovenie antigénu VZV vo vyčerenej vakcíne po pôsobení ultrazvuku a potenciálne aj na stanovenie antigénu v naplnených lyofilizovaných vzorkách vo fľaštičkách. Tento postup sa vykonáva tak, že sa antigén VZV zo vzorky inkubuje s antisérom proti N7N v roztoku. Zvyšná voľná protilátka sa nechá viazať na antigén VZV, imobilizovaný na mikrotitračných platniach ELISA. Množstvo protilátky, ktoré sa viaže na platne, je nepriamo úmerné množstvu antigénu v skúmanej vzorke. Protilátka, ktorá sa viaže na platne sa kvantitatívne stanoví reakciou s enzymaticky viazanou ľudskou protilátkou proti tejto protilátke a príslušným substrátom za vzniku farebného produktu, ktorý je potom možné stanoviť kvantitatívne spektrofotometricky.

Pri skúške ELISA na antigén VZV a pri skúške na tvorbu plakov VZV by všeobecne mali byť získané podobné výsledky, je však potrebné uvážiť, že pri skúške na prítomnosť antigénu VZV sa dokazuje neživý aj životaschopný VZV. Vzhľadom na to, že odpoveď imunitného systému, vytvorená s použitím živého atenuovaného vírusu, je skúška na tvorbu plakov kritickou skúškou, ktorou je jedine možné stanoviť dávku vírusu vo vakcíne s obsahom VZV. Ale skúška na antigén je tiež cenná vzhľadom na to, že touto skúškou je možné merať celkové zaťaženie príjemcu vakcíny antigénom.

Vykonanie postupu

L Platne ELISA sa opatria povlakom glykoproteínu (gp) z buniek MRC-5, neinfikovaných alebo infikovaných VZV a potom sa prevrstvia 1% sérom albumínu hovädzieho dobytka (frakcia V, šarža A-9647, Sigma) v 0,1% NaN₃ na zníženie nešpecifickej absorpcie protilátok na platne. Striedavo sa jednotlivé rady opatria povlakom VZV alebo kontrolného antigénu, to znamená, že na rady A, C, E a G sa nanesie VZV gp a na rady B, D, F a H sa nanesie neinfekčný MRC-5 gp ako antigén.

2. Antigén, vyčerený odstredením 1 minútu pri 3250 g sa ako skúmaná vzorka zriedi stabilizátorom v skúmavkách s rozmerom 12 x 75 mm alebo v mikroskúmavkách. Štandardný preparát vírusového antigénu (26 jednotiek/ml antigénu VZV pri blotovej skúške), sa zriedi 1:10a potom sériovo vždy v pomere 1 : 1,25, čím sa získajú koncentrácie antigénu 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1, 0,9 jednotiek/ml. Ďalšie riedenie je možné vykonať až na 0,7 a 0,5 jednotiek/ml. Tento zrieďovací rad sa používa na získanie štandardnej krivky pri meraní množstva antigénu v skúšobných vzorkách.

3. Ľudské sérum proti VZV sa zriedi stabilizátorom na dvojnásobok požadovaného konečného riedenia.

4. 300 mikrolitrov zriedeného antigénu sa pridá do mikroskúmaviek a tam sa zmieša s 300 μΐ zriedeného séra proti VZV a zmes sa inkubuje 15 až 22 minút pri teplote 35 “C. Kontrolná vzorka obsahuje ľudskú protilátku proti VZV a riedidlo bez antigénu.

5. Podiely 100 μΐ z každej zmesi séra a antigénu sa pridajú k dvom vyhĺbeninám, opatreným povlakom glykoproteínu VZV (VZV gp) a k dvom vyhĺbeninám, opatreným povlakom MRC-5 gp, použijú sa teda štyri vyhĺbeniny na jednu vzorku (napríklad vzorka 1 v stĺpci 1, radu A, B, C a D, vzorka 2 v stĺpci 2, radu A, B, C a D a podobne).

6. Platne sa inkubujú počas 15 ± 1 minúta pri teplote 35 °C tak, aby sa voľná protilátka, ktorá nevytvorila komplex s antigénom v roztoku, mohla viazať na vírusový antigén, imobilizovaný na platniach.

