JP2599552B2 - 水痘帯状疱疹ウイルスの弱毒ワクチンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ、
ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）は水
痘及び帯状疱疹（帯状ヘルペス）の原因ウイルスであ
る。水痘はＶＺＶ免疫のない人体で発症する極めて伝染
性の疾患である。９０％以上の人間は２０歳までにこの
ウイルスに感染する。免疫抑制された個体及び成人がこ
の疾患に罹った場合には重態に陥り易い。多くの場合、
ＶＺＶは背根神経節細胞中に潜伏する。ＶＺＶが潜伏状
態から再活性化されたとき、疼痛を伴う慢性疾患である
帯状ヘルペスが発症する。

【０００２】

【従来の技術】究極的にはワクチン接種によって水痘を
予防できるのが望ましく、水痘の弱毒生ワクチンの接種
を全児童に義務付ける制度も計画されている。種々の細
胞培養系においてＶＺＶを増殖させ、弱毒した無細胞の
生存ＶＺＶをワクチンとして使用することは従来技術で
報告されている。米国特許第３,９８５,６１５号は、ワ
クチン用として適当なＶＺＶの弱毒Ｏｋａ株をモルモッ
トの一次胚細胞中で産生させることを記載している。米
国特許第４,００８,３１７号は、ＶＺＶの温度感受性突
然変異体をワクチン安定剤として適当なＷＩ−３８細胞
中で培養することを記載している。生存ＶＺＶの維持に
有用なＳＰＧＡのような組成物も当分野で公知である。

【０００３】ＶＺＶワクチンの商業的製造に対する主な
制約は、当業界で公知の細胞培養系から得られる無細胞
ＶＺＶの収量である。本発明の新規な方法を使用するこ
とによって無細胞ＶＺＶの収量を約５〜２０倍増加させ
得る。

【０００４】従って、本発明は、弱毒した無細胞の生Ｖ
ＺＶワクチンを高収量で製造する方法を提供する。

【０００５】当業界で公知の単層細胞培養方法で得られ
る典型的な収量は約８０,０００〜１６０,０００細胞／
ｃｍ²である（Ｍａｎｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎ
ｄ．、３７、１４９〜１５２（１９７７）；Ｗｏｏｄ
＆ Ｍｉｎｏｒ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ １８、１４
３〜１４６（１９９０））。ウイルス抗原を産生させる
ための単層細胞培養を使用する場合、その欠点は単層培
養物の増殖密度が小さいことである。

【０００６】細胞培養密度の増加を目的としたこれまで
の研究では、飽和密度を約１×１０⁶細胞／ｃｍ²に増加
させようとすると専用灌流型培養容器に依存せざるを得
なかった（Ｍａｎｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎ
ｄ．、３７、１４９〜１５２（１９７７））。本発明
は、既存の細胞培養系を使用しながら細胞収量を増加さ
せる独特の手段を提供する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、付着細胞を
従来可能であったよりもはるかに高い密度に増殖させ、
従って細胞単層に培養されたワクチン産生用ウイルスの
収量を向上させ得る方法を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、新規な単層細
胞培養方法及び該方法で使用するための新規な組成物に
関する。本発明方法によれば、最少培地ではなく富化培
地の使用が必要であり、富化培地に最適濃度の脂質を補
充することも必要である。本発明方法は、約０.０２〜
０.４ｍｇ／ｍｌの大豆脂質を補充したＳＲＦＥ−２培
地から成る新規な増殖培地を使用することによって単層
細胞培養密度のかなりの増加を達成し得る。このように
して達成された単層細胞密度の増加は抗ウイルスワクチ
ン製造用ウイルス抗原の産生増進に有用である。

【０００９】特定ワクチンの製造に使用した場合、本発
明は水痘の予防に有用な無細胞の弱毒生ＶＺＶワクチン
を大量に製造する方法を提供する。この方法では、細胞
培養によってＶＺＶを最適に増殖させ、ＶＺＶの収量及
び安定性が最大になる条件下でウイルスを採取する。最
適化された方法は、（ａ） ヒト二倍体細胞から選択さ
れたＶＺＶ感染感受性細胞を、高度の細胞複製を達成す
るに十分な高栄養の条件下で、集密的単層培養物となる
まで培養し、非代謝性二糖を供給するステップと、
（ｂ） ステップ（ａ）で培養した細胞の集密時点にで
きるだけ近い時期にＶＺＶ感染細胞を実用上可能な限り
高い感染多重度で感染させるステップと、（ｃ） ＶＺ
Ｖ感染培養物を高栄養状態に約２２〜９６時間維持して
感染性ＶＺＶ産生物が最大となったものを採取するステ
ップと、（ｄ） ＶＺＶ感染細胞を採取する前に、塩化
アンモニウムまたはクロロキンのようなリソソーム向性
物質を任意に含有する生理的溶液でＶＺＶ感染培養物を
洗浄するステップと、（ｅ） ＶＺＶ感染細胞を最小量
の安定化溶液に採取し、直ちに細胞を破壊するかまたは
後で破壊するために細胞を凍結するステップと、（ｆ）
ＶＺＶ感染細胞を細胞連合ＶＺＶが最適に解放される
まで破壊し、細胞性破片を除去して無細胞ＶＺＶ調製物
を提供するステップとを含む。

