JP2599552B2 - 水痘帯状疱疹ウイルスの弱毒ワクチンの製造方法 - Google Patents
水痘帯状疱疹ウイルスの弱毒ワクチンの製造方法Info
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Description
varicella zoster virus)は水
痘及び帯状疱疹(帯状ヘルペス)の原因ウイルスであ
る。水痘はVZV免疫のない人体で発症する極めて伝染
性の疾患である。90%以上の人間は20歳までにこの
ウイルスに感染する。免疫抑制された個体及び成人がこ
の疾患に罹った場合には重態に陥り易い。多くの場合、
VZVは背根神経節細胞中に潜伏する。VZVが潜伏状
態から再活性化されたとき、疼痛を伴う慢性疾患である
帯状ヘルペスが発症する。
予防できるのが望ましく、水痘の弱毒生ワクチンの接種
を全児童に義務付ける制度も計画されている。種々の細
胞培養系においてVZVを増殖させ、弱毒した無細胞の
生存VZVをワクチンとして使用することは従来技術で
報告されている。米国特許第3,985,615号は、ワ
クチン用として適当なVZVの弱毒Oka株をモルモッ
トの一次胚細胞中で産生させることを記載している。米
国特許第4,008,317号は、VZVの温度感受性突
然変異体をワクチン安定剤として適当なWI−38細胞
中で培養することを記載している。生存VZVの維持に
有用なSPGAのような組成物も当分野で公知である。
制約は、当業界で公知の細胞培養系から得られる無細胞
VZVの収量である。本発明の新規な方法を使用するこ
とによって無細胞VZVの収量を約5〜20倍増加させ
得る。
ZVワクチンを高収量で製造する方法を提供する。
る典型的な収量は約80,000〜160,000細胞/
cm2である(Mann、Dev.Biol.Stan
d.、37、149〜152(1977);Wood
& Minor、Biologicals 18、14
3〜146(1990))。ウイルス抗原を産生させる
ための単層細胞培養を使用する場合、その欠点は単層培
養物の増殖密度が小さいことである。
の研究では、飽和密度を約1×106細胞/cm2に増加
させようとすると専用灌流型培養容器に依存せざるを得
なかった(Mann、Dev.Biol.Stan
d.、37、149〜152(1977))。本発明
は、既存の細胞培養系を使用しながら細胞収量を増加さ
せる独特の手段を提供する。
従来可能であったよりもはるかに高い密度に増殖させ、
従って細胞単層に培養されたワクチン産生用ウイルスの
収量を向上させ得る方法を提供する。
胞培養方法及び該方法で使用するための新規な組成物に
関する。本発明方法によれば、最少培地ではなく富化培
地の使用が必要であり、富化培地に最適濃度の脂質を補
充することも必要である。本発明方法は、約0.02〜
0.4mg/mlの大豆脂質を補充したSRFE−2培
地から成る新規な増殖培地を使用することによって単層
細胞培養密度のかなりの増加を達成し得る。このように
して達成された単層細胞密度の増加は抗ウイルスワクチ
ン製造用ウイルス抗原の産生増進に有用である。
明は水痘の予防に有用な無細胞の弱毒生VZVワクチン
を大量に製造する方法を提供する。この方法では、細胞
培養によってVZVを最適に増殖させ、VZVの収量及
び安定性が最大になる条件下でウイルスを採取する。最
適化された方法は、(a) ヒト二倍体細胞から選択さ
れたVZV感染感受性細胞を、高度の細胞複製を達成す
るに十分な高栄養の条件下で、集密的単層培養物となる
まで培養し、非代謝性二糖を供給するステップと、
(b) ステップ(a)で培養した細胞の集密時点にで
きるだけ近い時期にVZV感染細胞を実用上可能な限り
高い感染多重度で感染させるステップと、(c) VZ
V感染培養物を高栄養状態に約22〜96時間維持して
感染性VZV産生物が最大となったものを採取するステ
ップと、(d) VZV感染細胞を採取する前に、塩化
アンモニウムまたはクロロキンのようなリソソーム向性
物質を任意に含有する生理的溶液でVZV感染培養物を
洗浄するステップと、(e) VZV感染細胞を最小量
の安定化溶液に採取し、直ちに細胞を破壊するかまたは
後で破壊するために細胞を凍結するステップと、(f)
VZV感染細胞を細胞連合VZVが最適に解放される
まで破壊し、細胞性破片を除去して無細胞VZV調製物
を提供するステップとを含む。
する。本発明の目的は、付着培養細胞の細胞密度の増加
を達成することである。この目的は、最適化濃度の脂質
を補充した富化増殖培地を与えることによって達成され
る。本発明の新規な培地−脂質組成物中で本発明に従っ
て単層培養物を増殖させると、ウイルスプラーク形成単
位(PFU)即ちウイルス抗原の産生収量をかなり増加
させることが可能である。従って、A型肝炎ウイルス、
水痘帯状疱疹ウイルス、風疹、ロタウイルス、麻疹、ポ
リオ、おたふくかぜ及びその他のウイルスワクチンの製
造に、本発明の細胞培養方法を有利に使用し得る。
はSRFE−2(SIGMA Chemical C
o.、St.Louis、MO、S2138またはSe
rvaFine Chemicals、Heildel
berg、Germany47523から市販)。この
培地はWeissら(In Vitro 16(7)、
616〜628(1980))によって記載されてい
る。同様に使用できるその他のSRFE−2等価培地ま
たは組成の多少異なる培地も勿論本発明の範囲に包含さ
れる。
明方法に有利に使用し得る。例えば、成ウシ血清に由来
のコレステロール富化脂質(SIGMA Chemic
alCo.、catalog # L−4646)、E
X−CYTE I脂質またはVery Low End
otoxin(VLE)脂質(MILES Inc.、
catalog # 82−004−7〜8及び82−
019−1)が富化培地補充物として有効であることが
知見された。好ましい脂質添加物は、Boehring
er Mannheim Biochemicals、
Indianapolis INからcatalog
#1074 482として入手できる市販の大豆脂質抽
出物である。この材料または同様の材料は、Iscov
e及びMelchers(J.al.Ex.Medic
ine、147、923〜933、1979)にB−リ
ンパ球培養物中の血清置換物として記載されている。こ
の文献にも、またBoehringer Mannhe
imの使用説明書にも、大豆脂質補充物が富化培地の補
充に有用であることは示唆されていない。これらの文献
における脂質の使用目的は最少培地中の血清置換物とし
て使用することである。本発明における脂質の使用目的
は富化培地の補充物として使用することである。更に、
公知の文献では、脂質の使用濃度は約10〜100μg
/mlである。本発明では、脂質の最適使用濃度は文献
または製造業者によって示唆された濃度の2〜3倍であ
る。更に、本発明では、脂質補充物を血清補充物に代替
するのでなく血清に補充物として添加する。
WI−38細胞、Vero細胞またはウイルス増殖に有
用な別種の細胞を培養容器に播種する。最初の細胞移植
期は、EMEMまたはEBMEのような当分野で公知の
最少培地中または脂質補充物非添加のSRFE−2培地
のような富化培地中で行なう。また、約10%ウシ胎仔
血清(FCS)、ネオマイシンのような抗生物質(約5
0μg/mlが適量)及びL−グルタミン(約2mM)
の使用も有利であろう。製造すべきウイルスの種類に従
って細胞及びウイルスの許容温度、通常は約34〜37
℃、好ましくは約35℃で細胞を数日間増殖させる。
増殖した後で、最少培地または富化培地を除去し、最適
濃度の脂質を補充した新しい富化培地に交換する。
質補充物非添加の新しい富化培地に交換する。細胞がほ
ぼ集密または集密に達した後まで脂質を与えると産生妨
害性になり細胞の最大収量を低下させることが知見され
た。
させる必要がある場合、脂質補充物を除去し、富化培地
の新しいバッチにウイルス原液を導入する。この交換培
地に脂質が存在しないとき、上記のような脂質誘発性の
細胞減少の問題を生じることなく細胞増殖期間を延長し
得る。
なりの収量増加が達成される。従って、MRC−5細胞
で増殖させた水痘ウイルスの場合、MRC−5細胞を最
少培地またはSRFE−2培地単独で増殖させた場合に
比較してVZV PFU収量のかなりの増加が達成され
る。また、水痘ウイルスの増殖または風疹ウイルスの産
生に有用なWI−38細胞も、本発明の新規な方法によ
って培養されると増殖密度がかなり増加する。
発明の新規な方法では、細胞培養によってVZVを増殖
させ、得られたVZVをウイルスの収量及び安定性を最
適化する条件下で採取する。VZV以外のヘルペスウイ
ルス、麻疹、おたふくかぜまたは風疹のようなその他の
エンベロープ付きウイルスの産生においてもVZVの産
生の場合と同様の利点が得られるであろう。
用するためのVZVを有効に産生し得る方法を提供する
ことである。方法の各ステップを最適化したときに最終
的に達成された無細胞VZVの収量に基づいて方法の成
否を判断し得る。無細胞VZVの最終調製物の感染力価
によって収量を決定する。水痘帯状疱疹ウイルス(VZ
V)調製物の感染力価は、Krahら(J.Virol.
