DE69330850T2

DE69330850T2 - Verfahren zur Herstellung von Virusimpfstoff aus abgeschwächten Varicella Zoster Viren

Info

Publication number: DE69330850T2
Application number: DE69330850T
Authority: DE
Inventors: Paul A. Friedman; David L. Krah; Phillip J. Provost
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-05-27
Publication date: 2002-04-11
Anticipated expiration: 2013-05-28
Also published as: DE69334254D1; DK0573107T3; EP0573107B1; KR100350169B1; NO944654L; ES2161702T3; WO1993024616A1; CN1082923A; NO314068B1; YU38893A; AU4003693A; DE69330850D1; AU673167B2; HUT71863A; US5607852A; HU9403473D0; ATE419332T1; EP1097988B1; RO114906B1; CZ289690B6

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Varicella-Zoster-Virus (VZV) verursacht Windpocken und Zoster (Gürtelrose). Windpocken ist eine hochansteckende Krankheit, welche bei Personen ohne VZV-Immunität auftritt. Mehr als 90% der Bevölkerung sind ihr während der ersten zwei Jahrzehnte des Lebens ausgesetzt. Die Krankheit ist eine ernsthafte Bedrohung für immungeschwächte Personen und Erwachsene. In vielen Fällen wird VZV in Spinalganglionzellen latent. Gürtelrose, ein schmerzhafter chronischer Zustand, tritt auf, wenn VZV aus dem latenten Zustand reaktiviert wird.
Die Verhütung von Windpocken durch Impfung ist ein wünschenswertes Ziel und die Einführung einer allgemeinen Impfung in der Kindheit mit einem Lebendvakzin mit abgeschwächtem Varicella wird ins Auge gefaßt. Der Stand der Technik berichtete über die Vermehrung von VZV in verschiedenen Zellkultursystemen und die Verwendung von lebendem, abgeschwächtem, zellfreiem VZV als Vakzin. US-Patent 3,985,615 beschreibt die Herstellung des abgeschwächten Oka-Stammes von VZV, zur Verwendung als Vakzin geeignet, in primären Embryonalzellen von Meerschweinchen. US-Patent 4,008,317 beschreibt die Kultivierung einer temperatursensitiven Mutante von VZV in WI-38-Zellen zur Verwendung als Vakzin-Stabilisator. Zusammensetzungen, die sich zur Aufrechterhaltung von lebensfähigem VZV eignen, z.B. SPGA, sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt.
Die Hauptbeschränkung für die kommerzielle Herstellung eines VZV-Vakzins ist die Ausbeute an zellfreiem VZV von im Stand der Technik bekannten Zellkultursystemen. Die Ausbeuten an zellfreiem VZV werden durch die Anwendung des neuen Verfahrens dieser Erfindung um einen Faktor von etwa dem 5-20fachen verbessert.
Somit handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung um ein Verfahren zur Herstellung eines Lebendvakzins mit abgeschwächtem, zellfreiem VZV in hoher Ausbeute.
Im Stand der Technik bekannte Monoschicht-Zellkulturverfahren ergeben typischerweise etwa 80.000 bis 160.000 Zellen/cm² [Mann, Dev. Biol. Stand. 37, 149-152 (1977); Wood und Minor, Biologicals 18, 143-146 (1990)]. Die Verwendung von Monoschicht- Zellkulturen zur Produktion viraler Antigene wurde durch die eingeschränkte Dichte, zu der diese Monoschichtkulturen gezüchtet werden konnten, behindert.
Versuche zur Erhöhung der Zellkulturdichten in der Vergangenheit führten zu spezialisierten Perfusionskulturgefäßen, um die Sättigungsdichten auf etwa 1 · 10&sup6; Zellen pro cm² zu erhöhen [Mann, Dev. Biol. Stand. 37, 149-152 (1977)]. Die vorliegende Erfindung bietet ein einzigartiges Mittel zur Erhöhung von Zellausbeuten unter Verwendung vorhandener Zellkultursysteme.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit, wodurch anhaftende Zellen bis zu viel höheren Dichten als bisher möglich gezüchtet werden können und damit höhere Ausbeuten an Viren, die auf Zellmonoschichten kultiviert wurden, für die Vakzinproduktion ermöglichen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein neues Verfahren für die Monoschicht-Zellkultur. Das Verfahren erfordert die Verwendung eines reichen Kulturmediums im Gegensatz zu einem Minimalmedium und gegebenenfalls die Ergänzung des reichen Mediums mit einer optimierten Konzentration an Lipid. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung sind durch die Verwendung eines neuen Wachstumsmediums, umfassend SRFE-2-Medium, das mit etwa 0,02-0,4 g/ml Sojabohnenlipid ergänzt ist, substantielle Zunahmen der Monoschicht- Zellkulturdichte erreichbar. Die so erreichte, erhöhte Monoschicht-Zelldichte ist für die erhöhte Produktion viraler Antigene zur Herstellung eines antiviralen Vakzins von Nutzen.
Angewandt auf die Herstellung eines speziellen Vakzins, kann die vorliegende Erfindung eingesetzt werden in einem Verfahren zur Herstellung großer Mengen eines Lebendvakzins mit abgeschwächtem, zellfreiem VZV, geeignet zur Verhütung von Windpocken, welches die optimale Vermehrung von VZV in Zellkultur und das Ernten des Virus unter Bedingungen, welche die VZV-Ausbeute und -Stabilität maximieren, umfaßt. Die Schritte des optimierten Verfahrens umfassen:
a. Kultivieren von für eine VZV-Infektion anfälligen Zellen, ausgewählt aus humanen diploiden Zellen, z.B. MRC-5, bis zur Konfluenz in Monoschichtkultur unter ausreichenden Ernährungsbedingungen, um die Zellreplikation bis zur Konfluenz sicherzustellen, und Versorgen mit einem nicht-metabolisierbaren Disaccharid, z.B. Sucrose;
b. Infizieren der nach Schritt (a) bis nahe an den Punkt der Konfluenz kultivierten Zellen mit VZV infizierten Zellen;
c. Haften der VZV infizierten Kultur in einem Zustand guter Ernährung für etwa 22-96 Stunden und Ernten zum Zeitpunkt der maximalen Produktion von infektiösem VZV
d. Waschen der VZV infizierten Kultur vor dem Ernten der VZV infizierten Zellen mit einer physiologischen Lösung;
e. Ernten der VZV infizierten Zellen in ein Minimalvolumen einer Stabilisierungslösung und entweder sofortiges Aufbrechen der Zellen oder Einfrieren der Zellen für ein späteres Aufbrechen;
f. Aufbrechen der VZV-infizierten Zellen zur optimalen Freisetzung von zellassoziiertem VZV und Entfernen von Zelitrümmern, um eine zellfreie VZV-Präparation bereitzustellen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1: VZV-Ausbeuten, PFU, in mit Sucrose ergänzten Medien
Fig. 2: Ausbeuten an zellfreiem VZV-Antigen
Fig. 3: VZV-Stabilität in SPGA-Stabilisator bei -20ºC oder 4ºC
Fig. 4: VZV-Ausbeuten, PFU, erzielt unter Einsatz verschiedener Kulturmedien
Fig. 5: Wirkung der eingesetzten zellassoziierten MOI auf die Ausbeuten an zellfreiem VZV