【００１０】本発明は単層培養による細胞増殖方法に関
する。本発明の目的は、付着培養細胞の細胞密度の増加
を達成することである。この目的は、最適化濃度の脂質
を補充した富化増殖培地を与えることによって達成され
る。本発明の新規な培地−脂質組成物中で本発明に従っ
て単層培養物を増殖させると、ウイルスプラーク形成単
位（ＰＦＵ）即ちウイルス抗原の産生収量をかなり増加
させることが可能である。従って、Ａ型肝炎ウイルス、
水痘帯状疱疹ウイルス、風疹、ロタウイルス、麻疹、ポ
リオ、おたふくかぜ及びその他のウイルスワクチンの製
造に、本発明の細胞培養方法を有利に使用し得る。

【００１１】本方法で使用するための好ましい富化培地
はＳＲＦＥ−２（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｓ２１３８またはＳｅ
ｒｖａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｅｉｌｄｅｌ
ｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ４７５２３から市販）。この
培地はＷｅｉｓｓら（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １６（７）、
６１６〜６２８（１９８０））によって記載されてい
る。同様に使用できるその他のＳＲＦＥ−２等価培地ま
たは組成の多少異なる培地も勿論本発明の範囲に包含さ
れる。

【００１２】多くの公知の脂質補充物のいずれかを本発
明方法に有利に使用し得る。例えば、成ウシ血清に由来
のコレステロール富化脂質（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏ．、ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｌ−４６４６）、Ｅ
Ｘ−ＣＹＴＥ Ｉ脂質またはＶｅｒｙ Ｌｏｗ Ｅｎｄ
ｏｔｏｘｉｎ（ＶＬＥ）脂質（ＭＩＬＥＳ Ｉｎｃ．、
ｃａｔａｌｏｇ ＃ ８２−００４−７〜８及び８２−
０１９−１）が富化培地補充物として有効であることが
知見された。好ましい脂質添加物は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮからｃａｔａｌｏｇ
＃１０７４ ４８２として入手できる市販の大豆脂質抽
出物である。この材料または同様の材料は、Ｉｓｃｏｖ
ｅ及びＭｅｌｃｈｅｒｓ（Ｊ．ａｌ．Ｅｘ．Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ、１４７、９２３〜９３３、１９７９）にＢ−リ
ンパ球培養物中の血清置換物として記載されている。こ
の文献にも、またＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍの使用説明書にも、大豆脂質補充物が富化培地の補
充に有用であることは示唆されていない。これらの文献
における脂質の使用目的は最少培地中の血清置換物とし
て使用することである。本発明における脂質の使用目的
は富化培地の補充物として使用することである。更に、
公知の文献では、脂質の使用濃度は約１０〜１００μｇ
／ｍｌである。本発明では、脂質の最適使用濃度は文献
または製造業者によって示唆された濃度の２〜３倍であ
る。更に、本発明では、脂質補充物を血清補充物に代替
するのでなく血清に補充物として添加する。

【００１３】本発明方法においては、ＭＲＣ−５細胞、
ＷＩ−３８細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはウイルス増殖に有
用な別種の細胞を培養容器に播種する。最初の細胞移植
期は、ＥＭＥＭまたはＥＢＭＥのような当分野で公知の
最少培地中または脂質補充物非添加のＳＲＦＥ−２培地
のような富化培地中で行なう。また、約１０％ウシ胎仔
血清（ＦＣＳ）、ネオマイシンのような抗生物質（約５
０μｇ／ｍｌが適量）及びＬ−グルタミン（約２ｍＭ）
の使用も有利であろう。製造すべきウイルスの種類に従
って細胞及びウイルスの許容温度、通常は約３４〜３７
℃、好ましくは約３５℃で細胞を数日間増殖させる。

【００１４】細胞がはっきりと付着し単層培養物として
増殖した後で、最少培地または富化培地を除去し、最適
濃度の脂質を補充した新しい富化培地に交換する。

【００１５】再度の増殖期間後、培地を再度除去し、脂
質補充物非添加の新しい富化培地に交換する。細胞がほ
ぼ集密または集密に達した後まで脂質を与えると産生妨
害性になり細胞の最大収量を低下させることが知見され
た。

【００１６】培養した単層細胞にウイルス接種物を感染
させる必要がある場合、脂質補充物を除去し、富化培地
の新しいバッチにウイルス原液を導入する。この交換培
地に脂質が存在しないとき、上記のような脂質誘発性の
細胞減少の問題を生じることなく細胞増殖期間を延長し
得る。

【００１７】上記方法によれば、細胞及びウイルスのか
なりの収量増加が達成される。従って、ＭＲＣ−５細胞
で増殖させた水痘ウイルスの場合、ＭＲＣ−５細胞を最
少培地またはＳＲＦＥ−２培地単独で増殖させた場合に
比較してＶＺＶ ＰＦＵ収量のかなりの増加が達成され
る。また、水痘ウイルスの増殖または風疹ウイルスの産
生に有用なＷＩ−３８細胞も、本発明の新規な方法によ
って培養されると増殖密度がかなり増加する。

【００１８】特定ワクチンの製造に使用された場合、本
発明の新規な方法では、細胞培養によってＶＺＶを増殖
させ、得られたＶＺＶをウイルスの収量及び安定性を最
適化する条件下で採取する。ＶＺＶ以外のヘルペスウイ
ルス、麻疹、おたふくかぜまたは風疹のようなその他の
エンベロープ付きウイルスの産生においてもＶＺＶの産
生の場合と同様の利点が得られるであろう。