Methods、1990、27:319〜326)に
よって記載されたアガロース−オーバーレイまたは液体
オーバーレイ手順によって得られた。簡単に説明すると
この方法は、VZV感染感受性のMRC−5細胞を能動
的複製状態(actively replicatin
g state)まで、即ち、細胞が約50〜80%集
密状態になる点まで培養する。次いで最少量のウイルス
を細胞単層にオーバーレイし、細胞に付着させ、次に追
加の増殖培地を添加する。数日間増殖させた後、細胞を
タンパク質染料に接触させ、透明な領域即ちプラークを
カウントする。従って既知量のウイルス接種物に対する
1ミリリットルあたりのプラーク形成単位(PFU)の
数がウイルス収量の十分な尺度となり得る。所与の任意
のウイルス調製物から得られた無細胞ウイルスの総量を
乗算すると、PFUの総数を計算し得る。
適化された任意の特定方法によって得られたPFUの増
加を最適化されない処理ステップを含む方法によって得
られた結果に対する比として示す。ウイルス収量の増加
倍率をこのようにして示すとPFUアッセイ自体のばら
つきが相殺される。最終的には、ここに記載の処理ステ
ップが総合され当分野に公知の方法によるVZV収量の
約16〜20倍のVZV収量が得られる。このような増
加倍率は文献に報告されたことはなく、これはVZVワ
クチン産生の分野で多大な貢献を果たし得る。
理であるから、反応条件の制御は特に難しい。高速VZ
V抗原ELISAは、水痘生ワクチン製造中のウイルス
増殖をモニタできるようにVZV抗原量を測定し得る。
更にこの試験は、清澄化し音波処理したワクチンバルク
中のVZV抗原量を算定するために使用でき、また、凍
結乾燥ワクチン充填バイアル中の抗原を測定するために
も使用できよう。要約するとこのアッセイでは、試験サ
ンプルに由来のVZV抗原を抗VZV血清と共に溶液中
でインキュベートする。ELISAマイクロタイタープ
レートに固定させたVZV抗原に残留遊離抗体を結合さ
せる。プレートに結合し得る抗体の量は試験サンプル中
の抗体の量に反比例する。プレートに結合する抗体を酵
素リンクした抗ヒト抗体及び分光光度法によって定量可
能な着色物質を与える適当な基質との反応によって定量
する。
アッセイは概して相関するデータを与えるが、VZV抗
原アッセイは非生存及び生存の双方のVZVを検出する
ことに留意されたい。死VZVによって生じた免疫応答
が弱毒生ウイルスに対する応答と同じほど有効であると
いう証明はないので、VZVワクチンのウイルス接種量
を決定するためにはプラークアッセイが必須である。し
かしながら抗原アッセイも、VZVワクチンレシピエン
トに投与される総抗原負荷の測定値を与える、PFUア
ッセイよりも高速であるからVZV産生を経時的にモニ
タできる、VZV PFU産生ピーク点に少なくとも相
関するので採取適期を判断できる、などの利点を有して
いる。
節することによって本発明方法が更に優れた結果を与え
る。これらのすべてのパラメータが本発明の範囲に包含
される。
胞から選択されたVZV感染感受性細胞を、高度の細胞
複製を達成し得る多量の培地または富化培地を用いて集
密的単層が得られるまで培養し、ショ糖のような非代謝
性二糖を供給するステップ:VZVを産生させるために
有用であることが当分野で知られている多数の種々の細
胞培養系のいずれを使用してもよい。このために例え
ば、Vero細胞、WI−38細胞、MRC−細胞及び
その他の多くの種類の細胞が使用されている。本発明者
らはヒト用ワクチン産生のために許容されたMRC−5
細胞を終始使用した。しかしながら、MRC−5細胞以
外の特に多産性の細胞系を使用した場合に無細胞VZV
の収量がここで報告した程度以上に増進される可能性を
否定することはできない。このような細胞系が現行の方
法に適している限り、このような細胞系の使用は本発明
に包含される。
を加えたイーグルの最少必須培地(EMEM)中で5%
CO2雰囲気下に35℃でインキュベートした亜集密状
態または集密状態のMRC−5細胞単層中の無細胞生存
ウイルスを比較することによって、無細胞VZVプラー
ク形成単位(PFU)の収量に対する細胞集密度の効果
が判明する(実施例2、表1参照)。
ZVの収量PFU/mlは、亜集密的培養物を能動的に
増殖させるか(10%血清)または否か(2%血清)に
かかわりなく、亜集密的単層を感染させることによって
得られる収量の約2〜3倍に増加する。従ってVZV収
量増進のためには、能動的に増殖しない集密的細胞がワ
クチン製造プロセスに必要であると考えられる。
パーセンテージは、無細胞VZVPFU収量を左右する
主な要因であるとは考えられない。従って、細胞増殖及
びウイルス培養にEMEMもしくはEBMEのような最
少培地を使用するかまたはSRFE−2のような富化培
地を使用するかにかかわりなく、典型的には、方法の細
胞増殖期に約10%のFCSを与え、ウイルス増殖期に
約2%のFCSを与える。
0μg/mlのネオマイシンのような抗生物質とグルタ
ミン(約2mM)とを細胞培養物及びウイルス増殖培地
に添加する。
これらの培養容器の機能的等価物)に、MRC−5また
はその他の二倍体細胞を、細胞の初期濃度が約10,0
00〜40,000細胞/cm2となるように播種する。
約10%のウシ胎仔血清を補充した増殖培地で細胞を養
育し、5%CO2ガスを与え、約30〜37℃、好まし
くは約35℃でインキュベートする。
めの必要最小量の細胞を移植するとよい。表面積に対す
る作用量の比は、増殖表面積1cm2あたり培地約0.5
mlである。回転培養瓶で細胞を増殖させる場合、85
0cm2あたり約125mlという少量でもよいが、約
425ml/cm2が好ましい。
で公知の市販の最少培地、例えば、イーグルの最少必須
培地(EMEM)またはアール塩を補充したイーグルの
基礎培地(EMBE)を約10%のFCSと共に使用し
てもよい。または、強化された富化培地を使用してもよ
く、この段階には後者の使用が有利であろう。SIGM
Aから入手できるSRFE培地(Weissら、In
Vitro 16(7)、616〜628(198
0))は、この時期に有利に使用できる富化培地であ
る。但し、富化培地が方法のこの段階に必須であるとい
うのではない。
に集密的な細胞の増殖を確保するために十分な栄養を与
えることが必須である。このためには、多量の最少培地
を与えるかまたはより少量の富化培地を与える。細胞を
約30〜37℃、好ましくは約32〜35℃で増殖させ
る。
維持した後で、培地の除去及び交換によって細胞をリフ
ィードし、次いでインキュベーションを継続する。吸引
もしくは傾瀉によって培地を除去してもよく、または、
細胞単層の団結性を弱体化しない限り任意の別の手段に
よって培地を除去してもよい。上記のように移植された
MRC−5細胞の場合、細胞を培養容器に導入した約7
2時間後にリフィードを行なう。
と同じでもよい。しかしながら、細胞増殖期には移植期
の使用量よりも多い量の培地を与えるのが好ましい。こ
のことは、FCSを加えたEMEMまたはEBMEのよ
うな最少培地で細胞を培養する場合に特に重要である。
大量培養は細胞に適当な栄養供給を確保する1つの方法
である。
培養に関する要件が緩和される。特に好ましい富化培地
の一例はSRFE−2(SIGMA)である。この時期
に最少培地でなく富化培地を使用すると、集密的細胞単
層の密度が顕著に増加する。細胞密度の増加に伴って、
富化培地で増殖させた感染細胞培養物から得られるVZ
Vの収量も増加する。従って、細胞増殖期に富化培地を
使用したときのVZVの最終収量は同時期に最少培地を
使用したときに比べて約2〜4倍増加する。
質を補充する。複数の脂質補充物のいずれかを使用し得
る。例えば、成ウシ血清(SIGMA Chemica
lCo.)に由来のコレステロール富化脂質、EXCY
TE I脂質またはVery Low Endotox
in(VLE)脂質(MILES)が富化培地または最
少培地の補充物として有用であることが知見された。市
販の大豆脂質(Boehringer Mannhei
m、Iscoveら、J.Exp.Med.、147、9
23〜933(1978))は約0.2mg/mlで与
えられたときに極めて有利な補充物であることが証明さ
れた。SRFE−2と脂質とFCSとを混用すると約5
00,000/cm2に近い細胞密度が得られた。細胞増
