NO314068B1

NO314068B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av levende varicella zostervirusvaksiner ogfremgangsmåte for dyrkning av celler i monolag samt medium som kananvendes tilslik dyrkning

Info

Publication number: NO314068B1
Application number: NO19944654A
Authority: NO
Inventors: Philip J Provost; David L Krah; Paul A Friedman
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1994-12-02
Publication date: 2003-01-27
Also published as: DE69334254D1; DK0573107T3; EP0573107B1; KR100350169B1; NO944654L; ES2161702T3; WO1993024616A1; CN1082923A; YU38893A; AU4003693A; DE69330850D1; AU673167B2; HUT71863A; US5607852A; HU9403473D0; ATE419332T1; EP1097988B1; RO114906B1; CZ289690B6; RS50330B

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Varicella zoster-virus (VZV) forårsaker kyllingkopper og zoster (helvetesild) . Kyllingkopper er en svært smittsom sykdom som inntrer hos personer uten noen VZV-immunitet. Mer enn 90% av befolkningen eksponeres i løpet av livets to første tiår. Sykdommen er en alvorlig trussel mot de som har under-trykket immunsystem og mot voksne. I mange tilfeller forblir VZV latent i gangliecellene i den nedre del av ryggen. Helvetesild, en smertefull, kronisk tilstand, inntrer når VZV reaktiveres fra den latente tilstand.

Forhindring av kyllingkopper ved vaksinasjon er et ønskelig mål, og man forestiller seg instituering av univer-sell barnevaksinasjon med en levende, svekket varicella-vaksine. Teknikkens stand har rapportert propageringen av VZV i forskjellige cellekultursystemer og bruken av levende, svekket, cellefritt VZV som vaksine. I US patentskrift nr. 3 985 615 beskrives fremstillingen av primære embryoceller fra marsvin av den svekkede Oka-stamme av VZV, egnet for vaksine-bruk. I US patentskrift nr. 4 008 317 beskrives dyrkningen av en temperaturfølsom mutant av VZV i WI-38-celler for anvendelse som en vaksinestabilisator. Preparater som kan anvendes til opprettholdelsen av levedyktig VZV, slik som SPGA, er også kj ent innen teknikken.

Hovedbegrensningen for kommersiell produksjon av en VZV-vaksine er utbyttet av cellefritt VZV fra celledyrkningssystemer som er kjent innen teknikken. Utbytter av cellefritt VZV forbedres med en faktor på ca. 5-20 ganger ved anvendelse av de nye fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således fremgangsmåter for fremstilling av levende, svekket, cellefri VZV-vaksine i høyt utbytte.

Monolageellekulturmetoder kjent innen teknikken, gir vanligvis ca. 80.000 til 160.000 celler/cm<2> [Mann, Dev. Biol. Stand. 37, 149-152 (1977) Wood and Minor, Biologicals 18, 143-146 (1990)]. Anvendelse av monolagcellekulturer for fremstilling av virusantigener har vært hindret av den begrensede tetthet som disse monolagkulturene kan dyrkes til.

Forsøk på å øke cellekulturtettheter har tidligere vendt seg mot spesialiserte perfusjonskulturkar for å øke met-ningstettheter til ca. lx IO<6> celler pr. cm<2> [Mann, Dev. Biol. Stand. 37, 149-152 (1977)]. Foreliggende oppfinnelse gir et unikt middel for å øke celleutbytter samtidig som man bruker eksisterende celledyrkningssystemer.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer således fremgangsmåter hvorved festede celler kan dyrkes til mye større tettheter enn det som hittil var mulig, hvorved det muliggjøres høyere utbytter av virus dyrket på cellemonolag for vaksineproduksjon.

Oppfinnelsen omfatter også et medium som kan anvendes til dyrkning av celler i monolagkultur.

Oppsummering av oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte for fremstilling av en levende varicella zoster-virus(VZV)vaksine, som består av trinnene i den følgende rekkefølge: a) VZV-infeksjonsmottakelige celler valgt fra humane diploidceller, dyrkes til sammenflytning i monolagkultur under betingelser med tilstrekkelig høy nær-ingstilførsel til å oppnå en høy grad av cellereplikasjon, og et ikke-metaboliserbart disakkarid til-føres , b) cellene dyrket i henhold til trinn (a), infiseres så nært punktet for sammenflytning som mulig med så høy

infeksjonsmultiplisitet med VZV-infiserte celler som

praktisk mulig,

c) den VZV-infiserte kultur holdes ved en tilstand av høy næringstilførsel i 22-96 timer, og det innhøstes

på tidspunktet for topproduksjon av infeksiøst VZV,

d) den VZV-infiserte kultur vaskes med en fysiologisk oppløsning som eventuelt inneholder et lysosomotropt

middel, slik som ammoniumklorid eller klorokin, før

innhøsting av de VZV-infiserte celler,

e) de VZV-infiserte celler innhøstes i et minimalt volum av en stabiliserende oppløsning, og cellene brytes enten opp umiddelbart eller cellene nedfryses for

senere oppbrytning,

f) de VZV-infiserte celler oppbrytes inntil optimal fri-gjøring av celleforbundet VZV, og cellerestene fjernes, hvorved man får et cellefritt VZV-preparat.

Videre vedrører oppfinnelsen en ny fremgangsmåte for fremstilling av en levende, svekket, cellefri varicella-zoster-virus(VZV)vaksine, som består av trinnene i den følgende rekkefølge: a) dyrkning av VZV-infeksjonsmottakelige celler inntil sammenflytning, hvor dyrkningen omfatter:

1) en celleinokulasjonsfase,

2) en celledyrkningsfase enten i et så stort volum minimalmedium som praktisk mulig eller i et mindre volum med høynæringsmedium, og 3) en forinfeksjonsfase som omfatter eksponering av cellene mot et ikke-toksisk, ikke-metaboliserbart disakkarid, b) infeksjon av cellene dyrket i henhold til trinn a), så nært opptil punktet for sammenflytning som mulig, med så høy infeksjonsmultiplisitet med svekkede, VZV-infiserte celler som praktisk mulig, c) opprettholdelse av den VZV-infiserte kultur i et stort volum minimalmedium eller et mindre volum rikt medium i 22-96 timer inntil punktet for topp-VZV-produksjon, d) vasking av den VZV-infiserte kultur med en fysiologisk oppløsning som eventuelt inneholder et lysosomotropt middel, før innhøsting,

e) innhøsting av den VZV-infiserte kultur ved

1) fjerning av væske,

2) tilsetning av et minimalt volum stabiliser-ingsmiddeloppløsning, 3) utskraping eller kjemisk frigjøring av de

VZV-infiserte celler,

4) eventuelt nedfrysing av de frigjorte, VZV-inf iserte celler ved ca. -70°C,

f) oppbrytning av de frigjorte, VZV-infiserte celler inntil optimal frigjørelse av cellebundet VZV, og fjerning av cellerester, og eventuelt lyofilisering av det cellefrie VZV eller lagring i flytende, ned-frys t form.

Oppfinnelsen vedrører også en ny fremgangsmåte for fremstilling av en levende, svekket, cellefri varicella-zoster-virus(VZV)vaksine, som består av trinnene i den følgende rekkefølge: a) dyrkning av MRC-5-celler til sammenflytning, hvor dyrkningen omfatter:

1) en celleinokulasjonsfase i EBME,

2) en celledyrkningsfase i SRFE-2 supplert med

ca. 0,2 mg/ml soyalipider, som starter ca.

3 dager etter celleinokulasjon,

3) en forinfeksjonsfase som omfatter eksponering av MRC-5-cellene mot 20-50 mM sukrose i

24-96 timer før infeksjon,

b) infeksjon av cellene dyrket i henhold til trinn a), så nært opptil punktet for sammenflytning som mulig, med så høy infeksjonsmultiplisitet med svekkede, VZV-infiserte MRC-5-celler som praktisk mulig, c) opprettholdelse av den VZV-infiserte kultur i 37-96 timer, og innhøsting på tidspunktet for topp-VZV-produksjon, d) vasking av kulturen med fosfatbufret saltoppløsning som eventuelt er supplert med 1-100 mM NH4C1 eller

klorokin,

e) innhøsting av de VZV-infiserte MRC-5-celler ved:

1) fjerning av væske,

2) tilsetning av et minimalt volum stabiliseringsmiddel som eventuelt inneholder 1-100 mM NH4C1 eller klorokin ved ca. 230 uM, 3) utskraping av cellene eller frigjøring av

cellene kjemisk,

4) eventuelt nedfrysing av de frigjorte, VZV-infiserte celler ved -70°C,

f) oppbrytning av de frigjorte, VZV-infiserte celler ved 1. Dounce-homogenisering, 2. pelletering av rester og bibeholdelse av supernatanten, 3. sonikering av pelleten og nypelletering, og 4. kombinering av

supernatantene fra trinnene f-2 og f-3,

g) fortynning av produktet fra trinn (f) i stabiliseringsmiddel og påfylling av produktet i enhetsdoser

for lyofilisering og lagring ved 4°C eller lavere, slik at ikke mindre enn ca. 1000 PFU er tilgjengelig pr. dose på tidspunktet for senere bruk.

Dessuten vedrører oppfinnelsen en ny fremgangsmåte for dyrkning av celler i monolag, som består av trinnene i følgende rekkefølge: a) inokulering av en dyrkningsbeholder med en celle-mengde i et minimalt eller rikt medium, og cellene

får inokuleres i 24-72 timer,

b) fjerning av mediet fra kulturen ifølge trinn a) og erstatning med friskt, rikt medium, supplert med en

optimalisert konsentrasjon av lipider, og som eventuelt også omfatter et serumsupplement, hvor lipidsupplementet tilveiebringes ved mellom 0,02 mg/ml og

0,4 mg/ml,

c) dyrkning av kulturen av celler i rikt medium supplert med lipid, d) eventuelt erstatning av mediet fra trinn c) med friskt medium som ikke inneholder noe lipidsupplement, etter 24-72 timers vekst.

Endelig vedrører oppfinnelsen et medium som er kjennetegnet ved at det kan anvendes til dyrkning av celler i monolagkultur som omfatter SRFE-2-medium supplert med 0,02-0,4 mg/ml lipider.

Kort beskrivelse av tegningene

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for dyrkning av celler i monolagkultur. Formålet ved oppfinnelsen er å oppnå forøkt celletetthet for festede kulturceller. Dette formålet oppnås ved tilveiebringelse av et anriket dyrkningsmedium supplert med et lipid, ved optimaliserte konsentrasjoner. Ved å dyrke monolagkulturer i henhold til denne oppfinnelsen i det nye medium-lipidpreparat ifølge denne oppfinnelsen, muliggjøres vesentlig forøkte utbytter av virusplakk-dannende enheter (PFU-er) eller virusantigenproduksjon. Således har hepatitt A-virus-, varicella zoster-virus-, rubella-, rotavirus-, mesling-, polio-, kusma- og andre virusvak-siner nytte av anvendelse av celledyrkningsfremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen.

Et foretrukket, anriket medium for anvendelse i denne fremgangsmåten er SRFE-2 (kommersielt tilgjengelig fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, S2138 eller fra Serva Fine Chemi-cals, Heidelberg, Tyskland 47523). Dette mediet ble beskrevet av Weiss et al. [ In Vitro 16( 1), 616-628 (1980)]. Andre, ekvi-valente medier eller små endringer i sammensetningen av SRFE-2 anvendt på samme måte som her beskrevet, faller naturlig innenfor omfanget av denne oppfinnelsen.

