CZ289690B6 - Způsob pěstování lidských diploidních buněk - Google Patents

Abstract

Podstatu °e en tvo° zp sob p stov n lidsk²ch diploidn ch bun k v jednoduch spojit vrstv pro v²robu atenuovan ho viru varicella zoster, postup spo v v tom, e se z sobn kulturou diploidn ch bun k nao kuje bohat ivn prost°ed v n dob pro tk ov kultury, bu ky se p stuj 24 a 72 hodin, pak se ivn prost°ed nahrad erstv²m bohat²m ivn²m prost°ed m, dopln n²m 0,02 a 0,4 mg/ml prost°ed lipid , v tomto prost°ed se bu ky p stuj po dobu 24 a 72 hodin a pak se bohat prost°ed , dopln n 0,02 a 0,4 mg/ml ivn ho prost°ed lipid odstran a nahrad se erstv²m bohat²m prost°ed m bez lipid .\

Description

Způsob pěstování lidských diploidních buněk

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu pěstování lidských diploidních buněk, například buněk MRC-5 v jednoduché spojité vrstvě pro výrobu atenuovaného viru varicella zoster k výrobě živé vakcíny.

Dosavadní stav techniky

Virus varicella zoster, VZV, způsobuje plané neštovice a pásový opar. Plané neštovice jsou vysoce nakažlivé onemocnění, které se vyskytuje u nemocných, kteří nemají žádnou imunitu proti tomuto viru. Do 20 let věku dojde k expozici přibližně 90 % celé populace. U dospělých a u lidí s nedostatečným imunitním systémem však běží o velmi závažné onemocnění. U řady lidí přežívá VZV bez jakýchkoliv příznaků v buňkách ganglií dorsálních míšních kořenů. V případě, že dojde k reaktivaci viru z tohoto latentního stádia, vzniká pásový opar jako bolestivé chronické onemocnění.

Bylo by velmi žádoucí předcházet planým neštovicím vakcinací, přičemž nejvýhodnější očkovací látkou pro děti by byla živá vakcína, obsahující zeslabený, atenuovaný virus. Byly již podávány zprávy o pěstování tohoto viru v buněčných kulturách různých typů buněk a také o použití živého, atenuovaného, buněk prostého viru jako vakcíny. V US patentovém spisu č. 3 985 615 se popisuje produkce primárních embryonálních morčecích buněk s obsahem kmene Oka tohoto viru, materiál je vhodný pro použití jako vakcína. V US patentovém spisu č. 4 008 317 se popisuje kultivace mutanty N7N, citlivé na změny teploty v buněčné kultuře buněk WI-38, materiál je možno použít jako stabilizátor pro vakcínu. Prostředky, použitelné pro udržování životaschopného viru NZN, například prostředek SPGA, jsou rovněž již z literatury známy.

Hlavním omezením produkce vakcíny s obsahem VZV ve velkém měřítku je výtěžek bezbuněčného VZV ze systémů buněčných kultur, které jsou až dosud známy, tento výtěžek je tak nízký, že náklady na výrobu vakcíny jsou neúnosně vysoké. Při použití nového způsobu podle vynálezu je možno zvýšit výtěžek bezbuněčného VZV přibližně 5x až 20x.

Vynález si klade za úkol navrhnout způsob výroby živé, atenuované, bezbuněčné vakcíny, obsahující virus VZV, ve vysokém výtěžku.

Buněčné kultury, tvořící jednu souvislou vrstvu buněk tak, jak jsou z literatury známy, poskytují přibližně 80 000 až 160 000 buněk/cm² podle Mann, Dev. Biol. Stand, 37, 149-152, 1977, Wood a Minor, Biologicals, 18, 143 až 146, 1990. Použití takových jednovrstevných buněčných kultur pro výrobu virových antigenů je znevýhodněno omezenou hustotou, s níž je možno tyto jednovrstevné buněčné kultury pěstovat.

Pokusy zvýšit hustotu buněčných kultur byly v minulosti prováděny při použití specializovaných nádobek pro buněčné kultury, které byly promývány živnými roztoky tak, aby bylo možno zvýšit hustotu buněk až na 1 x 10⁶ buněk/cm² podle Mann, Dev. Biol. Stand., 37, 149- 152, 1977. Vynález si klade za úkol navrhnout způsob, jímž by bylo možno zvýšit výtěžek buněk při použití existujících systémů buněčných kultur.

Vynález si tedy klade za úkol navrhnout způsob pěstování buněk do vyšší hustoty, než bylo dříve nutné, a tak dosáhnout daleko vyšších výtěžků virů, pěstování na těchto jednovrstevných buněčných kulturách za účelem výroby vakcíny k ochraně proti těmto virům.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob pěstování lidských diploidních buněk v jednoduché spojité vrstvě pro výrobu atenuovaného viru varicella zoster, postup spočívá v tom, že se zásobní kulturou diploidních buněk naočkuje bohaté živné prostředí v nádobě pro tkáňové kultury, buňky se pěstují 24 až 72 hodin, pak se živné prostředí nahradí čerstvým bohatým živným prostředím, doplněným 0,02 až 0,4 mg/ml prostředí lipidů, v tomto prostředí se buňky pěstují po dobu 24 až 72 hodin a pak se bohaté prostředí, doplněné 0,02 až 0,04 mg/ml živného prostředí lipidů odstraní a nahradí se čerstvým bohatým prostředím bez lipidů.

Podstatu vynálezu tedy tvoří nový způsob pěstování jednovrstevných buněčných kultur, při němž je zapotřebí použít bohaté živné prostředí ve srovnání s běžně používaným minimálním prostředím, s výhodou prostředí SRFE-2, a ještě je nutno toto prostředí doplnit optimalizovanou koncentraci lipidů, s výhodou se užije 0,02 až 0,4 mg/ml živného prostředí sójových lipidů nebo lipidů ze séra dospělého skotu. Tímto způsobem se získá jednovrstevná kultura se zvýšenou hustotou, která je vhodná pro zvýšenou produkci virových antigenů pro výrobu vakcíny proti viru. Jako diploidní buňky se s výhodou pěstují buňky MRC-5, WI-38 nebo Věro.

Získanou kulturu je možno použít k produkci velkého množství živé, atenuované, bezbuněčné vakcíny, vhodné pro prevenci planých neštovic. Tento postup spočívá v tom, že se

a) pěstují buňky, které mohou být infikovány N7N, a to lidské diploidní buňky, například MRC-5 až do souvislé jednobuněčné kultury při použití vysokého objemu bohatého živného prostředí a za přívodu nemetabolizovatelného disacharidů, například disacharózy,

b) buňky, pěstované podle stupně a) se infikují co nejblíže k bodu, v němž dochází ke vzniku souvislé vrstvy buněk při použití nejvyššího z praktického hlediska vhodného počtu buněk, infikovaných N7N,

c) kultura, infikovaná VZV se udržuje po dobu 22 až 96 hodin za přívodu vysokého množství živin a VZV se izoluje v okamžiku své nejvyšší produkce,

d) kultura, infikovaná VZV se promyje fyziologickým roztokem chloridu sodného, popřípadě s obsahem lysosomotropního činidla, například chloridu amonného nebo chlorochinu před izolací buněk, infikovaných NZN,

e) buněčný materiál, infikovaný VZV se izoluje do co nejmenšího objemu, načež se buněčný materiál okamžitě rozruší nebo se lyofilizuje pro pozdější rozrušení buněk,

f) buňky, infikované virem VZV se rozruší k optimálnímu uvolnění NZN, spojeného s buňkami a buněčná drť se oddělí, čímž se získá bezbuněčný N7N.

Vynález bude dále podrobněji popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech na obr. 1 jsou znázorněny výtěžky VZV v hodnotách PFU na živném prostředí, doplněné sacharózou.

Na obr. 2 je znázorněn výtěžek bezbuněčného antigenního VZV.

Na obr. 3 je znázorněna stabilita VZV při použití stabilizátoru SPGA při teplotě -20 nebo 4 °C.

-2CZ 289690 B6

Na obr. 4 jsou znázorněny výtěžky VZV v hodnotách PFU při použití různých živných prostředí.

Na obr. 5 je znázorněn vliv přívodu MOI, spojeného s buněčným materiálem na výtěžek bezbuněčného NZN.

Na obr. 6 jsou uvedeny výtěžky virového antigenů VZV jako funkce přívodu MOI.

Vynález se tedy týká způsobu pěstování buněk v souvislé jednovrstevné kultuře. Cílem vynálezu je dosáhnout zvýšené hustoty buněk v těchto spojitých buněčných kulturách. Tohoto cíle je možno dosáhnout použitím obohaceného živného prostředí, doplněného lipidem v optimalizované koncentraci. Pěstování jednovrstevných buněčných kultur způsobem podle vynálezu při použití nového živného prostředí s obsahem lipidů je možno dosáhnout podstatně vyššího výtěžku virového antigenů, vyjádřeno jako virové jednotky, vytvářející plaky, PFU. Při použití buněčných kultur, získaných způsobem podle vynálezu je možno dosáhnout vyšší produkce viru hepatitidy A, viru pásového oparu, viru zarděnek, viru spalniček, dětské obrny, rotaviru a podobně, čímž je možno dosáhnout vyšší produkce vakcíny proti uvedeným chorobám.

Výhodným obohaceným prostředím pro toto použití je prostředí SRFE-2, které se běžně dodává (SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO, S2138 nebo Serva Fine Chemicals, Heidelberg, SRN, 47523). Toto živné prostředí bylo popsáno v publikaci Weiss a další, In Vitro, 16(7), 616 - 628, 1980. Je možno použít také ekvivalentní živná prostředí nebo mírně pozměněné živné prostředí SRFE-2 v případě, že tato prostředí jsou použita stejným způsobem, jak bude dále podrobněji uvedeno.

Při provádění způsobu podle vynálezu je možno použít celou řadu známých lipidových doplňků. Je například možno užít lipidy, bohaté na cholesterol, získané ze séra dospělého skotu (Sigma Chemical Co., číslo v katalogu L-4646), Lipid EX-CYTEI nebo lipid s velmi nízkým množstvím endotoxinu, VLE (Miles, lne., číslo v katalogu 82-004-7 a 8 a 82-019-1), všechny tyto látky jsou velmi vhodné k doplnění bohatého prostředí. Výhodným lipidem pro toto použití je běžně dodávaný extrakt lipidů ze sójových bobů (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, číslo v katalogu 1074-482). Tento materiál a podobné materiály byly popsány v publikaci Iscove a Melchers, J. AI. Exp. Medicine, 147, 923 - 933, 1979 jako materiály, vhodné k náhradě séra v buněčné kultuře B-lymfocytů. V uvedené publikaci se nikde neuvádí, stejně jako v katalogu Boehringer Mannheim u popisu tohoto produktu se neuvádí, že by lipidy ze sójových bobů mohly být použitelné jako přísady k bohatým živným prostředím pro pěstování buněčných kultur. Podle uvedených literárních zdrojů jsou totiž tyto lipidy určeny k náhradě krevního séra v buněčných kulturách, pěstovaných při použití minimálního živného prostředí. Při provádění způsobu podle vynálezu se však uvedené lipidy užívají k doplnění bohatého živného prostředí. Mimoto se podle uvedených literárních údajů lipidy používají v koncentraci přibližně 10 až 100 mikrogramů/ml, zatímco při provádění způsobu podle vynálezu je optimální koncentrace uvedených lipidů dvakrát až třikrát vyšší než koncentrace, uvedené v literatuře. Navíc se při provádění způsobu podle vynálezu lipidový doplněk používá spolu se sérem a nikoliv místo séra.

Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se do nádoby pro pěstování buněčných kultur naočkují buňky MRC-5, WI-38, Věro nebo jakýkoliv jiný buněčný materiál, o němž je známo, že je vhodný pro pěstování virů. Počáteční fáze pěstování se provádí v minimálním živném prostředí tak, jak je známo z literatuiy, například v prostředí EMEM nebo EBME, nebo v bohatém živném prostředí, jako je SRFE-2 bez doplnění lipidy. Může být také výhodné přidat 10% fetálního telecího séra FCS, antibiotikum, například neomycin v množství 50 mikrogramů/ml a L-glutamin v množství přibližně 2 mM. Buněčný materiál se pak pěstuje při teplotě, vhodné pro pěstování buněk i viru, obvykle 34 až 37, s výhodou přibližně 35 °C v závislosti na typu viru, který má být získán, kultura se pěstuje několik dnů.