殖を最少培地または富化培地のいずれで行なうかにかか
わりなく、脂質を補充したときにVZV収量が増加す
る。市販材料は、20mg/mlの脂質、100mg/
mlのウシ血清アルブミンを含む原液として供給されて
いる。この材料は1:100の最終希釈度で使用すると
便利である。細胞増殖期にSRFE−2に約0.2mg
/mlの大豆脂質を補充したときのVZVの最終収量
は、EMEM培地単独のときの該収量の約9倍、SRF
E−2培地単独のときの該収量の約3.3倍に増加し
た。
毒性非代謝性二糖に接触させるとVZVの最終収量が更
に増加することを知見した。極めて成功した1つの実施
態様では、培養容器に細胞を導入した72時間後であ
り、かつ培養物にVZVを感染させる好ましくは約24
〜96時間前に、約20〜60mMのショ糖を与える。
実際には、上記のステップ2のリフィード培地に約50
mMのショ糖を添加することによってこれらの条件を満
たし、このステップ及び先行ステップを実質的に合体さ
せることによって無菌操作の必要数を減らす。
のような別の二糖もVZVの最終収量を増進させるが、
好ましい二糖はショ糖である。フルクトース及びリボー
スのような単糖を試験したが、これらの単糖はVZV収
量を増加させなかった(リボースは毒性さえ示す)。二
糖は増殖する細胞のリソソーム中に濃縮され、これらを
膨潤させて小胞を形成すると考えられる(DeCour
cy & Storrie、Exp.Cell Re
s.、192、52〜60(1991))。二糖がVZ
V収量に与えるこのような効果はVZVのリソソーム性
損傷の減衰に起因するものかもしれない。二糖以外に
も、三糖及び四糖が有利な効果を有することが予測され
る。例えばCohn及びEhrenreich(J.E
xp.Med.、129、201〜222(1969))
は、このようなより大きい糖またはショ糖がマクロファ
ージに供給されるとき糖が細胞によって代謝されない間
は同様の小胞形成が生じることを観察した。
集密時点にできるだけ近い時期にVZV感染細胞を実用
的な高い感染多重度で感染させるステップ:反復実験を
平均すると、集密化後に48時間静置した細胞は、集密
化直後の細胞にVZVを感染させた場合の収量に比べて
約50%のVZV PFU/mlしか与えないことが知
見された。従って、VZV接種物の導入時期を集密化時
点にできるだけ近付けることが重要である。不都合に
も、集密化は、培地の種類、培養される細胞の種類及び
その他の使用培養条件に従って変動するパラメータであ
る。上記のステップ(a)1.に従って移植されたMR
C−5細胞の場合、典型的には集密化に到達した時点で
細胞感染させる。
くは、米国特許第3,985,615号に記載されており
ATCCに寄託された弱毒ウイルスのOka株である。
このウイルスは、モルモット胚細胞培養物及びヒト二倍
体肺腺維芽細胞培養物(例えばMRC−5細胞)中で増
殖するのに適している。
をMRC−5細胞に約1:125のMOIで感染させ、
感染した細胞をウイルス複製可能に維持し、細胞をトリ
プシン処理し、遊離した細胞を作用シード(種菌)とし
て直ちに使用してもよく、または、後で使用するためも
しくはPFU定量のためにDMSOもしくはグリセロー
ルのような寒冷保護剤と共に約107細胞/mlでゆっ
くりと凍結させて保存してもよい。VZV感染を開始さ
せるためには、凍結したVZV感染細胞原液を解凍し、
集密的細胞培養物に添加し得る。
ur die gesamte Virusforsc
hung 40、397〜399(1973))に記載
された凍結乾燥接種物の4℃長期保存を可能にする方法
に従ってVZV感染細胞を凍結乾燥させてもよい。ま
た、無細胞VZVを接種物として使用することも可能で
あるが、採取のときにウイルス収量の損失が生じるので
細胞定着接種物を使用するのが好ましい。
別の方法では、産生用細胞の移植よりも前にウイルスシ
ード調製用細胞の増殖を開始させる。VZV感染細胞を
シード細胞に感染させるときに産生用細胞の移植を開始
させ、ウイルスシードがVZVのピーク力価に達すると
同時に集密化するようにしてもよい。最適ではないがよ
り便利な方法としては、シード細胞及びバルク細胞の全
部を同時に少量の培養培地(850cm2の回転培養瓶
あたり約125ml)に移植してもよい。約2〜3日間
増殖させた後、VZVシード調製用細胞の培養瓶を約4
25mlに拡大するか、または集密まで増殖するように
富化培地をリフィードする。産生用細胞は、作用シード
細胞にVZV感染細胞を感染させる約2日前までは(約
10%のFCSを含む)少量の最少培地中で比較的休眠
している。このときに、産生用細胞の量を約425ml
まで増加させるか、または、最適量の大豆脂質とウシ胎
仔血清とを添加したSRFE−2のような富化培地をリ
フィードする。このようにすれば産生用細胞は高度に集
密化するまで増殖するであろう。産生用細胞に上記培地
をリフィードした2日後に、集密化した作用シード細胞
にVZV感染細胞を1:125以上のMOIで感染さ
せ、VZV複製を約2〜3日間継続させる。シード培養
物中でVZVが産生ピークに達するまでに産生用細胞が
集密化するであろう。次にシード細胞を採取して産生用
細胞に添加する。
VZV感染後の適当な時期に、VZV感染したシード培
養物から培地を吸引し、VZV感染したシードをトリプ
シン処理(約0.25%トリプシン)またはその他の非
破壊的手段によって採取し、産生用細胞培養物に既知の
MOIで感染させる。
te、E.H.(Infectionand Immun
ity 14、709〜715(1976))は、VZ
Vの高収量を得るためには高MOIが重要であることを
指摘しているが、低MOI感染との厳密な比較はしてい
ない。本発明はこれを詳細に比較する。
ごとく調製された既知量のVZV感染細胞を含む新しい
培地に交換することによって、細胞にVZVを感染させ
る。好ましくはウイルス原液の水痘ウイルスのプラーク
形成単位(PFU)を測定し、レシピエント細胞をカウ
ントして感染多重度(MOI)を定量する。MOIは、
接種物中のVZV感染細胞対培養物中の非感染単層細胞
の数の比として示される。従って、1:10のMOIは
高い値であり、1:625のMOIは低い値である。M
OIが高い値であることが望ましいといえるが、実際に
はMOI=1:125という低い値で優れたVZV収量
が得られる。
れる収量は、最高値のMOIにおける約500,000
PFU/mlから最低値のMOIにおける約100,0
00PFU/mlの範囲である(実施例5の表3参
照)。MOIが高いほど、ピークPFUに達するまでの
所要インキュベーション時間が短く、収量が高い。従っ
て、MOIの値及び採取時期次第では最終PFUが約5
倍に達することも可能である。
約22〜96時間維持し、VZV産生のピーク点で採取
するステップ:VZV感染細胞の培養を感染後約22〜
96時間継続する。ウイルス増殖のこの時期に適正な栄
養を維持することが重要である。約2%〜10%のFC
Sを加えたEMEMのような最少培地による大量培養で
もよく、またはより少量の富化培地を使用してもよい。
極めて好ましくは、2%〜10%のFCSを加えたSR
FE−2を脂質補充物非添加で使用する。脂質はこの時
期で使用されるとVZV収量を低下させることが判明し
た。
は感染細胞中で複製し、拡張して隣接細胞に感染する。
しかしながら、古い感染細胞は回収可能な無細胞PFU
を与えないであろう。VZVの増殖曲線及び以後の下降
の勾配は極めて大きい。従って、感染性VZVの収量を
最大にするために採取適期は重要なパラメータであり、
個々の産生処理毎の初期(input)MOI、栄養及
びインキュベーション時間の厳密な管理を維持すること
によって採取適期を正確に再現できる。更に、感染性V
ZVの産生は、少なくともウイルス死が起こり始めると
きまではVZV抗原の産生と相関するので(図5参
照)、採取適期を知るために高速VZV抗原ELIZA
を使用してもよい。
富化培地中で増殖させる、細胞を50mMのショ糖に感
染前72時間接触させる)、感染の約72時間後にVZ
V感染MRC−5細胞を採取した場合、無細胞VZVの
最終収量は、最少培地を用いて培養し48時間目に採取
したウイルスの収量に比べて約16倍に増加し、96時
間目に採取したときは収量の差が更に大きくなっている
(実施例8、図1)。ウイルスを感染後48時間で採取