7. Nenaviazaná protilátka sa odstráni premytím a do vyhĺbeniny sa pridá kozia protilátka proti ľudskému IgG, konjugovaná s alkalickou fosfatázou na dôkaz ľudskej protilátky.

8. Zmes sa inkubuje počas 15 ± 1 minúta pri teplote 35 °C a nenaviazaný konjugát sa dokáže tak, že sa zmes inkubuje 15 minút pri 35 °C s p-nitrofenylfosfátom ako substrátom, rozpusteným v dietanolamínovom pufri.

9. Po skončení reakcie so substrátom sa pridá 50 μΐ 3 M hydroxidu sodného do každej vyhĺbeniny a vznik zafarbenia sa kvantitatívne stanoví spektrofotometrom na odčítanie na mikroplatniach, stanoví sa optická hustota pri 405 nm.

Výpočty a interpelácie výsledkov

Vypočíta sa priemer z radu hodnôt optickej hustoty pre určitý počet vyhĺbenín, opatrených povlakom VZV a MRC-5. Skúsenosť ukázala, že optická hustota OD pre MRC-5 sa v rôznych vzorkách a riedeniach príliš nelíši. Z tohto dôvodu sa vypočíta priemer hodnôt MRC-5 na celú platňu a táto hodnota sa použije na opravy na nešpecifickú väzbu primárnej protilátky alebo konjugátu v extraktoch neinfikovaných buniek. Priemerná OD pre MRC-5 sa odčíta od priemerných hodnôt OD pre VZV, čím sa získajú špecifické hodnoty optickej hustoty, deltaOD pre VZV.

Príprava štandardnej krivky na stanovenie množstva antigénu :

Hodnoty deltaOD zo štandardnej krivky sa vynášajú proti známym koncentráciám antigénu v jednotkách VZV/ml. Údaje sa zanesú do príslušného grafického programu (napríklad Cricket Graph, verzia 1.3, Cricket Software Malvem, PA), lineárna časť krivky sa identifikuje (musí obsahovať najmenej štyri body) a týmto spôsobom sa získa rovnica pre priamku y = a + bx.

Výpočet množstva antigénu zo skúmaných vzoriek :

Hodnoty pre a a b sú udané v rovnici pre priamku a y (deltaOD) je známe. Zvyšná neznáma hodnota x je hodnota pre antigén v jednotkách/ml a je možné ju vypočítať a uskutočniť opravu na riedení vzorky na získanie koncentrácie antigénu v neriedenej vzorke. Ďalej je uvedený spôsob výpočtu pre vzorku :

Uvádzaná koncentrácia antigénu je koncentrácia, získaná pre najmenej zriedenú vzorku pri hodnote deltaOD v lineárnej časti štandardnej krivky.

Výpočet:

vzorka antigénu	riedenie	deltaOD	jednotky/ml antigénu	jednotky/ml
riedenie A	1:2	Y	z rovnice priamky x = ív-aVh	oprava na x (faktor yriedenia)

Príklad 12

Skúška ELISA na antigén VZV a porovnanie s výťažkom VZV, uvedeným v PFU

Vzorky bezbunkového VZV z príkladu 7, pre ktorý je výťažok v PFU/ml uvedený na obr. 1, boli skúmané skúškou ELISA na prítomnosť antigénu VZV podľa príkladu 11. Výsledky týchto skúšok sú uvedené na obr. 2.

Je nutné uviesť, že množstvo antigénu VZV stúpa počas 96 hodín napriek tomu, že podľa údajov z obr. 1 sa hodnota PFU/ml už znižuje. Je teda nutné uviesť, že hodnoty pre VZV v prostredí SRFE-2 s lipidom zo sójových bôbov a so sacharózou nie sú nikde šesťnásobkom hodnoty pre antigén v prostredí EMEM, ako je znázornené na obr. 2, napriek tomu, že hodnoty pre životaschopný bezbunkový vírus VZV v PFU/ml sú takto zvýšené, ako je zrejmé z obr. L Z tohto porovnania je zrejmé, že sacharóza spôsobuje práve zvýšenie množstva životaschopného vírusu N7N počas 72 hodín po infekcii bunkového materiálu vírusom.