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von Zellen in Monoschichtkultur. Die Aufgabe der Erfindung ist die Erzielung einer erhöhten Zelldichte von anhaftenden Kulturzellen. Diese Aufgabe wird erfüllt durch die Bereitstellung eines angereicherten Wachstumsmediums, gegebenenfalls mit einem Lipid ergänzt, in optimierten Konzentrationen.
Ein bevorzugtes angereichertes Medium zur Verwendung in diesem Verfahren ist SFRE-2 (von SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO, S2138 oder von Serva Fine Chemicals, Heidelberg, Deutschland 47523, im Handel erhältlich). Dieses Medium wurde von Weiss et al. [In Vitro 16 (7), 616-628 (1980)] beschrieben. Andere äquivalente Medien oder leichte Änderungen in der Zusammensetzung von SRFE-2 können auf dieselbe Weise wie hier beschrieben eingesetzt werden.
Es kann irgendeine von einer Reihe bekannter Lipid-Ergänzungen vorteilhaft in dieser Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise wurden cholesterinreiche Lipide aus Serum ausgewachsener Rinder (SIGMA CHEMICAL CO., Katalog-Nr. L-4646), EX-CYTE- Lipid I oder "Very Low Endotoxin" (VLE)-Lipid (MILES Inc., Katalog-Nrn. 82-004-7 bis 8 und 82-019-1) befunden, als Ergänzung für reiches Medium vorteilhaft zu sein. Ein bevorzugtes Lipid-Additiv ist der im Handel erhältliche Sojabohnenlipid-Extrakt, erhältlich von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis IN, Katalog-Nr. 1074482. Dieses Material, oder ein ähnliches Material, wird von Iscove und Melchers [J. al. Exp. Medicine, 147, 923-933, 1979)] als Ersatz für Serum in einer B-Lymphozytenkultur beschrieben. Es wird dort kein Hinweis darauf gegeben, daß die Sojabohnenlipid-Ergänzung zur Ergänzung eines reichen Mediums von Nutzen sein würde, noch gibt es irgendeinen derartigen Hinweis in der Produktbeschreibung des Katalogs von Boehringer Mannheim. Gemäß diesen Quellen ist das Lipid zur Verwendung als Serumersatz in Minimalmedium-Kulturen vorgesehen. Wie in dieser Erfindung verwendet, ist das Lipid eine Ergänzung für reiches Medium. Darüber hinaus wird gemäß veröffentlichten Quellen das Lipid in einer Konzentration von etwa 10-100 ug/ml eingesetzt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Lipid optimal in einer Konzentration eingesetzt werden, welche 2-3fach höher liegt als die in der Literatur oder vom Hersteller vorgeschlagenen Konzentrationen. Darüber hinaus kann die Lipid-Ergänzung, wie in dieser Erfindung verwendet, neben statt an Stelle einer Serum-Ergänzung eingesetzt werden.
Im Verfahren dieser Erfindung werden MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen, Vero-Zellen oder ein anderer zur Virusvermehrung geeigneter Zelltyp in ein Kulturgefäß ausgesät. Die anfängliche Zellaussaatphase wird entweder in einem im Stand der Technik bekannten Minimalmedium, wie z.B. EMEM oder EBME, oder in einem reichen Medium, wie z.B. SRFE-2-Medium ohne Lipid-Ergänzung, durchgeführt. Etwa 10% fötales Kalbsserum (FCS), ein Antibiotikum, wie z.B. Neomycin (etwa 50 ug/ml ist adäquat), und L-Glutamin (etwa 2 mM) können ebenfalls vorteilhaft bereitgestellt werden. Die Zellen werden bei einer zell- und virus-permissiven Temperatur, gewöhnlich etwa 34-37ºC und vorzugsweise bei etwa 35ºC, in Abhängigkeit von dem herzustellenden Virus mehrere Tage lang gezüchtet.
Nachdem sich die Zellen eindeutig angeheftet haben und in Monoschichtkultur gedeihen, wird das Minimalmedium oder angereicherte Medium entfernt und durch frisches reiches Medium ersetzt, das gegebenenfalls mit einer optimierten Konzentration an Lipid ergänzt ist.
Nach einer weiteren Wachstumsperiode kann das Medium erneut entfernt werden und durch frisches reiches Medium ohne Lipid-Ergänzung ersetzt werden. Die Bereitstellung von Lipid, nachdem die Zellen sich der Konfluenz angenähert oder diese erreicht haben, wurde als kontraproduktiv befunden und verringert die maximalen Zellausbeuten.
Wenn die kultivierten Monoschichtzellen mit einem viralen Impfgut infiziert werden sollen, wird die Lipid-Ergänzung eliminiert und das Virus-Ausgangsmaterial in einer frischen Charge von reichem Medium eingeführt. Die Abwesenheit von Lipid in dieser Neuversorgung ermöglicht ein ausgedehntes Zellwachstum ohne das oben erwähnte Problem einer lipid-induzierten Zellverminderung.
Bei Befolgung des oben beschriebenen Verfahrens werden substantielle Erhöhungen der Zell- und Virusausbeute erzielt. So wird für ein auf MRC-5-Zellen gezüchtetes Varicella-Virus im Vergleich dazu, wenn MRC-5-Zellen in Minimalmedium oder nur SRFE-2-Medium gezüchtet werden, eine substantielle Erhöhung der PFU-Ausbeute von VZV erzielt. Gleichermaßen wachsen WI-38-Zellen, welche für die Varicella-Züchtung oder die Rötelnvirus-Produktion geeignet sind, zu substantiell höheren Dichten, wenn sie nach diesem neuen Verfahren kultiviert werden.
Angewandt auf die Herstellung eines speziellen Vakzins, umfaßt das neue Verfahren dieser Erfindung die Vermehrung von VZV in Zellkultur und das Ernten des resultierenden VZV unter Bedingungen, welche die Virusausbeute und -stabilität optimieren. Die für die Produktion von VZV offenbarten Vorteile werden auf die Produktion anderer umhüllter Viren, einschließlich anderer Herpes-Viren als VZV, Masern, Mumps oder Röteln, anwendbar sein.
Das letztliche Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches die effiziente Produktion von VZV zur Verwendung als Vakzin ermöglicht. Der Erfolg des Verfahrens wird gemessen durch die Ausbeute an zellfreiem VZV, die schließlich nach Optimierung eines jeden Schritts des Verfahrens erzielt wird. Die Ausbeute wird durch den Infektivitätstiter der letztlichen zellfreien VZV-Präparation bestimmt. Die Infektivitätstiter von Varicella-Zoster-Virus (VZV)-Präparationen wurden durch ein Agarose-Überschichtungs- oder Flüssigkeits-Überschichtungsverfahren, beschrieben von Krah et al. (J. Virol. Methods, 1990, 27: 319-326), erhalten. In Kürze, dieses Verfahren beinhaltet die Kultivierung von MRC-5-Zellen, welche für eine VZV-Infektion anfällig sind, bis zu einem aktiv replizierenden Zustand, d. h., zu einem Punkt, an dem die Zellen zu etwa 50-80% konfluent sind. Die Zellmonoschicht wird dann mit Virus in einem minimalen Volumen überschichtet, diesem wird die Anheftung an die Zellen ermöglicht und dann wird zusätzliches Wachstumsmedium zugegeben. Nach mehreren Tagen Wachstum werden die Zellen einer Proteinanfärbung unterworfen und klare Gebiete, Plaques, werden gezählt. So stellt für ein bekanntes Volumen an viralem Impfgut die Anzahl der plaquebildenden Einheiten (PFU) pro Milliliter ein gutes Maß der Virusausbeute dar. Multipliziert mit dem Gesamtvolumen an zellfreiem Virus, erhalten aus irgendeiner gegebenen Viruspräparation, kann die Gesamtzahl der PFU berechnet werden.
Aufgrund der Variabilität im Assay selbst wird die PFU-Zunahme, die durch irgendeine spezielle Verfahrensoptimierung erzielt wird, im Verhältnis zu einem weniger optimierten Verfahrensschritt angegeben. Diese Angabe von Erhöhungen als Mehrfache der Virusausbeute eliminiert daher eine etwaige Variabilität in dem PFU-Assay selbst. Letztlich resultieren die hier beschriebenen Verfahrensschritte zusammen in einer etwa 16-20fachen Erhöhung der VZV-Ausbeuten, welche unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren erzielt wurden. Diese mehrfache Erhöhung wird in der Literatur nicht mitgeteilt und sie stellt einen signifikanten Beitrag zum Stand der VZV-Vakzinherstellung dar.
Nachdem der VZV-Plaque-Assay zeitraubend ist, ist er für eine verfahrensbegleitende Kontrolle nicht besonders geeignet. Ein schneller VZV-Antigen-ELISA erlaubt die Messung von VZV-Antigenmengen, um eine Überwachung des Viruswachstums während der Herstellung von Varicella-Lebendvakzin zu ermöglichen. Darüber hinaus kann dieser Test eingesetzt werden, um VZV-Antigenmengen in geklärten beschauten Vakzin-Volumina abzuschätzen, und potentiell, um Antigen in Gefäßen mit abgefülltem lyophilisiertem Vakzin zu messen. In Kürze, dieser Assay wird durch Inkubation von VZV-Antigen aus Testproben mit Anti-VZV-Serum in Lösung durchgeführt. Dem verbleibenden freien Antikörper wird erlaubt, an VZV-Antigen zu binden, das auf ELISA-Mikrotiterplatten immobilisiert ist. Die Menge an Antikörper, welcher zur Bindung an die Platten imstande ist, ist umgekehrt proportional zur Menge an Antigen in der Testprobe. Die Antikörperbindung an die Platten wird quantitativ bestimmt durch Reaktion mit einem enzymgekoppelten Anti-Human- Antikörper und einem geeigneten Substrat, um ein gefärbtes Produkt zu ergeben, welches spektralphotometrisch quantitativ bestimmt wird.
Die VZV-Antigen-ELISA- und die VZV-Plaque-Assays sollten im allgemeinen korrelierende Daten liefern, es sollte jedoch berücksichtigt werden, daß der VZV-Antigen- Assay sowohl nicht-lebenden als auch lebenden VZV nachweist. Nachdem sich die durch abgetöteten VZV ausgelöste Immunreaktion als nicht so effektiv wie die Reaktion auf lebenden abgeschwächten Virus erwiesen hat, stellt der Plaque-Assay den kritischen Assay zur Bestimmung der Virusimpfgut-Dosis für VZV-Vakzine dar. Der Antigen-Assay ist jedoch insofern wertvoll, als er eine Bestimmung der gesamten Antigenfracht, die einem VZV- Vakzin-Empfänger verabreicht wird, ergibt, er ist schneller als der PFU-Assay und ermöglicht damit eine verfahrensbegleitende Überwachung der VZV-Produktion und er korreliert mindestens bis zu dem Zeitpunkt der maximalen VZV-PFU-Produktion, was eine Abschätzung des optimalen Zeitpunkts für die Ernte erlaubt.
Der Erfolg des Verfahrens dieser Erfindung wird inkremental durch jeden der folgenden kritischen Parameter vergrößert:
a. Kultivieren von für eine VZV-Infektion anfälligen Zellen, ausgewählt aus humanen diploiden Zellen, wie z.B. MRC-5, bis zur Konfluenz in Monoschichtkultur unter Verwendung von großen Kulturvolumina oder reichem Kulturmedium, um einen hohen Grad an Zellreplikation zu erzielen, und Versorgen mit einem nicht- metabolisierbaren Disaccharid, wie z.B. Sucrose:
Es kann irgendeines von einer Reihe unterschiedlicher Zellkultursysteme, von denen im Stand der Technik bekannt ist, daß sie sich für die VZV-Produktion eignen, eingesetzt werden. So wurden Vero-Zellen, WI-38-Zellen, MRC-5-Zellen und eine Reihe anderer Zelltypen für diesen Zweck eingesetzt. Wir haben durchwegs MRC-5-Zellen eingesetzt, welche für die Herstellung eines für die Anwendung beim Menschen vorgesehenen Vakzins akzeptabel sind. Es ist jedoch nicht unvorstellbar, daß die Ausbeuten an zellfreiem VZV über das hier berichtete Maß hinaus erhöht werden könnten, wenn eine besonders produktive, andere Zellinie als MRC-5 eingesetzt würde.
Der Vergleich der Ausbeuten an zellfreiem, lebendem Virus in entweder subkonfluenten oder konfluenten MRC-5-Zellmonoschichten, die bei 35ºC unter einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) mit 2% oder 10% fötalem Kalbsserum (FCS) inkubiert wurden, offenbart die Auswirkung der Zellkonfluenz auf die Ausbeute an plaquebildenden Einheiten (PFU) von zellfreiem VZV (siehe Beispiel 2, Tabelle I).
Die Verwendung von konfluenten Zellmonoschichten führt zu einer etwa 2-3fachen Erhöhung an zellfreien PFU/ml gegenüber der Ausbeute, welche durch Infektion von subkonfluenten Monoschichten erzielt wird, ob die subkonfluenten Kulturen aktiv proliferieren (10% Serum) oder nicht (2% Serum). Deshalb scheinen konfluente, jedoch nicht aktiv proliferierende Zellen für erhöhte VZV-Ausbeuten bei dem Vakzin-Herstellungsverfahren erforderlich zu sein.
Der Prozentsatz an fötalem Kalbsserum, der während des Viruswachstums vorliegt, scheint keine größere Auswirkung auf die Ausbeuten an zellfreien PFU zu haben. So wird während der Zellwachstumsphase FCS typischerweise mit etwa 10% bereitgestellt, wohingegen während der Viruswachstumsphasen des Verfahrens FCS mit etwa 2% bereitgestellt wird, ob ein Minimalmedium, wie z.B. EMEM oder EBME, oder ein reiches Medium, wie z.B. SRFE-2, für das Zellwachstum und die Viruskultur eingesetzt wird.
Neben dem FCS und Medium wird typischerweise ein Antibiotikum, wie z.B. 50 ug/ml Neomycin, und Glutamin (etwa 2 mM) den Zellkultur- und Viruswachstumsmedien zugegeben.

1. Zellaussaatphase:

Zellkulturbehälter (Kolben, Rollflaschen oder funktionelle Äquivalente dieser Kulturgefäße) werden mit MRC-5 oder anderen diploiden Zellen angesät, so daß die Anfangskonzentration an Zellen zwischen etwa 10.000 und 40.000 Zellen/cm² liegt. Die Zellen werden mit Wachstumsmedium versorgt, das mit etwa 10% fötalem Kalbsserum ergänzt ist, mit 5%igem CO&sub2; begast und bei etwa 30-37ºC und vorzugsweise etwa 35ºC inkubiert.
Die Zellen können in einem so kleinen Volumen ausgesät werden, wie es erforderlich ist, um in stationärer Kultur gezüchtete Zellen vollständig zu bedecken. Ein geeignetes Verhältnis von Volumen zu Oberfläche beträgt etwa 0,5 ml Kulturmedium pro cm² Wachstumsoberfläche. Wenn Zellen in Rollflaschen gezüchtet werden, kann so wenig wie 125 ml pro 850 cm² ausreichend sein, jedoch ist etwa 425 ml/cm² vorzuziehen.
Im Handel erhältliche Minimalmedien, die auf dem Gebiet der Zellkultur bekannt sind, wie z.B. Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) oder Eagles Basal Medium, ergänzt mit Earle's Salzen (EBME), können mit etwa 10% FCS für die Zellaussaatphase eingesetzt werden. Alternativ kann ein reicheres Medium vorteilhaft in dieser Phase eingesetzt werden. SRFE-Medium [Weiss et al., In Vitro 16 (7), 616-628 (1980)], erhältlich von SIGMA, ist ein reiches Medium, welches vorteilhaft in diesem Stadium eingesetzt werden kann, jedoch ist ein reiches Medium in diesem Verfahrensstadium nicht kritisch.

2. Zellwachstumsphase:

Es ist kritisch, daß in dieser Phase des Verfahrens für eine ausreichende Ernährung gesorgt wird, um das Wachstum von Zellen bis zur massiven Konfluenz sicherzustellen. Dies kann erzielt werden, indem ein großes Volumen eines Minimalmediums oder ein geringeres Volumen an reichem Medium bereitgestellt wird. Die Zellen werden bei etwa 30-37ºC und vorzugsweise bei etwa 32-35ºC gezüchtet.
Nach der Gewährung einer ausreichenden Zeitspanne für die Zellanheftung und das Zellwachstum können die Zellen neu versorgt werden, indem das Medium entfernt und ersetzt wird und dann die Inkubation fortgesetzt wird. Das Medium kann durch Absaugen oder Dekantieren oder irgendein anderes Mittel entfernt werden, solange die Unversehrtheit der Zellmonoschicht nicht beeinträchtigt wird. Für MRC-5-Zellen, die wie oben beschrieben ausgesät wurden, kann eine Neuversorgung etwa 72 Stunden nach Einführung der Zellen in das Kulturgefäß vorgenommen werden.
Das Volumen des ersetzten Kulturmediums kann gleich dem für die Zellaussaatphase eingesetzten Volumen sein. Vorzugsweise wird jedoch während der Zellwachstumsphase ein größeres Volumen als das während der Aussaat eingesetzte Volumen bereitgestellt. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn Zellen in einem Minimalmedium, wie z.B. EMEM oder EBME plus FCS, kultiviert werden. Ein großes Kulturvolumen ist ein Weg, um sicherzustellen, daß die Zellen eine ausreichende Ernährung erhalten.
Der Bedarf für ein großes Volumen kann verringert sein, wenn das für die Wachstumsphase bereitgestellte Medium ein reiches Medium ist. Ein besonders bevorzugtes Medium für diesen Zweck ist SRFE-2 (SIGMA). Die Verwendung eines reichen Mediums anstelle eines Minimalmediums in diesem Stadium erhöht die Dichte der Zellmonoschicht bei Konfluenz stark. Die erhöhte Zelldichte trägt dazu bei, die Ausbeute an VZV zu erhöhen, welche von einer in angereicherten Medien gezüchteten, infizierten Zellkultur erhältlich ist. So führte die Verwendung von angereichertem Medium während der Zellwachstumsphase zu einer etwa 2-4fachen Erhöhung der letztlichen VZV-Ausbeute gegenüber derjenigen, welche erzielt wird, wenn Zellen in diesem Stadium in Minimalmedien gezüchtet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird SRFE-2 mit Lipid ergänzt. Es sind irgendwelche aus einer Reihe von Lipid-Ergänzungen geeignet. So wurden cholesterinreiche Lipide aus Serum ausgewachsener Rinder (SIGMA CHEMICAL CO.), EXCYTE-Lipid I oder "Very Low Endotoxin" (VLE)-Lipid (MILES) befunden, als Ergänzungen für reiches Medium oder Minimalmedium vorteilhaft zu sein. In Handel erhältliches Sojabohnenlipid (Boehringer Mannheim, siehe auch Iscove et al., J. Exp. Med. 147, 923-933 (1978)] hat sich als sehr vorteilhafte Ergänzung erwiesen, wenn es mit etwa 0,2 mg/ml bereitgestellt wird. Zelldichten, die sich etwa 500.000/cm² nähern, wurden unter Verwendung von SRFE-2 plus Lipid und FCS erzielt. Erhöhte VZV-Ausbeuten werden erzielt, wenn Lipid bereitgestellt wird, unabhängig davon, ob das Zellwachstum in Minimalmedien oder angereicherten Medien stattfindet. Im Handel erhältliches Material wird als Ausgangsmaterial von 20 mg/ml Lipid, 100 mg/ml Rinderserumalbumin bereitgestellt. Dieses Material wird günstig in einer Endverdünnung von 1 : 100 eingesetzt. Wenn SRFE-2 während der Zellwachstumsphase mit etwa 0,2 mg/ml Sojabohnenlipid ergänzt wurde, wurde die letztliche VZV-Ausbeute um etwa das 9fache gegenüber der VZV-Ausbeute von EMEM allein und um etwa das 3,3fache gegenüber SRFE-2-Medium allein erhöht.