したときには、最適化した条件下のVZVの収量は最少
培地の約4倍でしかなかったが、96時間後に採取した
ときは最少培地の収量に比べて極めて増加していた。従
って、富化培地中ではウイルス収量がはるかに増加し、
ウイルス死がはるかに減少し、ウイルス収量が急勾配の
経時的下降を生じない。富化培地中ではMOIもそれほ
ど重要でない。
ZV感染培養物を、任意に塩化アンモニウムまたはクロ
ロキンのようなリソソーム向性物質を含む生理的溶液で
洗浄するステップ:培養物から血清、脂質及び細胞性破
片を除去するために、細胞を溶解しない生理的バッファ
で単層培養物を洗浄する。このためにはリン酸塩緩衝生
理的食塩水(PBS)を問題なく使用し得る。細胞を数
回洗浄し、洗浄溶液を傾瀉するかまたは吸引するか、ま
たは単層の団結性を破壊しない別の任意の手段によって
除去する。
きは、細胞を遠心によって濃縮し、生理的バッファを安
定化溶液に交換する必要がある。
ロロキンを与えるとVZVの最終収量が改善されること
が知見された。Kielianら(EMBO J.5、
3103〜3109(1986))は、感染性ウイルス
がその細胞内寿命のある部分を過ごすと考えられる細胞
性エンドソームの内部pHを調節するために塩化アンモ
ニウムを使用した。リソソーム向性物質に細胞を接触さ
せたときにVZV収量が増加するメカニズムは、害の少
ないエンドソーム性環境が誘発されることに関連すると
推定される。従って、ショ糖のような無毒性非代謝性二
糖を感染前に細胞に充填(loading)すること及
び塩化アンモニウムまたはクロロキンに細胞を接触させ
ることによって、同様のメカニズムによる作用が得られ
ると思われる。いずれにしても、細胞破壊の前に、塩化
アンモニウムを最終濃度1〜100mM、より好ましく
は20〜50mMの範囲で与え、好ましくは約4℃で約
25〜50分間維持するとVZVの最終収量が増進され
ることが実験的に確認された。第2のリソソーム向性物
質即ちクロロキンを約230μMの濃度で使用したとき
にも同様に、VZVの回収率PFU/mlが増加する。
感染細胞の採取、及び直後の細胞破壊または後日の破壊
用の細胞の凍結ステップ:VZV感染細胞を洗浄し、増
殖容器が掻取り可能な容器であれば掻取りによって採取
し、そうでなければ細胞を化学的に剥離する。細胞の酵
素遊離はあまり好ましくない。その理由は、残留酵素が
細胞破壊後のウイルス収量を減少させ得るからである。
上述のように、細胞を生理的食塩水中に遊離させたとき
は、細胞を遠心によって濃縮し、生理的食塩水を最小量
のVZV安定化溶液に交換する。細胞増殖表面積に対す
る好ましい量は、表面積850cm2あたり安定剤約4
0mlである。
えば、米国特許第3,985,615号はリン酸塩緩衝生
理食塩水中の5%ショ糖による安定化を示唆している
が、別の文献ではSPGAのようなより複雑な安定剤が
報告されている。
た後、細胞を直ちに破壊してもよく、または大量のVZ
Vを調製する場合には、後で処理できるように−70℃
で凍結する。細胞を直ちに破壊したときは増殖細胞cm
2あたりのVZVの収量はやや多いが、凍結段階を経由
してもその収量が直後の処理で得られる収量から10%
以上減少することはない。
るためのVZV感染細胞の破壊及び細胞性破片の除去に
よる無細胞VZV調製物の供給ステップ:上述のごと
く、好ましくは培養培地を破壊前に細胞から除去し、最
小量のVZV安定剤に交換し、掻取りまたはその他の方
法で細胞を安定剤に解放する。細胞浮遊液を0〜4℃に
冷却し、次に、音波処理、ダウンスホモジナイゼーショ
ンのような適当な手段によって破壊する。ダウンスより
も大規模な処理ができる別の種類の剪断手段を用いても
よく、またこれらの技術を併用してもよい。
率が得られないことを確認した。実際、初期破壊ステッ
プとしてダウンスホモジナイゼーションを使用し、次い
で遠心し、上清を上清Iとして保存し、次いでペレット
の音波処理及び遠心を順次行なって上清IIを得る場
合、破壊によるVZV収量は極めて改善される。上清I
及びIIの合計収量は、破壊技術として音波処理単独を
使用したときに得られる収量の4倍という高い値にな
る。
濾過またはVZVを損傷しないで細胞破片を除去する当
分野で公知のその他の任意の手段によって行なう。次
に、無細胞ウイルス調製物を安定化溶液で希釈し、ワク
チンとして使用するために小分けする。好ましくは、長
期保存のために当分野で公知の方法のいずれかによって
VZVを凍結乾燥する。
れる収量増加の概数を最少培地中の細胞増殖によるVZ
V産生との比較によって以下にまとめる:方法のステップ PFUの増加率 培地/補充物: 1.MOI 2〜5 2.細胞の集密化 2〜3 3.SRFE−2培地+脂質 2〜3 4.前感染期のショ糖添加 2〜5 5.最適培地量の使用 1〜2 培地/安定剤補充物と最適感染条件との併用によって 得られる正味増加率 ≧8 回転培養瓶中で3、4及び5を併用したときに 観察された増加率 16 6.細胞定着VZVを遊離させるための剪断/音波処理の併用 1.5 最適化されない方法に比べた総増加率 ≧18
あることは証明されている。多数の臨床試験でこの有用
性が最終的に立証され、このような証明はもはや従来技
術の一部となっている(例えば、Pediatrics
88(3)、604〜607(1991);Pedi
atrics 87(5)、604〜610(199
1)参照)。従って、弱毒した生存VZVを高収量で産
生する極めて有効な方法を提供することによって本発明
は当分野に多大な功績を果たし得る。本発明方法で調製
されたウイルスは、当分野で公知の方法に従ってワクチ
ン製剤として調製でき、既に確定した投薬計画(reg
imen)に従って投与できる。例えば、本発明の弱毒
した無細胞の生存VZV産生物を安定剤に希釈し、瓶に
充填し、単位用量ずつ凍結乾燥し、約4℃以下で貯蔵す
ると、使用時に用量約1000PFUの製剤が得られ
る。本発明方法で製造されたVZVワクチンは、VZV
のビルレント菌の感染を防御する免疫応答を誘発すべく
ヒトに接種するための単位用量製剤として使用され得
る。好ましくは最小で、約2000PFU/mlの用量
(1000PFU/0.5ml用量)を皮下または筋肉
内に投与する。合計で15,000〜20,000PFU
に達する高い用量も投与したが、これらの用量も許容範
囲であった。
ための最適化した方法を提供し、該方法に当分野で周知
の事項を応用することによって、水痘予防のために抗V
ZV免疫応答を追加刺激するワクチンを調製することが
可能である。
明する。本発明の範囲がこれらの実施例に限定されない
ことは理解されよう。
イまたは液体オーバーレイ手順(J.Virol.Met
hods、1990、27:319〜326)を用いて
水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)調製物の感染力価を評
価した。以下の手順でアッセイを実施した。
(ハンクスの平衡塩類溶液と混合したイーグルの基礎培
地)中に6×105細胞の濃度のMRC−5細胞を、1
00mg/リットルのガラクトース、50μg/mlの
ネオマイシン、2mMのL−グルタミンと共に播種し、
5%CO2雰囲気中で35℃でインキュベートした。2
4〜48時間のインキュベーション後、細胞が50〜8
0%集密化した。増殖培地を吸引によって除去し、SP
GAバッファまたは液体維持培地(LMM)のような適
当なウイルス希釈剤に希釈した100μlのVZV溶液
で細胞を感染させた。SPGAバッファは7.5%(w
/v)ショ糖と11mMのリン酸カリウムと0.1%
(w/v)のグルタミン酸ナトリウムと1%のヒト血清
アルブミンとを含有する。ウイルスを5%CO2雰囲気
中で35℃で1時間以上付着させる。次に、VZV感染
細胞培養物に5mlのアガロースオーバーレイ培地(A
OM)または液体維持培地(LMM)をオーバーレイす
る。アガロースオーバーレイ培地は2つの溶液、即ち液
体オーバーレイ培地(LOM)とアガロース溶液との混
合物である。LOMはアールの塩(MEM)、2%熱失
活ウシ胎仔血清、50μg/ml硫酸ネオマイシン及び
2mMのL−グルタミンと共に最少必須培地を含む。
4.5gの低ゲル化温度のアガロースを100mlのM
EM中で121℃で15分間加熱し、溶液を45℃に冷
却することによってアガロース溶液を調製する。1容の