Príklad 13

Urýchlenie rastu buniek MRC-5 s použitím prostredia SRFE-2 s lipidom zo sójových bôbov

Kultúra buniek MRC-5 bola naočkovaná do T-fliaš s plochou 25 cm^ s hustotou 53 000 buniek/ml s použitím

12,5 ml prostredia EBME s 10 % FCS, 50 pg/ml neomycínu a 2 mM L-glutamínu a potom bola kultúra inkubovaná pri teplote 35 °C. Po 2 až 3 dňoch bolo živné prostredie odstránené a nahradené (výmena 2) 12,5 ml čerstvého prostredia alebo prostredím SRFE-2 s obsahom 10 % FCS, 50 μg/ml neomycínu, 2 mM L-glutamínu a rôznych množstiev lipidu zo sójových bôbov. Neriedené lipidy zo sójových bôbov obsahovali 20 mg/ml lipidu a 100 mg/ml sérového albumínu hovädzieho dobytka.

Prostredie bolo odstránené 6 dní po naočkovaní kultúry a bolo nahradené 12,5 ml prostredia EMEM s 2 % FCS, 50 pg/ml neomycínu a 2 mM L-glutamínu alebo prostredím SRFE-2 s rôznym množstvom lipidov zo sójových bôbov. Bunkový materiál bol z vybraných fliaš uvoľnený trypsínom a bunky boli spočítané v hematocytometri. Po ďalších dvoch dňoch pestovania bol určený počet buniek aj v ostatných kultúrach, výsledky týchto skúšok sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 5.

Poznámky k tabuľke: Výmena prostredia 1 : prostredie bolo nahradené uvedeným prostredím, doplneným 10 % FCS 2 až 3 dni po založení kultúry.

Výmena prostredia 2 : prostredie bolo nahradené uvedeným prostredím, doplneným 2 % FCS 6 dní po založení kultúry.

ND = nebolo stanovené

Tabuľka 5

Zvýšenie hustoty MRC-5 s použitím živného prostredia SRFE s lipidmi zo sójových bôbov

prostredie	pokus 1	pokus 2
EMEM (E)	2.3	1.5
SRFE (S)	4,0	3,a
S+ 1:100 lipidy	ND	7,6
S +1:200 lipidy	7,9	7,6
S +1:500 lipidy	5.9	3,7
S+ 1:2000 lipidy	5,0	3,8

Je teda možné uzavrieť, že pri použití prostredia SRFE-2 bez doplnenia lipidmi sa približne dvojnásobne zvýši počet buniek v porovnaní s použitím prostredia EMEM. Výťažok buniek je možné ďalej zvýšiť doplnením živného prostredia lipidmi zo sójových bôbov, a to v závislosti od dávky týchto lipidov. Maximálny výťažok buniek bol dosiahnutý s použitím kombinácie živného prostredia SRFE-2 a lipidov v rozmedzí približne 200 až 400 pg/ml.

Príklad 14

Pestovanie buniek WI-38 spôsobom podľa vynálezu

Kultúra buniek WI-38 bola naočkovaná do T-fliaš s plochou 25 cm2 s použitím 53 000 buniek/ml v 12,5 ml prostredia EBME s 10 % FCS, 50 pg/ml neomycínu a 2 mM L-glutamínu a kultúra inkubovaná pri teplote 35 °C. Po 2 dňoch bolo živné prostredie odstránené a nahradené

12,5 ml prostredia SRFE-2, ktoré bolo doplnené 50 ug/ml neomycínu, 2 mM L-glutamínu a lipidom zo sójových bôbov v riedení 1 : 200. Kontrolné kultúry boli pestované v tomto istom prostredí bez lipidov zo sójových bôbov. Po piatich dňoch pestovania pri teplote 35 °C bolo prostredie odstránené, bunkový materiál bol od fliaš oddelený pôsobením trypsínu a počítaný v hematocytometri. Zvyšné fľaše boli za tých istých podmienok pestované ešte tri dni pred počítaním buniek. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 6:

Tabuľka 6

bunková línia	lipidový doplnok	bunky fflaša x 10-θ po
5 dňoch	8 dňoch
1		4,2	4.8
	+	9,5	10,2
3	-	4,1	4,9
	+	9,3	12,5

Je teda možné uzavrieť, že pri doplnení bohatého živného prostredia zo sójových bôbov sa zvýši výťažok buniek WI-38 približne dvojnásobne. Je teda možné očakávať, že s použitím tejto bunkovej línie na výrobu vírusu VZV bude možné postupovať podobným spôsobom ako pri použití kultúry buniek MRC-5.