Hvilket som helst av en rekke kjente lipidsupplementer kan anvendes med fordel ved denne oppfinnelsen. For eksempel ble kolesterolrike lipider fra serum fra utvokst storfe (Sigma Chemical Co., katalog nr. L-4646), "EX-CYTE"-lipid I eller "Very Low Endotoxin" (VLE)-lipid (Miles Inc., katalog nr. 82-004-7 - 8 og 82-019-1) funnet å være gunstige som supplementer til rikt medium. Et foretrukket lipidadditiv er den kommersielt tilgjengelige soyabønnelipidekstrakt som er tilgjengelig fra Boehringer Mannheim Biochemicals, Indiana-polis IN, katalog nr. 1074 482. Dette materiale, eller et lignende materiale, er beskrevet av Iscove and Melchers [J. al. Exp. Medicine, 147, 923-933, (1979)] som en erstatning for serum i en B-lymfocyttkultur. Det er ikke gjort noe forslag der, og heller ikke er det noe forslag i Boehringer Mannheims katalogproduktbeskrivelse om at soyabønnelipidsupplement ville være anvendbart for supplering av rikt medium. I henhold til disse kildene er lipidet ment for bruk som en serumerstatning i kulturer med minimalt medium. Slik det er brukt ved denne oppfinnelsen, er lipidet et supplement for rikt medium. I tillegg anvendes lipidet i henhold til publiserte kilder, ved en konsentrasjon på ca. 10-100 ug/ml. Ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes lipidet optimalt ved en konsentrasjon som er 2-3 ganger høyere enn konsentrasjonene som er foreslått i litteraturen eller av produsenten. Dessuten kan, slik det er brukt ved denne oppfinnelsen, lipidsupplementet anvendes i tillegg til, og ikke i stedet for, serumsupplering.

Ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen inokuleres MRC-5-celler, WI-38-celler, Vero-celler eller en annen celletype som kan anvendes for viruspropagering, i en dyrkningsbeholder. Den innledende celleutplantingsfase utføres enten i et minimalmedium kjent innen teknikken, slik som EMEM eller EBME, eller i et rikt medium, slik som SRFE-2-medium uten lipidsupplering. Ca. 10% kalvefosterserum (FCS), et slikt antibiotikum som neomycin {ca. 50 ug/ml er passende) og L-glutamin (ca. 2 mM) kan også med fordel tilføres. Cellene dyrkes ved en celle- og virusakseptabel temperatur, vanligvis 30-37°C, og fortrinnsvis ved ca. 35°C, avhengig av viruset som skal fremstilles, i flere dager.

Etter at cellene klart har festet seg og trives i monolågkultur, fjernes minimalmediet eller det anrikede medium og erstattes med nyfremstilt, rikt medium, supplert med en optimalisert konsentrasjon av lipid.

Etter en ytterligere dyrkningsperiode kan mediet igjen fjernes og erstattes med nyfremstilt, rikt medium uten lipidsupplering. Tilførsel av lipid etter at cellene har kom-met til syne eller nådd sammenflytning, er blitt funnet å ikke være produktivt, idet den reduserer maksimale celleutbytter.

Når de dyrkede monolagcellene skal infiseres med et virusinokulum, fjernes lipidsupplementet, og virusmengden innføres i en nyfremstilt mengde rikt medium. Fraværet av lipid i denne nye næringstilførselen muliggjør forlenget cellevekst uten problemet med lipidindusert cellereduksjon nevnt ovenfor.

Etter den ovenfor beskrevne fremgangsmåte oppnås vesentlige økninger i celle- og virusutbytte. For varicella-virus dyrket på MRC-5-céller, oppnås således en vesentlig økning i VZV-PFU-utbytte sammenlignet med når MRC-5-celler dyrkes i minimalmedium eller SRFE-2-medium alene. Likeledes vokser WI-38-celler som kan anvendes til varicelladyrkning eller rubellavirusproduksjon, til vesentlig større tettheter når de dyrkes i henhold til denne nye fremgangsmåten.

Når den anvendes til fremstillingen av en bestemt vaksine, omfatter den nye fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen propagering av VZV i cellekultur og innhøsting av det resulterende VZV under betingelser som optimaliserer virusutbytte og -stabilitet. Fordelene som er beskrevet for fremstillingen av VZV, vil gjelde for fremstillingen av andre kapsel-virus, inkludert herpesvirus enn VZV, meslinger, kusma eller rubella.

Det endelige mål ved denne oppfinnelsen er å tilveiebringe fremgangsmåter som muliggjør effektiv fremstilling av VZV for anvendelse som en vaksine. Fremgangsmåtenes suksess måles gjennom utbyttet av cellefritt VZV som oppnås til sist etter optimalisering av hvert trinn i fremgangsmåtene. Utbyttet bestemmes ved infektivitetstiteren til det endelige cellefrie VZV-preparat. Infektivitetstitrene for preparater av varicella zoster-virus (VZV) ble oppnådd ved hjelp av en fremgangsmåte med agarosebelegg eller flytende belegg beskrevet av Krah et al. (J. Virol. Methods, 1990, 27:319-326). I korte trekk omfatter denne fremgangsmåten dyrkning av MRC-5-celler som er mottakelige for VZV-infeksjon, til en aktivt replikerende tilstand, dvs. til et punkt hvor cellene er ca. 50-80% sammenflytende. Virus belegges så på cellemonolaget i et minimalt volum, får feste seg til cellene og så tilsettes ytterligere dyrkningsmedium. Etter flere dagers dyrkning eksponeres cellene mot en proteinstamme, og klare områder, plakker, telles. For et kjent volum av virusinokulum utgjør således antallet plakkdannende enheter (PFU) pr. milliliter et godt mål for virusutbytte. Multiplisert med det totale volum av cellefritt virus oppnådd fra hvilket som helst bestemt viruspreparat, kan det totale antall PFU beregnes.

På grunn av variasjon i selve analysen er økningen i PFU oppnådd ved hjelp av hvilken som helst bestemt fremgangs-måteoptimalisering, rapportert som et forhold til et mindre optimalisert fremgangsmåtetrinn. Denne rapporteringen av ganger økningen i virusutbytte opphever derfor en eventuell variasjon i selve PFU-analysen. Fremgangsmåtetrinnene som her er beskrevet, resulterer til sist kumulativt i mellom ca. en 16-20 gangers økning i VZV-utbytter oppnådd ved å bruke fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. Denne økning er ikke rapportert i litteraturen, og den utgjør et betydelig bidrag til teknikken med VZV-vaksineproduksjon.

Ettersom VZV-plakkanalysen er tidkrevende, er den ikke særlig rimelig for kontroll under fremgangsmåten. En hurtig VZV-antigen-ELISA muliggjør måling av VZV-antigenmengder slik at overvåkning av virusvekst under fremstilling av levende varicellavaksine muliggjøres. I tillegg kan denne testen brukes til å beregne VZV-antigenmengder i klarede, sonikerte vaksinemengder, og muligens måle antigen i fylte, lyofiliserte vaksineampuller. I korte trekk utføres denne analysen ved inkubasjon av VZV-antigen fra testprøver med anti-VZV-serum i oppløsning. Gjenværende, fritt antistoff får bindes til VZV-antigen immobilisert på ELISA-mikrotiterplater. Mengden av antistoff som er i stand til å bindes til platene, er omvendt proporsjonal med mengden av antigen i testprøven. Antistoffbinding til platene kvantifiseres ved omsetning med et enzymbundet antihuman-antistoff og passende substrat, hvorved man får et farget produkt som kvantifiseres spektrofotometrisk.

VZV-antigen-ELISA- og VZV-plakkanalysene burde generelt gi data som kan korreleres, men det bør huskes på at VZV-antigenanalysen påviser både ikke-levedyktig og levedyktig VZV. Ettersom immunresponsen generert ved hjelp av drept VZV ikke er blitt påvist å være like effektiv som responsen mot levende, svekket virus, er plakkanalysen den avgjørende analyse for bestemmelse av virusinokulumdose for VZV-vaksiner. Antigenanalysen er imidlertid verdifull ved at den gir et mål for den totale antigenmengde som administreres til en mottaker av VZV-vaksine, den er hurtigere enn PFU-analysen og muliggjør derfor overvåking av VZV-produksjon under fremgangsmåtene, og den korrelerer i det minste inntil punktet for topp-VZV-PFU-produksjon, noe som muliggjør beregning av det optimale tidspunkt for innhøsting.

Suksessen ved fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelsen økes trinnvis med hver av de følgende kritiske parametere som alle er innenfor omfanget av denne oppfinnelsen: a. Dyrkning av VZV-infeksjonsmottakelige celler, utvalgt fra humane diploidceller, slik som MRC-5, inntil sammenflytning i monolagkultur, under anvendelse av store kulturvolumer eller rikt dyrkningsmedium for å oppnå en høy grad av cellereplikasjon, og tilførsel av et ikke-metaboliserbart disakkarid, slik som sukrose

Hvilket som helst av en rekke forskjellige cellekultursystemer som er kjent innen teknikken for å være anvendbare for VZV-produksjon, kan anvendes. Således har Vero-celler, WI-38-celler, MRC-5-celler og en rekke andre celletyper blitt brukt for dette formål. Vi har i overensstemmelse med dette brukt MRC-5-celler som er akseptable for fremstilling av vaksine ment for anvendelse på mennesker. Det er imidlertid ikke utenkelig at utbytter av cellefritt VZV vil kunne økes utover det omfang som her er rapportert, dersom det benyttes en særlig produktiv cellelinje som ikke er MRC-5. I den grad en slik cellelinje ville være tilpasningsdyktig for bruk ved den foreliggende fremgangsmåte, omfatter denne oppfinnelsen anvendelse av denne fremgangsmåten på slike celler.

Sammenligning av utbytter av cellefrie, levende virus i enten subsammenflytende eller sammenflytende MRC-5-cellemonolag inkubert ved 35°C under en atmosfære av 5% C02 i "Eagles Minimal Essential Medium" (EMEM) med 2% eller 10% kalvefosterserum (FCS), avslører effekten av cellesammenflytning på utbyttet av cellefrie, VZV-plakkdannende enheter (PFU)

(se eksempel 2, tabell I).

Anvendelse av sammenflytende cellemonolag gir opphav til ca. en 2-3 gangers økning i cellefri PFU/ml sammenlignet med utbyttet oppnådd ved infeksjon av subsammenflytende monolag, uansett om de subsammenflytende kulturer prolifererer aktivt {10% serum) eller ikke (2% serum). Sammenflytende, men ikke aktivt prolifererende celler, synes derfor å være nød-vendige for forøkte VZV-utbytter ved vaksinefremstillingsfrem-gangsmåten.

Prosentandelen av kalvefosterserum som er til stede under virusvekst, synes ikke å ha noen stor effekt på utbytter av cellefrie pfu. Således tilveiebringes vanligvis FCS under cellevekstfasen ved ca. 10%, mens FCS tilveiebringes ved ca. 2% under virusvekstfaser i fremgangsmåten, uansett om det anvendes et minimalmedium, slik som EMEM eller EBME, eller et rikt medium, slik som SRFE-2, for cellevekst og viruskultur.

I tillegg til FCS og mediet tilsettes det vanligvis et slikt antibiotikum som 50 ug/ml neomycin, og glutamin (ca.

2 mM) til celledyrknings- og virusvekstmediene.

1. Celleinokulasjonsfase

Cellekulturbeholdere (kolber, rulleflasker eller funksjonelle ekvivalenter til disse kulturbeholderne) inokuleres med MRC-5 eller andre diploide celler slik at startkon-sentrasjonen av celler er mellom ca. 10.000 og 40.000 celler/- cm<2>. Cellene tilføres dyrkningsmedium supplert med ca. 10% kalvefosterserum, tilsatt 5% C02, og inkuberes ved 30-37°C og fortrinnsvis ca. 35°C.

Cellene kan inokuleres ved et så lite volum som nød-vendig for fullstendig å tildekke celler dyrket i stasjonær kultur. Et brukbart forhold mellom volum og overflateareal er ca. 0,5 ml dyrkningsmedium pr. cm<2> vekstoverflate. Når celler dyrkes i rulleflasker, kan det være passende med så lite som 125 ml pr. 850 cm<2>, men ca. 425 ml/cm<2> er foretrukket.