アガロース溶液を4容の1.25×LOM濃縮物と共に
45℃で混合することによってAOMを調製する。プレ
ートを23〜25℃に冷却してAOMを凝固させる。培
養物をインキュベートしてプラークを増殖させる。6〜
7日後に、LOMを与えたプレートに5mlのリン酸塩
緩衝生理食塩水(PBS)をオーバーレイし、アガロー
スをばらばらにして除去するためにガラスパスツールピ
ペットで刻みをつける。LMMを与えたプレートから培
地を吸引し、エタノール−1%酢酸中の0.2%(w/
v)クーマシーブルーR−250の溶液で細胞を染色す
ることによってプレートを可視化する。4〜5個の重複
プレートの平均から得られたプレートカウント数を、m
lあたりのプラーク形成単位(PFU/ml)として示
す。
ため、最適でない条件下の同様のアッセイと比較してV
ZV収量の増加を調べる。
ならし(均平化し)、10%ウシ胎仔血清(FCS)の
存在下のアール塩を補充したイーグルの基礎培地(EB
ME)中で3日間増殖させた。約12×106細胞/1
50cm2の亜集密的細胞密度に達すると、2%FCS
または10%FCSを補充した新しいEBMEを細胞に
リフィードした。このときに、VZV感染(MOI=
1:125)を伴う場合と伴わない場合で亜集密的細胞
を更に増殖させ、48時間後の細胞密度及びウイルス収
量の増加をモニターした。2%FCS中の非感染細胞は
33%の密度増加しか示さなかったが、10%FCS中
では92%の増加を示した。感染培養物中の細胞の数は
増加していなかった。表1に示すように、亜集密的細胞
からのウイルス収量は、FCS補充量が最小(2%FC
S)であるかまたは最大(10%FCS)であるかにか
かわりなく培養物中の細胞複製能力(capacity
for cell replication)によっ
て影響を受けていなかった。
日間、150cm2のフラスコあたり約20×106細胞
(集密化)まで増殖させ、次いで、2%FCSまたは1
0%FCSを補充した新しいEBMEをリフィードし、
VZVを感染させるか(MOI1:125)または非感
染で維持した。48時間後に細胞密度の増加とウイルス
収量とをモニターした。2%FCS中の非感染細胞は密
度増加を示さなかったが10%FCS中の細胞は約15
%増加することが知見された。従って、どちらの条件で
も細胞複製を大して増加させることはできなかった。2
%FCSまたは10%FCS中のウイルス収量は同様で
あり、双方は亜集密的感染細胞からの収量の約3倍に増
加していた(表1)。従って、無細胞VZVの最適収量
を得るためには、能動的に複製する亜集密的細胞単層を
使用するよりも新しい集密的細胞単層を使用するのが好
ましい。
けるVZV収量の比較 約26,500細胞/cm2の濃度のMRC−5細胞を回
転培養瓶(850cm2)に播種した。全部の細胞を1
0%(v/v)のウシ胎仔血清(FCS10)を含むEB
ME培地中で5%CO2雰囲気下に35℃で増殖させ
た。VZV感染時間に基づいて培養瓶を2グループに分
割し、グループIの細胞は5日間増殖させると集密的細
胞単層に達した。ここで培地を除去し、1:125のM
OIで細胞会合VZVを細胞に感染させ、EMEM+2
%FCSに浮遊させた。追加の培地を添加し、細胞を更
に48時間インキュベートした。グループIIの細胞は
更に48時間維持した後でMOI=1:125で感染さ
せた。
産生を以下のごとく定量した。培地を回転培養瓶から除
去し、細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、等容の
安定剤中でガラスビーズで掻取り、4℃に冷却した。低
温の細胞浮遊液を音波処理によって破壊した。細胞破片
を低速遠心(325×gで10分間)によってウイルス
から除去し、ウイルス上清を保存した。VZV産生をプ
ラークアッセイによって測定した。表2に示すように、
新しい集密的細胞単層にVZVを感染させたとき、収量
が約2倍に増加した。
E、10%のFCS、50μg/mlのネオマイシン及
び2mMのL−グルタミンに、MRC−5細胞(10×
106細胞)を播種し、35℃で3日間インキュベート
した。300mlの新しい培地を添加し、培養物を35
℃で更に4日間インキュベートした。次に培地を除去
し、2%の熱失活FCS、50μg/mlのネオマイシ
ン及び2mMのL−グルタミンを含む125mlまたは
425mlのEMEMに交換した。VZV感染MRC−
5細胞を添加し(MOI約1:125)、培養物に5%
CO2ガスを与えながら35℃で46時間インキュベー
トした。培地を除去し、細胞を100mlのPBSで4
回洗浄し、ガラスビーズを用いて掻取り、43mlの安
定剤に導入した。細胞を−70℃で凍結した。無細胞ウ
イルスを音波処理によって調製した。(遠心分離によっ
て)清澄化した音波処理物中の感染性ウイルスの量をV
ZVプラークアッセイによって測定した。
からの感染性VZVの収量が約2倍になる。
果 回転培養瓶にMRC−5細胞を播種し集密まで増殖させ
た。増殖培地を除去し細胞に種々のMOIでVZVを感
染させた。感染細胞培養物によるVZVの産生を、定期
的な採取及び実施例1と同様のプラークアッセイによっ
て定量した。表3及び図5に示すように、使用したMO
Iの値が高いほど感染性の無細胞VZVの回収率が増加
し、インキュベーション期間が短縮された。また、MO
Iの値が高いほどピーク抗原レベルも早期に得られた。
MOIが1:625のような極めて低い値のとき、抗原
産生は遅くなり、最適レベルには到達しなかった。
衝生理食塩水で洗浄した。次に細胞定着ウイルスを音波
処理によって解放し、細胞破片を遠心分離によって除去
した。無細胞ウイルスの濃度を既知のPFU/ml濃度
に調整し、安定剤中のウイルスのアリコートを凍結乾燥
し、4℃または−20℃で保存した。1箇月毎の間隔で
合計14箇月までサンプルを復元し、残留PFU/ml
力価を定量した。この実験の結果を図3に示す。
たときよりもVZVの安定性がかなり改善されることが
明らかである。
終VZV収量に与える効果 1.細胞移植期:10%のFCS、50μg/mlのネ
オマイシン、2mMのL−グルタミンを含むEBME培
地中で60mmのプレートにMRC−5細胞(5ml)
を120,000細胞/mlの濃度(合計600,000
細胞)で移植し、5%のCO2下に35℃でインキュベ
ートした。
胞が集密化した。48のプレートから移植培地を吸引
し、10%のFCS、50μg/mlのネオマイシン、
2mMのL−グルタミン及び0.2mg/mlの大豆脂
質、1mg/mlのBSAを補充したSRFE−2また
はEBMEから成り、50mMのショ糖添加または非添
加の8mlの増殖培地に交換した。新しい増殖培地の添
加後、細胞を5%のCO2下に35℃で更に3日間イン
キュベートした。
を除去し、EBMEに代えてEMEM、大豆脂質を添加
したSRFE−2に代えてSRFE−2を夫々8ml添
加した。増殖期に比べて全部のプレートでFCSを2%
に減らしたが、その他の補充成分、即ちネオマイシン、
グルタミン及びショ糖は同量にした。次に各プレートに
EMEM、2%のFCS、ネオマイシン、グルタミン中
で1:16に希釈した333μlのVZV感染細胞(4
7,000PFU/ml)を導入した。
製させ、次いで異なる各条件毎に2つのプレートから培
地を取り出した。細胞をPBSで4回洗浄した。細胞を
プレートあたり1.2mlの氷冷安定剤に掻取った。重
複プレートからの採取物を50mlの円錐状遠心管にプ
ールし、−70℃で凍結させた。
条件毎に2つのプレートを取り出して上記と同様の手順
で処理し、各組2プレートの採取物をプールし、−70
℃で保存した。
解凍し、カップ−ホーンソニケータ(cup−horn
sonicator)を用いて氷上でチューブあたり
30秒間音波処理し、1000×gで4℃で10分間遠
心することによって清澄化した。プラークアッセイのた
めに上清のアリコートを採取した。実施例1と同様に行
なったプラークアッセイの結果を図1に示す。
確認される: (1)50mMのショ糖による細胞の前感染インキュベ
ーションはVZVの最終収量に対して極めて有利に作用
する。感染前に細胞をショ糖で処理するとEMEMまた
はSRFE−2のような各培地中でVZV収量が増加し
た。ショ糖に接触させたSRFE−2増殖培地中で感染
72時間後にPFUとして測定したVZV収量はショ糖