Príklad 15

Spôsob vyhodnotenia urýchlenia rastu buniek MRC-5

Kultúra buniek MRC-5 bola založená v T-fľašiach s plochou 25 crA s použitím približne 53 000 buniek/ml v

12,5 ml základného Eaglovho živného prostredia s Earlo vou zmesou solí, EBME s 10 % FCS, 50 pg/ml neomycínsulfátu (neo) a 2 mM glutamínu (Gin). Kultúry boli inkubované 3 dni pri teplote 35 °C, po tomto čase sa zvyčajne vytvorí vrstva buniek, súvislá na 50 až 75 %. Živné prostredie sa odstráni a nahradí sa 10 až 12,5 ml živného prostredia SRFE-2 s 10 % FCS, 50 μg/ml neomycínu, 2 mM Gin a lipidom zo sójových bôbov alebo iným lipidom a kultúra sa ďalej inkubuje pri teplote 35 °C. Potom sa stanoví počet buniek v rôznych časových intervaloch tak, že sa bunkový materiál uvoľní 2,5 ml roztoku trypsínu s 0,25 % citrátu a bunkový materiál sa počíta v hematocytometri. Životnosť buniek sa stanoví ich sfarbením 0,2 % trypanovou modrou. Počet buniek sa použije na stanovenie koncentrácie buniek a tá sa potom opraví na celkový objem bunkovej suspenzie, čím sa vypočíta výťažok buniek na jednu fľašu. V niektorých pokusoch boli kultúry pestované 3 až 4 dni po výmene živného prostredia v prítomnosti 2 % FCS a počty buniek boli stanovené po inkubácii ďalšie 2 dni.

Príklad 16

Vplyv dlhodobého pôsobenia lipidu na bunkové kultúry

Kultúra buniek MRC-5 bola pestovaná v T-fľašiach s plochou 25 cm2, živné prostredie bolo prvýkrát vymenené po troch dňoch a počet buniek bol stanovený po ďalších 3 dňoch rastu. Niektoré ďalšie fľaše toho istého typu boli udržované za tých istých podmienok ešte ďalšie dva dni s tým rozdielom, že vymenené živné prostredie obsahovalo alebo neobsahovalo lipidy. Bunkový materiál bol uvoľnený pôsobením trypsínu. Výťažok buniek bol 2,6 x 10^ v prípade buniek, naočkovaných v prostredí EBME a pestovaných v EMEM, zatiaľ čo pri kultúrach, pestovaných v prostredí SRFE-2 s lipidom zo sójových bôbov v riedení 1 : 100 bol dosiahnutý počet 6,6 x 10^ a 7,7 x 1θ6 buniek. Z kultúr, pestovaných ďalšie dva dni bolo získaných 2,76 x 10*5 buniek v prostredí EBME/EMEM, zatiaľ čo s použitím EBME/SRFE-2 bez lipidov zo sójových bôbov bolo získaných 9,2 x 1 θ6 a 7,88 x 10^ buniek na jednu T-fľašu s plochou 25 cm2. S použitím prostredia EBME/SRFE-2 so sójovým lipidom, zriedeným 1 : 100 bolo získaných len 2,48 a 2,28 x 1θ6 buniek. Tieto údaje dokazujú, že pri dlhodobom pôsobení, približne 5 dni po druhej výmene živného prostredia a s použitím vysokej koncentrácie lipidov môže dôjsť aj k zníženiu výťažku buniek, pravdepodobne ich uhynutiu. To znamená, že sa zvyčajne v tejto fáze už použije bohaté živné prostredie bez lipidov. Táto výmena za bohaté prostredie bez lipidov je zvlášť dôležitá v prípade, že kultúra je infikovaná vírusom vzhľadom na to, že lipid môže byť toxický pre rast vírusu alebo pre životaschopnosť buniek v prítomnosti vírusu.