Kommersielt tilgjengelige minimalmedier kjent innen teknikken for celledyrkning, slik som "Eagles Minimal Essential Medium" (EMEM) eller "Eagles Basal Medium" supplert med "Earle's Salts" (EBME), kan anvendes med ca. 10% FCS for cel-leinokulasj onsf asen. Alternativt kan det med fordel brukes et rikere medium i denne fasen. SRFE-medium [Weiss et al., In Vitro 16( 7), 616-628 (1980)] tilgjengelig fra Sigma, er et rikt medium som kan anvendes med fordel på dette stadium, men et rikt medium er ikke av avgjørende betydning for dette stadium av fremgangsmåten.

2. Celledyrkningsfase

Det er av avgjørende betydning at tilstrekkelig næring tilveiebringes i denne fasen av fremgangsmåten for å sikre vekst av celler til tung sammenflytning. Dette kan oppnås ved å tilveiebringe et stort volum minimalmedium eller et mindre volum rikt medium. Cellene dyrkes ved 30-37°C og fortrinnsvis ved 32-35°C.

Etter at et passende tidsrom for cellefesting og cellevekst har fått passere, kan celler tilføres ny næring ved å fjerne og erstatte mediet og så fortsette inkubasjonen. Mediet kan fjernes ved aspirasjon eller dekantering, eller ved hvilket som helst annet middel så lenge som helheten til cellemonolaget ikke kompromitteres. For MRC-5-celler inokulert som beskrevet ovenfor, kan ny tilførsel av næring foretas ca. 72 timer etter innføring av cellene i kulturbeholderen.

Volumet av kulturmedium som erstattes, kan være det samme som volumet som brukes for celleinokulasjonsfasen. Fortrinnsvis tilveiebringes imidlertid et større volum under cellevekst f asen enn det som ble brukt under inokulasjon. Dette er særlig viktig når celler dyrkes i et slikt minimalmedium som EMEM eller EBME pluss FCS. Et stort kulturvolum er én måte å sikre at cellene får passe mye næring.

Behovet for stort volum kan reduseres når mediet som tilføres for vekstfasen, er et rikt medium. Et særlig foretrukket medium for dette formål er SRFE-2 (Sigma). Anvendelse av et rikt medium på dette stadium i stedet for et minimalmedium forøker i stor grad tettheten av cellemonolaget ved sammenflytning. Den forøkte celletetthet fører til økning av utbyttet av VZV som lar seg erholde fra en infisert cellekultur dyrket i anriket medium. Anvendelse av anriket medium under cellevekstfase har således gitt opphav til ca. en 2-4 gangers økning i slutt-VZV-utbytte sammenlignet med det som ble oppnådd når celler dyrkes i minimalmedier på dette stadium.

Ved en foretrukket utførelsesform suppleres SRFE-2 med lipid. Hvilket som helst av en rekke lipidsupplementer kan anvendes. Således ble kolesterolrike lipider fra serum fra utvokst storfe (Sigma Chemical Co.), "EXCYTE"-lipid I eller "Very Low Endotoxin" (VLE)-lipid (Miles) funnet å være gunstig som supplementer til rikt medium eller minimalmedium. Kommersielt tilgjengelig soyabønnelipid (Boehringer Mannheim, se også Iscove et al., J. Exp. Med. 147, 923-933 (1978)] har vist seg å være et svært gunstig supplement når det tilveiebringes ved ca. 0,2 mg/ml. Celletettheter som når opptil ca. 500.000/cm<2>, er blitt oppnådd under anvendelse av SRFE-2 pluss lipid og FCS. Forøkte VZV-utbytter oppnås når lipid tilveiebringes uansett hvorvidt celledyrkning skjer i minimalmedier eller anrikede medier. Kommersielt tilgjengelig materiale til-føres som en blanding av 20 mg/ml lipid, 100 mg/ml bovint serumalbumin. Dette materialet brukes passende ved en slutt-fortynning på 1:100. Slutt-VZV-utbytte ble forøkt med ca. 9 ganger sammenlignet med VZV-utbyttet fra EMEM alene, og med ca. 3,3 ganger sammenlignet med SRFE-2-medium alene når SRFE-2 ble supplert med ca. 0,2 mg/ml soyabønnelipid under celle-dyrkningsfasen.

3. Forinfeksjonsfase

Vi har oppdaget at sluttutbyttet av VZV kan forøkes ytterligere når dyrkede celler eksponeres mot et ikke-metaboliserbart, ikke-toksisk disakkarid ved en optimal konsentrasjon, før VZV-infeksjon. Én svært vellykket utførelsesform gir 20-60 mM sukrose ca. 72 timer etter at cellene innføres i kulturbeholderen, og fortrinnsvis 24-96 timer før infeksjon av kulturen med VZV. Av praktiske grunner skal man her være oppmerksom på at tilveiebringelse av ca. 50 mM sukrose i mediet for ny tilførsel av næring ifølge trinn 2 ovenfor, imøtekommer disse kriteriene og reduserer antallet sterile manipulasjoner som kreves, ved effektivt å utføre dette og de tidligere trinn samtidig.

Andre disakkarider, inkludert laktose, cellobiose og maltose, forøker også slutt-VZV-utbyttet, men sukrose er foretrukket. Monosakkarider som ble testet, slik som fruktose og ribose, forøkte ikke VZV-utbyttet (ribose kan til og med være toksisk). Det synes som om disakkaridene konsentreres i lyso-symene til de voksende celler slik at disse svelles til vaku-oler [DeCourcy and Storrie, Exp. Cell Res. 192, 52-60 (1991)]. Denne disakkarideffekten på VZV-utbytte kan skyldes svekking av lysosomal skade på VZV. I tillegg til disakkarider kan tri-og tetrasakkarider forventes å ha gunstige effekter ettersom Cohn and Ehrenreich [J. Exp. Med. 129, 201-222 (1969)3 la merke til identisk vakuolisering når disse høyere sukkere eller sukrose ble tilført makrofager, så lenge som sukkerne ikke ble metabolisert av cellene.

b. Infeksjon av cellene dyrket i henhold til trinn (a)

så nært punktet for sammenflytning som mulig, med så stor infeksjonsmultiplisitet for VZV-infiserte celler som praktisk mulig

Ved gjentatte forsøk har vi funnet at celler som fikk bero i 48 timer etter at de var blitt sammenflytende, gjennom-snittlig ga bare ca. 50% av VZV-PFU/ml sammenlignet med utbyttet når nylig sammenflytende celler infiseres med VZV. Det er således viktig å tidfeste innføringen av VZV-inokulumet for så nært sammenfall som mulig med sammenflytning. Dessverre er sammenflytning en parameter som varierer etter typen av medium, celletypen som dyrkes, og andre dyrkningsbetingelser som brukes. For MRC-5-celler inokulert i henhold til trinn (a)(1) ovenfor, infiseres cellene vanligvis på det tidspunktet da sammenflytning oppnås.

Varicella-zoster-viruset (VZV) er fortrinnsvis Oka-stammen av svekket virus beskrevet i US patentskrift nr. 3 985 615, og som er deponert ved ATCC. Dette viruset tilpas-ses vekst i marsvinembryocellekulturer og humane diploidlunge-fibroblastcellekulturer (f.eks. MRC-5-celler).

Et forråd av infeksiøse, levedyktige, varicella-infiserte celler kan fremstilles ved å infisere MRC-5-celler ved en MOI på ca. 1:125, idet de infiserte cellene oppbevares for å muliggjøre virusreplikasjon, cellene trypsineres, og de frigjorte celler brukes umiddelbart som et arbeidsinokulum, eller lagres for senere bruk og PFU-kvantifisering ved sakte nedfrysing med et slikt frysebeskyttelsesmiddel som DMSO eller glyserol, ved ca. IO<7> celler/ml. Det nedfryste, VZV-infiserte celleforråd kan tines opp og tilsettes til en sammenflytende cellekultur for å initiere VZV-infeksjon.

Alternativt kan VZV-infiserte celler lyofiliseres i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Hondo et al., [Archiv fiir de gesamte Virusforschung 40, 397-399 (1973)] som mulig-gjør langvarig lagring av det lyofiliserte inokulum ved 4°C. Det er også mulig å bruke cellefritt VZV som et inokulum, men på grunn av tap i virusutbytte etter innhøsting er det foretrukket med bruk av et cellebundet inokulum.

En annen mulighet for fremstilling av det virus-infiserte inokulasjonsforråd er å initiere cellevekst for virusinokulasjonsproduksjon før inokulering av produksjonsceller. På tidspunktet for inokulumcelleinfeksjon med VZV-inf iserte celler kan inokulering av produksjonsceller initieres for å oppnå sammenflytning på samme tidspunkt som virus-inokulumet når topp-VZV-titere. Mindre optimalt, men mer bekvemt, kan inokulumcellene og hovedcellene alle inokuleres samtidig i et lite volum dyrkningsmedium (ca. 125 ml pr.

850 cm<2> rulleflaske). Etter ca. 2-3 dagers vekst økes flaskene for VZV-inokulumproduksjon i volum til ca. 425 ml, eller tilføres på nytt rikt medium for å muliggjøre vekst til sammenflytning. Produksjonscellene hensettes forholdsvis i en hvileperiode i et lite volum minimalmedium (inkludert ca. 10% FCS) inntil ca. 2 dager før inokulumcellene som skal brukes, infiseres med VZV-infiserte celler. På dette tidspunktet økes produksjonscellevolumet til ca. 425 ml eller tilføres på nytt rikt medium, slik som SRFE-2 pluss en optimal mengde soya-bønnelipid og kalvefosterserum. Produksjonscellene vil så vokse til tung sammenflytning. 2 dager etter tilførsel av næring til produksjonscellene infiseres inokulumcellene som skal anvendes, og som nå er ved sammenflytning, med VZV-inf iserte celler ved en MOI på 1:125 eller høyere, og VZV-replikasjon får fortsette i ca. 2 til 3 dager. På det tids-

punktet da topp-VZV-produksjon i inokulumkulturene nås, vil produksjonscellene ha nådd sammenflytning. Så innhøstes inokulumcellene og tilsettes til produksjonscellene.

Uansett timingen for inokulumproduksjon aspireres mediet fra den VZV-infiserte inokulumkultur på et passende tidspunkt etter VZV-infeksjon, det VZV-infiserte inokulum innhøstes ved trypsinering (ca. 0,25% trypsin) eller annet, ikke-oppbrytende middel, og produksjonscellekulturene infiseres ved en kjent MOI.

Schmidt, N.S. and Lennette, E.H., [Infection and Im-munity 14, 709-715 (1976)] la merke til viktigheten av høy MOI for høyt VZV-utbytte, men gjorde ingen nøye sammenligning med infeksjon ved lav MOI. Foreliggende oppfinnelse gjør nøyaktig denne sammenligning.

Celler infiseres med VZV ved å fjerne dyrkningsmediet fra cellekulturene og erstatte det med friskt medium som inneholder en kjent mengde VZV-infiserte celler fremstilt som beskrevet ovenfor. Virusforrådet titreres fortrinnsvis med hensyn på varicella-plakk-dannende enheter (PFU-er), og mottaker-cellene telles for å muliggjøre kvantifisering av infeksjons-multiplisiteten (MOI). MOI-er uttrykkes som forholdet mellom VZV-infiserte celler i inokulumet og antallet ikke-infiserte monolagceller i kultur. En MOI på 1:10 er således høy, mens 1:625 er lav. En høy MOI er ønskelig, men i praksis kan gode VZV-utbytter oppnås med en MOI så lav som 1:125.