3. Vorinfektionsphase:

Wir haben festgestellt, daß die Endausbeute an VZV weiter erhöht werden kann, wenn kultivierte Zellen vor der VZV-Infektion einem nicht-metabolisierbaren, nicht-toxischen Disaccharid in einer optimalen Konzentration ausgesetzt werden. Eine sehr erfolgreiche Ausführungsform stellt etwa 20-60 mM Sucrose etwa 72 Stunden, nachdem die Zellen in das Kulturgefäß eingeführt wurden, und vorzugsweise etwa 24 bis 96 Stunden vor der Infektion der Kultur mit VZV bereit. In der Praxis erfüllt die Bereitstellung von etwa 50 mM Sucrose in dem Neuversorgungsmedium von Schritt 2 oben diese Kriterien und verringert die Anzahl der erforderlichen sterilen Manipulationen, indem sie diesen und die vorhergehenden Schritte effektiv gleichzeitig stattfinden läßt.
Andere Disaccharide, einschließlich Lactose, Cellobiose und Maltose, erhöhen ebenfalls die Endausbeute an VZV, jedoch ist Sucrose bevorzugt. Getestete Monosaccharide, wie z.B. Fructose und Ribose, erhöhten die VZV-Ausbeute nicht (Ribose könnte sogar toxisch sein). Es scheint so, daß die Disaccharide in den Lysosomen der wachsenden Zellen konzentriert werden und diese unter Vakuolenbildung zum Anschwellen bringen [DeCourcy und Storrie, Exp. Cell Res. 192, 52-60 (1991)]. Diese Disaccharid-Wirkung auf die VZV-Ausbeute kann auf eine Abschwächung der Lysosomenschädigung von VZV zurückzuführen sein. Man könnte erwarten, daß neben Disacchariden Tri- und Tetrasaccharide günstige Auswirkungen haben werden, nachdem Cohn und Ehrenreich [J. Exp. Med. 129, 201-222 (1969)] eine identische Vakuolenbildung feststellten, wenn diese höheren Zucker oder Sucrose Makrophagen zugeführt wurden, solange die Zucker nicht von den Zellen metabolisiert wurden.
b. Infizieren der nach Schritt (a) kultivierten Zellen so nahe wie möglich am Punkt der Konfluenz mit einer so hohen Multiplizität der Infektion von VZV-infizierten Zellen wie praktikabel:
Wir haben durch wiederholte Experimente festgestellt, daß im Mittel Zellen, die man 48 Stunden lang stehen ließ, nachdem sie konfluent wurden, im Vergleich zu der Ausbeute, wenn frisch konfluente Zellen mit VZV infiziert werden, nur etwa 50% der VZV-PFU/ml ergeben. Somit ist es wichtig, den Zeitpunkt der Einführung des VZV-Impfguts so zu wählen, daß er so nahe wie möglich mit der Konfluenz zusammenfällt. Unglücklicherweise ist Konfluenz ein Parameter, der je nach der Art des Mediums, dem kultivierten Zelltyp und anderen angewandten Kulturbedingungen variiert. Für MRC-5-Zellen, die nach Schritt (a) (1) oben ausgesät wurden, werden die Zellen typischerweise an dem Punkt, an dem sie Konfluenz erreichen, infiziert.
Das Varicella-Zoster-Virus (VZV) ist vorzugsweise der Oka-Stamm eines abgeschwächten Virus, der im US-Patent 3,985,615 beschrieben wird und bei der ATCC hinterlegt ist. Dieses Virus ist für das Wachstum in Kulturen von Meerschweinchen- Embryonalzellen und humanen diploiden Lungenfibroblastenzellen (z.B. MRC-5-Zellen) adaptiert.
Ein Ausgangsmaterial von infektiösen, lebenden, Varicella-infizierten Zellen kann durch Infektion von MRC-5-Zellen bei einer MOI von etwa 1 : 125, Erhaltung der infizierten Zeilen, um virale Replikation zu erlauben, Trypsinbehandlung der Zellen und sofortige Verwendung der freigesetzten Zellen als Arbeitsimpfgut oder Lagerung für die spätere Verwendung und quantitative Bestimmung der PFU durch langsames Einfrieren mit einem Gefrierschutzmittel wie DMSO oder Glycerin bei etwa 10&sup7; Zellen/ml hergestellt werden. Das eingefrorene, mit VZV infizierte Ausgangszellmaterial kann aufgetaut und einer konfluenten Zellkultur zugegeben werden, um die VZV-Infektion zu initiieren.
Alternativ können VZV infizierte Zellen nach dem von Hondo et al. [Archiv für die gesamte Virusforschung 40, 397-399 (1973)] beschriebenen Verfahren, welches eine Langzeitlagerung bei 4ºC des lyophilisierten Impfguts erlaubt, lyophilisiert werden. Es ist auch möglich, zellfreies VZV als Impfgut einzusetzen, aber aufgrund von Verlusten bei der Virusausbeute nach der Ernte ist die Verwendung eines zellgebundenen Impfguts bevorzugt.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung des Virus-infizierten Ausgangsimpfguts ist die Initiierung von Zellwachstum für die Produktion von Virusimpfgut vor der Aussaat der Produktionszellen. Zum Zeitpunkt der Impfzellinfektion mit VZV-infizierten Zellen kann die Aussaat von Produktionszellen initiiert werden, um die Konfluenz zum selben Zeitpunkt zu erreichen, an dem das Virusimpfgut maximale VZV-Titer erreicht. Weniger optimal, aber bequemer, können die Impfzellen und die Hauptzellen alle zum selben Zeitpunkt in einem kleinen Volumen an Kulturmedium (etwa 125 ml pro 850-cm²-Rollflasche) ausgesät werden. Nach etwa zwei bis drei Tagen Wachstum werden die Flaschen für die VZV-Impfgutproduktion im Volumen auf etwa 425 ml erhöht oder neu mit reichem Medium versorgt, um Wachstum bis zur Konfluenz zu ermöglichen. Die Produktionszellen werden, relativ schlafend, bis etwa zwei Tage, bevor die Arbeitsimpfzellen mit VZV-infizierten Zellen infiziert werden, in einem kleinen Volumen an Minimalmedium (einschließlich etwa 10% FCS) belassen. Zu diesem Zeitpunkt wird das Produktionszellvolumen auf etwa 425 ml erhöht oder mit reichem Medium, wie z.B. SRFE-2 plus einer optimalen Menge an Sojabohnenlipid und fötalem Kalbsserum, neu versorgt. Die Produktionszellen werden dann bis zur massiven Konfluenz wachsen. Zwei Tage nach der Neuversorgung der Produktionszellen werden die Arbeitsimpfzellen, nun bei Konfluenz, mit VZV-infizierten Zellen bei einer MOI von 1 : 125 oder höher infiziert und der VZV-Replikation gestattet, sich etwa zwei bis drei Tage lang fortzusetzen. Wenn der Zeitpunkt der maximalen VZV-Produktion in den Impfkulturen erreicht ist, werden die Produktionszellen Konfluenz erreicht haben. Dann werden die Impfzellen geerntet und den Produktionszellen zugegeben.
Wie das Timing der Impfgutproduktion auch ist, zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der VZV-Infektion wird das Medium von der VZV-infizierten Impfkultur abgesaugt, das VZV infizierte Impfgut wird durch Trypsinbehandlung (etwa 0,25% Trypsin) oder andere nicht-aufbrechende Mittel geerntet und die Produktionszellkulturen werden bei einer bekannten MOI infiziert.
Schmidt, N.S., und Lennette, E.H. [Infection and Immunity 14, 709-715 (1976)], stellten die Bedeutung einer hohen MOI für eine hohe VZV-Ausbeute fest, führten jedoch keinen genauen Vergleich mit einer Infektion bei niedriger MOI durch. Die vorliegende Erfindung führt genau diesen Vergleich durch.
Die Zellen werden durch Entnahme des Wachstumsmediums aus den Zellkulturen und dessen Ersatz durch frisches Medium, das eine bekannte Menge an VZV-infizierten Zellen, hergestellt wie oben beschrieben, enthält, mit VZV-infiziert. Das Virus-Ausgangsmaterial wird vorzugsweise hinsichtlich plaquebildender Einheiten (PFU) von Varicella titriert und die Empfängerzellen werden gezählt, um eine quantitative Bestimmung der Multiplizität der Infektion (MOI) zu ermöglichen. Die MOI werden als das Verhältnis von VZV infizierten Zellen im Impfgut zur Anzahl der nicht-infizierten Monoschichtzellen in Kultur ausgedrückt. Somit ist eine MOI von 1 : 10 hoch, während 1 : 625 niedrig ist. Eine hohe MOI ist wünschenswert, in der Praxis können jedoch gute VZV-Ausbeuten mit einer so niedrigen MOI wie 1 : 125 erzielt werden.
MOI zwischen 1 : 7 und 1 : 625 ergeben zwischen etwa 500.000 PFU/ml bei der hohen MOI bis herunter zu etwa 100.000 PFU/ml bei der niedrigen MOI (siehe Tabelle 3 von Beispiel 5). Je höher die MOI, desto kürzer die erforderliche Inkubationszeit, um maximale PFU zu erreichen, und desto größer die Ausbeute. So kann ein etwa Sfacher Bereich der End-PFU in Abhängigkeit von der MOI und dem Erntezeitpunkt erreicht werden.
c. Halten der VZV-infizierten Kultur in einem Zustand guter Ernährung für etwa 22-96 Stunden und Ernten zum Zeitpunkt maximaler VZV-Produktion:
Die Kultivierung der VZV-infizierten Zellen wird für etwa 22 bis 96 Stunden nach der Infektion fortgesetzt. Es ist kritisch, daß in diesem Stadium des Viruswachstums eine adäquate Ernährung aufrechterhalten wird. Wünschenswert ist entweder die Bereitstellung großer Kulturvolumina eines Minimalmediums, wie z.B. EMEM plus etwa 2-10% FCS, oder eines geringeren Volumens an reichem Medium. Am meisten bevorzugt wird SRFE-2 plus 2-10% FCS ohne den Zusatz einer Lipid-Ergänzung bereitgestellt. Es wurde festgestellt, daß das Lipid die VZV-Ausbeute reduziert, wenn es in diesem Stadium eingeschlossen wird.
Während der 22-96 Stunden Nachinfektionskultur repliziert sich das VZV in den Zellen, welche infiziert wurden, und verbreitet sich, um benachbarte Zellen zu infizieren. Jedoch werden alte infizierte Zellen keine gewinnbaren zellfreien PFU ergeben. Die VZV- Wachstumskurve und der anschließende Abfall können ziemlich scharf sein. Deshalb ist die Wahl des richtigen Zeitpunkts für die Ernte ein kritischer Parameter zur Maximierung der Ausbeute an infektiösem VZV und kann durch Aufrechterhaltung einer strengen Kontrolle der eingesetzten MCI, Ernährung und Inkubationszeit von Produktionslauf zu Produktionslauf genau reproduziert werden. Darüber hinaus kann der schnelle VZV-Antigen-ELISA eingesetzt werden, um den Zeitpunkt der Ernte zu optimieren, da die Produktion von infektiösem VZV mit der VZV-Antigenproduktion korreliert, mindestens bis zu dem Zeitpunkt, an dem Virustod stattzufinden beginnt (siehe Fig. 5 und 6).
Für VZV-infizierte MRC-5-Zellen, die etwa 72 Stunden nach der Infektion geerntet wurden, wobei jeder der vorangehenden Schritte optimiert wurde (d. h., Wachstum in reichem Medium und Vorinfektions-Exposition der Zellen gegenüber 50 mM Sucrose für 72 Stunden), wurde die letztliche Ausbeute an zellfreiem VZV gegenüber der Ausbeute, die bei Minimalmedium und Virusernte nach 48 Stunden erzielt wurde, etwa um das 16fache erhöht und sogar um eine noch größere Spanne gegenüber einer Ernte, die nach 96 Stunden stattfindet (siehe BEISPIEL 8, Fig. 1). Die Ausbeute an VZV unter denselben optimierten Bedingungen betrug nur etwa das 4fache gegenüber der Ausbeute in Minimalmedium, wenn das Virus 48 Stunden nach der Infektion geerntet wurde, war jedoch immer noch stark verbessert gegenüber der Ausbeute in Minimalmedium nach 96 Stunden. Somit ist in reichem Medium die Virusausbeute wesentlich größer und der Virustod stark verringert und es gibt keinen derartig steilen Abfall der Virusausbeute mit der Zeit. Die MOI wird in reichem Medium ebenfalls weniger kritisch.
d. Waschen der VZV-infizierten Kultur mit einer physiologischen Lösung, die gegebenenfalls ein lysosomotropisches Agens, wie z.B. Ammoniumchlorid oder Chloroquin, enthält, vor dem Ernten der VZV-infizierten Zellen:
Zur Entfernung von Serum, Lipid und Zelltrümmern aus der Kultur wird die Monoschichtkultur mit einem physiologischen Puffer gewaschen, welcher die Zellen nicht lysiert. Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ist für diesen Zweck völlig akzeptabel. Die Zellen können mehrere Male gewaschen werden und die Waschlösung kann dekantiert, abgesaugt oder auf irgendeine andere Weise entfernt werden, solange die Unversehrtheit der Monoschicht nicht beeinträchtigt wird.
Falls die Zellen chemisch aus dem Wachstumsgefäß freigesetzt werden, sollten sie durch Zentrifugation konzentriert und der physiologische Puffer durch eine Stabilisierungslösung ersetzt werden.
Die Bereitstellung von Ammoniumchlorid oder Chloroquin vor der Zellernte wurde befunden, die VZV-Endausbeuten zu verbessern. Kielian et al. [EMBO J. 5, 3103-3109 (1986)] verwendeten Ammoniumchlorid, um den internen pH-Wert von zellulären Endosomen zu regeln, wo infizierende Viren anscheinend einen Teil ihres intrazellulären Lebens verbringen. Möglicherweise steht der Mechanismus der erhöhten VZV-Ausbeute nach Exposition von Zellen gegenüber lysosomotropen Agenzien in Zusammenhang mit der Herbeiführung einer weniger drastischen endosomalen Umgebung. Die Befrachtung von Zellen vor der Infektion mit nicht-toxischen, nicht-metabolisierbaren Disacchariden, wie z.B. Sucrose, und die Exposition von Zellen gegenüber Ammoniumchlorid oder Chloroquin könnte deshalb über ähnliche Mechanismen Wirkung entfalten. Auf jeden Fall wurde die Feststellung empirisch bestätigt, daß die VZV-Endausbeuten erhöht werden, wenn Ammoniumchlorid in einer Endkonzentration von zwischen 1-100 mM, und am meisten bevorzugt im Bereich von 20-50 mM, bereitgestellt wird, und es wird vorzugsweise bei etwa 4ºC für etwa 25-50 Minuten vor dem Aufbrechen der Zellen bereitgestellt. Ein zweites lysosomotropisches Agens, Chloroquin, erhöht in einer Konzentration von etwa 230 uM gleichermaßen den Ertrag an VZV-PFU/ml.
e. Ernten der VZV-infizierten Zellen in ein minimales Volumen einer Stabilisierungslösung und entweder sofortiges Aufbrechen der Zellen oder Einfrieren der Zellen für ein späteres Aufbrechen:
Sobald die VZV-infizierten Zellen gewaschen wurden, können sie durch Abschaben, falls das Wachstumsgefäß dieses erlaubt, oder durch chemisches Ablösen der Zellen gewonnen werden. Eine enzymatische Freisetzung der Zellen ist weniger wünschenswert, da restliches Enzym die Virusausbeute verringern könnte, sobald die Zellen aufgebrochen sind. Wie oben festgestellt, werden, wenn die Zellen in physiologische Salzlösung freigesetzt werden, die Zellen durch Zentrifugation konzentriert und die physiologische Salzlösung durch ein minimales Volumen an VZV-Stabilisierungslösung ersetzt. Ein gutes Verhältnis von Volumen zu Oberfläche des Zellwachstums beträgt etwa 40 ml Stabilisator auf 850 cm².
Virale Stabilisatoren sind im Stand der Technik bekannt. So wird die Stabilisierung mit 5% Sucrose in phosphatgepufferter Salzlösung im US-Patent 3,985,615 vorgeschlagen, während andere Berichte komplexere Stabilisatoren, wie z.B. SPGA, empfehlen.
Nachdem die VZV-infizierten Zellen in einer Stabilisierungslösung resuspendiert wurden, können die Zellen sofort aufgebrochen werden, oder, falls große Mengen an VZV präpariert werden, für eine spätere Weiterverarbeitung bei -70ºC eingefroren werden. Die VZV-Ausbeute pro cm² der gezüchteten Zellen wird etwas größer sein, wenn die Zellen sofort aufgebrochen werden, jedoch verursacht der Einfrierschritt gewöhnlich keinen Verlust von mehr als 10% der durch sofortige Aufarbeitung erhaltenen Ausbeute.
f. Aufbrechen der VZV-infizierten Zellen zur optimalen Freisetzung von zellassoziiertem VZV und Entfernen von Zelltrümmern, um eine zellfreie VZV- Präparation bereitzustellen:
Wie oben beschrieben, wird das Kulturmedium vorzugsweise vor dem Aufbrechen von den Zellen entfernt und durch ein Minimalvolumen an VZV-Stabilisator ersetzt, in das die Zellen abgeschabt oder anderweitig freigesetzt werden. Die Zellsuspension wird auf 0-4ºC gekühlt und die Zellen werden dann durch ein geeignetes Mittel, wie z.B. Beschallung, DOUNCE- Homogenisierung, andere Scherungsarten, welche leichter als DOUNCE im Maßstab angepaßt werden können, oder durch eine Kombination dieser Techniken aufgebrochen.
Wir haben bestätigt, daß eine Beschallung allein nicht den besten Ertrag an zellfreiem VZV ergibt. In der Tat wird bei Anwendung der DOUNCE-Homogenisierung als einleitendem Aufbrechungsschritt, gefolgt von Zentrifugation, Zurückbehalten des Überstands als Überstand I, gefolgt von Beschallung des Pellets und Zentrifugation, um Überstand II zu erhalten, die VZV-Ausbeute des Aufbrechens stark erhöht. Die vereinigte Ausbeute von Überstand I und II war bis zu viermal höher als die Ausbeute, wenn lediglich Beschallung als Aufbrechtechnik eingesetzt wird.
Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Entfernung von Zelltrümmern durch Zentrifugation, Filtration oder irgendein anderes Mittel, das im Stand der Technik zur Entfernung von Zelitrümmern unter Zurücklassung von unbeeinträchtigtem VZV bekannt ist, erzielt. Die Präparation des zellfreien Virus wird dann mit Stabilisierungslösung verdünnt und zur Verwendung als Vakzin aufgeteilt. Vorzugsweise wird das VZV für die Langzeitlagerung nach einem der im Stand der Technik bekannten Verfahren lyophilisiert.
Als Zusammenfassung sind annähernde potentielle Ausbeutesteigerungen durch Befolgung der optimierten Schritte dieses Verfahrens im Vergleich zu der VZV-Produktion durch Zellwachstum in Minimalmedien im folgenden angegeben:

Verfahrensschritt Mehrfache der PFU-Erhöhung

Medium/Ergänzungen:
1. MOI 2-5
2. Konfluenz der Zellen 2-3
3. SRFE-2-Medium + Lipid 2-3
4. Sucrose in der Vorinfektionsphase 2-5
5. Optimales Mediumvolumen 1-2
Potentielle Nettoerhöhung für kombinierte Medium/Stabilisator Ergänzungen und optimierte Infektionsbedingungen ≥ 8
Beobachtete Erhöhung für eine Kombination von 3, 4 und 5 in Rollflaschen 16
6. Kombination von Scherung/Beschallung zur Freisetzung von zellgebundenem VZV 1,5
Gesamte potentielle Erhöhung gegenüber dem nicht-optimierten Verfahren ≥ 18

Anwendbarkeit dieses Verfahrens zur Vakzinproduktion:

Die Anwendbarkeit von abgeschwächtem, zellfreiem VZV als Vakzin zur Verhütung von Windpocken wurde demonstriert. Mehrere klinische Studien haben diese Anwendbarkeit schlüssig bewiesen und ein solcher Beweis ist nun Teil des Standes der Technik [siehe beispielsweise Pediatrics 88 (3), 604-607 (1991); Pediatrics 87, (5), 604-610 (1991)]. So liegt der gewaltige Beitrag, den diese Erfindung zum Stand der Technik leistet, darin, daß sie ein hocheffizientes Verfahren für eine Produktion von lebendem, abgeschwächtem VZV in hoher Ausbeute bereitstellt. Nach dieser Erfindung hergestelltes Virus kann als Vakzin nach im Stand der Technik bekannten Verfahren formuliert werden und nach Behandlungsplänen verabreicht werden, die nun gut etabliert sind. Beispielsweise kann das lebende, abgeschwächte, zellfreie VZV-Produkt in Stabilisator verdünnt, in Flaschen abgefüllt und in Einheitsdosen lyophilisiert werden, so daß nach Lagerung bei etwa 4ºC oder weniger eine Dosis von etwa 1000 PFU zum Anwendungszeitpunkt zur Verfügung stehen wird. Das gemäß dem Verfahren dieser Erfindung produzierte VZV-Vakzin kann in Dosierungseinheitsformulierungen zur Impfung von Menschen eingesetzt werden, um Immunreaktionen auszulösen, welche Schutz gegen Infektion durch virulente Stämme von VZV bieten. Vorzugsweise wird mindestens eine Dosis von etwa 2000 PFU/ml (1000 PFU/0,5 ml/Dosis) subkutan oder intramuskulär verabreicht. So hohe Dosen wie insgesamt 15.000 oder 20.000 PFU wurden verabreicht und sind annehmbar.
Durch Bereitstellung eines optimierten Verfahrens zur Produktion eines abgeschwächten VZV-Virus ermöglicht diese Erfindung die Anwendung von im Stand der Technik Bekanntem, um ein Vakzin zur Auslösung von Anti-VZV-Immunreaktionen für die Verhütung von Windpocken zu formulieren.
Die folgenden Beispiele 1-12 werden zum Zweck der Erläuterung der vorliegenden Erfindung gegeben und sollten nicht als Beschränkung ihres Umfangs angesehen werden. Die Beispiele 13-20 zeigen relevante Testergebnisse, stehen jedoch nicht in direkter Verbindung mit der beanspruchten Erfindung.

BEISPIEL 1

Assay zur Bestimmung der VZV-Ausbeute:

Die Infektivitätstiter von Varicella-Zoster-Virus (VZV)-Präparationen wurden unter Anwendung des von Krah et al. (J. Virol. Methods, 1990, 27: 319-326) beschriebenen Agarose-Überschichtungs- oder Flüssigkeits-Überschichtungsverfahren abgeschätzt. Der Assay wird folgendermaßen durchgeführt:
MRC-5-Zellen werden in 60-mm-Gewebekulturplatten mit 6 · 10&sup5; Zellen in 5-ml- Volumina von BME (Basal Medium Eagle mit Hanks' ausgewogener Salzlösung) mit 100 mg/l Galactose, 50 ug/ml Neomycin, 2 mM L-Glutamin ausgesät und bei 35ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Nach Inkubation für 24-48 Stunden erreichen die Zellen 50-80% Konfluenz. Das Wachstumsmedium wird durch Absaugen entfernt und die Zellen werden mit 100 ul VZV-Lösung, in einem geeigneten Virus-Verdünnungsmittel, wie z.B. SPGA-Puffer, oder flüssigem Erhaltungsmedium (LMM) verdünnt, infiziert. SPGA-Puffer enthält 7,5% (Gew./Vol.) Sucrose, 11 mM Kaliumphosphat, 0,1% (Gew./Vol.) Natriumglutamat und 1% Humanserumalbumin. Dem Virus wird die Anheftung für ≥ 1 Stunde bei 35ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre gestattet. Die VZV-infizierten Zellkulturen werden dann mit 5 ml Agarose-Überschichtungsmedium (AOM) oder flüssigem Erhaltungsmedium (LMM) überschichtet. Agarose-Überschichtungsmedium ist eine Mischung von zwei Lösungen, flüssigem Überschichtungsmedium (LOM) und Agaroselösung. LOM enthält Minimal Essential Medium mit Earle's Salzen (MEM), 2% hitze-inaktiviertes fötales Kalbsserum, 50 ug/ml Neomycin-Sulfat und 2 mM L-Glutamin. Die Agaroselösung wird vorbereitet, indem 4,5 g Agarose mit niedriger Gelbildungstemperatur in 100 ml MEM für 15 Min. bei 121ºC erwärmt werden und der Lösung gestattet wird, auf 45ºC abzukühlen. AOM wird hergestellt durch Mischen eines Volumens Agaroselösung mit 4 Volumina eines 1,25 · Konzentrats von LOM bei 45ºC. Die Platten werden auf 23-25ºC abgekühlt, um dem AOM die Verfestigung zu ermöglichen. Die Kulturen werden inkubiert, um die Plaqueentwicklung zu gestatten. Nach 6-7 Tagen werden Platten, die LOM erhielten, mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) überschichtet und mit einer gläsernen Pasteurpipette eingeritzt, um die Agarose zu lockern und zu entfernen. Medium wird von Platten, die LMM erhielten, abgesaugt und die Plaques werden durch Anfärben der Zellen mit einer Lösung von 0,2% (Gew./Vol.) Coomassie Blue R-250 in Ethanol-1% Essigsäure sichtbar gemacht. Die Plaquezählungen sind das Mittel von 4-5 Replikat-Platten und als plaquebildende Einheiten pro ml (PFU/ml) ausgedrückt.
Aufgrund der potentiellen Variabilität im Assay werden die Erhöhungen der VZV- Ausbeute relativ zu nicht-optimierten Bedingungen, bei Durchführung eines identischen Assays, angegeben.