【００１９】本発明の究極の目的は、ワクチンとして使
用するためのＶＺＶを有効に産生し得る方法を提供する
ことである。方法の各ステップを最適化したときに最終
的に達成された無細胞ＶＺＶの収量に基づいて方法の成
否を判断し得る。無細胞ＶＺＶの最終調製物の感染力価
によって収量を決定する。水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺ
Ｖ）調製物の感染力価は、Ｋｒａｈら（Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.
Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９０、２７：３１９〜３２６）に
よって記載されたアガロース−オーバーレイまたは液体
オーバーレイ手順によって得られた。簡単に説明すると
この方法は、ＶＺＶ感染感受性のＭＲＣ−５細胞を能動
的複製状態（ａｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎ
ｇ ｓｔａｔｅ）まで、即ち、細胞が約５０〜８０％集
密状態になる点まで培養する。次いで最少量のウイルス
を細胞単層にオーバーレイし、細胞に付着させ、次に追
加の増殖培地を添加する。数日間増殖させた後、細胞を
タンパク質染料に接触させ、透明な領域即ちプラークを
カウントする。従って既知量のウイルス接種物に対する
１ミリリットルあたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の
数がウイルス収量の十分な尺度となり得る。所与の任意
のウイルス調製物から得られた無細胞ウイルスの総量を
乗算すると、ＰＦＵの総数を計算し得る。

【００２０】アッセイ自体にばらつきが生じるので、最
適化された任意の特定方法によって得られたＰＦＵの増
加を最適化されない処理ステップを含む方法によって得
られた結果に対する比として示す。ウイルス収量の増加
倍率をこのようにして示すとＰＦＵアッセイ自体のばら
つきが相殺される。最終的には、ここに記載の処理ステ
ップが総合され当分野に公知の方法によるＶＺＶ収量の
約１６〜２０倍のＶＺＶ収量が得られる。このような増
加倍率は文献に報告されたことはなく、これはＶＺＶワ
クチン産生の分野で多大な貢献を果たし得る。

【００２１】ＶＺＶプラークアッセイは時間のかかる処
理であるから、反応条件の制御は特に難しい。高速ＶＺ
Ｖ抗原ＥＬＩＳＡは、水痘生ワクチン製造中のウイルス
増殖をモニタできるようにＶＺＶ抗原量を測定し得る。
更にこの試験は、清澄化し音波処理したワクチンバルク
中のＶＺＶ抗原量を算定するために使用でき、また、凍
結乾燥ワクチン充填バイアル中の抗原を測定するために
も使用できよう。要約するとこのアッセイでは、試験サ
ンプルに由来のＶＺＶ抗原を抗ＶＺＶ血清と共に溶液中
でインキュベートする。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープ
レートに固定させたＶＺＶ抗原に残留遊離抗体を結合さ
せる。プレートに結合し得る抗体の量は試験サンプル中
の抗体の量に反比例する。プレートに結合する抗体を酵
素リンクした抗ヒト抗体及び分光光度法によって定量可
能な着色物質を与える適当な基質との反応によって定量
する。

【００２２】ＶＺＶ抗原ＥＬＩＳＡ及びＶＺＶプラーク
アッセイは概して相関するデータを与えるが、ＶＺＶ抗
原アッセイは非生存及び生存の双方のＶＺＶを検出する
ことに留意されたい。死ＶＺＶによって生じた免疫応答
が弱毒生ウイルスに対する応答と同じほど有効であると
いう証明はないので、ＶＺＶワクチンのウイルス接種量
を決定するためにはプラークアッセイが必須である。し
かしながら抗原アッセイも、ＶＺＶワクチンレシピエン
トに投与される総抗原負荷の測定値を与える、ＰＦＵア
ッセイよりも高速であるからＶＺＶ産生を経時的にモニ
タできる、ＶＺＶ ＰＦＵ産生ピーク点に少なくとも相
関するので採取適期を判断できる、などの利点を有して
いる。

【００２３】以下の重要パラメータの各々を好ましく調
節することによって本発明方法が更に優れた結果を与え
る。これらのすべてのパラメータが本発明の範囲に包含
される。

【００２４】（ａ） ＭＲＣ−５のようなヒト二倍体細
胞から選択されたＶＺＶ感染感受性細胞を、高度の細胞
複製を達成し得る多量の培地または富化培地を用いて集
密的単層が得られるまで培養し、ショ糖のような非代謝
性二糖を供給するステップ：ＶＺＶを産生させるために
有用であることが当分野で知られている多数の種々の細
胞培養系のいずれを使用してもよい。このために例え
ば、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−細胞及び
その他の多くの種類の細胞が使用されている。本発明者
らはヒト用ワクチン産生のために許容されたＭＲＣ−５
細胞を終始使用した。しかしながら、ＭＲＣ−５細胞以
外の特に多産性の細胞系を使用した場合に無細胞ＶＺＶ
の収量がここで報告した程度以上に増進される可能性を
否定することはできない。このような細胞系が現行の方
法に適している限り、このような細胞系の使用は本発明
に包含される。