MOI-er på mellom 1:7 og 1:625 gir mellom ca. 500.000 PFU/ml ved den høye MOI og ned til ca. 100.000 PFU/ml ved den lave MOI-ende (se tabell 3 i eksempel 5). Dess høyere MOI, dess kortere er den påkrevde inkubasjonstid for å nå topp-PFU, og dess høyere er utbyttet. Omkring et 5 gangers område i slutt-PFU kan således oppnås avhengig av MOI og innhøstings-tidspunktet.

c. Opprettholdelse av den VZV-infiserte kultur i en tilstand av høy næring i 22-96 timer og innhøsting på tidspunktet for topp- VZV- produksjon

Dyrkningen av de VZV-infiserte celler fortsettes i 22 til 96 timer etter infeksjon. Det er av avgjørende betydning at passe næringstilførsel opprettholdes på dette stadium av virusveksten. Enten tilveiebringelse av store kulturvolumer av et minimalmedium som EMEM pluss ca. 2-10% FCS, eller et mindre volum rikt medium, er ønskelig. Helst tilveiebringes SRFE-2 pluss 2-10% FCS uten tilsetning av lipidsupplering. Det er blitt lagt merke til at lipidet reduserer VZV-utbytte når det inkluderes på dette stadium.

I løpet av de 22-96 timer med etterinfeksjonsdyrkning replikerer VZV i cellene som er blitt infisert og spres for å infisere tilgrensende celler. Gamle, infiserte celler vil imidlertid ikke gi gjenvinnbare, cellefrie PFU-er. VZV-vekst-kurven og det etterfølgende fall kan være ganske skarpe. Kor-rekt timing av tidspunktet for innhøsting er derfor en avgjør-ende parameter for å maksimalisere infeksiøst VZV-utbytte og kan reproduseres nøyaktig ved opprettholdelse av nøye kontroll av input-MOI, næring og inkubasjonstid fra produksjonsforløp til produksjonsforløp. I tillegg kan den hurtige VZV-antigen-ELISA anvendes for å optimalisere innhøstingstidspunktet ettersom infeksiøs VZV-produksjon korrelerer med VZV-antigen-produksjon, i det minste inntil det punkt der virusdød begyn-ner å inntre (se figurene 5 og 6).

For VZV-infiserte MRC-5-celler innhøstet ca. 72 timer etter infeksjon hvor hvert av de ovenfor nevnte trinn var optimalisert (dvs. vekst i rikt medium og preinfeksjonseksponer-ing av cellene mot 50 mM sukrose i 72 timer), ble sluttutbyttet av cellefritt VZV økt med ca. 16 ganger sammenlignet med utbyttet oppnådd i minimalmedium og viral innhøsting etter 48 timer, og med en enda større margin enn når innhøsting er etter 96 timer (se eksempel 8, figur 1). Utbyttet av VZV under de samme optimaliserte betingelser var bare ca. 4 ganger over minimalmediumutbyttet når viruset ble innhøstet 48 timer etter infeksjon, men ble fortsatt mye forbedret sammenlignet med minimalmediumutbyttet etter 96 timer. Virusutbytte er således mye større, og virusdød reduseres mye i rikt medium, og det er ikke noe slikt brått fall i virusutbytte over tid. MOI blir også av mindre avgjørende betydning i rikt medium.

d. Vasking av den VZV-infiserte kultur med en fysiologisk oppløsning, eventuelt inneholdende et lysosomotropt middel, slik som ammoniumklorid eller klorokin, før innhøsting av de VZV- infiserte celler

For å fjerne serum, lipid og cellerester fra kulturen vaskes monolagkulturen med en fysiologisk buffer som ikke lyser cellene. Fosfatbufret saltoppløsning (PBS) er ganske ak-septabel for dette formål. Cellene kan vaskes flere ganger, og vaskeoppløsningen dekanteres, aspireres eller fjernes ved hjelp av andre midler så lenge helheten til monolaget ikke kompromitteres.

Dersom cellene frigjøres kjemisk fra dyrkningsbeholderen, bør de konsentreres ved sentrifugering og den fysiologiske buffer erstattes med en stabiliserende oppløsning.

Tilveiebringelse av ammoniumklorid eller klorokin før celleinnhøsting er blitt funnet å forbedre slutt-VZV-utbytter. Kielian et al. [EMBO J. 5, 3103-3109 (1986)] brukte ammoniumklorid for å regulere den interne pH i celleendosomene hvor infiserende virus tilsynelatende tilbrakte en del av sitt intracellulære liv. Mekanismen med forøkt VZV-utbytte etter eksponering av celler mot lysosomotrope midler er muligens relatert til induksjon av et mindre krevende, endosomalt miljø. Førinfeksjonspåfyllingen av celler med ikke-toksiske, ikke-metaboliserbare disakkarider, slik som sukrose, og eks-poneringen av celler mot ammoniumklorid eller klorokin, kan derfor virke ved lignende mekanismer. I alle tilfeller er den observasjon at slutt-VZV-utbytter økes når ammoniumklorid tilveiebringes ved en sluttkonsentrasjon på mellom 1-100 mM, helst i området 20-50 mM, og fortrinnsvis tilveiebringes ved ca. 4°C i fra ca. 25-50 minutter, før celleoppbrytning, blitt bekreftet empirisk. Et andre lysosomotropt middel, klorokin, ved en konsentrasjon på ca. 230 uM, øker likeledes utvinning av VZV-pfu/ml.

e. Innhøsting av de VZV-infiserte celler i et minimalt volum av en stabiliseringsoppløsning, og enten oppbrytning av cellene umiddelbart eller nedfrysing av cellene for senere oppbrytning

Så snart de VZV-infiserte celler er blitt vasket, kan de innhøstes ved utskraping dersom dyrkningsbeholderen til-later dette, eller ved å løsrive cellene kjemisk. Enzymatisk frigjørelse av cellene er mindre ønskelig ettersom gjenværende enzym kan redusere virusutbytte så snart cellene brytes opp. Som angitt ovenfor, konsentreres cellene ved sentrifugering dersom cellene frigjøres i fysiologisk saltoppløsning, og den fysiologiske saltoppløsning erstattes med et minimalt volum av VZV-stabiliserende oppløsning. Et godt volum for overflateareal av cellevekst er ca. 40 ml stabiliseringsmiddel pr.

850 cm<2>.

Virusstabiliseringsmidler er kjent innen teknikken. Stabilisering med 5% sukrose i fosfatbufret saltoppløsning er således foreslått i US patentskrift nr. 3 985 615, mens andre rapporter anbefaler mer komplekse stabiliseringsmidler, slik som SPGA.

Etter at de VZV-infiserte celler er blitt oppslemmet på nytt i en stabiliseringsoppløsning, kan cellene brytes opp umiddelbart, eller i det tilfellet at store mengder VZV fremstilles, fryses ned ved -70°C for senere bearbeiding. VZV-utbyttet pr. cm<2> cellevekst vil være litt større dersom cellene oppbrytes umiddelbart, men frysetrinnet gir vanligvis ikke et tap på mer enn 10% av utbyttet erholdt ved umiddelbar be-arbeidelse .

f. Oppbrytning av de VZV-infiserte celler for på optimal måte å frigjøre cellebundet VZV, og fjerning av cellerester, hvorved det fås et cellefritt VZV- preparat

Som beskrevet ovenfor, fjernes dyrkningsmediet fortrinnsvis fra cellene før oppbrytning og erstattes med et minimalt volum VZV-stabiliseringsmiddel som cellene skrapes ut i eller på annen måte frigjøres i. Cellesuspensjonen avkjøles til 0-4°C, og cellene brytes så opp på passende måte, slik som ved sonikering, Dounce-homogenisering, andre typer av skjær-krefter som er bedre oppskalerbare enn Dounce, eller en kombinasjon av disse teknikkene.

Vi har bekreftet at sonikering alene ikke gir den beste utvinning av cellefritt VZV. Når Dounce-homogenisering anvendes som et innledende oppbrytningstrinn, etterfulgt av sentrifugering, retensjon av supernatanten som supernatant I, etterfulgt av sonikering av pelleten og sentrifugering for å oppnå supernatant II, økes faktisk VZV-utbyttet fra oppbryt-ningen mye. Det kombinerte utbytte av supernatant I og II har blitt så mye som fire ganger utbyttet når sonikering alene brukes som oppbrytningsteknikk.

Etter celleoppbrytning utføres fjerning av cellerester ved sentrifugering, filtrering eller hvilken som helst annen metode som er kjent innen teknikken for å fjerne cellerester mens VZV blir uskadet tilbake. Det cellefrie viruspreparat fortynnes så med stabiliseringsoppløsning og deles opp for anvendelse som vaksine. For langvarig lagring lyofiliseres fortrinnsvis VZV ved hjelp av én av metodene som er kjent innen teknikken.

For å oppsummere, er omtrentlige, potensielle utbytteøkninger ved å følge de optimaliserte trinn ifølge denne fremgangsmåten, sammenlignet ved VZV-produksjon ved cellevekst i minimalmedier, rapportert nedenunder:

Utnyttbarhet av denne fremgangsmåten for vaksineproduksjon

Utnyttbarheten av svekket, cellefritt VZV som vaksine for å forhindre kyllingkopper, er blitt vist. Multiple klin-iske undersøkelser har klart bevist denne utnyttbarheten, og slike bevis er nå en del av teknikkens stand [se f.eks. Pediatrics 88 (3), 604-607 (1991); Pediatrics 87 (5), 604-610

(1991)]. Det enorme bidrag som denne oppfinnelsen gir teknikken, er således at den tilveiebringer en svært virkningsfull fremgangsmåte for høyutbytteproduksjon av levende, svekket VZV. Virus fremstilt i henhold til denne oppfinnelsen, kan formuleres som en vaksine i henhold til fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, og administreres i henhold til regimer som nå er godt etablerte. For eksempel kan det levende, svekkede, cellefrie VZV-produkt ifølge denne oppfinnelsen fortynnes i stabiliseringsmiddel, fylles i flasker, lyofiliseres i éndoser slik at, etter lagring ved ca. 4°C eller lavere, vil en dose på ca. 1000 PFU være tilgjengelig på brukstidspunktet. VZV-vaksinen fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen, kan anvendes i éndosepreparater for å inokulere mennesker slik at immunresponser som gir beskyttelse mot infeksjon av virulente stammer av VZV, induseres. Fortrinnsvis administreres minst en dose på ca. 2 000 PFU/ml (1000 PFU/0,5 ml dose) subkutant eller intramuskulært. Så høye doser som i alt 15.000 til 20.000 PFU er blitt administrert og er akseptable.

Ved å tilveiebringe en optimalisert fremgangsmåte for fremstillingen av et svekket VZV-virus gjør denne oppfinnelsen det mulig å anvende det som er kjent innen teknikken, for å formulere en vaksine for forsterkning av anti-VZV-immunresponser slik at kyllingkopper forhindres.

De følgende eksempler er gitt for det formål å illus-trere foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Analyse med hensyn på VZV- utbyttebestemmelse

Infektivitetstiterne for preparater av varicella zoster-virus (VZV) beregnes ved å bruke agarosebelegg- eller flytende beleggfremgangsmåten beskrevet av Krah et al. (J. Virol. Methods, 1990, 27:319-326). Analysen utføres på følg-ende måte: MRC-5-celler inokuleres i 60 mm vevskulturplater ved 6 x IO<5> celler i 5 ml volumer av BME ("Basal Medium Eagle" med Hanks oppløsning av avveide salter) med 100 mg/l galaktose,

50 ug/ml neomycin, 2 mM L-glutamin, og inkuberes ved 35°C i en 5% C02-atmosfære. Etter inkubasjon i 24-48 timer når cellene 50-80% sammenflytning. Dyrkningsmediet fjernes ved aspirasjon, og cellene infiseres med 100 ul VZV-oppløsning fortynnet i passende virusfortynningsmiddel, slik som SPGA-buffer, eller flytende opprettholdelsesmedium (LMM). SPGA-buffer inneholder 7,5% (vekt/volum) sukrose, 11 mM kaliumfosfat, 0,1%

(vekt/volum) natriumglutamat og 1% humant serumalbumin.