BEISPIEL 2

VZV-Ausbeute als Funktion der Zellkonfluenz bei der Infektion:

MRC-5-Zellen wurden mit 4 · 10&sup6; Zellen/150 cm² ausplattiert und 3 Tage lang in Earle's Salzen, ergänzt mit Eagles Basal Medium (EBME), in Gegenwart von 10% fötalem Kalbsserum (FCS) gezüchtet. Nach Erreichen einer subkonfluenten Zelldichte von etwa 12 · 10&sup6; Zellen/150 cm² wurden die Zellen mit frischem EBME, ergänzt mit entweder 2% FCS oder 10% FCS, neu versorgt. Zu diesem Zeitpunkt wurde den subkonfluenten Zellen gestattet, weiter zu wachsen, entweder in Gegenwart oder Abwesenheit einer VZV-Infektion (MOI = 1 : 125), und die Erhöhung der Zelldichte und der Virusausbeuten nach 48 Stunden wurde überprüft. Es wurde festgestellt, daß nicht-infizierte Zellen in 2% FCS in der Dichte nur um 33% zunahmen, wohingegen sie um 92% in 10% FCS zunahmen. Zellen in den infizierten Kulturen nahmen in der Anzahl nicht zu. Wie in Tabelle I gezeigt, wurden die Virusausbeuten von den subkonfluenten Zellen durch die Kapazität zur Zellreplikation in den Kulturen nicht beeinflußt, ob minimal (2% FCS) oder maximal (10% FCS) mit FCS ergänzt wurde.
Andere Zellkulturen wurden zusätzliche 2 Tage in 10% FCS bis zu etwa 20 · 10&sup6; Zellen/150 cm²-Kolben (ein konfluenter Zustand) gezüchtet und dann neu mit frischem EBME, mit entweder 2% FCS oder 10% FCS ergänzt, versorgt und entweder mit VZV (MOI 1 : 125) infiziert oder uninfiziert befassen. Die Erhöhung der Zelldichte und Virusausbeuten wurde nach 48 Stunden überprüft. Es wurde festgestellt, daß die uninfizierten Zellen in 2% FCS in der Dichte nicht zugenommen hatten, während die Zellen in 10% FCS nur um etwa 15% zugenommen hatten. Somit war keine Bedingung für eine große Zellreplikation geeignet. Die Virusausbeuten in entweder 2% FCS oder 10% FCS waren ähnlich und beide waren gegenüber der Ausbeute von Zellen, die bei Subkonfluenz infiziert worden waren, um etwa das 3fache erhöht (siehe Tabelle I). Somit ist die bevorzugte Verwendung von frisch konfluenten Zellmonoschichten gegenüber aktiv replizierenden subkonfluenten Zellmonoschichten für optimale Ausbeuten an zellfreiem VZV begründet. TABELLE I

BEISPIEL 3

Vergleich der VZV-Ausbeute von frisch konfluenten und gealterten konfluenten Zellkulturen:

Rollflaschen (850 cm²) wurden mit MRC-5-Zellen in einer Konzentration von etwa 26.500 Zellen/cm² beimpft. Alle Zellen wurden in EBME-Medium, enthaltend 10% (Vol/Vol.) fötales Kalbsserum (FCS&sub1;&sub0;), in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre bei 35ºC gezüchtet. Auf Grundlage des Zeitpunkts der Infektion mit VZV wurden die Kolben in zwei Gruppen aufgeteilt. Gruppe I-Zellen wurden 5 Tage lang gezüchtet, zu welchem Zeitpunkt die Zellmonoschichten konfluent waren. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit zellassoziiertem VZV bei einer MOI von 1 : 125, suspendiert in EMEM + 2 % FCS, infiziert. Zusätzliches Medium wurde zugegeben und die Zellen wurden weitere 48 Stunden lang inkubiert. Gruppe II-Zellen wurden vor der Infektion bei einer MOI = 1 : 125 weitere 48 Stunden aufrechterhalten.
Die Produktion von VZV durch Zellen der Gruppen I und II wurde wie folgt bestimmt: das Medium wurde aus den Rollflaschen entfernt und die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung gespült, mit Glasperlen in gleichen Volumina an Stabilisator abgeschabt und auf 4ºC gekühlt. Die kalten Zellsuspensionen wurden durch Beschallung aufgebrochen. Zelltrümmer wurden von Virus durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (325 · g für 10 Minuten) entfernt und der virale Überstand zurückbehalten. Die VZV-Produktion wurde mit dem Plaque-Assay gemessen. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde eine Ausbeuteerhöhung, die dem 2fachen nahe kam, erhalten, wenn frisch konfluente Zellmonoschichten mit VZV infiziert wurden. TABELLE 2

BEISPIEL 4

Wirkung des Kulturvolumens auf die VZV-Ausbeute in PFU/ml:

MRC-5-Zellen (10 Millionen) wurden in 125-ml-Volumina von EBME, 10% FCS, 50 ug/ml Neomycin und 2 mM L-Glutamin in 850-cm²-Rollflaschen ausgesät und 3 Tage lang bei 35ºC inkubiert. 300 ml an frischem Medium wurden zugegeben und die Kulturen zur Inkubation bei 35ºC für weitere 4 Tage zurückgebracht. Das Medium wurde dann entfernt und durch 125 oder 425 ml EMEM, 2% hitzeinaktiviertes FCS, 50 ug/ml Neomycin und 2 mM L-Glutamin ersetzt. VZV-infizierte MRC-5-Zellen wurden zugegeben (MOI etwa 1 : 125), die Kulturen wurden mit 5% CO&sub2; begast und zur Inkubation bei 35ºC für 46 Stunden zurückgebracht. Das Medium wurde entfernt, die Zellen wurden 4x mit 100-ml-Volumina von PBS gewaschen und mit Hilfe von Glasperlen in 43-ml-Volumina von Stabilisator abgeschabt. Die Zellen wurden bei -70ºC eingefroren. Zellfreies Virus wurde durch Beschallung präpariert. Die Mengen an infektiösem Virus in (durch Zentrifugation) geklärten Überständen der Beschallung wurden im VZV-Plaque-Assay gemessen.

Ergebnisse:

Mediumvolumen (ml) VZV-PFU/ml*

125 55.000; 45.000
425 153.000; 103.000
*Resultate von Duplikat-Kulturen
Schlußfolgerung: Die Verwendung des größeren Mediumvolumens führt zu einer etwa 2fachen Erhöhung der Ausbeuten an infektiösem VZV aus MRC-5-Zellkulturen.

BEISPIEL 5

Wirkung der VZV-MOI auf die Ausbeute an VZV in PFU/ml:

Rollflaschen wurden mit MRC-5-Zellen beimpft und diese bis zur Konfluenz gezüchtet. Das Wachstumsmedium wurde entfernt und die Zellen mit VZV bei unterschiedlichen MOI infiziert. Die Produktion von VZV durch die infizierten Zellkulturen wurde mit Hilfe des Plaque-Assays durch periodisches Ernten und Durchführen eines Assays wie in Beispiel 1 bestimmt. Wie in Tabelle 3 und in Fig. 5 gezeigt, war der Ertrag an zellfreiem, infektiösem VZV größer und wurde in einer kürzeren Inkubationsperiode erhalten, wenn höhere MOI eingesetzt wurden. Die maximalen Antigenniveaus wurden ebenfalls mit höherer MOI schneller erhalten. Bei sehr niedriger MOI, wie z.B. 1 : 625, ist die Antigenproduktion verzögert und suboptimal (siehe Fig. 6). TABELLE 3. Wirkung der eingesetzten zellassoziierten MOI auf die Ausbeuten an zellfreiem VZV aus MRC-5-Monoschichtkulturen

BEISPIEL 6

Die erhöhte Stabilität von VZV in einem Stabilisator bei -20ºC:

Infizierte Zellkulturen wurden in SPGA beschallt und mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Zellgebundenes Virus wurde dann durch Beschallung freigesetzt und die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt. Die Konzentration an zellfreiem Virus wurde auf eine bekannte PFU/ml-Konzentration eingestellt und Aliquots des Virus in Stabilisator wurden lyophilisiert und bei 4ºC oder -20ºC gelagert. In einmonatigen Intervallen über insgesamt 14 Monate wurden Proben rekonstituiert und die verbleibenden PFU- /ml-Titer bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 3 dargestellt.
Der substantielle Vorteil für die VZV-Stabilität, der durch eine Lagerung bei -20ºC statt 4ºC erhalten wird, ist offensichtlich.

BEISPIEL 7

Wirkung der Menge und des Zeitpunkts der Sucrosezugabe während der Vorinfektionsphase des Zellwachstums auf die VZV-Endausbeute:

1. Zellaussaatphase:

MRC-5-Zellen (5 ml) wurden in einer Konzentration von 120.000 Zellen/ml (insgesamt 600.000 Zellen) auf 60-mm-Platten in EBME-Medium, enthaltend 10% FCS, 50 ug/ml Neomycin, 2 mM L-Glutamin, ausgesät und bei 35ºC unter 5% CO&sub2; inkubiert.

2. Zellwachstums/Vorinfektionsphase:

Die Zellen wurden am dritten Tag nach der Aussaat konfluent. Das Aussaatmedium wurde von 48 Platten abgesaugt und durch 8-ml-Volumina von Wachstumsmedium, enthaltend entweder EBME oder SRFE-2, ergänzt mit 10% FCS, 50 ug/ml Neomycin, 2 mM L-Glutamin und 0,2 mg/ml Sojabohnenlipid/l mg/ml BSA, entweder mit oder ohne 50 mM Sucrose, ersetzt. Nach Zugabe der frischen Wachstumsmedien wurden die Zellen weitere 3 Tage lang bei 35ºC unter 5% CO&sub2; inkubiert.

3. VZV-Infektion:

Das Medium wurde dann von jeder Platte entfernt und durch 8 ml EMEM statt EBME und SRFE-2 statt SRFE-2 plus Sojabohnenlipide ersetzt. Das FCS wurde für alle Platten auf 2% verringert, jedoch waren die anderen Ergänzungen, Neomycin, Glutamin und Sucrose, wie während der Wachstumsphase. Jede Platte erhielt dann 333 ul einer 1 : 16-Verdünnung von VZV-infizierten Zellen (47.000 PFU/ml) in EMEM, 2% FCS, Neomycin, Glutamin.
Dem VZV wurde die Replikation bei 35ºC unter 5% CO&sub2; für zwei Tage gestattet und dann wurden die Medien von 2 Platten einer jeden unterschiedlichen Bedingung entfernt. Die Zellen wurden viermal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden in 1,2 ml/Platte von eiskaltem Stabilisator abgeschabt. Die Ernte von den Duplikat-Platten wurde in konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen vereinigt und bei -70ºC eingefroren.
Dasselbe Verfahren wie im vorhergehenden Absatz beschrieben, wurde für zwei Platten einer jeden Bedingung am dritten, vierten und fünften Tag nach der VZV-Infektion wiederholt und die vereinigte Ernte von jedem Satz von zwei Platten wurde bei -70ºC gelagert.
Jede Zellernte, hergestellt wie oben beschrieben, wurde später aufgetaut, 30 Sekunden lang pro Röhrchen mit Hilfe eines Cup-Horn-Beschallungsgeräts auf Eis beschallt und durch Zentrifugation bei 1000 · g für 10 Minuten bei 4ºC geklärt. Aliquots der Überstände wurden für den Plaque-Assay entnommen. Die Ergebnisse des Plaque-Assays, durchgeführt wie in BEISPIEL 1 beschrieben, werden in Fig. 1 präsentiert.
Die in Fig. 1 präsentierten Daten bestätigen mehrere Schlußfolgerungen:
1. Die Vorinfektions-Inkubation von Zellen mit 50 mM Sucrose ist für die VZV- Endausbeute sehr vorteilhaft. In jedem Medium, EMEM oder SRFE-2, waren die VZV- Ausbeuten höher, wenn die Zellen vor der Infektion mit Sucrose behandelt wurden. 72 Stunden nach der Infektion war die VZV-Ausbeute bei in SRFE-2-gezüchteten Zellen, die Sucrose ausgesetzt worden waren, etwa 16mal höher als die VZV-Ausbeute, gemessen in PFU, bei Zellen in Minimalmedien ohne Sucrose!
2. Die Bereitstellung von reichen Medien (SRFE-2 plus Sojabohnenlipide während des Wachstums und SRFE-2 während des Viruswachstums) ist für die VZV-Ausbeute vorteilhaft, ermöglicht jedoch in Verbindung mit dem Sucrose-Effekt, daß eine Größenordnung mehr VZV produziert wird. Somit scheint das reiche Medium in synergistischer Weise mit dem Sucrose-Effekt zusammenzuwirken.
3. Der Zeitpunkt der VZV-Ernte ist sehr wichtig. Selbst unter den optimierten Kulturbedingungen, SRFE-2 und Sucrose etc., wird die maximale VZV-Ausbeute nicht nach 48 Stunden nach der Infektion erzielt. Zu diesem Zeitpunkt wird nur eine 4fache Erhöhung gegenüber der Ausbeute in Minimalmedium erzielt. Jedoch wird 72 Stunden nach der Infektion eine etwa 16fache Erhöhung der VZV-Ausbeute erzielt.
In separaten Experimenten wurde die VZV-Ausbeute nicht so stark erhöht, wenn 50 mM Sucrose zum Infektionszeitpunkt, im Gegensatz zu 72 Stunden vor der Infektion, zugegeben wurde, und zeigt somit die Bedeutung einer langen Vorinfektionsphase zur intrazellulären Anhäufung von Sucrose. Wir stellten auch fest, daß die Zugabe von 25 mM oder 100 mM Sucrose weniger vorteilhaft als 50 mM Sucrose war. Dieselben angenäherten Konzentrationen sind auf Lactose, Cellobiose und Maltose anwendbar.