【００２５】２％または１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）
を加えたイーグルの最少必須培地（ＥＭＥＭ）中で５％
ＣＯ₂雰囲気下に３５℃でインキュベートした亜集密状
態または集密状態のＭＲＣ−５細胞単層中の無細胞生存
ウイルスを比較することによって、無細胞ＶＺＶプラー
ク形成単位（ＰＦＵ）の収量に対する細胞集密度の効果
が判明する（実施例２、表１参照）。

【００２６】集密的細胞単層を使用したときの無細胞Ｖ
ＺＶの収量ＰＦＵ／ｍｌは、亜集密的培養物を能動的に
増殖させるか（１０％血清）または否か（２％血清）に
かかわりなく、亜集密的単層を感染させることによって
得られる収量の約２〜３倍に増加する。従ってＶＺＶ収
量増進のためには、能動的に増殖しない集密的細胞がワ
クチン製造プロセスに必要であると考えられる。

【００２７】ウイルス増殖中に存在するウシ胎仔血清の
パーセンテージは、無細胞ＶＺＶＰＦＵ収量を左右する
主な要因であるとは考えられない。従って、細胞増殖及
びウイルス培養にＥＭＥＭもしくはＥＢＭＥのような最
少培地を使用するかまたはＳＲＦＥ−２のような富化培
地を使用するかにかかわりなく、典型的には、方法の細
胞増殖期に約１０％のＦＣＳを与え、ウイルス増殖期に
約２％のＦＣＳを与える。

【００２８】ＦＣＳ及び培地に加えて、典型的には、５
０μｇ／ｍｌのネオマイシンのような抗生物質とグルタ
ミン（約２ｍＭ）とを細胞培養物及びウイルス増殖培地
に添加する。

【００２９】１.細胞移植期 細胞培養容器（フラスコ即ち培養瓶、回転培養瓶または
これらの培養容器の機能的等価物）に、ＭＲＣ−５また
はその他の二倍体細胞を、細胞の初期濃度が約１０,０
００〜４０,０００細胞／ｃｍ²となるように播種する。
約１０％のウシ胎仔血清を補充した増殖培地で細胞を養
育し、５％ＣＯ₂ガスを与え、約３０〜３７℃、好まし
くは約３５℃でインキュベートする。

【００３０】静置培養で増殖細胞が完全被覆に達するた
めの必要最小量の細胞を移植するとよい。表面積に対す
る作用量の比は、増殖表面積１ｃｍ²あたり培地約０.５
ｍｌである。回転培養瓶で細胞を増殖させる場合、８５
０ｃｍ²あたり約１２５ｍｌという少量でもよいが、約
４２５ｍｌ／ｃｍ²が好ましい。

【００３１】細胞移植期には、細胞培養のために当分野
で公知の市販の最少培地、例えば、イーグルの最少必須
培地（ＥＭＥＭ）またはアール塩を補充したイーグルの
基礎培地（ＥＭＢＥ）を約１０％のＦＣＳと共に使用し
てもよい。または、強化された富化培地を使用してもよ
く、この段階には後者の使用が有利であろう。ＳＩＧＭ
Ａから入手できるＳＲＦＥ培地（Ｗｅｉｓｓら、Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ １６（７）、６１６〜６２８（１９８
０））は、この時期に有利に使用できる富化培地であ
る。但し、富化培地が方法のこの段階に必須であるとい
うのではない。

【００３２】２.細胞増殖期：方法のこの段階では高度
に集密的な細胞の増殖を確保するために十分な栄養を与
えることが必須である。このためには、多量の最少培地
を与えるかまたはより少量の富化培地を与える。細胞を
約３０〜３７℃、好ましくは約３２〜３５℃で増殖させ
る。

【００３３】細胞付着及び細胞増殖のために適当な期間
維持した後で、培地の除去及び交換によって細胞をリフ
ィードし、次いでインキュベーションを継続する。吸引
もしくは傾瀉によって培地を除去してもよく、または、
細胞単層の団結性を弱体化しない限り任意の別の手段に
よって培地を除去してもよい。上記のように移植された
ＭＲＣ−５細胞の場合、細胞を培養容器に導入した約７
２時間後にリフィードを行なう。

【００３４】培地の交換量は細胞移植期の培地の使用量
と同じでもよい。しかしながら、細胞増殖期には移植期
の使用量よりも多い量の培地を与えるのが好ましい。こ
のことは、ＦＣＳを加えたＥＭＥＭまたはＥＢＭＥのよ
うな最少培地で細胞を培養する場合に特に重要である。
大量培養は細胞に適当な栄養供給を確保する１つの方法
である。

【００３５】増殖期に富化培地を供給する場合には大量
培養に関する要件が緩和される。特に好ましい富化培地
の一例はＳＲＦＥ−２（ＳＩＧＭＡ）である。この時期
に最少培地でなく富化培地を使用すると、集密的細胞単
層の密度が顕著に増加する。細胞密度の増加に伴って、
富化培地で増殖させた感染細胞培養物から得られるＶＺ
Ｖの収量も増加する。従って、細胞増殖期に富化培地を
使用したときのＶＺＶの最終収量は同時期に最少培地を
使用したときに比べて約２〜４倍増加する。