-3CZ 289690 B6

Jakmile dojde ke spojení buněk s podkladem a k tvorbě jednovrstevné buněčné kultury, oddělí se použité minimální nebo obohacené živné prostředí a nahradí se čerstvým, bohatým živným prostředím, doplněným optimalizovanou koncentrací lipidu.

Po dalším období růstu může být živné prostředí opět odstraněno a nahrazeno čerstvým bohatým živným prostředím bez doplnění lipidy. V případě, že se lipidy přidávají v okamžiku, kdy buněčný materiál dosáhne nebo téměř dosáhne spojité vrstvy, působí tento přídavek proti produkci buněk a snižuje maximální výtěžek buněčného materiálu.

V okamžiku, kdy mají být buňky v souvislé vrstvě infikovány virovým očkovacím materiálem, odstraní se lipidový doplněk a přidá se virus v čerstvém bohatém živném prostředí. Nepřítomnost lipidu v tomto okamžiku dovolí buněčný růst bez snížení buněčného růstu, které by v tomto okamžiku bylo lipidem způsobeno, jak již bylo svrchu uvedeno.

Uvedeným způsobem je možno dosáhnout podstatné zvýšení výtěžku buněk i viru. Například v případě viru planých neštovic na buňkách MRC-5 je možno dosáhnout podstatného zvýšení výtěžku N7N, vyjádřeno v jednotkách PFU ve srovnání s případem, kdy jsou buňky MRC-5 pěstovány v minimálním živném prostředí nebo v samotném prostředí SRFE-2. Také v případě buněk WI-38, které jsou vhodné pro růst viru planých neštovic nebo zarděnek, je možno pozorovat růst do podstatně vyšší hustoty při pěstování buněk novým způsobem.

Při použití vypěstované buněčné kultury je možno vakcínu získat tak, že se virus planých neštovic (VZV) pěstuje v buněčné kultuře a pak se získaný virus izoluje za podmínek, při nichž dochází k optimálnímu výtěžku a dobré stálosti získaného viru. Výhoda, které je možno dosáhnout tímto způsobem při pěstování VZV je aplikovatelná i na produkci jiných virů s obalovým materiálem včetně virů jiných oparů než VZV, viru spalniček, příušnic a zarděnek.

Konečným cílem vynálezu je způsob, který dovoluje účinnou produkci VZV pro použití ve formě vakcíny. Úspěch způsobu podle vynálezu se měří výtěžkem bezbuněčného VZV, jehož je možno dosáhnout po optimálním provedení každého jednotlivého stupně postupu. Tento výtěžek je možno stanovit titrem infektivity výsledného bezbuněčného viru VZV. Titry infektivity pro virus VZV byly stanoveny po převrstvení agarózou nebo kapalným prostředím podle publikace Krah a další, J. Virol. Methods, 1990, 27: 319-326. Tento postup spočívá vtom, že se pěstuje buněčný materiál MRC-5, který je možno infikovat VZV až do stádia aktivní replikace, to znamená do stádia, v němž buněčný materiál vytváří jednoduchou vrstvu, spojitou na 50 až 80 %. Pak se do této jednovrstevné kultury přivede virus v minimálním objemu, nechá se přilnout k buňkám a pak se přidá další živné prostředí. Po několika dnech dalšího růstu se buněčný materiál barví barvivém pro bílkovinu a počítají se čiré oblasti v buněčné kultuře, které je možno považovat za vzniklé plaky. Za těchto podmínek je v případě použití známého objemu virového očkovacího materiálu počet jednotek pro tvorbu plaků, PFU, v 1 ml dobrým měřítkem pro výtěžek viru. Tato hodnota se pak vynásobí celkovým objemem bezbuněčného viru pro jakýkoliv daný virový preparát, čímž je možno vypočítat celkové množství PFU.

Vzhledem k variabilitě samotného postupu jako takového se zvýšení množství PFU, které je možno získat určitým postupem uvádí v poměru k určitému postupu, který je méně optimální. Tento postup, při němž se uvádí násobek zvýšení výtěžku viru tedy vylučuje vliv jakékoliv variability při stanovení jednotek PFU. Tímto způsobem bylo prokázáno, že způsobem podle vynálezu je možno dosáhnout 16 až 20násobného zvýšení výtěžku VZV ve srovnání se známými postupy. Tento postup vypočítávání zvýšení výtěžku není v literatuře uváděn a podle našeho názoru je významným příspěvkem pro určení účinnosti produkce vakcín s obsahem VZV.

Vzhledem k tomu, že počítání plaků VZV je náročné na čas, neběží o zvláště výhodný postup při ověřování účinnosti postupu. V tomto případě je možno užít také rychlou zkoušku ELISA pro stanovení množství antigenu VZV a tak sledovat růst viru v průběhu výroby živé vakcíny s obsahem tohoto viru. Mimoto je tuto zkoušku možno použít také ke stanovení množství

-4CZ 289690 B6 antigenu v lyofilizované vakcíně, naplněné do příslušných nádobek. Tento postup spočívá v tom, že se inkubuje antigen VZV ze zkoumaného vzorku v roztoku s obsahem séra proti VZV. Zbývající volná protilátka se může vázat na antigen VZN, imobilizovaný na mikrotitračních plotnách ELISA. Množství protilátky, které se váže na tyto mikrotitrační plotny je nepřímo úměrné množství antigenu ve zkoumaném vzorku. Protilátka, vázaná na mikrotitrační plotny se kvantitativně stanoví reakcí s enzymaticky vázanou protilátkou proti lidským tkáním a reakcí s příslušným substrátem, čímž se získá zbarvený produkt, který je možno kvantitativně stanovit spektrofotometricky.

Zkouška ELISA na antigen VZV a zkouška na počet plaků VZV by měly poskytovat obecně odpovídající údaje, je však nutno mít na paměti, že při zkoušce na antigen VZV se prokazuje jak životaschopný, tak usmrcený N7N. Vzhledem k tomu, že imunologická odpověď na usmrcený VZV není tak účinná jako odpověď, které je možno dosáhnout při použití živého atenuovaného viru, je zkouška na počet jednotek pro tvorbu plaků kritickou zkouškou, jíž je možno stanovit dávku viru pro vakcínu s obsahem N7N. Avšak zkouška na antigen je cenná v tom smyslu, že poskytuje informaci o celkovém množství antigenu ve vakcíně s obsahem VZV, je rychlejší než stanovení počtu jednotek PFU a tím je vhodná pro sledování produkce N7N v průběhu postupu, přičemž je v odpovídající korelaci alespoň až do okamžiku vrcholné produkce jednotek PFU viru VZV, takže je možno při jejím použití odhadnout optimální okamžik pro izolaci viru.

Úspěšnost provedení způsobu podle vynálezu je možno zvýšit optimalizaci každého z následujících kritických parametrů způsobu podle vynálezu:

a) buněčný materiál, který může být infikován N7N, zvolený z lidských diploidních buněk, například MRC-5 se pěstuje v buněčné kultuře až do vytvoření spojité souvislé vrstvy při použití velkého objemu bohatého živného prostředí k dosažení vysokého stupně replikace buněk za současného přívodu nemetabolizovatelného disacharidu, například sacharózy:

K produkci VZV je možno použít celou řadu známých systémů různých buněčných kultur. Je například možno použít kultury buněk Věro, WI-38 nebo MRC-5 a řadu dalších buněčných typů. V popsaných pokusech byl trvale používán buněčný materiál MRC-5, který je vhodný pro produkci vakcíny, určené pro použití u člověka. Je však možné uvažovat i o tom, že by bylo lze zvýšit výtěžek bezbuněčného VZV i nad uváděné hodnoty v případě použití ještě produktivnější buněčné linie než MRC-5. Vynález zahrnuje i použití takových buněčných linií, pokud by bylo možno je upravit pro provádění způsobu podle vynálezu.

Při srovnání výtěžků bezbuněčného živého viru v buněčných kulturách buněk MRC-5, pěstovaných téměř do vytvoření nebo až do vytvoření souvislé vrstvy při pěstování při teplotě 35 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého v Eaglově minimálním základním prostředí EMEM s přídavkem 2 nebo 10 % fetálního telecího séra FCS, je možno zjistit vliv vytvoření skutečně spojité vrstvy buněk na výtěžek bezbuněčného VZV ve formě jednotek pro tvorbu plaků, PFU, jak bude dále popsáno v příkladu 2, v tabulce I.

Při použití spojité jednoduché vrstvy buněk je možno získat 2 až 3x vyšší výtěžek PFU/ml ve srovnání s výtěžkem, jehož je možno dosáhnout při použití téměř spojité vrstvy buněk, a to v případě, že se užije aktivní proliferace v přítomnosti 10 % séra i v případě, že se užije pouze 2 % fetálního telecího séra. Je tedy zřejmé, že je zapotřebí dosáhnout zcela spojité vrstvy buněk bez aktivní proliferace k dosažení vysokých výtěžků VZV při výrobě vakcíny s jeho obsahem.

Množství fetálního telecího séra v procentech nemá podstatný vliv na výtěžek PFU bezbuněčného viru v průběhu růstu viru. V typických případech se v průběhu růstové fáze buněk FCS přidává v množství 10%, zatímco v průběhu růstu viru se FCS přidává v množství 2% v minimálním prostředí, například EMEM nebo EBME nebo v bohatém prostředí, například SRFE-2 pro buněčný růst i pro pěstování viru.

-5CZ 289690 B6

Kromě FCS se do živného prostředí typicky přidává ještě antibiotikum, například 50 mikrogramů/ml neomycinu a přibližně 2 mM glutaminu v průběhu růstu buněčné kultury i v průběhu růstu viru.

1) Fáze pěstování buněk

Nádoby pro pěstování buněčných kultur, například lahve nebo jejich funkční ekvivalenty se naočkují buněčným materiálem MRC-5 nebo jinými diploidními buňkami tak, že počáteční koncentrace buněk se pohybuje v rozmezí 10 000 až 40 000 buněk/cm². K buněčnému materiálu se přivádí růstové prostředí, doplněné přibližně 10 % fetálního telecího séra a kultura se pěstuje v prostředí s obsahem 5 % oxidu uhličitého při teplotě 30 až 37, s výhodou přibližně 35 °C.

Buněčný materiál je možno pěstovat v malém objemu, tak jak je to zapotřebí v případě buněk ve stacionární kultuře. Přijatelný poměr objemu k povrchu buněčné kultury je přibližně 0,5 ml živného prostředí na cm² povrchu kultury. V případě třepacích kultur může být dostatečné množství 125 ml prostředí na 850 cm², výhodné množství je však 425 ml živného prostředí na cm² kultury.

Ve fázi buněčného růstu je možno užít běžně dodávaná známá minimální živná prostředí pro pěstování buněčných kultur, například Eaglovo minimální základní prostředí EMEM nebo Eaglovo bazální prostředí, doplněné solemi podle Earleho EBME, vždy spolu s 10 % FCS. V této fázi je však možno použít s výhodou také bohatší prostředí. Prostředí SRFE, které bylo popsáno v publikaci Weiss a další. In Vitro, 16(7), 616 - 628, 1980 (Sigma) je bohaté prostředí, které je možno v tomto stupni použít, použití bohatého prostředí v tomto stupni však není pro provádění způsobu podle vynálezu kritické.

2) Fáze buněčného růstu

Po počátečním pěstování buněčné kultury je nezbytně zapotřebí přivádět dostatečné množství živin pro růst buněk až do vytvoření souvislé vrstvy. Toho je možno dosáhnout přiváděním velkého objemu minimálního prostředí nebo menšího objemu bohatého prostředí. Buněčný materiál se pěstuje při teplotě 30 až 37, s výhodou 32 až 35 °C.

Po přilnutí buněk a počáteční fázi buněčného růstu je možno prostředí odstranit a nahradit čerstvým živným prostředím a pak pokračovat v inkubaci. Prostředí je možno odstranit odsátím nebo slitím nebo jakýmkoliv jiným způsobem, pokud nebude porušena souvislost buněčné vrstvy. Při použití buněk MRC-5, pěstovaných svrchu uvedeným způsobem je možno živné prostředí vyměnit po 72 hodinách od naočkování buněk do nádoby.