BEISPIEL 8

Wirkungen mehrerer verbesserter Verfahrensparameter auf die VZV-Ausbeute:

Ein Rollflaschenexperiment wurde durchgeführt, um die Wirkungen verschiedener Verfahrensänderungen (Kulturmedium, Sucrose-Ergänzung, Zugabe von NH&sub4;Cl zum Stabilisator, Dounce-Behandlung oder Beschallung für die Virusfreisetzung aus Zellen) auf die PFU-Ausbeuten an zellfreiem VZV festzustellen. Die Kulturen wurden mit 80 · 10³ Zellen/ml · 125 ml EBME, 10% FCS pro Rollflasche ausgesät. Sie wurden mit EBME auf 425 ml eingestellt oder mit SRFE + Sojalipid-Medium neu versorgt und mit Arbeitsimpfgut- VZV in 125 ml ("niedriges Volumen") oder 425 ml ("hohes Volumen") EMEM- oder SRFE- Medium (ohne Sojalipid) infiziert. Das Timing für diese Mediumveränderungen/Infektion war wie in Beispiel 7 beschrieben. Zu verschiedenen Zeiten vor der Infektion (96 oder 24 h vor der Infektion oder zum Zeitpunkt der Infektion) wurde Sucrose (suc) bis 50 mM zugegeben. Kulturen, die vor der Infektion Sucrose erhielten, erhielten auch Sucrose in dem Virusinfektionsmedium. Alle Kulturen wurden bei einer angenäherten MOI = 1 : 15 infiziert, wobei die VZV-infizierten Zellen in EMEM-Kulturen nach 46 Stunden in Post-Infektions-Stabilisator, enthaltend 20 mM NH&sub4;Cl (N) oder keine Ergänzung, geerntet wurden. Alle Proben wurden bei -70ºC eingefroren und das Virus anschließend durch entweder Beschallung oder DOUNCE-Homogenisierung aus den Zellen freigesetzt. Alle Proben wurden durch Zentrifugation bei 1000 g für 10 Min. geklärt.
Die für die beschallten Proben erhaltenen PFU-Ergebnisse erlaubten die folgenden Schlußfolgerungen:
1. Die Verwendung des "hohen" Mediumvolumens an EMEM erhöhte die VZV-PFU um das 2fache. Mit SRFE scheint es hier und in anderen Experimenten so zu sein, daß die optimalen PFU-Ausbeuten in der Nähe des "niedrigen" Mediumvolumens erzielt werden. In manchen Fällen waren die Ausbeuten bei dem "hohen" Mediumvolumen verringert.
2. NH&sub4;Cl ist für hohe PFU-Erträge nicht kritisch.
3. Sucrose erhöhte die PFU-Ausbeuten für EBME/EMEM um das 2fache und für SRFE- Kulturen um das 5fache. Es scheint eine Wirkung des Zeitpunkts der Sucrosezugabe auf die PFU vorhanden zu sein. Bei einer weiteren Gruppe dieses Experiments betrugen die PFU-Ausbeuten 94 · 10³ für SRFE + Soja/SRFE-Kulturen, die keine Sucrose erhielten, und 296 · 10³, 427 · 10³ und 671 · 10³ für Kulturen, die Sucrose bei der Infektion, 24 Stunden vor der Infektion bzw. 96 Stunden vor der Infektion erhielten.
4. Die sucrose-behandelten Kulturen zeigten signifikant weniger zytopathische Effekte als deren sucrose-freie Gegenstücke. In einem weiteren Experiment zeigten die sucrosebehandelten Kulturen eine Woche nach der Infektion immer noch keine degenerativen zytopathischen Effekte, während deren sucrose-freie Kontrollen vollständig lysiert waren. Es ist deshalb möglich, daß die sucrose-behandelten Zellen mehr VZV (Antigen und insbesondere PFU) bei verlängerten Inkubationszeiten (über die Ernte bei 46 Stunden von dem Rollflaschenexperiment hinaus) anhäufen werden.
5. Die MOI wurde in diesem Experiment nicht auf höhere Zellkonzentrationen zum Infektionszeitpunkt aufgrund von Zellwachstum im SRFE-Medium eingestellt. Deshalb könnten sogar noch größere PFU-Ausbeuten erhalten werden, falls dieser Parameter optimiert würde.

BEISPIEL 9

Ausbeute an zellfreiem VZV, erzielt durch mechanische Scherung, Beschallung und eine Kombination von diesen:

Ein großmaßstäbliches Experiment wurde unter Anwendung mehrfach unterschiedlicher Bedingungen für die VZV-Produktion, ähnlich dem in BEISPIEL 8 beschriebenen Experiment, durchgeführt. Ein neuer Parameter, die Art und Weise des Zellaufbruchs, wurde in diesem Experiment untersucht. Die Ergebnisse werden im folgenden angegeben, wobei die Ausbeute an zellfreiem VZV, die durch DOUNCE-Homogenisierung allein, Beschallung allein und eine Kombination von DOUNCE und Beschallung erzielt wird, verglichen wird. Die angegebenen VZV-Kulturbedingungen sind für Zellen, die in Minimalmedien (EBME/EMEM) oder guter Ernährung (SRFE-2 plus Sojabohnenlipide/SRFE-2 plus 50 mM Sucrose in der Vorinfektionsphase) gezüchtet wurden. Die Zellen wurden wie in BEISPIEL 8 beschrieben gezüchtet und geerntet und VZV-PFU/ml wurde mit dem in BEISPIEL 1 beschriebenen Assay bestimmt: TABELLE 4 Zellfreie PFU/ml (x 10&supmin;³)
Aus diesen Daten ist klar ersichtlich, daß eine substantielle Steigerung der VZV- Ausbeute erzielbar ist, wenn eine mechanische Scherung mit dem Aufbrechen von Zellen durch Beschallung kombiniert wird.

BEISPIEL 10

Anwendung von SRFE-2-Medium und Sojabohnenlipid-Ergänzung, um einen gesteigerten Ertrag an Varicella-Lebendvakzin aus MRC-5-Zellen zu erzielen:

MRC-5-Zellen wurden in 25-cm²-T-Kolben in EBME ausgesät und 3 Tage lang bei 35ºC inkubiert. Das Medium wurde entfernt und durch 12,5 ml frisches EMEM-Medium oder SRFE-2-Medium mit 10% FCS, Neomycin, Glutamin und entweder kein Sojabohnenlipid oder einer 1 : 200-Verdünnung an Lipid ersetzt. Die Kulturen wurden weitere drei Tage lang bei 35ºC inkubiert. Die Medien wurden dann entfernt und die Zellen erhielten VZV-infizierte MRC-5-Zellen und 12,5-ml-Volumina von 2% fötalem Kalbsserum, Neomycin, Glutamin in EMEM oder SRFE-2. Bei der als "SRFE-2" bezeichneten Kulturbedingung erhielten sie SRFE-2 während der Zellkultur und Viruskultur. Die "SRFE + Soja"-Bedingung zeigt Proben an, die SRFE-2-Medium und eine 1 : 200-Verdünnung von Sojabohnenlipid während der Zellkultur, jedoch nur SRFE-2-Medium während der Viruskultur, erhielten. Nach einer Kultur für 48 Stunden wurden die Medien entfernt, die Zellen 4 · mit 5-ml-Volumina PBS gespült und in 1,2-ml-Volumina Stabilisator abgeschabt. Proben aus Duplikat-Kolben wurden vereinigt und bei -70ºC eingefroren. Nach anschließendem Auftauen wurden die Zellen durch Beschallung aufgebrochen, durch Zentrifugation (1000 g für 10 Min.) geklärt und die Überstände für einen nachfolgenden Assay der Virusinfektivitätstiter bei -70ºC eingefroren. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
Schlußfolgerungen: Die Verwendung von SRFE-2-Medium anstelle von EMEM führte zu einer 2,5fachen Steigerung des Ertrags an lebenden Varicella. Die Verwendung von sojabohnen-ergänztem SRFE-2 während der Zellkultur erlaubte eine zusätzliche 2,7fache Steigerung des Virusertrags für eine 7fache Nettoerhöhung gegenüber dem bei Anwendung des EMEM-Viruswachstumsverfahrens erhaltenen.

BEISPIEL 11

Konkurrenz-ELISA zur quantitativen Bestimmung von VZV-Antigen:

Nachdem der VZV-Plaque-Assay zeitraubend ist, ist er für eine verfahrensbegleitende Kontrolle nicht besonders geeignet. Ein schneller VZV-Antigen-ELISA erlaubt die Messung von VZV-Antigenmengen, um die Überwachung des Viruswachstums während der Herstellung von Varicella-Lebendvakzin zu ermöglichen. Darüber hinaus kann dieser Test eingesetzt werden, um die VZV-Antigenmengen in geklärten, beschallten Vakzin-Volumina abzuschätzen, und potentiell, um Antigen in abgefüllten Gefäßen mit lyophilisiertem Vakzin zu messen. In Kürze, dieser Assay wird durch Inkubation von VZV-Antigen aus Testproben mit Anti-VZV-Serum in Lösung durchgeführt. Dem verbleibenden freien Antikörper wird gestattet, an VZV-Antigen zu binden, das auf ELISA-Mikrotiterplatten immobilisiert ist. Die Menge an Antikörper, der zur Bindung an die Platten imstande ist, ist umgekehrt proportional zur Menge an Antigen in der Testprobe. Die Antikörperbindung an die Platten wird quantitativ bestimmt durch Reaktion mit einem enzymgekoppelten Anti-Human-Antikörper und einem geeigneten Substrat, um ein gefärbtes Produkt zu ergeben, welches spektralphotometrisch quantitativ bestimmt wird.
Die VZV-Antigen-ELISA- und die VZV-Plaque-Assays sollten im allgemeinen korrelierende Daten ergeben, es sollte jedoch berücksichtigt werden, daß der VZV-Antigen- Assay sowohl nicht-lebende als auch lebende VZV nachweist. Nachdem sich die durch abgetötetes VZV ausgelöste Immunreaktion nicht als ebenso effektiv wie die Reaktion auf lebendes abgeschwächtes Virus erwiesen hat, stellt der Plaque-Assay den kritischen Assay zur Bestimmung der Virusimpfgut-Dosis für VZV-Vakzine dar. Der Antigen-Assay ist jedoch auch insofern wertvoll, als er eine Bestimmung der gesamten Antigenfracht ergibt, die einem VZV-Vakzin-Empfänger verabreicht wird.

Testverfahren:

1. ELISA-Platten werden mit Glykoproteinen (gps) aus VZV-infizierten oder nicht- infizierten MRC-5-Zellen beschichtet und mit 1%igem Rinderserumalbumin ([Fraktion V, #A-9647, Sigma], 0,1% NaN&sub3;) überschichtet, um die unspezifische Adsorption von Antikörpern an die Platten zu verringern. Alternierende Reihen werden mit VZV oder Kontrollantigen beschichtet (d. h., die Reihen A, C, E und G erhalten VZV-gp und die Reihen B, D, F und H erhalten gp-Antigen nicht-infizierter MRC-5).
2. Geklärtes (3250 g-Min.) Testantigen wird in Stabilisator in 12 · 75 mm-Röhrchen oder Mikroröhrchen verdünnt. Eine Virusantigen-Standardpräparation (26 Einheiten/ml VZV-Antigen gemäß Dot-Blot-Assay) wird 1 : 10 verdünnt und dann in Reihe 1 : 1,25fach verdünnt, um Antigenkonzentrationen von 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1, 0,9 Einheiten/ml zu ergeben. Weitere Verdünnungen können eingeschlossen werden, um 0,7 und 0,5 Einheiten/ml Antigen zu ergeben. Diese Verdünnungsreihe wird eingesetzt, um eine Standardkurve für die Messung von Antigenmengen in Testproben zu erstellen.
3. Ein Human-Anti-VZV-Serum wird in Stabilisator auf das Doppelte der gewünschten Endverdünnung verdünnt.
4. 300-ul-Volumina von verdünntem Antigen werden in Mikroröhrchen abgefüllt, mit 300 ul verdünntem Anti-VZV-Serum gemischt und bei 35ºC 15-22 Min. lang inkubiert. Eine Kontrolle schließt Human-Anti-VZV und Verdünnungsmittel (kein Antigen) ein.
5. Aliquots von 100 ul aus jeder Serum-Antigen-Mischung werden 2 Replikaten von mit VZV-Glykoprotein (VZV-gp) beschichteten Vertiefungen und 2 mit MRC-5-gp beschichteten Vertiefungen (4 Vertiefungen pro Probe) zugegeben (z.B.: Probe 1 in Spalte 1, Reihen A, B, C und D; Probe 2 in Spalte 2, Reihen A, B, C und D; etc.).
6. Die Platten werden für 15 ± 1 Minute(n) bei 35ºC inkubiert, um freiem Antikörper (nicht mit Antigen in Lösung komplexiert) die Bindung an Virusantigen, das auf den Platten immobilisiert ist, zu ermöglichen.
7. Ungebundener Antikörper wird durch Waschen entfernt und die Vertiefungen erhalten einen mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anti-Human-Ziegen-IgG, um gebundenen Human-Antikörper nachzuweisen.
8. Nach Inkubation für 15 ± 1 Minute(n) bei 35ºC wird ungebundenes Konjugat durch Waschen entfernt. Gebundenes Konjugat wird durch Inkubation für 15 Minuten bei 35ºC mit p-Nitrophenylphosphat-Substrat, gelöst in Diethanolamin-Puffer, nachgewiesen.
9. Nach Beendigung der Substratreaktion durch Zugabe von 50 ul/Vertiefung 3 M NaOH wird die Farbentwicklung (OD bei 405 nm) quantitativ mit Hilfe eines Mikroplatten-Spektralphotometers bestimmt.