【００３６】好ましい実施態様では、ＳＲＦＥ−２に脂
質を補充する。複数の脂質補充物のいずれかを使用し得
る。例えば、成ウシ血清（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ.）に由来のコレステロール富化脂質、ＥＸＣＹ
ＴＥ Ｉ脂質またはＶｅｒｙ Ｌｏｗ Ｅｎｄｏｔｏｘ
ｉｎ（ＶＬＥ）脂質（ＭＩＬＥＳ）が富化培地または最
少培地の補充物として有用であることが知見された。市
販の大豆脂質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ、Ｉｓｃｏｖｅら、Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.、１４７、９
２３〜９３３（１９７８））は約０.２ｍｇ／ｍｌで与
えられたときに極めて有利な補充物であることが証明さ
れた。ＳＲＦＥ−２と脂質とＦＣＳとを混用すると約５
００,０００／ｃｍ²に近い細胞密度が得られた。細胞増
殖を最少培地または富化培地のいずれで行なうかにかか
わりなく、脂質を補充したときにＶＺＶ収量が増加す
る。市販材料は、２０ｍｇ／ｍｌの脂質、１００ｍｇ／
ｍｌのウシ血清アルブミンを含む原液として供給されて
いる。この材料は１：１００の最終希釈度で使用すると
便利である。細胞増殖期にＳＲＦＥ−２に約０.２ｍｇ
／ｍｌの大豆脂質を補充したときのＶＺＶの最終収量
は、ＥＭＥＭ培地単独のときの該収量の約９倍、ＳＲＦ
Ｅ−２培地単独のときの該収量の約３.３倍に増加し
た。

【００３７】３.前感染期 発明者らは、ＶＺＶ感染の前に培養細胞を最適濃度の無
毒性非代謝性二糖に接触させるとＶＺＶの最終収量が更
に増加することを知見した。極めて成功した１つの実施
態様では、培養容器に細胞を導入した７２時間後であ
り、かつ培養物にＶＺＶを感染させる好ましくは約２４
〜９６時間前に、約２０〜６０ｍＭのショ糖を与える。
実際には、上記のステップ２のリフィード培地に約５０
ｍＭのショ糖を添加することによってこれらの条件を満
たし、このステップ及び先行ステップを実質的に合体さ
せることによって無菌操作の必要数を減らす。

【００３８】ラクトース、セロビオース及びマルトース
のような別の二糖もＶＺＶの最終収量を増進させるが、
好ましい二糖はショ糖である。フルクトース及びリボー
スのような単糖を試験したが、これらの単糖はＶＺＶ収
量を増加させなかった（リボースは毒性さえ示す）。二
糖は増殖する細胞のリソソーム中に濃縮され、これらを
膨潤させて小胞を形成すると考えられる（ＤｅＣｏｕｒ
ｃｙ ＆ Ｓｔｏｒｒｉｅ、Ｅｘｐ.Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ.、１９２、５２〜６０（１９９１））。二糖がＶＺ
Ｖ収量に与えるこのような効果はＶＺＶのリソソーム性
損傷の減衰に起因するものかもしれない。二糖以外に
も、三糖及び四糖が有利な効果を有することが予測され
る。例えばＣｏｈｎ及びＥｈｒｅｎｒｅｉｃｈ（Ｊ.Ｅ
ｘｐ.Ｍｅｄ.、１２９、２０１〜２２２（１９６９））
は、このようなより大きい糖またはショ糖がマクロファ
ージに供給されるとき糖が細胞によって代謝されない間
は同様の小胞形成が生じることを観察した。

【００３９】（ｂ） ステップ（ａ）で培養した細胞の
集密時点にできるだけ近い時期にＶＺＶ感染細胞を実用
的な高い感染多重度で感染させるステップ：反復実験を
平均すると、集密化後に４８時間静置した細胞は、集密
化直後の細胞にＶＺＶを感染させた場合の収量に比べて
約５０％のＶＺＶ ＰＦＵ／ｍｌしか与えないことが知
見された。従って、ＶＺＶ接種物の導入時期を集密化時
点にできるだけ近付けることが重要である。不都合に
も、集密化は、培地の種類、培養される細胞の種類及び
その他の使用培養条件に従って変動するパラメータであ
る。上記のステップ（ａ）１．に従って移植されたＭＲ
Ｃ−５細胞の場合、典型的には集密化に到達した時点で
細胞感染させる。

【００４０】水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は好まし
くは、米国特許第３,９８５,６１５号に記載されており
ＡＴＣＣに寄託された弱毒ウイルスのＯｋａ株である。
このウイルスは、モルモット胚細胞培養物及びヒト二倍
体肺腺維芽細胞培養物（例えばＭＲＣ−５細胞）中で増
殖するのに適している。

【００４１】感染性の生存水痘ウイルスに感染した細胞
をＭＲＣ−５細胞に約１：１２５のＭＯＩで感染させ、
感染した細胞をウイルス複製可能に維持し、細胞をトリ
プシン処理し、遊離した細胞を作用シード（種菌）とし
て直ちに使用してもよく、または、後で使用するためも
しくはＰＦＵ定量のためにＤＭＳＯもしくはグリセロー
ルのような寒冷保護剤と共に約１０⁷細胞／ｍｌでゆっ
くりと凍結させて保存してもよい。ＶＺＶ感染を開始さ
せるためには、凍結したＶＺＶ感染細胞原液を解凍し、
集密的細胞培養物に添加し得る。