非添加の最少培地中のVZV収量の約16倍に増加して
いた。
添加したSRFE−2を用い、ウイルス増殖中にSRF
E−2を用いる)の使用もVZV収量に極めて有利に作
用し、ショ糖効果と併用するとVZVの産生量が1桁増
加する。従って、富化培地はショ糖と相乗的に作用する
と考えられる。
る。最適の培養条件、SRFE−2、ショ糖などを使用
した場合でも、VZVのピーク収量は感染後48時間で
は得られない。この時点の収量は最少培地の4倍になる
だけである。しかしながら感染72時間後にはVZV収
量が約16倍に増加する。
ョ糖を添加したときのVZV収量は、感染72時間前に
添加したときほどには増加しなかった。これは、ショ糖
の細胞内蓄積には長い前感染期が重要であることを示
す。また、25mMまたは100mMのショ糖の添加は
50mMのショ糖の添加ほど有効でないことも知見され
た。ラクトース、セロビオース及びマルトースに関して
も適当な濃度はほぼ同じである。
える効果 種々のプロセスパラメータ(培地の種類、ショ糖の補
充、安定剤に対するNH4Clの添加、細胞からのウイ
ルス遊離のためのダウンス処理または音波処理)の変更
が無細胞VZV PFU収量に与える効果を定量するた
めに回転培養瓶試験を実施した。回転培養瓶あたり80
×103細胞/mlの培養物を含む125mlのEBM
E、10%のFCSを移植した。これらをEBMEで4
25mlに調節するかまたはSRFE+大豆脂質培地を
リフィードし、125ml(低容量)または425ml
(高容量)のEMEMまたはSRFE培地(大豆脂質非
添加)中の作用シードVZVを感染させた。実施例7に
記載した時期にこれらの培地の交換/感染を実施した。
感染前の種々の時期(感染96時間前または24時間前
または感染と同時)にショ糖(suc)を50mMまで
添加した。感染前にショ糖を添加した培養物にはウイル
ス感染培地にもショ糖を添加した。全部の培養物をMO
I約1:15で感染させ、46時間後にEMEM培養物
中のVZV感染細胞を20mMのNH4Cl(N)を含
有するかまたは補充物非含有の感染後安定剤に採取し
た。全部のサンプルを−70℃で凍結させ、次に、音波
処理またはダウンスホモジナイゼーションによって細胞
からウイルスを遊離した。全部のサンプルを1000g
で10分間遠心して清澄化した。
ら以下の結論が得られた。
るとVZV PFUは2倍に増加した。SRFEを使用
するときはこの実験でも別の実験でも「低容量」に近い
培地によって最適PFU収量が得られると考えられる。
いくつかの場合には「高容量」培地で収量が低下する。
4Clは必須ではない。
のPFU収量を2倍に増加させ、SRFE培養物のPF
U収量を5倍に増加させた。ショ糖の添加時期がPFU
に影響を与えると考えられる。ショ糖非添加、並びに、
感染と同時、感染24時間前及び感染96時間前にショ
糖を夫々添加したSRFE+大豆/SRFE培養物のP
FU収量は夫々、94×103、296×103、427
×103及び671×103であった。
有の対応物に比べて細胞変性作用も有意に減少してい
た。別の実験では、ショ糖処理した培養物は感染1週後
に退化性細胞変性作用を示さなかったが、ショ糖非含有
の対照は完全に溶菌していた。従って、ショ糖処理した
細胞はインキュベーション期間の延長に伴って(回転培
養瓶実験から46時間以上後の採取物の)VZV(抗原
特にPFU)蓄積量を増加させることも推定できる。
増殖させるので感染時期に細胞濃度をより高い濃度に調
節しなかった。従って、このパラメータを最適にすると
PFU収量が更に増加することも予想できる。
きる無細胞VZVの収量 多くの異なるVZV産生条件を使用し実施例8に記載の
実験と同様にして大規模実験を実施した。この実験では
細胞破壊手順を新しいパラメータとして分析した。ダウ
ンスホモジナイゼーション単独、音波処理単独及びダウ
ンス処理と音波処理との併用によって得られた無細胞V
ZVの収量を比較した結果を以下に示す。表中のVZV
培養条件は、細胞を最少培地(EBME/EMEM)ま
たは高栄養培地(SRFE−2+大豆脂質/SRFE−
2+50mMのショ糖(前感染期))で増殖させた。実
施例8に記載のごとく細胞を増殖させて採取し、実施例
1に記載のアッセイによってVZV PFU/mlを定
量した。
破壊とを併用するとVZV収量が実質的に増加すること
が明らかである。
るためのSRFE−2培地及び大豆脂質補充物の使用 MRC−5細胞をEBME中の25cm2のT型培養瓶
に接種し、35℃で3日間インキュベートした。培地を
除去し、大豆脂質非添加または1:200に希釈した大
豆脂質を添加した12.5mlの新しいEMEM培地ま
たはSRFE−2培地+10%のFCS、ネオマイシ
ン、グルタミンに交換した。培養物を35℃で更に3日
間インキュベートした。次に培地を除去し、細胞に、V
ZV感染MRC−5細胞と12.5mlの2%ウシ胎仔
血清、ネオマイシン、グルタミンを含むEMEMまたは
SRFE−2とを与えた。培養条件の「SRFE−2」
は、細胞培養中及びウイルス培養中にSRFE−2を与
えたことを示す。条件の「SRFE+大豆」は、サンプ
ルに対して細胞培養中にSRFE−2培地と1:200
に希釈した大豆脂質とを与え、ウイルス培養中にSRF
E−2培地だけを与えたことを示す。培養48時間後に
培地を除去し、細胞を5mlのPBSで4回洗浄し、
1.2mlの安定剤中に掻取った。重複フラスコのサン
プルをプールし−70℃で凍結させた。後に解凍後、細
胞を音波処理によって破壊し、遠心(1000gで10
分間)によって清澄化し、以後のウイルス感染力価アッ
セイに備えて上清を−70℃で凍結させた。結果を図4
に示す。
地を使用すると、生きた水痘ウイルスの回収率が2.5
倍に増加する。細胞培養中に大豆補充SRFE−2を使
用するとウイルス回収率が更に2.7倍増加し、これは
EMEMウイルス増殖プロセスで得られた値の正味7倍
である。
セスコントロールは特に難しい。高速VZV抗原ELI
SAによれば、水痘生ワクチンの製造中のウイルス増殖
をモニターするためのVZV抗原量の測定が可能であ
る。更に、この試験は、清澄化し音波処理したワクチン
バルク中のVZV抗原量を算定するために使用でき、ま
た凍結乾燥ワクチン充填バイアル中の抗原を測定するこ
とも可能であろう。簡単に説明すると、このアッセイで
は、試験サンプルからのVZV抗原を抗VZV血清と共
に溶液中でインキュベートする。残留する遊離抗体はE
LISAマイクロタイタープレートに固定されたVZV
抗原に結合する。プレートに結合し得る抗体の量は試験
サンプル中の抗原の量に反比例する。プレートに結合す
る抗体を酵素リンクした抗ヒト抗体及び分光光度法で定
量できる発色物質を生じる適当な基質との反応によって
定量する。
ッセイとは概して相関するデータを与えるであろうが、
VZV抗原アッセイが非生存VZV及び生存VZVの双
方を検出することに留意する必要がある。死VZVによ
って生じた免疫応答は、弱毒した生存ウイルスに対する
応答ほど有効であるとされておらず、VZVワクチンの
ウイルス接種量を決定するためにはプラークアッセイが
必須である。しかしながら、抗原アッセイはVZVワク
チンレシピエントに投与される総抗原負荷の測定値を与
えるという点でやはり有効なアッセイである。
の糖タンパク質(gps)をELISAプレートにコー
トし、プレートに対する抗体の非特異的吸着を減少させ
るために1%のウシ血清アルブミン(分画V、#A−9
647、Sigma、0.1%NaN3)をオーバーコー
トする。1列おきにVZVまたは対照抗原をコートする
(即ち列A、C、E及びGにVZV gpをコートし、
列B、D、F及びHに非感染MRC−5 gp抗原をコ
ートする)。
抗原を12×75mmのチューブまたはマイクロチュー
ブに入れた安定剤に希釈する。標準ウイルス抗原調製物
(ドットブロットアッセイによる26単位/mlのVZ
V抗原)を1:10に希釈し、次いで1:1.25倍に
系列希釈して抗原濃度2.6、2.1、1.7、1.3、
1.1、0.9単位/mlを与える。更に希釈して0.7
及び0.5単位/mlの抗原濃度を与えてもよい。この
希釈系列を使用して、試験サンプル中の抗原量を測定す
るための標準曲線を作成する。
度の2倍まで安定剤に希釈する。
ューブに分注し、300μlの希釈抗VZV血清と混合