Príklad 17

Vplyv rôznych koncentrácií lipidov na rast buniek v bohatom a v minimálnom prostredí

Postupuje sa v podstate rovnakým spôsobom pri výmene prostredia aj pri počítaní buniek ako v príklade 16 s použitím buniek MRC-5. Za týchto podmienok boli získané nasledujúce výťažky buniek.

živné prostredie	celkový počet buniek MRC-5X10”⁶naT-ffaŠa dni po výmene prostredia
3	5
EBME(EMEM (3 pokusy)	4,3, 2,46, 1,52	2,94, 3,50
EBME/SRFE-2	3,80
EBME/SRFE-2-0,4 sl.		13,69, 11,09
EBME/SRFE-2 + 0,4 sl.	11,7	11,65
EBME/SRFE-2 - 0.2 sl.	5,10	8,51, 6,27
EBME/SRFE-2 + 0.2 sl.	7,62, 9.7	9,66
EBME/SRFE-2-0,1 sl.	3,52
EBME/SRFE-2 * 0,1 sl.	4,94
EBME/SRFE-2-0,04 sl.	3,10
EBME/SRFE-2 4 0,05 sl.	3,16
EBME/SRFE-2-0,01 sl.	2,90
EBME/SRFE-2 + 0.01 sl.	3.82

Poznámka : Symboly + a - za uvedením živného prostredia ukazujú na prítomnosť alebo neprítomnosť uvedeného množstva sójového lipidu (sl.) v mg/ml v živnom prostredí po druhej výmene tohto prostredia.

Uvedené údaje sú v súlade s výsledkami z príkladu 16, ktoré dokazujú, že dlhodobé vystavenie buniek pôsobeniu vysokej koncentrácie lipidov už nie je výhodné, hoci v tomto prípade je toxický účinok menej vyjadrený než v príklade 16. Pri nižšej koncentrácii lipidov je dlhodobé vystavenie buniek tejto koncentrácii menej škodlivé a môže priaznivo ovplyvniť výťažok buniek na cm2 plochy, na ktorej materiál rastie.

Príklad 18

Vplyv koncentrácie fetálneho teľacieho séra na celkový výťažok buniek

V tomto pokuse bol sledovaný vplyv pridania 2 % alebo 10 % fetálneho teľacieho séra v prítomnosti lipidov. Kultúry buniek MRC-5 boli pestované v prostredí EBME, po 3 dňoch bolo prostredie nahradené prostredím SRFE-2 s rôznym množstvom lipidov zo sójových bôbov a po ďalších 2 dňoch bolo prostredie nahradené prostredím SRFE-2 s rovnakou koncentráciou lipidov ako pri prvej výmene prostredia. Výťažok buniek v prítomnosti 10 % FCS bol 9,5, 11,3 a 12,2 x 10^ pre kultúry, doplnené 0,1, 0,2 a 0,4 mg/ml lipidu. V prípade, že boli použité 2 % FCS, boli výťažky buniek za tých istých podmienok 6,5, 8,8 a 3,2 x ÍOÔ. Tento pokus teda dokazuje priaznivý vplyv prítomnosti FCS na rast buniek pri doplnení živného prostredia lipidom. Prípadné toxické účinky zvýšenej koncentrácie lipidov na bunkový materiál sú v tomto prípade zrejme znižované dostatočným množstvom FCS.