【００４２】または、Ｈｏｎｄｏら（Ａｒｃｈｉｖ ｆ
ｕｒ ｄｉｅ ｇｅｓａｍｔｅ Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃ
ｈｕｎｇ ４０、３９７〜３９９（１９７３））に記載
された凍結乾燥接種物の４℃長期保存を可能にする方法
に従ってＶＺＶ感染細胞を凍結乾燥させてもよい。ま
た、無細胞ＶＺＶを接種物として使用することも可能で
あるが、採取のときにウイルス収量の損失が生じるので
細胞定着接種物を使用するのが好ましい。

【００４３】ウイルス感染したシード原液を調製し得る
別の方法では、産生用細胞の移植よりも前にウイルスシ
ード調製用細胞の増殖を開始させる。ＶＺＶ感染細胞を
シード細胞に感染させるときに産生用細胞の移植を開始
させ、ウイルスシードがＶＺＶのピーク力価に達すると
同時に集密化するようにしてもよい。最適ではないがよ
り便利な方法としては、シード細胞及びバルク細胞の全
部を同時に少量の培養培地（８５０ｃｍ²の回転培養瓶
あたり約１２５ｍｌ）に移植してもよい。約２〜３日間
増殖させた後、ＶＺＶシード調製用細胞の培養瓶を約４
２５ｍｌに拡大するか、または集密まで増殖するように
富化培地をリフィードする。産生用細胞は、作用シード
細胞にＶＺＶ感染細胞を感染させる約２日前までは（約
１０％のＦＣＳを含む）少量の最少培地中で比較的休眠
している。このときに、産生用細胞の量を約４２５ｍｌ
まで増加させるか、または、最適量の大豆脂質とウシ胎
仔血清とを添加したＳＲＦＥ−２のような富化培地をリ
フィードする。このようにすれば産生用細胞は高度に集
密化するまで増殖するであろう。産生用細胞に上記培地
をリフィードした２日後に、集密化した作用シード細胞
にＶＺＶ感染細胞を１：１２５以上のＭＯＩで感染さ
せ、ＶＺＶ複製を約２〜３日間継続させる。シード培養
物中でＶＺＶが産生ピークに達するまでに産生用細胞が
集密化するであろう。次にシード細胞を採取して産生用
細胞に添加する。

【００４４】シード調製のタイミングにかかわりなく、
ＶＺＶ感染後の適当な時期に、ＶＺＶ感染したシード培
養物から培地を吸引し、ＶＺＶ感染したシードをトリプ
シン処理（約０.２５％トリプシン）またはその他の非
破壊的手段によって採取し、産生用細胞培養物に既知の
ＭＯＩで感染させる。

【００４５】Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｎ.Ｓ.及びＬｅｎｎｅｔ
ｔｅ、Ｅ.Ｈ.（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ １４、７０９〜７１５（１９７６））は、ＶＺ
Ｖの高収量を得るためには高ＭＯＩが重要であることを
指摘しているが、低ＭＯＩ感染との厳密な比較はしてい
ない。本発明はこれを詳細に比較する。

【００４６】細胞培養物から増殖培地を除去し、上記の
ごとく調製された既知量のＶＺＶ感染細胞を含む新しい
培地に交換することによって、細胞にＶＺＶを感染させ
る。好ましくはウイルス原液の水痘ウイルスのプラーク
形成単位（ＰＦＵ）を測定し、レシピエント細胞をカウ
ントして感染多重度（ＭＯＩ）を定量する。ＭＯＩは、
接種物中のＶＺＶ感染細胞対培養物中の非感染単層細胞
の数の比として示される。従って、１：１０のＭＯＩは
高い値であり、１：６２５のＭＯＩは低い値である。Ｍ
ＯＩが高い値であることが望ましいといえるが、実際に
はＭＯＩ＝１：１２５という低い値で優れたＶＺＶ収量
が得られる。

【００４７】１：７〜１：６２５の範囲のＭＯＩで得ら
れる収量は、最高値のＭＯＩにおける約５００,０００
ＰＦＵ／ｍｌから最低値のＭＯＩにおける約１００,０
００ＰＦＵ／ｍｌの範囲である（実施例５の表３参
照）。ＭＯＩが高いほど、ピークＰＦＵに達するまでの
所要インキュベーション時間が短く、収量が高い。従っ
て、ＭＯＩの値及び採取時期次第では最終ＰＦＵが約５
倍に達することも可能である。

【００４８】（ｃ） ＶＺＶ感染培養物を高栄養状態に
約２２〜９６時間維持し、ＶＺＶ産生のピーク点で採取
するステップ：ＶＺＶ感染細胞の培養を感染後約２２〜
９６時間継続する。ウイルス増殖のこの時期に適正な栄
養を維持することが重要である。約２％〜１０％のＦＣ
Ｓを加えたＥＭＥＭのような最少培地による大量培養で
もよく、またはより少量の富化培地を使用してもよい。
極めて好ましくは、２％〜１０％のＦＣＳを加えたＳＲ
ＦＥ−２を脂質補充物非添加で使用する。脂質はこの時
期で使用されるとＶＺＶ収量を低下させることが判明し
た。