Virus får feste seg i >1 time ved 35°C i en 5% C02-atmosfære. De VZV-infiserte cellekulturer tildekkes så med 5 ml agarosebeleggmedium (AOM) eller flytende opprettholdelsesmedium (LMM). Agarosebeleggmedium er en blanding av to oppløsninger, flytende beleggmedium (LOM) og agaroseoppløsning. LOM inneholder minimalt, essensielt medium med Earles salter (MEM), 2% varmeinaktivert kalvefosterserum, 50 ug/ml neomycinsulfat og 2 mM L-glutamin. Agaroseoppløsning fremstilles ved å varme opp 4,5 g agarose med lav geldannelsestemperatur i 100 ml MEM i 15 minutter ved 121°C og la oppløsningen avkjøles til 45°C. AOM fremstilles ved å blande 1 volumdel agaroseopp-løsning med 4 volumdeler av et 1,25 x konsentrat av LOM ved 45°C. Platene avkjøles til 23-25°C for å la AOM størkne. Kulturene inkuberes for å muliggjøre plakkutvikling. Etter 6-7 dager belegges platene som fikk LOM, med 5 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og kantes med en Pasteur-pipette av glass for å løsne og fjerne agarosen. Medium suges bort fra platene som fikk LMM, og plakker synliggjøres ved å farge cellene med en oppløsning av 0,2% (vekt/volum) Coomassie Blue R-250 i etanol med 1% eddiksyre. Plakktellinger er gjennomsnittet av 4-5 replikaplater og uttrykkes som plakkdannende enheter pr. ml (PFU/ml).

På grunn av mulig variabilitet ved analysen er økninger i VZV-utbytte rapportert i forhold til ikke-optimaliserte betingelser analysert på identisk måte.

Eksempel 2

VZV- utbytte som funksjon av cellesammenflytning ved infeksjon

MRC5-celler ble platet ut ved 4 x IO<6> celler/150 cm<2 >og fikk vokse i 3 dager i Earles salter supplert med "Eagles Basal Medium" (EBME) i nærvær av 10% kalvefosterserum (FCS). Etter å ha nådd en sammenflytende celletetthet på ca. 12 x IO<6 >celler/150 cm<2> tilføres cellene på nytt friskt EBME supplert enten med 2% FCS eller 10% FCS. På dette tidspunkt fikk de sammenflytende celler vokse videre, enten i nærvær eller fravær av VZV-infeksjon (MOI=l:125), og økningen i celletetthet og virusutbytter etter 48 timer ble overvåket. Det ble funnet at ikke-infiserte celler i 2% FCS økte i tetthet med bare 33%, mens de økte med 92% i 10% FCS. Celler.i de infiserte kulturer økte ikke i antall. Som vist i tabell I, ble virusutbyttene fra de sammenflytende celler ikke påvirket av kapasiteten med hensyn på cellereplikasjon i kulturene, enten de var minimalt (2% FCS) eller maksimalt (10% FCS) supplert med FCS.

Andre cellekulturer ble dyrket i ytterligere 2 dager i 10% FCS til ca. 20 x IO<6> celler/150 cm<2> kolbe (en sammenflyt-ningsbetingelse), og så på nytt tilført nytt EBME supplert enten med 2% FCS eller 10% FCS og ble enten infisert med VZV (MOI 1:125) eller forble ikke-infisert. Økningen i celletetthet og virusutbytter ble overvåket etter 48 timer. Det ble funnet at ikke-infiserte celler i 2% FCS ikke hadde økt i tetthet, men celler i 10% FCS hadde økt med bare ca. 15%. Ingen av betingelsene var således i stand til å gi noen særlig cellereplikasjon. Virusutbytter i enten 2% FCS eller 10% FCS var like, og begge ble økt med ca. tre ganger over utbyttet fra celler infisert ved subsammenflytning (se tabell I). Den foretrukne anvendelse av nylig sammenflytende cellemonolag i motsetning til aktivt replikerende, subsammenflytende cellemonolag for optimale utbytter av cellefritt VZV, fastslås således .

Eksempel 3

Sammenligning av VZV- utbytte fra nylig sammenflytende og sammenflytende kulturer som har vært lagret

Rulleflasker (850 cm<2>) ble inokulert med MRC-5-celler ved en konsentrasjon på omtrent 26.500 celler/cm<2>. Alle cellene ble dyrket i EBME-medium inneholdende 10%

(volum/volum) kalvef osterserum (FCSi0) i en 5% CC-2-atmosf ære ved 35°C. Kolbene ble delt i to grupper basert på tidspunktet for infeksjon med VZV. Celler fra gruppe I ble dyrket i 5 dager på hvilket tidspunkt cellemonolagene ble sammenflyt-

ende. På dette tidspunktet ble mediet fjernet og cellene infisert med cellebundet VZV ved en MOI på 1:125, oppslemmet i EMEM + 2% FCS. Ytterligere medium ble tilsatt, og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer. Celler fra gruppe II ble oppbevart i ytterligere 48 timer før infeksjon ved en MOI = 1:125.

Fremstillingen av VZV ved hjelp av celler fra grup-pene I og II ble bestemt på følgende måte: medium ble fjernet fra ruileflaskene, og cellene ble skyllet med fosfatbufret

saltoppløsning, skrapet av med glasskuler i like store volumer stabiliseringsmiddel og avkjølt til 4°C. De kalde cellesuspen-sjonene ble brutt opp ved hjelp av sonikering. Cellerester ble fjernet fra virus ved hjelp av lavhastighetssentrifugering (325 x g i 10 minutter), og virussupernatanten ble beholdt. VZV-produksjon ble målt ved hjelp av plakkanalysen. Som vist i tabell 2, ble det oppnådd en økning i utbyttet på bortimot to ganger når nylig sammenflytende cellemonolag ble infisert med

VZV.

Eksempel 4

Effekt av kulturvolum på VZV- PFU/ ml- utbytte

MRC-5-celler (10 millioner) ble inokulert i 125 ml volumer EBME, 10% FCS, 50 ug/ml neomycin og 2 mM L-glutamin i 850 cm<2> rulleflasker, og inkubert ved 35°C i 3 dager. 300 ml nytt medium ble tilsatt, og kulturene ble returnert til inkubasjon ved 3 5°C i 4 ytterligere dager. Medium ble så fjernet og erstattet med 125 eller 425 ml EMEM, 2% varmeinaktivert FCS, 50 ug/ml neomycin og 2 mM L-glutamin. VZV-infiserte MRC-5-celler ble tilsatt {MOI ca. 1:125), kulturene ble gasset med 5% C02 og returnert til inkubasjon ved 35°C i 46 timer. Medium ble fjernet, cellene ble vasket fire ganger med 100 ml volumer PBS og avskrapt ved hjelp av glasskuler i stabiliseringsmiddel i volumer på 43 ml. Celler ble nedfryst ved -70°C. Cellefritt virus ble fremstilt ved sonikering. Mengder av infeksiøst virus i klarede (ved sentrifugering) sonikater ble målt i VZV-plakkanalysen.

Konklusjon: Anvendelsen av det største mediumvolum resulterer i ca. en to-gangers økning i utbytter av infeksiøst VZV fra MRC-5-ce11ekulturer.

Eksempel 5

Effekt av VZV- MOI på VZV- PFU/ ml- utbytte

Rulleflasker ble inokulert med MRC-5-celler og dyrket til sammenflytning. Dyrkningsmediet ble fjernet, og celler ble infisert med VZV ved varierende MOI-er. Fremstillingen av VZV ved hjelp av de infiserte cellekulturer ble bestemt ved å bruke plakkanalysen ved periodevis innhøsting og analysering som i eksempel 1. Som vist i tabell 3 og i figur 5, var utvinning av cellefritt, infeksiøst VZV større og ble oppnådd i løpet av en kortere inkubasjonsperiode når høyere MOI-er ble anvendt. Topp-antigennivåer oppnås også hurtigere med høyere MOI. Med svært lav MOI, slik som 1:625, forsinkes antigenprod-uksjonen og blir suboptimal (se figur 6).

Eksempel 6

Den økte stabilitet for VZV i et stabiliseringsmiddel ved

- 20°C

Infiserte cellekulturer ble sonikert i SPGA og vasket med fosfatbufret saltoppløsning. Cellebundet virus ble så frigjort ved sonikering, og celleresten ble fjernet ved sentrifugering. Konsentrasjonen av cellefritt virus ble regulert til en kjent PFU/ml-konsentrasjon, og aliquoter av viruset i stabiliseringsmiddel ble lyofilisert og lagret ved 4°C eller -20°C. Ved 1 måneds intervaller i løpet av i alt 14 måneder ble prøver rekondisjonert, og den gjenværende PFU/ml-titer ble bestemt. Resultatene av dette forsøket er vist i figur 3.

Den betydelige fordel for VZV-stabilitet oppnådd ved lagring ved -20°C i stedet for ved 4°C, er helt klar.

Eksempel 7

Effekt på slutt- VZV- utbytte av mengde og timing for sukrosetilsetning under forinfeksjonsfase av cellevekst 1. Celleinokulasjonsfase

MRC-5-celler (5 ml) ble inokulert ved en konsentrasjon på 120.000 celler/ml (600.000 celler totalt) på 60 mm plater i EBME-medium inneholdende 10% FCS, 50 ug/ml neomycin og 2 mM L-glutamin, og inkubert ved 35°C under 5% C02.

2. Cellevekst/ forinfeksjonsfase

Cellene ble sammenflytende på den tredje dag etter inokulering. Inokuleringsmediet ble sugd bort fra 4 8 plater og ble erstattet med 8 ml volumer dyrkningsmedium inneholdende enten EBME eller SRFE-2 supplert med 10% FCS, 50 ug/ml neomycin, 2 mM L-glutamin og 0,2 mg/ml soyabønnelipid/1 mg/ml BSA enten med eller uten 50 mM sukrose. Etter tilsetning av det nye dyrkningsmedium ble cellene inkubert i ytterligere 3 dager ved 35°C under 5% C02.

3. VZV- infeksjon

Mediet ble så fjernet fra hver plate og erstattet med 8 ml EMEM i stedet for EBME og SRFE-2 i stedet for SRFE-2 pluss soyabønnelipider. FCS ble redusert til 2% for alle platene, men de øvrige supplementene, neomycin, glutamin og sukrose, var som under vekstfasen. Hver plate fikk så 333 ul av en 1:16 fortynning av VZV-infiserte celler {47.000 PFU/ml) i EMEM, 2% FCS, neomycin og glutamin.

VZV fikk replikere ved 35°C under 5% C02 i 2 dager, og mediene fra 2 plater fra hver forskjellig betingelse ble fjernet. Cellene ble vasket fire ganger med PBS. Cellene ble skrapt av i 1,2 ml/plate iskaldt stabiliseringsmiddel. Inn-høstingen fra platene in duplo ble slått sammen i 50 ml kon-iske sentrifugerør og nedfryst ved -70°C.

Den samme fremgangsmåte som beskrevet i avsnittet ovenfor, ble gjentatt for to plater fra hver betingelse på den tredje, fjerde og femte dag etter VZV-infeksjon, og den sam-menslåtte innhøsting fra hvert sett av to plater ble lagret ved -70°C.

Hver celleinnhøsting fremstilt som beskrevet ovenfor, ble senere opptint, sonikert på is i 30 sekunder pr. rør under anvendelse av en "cup-horn"-sonikator og klaret ved sentrifugering ved 1000 x g i 10 minutter ved 4°C. Aliquoter av supernatantene ble fjernet for plakkanalyse. Resultatene av plakkanalysen utført som beskrevet i eksempel 1, er vist i figur 1.