し、35℃で15〜22分間インキュベートする。対照
はヒト抗VZV及び希釈剤(抗原非含有)を含む。
のアリコートを、VZV糖タンパク質(VZV gp)
をコートした2つの重複ウェル及びMRC−5 gpを
コートした2つのウェル(サンプルあたり4ウェル)に
添加する。(例えば、コラム1、列A、B、C及びDに
サンプル1を添加し、コラム2の列A、B、C及びDに
サンプル2を添加する、など)。
い)遊離抗体がプレートに固定されたウイルス抗原に結
合するようにプレートを35℃で15±1分間インキュ
ベートする。
結合したヒト抗体を検出するためにアルカリホスファタ
ーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgGをウェルに
導入する。
ーション後、未結合コンジュゲートを洗浄によって除去
する。ジエタノールアミンバッファに溶解したp−ニト
ロフェニルリン酸塩基質と共に35℃で15分間インキ
ュベーションすることによって結合コンジュゲートを検
出する。
の量で添加して基質反応を終了させた後、マイクロプレ
ート分光光度計によって発色(405nmのOD)を定
量する。
重複OD値を夫々平均する。実験は、種々のサンプル及
び希釈度でMRC−5のODが一致していることを示し
た。従って、全プレートのMRC−5値を平均し、これ
を使用して非感染細胞抽出物に対する第1抗体またはコ
ンジュゲートの非特異的結合を補正する。MRC−5
ODの平均をVZV ODの平均から夫々減算するとV
ZV特異的OD(ΔOD)値が得られる。
作成:既知の抗原濃度(VZV単位/ml)に対する標
準曲線ΔOD値をプロットする。
(例えばCricketグラフバージョン1.3、Cr
icket Software、Malvern、P
A)、グラフの直線部分を識別し(少なくとも4つの点
を含まなければならない)、「直線近似式」(y=a+
bx)を得る。
a及びbの値を直線近似式によって与え、y(ΔOD)
は既知数である。残りの未知数、即ち抗原量を単位/m
lで示すxの値を計算し、サンプル希釈度によって補正
して非希釈サンプルの抗原濃度を得る。次にサンプル全
体の計算を行なう。
OD値を与える最小希釈サンプルで得られた濃度であ
る。
胞VZVのサンプルを、実施例11に記載したVZV抗
原ELISAに従って検定した。このアッセイの結果を
図2に示す。
する96時間後にもVZV抗原が増加を続けることが観
察される。また、SRFE−2と大豆とショ糖とを加え
た培地中のVZV抗原のレベルがEMEM培地中の該抗
原のレベルのほぼ16倍になることはないが(図2)、
無細胞の生存VZVのPFU/mlは16倍になる(図
1)。この比較から、感染72時間後に生存VZVを維
持するためにはショ糖効果が極めて重要であると考えら
れる。
5細胞増殖の増進 25cm2のT型培養瓶に、12.5mlのEBME、1
0%のFCS、50μg/mlのネオマイシン、及び2
mMのL−グルタミン中のMRC−5細胞を53,00
0細胞/mlの濃度で接種し、35℃でインキュベート
した。2〜3日後、培地を除去し、10%のFCS、5
0μg/mlのネオマイシン、2mMのL−グルタミン
及び種々の量の大豆脂質を含有する12.5mlの新し
いSRFE−2培地に交換した(シフト2)。非希釈の
大豆脂質は20mg/mlの脂質と100mg/mlの
ウシ血清アルブミンとを含有していた。
々の量の大豆脂質を補充した2%FCS、50μ/ml
のネオマイシン、2mMのL−グルタミンを含む12.
5mlのEMEMまたはSRFE−2培地中に交換し
た。トリプシン処理によって選択培養瓶から細胞を解離
させ、血球計によって細胞をカウントした。35℃で更
に2日間培養した後で残留培養物の細胞カウント数を定
量した。結果を表5にまとめる。
0%FCSを補充した指示培地に交換した。
CSを補充した指示培地に交換した。
ときの細胞数はEMEM単独使用のときに比べて約2倍
に増加した。培地に大豆脂質を補充することによって細
胞収量は量依存的に更に増加した。SRFE−2培地と
約200〜400μg/mlの脂質の併用によって最大
の細胞収量が得られた。
E、10%のFCS、50mg/mlのネオマイシン、
2mMのL−グルタミン中に53,000細胞/mlの
濃度でWI−38細胞を接種し、35℃でインキュベー
トした。2日後、培地を除去し、50mg/mlのネオ
マイシンと2mMのL−グルタミンと1:200に希釈
した大豆脂質とを補充した12.5mlのSRFE−2
培地に交換した。対照には脂質補充物を含まない培地を
導入した。35℃で5日間培養した後、培地を除去し、
トリプシン処理によって細胞を培養瓶から解離させ、血
球計でカウントした。残りの培養瓶を更に3日間維持し
た後で細胞をカウントした。結果を以下にまとめる:
I−38細胞の収量は約2倍に増加した。従ってVZV
の産生にこの細胞系を使用するとMRC−5細胞を使用
した場合と同様の結果が得られると予想される。
イーグルの基礎培地(EBME)、10%のFCS、5
0μg/mlの硫酸ネオマイシン(neo)及び2mM
のグルタミン(Gln)中に約53,000細胞/ml
の濃度でMRC−5細胞を移植する。培養物を35℃で
3日間インキュベートする。このときまでに、細胞単層
は典型的に約50〜75%集密である。培地を除去し、
10%FCS、50μg/mlのneo及び2mMのG
ln±大豆またはその他の脂質を含む10〜12.5m
lのSRFE−2培地に交換し、培養物を35℃でイン
キュベートする。細胞をトリプシン処理(2.5mlの
0.25%クエン酸トリプシン溶液)し、血球計でカウ
ントすることによって種々の時点の細胞カウント数を定
量する。0.2%トリパンブルーの細胞排除によって細
胞の生存率をモニターする。細胞カウント数を使用し
て、細胞濃度を推定し、次いで細胞浮遊液の総量に対し
て補正し、培養瓶あたりの細胞収量を得る。いくつかの
実験では、培養物を培地交換の3〜4日後に2%FCS
培地にシフトし、更に2日間のインキュベーション後に
細胞カウント数を定量する。
ィードし(第1リフィード)、更に3日間の増殖後に細
胞カウント数を定量した。脂質を加えるかまたは加えず
してリフィードすることによって(第2リフィード)T
25培養瓶の増殖を更に継続し、更に2日間増殖させ
た。細胞をトリプシンで回収した。EBMEに移植しE
MEMで増殖させた細胞の収量は2.6×106であった
が、SRFE−2と1:100に希釈した大豆脂質とを
混用した培地で増殖させた細胞の収量は6.6×106及
び7.7×106に達した。更に2日間増殖させた細胞
は、EBME/EMEM増殖細胞の場合は収量2.76
×106であったが、大豆脂質補充物非添加のEBME
/SRFE−2の場合はT25培養瓶あたりの収量が
9.2×106及び7.88×106であった。EBME
/SRFE−2+1:100大豆脂質で増殖した細胞の
収量はわずかに2.48及び2.28×106であった。
このデータは、高脂質濃度に長期接触させると(第2リ
フィード後約5日間)、以後の細胞収量が減少するこ
と、その理由は細胞死に起因すると推定されることを示
す。従って一般には、脂質補給物非添加の富化培地を細
胞にリフィードする。脂質はウイルス増殖またはウイル
ス急襲の存在下の細胞生存の継続に対して有毒になるか
もしれないので、このような脂質非添加富化培地に切換
える手順は、ウイルス増殖期を開始させるときに特に重
要である。
度の効果 MRC−5細胞の培養に関する実施例16の記載と本質
的に同じ手順及びリフィード/細胞定量スケジュールに
従って、以下の細胞収量が得られた(注:培地記述後の
+及び−符号は第2のリフィード培地中の指定量の大豆
脂質(sl.)mg/mlの補給の有無を示す):
する細胞の長期接触が極めて有利ではないという実施例
16で得られた観察とほぼ符合するが、このデータでは
実施例16で観察された顕著な毒作用が減少している。
より低濃度の脂質に対する細胞のより長期間の接触は、
より低毒性であり、増殖表面1cm2あたりの細胞収量
が増加するという利点が得られる。
のウシ胎仔血清の添加を試験した。MRC−5細胞をE
BMEに移植し、3日後に種々の量の大豆脂質を補充し
たSRFE−2をリフィードし、2日後に第1リフィー
ドで与えた濃度と同じ濃度の脂質を含むSRFE−2を
リフィードした。10%FCS中の細胞収量は、0.