【００４９】感染後２２〜９６時間の培養中に、ＶＺＶ
は感染細胞中で複製し、拡張して隣接細胞に感染する。
しかしながら、古い感染細胞は回収可能な無細胞ＰＦＵ
を与えないであろう。ＶＺＶの増殖曲線及び以後の下降
の勾配は極めて大きい。従って、感染性ＶＺＶの収量を
最大にするために採取適期は重要なパラメータであり、
個々の産生処理毎の初期（ｉｎｐｕｔ）ＭＯＩ、栄養及
びインキュベーション時間の厳密な管理を維持すること
によって採取適期を正確に再現できる。更に、感染性Ｖ
ＺＶの産生は、少なくともウイルス死が起こり始めると
きまではＶＺＶ抗原の産生と相関するので（図５参
照）、採取適期を知るために高速ＶＺＶ抗原ＥＬＩＺＡ
を使用してもよい。

【００５０】上記ステップの各々を最適化して（即ち、
富化培地中で増殖させる、細胞を５０ｍＭのショ糖に感
染前７２時間接触させる）、感染の約７２時間後にＶＺ
Ｖ感染ＭＲＣ−５細胞を採取した場合、無細胞ＶＺＶの
最終収量は、最少培地を用いて培養し４８時間目に採取
したウイルスの収量に比べて約１６倍に増加し、９６時
間目に採取したときは収量の差が更に大きくなっている
（実施例８、図１）。ウイルスを感染後４８時間で採取
したときには、最適化した条件下のＶＺＶの収量は最少
培地の約４倍でしかなかったが、９６時間後に採取した
ときは最少培地の収量に比べて極めて増加していた。従
って、富化培地中ではウイルス収量がはるかに増加し、
ウイルス死がはるかに減少し、ウイルス収量が急勾配の
経時的下降を生じない。富化培地中ではＭＯＩもそれほ
ど重要でない。

【００５１】（ｄ） ＶＺＶ感染細胞を採取する前にＶ
ＺＶ感染培養物を、任意に塩化アンモニウムまたはクロ
ロキンのようなリソソーム向性物質を含む生理的溶液で
洗浄するステップ：培養物から血清、脂質及び細胞性破
片を除去するために、細胞を溶解しない生理的バッファ
で単層培養物を洗浄する。このためにはリン酸塩緩衝生
理的食塩水（ＰＢＳ）を問題なく使用し得る。細胞を数
回洗浄し、洗浄溶液を傾瀉するかまたは吸引するか、ま
たは単層の団結性を破壊しない別の任意の手段によって
除去する。

【００５２】細胞を増殖容器から化学的に遊離させると
きは、細胞を遠心によって濃縮し、生理的バッファを安
定化溶液に交換する必要がある。

【００５３】細胞採取の前に塩化アンモニウムまたはク
ロロキンを与えるとＶＺＶの最終収量が改善されること
が知見された。Ｋｉｅｌｉａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ.５、
３１０３〜３１０９（１９８６））は、感染性ウイルス
がその細胞内寿命のある部分を過ごすと考えられる細胞
性エンドソームの内部ｐＨを調節するために塩化アンモ
ニウムを使用した。リソソーム向性物質に細胞を接触さ
せたときにＶＺＶ収量が増加するメカニズムは、害の少
ないエンドソーム性環境が誘発されることに関連すると
推定される。従って、ショ糖のような無毒性非代謝性二
糖を感染前に細胞に充填（ｌｏａｄｉｎｇ）すること及
び塩化アンモニウムまたはクロロキンに細胞を接触させ
ることによって、同様のメカニズムによる作用が得られ
ると思われる。いずれにしても、細胞破壊の前に、塩化
アンモニウムを最終濃度１〜１００ｍＭ、より好ましく
は２０〜５０ｍＭの範囲で与え、好ましくは約４℃で約
２５〜５０分間維持するとＶＺＶの最終収量が増進され
ることが実験的に確認された。第２のリソソーム向性物
質即ちクロロキンを約２３０μＭの濃度で使用したとき
にも同様に、ＶＺＶの回収率ＰＦＵ／ｍｌが増加する。

【００５４】（ｅ） 最小量の安定化溶液内へのＶＺＶ
感染細胞の採取、及び直後の細胞破壊または後日の破壊
用の細胞の凍結ステップ：ＶＺＶ感染細胞を洗浄し、増
殖容器が掻取り可能な容器であれば掻取りによって採取
し、そうでなければ細胞を化学的に剥離する。細胞の酵
素遊離はあまり好ましくない。その理由は、残留酵素が
細胞破壊後のウイルス収量を減少させ得るからである。
上述のように、細胞を生理的食塩水中に遊離させたとき
は、細胞を遠心によって濃縮し、生理的食塩水を最小量
のＶＺＶ安定化溶液に交換する。細胞増殖表面積に対す
る好ましい量は、表面積８５０ｃｍ²あたり安定剤約４
０ｍｌである。

【００５５】ウイルス安定剤は当分野で公知である。例
えば、米国特許第３,９８５,６１５号はリン酸塩緩衝生
理食塩水中の５％ショ糖による安定化を示唆している
が、別の文献ではＳＰＧＡのようなより複雑な安定剤が
報告されている。