Objem nového živného prostředí může být stejný jako počáteční objem prostředí. S výhodou se však užije v průběhu růstové fáze většího objemu živného prostředí než v počáteční fázi. To je zvláště důležité v případě, že se buněčný materiál pěstuje v minimálním prostředí, například v prostředí EMEM nebo EBME s přídavkem FCS. Velký objem kultury je jednou z cest, kterou je možno zajistit pro buněčný materiál dostatečnou výživu.

Požadavek na velký objem prostředí je možno omezit v případě, že se v růstové fázi buněk přidává bohaté živné prostředí. Zvláště výhodným živným prostředím pro tento účel je prostředí SRFE-2 (Sigma). Použití bohatého živného prostředí v tomto stupni místo minimálního živného prostředí podstatně podporuje hustotu souvislé spojité vrstvy buněk. Zvýšená hustota buněk v kultuře pak podporuje zvýšení výtěžku NZN, který je možno získat z infikované buněčné kultury při použití bohatého živného prostředí. To znamená, že při použití obohaceného živného prostředí v průběhu růstové fáze buněk je možno dosáhnout 2 až 4-násobného zvýšení konečného výtěžku VZV ve srovnání s buněčnou kulturou, která byla v tomto stupni pěstována v minimálním živném prostředí. Ve výhodném provedení se prostředí SRFE-2 doplní lipidem. Použít je možno celou řadu lipidových materiálů. Jde například o lipidy, bohaté na cholesterol ze

-6CZ 289690 B6 séra dospělého skotu (Sigma Chemical Co.), lipid EXCYTEI nebo lipid s velmi nízkým obsahem endotoxinu, VLE (MILES), tyto látky byly velmi vhodné pro doplnění bohatého prostředí i minimálního živného prostředí. Velmi vhodným prostředkem pro doplnění byl lipid ze sójových bobů (Boehringer Mannheim), který byl popsán v publikaci Iscove a další, J. Exp. Med., 147, 923 - 933, 1978, tento lipid je velmi vhodným materiálem při použití v množství 0,2 mg/ml. Při použití živného prostředí SRFE-2 s lipidem a FCS bylo možno dosáhnout hustoty buněk až přibližně 500 000/cm². Při použití lipidu je možno dosáhnout výtěžku VZV bez ohledu na to, zda je buněčný materiál pěstován v minimálním živném prostředí nebo v obohaceném živném prostředí. Materiál se běžně dodává jako zásobní materiál, který ve 100 mg/ml sérového albuminu skotu obsahuje navíc 20 mg/ml lipidu. Tento materiál se běžně užívá v konečném ředění 1 : 100. Konečný výtěžek VZV byl zvýšen přibližně devětkrát ve srovnání s výtěžkem, získaným při použití samotného živného prostředí EMEM a přibližně 3,3-krát ve srovnání se samotným prostředím SRFE-2 v případě, že prostředí SRFE-2 bylo doplněno v průběhu růstové fáze buněk přidáním 0,2 mg/ml lipidu ze sójových bobů.

3) Fáze před infekcí buněk

Bylo zjištěno, že konečný výtěžek VZV je možno dále zvýšit v případě, že se buněčná kultura před infekcí N7N vystaví působení nemetabolizovatelného netoxického disacharidu v optimální koncentraci. V jednom z velmi výhodných provedení se přidává přibližně 20 až 60 mM sacharózy přibližně 72 hodin po naočkování buněk do nádoby a s výhodou 24 až 96 hodin před infikováním kultury NZN. Při praktickém provedení je možno přidat přibližně 50 mM sacharózy do čerstvého živného prostředí ve stupni 2, čímž je možno omezit počet sterilních manipulací s kulturou současným provedením přidání obou materiálů.

Jiné disacharidy, například laktóza, cellobiosa a maltosa rovněž zvyšují konečný výtěžek N7N, avšak výhodná je zejména sacharóza. Byly zkoumány také monosacharidy, jako fruktosa aribosa, tyto látky však nezvyšovaly výtěžek N7N, přičemž ribóza byla dokonce toxická. Je zřejmé, že disacharidy se hromadí v lysosomech rostoucích buněk a zvětšují tyto útvary za vzniku vakuol podle publikace DeCourcy a Storrie, Exp. Cell. Res., 192, 52-60, 1991. Vliv disacharidů na výtěžek N7N tedy může být vyvolán zmírněním poškození buněčných lysosomů virem N7N. Kromě disacharidů je možno očekávat, že také trisacharidy a tetrasacharidy budou mít v uvedeném smyslu příznivý účinek, také vzhledem k tomu, že v publikaci Cohn a Ehrenreich, J. Exp. Med., 129,201 až 222,1969 se popisuje tatáž vakuolizace v případě, že tyto vyšší cukry nebo sacharóza jsou přiváděny do živného prostředí makrofágů, pokud tyto cukry nejsou buňkami metabolizovány.

b) Infekce buněk, získaných ve stupni a) v okamžiku, co nejbližším vytvoření spojité vrstvy buněk s použitím co nejvyššího množství infikovaných buněk

Opakovaným pokusy bylo prokázáno, že po uplynutí 48 hodin po dosažení souvislé vrstvy buněk se vytváří již pouze 50 % PFU/ml ve srovnání s výtěžkem, jehož je možno dosáhnout v případě, že jsou virem VZV infikovány buňky, které právě vytvořily spojitou vrstvu. To znamená, že je velmi důležité přivádět očkovací virus NZN v okamžiku, který je co nejblíže okamžiku vytvoření souvislé vrstvy buněk. Naneštěstí je tvorba spojité vrstvy buněk parametrem, který se může měnit v závislosti na typu použitého živného prostředí, na použitém typu buněk a na dalších podmínkách. V případě buněk MRC-5, pěstovaných podle svrchu uvedeného stupně al) je možno v typických případech buněčný materiál infikovat právě v okamžiku tvorby souvislé vrstvy.

Jako virus VZV se s výhodou použije kmen Oka atenuovaného viru, který byl popsán v US patentovém spisu č. 3 985 615 a který je uložen ve veřejné sbírce kultur ATCC. Tento virus je upraven pro růst na buněčných kulturách embryonálních buněk morčete a na lidských buněčných kulturách diploidních fibroblastů z plicní tkáně, například může jít o buňky MRC-5.

-7CZ 289690 B6

Zásobní materiál životaschopných infikovaných buněk uvedeným kmenem je možno připravit tak, že se buňky MRC-5 infikují při MOI přibližně 1 : 125, infikované buňky se pěstují tak, aby došlo k replikaci viru, pak se buněčný materiál zpracuje působením trypsinu a uvolněné buňky se okamžitě použijí k očkování nebo se skladují pro pozdější použití a pro stanovení PFU pomalým zmrazením za použití ochranných látek, jako DMSO nebo glycerolu v množství 10⁷ buněk/ml. Zmrazené zásobní buňky, infikované VZV je pak možno kdykoliv nechat roztát a přidat ke spojité vrstvě buněčné kultury k infikování této kultury N7N.

Buněčný materiál, infikovaný VZV je také možno lyofilizovat způsobem, popsaným v publikaci Hondo a další, Archiv fur die gesamte Virusforschung, 40, 397 - 399, 1973, tento postup dovoluje dlouhodobé uložení lyofilizovaného očkovacího materiálu při teplotě 4 °C. Jako očkovací materiál je také možno použít bezbuněčný virus VZV, avšak vzhledem ke ztrátám výtěžku při izolaci je výhodnější použít virus, vázaný na buněčný materiál.

Další možností, jak získat zásobní buněčný materiál, infikovaný virem je infekce buněčného materiálu před počátkem jeho pěstování. Pak je možno naočkovat infikované buňky a tyto buňky pěstovat, čímž je možno dosáhnout tvorby spojité vrstvy buněk přibližně v tomtéž okamžiku, kdy se dosahuje také nejvyššího titru N7N. Je také možno současně naočkovat infikované i neinfikované buňky do malého objemu živného prostředí, například při použití 125 ml živného prostředí v třepatí lahvi s plochou 850 cm². Po 2 až 3 dnech růstu se množství živného prostředí zvýší až na 425 ml nebo se prostředí nahradí bohatým živným prostředím a pak se buněčný materiál pěstuje až do vytvoření spojité vrstvy buněk. Produkční buňky se ponechají v malém množství minimálního prostředí s obsahem 10 % FCS až do doby 2 dny před infekcí naočkovaných buněk pomocí buněk, infikovaných NZN. N tomto okamžiku se objem živného prostředí pro produkční buňky zvýší na 425 ml nebo se vymění prostředí za bohaté prostředí, například prostředí SRFE-2 s lipidem ze sójových bobů a s fetálním telecím sérem. Produkční materiál se pak pěstuje až do dosažení zcela spojité vrstvy buněk. Dva dny před výměnou živného prostředí se spojitá vrstva produkčních buněk naočkuje při použití buněk, infikovaných VZV při použití MOI 1 : 125 nebo vyšším a nechá se probíhat replikace viru další 2 až 3 dny. Jakmile je dosaženo vrcholné produkce VZV v očkovací kultuře, dosáhnou produkční buňky zcela spojité vrstvy. V tomto okamžiku se buňky z očkovací kultury přidají k produkční kultuře.

Při jakémkoliv načasování produkce očkovacího materiálu se v příslušné době po infekci VZV živné prostředí z očkovací kultury, infikované VZV odsaje, buněčný materiál, inifikovaný VZV se podrobí působení trypsinu v koncentraci přibližně 0,25 % nebo působení jiného prostředku a produkční kultura buněk se infikuje při použití známého MOI.

V publikaci Schmidr N. S. a Lennette E. H., Infection and Immunity, 14, 709-715, 1976 se uvádí důležitost vysoké hodnoty MOI pro dosažení vysokého výtěžku VZV, avšak neuvádí se žádné přesné srovnání s případy při nichž bylo použito nízké hodnoty MOI. V tomto případě bude toto srovnání provedeno.

Buněčný materiál se infikuje VZV tak, že se růstové prostředí z buněčné kultury odstraní a nahradí se čerstvým živným prostředím, které obsahuje známé množství buněk, infikovaných VZV a připravených svrchu uvedeným způsobem. Zásobní virus se s výhodou titruje a stanoví se tak počet jednotek pro tvorbu plaků, PFU a buněčný materiál, určený k infekci se spočítá tak, aby bylo možno určit počet infikovaných buněk na neinfikované buňky, MOI. Hodnota MOI tedy vyjadřuje poměr buněk, infikovaných VZV v očkovacím materiálu k počtu neinfikovaných buněk ve spojité vrstvě buněk v buněčné kultuře. To znamená, že hodnota MOI 1 : 10 je vysoká, kdežto hodnota 1 : 625 je nízká. Vysoká hodnota MOI je žádoucí, avšak z praktického hlediska je možno dobrých výtěžků VZV dosáhnout i při nižších hodnotách MOI, například 1 ; 125.

Při hodnotách MOI v rozmezí 1:7 až 1 :625 je možno dosáhnout výtěžku v rozmezí 500 000 PFU/ml při vyšších hodnotách MOI až 100 000 PFU/ml při nízkých hodnotách MOI, jek je zřejmé z tabulky 3 z příkladu 5. Čím vyšší je hodnota MOI, tím kratší inkubační doby je

-8CZ 289690 B6 zapotřebí k dosažení vysokých hodnot PFU a tím vyšší je výtěžek. Znamená to, že v závislosti na hodnotě MOI a na době ukončení kultury je možno získat přibližně pětinásobné rozdíly v konečných dosažených hodnotách PFU.

c) Udržování kultur, infikovaných VZV v živném prostředí s vysokým obsahem živin po dobu 22 až 96 hodin a izolace materiálu v okamžiku vrcholné produkce VZV

Buněčný materiál, infikovaný VZV se po infekci pěstuje ještě přibližně 22 až 96 hodin. Je důležité zachovat dostatečný přívod živin v tomto stupni růstu viru. Je žádoucí uchovat vysoký objem živného prostředí v případě, že se užije minimálního živného prostředí, jako EMEM s 2 až 10% FCS nebo je možno použít menší objem bohatého živného prostředí. Nejvýhodnější je použití živného prostředí SRFE-2 s 2 až 10 % FCS bez přídavku lipidu. Jak již bylo svrchu uvedeno, přidání lipidu v tomto stupni buněčné kultury již snižuje výtěžek VZV.