Dataene vist i figur 1, bekrefter flere konklusjoner:

1. Forinfeksjonsinkubasjon av celler med 50 mM sukrose er svært gunstig for slutt-VZV-utbyttet. I hvert medium, EMEM eller SRFE-2, var VZV-utbytter høyere når cellene ble behand-let med sukrose før infeksjon. 72 timer etter infeksjon ga VZV-utbyttet i SRFE-2-dyrkede celler eksponert mot sukrose, ca. 16 ganger VZV-utbyttet, målt som PFU, i forhold til det celler i minimalmedier uten sukrose ga! 2. Tilførselen av rikt medium (SRFE-2 pluss soyabønne-lipider under dyrkning og SRFE-2 under virusvekst) er gunstig for VZV-utbyttet, men sammen med sukroseeffekten muliggjøres fremstilling av en størrelsesorden mer VZV. Det rike medium synes således å virke synergistisk sammen med sukroseeffekten. 3. Tidspunktet for VZV-innhøsting er svært betydnings-fullt. Selv under de optimaliserte dyrkningsbetingelser, SRFE-2 og sukrose etc, er topp-VZV-utbyttet ikke oppnådd 48 timer etter infeksjon. På dette tidspunkt er det bare oppnådd en fire gangers økning over minimalmediumutbytte. 72 timer etter infeksjon er det imidlertid en 16 gangers økning i VZV-utbytte.

I separate forsøk ble VZV-utbyttet ikke økt så mye dersom 50 mM sukrose ble tilsatt på infeksjonstidspunktet i stedet for 72 timer før infeksjon, noe som viser viktigheten av en lang forinfeksjonsfase for intracellulær akkumulering av sukrose. Vi fant også at tilsetning av 25 mM eller 100 mM sukrose var mindre gunstig enn 50 mM sukrose. De samme omtrentlige konsentrasjoner gjelder for laktose, cellobiose og maltose.

Eksempel 8

Effekter av flere forbedrede fremgangsmåteparametre på VZV-utbytte

Et rulleflaskeforsøk ble gjort for å bestemme effek-tene av forskjellige fremgangsmåteendringer (dyrkningsmedium, sukrosesupplering, tilsetning av NH4C1 til stabiliseringsmid-let, Dounce-behandling eller sonikering for virusfrigjørelse fra celler) på utbytter av cellefrie VZV-PFU. Kulturer ble inokulert ved 80 x IO<3> celler/ml x 125 ml EBME, 10% FCS pr. rulleflaske. Disse ble regulert til 425 ml med EBME eller på nytt tilført SRFE + soyalipidmedium, og infisert med arbeidsinokulasjons-VZV i 125 ("lite volum") eller 425 ("stort volum") ml EMEM- eller SRFE-medium (uten soyalipid). Tids-beregningen for disse mediumendringene/infeksjon var som beskrevet i eksempel 7. På forskjellige tidspunkter før infeksjon (96 eller 24 timer før infeksjon, eller på tidspunktet for infeksjon) ble sukrose (suc) tilsatt til 50 mM. Kulturer som fikk sukrose før infeksjon, fikk også sukrose i virusin-feksjonsmediet. Alle kulturene ble infisert ved en omtrentlig MOI = 1:15, idet VZV-infiserte celler i EMEM-kulturer ble innhøstet 46 timer i etterinfeksjonsstabiliseringsmiddel inneholdende 20 mM NH4C1 (N), eller uten noe supplement. Alle prøvene ble nedfryst ved -70°C, og virus ble deretter frigjort fra celler enten ved sonikering eller Dounce-homogenisering. Alle prøvene ble klaret ved sentrifugering ved 1000 g i

10 minutter.

PFU-resultatene oppnådd for sonikerte prøver, ga de følgende konklusjoner: 1. Anvendelsen av det "høye" mediumvolum av EMEM økte VZV-PFU to ganger. Med SRFE synes det her og i andre forsøk som om optimale PFU-utbytter oppnås nær det "lave" mediumvolum. I noen tilfeller undertrykkes utbyttene av det "høye" mediumvolum. 2. NH4CI er ikke av avgjørende betydning for høye PFU-utvinninger. 3. Sukrose økte PFU-utbytter to ganger for EBME/EMEM- og 5 ganger for SRFE-kulturer. Det synes å være en effekt på tidspunktet for sukrosetilsetning på PFU. I en annen gren av dette forsøket var PFU-utbytter 94 x IO<3> for SRFE + soya/SRFE-kulturer som ikke fikk sukrose, og 296 x IO<3>, 427 x IO<3> og 671 x IO<3> for kulturer som fikk sukrose henholdsvis ved infeksjon, 24 timer før infeksjon og 96 timer før infeksjon. 4 . De sukrosebehandlede kulturer oppviste signifikant lavere cytopatiske effekter enn deres sukrosefrie motparter. Ved et annet forsøk oppviste sukrosebehandlede kulturer fortsatt ikke degenerative, cytopatiske effekter 1 uke etter infeksjon, mens deres sukrosefrie kontroller ble fullstendig lysert. Det er derfor mulig at de sukrosebehandlede celler vil akkumulere mer VZV (antigen og spesielt PFU) ved forlengede inkubasjonstider (utover de 46 timene med innhøsting fra rulleflaskeforsøket). 5. MOI ble i dette forsøket ikke regulert med hensyn på høyere cellekonsentrasjoner på tidspunktet for infeksjon på grunn av cellevekst i SRFE-medium. Selv høyere PFU-utbytter kunne således oppnås dersom denne parameteren ble optimalisert .

Eksempel 9

Utbytte av cellefritt VZV oppnådd ved hjelp av mekanisk skjærkraft, sonikering og en kombinasjon av disse

Et storskalaforsøk ble utført under anvendelse av flere forskjellige betingelser for VZV-produksjon, som var likt med forsøket beskrevet i eksempel 8. En ny parameter, celleoppbrytningsmåten, ble analysert i dette forsøket. Resul-tater er rapportert nedenunder hvor cellefritt VZV-utbytte oppnådd ved hjelp av Dounce-homogenisering alene, sonikering alene og en kombinasjon av Dounce og sonikering, ble sammenlignet. De rapporterte VZV-dyrkningsbetingelser er for celler dyrket i minimalmedium (EBME/EMEM) eller ved høy næringstil-førsel (SRFE-2 pluss soyabønnelipider/SRFE-2 pluss 50 mM sukrose i forinkubasjonsfasen). Celler ble dyrket og innhøstet som beskrevet i eksempel 8, og VZV-pfu/ml ble bestemt ved hjelp av analysen beskrevet i eksempel 1:

Fra disse dataene er det klart at en vesentlig forøkning av VZV-utbytte lar seg oppnå når mekanisk skjærkraft kombineres med sonisk oppbrytning av celler.

Eksempel 10

Anvendelse av SRFE- 2- medium og soyabønnelipidsupplement for å oppnå forøket utvinning av levende varicella- vaksine fra MRC-5- celler

MRC-5-celler ble inokulert i 25 cm<2> T-kolber i EBME og inkubert i 3 dager ved 35°C. Medium ble fjernet og erstattet med 12,5 ml friskt EMEM-medium, eller SRFE-2-medium med 10% FCS, neomycin, glutamin og enten ikke noe soyabønnelipid eller en 1:200 fortynning av lipid. Kulturer ble inkubert i ytterligere 3 dager ved 35°C. Media ble så fjernet, og celler mottok VZV-infiserte MRC-5-celler og 12,5 ml volumer av 2% kalvefosterserum, neomycin, glutamin i EMEM eller SRFE-2. Dyrkningsbetingelsene angitt som "SRFE-2", mottok SRFE-2 under celledyrkning og virusdyrkning. "SRFE + soya"-betingelsen an-gir prøver som mottok SRFE-2-medium og en 1:200 fortynning av soyabønnelipid under celledyrkning, men bare SRFE-2-medium under virusdyrkning. Etter dyrkning i 48 timer ble media fjernet, celler ble skyllet 4 ganger med 5 ml volumer av PBS og skrapt ut i 1,2 ml volumer stabiliseringsmiddel. Prøver fra kolber in duplo ble slått sammen og nedfryst ved -70°C. Etter påfølgende opptining ble celler brutt opp ved sonikering, klaret ved sentrifugering (1000 g i 10 minutter), og super-natanter ble nedfryst ved -70°C for senere analyse av virus-infektivitetstitere. Resultatene er vist i figur 4. Konklusjoner: Anvendelse av SRFE-2-medium i stedet for EMEM resulterte i en 2,5 gangers økning i utvinning av levende varicella. Anvendelse av soyabønnesupplert SRFE-2 under celledyrkning muliggjorde en ytterligere 2,7 ganger økning i virus-utvinning, for en netto 7 ganger økning over det som ble oppnådd under anvendelse av EMEM-virusdyrkningsfremgangsmåten.

Eksempel 11

Kompetitiv ELISA for kvantifisering av VZV- antigen

Ettersom VZV-plakkanalysen er tidkrevende, er den ikke særlig egnet for kontroll under fremgangsmåten. En hurtig VZV-antigen-ELISA muliggjør måling av VZV-antigenmengder som igjen muliggjør overvåkning av virusvekst under fremstilling av levende varicella-vaksine. I tillegg kan denne testen brukes til å beregne VZV-antigenmengder i klarede, sonikerte vaksinemengder, og eventuelt til å måle antigen i fylte, lyofiliserte vaksineglass. I korte trekk utføres denne analysen ved inkubasjon av VZV-antigen fra testprøver med anti-VZV-serum i oppløsning. Gjenværende, fritt antistoff får bindes til VZV-antigen immobilisert på ELISA-mikrotiterplater. Mengden av antistoff som er i stand til å bindes til platene, er omvendt proporsjonal med mengden av antigen i testprøven. Antistoffbinding til platene kvantifiseres ved reaksjon med et enzymbundet anti-humanantistoff og passende substrat, hvorved man får et farget produkt som kvantifiseres spektrofotometrisk.

VZV-antigen-ELISA- og VZV-plakkanalysen burde generelt gi korrelative data, men det bør huskes på at VZV-antigenanalysen påviser både ikke-levedyktig og levedyktig VZV. Ettersom immunresponsen generert ved hjelp av drept VZV ikke er blitt påvist å være like effektiv som responsen på levende, svekket virus, er plakkanalysen den analysen som har avgjør-ende betydning for bestemmelse av virusinokulumdose for VZV-vaksiner. Antigenanalysen er imidlertid også verdifull ved at den gir et mål for den totale antigenmengde som administreres til en VZV-vaksinemottaker.