Príklad 19

Vplyv rôzneho množstva lipidov a rôznych druhov lipidov na rast buniek MRC-5

Kultúry buniek MRC-5 boli pestované v T-fľašiach s plochou 25 cm2 v prostredí EBME. Po 3 dňoch sa živné prostredie nahradí prostredím SRFE-2 s obsahom 10 % FCS a rôznych lipidov. V uvedených koncentráciách bol použitý lipid zo sójových bôbov (Boehringer Mannheim), lipidy, bohaté na cholesterol zo séra dospelého hovädzieho dobytka (Sigma) alebo lipid Miles/Pentex EX-CYTE I alebo lipoproteín hovädzieho dobytka (Very Low Endotoxin). Počet buniek po výmene živného prostredia bol 1,19 miliónov. Po ďalších piatich dňoch bol bunkový materiál spočítaný. V prostredí EMEM bolo 2,97 miliónov buniek. V SRFE-2 alebo SRFE-2 s 0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml a 0,1 mg/ml lipidu zo sójových bôbov bolo napočítaných 4,83, 10,44, 8,67 a 8,04 miliónov buniek. S použitím lipidu EXCYTE I v riedení 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 bolo získaných 5,37, 4,80 a 4,74 miliónov buniek. S použitím EX-CYTE VLE riedenie 1 : 25, 1 : 50, 1 : 100 bolo získaných 5,49, 7,23 a 7,92 miliónov buniek. S použitím lipidov s vysokým obsahom cholesterolu (Sigma) v riedení 1 : 25, 1 : 50 a 1 : 100, bolo získaných 6,87, 7,56 a 7,65 miliónov buniek. Najvyššie zvýšenie výťažku buniek bolo dosiahnuté s použitím lipidov zo sójových bôbov (Boehringer Mannheim), napriek tomu, že prostriedok EX-CYTE VLE a lipidy s vysokým obsahom cholesterolu (Sigma) boli takmer rovnako účinné. Je teda zrejmé, že na uvedený účel je možné použiť aj iné lipidy než lipidy zo sójových bôbov.

Príklad 20

Priaznivý vplyv vysokých koncentrácií lipidov zo sójových bôbov na rast buniek MRC-5

Kultúry buniek MRC-5 boli naočkované do fliaš s plochou 25 cm^ a živné prostredie bolo vymenené po 3 a po 6 dňoch rovnako ako v príklade 13. Výťažok buniek na jednu fľašu po 6 dňoch pre prostredie EBME/EMEM, SRFE-2 so sójovým lipidom 1 : 100 alebo SRFE-2 so sójovým lipidom 1 : 50 bol 4,3, 9,7 a 11,7 miliónov buniek. Životaschopnosť buniek bola vyššia než 99 % pri všetkých kultúrach pri stanovení farbením trypanovou modrou. Potom bolo živné prostredie vymenené za prostredie ± lipid zo sójových bôbov, kultúry boli inkubované ďalšie dva dni a potom boli stanovené výťažky buniek. Výťažok buniek na fľašu v týchto kultúrach bol 2,9 a 3,5 miliónov pre kultúry, pestované v prostredí EBME/EMEM, 11,65 miliónov pre kultúry, pestované v prostredí SRFE-2 so sójovým lipidom 1 : 50, kde prostredie bolo vymenené za rovnaké prostredie, zatiaľ čo v prípade buniek, pestovaných v prostredí SRFE-2 so sójovým lipidom 1 : 50 (vždy dve vzorky) a po výmene v prostredí SRFE-2 bez sójových lipidov bolo získaných 13,69 a 11,09 miliónov buniek. S použitím prostredia SRFE-2 so sójovým lipidom 1 : 100 pri pestovaní v tom istom prostredí po výmene prostredia bolo získaných 9,66 miliónov buniek, ale v prípade, že prostredie bolo vymenené za prostredie SRFE-2 bez lipidov, bolo v dvoch vzorkách získaných 8,51 a 6,27 miliónov buniek.

Z tohto pokusu je zrejmé, že výťažok buniek MRC-5 sa zvyšoval so zvyšujúcim množstvom sójového lipidu. Maximálny výťažok bol dosiahnutý s použitím lipidu z riedení 1 : 50, vyššie koncentrácie už neboli použité. Použitie lipidov aj po výmene živného prostredia ešte mierne zvyšuje výťažok buniek, výsledky však ukazujú, že maximálny výťažok buniek je možné dosiahnuť s použitím lipidu v riedení 1 : 50 už po prvej výmene prostredia. Pri druhej výmene živného prostredia je teda možné lipid už vynechať. Vzhľadom na to, že vysoká koncentrácia lipidov môže byť škodlivá na produkciu vírusu, môže byť žiaduce lipid nepoužívať v priebehu rastu vírusu.