V průběhu 22 až 96 hodin pěstování buněčné kultury po infekci dochází k replikaci viru VZV v infikovaných buňkách a virus také infikuje sousední buněčný materiál. Buňky, které byly infikovány na počátku však již neposkytnou izolovatelný bezbuněčný virus. Růstová křivka viru a následná sestupná větev této křivky může být velmi ostrá. To znamená, že přesné načasování doby izolace je kritickým parametrem pro získání co největšího množství infekčního N7N, tento údaj je možno přesně reprodukovat pouze přísným řízením použité hodnoty MOI, užitým živným prostředím a dobou inkubace. Mimoto je možno užít rychlou zkoušku Elisa na antigen VZV tak, aby bylo možno co nejpřesněji stanovit dobu izolace jako okamžik, kdy produkce infekčního VZV je v korelaci s produkcí antigenu VZV do okamžiku, kdy již začíná docházet k uhynutí viru, jak je zřejmé z obr. 5 a 6.

V případě infikovaných buněk MRC-5, jejichž kultura byla ukončena 72 hodin po infekci a každý z uvedených stupňů byl optimalizován (růst byl uskutečněn v bohatém prostředí a před infekcí byly buňky vystaveny na 72 hodin působení 50 mM sacharózy), byl konečný výtěžek bezbuněčného viru VZV zvýšen přibližně šestnáctkrát ve srovnání s kulturou, pěstovanou v minimálním živném prostředí a ukončenou po 48 hodinách, ještě větší rozdíl je možno pozorovat při ukončení kultury po 96 hodinách, jak je zřejmé z obr. 1 a příkladu 8. Výtěžek VZV za optimalizovaných podmínek byl pouze čtyřnásobný ve srovnání s použitím minimálního živného prostředí v případě, že virus byl izolován 48 hodin po infekci, avšak stále ještě vysoké zlepšení ve srovnání s použitím minimálního živného prostředí bylo možno pozorovat při izolaci viru po 96 hodinách od infekce buněk. To znamená, že výtěžek viru je daleko vyšší a uhynutí viru je podstatně nižší při použití bohatšího živného prostředí, přičemž současně nedochází k prudkému poklesu výtěžku viru v průběhu času. Při použití bohatšího živného prostředí se také snižuje význam použité hodnoty MOI.

d) Promytí kultury, infikované VZV fyziologický roztokem chloridu sodného, popřípadě s obsahem lysosomotropní látky, jako chloridu amonného nebo chlorochinu před izolací buněk, infikovaných VZV

Aby bylo možno odstranit sérum, lipidy a buněčnou drť z kultury, promyje se souvislá vrstva kultury fyziologický pufrem, který nerozruší buněčný materiál. K tomuto účelu je vhodný fyziologický roztok chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru, PBS. Buněčný materiál je možno promýt několikrát, promývací roztok se slije, odsaje nebo odstraní jakýmkoliv jiným způsobem, kterým se neporuší integrita souvislé vrstvy buněk.

V případě, že se buněčný materiál chemicky uvolní z nádoby, měl by být zahuštěn odstředěním a fyziologický pufr by měl být nahrazen stabilizačním roztokem.

Bylo prokázáno, že přidání chloridu amonného nebo chlorochinu před uvolněním buněk zvyšuje konečný výtěžek NZN. V publikaci Kielian a další, EMBO J. 5, 3103 -3109, 1986 se popisuje použití chloridu amonného k řízení vnitřního pH buněčných endosomů, v nichž infikující virus

-9CZ 289690 B6 zřejmě stráví určitou část nitrobuněčného života. Je možné, že zvýšení výtěžku VZV po použití tohoto lysosomotropního prostředku je způsobeno méně tvrdými podmínkami uvnitř endosomu. Použití netoxických, nemetabolizovatelných disacharidů, například sacharózy v období před infekcí buněk a působení chloridu amonného nebo chlorochinu na buněčný materiál může tedy mít podobný mechanismus účinku. Ve všech případech bylo empiricky pozorováním potvrzeno, že ke zvýšení výtěžku NZN dochází v případě, že se chlorid amonný použije v konečné koncentraci v rozmezí 1 až 100 mM, nejvýhodněji v rozmezí 20 až 50 mM, přičemž se touto koncentrací působí s výhodou při teplotě 4 °C po dobu přibližně 25 až 50 minut před rozrušením buněk. V případě, že se užije druhý lysosomotropní prostředek, chlorochin, v koncentraci přibližně 230 mM, dochází rovněž ke zvýšení výtěžku viru VZV, vyjádřeno v jednotkách PFU/ml.

e) Oddělení buněk, infikovaných virem VZV do co nejmenšího objemu stabilizačního roztoku s okamžitým následným rozrušením těchto buněk nebo s lyofiliazcí buněk pro pozdější rozrušení

Jakmile byl buněčný materiál, infikovaný NZN promyt, je možno jej oddělit mechanicky v případě, že to použitá nádoba dovoluje, nebo také chemickým způsobem. Uvolnění buněčného materiálu působením enzymu je méně žádoucí vzhledem k tomu, že zbytky enzymu mohou snižovat celkový výtěžek viru po rozrušení buněčného materiálu. Jak již bylo svrchu uvedeno, v případě uvolnění buněk do fyziologického roztoku chloridu sodného je nutno buněčný materiál zahustit odstředěním a fyziologický roztok chloridu sodného nahradit co nejmenším objemem stabilizačního roztoku pro N7N. Obvykle se k tomuto účelu užívá přibližně 40 ml stabilizačního roztoku na 850 cm² souvislé vrstvy buněk.

Stabilizátory pro viry jsou v oboru známy. Například v US patentovém spisu č. 3985 615 se navrhuje stabilizace 5% sacharózou ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem, v dalších publikacích se doporučují složitější stabilizační roztoky, například SPGA.

Po opětném uvedení buněk, infikovaných N7N do suspenze ve stabilizačním roztoku pro virus je možno buněčný materiál okamžitě rozrušit nebo v případě, že se současně připravuje velké množství N7N, je možno buněčný materiál zmrazit na teplotu -70 °C pro pozdější zpracování. Výtěžek viru VZN na cm² pěstovaných buněk bude sice o něco vyšší v případě, že se buňky rozruší okamžitě, avšak po zmrazení obvykle nedochází k většímu snížení výtěžku než o 10 % ve srovnání s okamžitým zpracováním buněk.

f) Rozrušení buněk, infikovaných N7N k optimálnímu uvolnění N7N, spojeného s buněčným materiálem a odstranění buněčné drti za získání prostředku s obsahem volného bezbuněčného VZV

Jak již bylo svrchu popsáno, před rozrušením buněk se s výhodou odstraní živné prostředí a nahradí se co nejmenším objemem stabilizačního roztoku pro N7N, do tohoto roztoku se buněčný materiál uvolní mechanicky nebo jiným způsobem. Suspenze buněk se pak zchladí na teplotu 0 až 4°C a buněčný materiál se rozruší běžným způsobem, například působením ultrazvuku, homogenizací (Dounce) nebo jinými typy homogenizátorů s lépe nastavitelným střihovým namáháním, neboje možno použít kombinaci těchto postupů.

Bylo potvrzeno, že při samotném použití ultrazvuku nedochází k získání nejvyšších výtěžků bezbuněčného N7N. V případě, že se jako počáteční stupeň při rozrušení užije homogenizace (Dounce), pak se buněčný materiál odstředí, supematant se uchová jako supematant I, pak se usazenina buněk zpracuje působením ultrazvuku a opět odstředí, čímž se získá supematant II, tímto způsobem je možno uvolnit co nejvyšší množství VZV. Výtěžek ze spojených supematantů I a II je přibližně čtyřikrát vyšší než celkový výtěžek v případě, že se jako jediný způsob rozrušení buněk užije ultrazvuk.

-10CZ 289690 B6

Po rozrušení buněčného materiálu se buněčná drť odstraní odstředěním, filtrací nebo jakýmkoliv jiným známým způsobem, při němž VZV zůstává nepoškozen. Bezbuněčný virus se pak ředí stabilizačním roztokem a dělí na menší podíly pro použití jako vakcína. Pro dlouhodobé skladování se virus s výhodou lyofilizuje někteiým ze známých postupů.

Je tedy možno uzavřít, že celkový výtěžek viru je možno zvýšit následujícími optimalizovanými stupni tohoto postupu ve srovnání s produkcí VZV s použitím minimálního živného prostředí pro buněčnou kulturu:

Stupeň zvýšení PFU _______________________________________________________________________násobky prostředí/doplňky

1. MOI2-5

2. tvorba spojité vrstvy buněk2-3

3. prostředí SRFE-2 + lipid2-3

4. působení sacharózy před infekcí2-5

5. optimální objem živného prostředí1-2 celkový potenciální vzestup pro kombinaci použití doplňků živného prostředí a stabilizátorů a optimální podmínky infekce> 8 pozorovaný vzestup pro kombinaci opatření z bodů 3, 4 a 5 v třepacích16 lahvích

6. kombinované působení střihového namáhání a ultrazvuku pro uvolnění1,5

VZV, vázaného na buňky celkové zvýšení ve srovnání s běžným postupem>18

Využití postupu pro výrobu vakcíny

Byla prokázána použitelnost atenuovaného bezbuněčného VZV jako vakcíny pro prevenci planých neštovic. Celá řada klinických zkoušek postupně prokázala tuto použitelnost, výsledek zkoušek byl popsán například v Pediatrics 88 (3), 604 - 607, 1991 a Pediatrics 87 (5), 604 - 610, 1991. Příspěvek vynálezu k výrobě takových vakcín je tedy vysoce účinný postup, který dovoluje vysoký výtěžek živého, atenuovaného VZV. Virus, připravený způsobem podle vynálezu je možno zpracovat na vakcínu známými postupy a pak podávat obvyklým způsobem. Je například možno postupovat tak, že se živý, atenuovaný, bezbuněčný N7N, získaný způsobem podle vynálezu zředí stabilizačním roztokem, plní do lahví, lyofilizuje po jednotlivých dávkách tak, že po skladování při teplotě přibližně 4 °C nebo při nižší teplotě je v okamžiku podávání vakcíny k dispozici dávka o velikosti přibližně 1000 PFU. Vakcína s obsahem VZV, připraveného způsobem podle vynálezu může být ve formě jednotlivých dávek použita k očkování v lidském lékařství k vyvolání odpovědi imunitního systému, takže vznikne ochrana proti infekci virulentními kmeny VZV. S výhodou se postupuje tak, že se podkožně nebo nitrosvalově podává roztok, obsahující minimální dávku 2000PFU/ml, to znamená 1000 PFU/0,5 ml. Celkově je možno podávat dávky až do velikosti 15 000 až 20 000 PFU.

Optimalizací způsobu podle vynálezu pro produkci atenuovaného VZV je možno připravit známým způsobem vakcínu, použitelnou pro vyvolání tvorby protilátek proti VZV k ochraně proti planým neštovicím.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady.