Testprosedyre:

1. ELISA-plater belegges med glykoproteiner (gps) fra VZV-infiserte eller uinfiserte MRC-5-celler, og over-dekkes med 1% bovint serumalbumin [fraksjon V, nr. A-9647, Sigma] og 0,1% NaN3 for å redusere ikke-spesi-fikk adsorpsjon av antistoffer til platene. Annenhver rad belegges med VZV og kontrollantigen {dvs. radene A, C, E og G får VZV-gp, og radene B, D, F og H får uinfisert MRC-5-gp-antigen). 2. Klaret (3250 g-min.) testantigen fortynnes i stabiliseringsmiddel i 12 x 75 mm rør eller mikrorør. Et standardvirusantigenpreparat (26 enheter/ml VZV-antigen ved "dot blot"-analyse) fortynnes i forholdet 1:10 og seriefortynnes så i forholdet 1:1,2 fem ganger, hvorved man får antigenkonsentrasjoner på 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1 og 0,9 enheter/ml. Ytterligere fortynninger kan tas med, hvorved man får 0,7 og 0,5 enheter/ml antigen. Denne fortynningsserie brukes til å frembringe en standardkurve for målingen av antigenmengder i testprøver. 3. Et humant anti-VZV-serum fortynnes i stabiliseringsmiddel til to ganger den endelige, ønskede fortynning . 4. 300 ul volumer fortynnet antigen dispenseres i mikrorør, blandes med 300 ul fortynnet anti-VZV-serum og inkuberes ved 3 5°C i 15-22 minutter. En kontroll omfatter humant anti-VZV og fortynning (ikke noe antigen). 5. Aliquoter å 100 ul fra hver serumantigenblanding tilsettes til 2 replikabrønner belagt med VZV-glykopro-tein (VZV-gp) og 2 brønner belagt med MRC-5-gp (4 brønner pr. prøve) {f.eks.: eksempel 1 i kolonne 1, radene A, B, C og D; prøve 2 i kolonne 2, radene A, B, C og D; etc.). 6. Plater inkuberes i 15 ± 1 minutt ved 35°C for å gjøre det mulig for fritt antistoff (ikke kompleksert til antigen i oppløsning) å binde seg til virusantigen immobilisert på platene. 7. Ubundet antistoff fjernes ved vasking, og brønnene får et alkalisk, fosfatasekonjugert geit-anti-human-IgG for å påvise bundet, humant antistoff. 8. Etter inkubasjon i 15 ± 1 minutt ved 35°C fjernes ubundet konjugat ved vasking. Bundet konjugat påvises ved inkubasjon i 15 minutter ved 35°C med p-nitro-fenylfosfatsubstrat oppløst i dietanolaminbuffer. 9. Etter avslutning av substratreaksjonen ved tilsetning av 50 ul/brønn 3 M NaOH, kvantifiseres fargefremkal-ling (OD ved 405 nm) ved å bruke et mikroplatespek-trofotometer.

Testberegninger og fortolkning:

1. Gjennomsnittsverdien for de respektive replika-OD-verdier for de replika-VZV- og -MRC-5-belagte brønner beregnes. Erfaring har vist at MRC-5-OD er i overensstemmelse mellom forskjellige prøver og fortynninger. De gjennomsnittlige MRC-5-verdier for hele platen beregnes derfor å brukes til å korrigere for ikke-spesifikk binding av det primære antistoff eller konjugat til ikke-infiserte celleekstrakter. Den gjennomsnittlige MRC-5-OD trekkes fra de respektive, gjennomsnittlige VZV-OD-er, hvorved man får VZV-spesifikke OD-verdier (AOD). 2. Generering av en standardkurve for måling av antigenmengder: Standardkurve-AOD-verdiene plottes mot de kjente antigenkonsentrasjoner (enheter VZV/ml).

Dataene innføres i et passende grafisk program (f.eks.: "Cricket Graph" versjon 1,3, Cricket Soft-ware, Malvern, PA), den lineære del av kurven identi-fiseres (må omfatte minst 4 punkter), og "line-fit formula" (y=a + bx) fås.

3. Beregning av antigenmengder i testprøver:

Verdier for a og b fås ved hjelp av "line-fit formula", og y (AOD) er kjent. Den gjenværende, ukjente verdi, x, som representerer antigenenhetene/ml, kan så beregnes og korrigeres ved hjelp av prøvefortyn-ningen, hvorved man får antigenkonsentrasjonen i den ufortynnede prøve. En generell prøveberegning følger:

Den rapporterte antigenkonsentrasjon er den som oppnås med den minst fortynnede prøve som gir en AOD-verdi innenfor den lineære del av standardkurven.

Eksempel 12

VZV- antigen- ELISA og sammenligning med VZV- PFU- utbytte

Prøvene av cellefritt VZV generert i eksempel 7 for hvilke PFU/ml-utbytte er vist i figurene 1, ble analysert i henhold til VZV-antigen-ELISA vist i eksempel 11. Resultatene av denne analysen er vist i figur 2.

Det er verdt å legge merke til at VZV-antigenet fort-setter å øke etter 96 timer selv om PFU/ml avtar ifølge dataene i figur 1. Det er også verdt å legge merke til at VZV-antigennivået i SRFE-2 pluss soya pluss sukrose ingen steder er nær 16 ganger antigennivået i EMEM (figur 2), enda pfu/ml for levedyktig, cellefritt VZV er (figur 1). Av denne sammenligning fremgår det at sukroseeffekten er en hovedbidragsyter til opprettholdelse av levedyktig VZV 72 timer etter infeksjon.

Eksempel 13

Økning av MRC- 5- cellevekst under anvendelse av SRFE- 2- medium og et soyabønnelipidsupplement

MRC-5-celler ble inokulert i 25 cm<2> T-kolber ved 53.000 celler/ml i 12,5 ml volumer EBME, 10% FCS, 50 ug/ml neomycin og 2 mM L-glutamin, og inkubert ved 35°C. Etter 2-3 dager ble mediet fjernet og erstattet (skifting 2) med 12,5 ml nytt medium eller SRFE-2-medium inneholdende 10% FCS, 50 ug/ml neomycin, 2 mM L-glutamin og forskjellige mengder soyabønne-lipid. Ufortynnet soyabønnelipid inneholdt 20 mg/ml lipid og 100 mg/ml bovint serumalbumin.

Mediene ble fjernet 6 dager etter innledende celle-inokulering og erstattet med 12,5 ml volumer av 2% FCS,

50 ug/ml neomycin, 2 mM L-glutamin i EMEM eller SRFE-2-medium supplert med forskjellige mengder soyabønnelipid. Celler ble dissosiert fra utvalgte kolber ved hjelp av trypsinbehandling, og celler ble tellet i et hemacytorneter. Celletellinger ble bestemt for gjenværende kulturer etter ytterligere 2 dagers dyrkning ved 35°C, og oppsummering av resultatene er vist i tabell 5.

Medium-skifting 1 = medium erstattet med angitt medium supplert med 10% FCS 2-3 dager etter celleinokulasjon.

Medium-skifting 2 = medium erstattet med angitt medium supplert med 2% FCS 6 dager etter celleinokulasjon.

ND = ikke bestemt

Konklusjoner: Anvendelse av SRFE-2-medium uten et lipidsupplement resulterte i en omtrentlig 2 gangers økning i celleantall sammenlignet med det som ble oppnådd i EMEM alene. Celleutbytter ble ytterligere økt på en doseavhengig måte ved supplering av medium med soyabønnelipid. Maksimale celleutbytter ble oppnådd ved å bruke kombinasjonen av SRFE-2-medium og ca.

200-400 ug/ml lipid.

Eksempel 14

Dyrkning av WI- 38- celler i henhold til fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen

WI-38-celler inokuleres i 25 cm<2> T-kolber ved 53.000 celler/ml i 12,5 ml volumer av EBME, 10% FCS, 50 mg/ml neomycin og 2 mM L-glutamin, og det inkuberes ved 35°C. Etter

2 dager ble medium fjernet og erstattet med 12,5 ml SRFE-2-medium supplert med 50 mg/ml neomycin, 2 mM L-glutamin og en fortynning av soyabønnelipid i forholdet 1:200. Kontroller

fikk medium uten et lipidsupplement. Etter 5 dagers dyrkning ved 35°C ble medium fjernet, cellene ble atskilt fra kolbene ved trypsinbehandling og tellet i et hemacytometer. Gjenværende kolber ble holdt i ytterligere 3 dager før telling av celler. En oppsummering av resultatene følger:

Konklusjon: Supplering av rike dyrkningsmedier med soyabønne-lipid økte WI-38-celleutbytter med omtrent to ganger. Anvendelse av denne cellelinjen for VZV-produksjon forventes således å forløpe på samme måte som anvendelse av MRC-5-celler.

Eksempel 15

Fremgangsmåte for evaluering av MRC- 5- cellevekstforøkning

MRC-5-celler inokuleres i 25 cm<2> T-kolber ved ca. 53.000 celler/ml i 12,5 ml volumer "Basal Medium Eagle" med Earles salter (EBME), 10% FCS, 50 ug/ml neomycinsulfat (neo) og 2 mM glutamin (Gin). Kulturene inkuberes ved 35°C i 3 dager, hvoretter cellemonolagene vanligvis er ca. 50-75% sammenflytende. Medium fjernes og erstattes med 10-12,5 ml volumer 10% FCS, 50 ug/ml neo og 2 mM Gin ± soyabønne eller annet lipid, i SRFE-2-medium, og kulturene returneres til inkubasjon ved 35°C. Celletellinger bestemmes på forskjellige tidspunkter ved trypsinering av celler (2,5 ml volumer av 0,25% sitrattrypsinoppløsning) og telling i et hemacytometer. Cellelevedyktighet overvåkes ved hjelp av celleutelukkelse med 0,2% trypanblått. Celletellinger brukes til å utlede en cellekonsentrasjon som igjen korrigeres for totalvolumet av cellesuspensjon for å oppnå celleutbyttet pr. kolbe. I noen forsøk skiftes kulturer over i medium med 2% FCS 3-4 dager etter erstatning av medium, og celletellinger bestemmes etter inkubasjon i ytterligere 2 dager.

Eksempel 16

Effekt av langvarig eksponering av dyrkede celler mot lipidsupplementer

MRC-5-celler ble inokulert i T25-kolber, tilført næring etter 3 dager (første nye næringstilførsel), og celletellinger ble bestemt etter ytterligere 3 dagers dyrkning. Ytterligere T25-kolber fikk fortsette dyrkning ved ny tilførsel av næring ± lipid (andre nye næringstilførsel) og fikk dyrkes i ytterligere 2 dager. Cellene ble utvunnet med trypsin. Utbytter var 2,6 x IO<6> for celler inokulert i EBME og dyrket i EMEM, mens celler dyrket i SRFE-2 pluss fortynning av soya-bønnelipider i forholdet 1:100 nådde 6,6 x IO<6> og 7,7 x 10<6>. Celler dyrket i de ytterligere 2 dager, ga 2,76 x 10<6> for EBME/EMEM-dyrkede celler, mens EBME/SRFE-2 uten noe soyabønne-lipidsupplering ga 9,2 x 10<6> og 7,88 x IO<6> celler pr. T25-kolbe. Celler dyrket i EBME/SRFE-2 + soyabønnelipid i forholdet 1:100 ga bare 2,48 og 2,28 x 10s celler. Disse dataene indikerer at langvarig eksponering (ca. 5 dager etter den andre nye tilførsel av næring) mot høye lipidkonsentrasjoner til sist kan føre til reduserte celleutbytter, sannsynligvis på grunn av celledød. Generelt tilføres celler således ny næring med rikt medium uten lipidsupplering. Denne skiftingen til et lipidfritt, rikt medium er særlig viktig når en virus-vekstfase initieres, ettersom lipidet kan være toksisk for virusvekst eller fortsatt cellelevedyktighet i nærvær av kraftig virusangrep.

Eksempel 17

Effekter av forskjellige lipidkonsentrasjoner på cellevekst i rikt og minimalmedium

Ved i hovedsak å følge den samme fremgangsmåte og plan for ny tilførsel av næring/cellekvantifisering beskrevet i eksempel 16 for MRC-5-kultur, ble de følgende celleutbytter oppnådd (anmerkning: +- og --symbolene etter mediumbeskrivel-sen indikerer tilstedeværelse eller fravær av den angitte mengde soyabønnelipid(sl)supplering i mg/ml i det andre medium med ny tilførsel av næring):

Dataene oppsummert ovenfor, er generelt i overensstemmelse med observasjonen anmerket i eksempel 16 om at langvarig eksponering av celler mot høye lipidkonsentrasjoner ikke er særlig gunstig selv om den toksiske effekt anmerket i eksempel 16, er mindre uttalt i disse dataene. Ved lavere lipidkonsentrasjoner er mer langvarig celleeksponering mot lipid mindre skadelig og kan være gunstig for forøkt utbytte av celler/cm<2> av dyrkningsoverflaten.