1、0.2及び0.4mg/mlの脂質を夫々補充した培
養物について夫々9.5、11.3、12.2×106であ
った。2%FCSを与えたとき、細胞収量は夫々、6.
5、8.8及び3.2×106であった。この実験は、F
CS補充は脂質補充と同様に細胞増殖に有利な効果を与
えることを示す。高脂質濃度が細胞に与える有毒作用は
十分なFCSの補充によって常に弱化される。
た。3日目に、10%FCSを含有し種々の脂質を補充
したSRFE−2培地を細胞にリフィードした。Boe
hringer Mannheim大豆脂質、成ウシ血
清に由来のSigmaコレステロール富化脂質またはM
iles/Pentex EX−CYTEIまたはVe
ry Low Endotoxinウシリポプロテイン
を指定濃度で使用した。リフィードのときの細胞カウン
ト数は1.19×106であった。5日後、細胞をカウン
トした。EMEM中の細胞カウント数は2.97×106
であった。SRFE−2またはSRFE−2+0.4m
g/ml、0.2mg/ml及び0.1mg/mlの大豆
脂質中の細胞カウント数は夫々、4.83、10.44、
8.67及び8.04×106であった。1:50、1:
100、1:200のEX−CYTE Iは夫々、5.
37、4.80及び4.74×106の細胞を生じた。
1:25、1:50、1:100のEX−CYTE V
LEは夫々、5.49、7.23及び7.92×106の細
胞を生じた。1:25、1:50、1:100のSig
ma高コレステロール脂質は夫々、6.87、7.56及
び7.65×106の細胞を生じた。Boehringe
r Mannheim大豆脂質は最大の細胞収量増進を
示したが、EX−CYTE VLE及びSigma脂質
もほぼ同様に有効であった。従って増進効果は大豆脂質
に固有ではない。
瓶に播種し、3日目及び6日目にリフィードした。6日
目のフラスコあたりの細胞収量は、EBME/EME
M、SRFE−2+1/100大豆脂質またはSRFE
−2+1/50大豆脂質培養物で夫々、4.3×106、
9.7×106及び11.7×106であった。細胞生存率
は(トリパンブルー排除から判断すると)、すべての培
養物で>99%であった。細胞に培地±大豆脂質をリフ
ィードし、更に2日間インキュベートし、細胞収量を定
量した。これらの培養物についてフラスコあたりの細胞
回収量は重複EBME/EMEM培養物では2.9及び
3.5×106、同じ培地にSRFE−2+1/50大豆
脂質をリフィードした場合には11.65×106、SR
FE−2+1/50大豆脂質培養物に大豆脂質非添加の
SRFE−2培地をリフィードした場合(重複)には1
3.69及び11.09×106、SRFE−2+1/1
00大豆脂質に同じ培地をリフィードした場合には9.
66×106、脂質非添加のSRFE−2をリフィード
した場合には重複培養物で8.51及び6.27×106
が得られた。
豆脂質の増量に伴って増加することは明らかである。最
大細胞収量は希釈度1/50の大豆脂質(試験最大濃
度)で得られた。第2のリフィード培地に脂質を添加す
ると細胞収量はある程度増加した。しかしながら、デー
タは、第1リフィード培地に1/50の脂質を使用した
ときに最大細胞収量が得られることを示す。従って脂質
補充物を第2リフィード培地から除去し得る。高濃度脂
質はウイルス産生に不利なのでウイルス増殖中には脂質
を除去するのが望ましい。
を示すグラフである。
のVZVの安定性を示すグラフである。
収量を示す。
にあたえた効果を示すグラフである。
Claims (5)
- 【請求項1】 水痘帯状庖疹ウイルス(VZV)の生ワ
クチンの製造方法であって、 (a) ヒト二倍体細胞から選択されたVZV感染感受
性細胞を、高度の細胞複製を達成するに十分な高栄養の
条件下で、集密的単層培養物となるまで培養し、非代謝
性二糖を供給するステップと、 (b) ステップ(a)で培養した細胞の集密時点にで
きるだけ近い時期にVZV感染細胞を実用上可能な限り
高い感染多重度で感染させるステップと、 (c) VZV感染培養物を高栄養状態に22ないし9
6時間維持して感染性VZV産生物が最大となったもの
を採取するステップと、 (d) VZV感染細胞を採取する前に、塩化アンモニ
ウムまたはクロロキンのようなリソソーム向性物質を任
意に含有する生理的溶液でVZV感染培養物を洗浄する
ステップと、 (e) VZV感染細胞を最小量の安定化溶液に採取
し、直ちに細胞を破壊するかまたは後で破壊するために
細胞を凍結するステップと、 (f) VZV感染細胞を細胞会合VZVが最適に解放
されるまで破壊し、細胞性破片を除去して無細胞VZV
調製物を提供するステップとから成る方法。 - 【請求項2】 (a) 1.細胞移植期と、 2.実用的な限り多量の最少培地またはより少量の高栄
養培地を用いる細胞増殖期と、 3.細胞を無毒性非代謝性二糖に接触させる前感染期と
から成る培養ステップとから成るVZV感染感受性細胞
を集密状態まで培養する培養ステップと、 (b) ステップ(a)で培養した細胞の集密時点にで
きるだけ近い時期に弱毒VZV感染細胞を実用的な限り
高い感染多重度で感染させるステップと、 (c) VZV感染培養物を多量の最少培地またはより
少量の富化培地にVZV産生ピーク点まで22ないし9
6時間維持するステップと、 (d) 採取に先立ってVZV感染培養物を、リソソー
ム向性物質を任意に含有する生理的溶液で洗浄するステ
ップと、 (e) 1.液体を除去し、 2.最小量の安定剤溶液を添加し、 3.VZV感染細胞を掻取るかまたは化学的に解放し、 4.任意に、解放したVZV感染細胞を−65℃以下で
凍結することによってVZV感染細胞を採取するステッ
プと、 (f) 細胞定着VZVを最適に放出させるために解放
されたVZV感染細胞を破壊し、細胞性破片を除去し、
任意に無細胞VZVを凍結乾燥するかまたは液体凍結形
態で保存するステップとを含むことを特徴とする水痘帯
状庖疹ウイルスの弱毒無細胞生ワクチンの製造方法。 - 【請求項3】 VZV感染感受性細胞がMRC−5細胞
であり、弱毒VZVが水痘帯状庖疹ウイルスのOka株
であり、培養温度が30ないし37℃であり、二糖が2
0ないし60mMで供給されるショ糖であり、培養温度
が34.5ないし35.5℃であり、MOIが1:25
ないし1:625であり、リソソーム向性物質が、20
ないし50mMで与えられる塩化アンモニウムまたはお
およそ230μMで与えられるクロロキンであることを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 高栄養培地が0.02ないし0.4mg
/mlの大豆脂質を任意に補充したSRFE−2であ
り、ウイルスが音波処理またはダウンスホモジナイゼー
ションまたはその双方によって細胞から遊離されること
を特徴とする請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 (a) 1.EBME中の細胞移植期
と、 2.細胞移植の約3日後に開始される0.15ないし
0.25mg/mlの大豆脂質を補充したSRFE−2
中の細胞増殖期と、 3.MRC−5細胞を20〜50mMのショ糖に24な
いし96時間接触させる前感染期とから成るMRC−5
細胞を集密状態まで培養するステップと、 (b) ステップ(a)で培養した細胞に、集密時点に
できるだけ近い時期に弱毒VZV感染MRC−5細胞を
実用的な限り高い感染多重度で感染させるステップと、 (c) VZV感染培養物を37ないし96時間維持
し、VZV産生物が最大となったものを採取するステッ
プと、 (d) 1ないし100mMのNH4Clまたはクロロ
キンを任意に補充したリン酸塩緩衝生理食塩水で培養物
を洗浄するステップと、 (e) 1.液体を除去し、 2.1ないし100mMのNH4Clまたはおおよそ2
30μMのクロロキンを任意に含有する最小量の安定化
剤を添加し、 3.細胞を掻取るかまたは細胞を化学的に解放し、 4.解放したVZV感染細胞を−65℃以下で任意に凍
結することによってVZV感染MRC−5細胞を採取
し、 (f) 1.ダウンスホモジナイゼーション、2.破片
のペレット化及び上清の保存、3.ペレットの音波処理
及び再ペレット化、4.ステップ(f)−2及び(f)
−3で得られた上清の混合によって解放されたVZV感
染細胞を破壊するステップと、 (g) ステップ(f)の産生物を安定剤に希釈し、後
で使用するときに用量あたり1000PFU以上が得ら
れるような凍結乾燥及び4℃以下保存用の単位用量で産
生物を充填するステップから成る無細胞水痘帯状庖疹ウ
イルスの弱毒生ワクチンの製造方法。
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