-11 CZ 289690 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stanovení výtěžku VZV

Titry infektivity pro virus varicella zoster, VZV je možno stanovit při převrstvení agarózou nebo jinou kapalinou podle publikace Krah a další, J. Virol. Methods, 1990, 27: 319 - 326, zkouška se provádí následujícím způsobem:

Buňky MRC-5 se naočkují na plotny pro pěstování tkáňových kultur s průměrem 60 mm, užije se 6xl0⁵ buněk v 5 ml prostředí BME (základní Eaglovo prostředí sHanksovým vyváženým roztokem solí) se lOOmg/litr galaktózy, 50 mikrogramů/ml neomycinu a 2mM L-glutamínu a plotny se inkubují při teplotě 35 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého. Po inkubaci, trvající 24 až 48 hodin vytvoří buněčný materiál vrstvu, spojitou na 50 až 80%. Růstové prostředí se odstraní odsátím a buněčný materiál se infikuje při použití 100 mikrolitrů roztoku N7N, zředěného vhodným ředidlem pro virus, například pufirem SPGA nebo kapalným udržovacím prostředím, například LMM. Pufr SPGA obsahuje 7,5 % hmotnostních sacharózy, 11 mM fosforečnanu draselného, 0,1 % hmotnostní glutamátu sodného a 1 % lidského sérového albuminu. Virus se nechá přilnout k buněčnému materiálu po dobu nejméně jedné hodiny při teplotě 35 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého. Buněčné kultury, infikované VZV se pak převrství 5 ml prostředí s obsahem agarózy, ACM, nebo kapalným udržovacím prostředím LMM. Prostředí, obsahující agarózu je směsí dvou roztoků a obsahuje kapalné prostředí pro převrstvení kultury, LOM a roztok agarózy. Prostředí LOM obsahuje minimální základní prostředí s Earlovou směsí solí, MEM, 2 % fetálního telecího séra, inaktivovaného působením tepla, 50 mikrogramů/ml neomycinsulfátu a 2 mM L-glutaminu. Roztok agarózy se připraví zahřátím 4,5 g agarózy s nízkou teplotou tvorby gelu ve 100 ml MEM na 15 minut při teplotě 121 °C s následným zchladnutím roztoku na 45 °C. Prostředí AOM se připraví smísením jednoho objemu roztoku agarózy se 4 objemy l,25x koncentrovaného prostředí LOM při 45 °C. Plotny se zchladí na teplotu 23 až 25 °C, aby došlo ke ztuhnutí prostředí AOM. Kultury se pak inkubují, aby mohlo dojít k vývoji plaků. Po 6 až 7 dnech se plotny s prostředím LOM převrství 5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufřem, PBS a pomocí skelněné Pasteurovy pipety se uvolní a odstraní agaróza. Pak se odsaje prostředí z ploten, které obsahovaly LMM, čímž je možno pozorovat vytvořené plaky po zbarvení buněk pomocí roztoku, obsahujícího 0,2 % hmotnostních modři Coomassie R-250 v ethanolu s 1 % kyseliny octové. Počet plaků je průměrem ze 4 až 5 ploten a vyjádří se ve formě jednotek pro tvorbu plaků na ml, PFU/ml.

Vzhledem k tomu, že při tomto stanovení může docházet k určité variabilitě, uvádí se výtěžek VZV ve srovnání se současně prováděným postupem za neoptimalizovaných podmínek.

Příklad 2

Výtěžek VZV jako funkce spojitosti buněčné vrstvy v okamžiku infekce

Buňky MRC-5 byly naočkovány při použití 4xl0⁶ buněk/150cm² a byly pěstovány celkem 3 dny v Eaglově základním prostředí, doplněném Earlovou směsí solí, EBME za přítomnosti 10 % fetálního telecího séra, FCS. Po dosažení téměř spojité vrstvy buněk s hustotou přibližně 2xl0⁶ buněk/150cm² a byly pěstovány celkem 3 dny v Eaglově základním prostředí, doplněném Earlovou směsí solí, EBME za přítomnosti 10 % fetálního telecího séra, FCS. Po dosažení téměř spojité vrstvy buněk s hustotou přibližně 2 x 10⁶ buněk/150 cm² se k buněčnému materiálu přidá čerstvé prostředí EBME, doplněné 2 % FCS nebo 10 % FCS. V tomto okamžiku

-12CZ 289690 B6 se nechají buňky, téměř tvořící spojitou vrstvu, dále růst v nepřítomnosti nebo v přítomnosti infikujícího VZV při MOI 1 : 125 a sleduje se zvýšení hustoty buněk a výtěžek viru po 48 hodinách. Bylo prokázáno, že se hustota neinfikovaných buněk při použití 2 % FCS zvýšila pouze o 33 %, zatímco hustota buněk, rostoucích v přítomnosti 10 % FCS se zvýšila o 92 %. Hustota buněk v infikovaných kulturách se nezvýšila. Jak je zřejmé z tabulky I, výtěžky viru při použití téměř spojité vrstvy buněk nebyly ovlivněny replikací v kulturách, ať již tyto kultury byly doplněny malým množstvím 2 % FCS nebo maximálním množstvím 10 % FCS.

Jiné buněčné kultury byly pěstovány další dva dny v přítomnosti 10 % FCS až do hustoty přibližně 20 x 10⁶ buněk/150 cm², to znamená až do vytvoření zcela spojité vrstvy a pak bylo přidáno čerstvé prostředí EBME, doplněné 2 % FCS nebo 10 % FCS a buněčný materiál byl infikován VZV při MOI 1 : 125 nebo nebyl infikován. Vzestup hustoty buněk a výtěžek viru byl sledován po dalších 48 hodinách. Bylo prokázáno, že hustota neinfikovaných buněk v prostředí s obsahem 2% FCS se nezvýšila, zatímco hustota buněk v prostředí s obsahem 10% FCS se zvýšila o 15%. Znamená to však, že v žádném případě již nedošlo k větší replikaci buněk. Výtěžky viru v prostředí s obsahem 2 % FCS i 10 % FCS byly obdobné a výtěžek byl zvýšen přibližně třikrát ve srovnání s výtěžkem viru z buněk, infikovaných po vytvoření téměř spojité vrstvy, jak je zřejmé z tabulky I. To potvrzuje výhodu použití právě vytvořené spojité vrstvy ve srovnání s použitím téměř spojité vrstvy buněk, u nichž ještě dochází k replikaci pro dosažení optimálního výtěžku bezbuněčného viru N7N.

Tabulka I

stav buněk v době	% FCS během	bezbuněčný materiál PFU/ml,	replikace buněk
infekce	růstu viru	pokus	při růstu viru
		A	B
téměř spojitá vrstva	2	44 000	30 000	33%
	10	33 000	27 000	92%
čerstvá spojitá vrstva	2	119 000	117 000	0%
10	123 000	100 000	15%

Příklad 3

Srovnání výtěžku VZV při použití čerstvě vytvořené spojité vrstvy a starší kultury se spojitou vrstvou

Třepací lahve s plochou kultury 850 cm² byly naočkovány buňkami MRC-5 v koncentraci přibližně 26 500 buněk/ml. Všechny buňky byly pěstovány v prostředí EBME s obsahem 10 % objemových fetálního telecího séra, FCSio v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého při teplotě 35 °C. Lahve byly rozděleny do dvou skupin v závislosti na době infekce virem VZV. Buněčný materiál ve skupině I byl pěstován 5 dnů, po této době se vytvořila spojitá vrstva, prostředí bylo odstraněno a buňky byly infikovány VZV, vázaným na buněčný materiál při použití MOI 1 :125, byla použita suspenze buněk v prostředí EMEM + 2% FCS. Pak bylo přidáno ještě další živné prostředí a buněčný materiál byl inkubován ještě 48 hodin. Buněčný materiál ve skupině II byl pěstován ještě dalších 48 hodin před infekcí virem, vázaným na buněčný materiál při použití hodnoty MOI 1 : 125.

Produkce VZV kulturou ve skupině I a II byla stanovena následujícím způsobem. Živné prostředí bylo z lahví odstraněno a buněčný materiál byl promyt fyziologickým roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem, mechanicky oddělen pomocí skleněných kuliček ve stejných objemech stabilizačního roztoku a roztoky byly zchlazeny na 4 °C. Zchlazené suspenze buněk byly rozrušeny ultrazvukem. Buněčná drť byla odstraněna odstředěním při nízké rychlosti, 10 minut při 325 g a supematant s obsahem viru byl uchován. Produkce VZV byla měřena svrchu

-13CZ 289690 B6 uvedenou zkouškou na tvorbu plaků. Jak je uvedeno v tabulce 2, bylo možno dosáhnout přibližně dvojnásobného zvýšení výtěžku viru v případě, že byly infikovány virem buňky, které právě vytvořily spojitou vrstvu.

Tabulka 2

stav buněk	pokus 1 PFU/ml	pokus 2 PFU/ml
čerstvá spojitá vrstva	121 000	190 000
starší spojitá vrstva	82 000	85 000

Příklad 4

Vliv objemu živného prostředí na výtěžek NZN v PFU/ml milionů buněk MRC-5 bylo naočkováno do objemu 125 ml prostředí EBME s obsahem 10 % FCS, 50 mikrogramů/ml neomycinu a 2 mM L-glutaminu v třepacích lahvích s plochou 850 cm² a materiál byl inkubován 3 dny při teplotě 35 °C.

Pak bylo přidáno 300 ml čerstvého živného prostředí a kultury byl inkubovány ještě 4 dny při teplotě 35 °C. Pak bylo prostředí odstraněno a nahrazeno 125 nebo 425 ml prostředí EMEM s obsahem 2 % FCS, inaktivovaného teplem, 50 mikrogramů/ml neomycinu a 2 mM L-glutaminu. Pak byl přidán buněčný materiál MRC-5, infikovaný VZV při MOI přibližně 1 :125, kultury byly dále inkubovány 46 hodin při teplotě 35 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého. Pak bylo prostředí odstraněno, buněčný materiál byl čtyřikrát promyt vždy 100 ml PBS a pak mechanicky pomocí skleněných kuliček uvolněn do 43 ml stabilizačního roztoku. Pak byl materiál zmrazen na -70 °C. Bezbuněčný virus byl připraven působením ultrazvuku. Množství infekčního viru v materiálu po působení ultrazvuku, vyčeřeném odstředěním bylo měřeno svrchu uvedenou metodou sledování tvorby plaků.

Výsledky:

objem prostředí v ml	VZV v PFU/ml *
125	55 000,45 000
425	153 000, 103 000

* Jsou uvedeny výsledky ze dvou kultur

Je tedy možno uzavřít, že při použití vyššího objemu živného prostředí je možno dosáhnout dvojnásobného výtěžku infekčního viru VZV z buněčných kultur buněk MRC-5.

Příklad 5

Vliv použitého MOI VZV na výtěžek v PFU/ml

Třepací lahve byly naočkovány buňkami MRC-5 a materiál byl pěstován až do vytvoření spojité vrstvy buněk. Pak bylo růstové prostředí odstraněno a buněčný materiál byl infikován při použití VZV s různou hodnotou MOI. Produkce VZV infikovanými buněčnými kulturami byla sledována metodou tvorby plaků při periodické izolaci buněk stejným způsobem jako v příkladu

1. Jak je zřejmé z tabulky 3 a z obr. 5, bylo možno izolovat větší množství infekčního viru VZV v kratší době inkubace v případě použití vyšších hodnot MOI. Maximálních hodnot antigenů bylo možno při použití vyšší hodnoty MOI dosáhnout rychleji. Při velmi nízkých hodnotách MOI,

- 14CZ 289690 B6 například 1 : 625 dochází ke tvorbě antigenu později a jeho množství není optimální, jak je zřejmé z obr. 6.

Tabulka 3

Vliv hodnoty MOI na výtěžek bezbuněčného N7N při použití buněčné kultury MRC-5 ve spojité vrstvě

MOI titr bezbuněčného viru VZV PFU/ml xl 0'³ h

h okamžik izolace h 37 h

1 :25	100	450	50	nd
1 : 125	nd	150	325	100
1 :625	nd	nd	100	90

* nd = nebylo provedeno

Příklad 6

Zvýšená stabilita VZV ve stabilizačním roztoku při -20 °C

Infikované buněčné kultury byly zpracovány ultrazvukem v prostředí SPGA a promyty fyziologickým roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem. Virus, vázaný na buněčný materiál pak byl uvolněn ultrazvukem a buněčná drť byla odstraněna odstředěním. Koncentrace bezbuněčného viru byla upravena na známou hodnotu PFU/ml a podíly viru v přítomnosti stabilizátoru byly lyofílizovány a uloženy při teplotě 4 nebo -20 °C. Po jednoměsíčních intervalech po dobu celkem 14 měsíců byly vzorky rekonstituovány a byl stanoven zbývající obsah viru v PFU/ml. Výsledky tohoto pokusu jsou znázorněny na obr. 3.

Z výkresu je zřejmá výhodnost skladování viru při teplotě -20 °C ve srovnání se skladováním při 4 °C.

Příklad 7

Vliv množství a doby přidání sacharózy před infekcí buněk na konečný výtěžek VZV

1. Fáze očkování a počátečního pěstování buněk ml buněk MRC-5 bylo naočkováno v koncentraci 120 000 buněk/ml, s celkem 600 000 buněk na plotny s průměrem 60 mm v prostředí EBME s obsahem 10% FCS, 50 mikrogramů/ml neomycinu, 2 mM L-glutaminu a pak byl buněčný materiál inkubován při teplotě 35 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého.