Testberechnungen und Interpretation:

1. Die jeweiligen Replikat-OD-Werte für die mit VZV und MRC-5 beschichteten Replikat-Vertiefungen werden gemittelt. Die Erfahrung hat gezeigt, daß die MRC-5- OD zwischen verschiedenen Proben und Verdünnungen konsistent ist. Deshalb werden die MRC-5-Werte für die gesamte Platte gemittelt und verwendet, um die Korrektur bezüglich der unspezifischen Bindung des primären Antikörpers oder Konjugats an nicht-infizierte Zellextrakte vorzunehmen. Die gemittelte MRC-5-OD wird von den jeweiligen gemittelten VZV-OD-Werten abgezogen, um VZVspezifische OD (ΔOD)-Werte zu ergeben.
2. Erstellung einer Standardkurve zur Messung von Antigenmengen: Die ΔOD-Werte der Standardkurve werden gegen die bekannten Antigenkonzentrationen aufgetragen (Einheiten VZV/ml). Die Daten werden in ein geeignetes Graphikprogramm (z.B.: Cricket Graph Version 1.3, Cricket Software, Malvern, PA) eingegeben, der lineare Anteil der Kurve wird identifiziert (muß mindestens 4 Punkte einschließen) und die Kurvenanpassungsformel ("line fit formula" (y = a + bx) wird erhalten.
3. Berechnung von Antigenmengen aus Testproben: Die Werte für a und b sind durch die Kurvenanpassungsformel gegeben und y (ΔOD) ist bekannt. Die verbleibende Unbekannte, x, repräsentierend die Einheiten/ml Antigen, kann dann berechnet und um die Probenverdünnung korrigiert werden, um die Antigenkonzentration der unverdünnten Probe zu erhalten. Eine allgemeine Probenberechnung folgt:
Die angegebene Antigenkonzentration ist diejenige, welche mit der am wenigsten verdünnten Probe, die einen ΔOD-Wert innerhalb des linearen Anteils der Standardkurve ergibt, erhalten wird.

BEISPIEL 12

VZV-Antigen-ELISA und Vergleich mit der VZV-Ausbeute in PFU:

Die in BEISPIEL 7 hergestellten Proben von zellfreiem VZV, für welche die PFU/ml- Ausbeute in Fig. 1 dargestellt ist, wurden entsprechend dem in BEISPIEL 11 dargestellten VZV-Antigen-ELISA einem Assay unterworfen. Die Ergebnisses dieses Assays sind in Fig. 2 dargestellt.
Es ist bemerkenswert, daß das VZV-Antigen bei 96 Stunden weiter ansteigt, obwohl nach den Daten der Fig. 1 die PFU/ml abnehmen. Es ist auch bemerkenswert, daß sich der VZV-Antigenspiegel in SRFE-2 plus Soja plus Sucrose nirgendwo in der Nähe des 16fachen des Antigenspiegels in EMEM (Fig. 2) befindet, jedoch die PFU/ml von lebendem zellfreiem VZV schon (Fig. 1). Nach diesem Vergleich scheint es so, daß der Sucrose-Effekt einen Hauptbeitrag zur Aufrechterhaltung von lebenden VZV 72 Stunden nach der Infektion liefert.

BEISPIEL 13

Steigerung des MRC-5-Zellwachstums bei Verwendung von SRFE-2-Medium und einer Sojabohnenlipid-Ergänzung:

MRC-5-Zellen wurden in 25-cm²-T-Kolben mit 53.000 Zellen/ml in 12,5-ml-Volumina von EBME, 10% FCS, 50 ug/ml Neomycin und 2 mM L-Glutamin ausgesät und bei 35ºC inkubiert. Nach 2-3 Tagen wurde das Medium entfernt und ersetzt (Austausch 2) durch 12,5 ml frisches Medium oder SRFE-2-Medium, enthaltend 10% FCS, 50 ug/ml Neomycin, 2 mM L-Glutamin und unterschiedliche Mengen an Sojabohnenlipid. Unverdünntes Sojabohnenlipid enthielt 20 mg/ml Lipid und 100 mg/ml Rinderserumalbumin.
Die Medien wurden 6 Tage nach der ursprünglichen Zellaussaat entfernt und durch 12,5-ml-Volumina von 2% FCS, 50 ug/ml Neomycin, 2 mM L-Glutamin in EMEM oder SRFE-2-Medium, ergänzt mit unterschiedlichen Mengen an Sojabohnenlipid, ersetzt. Die Zellen wurden von ausgewählten Kolben durch Trypsinbehandlung abgelöst und die Zellen wurden in einem Hämazytometer gezählt. Die Zellzahlen wurden für die verbleibenden Kulturen nach weiteren 2 Tagen Kultur bei 35ºC gezählt und eine Zusammenfassung der Ergebnisse wird in Tabelle 5 präsentiert. TABELLE 5 Verwendung von SRFE-Medium und Sojabohnenlipiden zur Erhöhung der MRC-5-Zelldichten
Mediumaustausch 1 = Medium wird durch das angegebene Medium, ergänzt mit 10% FCS, 2-3 Tage nach der Zellaussaat ersetzt.
Mediumaustausch 2 = Medium wird durch das angegebene Medium, ergänzt mit 2% FCS, 6 Tage nach der Zellaussaat ersetzt.
NB = nicht bestimmt
Schlußfolgerungen: Die Verwendung von SRFE-2-Medium ohne eine Lipid-Ergänzung führte zu einer etwa 2fachen Erhöhung der Zellzahlen gegenüber der in EMEM alleine erreichten. Die Zellausbeuten wurden weiter in dosisabhängiger Weise durch die Ergänzung von Medium mit Sojabohnenlipid erhöht. Maximale Zellausbeuten wurden bei Verwendung der Kombination von SRFE-2-Medium und etwa 200-400 ug/ml Lipid erzielt.

BEISPIEL 14

Wachstum von WI-38-Zellen gemäß dem Verfahren dieser Erfindung:

WI-38-Zellen wurden in 25-cm²-T-Kolben mit 53.000 Zellen/ml in 12,5-ml-Volumina von EBME, 10% FCS, 50 mg/ml Neomycin und 2 mM L-Glutamin ausgesät und bei 35ºC inkubiert. Nach 2 Tagen wurde das Medium entfernt und durch 12,5 ml SRFE-2-Medium, ergänzt mit 50 mg/ml Neomycin, 2 mM L-Glutamin und einer 1 : 200-Verdünnung von Sojabohnenlipid, ersetzt. Die Kontrollen erhielten Medium ohne eine Lipid-Ergänzung. Nach 5 Tagen Kultur bei 35ºC wurde das Medium entfernt, die Zellen von den Kolben durch Trypsinbehandlung abgelöst und in einem Hämazytometer gezählt. Die verbleibenden Kolben wurden vor der Zählung der Zellen für weitere 3 Tage beibehalten. Es folgt eine Zusammenfassung der Ergebnisse: TABELLE 6
Schlußfolgerung: Die Ergänzung von reichen Kulturmedien mit Sojabohnenlipid erhöhte die WI-38-Zellausbeuten um etwa das Doppelte. Es steht somit zu erwarten, daß der Einsatz dieser Zellinie für die VZV-Produktion ähnlich wie der Einsatz von MRC-5-Zellen verlaufen wird.

BEISPIEL 15

Verfahren zur Bewertung der MRC-5-Zellwachstumssteigerung:

MRC-5-Zellen werden in 25-cm²-T-Kolben mit etwa 53.000 Zellen/ml in 12,5-ml- Volumina von Basal Medium Eagle mit Earle's Salzen (EBME), 10% FCS, 50 ug/ml Neomycinsulfat (neo) und 2 mM Glutamin (Gln) ausgesät. Die Kulturen werden 3 Tage lang bei 35ºC inkubiert, nach welcher Zeit die Zellmonoschichten typischerweise zu etwa 50-75 % konfluent sind. Das Medium wird entfernt und durch 10- bis 12,5-ml-Volumina von 10% FCS, 50 ug/ml neo und 2 mM Gln ± Sojabohnenlipid oder ein anderes Lipid in SRFE-2- Medium ersetzt und die Kulturen zur Inkubation bei 35ºC zurückgebracht. Die Zellzahlen werden zu verschiedenen Zeiten durch Trypsinbehandlung von Zellen (2,5-ml-Volumina von 0,25%iger Citrat-Trypsin-Lösung) und Zählung in einem Hämazytometer bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Zellausschluß von 0,2%igem Trypanblau überprüft. Die Zellzahlen werden dazu verwendet, um eine Zellkonzentration zu erhalten, welche wiederum um das Gesamtvolumen der Zellsuspension korrigiert wird, um die Zellausbeute pro Kolben zu erhalten. In einigen Experimenten werden die Kulturen 3-4 Tage nach dem Ersatz des Mediums in Medium mit 2% FCS überführt und die Zellzahlen nach Inkubation für weitere zwei Tage bestimmt.

BEISPIEL 16

Wirkung einer verlängerten Exposition von kultivierten Zellen gegenüber Lipid- Ergänzungen:

MRC-5-Zellen wurden in T25-Kolben ausgesät, nach 3 Tagen versorgt (erste Neuversorgung) und die Zellzahlen nach weiteren 3 Tagen Wachstum bestimmt. Weiteren T25- Kolben wurde die Fortsetzung des Wachstums ermöglicht, indem eine Neuversorgung ± Lipid (zweite Neuversorgung) erfolgte und gestattet wurde, weitere 2 Tage lang zu wachsen. Die Zellen wurden mit Trypsin gewonnen. Die Ausbeuten betrugen 2,6 · 10&sup6; für in EBME ausgesäte und in EMEM gezüchtete Zellen, während Zellen, die in SRFE-2 plus einer 1 : 100-Verdünnung von Sojabohnenlipiden gezüchtet wurden, 6,6 · 10&sup6; und 7,7 · 10&sup6; erreichten. Zellen, welche die zusätzlichen 2 Tage gezüchtet wurden, ergaben 2,76 · 10&sup6; für in EBME/EMEM gezüchtete Zellen, während EBME/SRFE-2 ohne Sojabohnenlipid- Ergänzung 9,2 · 10&sup6; und 7,88 · 10&sup6; Zellen pro T25-Kolben ergab. In EBME/SRFE-2 + 1 : 100-Sojabohnenlipid gezüchtete Zellen ergaben nur 2,48 und 2,28 · 10&sup6; Zellen. Diese Daten zeigen an, daß eine verlängerte Exposition (etwa 5 Tage nach der zweiten Neuversorgung) gegenüber hohen Lipidkonzentrationen schließlich zu verringerten Zellausbeuten führen kann, mutmaßlich aufgrund von Zelltod. Somit werden die Zellen im allgemeinen mit reichem Medium ohne Lipid-Ergänzung neu versorgt. Dieser Übergang zu einem lipidfreien reichen Medium ist insbesondere von Bedeutung, wenn eine Viruswachstumsphase initiiert wird, da das Lipid für das Viruswachstum toxisch sein kann oder für das Weiterbestehen der Lebensfähigkeit der Zellen in Gegenwart eines Virusattacke.