Eksempel 18

Effekt av kalvefosterserumkonsentrasjon på celleutbytter

Tilsetningen av 2 eller 10% kalvefosterserum i nærvær av lipidsupplementer ble testet i dette forsøket. MRC-5-celler ble inokulert i EBME, tilført ny næring 3 dager senere med . SRFE-2 supplert med forskjellige mengder soyabønnelipid, på nytt tilført næring 2 dager senere med den samme konsentrasjon av lipid i SRFE-2 som tilveiebrakt ved den første nytilførsel av næring. Celleutbytter i 10% FCS var 9,5, 11,3 og 12,2 x 10<6 >for kulturer supplert med henholdsvis 0,1, 0,2 og 0,4 mg/ml lipid. Når det ble tilveiebrakt 2% FCS, var celleutbyttene henholdsvis 6,5, 8,8 og 3,2 x IO<6>. Dette forsøket fremhever den gunstige effekt på cellevekst av tilveiebringelse av FCS-supplering samt lipidsupplering. Uansett hvilke toksiske effekter cellene opplever ved forhøyede lipidkonsentrasjoner, så svekkes disse ved tilveiebringelse av tilstrekkelig FCS-supplering.

Eksempel 19

Effekter av forskjellige lipidsupplementer på MRC- 5- cellevekst

MRC-5-celler ble inokulert i T25-kolber i EBME. På den tredje dag ble cellene på nytt tilført næring med SRFE-2-medium inneholdende 10% FCS, supplert med forskjellige lipidsupplementer. Soyabønnelipid fra Boehringer Mannheim, kolesterolrike lipider fra storfeserum fra Sigma, eller Miles/- Pentex "EX-CYTE I" eller "Very Low Endotoxin" bovint lipopro-tein ble tilveiebrakt ved de angitte konsentrasjoner. Celletellinger ved nytilførsel av næring var i millioner: 1,19. Fem dager senere ble cellene tellet. Celler i EMEM var 2,97, i SRFE-2 eller SRFE-2 pluss 0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml, og 0,1 mg/ml med soyabønnelipider frembrakte 4,83, 10,44, 8,67 og 8,04 millioner celler. "EX-CYTE I" ved 1:50, 1:100, 1:200 frembrakte henholdsvis 5,37, 4,80 og 4,74 millioner celler. "EX-CYTE VLE" ved 1:25, 1:50, 1:100 ga økning til henholdsvis 5,49, 7,23 og 7,92 millioner celler. Sigma-høykolesterollipider ved 1:25, 1:50, 1:100 ga økning til henholdsvis 6,87, 7,56 og 7,65 millioner celler. Soyabønnelipidene fra Boehringer Mannheim ga den største celleutbytteøkning selv om "EX-CYTE VLE" og Sigma-lipider var nesten like effektive. Økningseffekten er derfor ikke unik for soyabønnelipider.

Eksempel 2 0

Økning av MRC- 5- cellevekst under anvendelse av høye konsentrasjoner av soyabønnelipid

MRC-5-celler ble inokulert i 25 cm<2> kolber og tilført ny næring på dagene 3 og 6 som i eksempel 13. Celleutbytter pr. kolbe på dag 6 for EBME/EMEM, SRFE-2 pluss 1/100 soya-bønnelipid eller SRFE-2 pluss 1/50 soyabønnelipidkulturer var henholdsvis 4,3 millioner, 9,7 millioner og 11,7 millioner. Cellelevedyktighet var >99% (bedømt ved hjelp av trypanblått-utelukkelse) for alle kulturer. Celler ble på nytt tilført næring med medium ± soyabønnelipid inkubert i ytterligere 2 dager, og celleutbyttene ble bestemt. Celleutvinning pr. kolbe for disse kulturene var 2,9 og 3,5 millioner for EBME/- EMEM-kulturer in duplo; 11,65 millioner for SRFE-2 pluss 1/50 soyabønnelipid under nytilførsel av næring med det samme medium, mens SRFE-2 pluss 1/50 soyabønnelipidkulturene (in duplo) tilført ny næring med SRFE-2-medium og ikke noe soya-bønnelipid, ga 13,69 og 11,09 millioner celler; 9,66 millioner for SRFE-2 pluss 1/100 soyabønnelipid nytilført næring med det samme medium, mens nytilførsel av næring med SRFE-2 og ikke noe lipid ga 8,51 og 6,27 millioner i kulturer in duplo.

Av dette forsøket er det klart at MRC-5-celleutbytter ble økt med økende mengder av soyabønnelipid. Maksimale celleutbytter ble oppnådd ved å bruke en fortynning av soyabønne-lipid i forholdet 1:50 (høyeste konsentrasjon som ble testet). Innlemmelse av lipid i det andre nytilførte medium ga middels økte celleutbytter. Dataene viser imidlertid at maksimale celleutbytter kan oppnås gjennom bruken av lipid i forholdet 1:50 i det første nytilførte medium. Lipidsupplementet kan så utelates fra det andre nytilførte medium. Ettersom høye konsentrasjoner av lipid kan være skadelige for virusproduksjon, kan det være ønskelig å utelate lipidet under virusdyrkning.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en levende varicella zoster-virus(VZV)vaksine, karakterisert ved trinnene i den følgende rekkefølge: a) VZV-infeksjonsmottakelige celler valgt fra humane diploidceller, dyrkes til sammenflytning i monolagkultur under betingelser med tilstrekkelig høy nær-ingstilførsel til å oppnå en høy grad av cellereplikasjon, og et ikke-metaboliserbart disakkarid til-føres, b) cellene dyrket i henhold til trinn (a), infiseres så nært punktet for sammenflytning som mulig med så høy infeksjonsmultiplisitet med VZV-infiserte celler som praktisk mulig, c) den VZV-infiserte kultur holdes ved en tilstand av høy næringstilførsel i 22-96 timer, og det innhøstes på tidspunktet for topproduksjon av infeksiøst VZV, d) den VZV-infiserte kultur vaskes med en fysiologisk oppløsning som eventuelt inneholder et lysosomotropt middel, slik som ammoniumklorid eller klorokin, før innhøsting av de VZV-infiserte celler, e) de VZV-infiserte celler innhøstes i et minimalt volum av en stabiliserende oppløsning, og cellene brytes enten opp umiddelbart eller cellene nedfryses for senere oppbrytning, f) de VZV-infiserte celler oppbrytes inntil optimal fri-gjøring av celleforbundet VZV, og cellerestene fjernes, hvorved man får et cellefritt VZV-preparat.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de VZV-infeksjonsmottakelige celler er MRC-5-celler, det svekkede VZV er Oka-stam-men av varicella zoster-virus, dyrkningstemperaturen er mellom 30 og 37°C, disakkaridet er sukrose tilveiebrakt ved 20-60 mM, MOI er mellom 1:25 og 1:625, det lysosomotrope middel er ammoniumklorid tilveiebrakt ved mellom 20 og 50 mM eller klorokin, tilveiebrakt ved ca. 23 0 uM.

3 . Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at dyrkningstemperaturen er ca. 3 5°C.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at høynæringsmediet er SRFE-2 eventuelt supplert med 0,02-0,4 mg/ml soyalipider, og viruset frigjøres fra cellene ved sonikering eller Dounce-homogenisering, eller begge deler.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en levende, svekket, cellefri varicella-zoster-virus(VZV)vaksine, karakterisert ved trinnene i den følgende rekkefølge: a) dyrkning av VZV-infeksjonsmottakelige celler inntil sammenflytning, hvor dyrkningen omfatter: 1) en celleinokulasjonsfase, 2) en celledyrkningsfase enten i et så stort volum minimalmedium som praktisk mulig eller i et mindre volum med høynæringsmedium, og 3) en forinfeksjonsfase som omfatter eksponering av cellene mot et ikke-toksisk, ikke-metaboliserbart disakkarid, b) infeksjon av cellene dyrket i henhold til trinn a), så nært opptil punktet for sammenflytning som mulig, med så høy infeksjonsmultiplisitet med svekkede, VZV-infiserte celler som praktisk mulig, c) opprettholdelse av den VZV-infiserte kultur i et stort volum minimalmedium eller et mindre volum rikt medium i 22-96 timer inntil punktet for topp-VZV-produksjon, d) vasking av den VZV-infiserte kultur med en fysiologisk oppløsning som eventuelt inneholder et lysosomotropt middel, før innhøsting, e) innhøsting av den VZV-infiserte kultur ved 1) fjerning av væske, 2) tilsetning av et minimalt volum stabiliser-ingsmiddeloppløsning, 3) utskraping eller kjemisk frigjøring av de VZV-infiserte celler, 4) eventuelt nedfrysing av de frigjorte, VZV-infiserte celler ved ca. -70°C, f) oppbrytning av de frigjorte, VZV-infiserte celler inntil optimal frigjørelse av cellebundet VZV, og fjerning av cellerester, og eventuelt lyofilisering av det cellefrie VZV eller lagring i flytende, nedfryst form.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av en levende, svekket, cellefri varicella-zoster-virus(VZV)vaksine, karakterisert ved trinnene i den følgende rekkefølge: a) dyrkning av MRC-5-celler til sammenflytning, hvor dyrkningen omfatter: 1) en celleinokulasjonsfase i EBME, 2) en celledyrkningsfase i SRFE-2 supplert med ca. 0,2 mg/ml soyalipider, som starter ca. 3 dager etter celleinokulasjon, 3) en forinfeksjonsfase som omfatter eksponering av MRC-5-cellene mot 20-50 mM sukrose i 24-96 timer før infeksjon, b) infeksjon av cellene dyrket i henhold til trinn a), så nært opptil punktet for sammenflytning som mulig, med så høy infeksjonsmultiplisitet med svekkede, VZV-inf iserte MRC-5-celler som praktisk mulig, c) opprettholdelse av den VZV-infiserte kultur i 37-96 timer, og innhøsting på tidspunktet for topp-VZV-produksjon, d) vasking av kulturen med fosfatbufret saltoppløsning som eventuelt er supplert med 1-100 mM NH4C1 eller klorokin, e) innhøsting av de VZV-infiserte MRC-5-celler ved: 1) fjerning av væske, 2) tilsetning av et minimalt volum stabiliseringsmiddel som eventuelt inneholder 1-100 mM NH4C1 eller klorokin ved ca. 230 uM, 3) utskraping av cellene eller frigjøring av cellene kjemisk, 4) eventuelt nedfrysing av de frigjorte, VZV-infiserte celler ved -70°C, f) oppbrytning av de frigjorte, VZV-infiserte celler ved 1. Dounce-homogenisering, 2. pelletering av rester og bibeholdelse av supernatanten, 3. sonikering av pelleten og nypelletering, og 4. kombinering av supernatantene fra trinnene f-2 og f-3, g) fortynning av produktet fra trinn (f) i stabiliseringsmiddel og påfylling av produktet i enhetsdoser for lyofilisering og lagring ved 4°C eller lavere, slik at ikke mindre enn ca. 1000 PFU er tilgjengelig pr. dose på tidspunktet for senere bruk.

7. Fremgangsmåte for dyrkning av celler i monolag, karakterisert ved trinnene i følgende rekke-følge : a) inokulering av en dyrkningsbeholder med en celle-mengde i et minimalt eller rikt medium, og cellene får inokuleres i 24-72 timer, b) fjerning av mediet fra kulturen ifølge trinn a) og erstatning med friskt, rikt medium, supplert med en optimalisert konsentrasjon av lipider, og som eventuelt også omfatter et serumsupplement, hvor lipidsupplementet tilveiebringes ved mellom 0,02 mg/ml og 0,4 mg/ml, c) dyrkning av kulturen av celler i rikt medium supplert med lipid, d) eventuelt erstatning av mediet fra trinn c) med friskt medium som ikke inneholder noe lipidsupplement, etter 24-72 timers vekst.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det rike medium er SRFE-2, eventuelt supplert med kalvefosterserum, og cellene er MRC-5, WI-38 eller Vero-celler.

9. Medium, karakterisert ved at det kan anvendes til dyrkning av celler i monolagkultur som omfatter SRFE-2-medium supplert med 0,02-0,4 mg/ml lipider.