2. Fáze buněčného růstu před infekcí

Buněčný materiál vytvořil spojitou vrstvu buněk 3 dny po naočkování. Živné prostředí bylo odsáto ze 48 ploten a bylo nahrazeno vždy 8 ml růstového živného prostředí, kterým bylo prostředí EBME nebo SRFE-2, doplněné 10% FCS, 50 mikrogramy/ml neomycinu, 2 mM L-glutaminu a 0,2 mg/ml lipidu ze sójových bobů v 1 mg/ml BSA, do živného prostředí bylo mimoto přidáno 50 mM sacharózy, kontrolní kultury byly ponechány bez sacharózy. Po přidání

-15CZ 289690 B6 čerstvého růstového prostředí byl buněčný materiál inkubován další 3 dny při teplotě 35 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého.

3. Infekce VZV

Z ploten bylo odstraněno živné prostředí a bylo nahrazeno 8 ml prostředí EmEm místo prostředí EBME a 8 ml prostředí SRFE-2 místo prostředí SRFE-2 s lipidy ze sójových bobů. Obsah FCS byl snížen na 2% u všech ploten, avšak ostatní doplňky, to znamená neomycin, glutamin a sacharóza byly užity stejně jako v růstové fázi. Do každé plotny pak bylo přidáno 333 mikrolitrů buněk, infikovaných N7N v ředění 1 : 16, to znamená 47 000 PFU/ml v prostředí EMEM se 2 % FCS, neomycinem a glutaminem.

Replikace viru VZV byla udržována 2 dny při teplotě 35 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého a pak bylo odstraněno živné prostředí vždy ze dvou ploten s rozdílnými podmínkami. Buněčný materiál byl čtyřikrát promyt PBS, buněčný materiál byl uvolněn do 1,2 ml ledového roztoku stabilizátoru z každé plotny a materiál, uvolněný vždy ze dvou ploten byl spojen do konických zkumavek pro odstředivky s objemem 50 ml a zmrazen na -70 °C.

Tentýž postup, jaký byl svrchu popsán, byl použit vždy pro dvě plotny, pěstované za různých podmínek třetího, čtvrtého a pátého dne po infekci VZV a spojený materiál vždy ze dvou ploten byl uložen při -70 °C.

Každý z materiálů, připravený svrchu uvedeným způsobem se později nechal roztát, byl zpracován ultrazvukem v ledu po dobu 30 sekund v každé ze zkumavek a pak byl materiál vyčeřen odstředěním při 1000 g celkem 10 minut při 4°C. Podíly supematantů pak byly odebrány pro zkoušku na tvorbu plaků. Výsledky této zkoušky, prováděné stejným způsobem jako v příkladu 1, jsou uvedeny na obr. 1.

Údaje, které jsou uvedeny na obr. 1 potvrzují několik skutečností:

1. Inkubace buněk před infekcí v prostředí s obsahem 50 mM sacharózy může velmi příznivě ovlivnit konečný výtěžek N7N. V prostředí EMEM i SRFE-2 byly výtěžky VZV vyšší v případě, že buněčný materiál byl před infekcí pěstován v přítomnosti sacharózy. V době 72 hodin po infekci byl výtěžek VZV u buněk v prostředí SRFE-2 s obsahem sacharózy přibližně 16x vyšší než výtěžek VZV u buněk, pěstovaných v minimálním živném prostředí bez sacharózy, výtěžky jsou uvedeny v PFU.

2. Pěstování buněk v bohatém živném prostředí SRFE-2 s lipidy ze sójových bobů v průběhu růstu buněk a SRFE-2 v průběhu růstu viru má příznivý vliv na výtěžek N7N, ve spojení s použitím sacharózy umožní toto opatření získat množství NZN, které je o řád vyšší než bez těchto opatření. To znamená, že vliv bohatého prostředí je synergní s působením sacharózy.

3. Doba izolace viru N7N je velmi významným faktorem. I za optimálních podmínek pěstování buněk v prostředí SRFE-2 při použití sacharózy a podobně, není nejvyššího výtěžku VZV dosaženo 48 hodin po infekci. V této době je možno dosáhnout pouze čtyřnásobného vzestupu ve srovnání s pěstováním buněk v minimálním živném prostředí. Avšak v době 72 hodin po infekci je možno dosáhnout až šestinásobku celkového množství NZN.

V jednotlivých pokusech nebyl výtěžek viru o tolik vyšší v případě, že 50 mM sacharózy bylo přidáno v době infekce a nikoliv 72 hodin před infekcí. Tyto pokusy ukazují na důležitost delšího pěstování buněk před infekcí tak, aby mohlo dojít k nahromadění sacharózy uvnitř buněk. Bylo také prokázáno, že přidání 25 mM nebo 100 mM sacharózy má méně příznivý vliv než přidání 50 mM sacharózy. Tytéž přibližné koncentrace platí také pro použití laktózy, cellobiózy nebo maltosy.

-16CZ 289690 B6

Příklad 8

Vliv celé řady optimalizovaných parametrů postupu na celkový výtěžek VZV

Pokusy byly prováděny v třepacích lahvích tak, aby bylo možno stanovit vliv různých změn, provedených v celkovém postupu, například změn v živném prostředí, doplnění prostředí sacharózou, přichází chloridu amonného ke stabilizátoru, uvolnění viru z buněk homogenizací nebo působením ultrazvuku na celkový výtěžek bezbuněčného viru v jednotkách PFU. Kultury byly založeny při použití 80 x 10³ buněk/ml ve 125 ml EBME s 10 % FCS na jednu třepatí láhev. Pak bylo živné prostředí upraveno na množství 425 ml při použití EBME nebo SRFE s lipidem ze sójových bobů a infikováno VZV ve 120 (malý objem) nebo 425 (vysoký objem) ml prostředí EMEM nebo SRFE bez lipidu ze sójových bobů. Časové údaje pro změny prostředí a pro dobu infekce byly stejné jako v příkladu 7. V různých dobách před infekcí, 96 nebo 24 hodin před infekcí nebo v době infekce byla přidána sacharóza (suc) v množství 50 mM. Do kultur, do nichž byla přidána sacharóza před infekcí, byla přidána sacharóza také spolu s infikujícím virem. Všechny kultury byly infikovány při použití MOI 1 : 15 pomocí buněk, infikovaných virem, 46 hodin po infekci byly kultury uvolněny do stabilizačního roztoku s obsahem 20 mM chloridu amonného (N), nebo do prostředí bez jakékoliv přísady. Všechny vzorky byly zmrazený na -70 °C a virus byl z buněk uvolněn působením ultrazvuku nebo homogenizací. Všechny vzorky byly vyčeřeny odstředěním 10 minut při 1000 g.

Výtěžek viru ve vzorcích, zpracovaných ultrazvukem, vyjádřeno v PFU, vedl k následujícím závěrům:

1. Použití většího objemu živného prostředí vede v případě prostředí EMEM k dvojnásobnému zvýšení výtěžku viru. Při použití prostředí SRFE je možno optimálního výtěžku viru dosáhnout již při nižším objemu živného prostředí. V některých případech došlo dokonce při použití většího objemu živného prostředí ke snížení výtěžku.

2. Přítomnost chloridu amonného není pro vysoký výtěžek VZV v PFU kritickým faktorem.

3. Přítomnost sacharózy zvyšuje výtěžek viru v PFU dvojnásobně při použití prostředí EBME/EMEM a pětinásobně v prostředí SRFE. Je zřejmé, že je také důležité, v jaké době se přidá sacharóza. V dalších pokusech bylo prokázáno, že množství PFU bylo 94 x 10³ pro kultury, pěstované v prostředí SRFE + sójový lipid/SRFE bez sacharózy a 296 xlO³, 427 xlO³ a 671 x 10³ v případě kultur, do nichž byla sacharóza přidána v okamžiku infekce, 24 hodin před infekcí a 96 hodin před infekcí.

4. U kultur, pěstovaných v přítomnosti sacharózy bylo možno pozorovat podstatně menší množství cytopathických účinků ne u kultur, k nimž nebyla sacharóza přidána. V dalším pokusu se u kultur, pěstovaných v prostředí se sacharózou do jednoho týdne po infekci stále ještě neprojevily degenerativní cytopathické účinky, kdežto kontrolní kultury bez sacharózy byly již zcela rozrušeny. Je proto možné, že buněčný materiál v přítomnosti sacharózy může nahromadit větší množství VZV ve formě antigenu a zejména jako PFU při prodloužené inkubační době, zvláště více než 46 hodin v případě třepacích lahví.

5. Hodnota MOI nebyla v tomto pokusu upravována pro vyšší koncentraci buněk v době infekce v prostředí SRFE. To znamená, že by bylo možno získat ještě vyšší výtěžky PFU v případě, že by i tento parametr byl optimalizován.

-17CZ 289690 B6

Příklad 9

Výtěžek bezbuněčného VZV při použití mechanického střihu, ultrazvuku a kombinace obou postupů

Byly provedeny pokusy ve velkém měřítku, při použití různých podmínek pro produkci VZV, podmínky byly měněny obdobným způsobem jako svrchu v příkladu 8. V tomto pokusu byl navíc analyzován ještě vliv dalšího parametru, kterým byl způsob rozrušení buněk. Výsledky těchto pokusů budou dále uvedeny srovnáním výtěžků bezbuněčného VZV při pouhé homogenizaci, samotném působení ultrazvuku a v případě kombinace homogenizace (Dounce) a působení ultrazvuku. Podmínky produkce N7N, tak jak jsou uvedeny, jsou shrnuty pro buněčný materiál, pěstovaný v minimálním prostředí EBME/EMEM nebo při vysokém přívodu živin, SRFE-2 se sójovými lipidy/SRFE-2 s 50 mM sacharózy v období před infekcí. Buněčný materiál byl pěstován a izolován stejným způsobem jako v příkladu 8 a hodnoty PFU/ml pro N7N byly stanoveny zkouškou podle příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4:

Tabulka 4

Množství bezbuněčného viru v PFU/ml x 10-³

prostředí	Dounce	ultrazvuk + Dounce	celkem	pouze ultrazvuk
EBME/EMEM	42	Ί	49	38
EBME/EMEM	64	4	66	46
SRFE-2 + sacharóza	154	47	201	42

Z uvedených údajů je zřejmé, že maximálního zvýšení výtěžků VZV je možno dosáhnout v případě, že se mechanické střihové namáhání při rozrušování buněčného materiálu kombinuje s působením ultrazvuku.

Příklad 10

Použití prostředí SRFE-2 a lipidu ze sójových bobů jako doplňků k dosažení zvýšeného výtěžku živého viru jako vakcíny z buněk MRC-5

Buňky MRC-5 byly naočkovány do T-lahví s plochou 25 cm² při použití prostředí EBME a kultura byla inkubována tři dny při teplotě 35 °C. pak bylo živné prostředí odstraněno a nahrazeno 12,5 ml čerstvého prostředí EMEM nebo prostředím SRFE-2 s 10 % FCS, neomycinem, glutaminem a do prostředí buď nebyl přidán žádný lipid nebo byl lipid přidán v poměru 1 :200. Kultury pak byly inkubovány ještě tři dny při teplotě 35 °C. Pak bylo prostředí odstraněno a byly přidány buňky MRC-5, infikované VZV a 12,5 ml 2% fetálního telecího séra aneomycin a glutamin v prostředí EMEM nebo SRFE-2. Kultury, označené „SRFE-2“ byly pěstovány v prostředí SRFE-2 před infekcí i po infekci. Kultury „SRFE + soy“ označují vzorky, které byly pěstovány v prostředí SRFE-2 se sójovým lipidem v ředění 1:200 při pěstování buněk, avšak pouze v prostředí SRFE-2 po infekci virem. Po 48 hodinách pěstování bylo živné prostředí odstraněno, buněčný materiál byl čtyřikrát promyt vždy 5 ml PBS a pak byly buňky uvolněny v 1,2 ml stabilizátoru. Vzorky ze dvou lahví byly spojeny a zmrazený na teplotu -70 °C. Po roztátí byl buněčný materiál rozložen ultrazvukem, vyčeřen odstředěním 10 minut při 1000 g a supematanty byly zmrazený na -70 °C pro stanovení infekčního titru viru. Výsledky jsou znázorněny na obr. 4. Je možno uzavřít, že při použití prostředí SRFE-2 místo EMEM došlo k 2,5násobnému vzestupu výtěžku živého viru. Při použití lipidu ze sójových bobů v prostředí SRFE-2 v průběhu růstu kultury bylo možno dosáhnout dalšího 2,7násobného zvýšení výtěžku

-18CZ 289690 B6 viru, celkem tedy bylo dosaženo sedminásobného zvýšení ve srovnání s použitím prostředí EMEM.