BEISPIEL 17

Wirkungen unterschiedlicher Lipidkonzentrationen auf das Zellwachstum in reichen Medien und Minimalmedien:

Bei Befolgung im wesentlichen desselben Verfahrens und Neuversorgungs/- Zellquantifizierungs-Schemas wie in BEISPIEL 16 für die MRC-5-Kultur beschrieben, wurden die folgenden Zellausbeuten erzielt (man beachte: die Symbole + und - nach der Mediumbeschreibung zeigen die Anwesenheit oder Abwesenheit der angegebenen Menge Sojabohnenlipid (sl.)-Ergänzung in mg/ml in dem zweiten Neuversorgungsmedium an):
EBME/SRFE-2 + 0,1 sl. 4,94
EBME/SRFE-2 - 0,04 sl. 3,10
EBME/SRFE-2 + 0,04 sl. 3,16
EBME/SRFE-2 - 0,01 sl. 2,90
EBME/SRFE-2 + 0,01 sl. 3,82
Die oben zusammengefaßten Daten stehen im allgemeinen in Einklang mit der in BEISPIEL 16 gemachten Beobachtung, daß eine verlängerte Exposition von Zellen gegenüber hohen Lipidkonzentrationen nicht sehr vorteilhaft ist, obwohl der in BEISPIEL 16 festgestellte toxische Effekt bei diesen Daten weniger ausgeprägt ist. Bei geringeren Lipidkonzentrationen ist eine längere Zellexposition gegenüber Lipid weniger schädlich und kann vorteilhaft sein, um die Ausbeute von Zellen/cm² Wachstumsoberfläche zu erhöhen.

BEISPIEL 18

Wirkung der Konzentration an fötalem Kalbsserum auf die Zellausbeuten:

Die Zugabe von 2% oder 10% fötalem Kalbsserum in Gegenwart von Lipid- Ergänzungen wurde in diesem Experiment getestet. MRC-5-Zellen wurden in EBME ausgesät, 3 Tage später mit SRFE-2, ergänzt mit verschiedenen Mengen an Sojabohnenlipid, neu versorgt, 2 Tage später mit derselben Konzentration an Lipid in SRFE-2 wie bei der ersten Neuversorgung neu versorgt. Die Zellausbeuten in 10% FCS betrugen 9,5, 11,3 und 12,2 · 10&sup6; für Kulturen, die mit 0,1, 0,2 bzw. 0,4 mg/ml Lipid ergänzt worden waren. Wenn 2% FCS bereitgestellt wurde, betrugen die Zellausbeuten 6,5, 8,8 bzw. 3,2 · 10&sup6;. Dieses Experiment weist auf die vorteilhafte Wirkung der Bereitstellung einer FCS- Ergänzung neben einer Lipid-Ergänzung auf das Zellwachstum hin. Welche toxischen Wirkungen die Zellen auch immer bei erhöhten Lipidkonzentrationen erfahren, sie werden durch Bereitstellung einer ausreichenden FCS-Ergänzung abgeschwächt.

BEISPIEL 19

Wirkungen verschiedener Lipid-Ergänzungen auf das MRC-5-Zellwachstum:

MRC-5-Zellen wurden in T25-Kolben in EBME ausgesät. Am Tag 3 wurden die Zellen mit 10% FCS enthaltendem SRFE-2-Medium, ergänzt mit verschiedenen Lipid- Ergänzungen, neu versorgt. Sojabohnenlipid von Boehringer Mannheim, cholesterinreiche Lipide aus Serum ausgewachsener Rinder von Sigma oder EX-CYTE I oder "Very Low Endotoxin"-Rinderlipoprotein von Miles/Pentex wurden in den angegebenen Konzentrationen bereitgestellt. Die Zellzahlen bei der Neuversorgung betrugen in Millionen: 1,19.
Fünf Tage später wurden die Zellen gezählt. Die Zellen in EMEM waren 2,97, in SRFE-2 oder SRFE-2 plus 0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml, und 0,1 mg/ml Sojabohnenlipide ergaben sich 4,83, 10,44, 8,67 bzw. 8,04 Millionen Zellen. EX-CYTE I bei 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 ergab 5,37, 4,80 bzw. 4,74 Millionen Zellen. EX-CYTE VLE bei 1 : 25, 1 : 50, 1 : 100 ergab 5,49, 7,23 bzw. 7,92 Millionen Zellen. Cholesterinreiche Lipide von Sigma bei 1 : 25, 1 : 50, 1 : 100 ergaben 6,87, 7,56 bzw. 7,65 Millionen Zellen. Die Sojabohnenlipide von Boehringer Mannheim ergaben die größte Steigerung der Zellausbeute, obwohl EX-CYTE VLE und Sigma-Lipide fast ebenso effektiv waren. Die Steigerungswirkung ist deshalb nicht für Sojabohnenlipide einzigartig.

BEISPIEL 20

Steigerung des MRC-5-Zellwachstums bei Verwendung hoher Konzentrationen an Sojabohnenlipid:

MRC-5-Zellen wurden in 25-cm²-Kolben ausgesät und an den Tagen 3 und 6 wie in Beispiel 13 neu versorgt. Die Zellausbeuten pro Kolben am Tag 6 für Kulturen von EBME/- EMEM, SRFE-2 plus 1/100 Sojabohnenlipid oder SRFE-2 plus 1/50 Sojabohnenlipid betrugen 4,3 Millionen, 9,7 Millionen bzw. 11,7 Millionen. Die Lebensfähigkeit der Zellen war > 99% (beurteilt mittels Trypanblau-Ausschluß) für alle Kulturen. Die Zellen wurden mit Medium ± Sojabohnenlipid neu versorgt, weitere 2 Tage lang inkubiert und die Zellausbeuten bestimmt. Die Zellerträge pro Kolben für diese Kulturen betrugen 2,9 und 3,5 Millionen für EBME/EMEM-Duplikat-Kulturen; 11,65 Millionen für SRFE-2 plus 1/50- Sojabohnenlipid, mit demselben Medium neu versorgt, während die Kulturen von SRFE-2 plus 1/50-Sojabohnenlipid (Duplikate), mit SRFE-2-Medium und ohne Sojabohnenlipid neu versorgt, 13,69 und 11,09 Millionen Zellen ergaben; 9,66 Millionen ergaben sich für SRFE-2 plus 1/100 Sojabohnenlipid, mit demselben Medium neu versorgt, während eine Neuversorgung mit SRFE-2 und ohne Lipid 8,51 und 6,27 Millionen in Duplikat-Kulturen ergab.
Aus diesem Experiment ist ersichtlich, daß die MRC-5-Zellausbeuten mit zunehmenden Mengen an Sojabohnenlipid gesteigert wurden. Maximale Zellausbeuten wurden bei Verwendung einer 1/50-Verdünnung von Sojabohnenlipid (höchste getestete Konzentration) erzielt. Der Einschluß von Lipid im zweiten Neuversorgungsmedium ergab mäßig erhöhte Zellausbeuten. Die Daten zeigen jedoch, daß maximale Zellausbeuten durch die Verwendung von 1/50-Lipid im ersten Neuversorgungsmedium erzielt werden können. Die Lipid- Ergänzung kann dann aus dem zweiten Neuversorgungsmedium weggelassen werden. Nachdem hohe Konzentrationen an Lipid für die Virusproduktion schädlich sein könnten, kann es wünschenswert sein, das Lipid während des Viruswachstums wegzulassen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Varicella-Zoster-Virus (VZV)-Lebendvakzins, welches umfaßt:

a. Kultivieren von für eine VZV-Infektion anfälligen Zellen, ausgewählt aus humanen diploiden Zellen, bis zur Konfluenz in Monoschichtkultur unter ausreichenden Ernährungsbedingungen, um die Zellreplikation bis zur Konfluenz sicherzustellen, und Versorgen mit einem nicht-metabolisierbaren Disaccharid;

b. Infizieren der nach Schritt (a) bis nahe an den Punkt der Konfluenz kultivierten Zellen mit VZV-infizierten Zellen;

c. Halten der VZV-infizierten Kultur in einem Zustand guter Ernährung für etwa 22-96 Stunden und Ernten zum Zeitpunkt der maximalen Produktion von infektiösem VZV;

d. Waschen der VZV-infizierten Kultur vor dem Ernten der VZV-infizierten Zellen mit einer physiologischen Lösung;

e. Ernten der VZV-infizierten Zellen in ein Minimalvolumen einer Stabilisierungslösung und entweder sofortiges Aufbrechen der Zellen oder Einfrieren der Zellen für ein späteres Aufbrechen;

f. Aufbrechen der VZV-infizierten Zellen zur optimalen Freisetzung von zellassoziiertem VZV und Entfernen von Zelltrümmern, um eine zellfreie VZV- Präparation bereitzustellen.

2. Verfahren zur Herstellung eines Lebendvakzins mit abgeschwächtem, zellfreiem Varicella-Zoster-Virus (VZV), welches umfaßt:

a. Kultivieren von für eine VZV-Infektion anfälligen Zellen bis zur Konfluenz, wobei das Kultivieren umfaßt:

1. eine Zellaussaatphase,

2. eine Zellwachstumsphase in einem Volumen eines Mediums, welches zur Sicherstellung der Zellreplikation bis zur Konfluenz ausreichend ist, und

3. eine Vorinfektionsphase, umfassend die Exposition der Zellen gegenüber einem nicht-toxischen, nicht-metabolisierbaren Disaccharid;

b. Infizieren der nach Schritt a bis nahe an den Punkt der Konfluenz kultivierten Zellen mit Zellen, die mit abgeschwächtem VZV infiziert wurden;

c. Halten der VZV-infizierten Kultur in einem großen Volumen an Minimalmedium oder einem kleineren Volumen an reichem Medium für 22-96 Stunden bis zum Zeitpunkt der maximalen VZV-Produktion;

d. Waschen der VZV-infizierten Kultur vor dem Ernten mit einer physiologischen Lösung;

e. Ernten der VZV-infizierten Kultur durch

1. Entfernung von Flüssigkeit,

2. Zugabe eines minimalen Volumens an Stabilisatorlösung,

3. Abschaben oder chemisches Freisetzen der VZV-infizierten Zellen,

4. gegebenenfalls Einfrieren der freigesetzten, VZV-infizierten Zellen bei etwa -70ºC;

f. Aufbrechen der freigesetzten, VZV-infizierten Zellen zur optimalen Freisetzung von zellgebundenem VZV und Entfernen von Zelltrümmern und gegebenenfalls Lyophilisieren des zellfreien VZV oder Lagern in flüssiger eingefrorener Form.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die für die VZV-Infektion anfälligen Zellen MRC-5-Zellen sind, der VZV der Oka-Stamm eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus ist, die Kulturtemperatur 30-37ºC beträgt und das Disaccharid Sucrose ist, die mit etwa 20-60 mM bereitgestellt wird.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, worin das Kulturmedium SFRE-2 ist, gegebenenfalls mit etwa 0,02-0,4 mg/ml Sojalipiden ergänzt, und das Virus durch Beschallung oder DOUNCE-Homogenisierung oder beides aus den Zellen freigesetzt wird.

5. Verfahren zur Herstellung eines Lebendvakzins mit abgeschwächtem, zellfreiem Varicella-Zoster-Virus (VZV), welches umfaßt:

a. Kultivieren von MRC-5-Zellen bis zur Konfluenz, wobei das Kultivieren umfaßt:

1. eine Zellaussaatphase in EBME,

2. eine Zellwachstumsphase in SFRE-2, ergänzt mit etwa 0,2 mg/ml Sojalipiden, beginnend etwa 3 Tage nach der Zellaussaat,

3. eine Vorinfektionsphase, umfassend die Exposition der MRC-5-Zellen gegenüber 20-50 mM Sucrose für etwa 24-96 Stunden Vorinfektion;

b. Infizieren der nach Schritt a bis nahe an den Punkt der Konfluenz kultivierten Zellen mit MRC-5-Zellen, die mit abgeschwächtem VZV infiziert wurden;

e. Halten der VZV-infizierten Kultur in einem Zustand guter Ernährung für etwa 37-96 Stunden und Ernten zum Zeitpunkt der maximalen VZV-Produktion;

d. Waschen der Kultur mit phosphatgepufferter Salzlösung, die gegebenenfalls mit 1-100 mM NH&sub4;Cl oder Chloroquin ergänzt ist;

e. Ernten der VZV-infizierten MRC-5-Zellen durch

1. Entfernung von Flüssigkeit,

2. Zugabe eines minimalen Volumens an Stabilisator, gegebenenfalls etwa 1-100 mM NH&sub4;Cl oder Chloroquin mit etwa 230 uM enthaltend,

3. Abschaben der Zellen oder chemisches Freisetzen der Zellen,

4. gegebenenfalls Einfrieren der freigesetzten, VZV-infizierten Zellen bei 70ºC;

f. Aufbrechen der freigesetzten, VZV-infizierten Zellen durch

1. DOUNCE-Homogenisierung,

2. Pelletierung von Zelltrümmern und Aufbewahrung des Überstands,

3. Beschallung des Pellets und erneute Pelletierung, und

4. Vereinigung der Überstände aus den Schritten f-2 und f-3;

g. Verdünnen des Produkts von Schritt (f) in Stabilisator und Abfüllen des Produkts in Einheitsdosen zur Lyophilisierung und Lagerung bei 4ºC oder niedriger, so daß nicht weniger als etwa 1000 PFE pro Dosis zum Zeitpunkt der späteren Verwendung zur Verfügung stehen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bedingungen guter Ernährung in Schritt a entweder ein großes Volumen an Minimalmedium oder ein kleineres Volumen an reichem Medium umfassen.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-4, worin die physiologische Lösung von Schritt d ein lyosomotropes Agens, ausgewählt aus Ammoniumchlorid und Chloroquin, enthält.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Infizieren mit VZV-infizierten Zellen in Schritt b eine Multiplizität der Infektion von 1 : 125 oder größer ergibt.