Claims

1. Spôsob výroby živej atenuovanej bezbunkovej vakcíny vírusu varicella zoster, vyznačujúci sa t ý m , že sa

a) pestujú bunky, ktoré môžu byť infikované vírusom varicella zoster a to ľudské diploidné bunky, až do súvislej jednovrstvovej kultúry za prívodu dostatočne vysokého množstva živín na dosiahnutie vysokého stupňa replikácie a za prívodu nemetabolizovateľného disacharidu,

b) kultúra zo stupňa a) sa infikuje v okamihu čo najbližšom vytvoreniu súvislej vrstvy buniek s použitím buniek, infikovaných vírusom v čo najvyššej vhodnej dávke,

c) infikovaná kultúra sa ďalej pestuje za prívodu vysokého množstva živín počas 22 až 96 hodín a materiál sa izoluje v okamihu najvyššej produkcie infekčného vírusu varicella zoster,

d) infikovaná kultúra sa premyje fyziologickým roztokom chloridu sodného, pripadne s obsahom lyzozomotropného činidla, napríklad chloridu amónneho alebo chlorochinu pred oddelením infikovaných buniek,

e) infikovaný bunkový materiál sa oddelí do čo najmenšieho množstva stabilizačného roztoku a bunky sa okamžite rozrušia alebo zmrazia pre neskoršie rozrušenie,

f) bunky, infikované vírusom varicella zoster sa rozrušia na optimálne uvoľnenie vírusu, spojeného s bunkovým materiálom a bunková drvina sa odstráni za vzniku bezbunkového preparátu vírusu.

2. Spôsob výroby živej, atenuovanej, bezbunkovej vakcíny vírusu varicella zoster podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že sa:

a) do vytvorenia spojitej vrstvy pestuje bunkový materiál, ktorý je možné infikovať vírusom, pričom toto pestovanie zahrnuje:

1. fázu založenia bunkovej kultúry,

2. fázu rastu buniek v čo najväčšom objeme minimálneho živného prostredia ale bo v menšom objeme prostredia s vysokým obsahom živín a

3. fázu pred infikovaním kultúry, v ktorej sa bunkový materiál vystaví pôsobeniu netoxického nemetabolizovateľného disacharidu,

b) bunkový materiál, pestovaný v stupni a) sa infikuje v okamihu, čo najbližšom vytvoreniu spojitej vrstvy pridaním buniek, infikovaných atenuovaným vírusom v čo najvyššom vhodnom počte,

c) infikovaná kultúra sa udržuje vo veľkom objeme minimálneho živného prostredia alebo v menšom objeme bohatého živného prostredia 22 až 96 hodín, do okamihu vrcholnej produkcie vírusu varicella zoster,

d) pred oddelením sa infikovaná kultúra premyje fyziologickým roztokom chloridu sodného, prípadne s obsahom lyzozomotropného činidla,

e) kultúra, infikovaná vírusom varicella zoster sa oddelí

1. odstránením kvapaliny,

2. pridaním čo najmenšieho objemu roztoku stabilizátora,

3. mechanickým alebo chemickým uvoľnením buniek, infikovaných vírusom a

4. prípadnou lyofilizáciou uvoľnených buniek, infikovaných vírusom pri teplote -70 °C,

f) uvoľnené bunky, infikované vírusom sa rozrušia na optimálne uvoľnenie vírusu, viazaného na bunkový materiál, bunková drvina sa odstráni a bezbunkový vírus sa prípadne lyofilizuje alebo sa skladuje v kvapalnej forme v zmrazenom stave.

3. Spôsob výroby živej atenuovanej bezbunkovej vakcíny vírusu varicella zoster podľa nároku 1 alebo 2, vyzná č u j ú ci sa tým, že sa vykonáva s použitím buniek MRC-5 ako buniek, ktoré je možné infikovať vírusom, ako kmeň vírusu varicella zoster sa použije kmeň Oka, kultúra sa pestuje pri teplote 30 °C až 37 °C, disacharid, ktorým je sacharóza, sa pridáva v koncentrácii 20 až 60 mM pri pestovaní kultúry pri teplote 35 °C, na infikovanie kultúry sa použije pomer buniek infikovaných vírusom varicella zoster v očkovacom materiáli k počtu neinfikovaných buniek v spojitej vrstve buniek v bunkovej kultúre v rozmedzí 1 : 25 až 1 : 625 a ako lyzozómotropná látka sa použije chlorid amónny v množstve 20 až 50 mM alebo chlorochin v množstve 230 μιηοΐ.