Příklad 11

Kompetitivní zkouška ELISA pro kvantitativní stanovení antigenu VZV

Vzhledem k tomu, že zkouška na tvorbu plaků virem je náročná na čas, není vhodná pro kontrolu průběhu postupu. Rychlá zkouška ELISA na antigen VZV dovoluje měření množství antigenu VZV a tím sledování růstu viru v průběhu výroby živé vakcíny VZV. Mimoto je tento postup možno použít ke stanovení antigenu VZV ve vyčeřené vakcíně po působení ultrazvuku a potenciálně také ke stanovení antigenu v naplněných lyofílizovaných vzorcích v lahvičkách. Tento postup se provádí tak, že se antigen VZV ze vzorku inkubuje s antisérem proti VZV v roztoku. Zbývající volná protilátka se nechá vázat na antigen VZV, imobilizovaný na mikrotitračních plotnách ELISA. Množství protilátky, které se váže na plotny, je nepřímo úměrné množství antigenu ve zkoumaném vzorku. Protilátka, která se váže na plotny se kvantitativně stanoví reakcí s enzymaticky vázanou lidskou protilátkou proti této protilátce a příslušným substrátem za vzniku barevného produktu, který je pak možno stanovit kvantitativně spektrofotometricky.

Při zkoušce ELISA na antigen VZV a při zkoušce na tvorbu plaků VZV by obecně měly být získány obdobné výsledky, je však třeba uvážit, že při zkoušce na přítomnost antigenu VZV se prokazuje neživý i životaschopný N7N. Vzhledem ktomu, že odpověď imunitního systému, vytvořená při použití usmrceného VZV není tak účinná jako odpověď po podání živého atenuovaného viru, je zkouška na tvorbu plaků kritickou zkouškou, jíž je jedině možno stanovit dávku viru ve vakcíně s obsahem N7N. Avšak zkouška na antigen je také cenná vzhledem k tomu, že touto zkouškou je možno měřit celkové zatížení příjemce vakcíny antigenem.

Provedení postupu

1. Plotny ELISA se opatří povlakem glykoproteinu (gp) z buněk MRC-5, neinfíkovaných nebo infikovaných VZV a pak se převrství 1% sérovým albuminem skotu (frakce V, šarže A-9647, Sigma) v 0,1% NaN₃ ke snížení nespecifické absorpce protilátek na plotny. Střídavě se jednotlivé řady opatří povlakem V7N nebo kontrolního antigenu, to znamená, že na řady A, C, E a G se nanese VZV gp a na řady B, D, F a H se nanese neinfekční MRC-5 gp jako antigen.

2. Antigen, vyčeřený odstředěním 1 minutu při 3250 g se jako zkoumaný vzorek zředí stabilizátorem ve zkumavkách s rozměrem k2 x 75 mm nebo v mikrozkumavkách. Standardní preparát virového antigenu (26 jednotek/ml antigenu VZV při blotové zkoušce), se zředí 1:10a pak sériově vždy v poměru 1 : 1,25, čímž se získají koncentrace antigenu 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1, 0,9 jednotek/ml. Další ředění je možno provést až na 0,7 a 0,5 jednotek/ml. Tato zřeďovací řada se užívá k získání standardní křivky při měření množství antigenu ve zkušebních vzorcích.

3. Lidské sérum proti VZV se zředí stabilizátorem na dvojnásobek požadovaného konečného ředění.

4. 300 mikrolitrů zředěného antigenu se přidá do mikrozkumavek a tam smísí s 300 mikrolitry zředěného séra proti VZV a směs se inkubuje 15 až 22 minut při teplotě 35 °C. Kontrolní vzorek obsahuje lidskou protilátku proti VZV a ředidlo bez antigenu.

5. Podíly 100 mikrolitrů z každé směsi séra a antigenu se přidají ke dvěma vyhloubením, opatřeným povlakem glykoproteinu VZV (VZV gp) a ke dvěma vyhloubením, opatřeným

-19CZ 289690 B6 povlakem MRC-5 gp, užijí se tedy čtyři vyhloubení najeden vzorek (například vzorek 1 ve sloupci 1, řady A, B, C a D, vzorek 2 ve sloupci 2, řady A, B, C a D, a podobně).

6. Plotny se inkubují po dobu 15 ± 1 minuta při teplotě 35 °C tak, aby se volná protilátka, která nevytvořila komplex s antigenem v roztoku mohla vázat na virový antigen, imobilizovaný na plotnách.

7. Nenavázaná protilátka se odstraní promytím a do vyhloubení se přidá kozí protilátka proti lidskému IgG, konjugovaná s alkalickou fosfatázou k průkazu lidské protilátky.

8. Směs se inkubuje po dobu 15 ± 1 minuta při teplotě 35 °C a nenavázaný konjugát se odstraní promytím. Vázaný konjugát se prokáže tak, že se směs inkubuje 15 minut při 35 °C s p-nitrofenylfosfátem jako substrátem, rozpuštěným v diethanolaminovém pufru.

9. Po ukončení reakce se substrátem se přidá 50 mikrolitrů 3 M hydroxidu sodného do každého vyhloubení a vznik zabarvení se kvantitativně stanoví spektrofotometrem pro odečítání na mikroplotnách, stanoví se optická hustota při 405 nm.

Výpočty a interpretace výsledků

1. Vypočítá se průměr z řady hodnot optické hustoty pro určitý počet vyhloubení, opatřených povlakem VZV a MRC-5. Zkušenost ukázala, že optická hustota OD pro MRC-5 se u různých vzorků a ředění příliš neliší. Z tohoto důvodu se vypočítá průměr hodnot MRC-5 na celou plotnu a tato hodnota se užije k opravám na nespecifickou vazbu primární protilátky nebo konjugátu v extraktech neinfikovaných buněk. Průměrná OD pro MRC-5 se odečte od průměrných hodnot OD pro N7N, čímž se získají specifické hodnoty optické hustoty, deltaOD pro VZV.

2. Příprava standardní křivky pro stanovení množství antigenu:

Hodnoty deltaOD ze standardní křivky se vynášejí proti známým koncentracím antigenu v jednotkách VZV/ml. Údaje se zanesou do příslušného grafického programu (například Cricket graph, verze 1,3, Cricket Software, Malvem, PA), lineární část křivky se identifikuje (musí obsahovat nejméně čtyři body) a tímto způsobem se získá rovnice pro přímku y = a + bx.

3. Vypočítání množství antigenu ze zkoumaných vzorků:

Hodnoty pro a a b jsou udány v rovnici pro přímku a y (deltaOD) je známo. Zbývající neznámá hodnota x je hodnota pro antigen v jednotkách/ml a je možno ji vypočítat a provést opravu na ředění vzorku k získání koncentrace antigenu v neředěném vzorku. Dále je uveden způsob výpočtu pro vzorek:

Uváděná koncentrace antigenu je koncentrace, získaná pro nejméně zředěný vzorek při hodnotě deltaOD v lineární části standardní křivky.

Výpočet:

vzorek antigenu	ředění	deltaOD jednotky/ml antigenu	jednotky/ml
ředění A	1:2	Y z rovnice přímky x = (y-a)/b	oprava na x (faktor zředění)

-20CZ 289690 B6

Příklad 12

Zkouška ELISA na antigen VZV a srovnání s výtěžkem N7N, uvedeným v PFU

Vzorky bezbuněčného VZV z příkladu 7, pro něž je výtěžek v PFU/ml uveden na obr. 1, byly zkoumány zkouškou ELISA na přítomnost antigenu VZV podle příkladu 11. Výsledky těchto zkoušek jsou uvedeny na obr. 2.

Je nutno uvést, že množství antigenu VZV stoupá po době 96 hodin přestože podle údajů z obr. 1 se hodnota PFU/ml již snižuje. Je také nutno uvést, že hodnoty pro antigen VZV v prostředí SRFE-2 s lipidem ze sójových bobů a se sacharózou nejsou nikde šestnáctinásobkem hodnoty pro antigen v prostředí EMEM, jak je znázorněno na obr. 2, přestože hodnoty pro životaschopný bezbuněčný virus VZV v PFU/ml jsou takto zvýšeny, jak je zřejmé z obr. 1. Z tohoto srovnání je zřejmé, že sacharóza působí právě zvýšení množství životaschopného viru VZV v době 72 hodin po infekci buněčného materiálu virem.

Příklad 13

Urychlení růstu buněk MRC-5 při použití prostředí SRFE-2 s lipidem ze sójových bobů

Kultura buněk MRC-5 byla naočkována do T-lahví s plochou 25 cm² s hustotou 53 000 buněk/ml při použití 12,5 ml prostředí EBME s 10% FCS, 50 mikrogramy/ml neomycinu a 2 mM L-glutaminu a pak byla kultura inkubována při teplotě 35 °C. Po 2 až 3 dnech bylo živné prostředí odstraněno a nahrazeno (výměna 2) 12,5 ml čerstvého prostředí nebo prostředí SRFE-2 s obsahem 10% FCS, 50 mikrogramů/ml neomycinu, 2 mM L-glutaminu a různých množství lipidu ze sójových bobů. Neředěné lipidy ze sójových bobů obsahovaly 20 mg/ml lipidu a 100 mg/ml sérového albuminu skotu.

Prostředí bylo odstraněno 6 dnů po naočkování kultury a bylo nahrazeno 12,5 ml prostředí EMEM se 2 % FCS, 50 mikrogramy/ml neomycinu a 2 mM L-glutaminu nebo prostředí SRFE-2 s různým množstvím lipidů ze sójových bobů. Buněčný materiál byl z vybraných lahví uvolněn trypsinem a buňky byly spočítány v hematocytometru. Po dalších dvou dnech pěstování byl určen počet buněk i v ostatních kulturách, výsledky těchto zkoušek jsou uvedeny v následující tabulce 5.

Poznámky k tabulce:

Výměna prostředí 1: prostředí bylo nahrazeno uvedeným prostředím, doplněným 10 % FCS 2 až 3 dny po založení kultury.

Výměna prostředí 2: prostředí bylo nahrazeno uvedeným prostředím, doplněným 2 % FCS 6 dnů po založení kultury.

ND = nebylo provedeno.

Tabulka 5

Zvýšení hustoty buněk MRC-5 při použití živného prostředí SRFE s lipidy ze sójových bobů

-21 CZ 289690 B6

prostředí	pokus 1	pokus 2
EMEM (E)	2,3	1,5
SRFE(S)	4,0	3,8
S + 1:100 lipidy	ND	7,6
S + 1:200 lipidy	7,9	7,6
S + 1:500 lipidy	5,9	3,7
S + 1:2000 lipidy	5,0	3,8

Je tedy možno uzavřít, že při použití prostředí SRFE-2 bez doplnění lipidy se přibližně dvojnásobně zvýší počet buněk ve srovnání s použitím prostředí EMEM. Výtěžek buněk je možno dále zvýšit doplněním živného prostředí lipidy ze sójových bobů, a to v závislosti na dávce těchto lipidů. Maximálního výtěžku buněk bylo dosaženo při použití kombinace živného prostředí SRFE-2 a lipidů v rozmezí přibližně 200 až 400 mikrogramů/ml.

Příklad 14

Pěstování buněk WI-38 způsobem podle vynálezu

Kultura buněk WI-38 byla naočkována do T-lahví s plochou 25 cm² při použití 53 000 buněk/ml ve 12,5 ml prostředí EBME s 10 % FCS, 50 mg/ml neomycinu a 2 mM L-glutaminu a kultura byla inkubována při teplotě 35 °C. Po dvou dnech bylo živné prostředí odstraněno a nahrazeno 12,5 ml prostředí SRFE-2, které bylo doplněno 50 mg/ml neomycinu, 2 mM L-glutaminu a lipidem ze sójových bobů v ředění 1:200. Kontrolní kultury byly pěstovány v tomtéž prostředí bez lipidů ze sójových bobů. Po pěti dnech pěstování při teplotě 35 °C bylo prostředí odstraněno, buněčný materiál byl od lahví oddělen působením trypsinu a počítán v hematocytometru. Zbývající lahve byly za stejných podmínek pěstovány ještě tři dny před počítáním buněk. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 6:

Tabulka 6

buněčná linie	lipidový doplněk	buňky/lahev x 10-6 po
5 dnech	8 dnech
1	-	4,2	4,8
	+	9,5	10,2
3	-	4,1	4,9
	+	9,3	12,5

Je tedy možno uzavřít, že při doplnění bohatého živného prostředí lipidy ze sójových bobů se zvýší výtěžek buněk WI-38 přibližně dvojnásobně. Je tedy možno očekávat, že při použití této buněčné linie pro výrobu viru VZV bude možno postupovat obdobným způsobem jako při použití kultury buněk MRC-5.

Příklad 15

Způsob vyhodnocení urychlení růstu buněk MRC-5

Kultura buněk MRC-5 byla založena vT-lahvích s plochou 25 cm² při použití přibližně 53 000 buněk/ml ve 12,5 ml základního Eaglova živného prostředí s Earlovou směsí solí, EBME s 10 % FCS, 50 mikrogramy/ml neomycinsulfátu (neo) a 2 mM glutaminu (Gin). Kultury byly inkubovány 3 dny při teplotě 35 °C, po této době se obvykle vytvoří vrstva buněk, souvislá na 50 až 75 %. Živné prostředí se odstraní a nahradí se 10 až 12,5 ml živného prostředí SRFE-2

-22CZ 289690 B6 s 10 % FCS, 50 mikrogramy/ml neomycinu, 2 mM Gin a lipidem ze sójových bobů nebo jiným lipidem a kultura se dále inkubuje při teplotě 35 °C. Pak se stanoví počet buněk v různých časových intervalech tak, že se buněčný materiál uvolní 2,5 ml roztoku trypsinu s 0,25 % citrátu a buněčný materiál se počítá v hematocytometru. Životnost buněk se stanoví jejich barvením 0,2% trypanovou modří. Počet buněk se užije ke stanovení koncentrace buněk a ta se pak opraví na celkový objem buněčné suspenze, čímž se vypočítá výtěžek buněk na jednu láhev. V někteiých pokusech byly kultury pěstovány 3 až 4 dny po výměně živného prostředí v přítomnosti 2 % FCS a počty buněk byly stanoveny po inkubaci další 2 dny.

Příklad 16

Vliv dlouhodobého působení lipidu na buněčné kultury

Kultura buněk MRC-5 byla pěstována v T-lahvích s plochou 25 cm², živné prostředí bylo poprvé vyměněno po třech dnech a počet buněk byl stanoven po dalších 3 dnech růstu. Některé další lahve téhož typu byly udržovány za stejných podmínek ještě další dva dny s tím rozdílem, že vyměněné živné prostředí obsahovalo nebo neobsahovalo lipidy. Buněčný materiál byl uvolněn působením trypsinu. Výtěžek buněk byl 2,6x10⁶ v případě buněk, naočkovaných vprostřed! EBME a pěstovaných v prostředí EMEM, zatímco u kultur, pěstovaných v prostředí SRFE-2 s lipidem ze sójových bobů v ředění 1 : 100 bylo dosaženo počtu 6,6 x 10⁶ a 7,7 x 10⁶ buněk. Z kultur, pěstovaných další dva dny bylo získáno 2,76 x 10⁶ buněk vprostřed! EBME/EMEM, zatímco při použití EBME/SRFE-2 bez lipidu ze sójových bobů bylo získáno 9,2x10⁶ a 7,88 x 10⁶ buněk na jednu T-lahev s plochou 25 cm². Při použití prostředí EBME/SRFE-2 se sójovým lipidem, zředěným 1 : 100 bylo získáno pouze 2,48 a 2,28 x 10⁶ buněk. Tyto údaje prokazují, že při dlouhodobém působení, přibližně 5 dnů po druhé výměně živného prostředí a při použití vysoké koncentrace lipidů může dojít i ke snížení výtěžku buněk, pravděpodobně jejich uhynutí. To znamená, že se obvykle v této fázi již užije bohaté živné prostředí bez lipidů. Tato výměna za bohaté prostředí bez lipidů je zvláště složitá v případě, že kultura je infikována virem vzhledem ktomu, že lipid může být toxický pro růst viru nebo pro životaschopnost buněk v přítomnosti viru.

Příklad 17

Vliv různých koncentrací lipidů na růst buněk v bohatém a v minimálním prostředí

Postupuje se v podstatě stejným způsobem při výměně prostředí i při počítání buněk jako v příkladu 16 při použití buněk MRC-5. Za těchto podmínek byly získány následující výtěžky buněk.

živné prostředí	celkový počet buněk MRC-5 x 10-b na T-lahev dny po výměně prostředí 3 5
EBME/EMEM (3 pokusy)	4,3,2,46,1,52	2,94,3,50
EBME/SRFE-2	3,80
EBME/SRFE-2-0,4 sl.		13,69,11,09
EBME/SRFE-2 + 0,4 sl.	11,7	11,65
EBME/SRFE-2-0,2 sl.	5,10	8,51,6,27
EBME/SRFE-2 + 0,2 sl.	7,62, 9,7	9,66
EBME/SRFE-2-0,1 sl.	3,52
EBME/SRFE-2 + 0,1 sl.	4,94
EBME/SRFE-2-0,04 sl.	3,10
EBME/SRFE-2 + 0,05 sl.	3,16
EBME/SRFE-2-0,01 sl.	2,90
EBME/SRFE-2 + 0,01 sl.	3,82

-23CZ 289690 B6

Poznámka: Symboly + a - za uvedením živného prostředí ukazují na přítomnost nebo nepřítomnost uvedeného množství sójového lipidu (sl.) v mg/ml v živném prostředí po druhé výměně tohoto prostředí.

Uvedené údaje jsou v souladu s výsledky z příkladu 16, které prokazují, že dlouhodobé vystavení buněk působení vysoké koncentrace lipidů již není výhodné, přestože v tomto případě je toxický účinek méně vyjádřen než v příkladu 16. Při nižší koncentraci lipidů je dlouhodobé vystavení buněk této koncentraci méně škodlivé a může příznivě ovlivnit výtěžek buněk na cm² plochy, na níž materiál roste.

Příklad 18

Vliv koncentrace fetálního telecího séra na celkový výtěžek buněk

V tomto pokusu byl sledován vliv přidání 2 % nebo 10 % fetálního telecího séra v přítomnosti lipidů. Kultury buněk MRC-5 byly pěstovány v prostředí EBME, po 3 dnech bylo prostředí nahrazeno prostředím SRFE-2 s různým množstvím lipidů ze sójových bobů a po dalších 2 dnech bylo prostředí nahrazeno prostředím SRFE-2 se stejnou koncentrací lipidů jako při první výměně prostředí. Výtěžek buněk v přítomnosti 10% FCS byl 9,5, 11,3 a 12,2 x 10⁶ pro kultury, doplněné 0,1, 0,2 a 0,4 mg/ml lipidu. V případě, že byla použita 2 % FCS, byly výtěžky buněk za týchž podmínek 6,5, 8,8 a 3,2 x 10⁶. Tento pokus tedy prokazuje příznivý vliv přítomnosti FCS na růst buněk při doplnění živného prostředí lipidem. Případné toxické účinky zvýšené koncentrace lipidů na buněčný materiál jsou v tomto případě zřejmě snižovány dostatečným množstvím FCS.

Příklad 19

Vliv různého množství lipidů a různých druhů lipidů na růst buněk MRC-5

Kultury buněk MRC-5 byly pěstovány v T-lahvích s plochou 25 cm² v prostředí EBME. Po 3 dnech se živné prostředí nahradí prostředím SRFE-2 s obsahem 10 % FCS a různých lipidů. V uvedených koncentracích byl použit lipid ze sójových bobů (Boehringer Mannheim), lipidy, bohaté na cholesterol ze séra dospělého skotu (Sigma), nebo lipid Miles/Pentex EX-CYTEI nebo lipoprotein skotu (Věry Low Endotoxin). Počet buněk po výměně živného prostředí byl 1,19 milionů. Po dalších pěti dnech byl buněčný materiál spočítán. V prostředí EMEM bylo 2,97 milionů buněk. V SRFE-2 nebo SRFE-2 s 0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml a 0,1 mg/ml lipidu ze sójových bobů bylo napočítáno 4,83, 10,44, 8,67 a 8,04 milionů buněk. Při použití lipidu EX-CYTE I v ředění 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 bylo získáno 5,37, 4,80 a 4,74 milionů buněk. Při použití EX-CYTE VLE ředění 1 :25, 1:50, 1:100 bylo získáno 5,49, 7,23 a 7,92 milionů buněk. Při použití lipidů s vysokým obsahem cholesterolu (Sigma) byly téměř stejně účinné. Je tedy zřejmé, že k uvedenému účelu je možno užít i jiné lipidy než lipidy ze sójových bobů.

Příklad 20

Příznivý vliv vysokých koncentrací lipidů ze sójových bobů na růst buněk MRC-5

Kultury buněk MRC-5 byly naočkovány do lahví s plochou 25 cm² a živné prostředí bylo vyměněno po 3 a 6 dnech stejně jako v příkladu 13. Výtěžek buněk na jednu láhev po 6 dnech pro prostředí EBME/EMEM, SRFE-2 se sójovým lipidem 1 : 100 nebo SRFE-2 se sójovým lipidem 1 : 50 byl 4,3, 9,7 a 11,7 milionů buněk. Životaschopnost buněk byla vyšší než 99 % u všech kultur při stanovení barvením trypanovou modří. Pak bylo živné prostředí vyměněno za

-24CZ 289690 B6 prostředí ± lipid ze sójových bobů, kultury byl inkubovány další dva dny a pak byly stanoveny výtěžky buněk. Výtěžek buněk na láhev v těchto kulturách byl 2,9 a 3,5 milionů pro kultury, pěstované v prostředí EBME/EMEM, 11,65 milionů pro kultury, pěstované v prostředí SRFE-2 se sójovým lipidem 1 : 50, kde prostředí bylo vyměněno za stejné prostředí, zatímco v případě buněk, pěstovaných v prostředí SRFE-2 se sójovým lipidem 1 :50 (vždy dva vzorky) a po výměně v prostředí SRFE-2 bez sójového lipidu bylo získáno 13,69 a 11,09 milionů buněk. Při použití prostředí SRFE-2 se sójovým lipidem 1 : 100 při pěstování v tomtéž prostředí po výměně prostředí bylo získáno 9,66 milionů buněk, avšak v případě, že prostředí bylo vyměněno za prostředí SRFE-2 bez lipidů, bylo u dvou vzorků získáno 8,51 a 6,27 milionů buněk.

Z tohoto pokusu je zřejmé, že výtěžek buněk MRC-5 se zvyšoval se zvyšujícím se množstvím sójového lipidu. Maximálního výtěžku bylo dosaženo při použití lipidu v ředění 1 :50, vyšší koncentrace již nebyly použity. Použití lipidů i po výměně živného prostředí ještě mírně zvyšuje výtěžek buněk, výsledky však ukazují, že maximálního výtěžku buněk je možno dosáhnout při použití lipidu v ředění 1 : 50 již po první výměně prostředí. Při druhé výměně živného prostředí je tedy možno lipid již vynechat. Vzhledem k tomu, že vysoká koncentrace lipidů může být škodlivá pro produkci viru, může být žádoucí lipid neužívat v průběhu růstu viru.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (4)

1. Způsob pěstování lidských diploidních buněk v jednoduché spojité vrstvě pro výrobu atenuovaného viru varicella zoster, vyznačující se tím, že se zásobní kulturou diploidních buněk naočkuje bohaté živné prostředí v nádobě pro tkáňové kultury, buňky se pěstují 24 až 72 hodin, pak se živné prostředí nahradí čerstvým bohatým živným prostředím, doplněným 0,02 až 0,4 mg/ml prostředí lipidů, v tomto prostředí se buňky pěstují po dobu 24 až 72 hodin a pak se bohaté prostředí, doplněné 0,02 až 0,4 mg/ml živného prostředí lipidů odstraní a nahradí se čerstvým bohatým prostředím bez lipidů.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se k obohacení živného prostředí užije 0,02 až 0,4 mg/ml živného prostředí sójových lipidů nebo lipidů ze séra dospělého skotu.

3. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že se buňky pěstují v bohatém živném prostředí SRFE-2.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako diploidní buňky užijí buňky MRC-5, WI-38 nebo Věro.