4. Spôsob podľa nároku laž 3, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako živné prostredie s vysokým obsahom živín použije prostredie SRFE-2, prípadne doplnené 0,02 až 0,4 mg/ml lipidov zo sójových bôbov a pomnožený vírus sa z bunkového materiálu uvoľní pôsobením ultrazvuku, homogenizáciou alebo kombináciou týchto postupov.

5. Spôsob výroby živej, atenuovanej, bezbunkovej vakcíny vírusu varicella zoster podľa hociktorého z nárokov laž 4, vyznačujúci sa tým, že sa

a) kultúra buniek MRC-5 pestuje až do vzniku spojitej vrstvy buniek, pričom toto pestovanie zahrnuje:

1. fázu založenia bunkovej kultúry v prostredí EBME,

2. fázu rastu buniek v prostredí SRFE-2, doplnenom 0,2 mg/ml lipidov zo sójových bôbov, toto prostredie sa pridáva 3 dni po založení kultúry,

3. fázu pred infekciou, v ktorej sa kultúra buniek MRC-5 vystaví počas 24 až 96 hodín pred infekciou pôsobeniu 20 až 50 mM sacharózy,

b) kultúra buniek zo stupňa a) sa infikuje v okamihu, čo najbližšom vytvoreniu spojitej vrstvy buniek pridaním buniek MRC-5, infikovaných atenuovaným vírusom v čo najväčšom vhodnom množstve,

c) kultúra, infikovaná vírusom varicella zoster sa ďalej pestuje počas 37 až 96 hodín a potom sa bunkový materiál oddelí v okamihu, kedy došlo k najvyššej produkcii vírusu varicella zoster,

d) bunková kultúra sa premyje fyziologickým roztokom chloridu sodného, obsahujúcom fosfátový pufor a prípadne doplnený ešte 1 až 100 mM chloridu amónneho alebo chlóroch inom,

e) bunky MRC-5, infikované vírusom varicella zoster sa oddelia tak, že sa

1. odstráni kvapalina,

2. pridá sa čo najmenší objem stabilizátora, prípadne obsahujúci 1 až 100 mM chloridu amónneho alebo 230 pmol chlorochínu,

3. bunkový materiál sa mechanickým alebo chemickým spôsobom oddelí a

4. uvoľnený bunkový materiál, infikovaný vírusom sa prípadne zmrazí na -70 °C,

f) uvoľnený bunkový materiál, infikovaný vírusom varicella zoster sa rozruší tak, že sa

1. homogenizuje,

2. bunková drvina sa oddelí odstredením a supematant sa uchová,

3. usadený materiál sa podrobí pôsobeniu ultrazvuku a potom sa znova odstredí a

4. supematanty zo stupňa f2) a f3) sa spoja,

g) produkt, získaný v predchádzajúcom stupni sa zriedi stabilizačným roztokom a potom sa plní do požadovaných jednotiek obsiahnutého vírusu na lyofilizáciu a skladovanie pri teplote do maximálne 4 °C tak, že pri použití je k dispozícii dávka najmenej 1000 PFU.

6. Spôsob pestovania buniek v jednoduchej spojitej vrstve, vyznačujúci sa tým, že sa

a) nádoba na pestovanie kultúry naočkuje zásobnými bunkami v minimálnom alebo bohatom živnom prostredí a kultúra sa pestuje 24 až 72 hodín,

b) z kultúry sa odstráni živné prostredie a nahradí sa čerstvým bohatým prostredím, doplneným optimalizovanou koncentráciou lipidov a pripadne doplneným ešte sérom,

c) kultúra buniek sa pestuje v bohatom prostredí, doplnenom lipidom,

d) prípadne sa prostredie zo stupňa c) nahradí čerstvým prostredím bez obsahu lipidov po 24 až 72 hodinách pestovania kultúry.

7. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako bohaté živné prostredie použije prostredie SRFE-2, prípadne doplnené fetálnym teľacím sérom, lipidy sú obsiahnuté v množstve 0,02 mg/ml a 0,4 mg/ml a pestovaným bunkovým materiálom sú bunky MRC-5, WI-38 alebo Vero.

8. Živné prostredie na pestovanie buniek v jednoduchej spojitej vrstve, vyznačujúce sa tým, že je tvorené prostredím SRFE-2, doplneným lipidmi v množstve 0,02 až 0,4 mg/ml.