【００５６】ＶＺＶ感染細胞を安定化溶液に再浮遊させ
た後、細胞を直ちに破壊してもよく、または大量のＶＺ
Ｖを調製する場合には、後で処理できるように−７０℃
で凍結する。細胞を直ちに破壊したときは増殖細胞ｃｍ
²あたりのＶＺＶの収量はやや多いが、凍結段階を経由
してもその収量が直後の処理で得られる収量から１０％
以上減少することはない。

【００５７】（ｆ） 細胞会合ＶＺＶを最適に遊離させ
るためのＶＺＶ感染細胞の破壊及び細胞性破片の除去に
よる無細胞ＶＺＶ調製物の供給ステップ：上述のごと
く、好ましくは培養培地を破壊前に細胞から除去し、最
小量のＶＺＶ安定剤に交換し、掻取りまたはその他の方
法で細胞を安定剤に解放する。細胞浮遊液を０〜４℃に
冷却し、次に、音波処理、ダウンスホモジナイゼーショ
ンのような適当な手段によって破壊する。ダウンスより
も大規模な処理ができる別の種類の剪断手段を用いても
よく、またこれらの技術を併用してもよい。

【００５８】音波処理単独では無細胞ＶＺＶの最大回収
率が得られないことを確認した。実際、初期破壊ステッ
プとしてダウンスホモジナイゼーションを使用し、次い
で遠心し、上清を上清Ｉとして保存し、次いでペレット
の音波処理及び遠心を順次行なって上清ＩＩを得る場
合、破壊によるＶＺＶ収量は極めて改善される。上清Ｉ
及びＩＩの合計収量は、破壊技術として音波処理単独を
使用したときに得られる収量の４倍という高い値にな
る。

【００５９】細胞性破壊後の細胞性破片の除去は遠心、
濾過またはＶＺＶを損傷しないで細胞破片を除去する当
分野で公知のその他の任意の手段によって行なう。次
に、無細胞ウイルス調製物を安定化溶液で希釈し、ワク
チンとして使用するために小分けする。好ましくは、長
期保存のために当分野で公知の方法のいずれかによって
ＶＺＶを凍結乾燥する。

【００６０】本発明方法の最適化ステップによって得ら
れる収量増加の概数を最少培地中の細胞増殖によるＶＺ
Ｖ産生との比較によって以下にまとめる：方法のステップ ＰＦＵの増加率 培地／補充物： １．ＭＯＩ ２〜５ ２．細胞の集密化 ２〜３ ３．ＳＲＦＥ−２培地＋脂質 ２〜３ ４．前感染期のショ糖添加 ２〜５ ５．最適培地量の使用 １〜２ 培地／安定剤補充物と最適感染条件との併用によって 得られる正味増加率 ≧８ 回転培養瓶中で３、４及び５を併用したときに 観察された増加率 １６ ６．細胞定着ＶＺＶを遊離させるための剪断／音波処理の併用 １.５ 最適化されない方法に比べた総増加率 ≧１８

【００６１】

【作用】ワクチン産生における本発明方法の有用性 弱毒した無細胞ＶＺＶが水痘予防ワクチンとして有用で
あることは証明されている。多数の臨床試験でこの有用
性が最終的に立証され、このような証明はもはや従来技
術の一部となっている（例えば、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ
８８（３）、６０４〜６０７（１９９１）；Ｐｅｄｉ
ａｔｒｉｃｓ ８７（５）、６０４〜６１０（１９９
１）参照）。従って、弱毒した生存ＶＺＶを高収量で産
生する極めて有効な方法を提供することによって本発明
は当分野に多大な功績を果たし得る。本発明方法で調製
されたウイルスは、当分野で公知の方法に従ってワクチ
ン製剤として調製でき、既に確定した投薬計画（ｒｅｇ
ｉｍｅｎ）に従って投与できる。例えば、本発明の弱毒
した無細胞の生存ＶＺＶ産生物を安定剤に希釈し、瓶に
充填し、単位用量ずつ凍結乾燥し、約４℃以下で貯蔵す
ると、使用時に用量約１０００ＰＦＵの製剤が得られ
る。本発明方法で製造されたＶＺＶワクチンは、ＶＺＶ
のビルレント菌の感染を防御する免疫応答を誘発すべく
ヒトに接種するための単位用量製剤として使用され得
る。好ましくは最小で、約２０００ＰＦＵ／ｍｌの用量
（１０００ＰＦＵ／０.５ｍｌ用量）を皮下または筋肉
内に投与する。合計で１５,０００〜２０,０００ＰＦＵ
に達する高い用量も投与したが、これらの用量も許容範
囲であった。

【００６２】本発明は、弱毒ＶＺＶウイルスを製造する
ための最適化した方法を提供し、該方法に当分野で周知
の事項を応用することによって、水痘予防のために抗Ｖ
ＺＶ免疫応答を追加刺激するワクチンを調製することが
可能である。

【００６３】

【実施例】代表的な実施例に基づいて本発明を以下に説
明する。本発明の範囲がこれらの実施例に限定されない
ことは理解されよう。

【００６４】実施例１ ＶＺＶ収量定量アッセイ Ｋｒａｈらによって記載されたアガロース−オーバーレ
イまたは液体オーバーレイ手順（Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ、１９９０、２７：３１９〜３２６）を用いて
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）調製物の感染力価を評
価した。以下の手順でアッセイを実施した。

【００６５】６０ｍｍの組織培養皿に、５ｍｌのＢＭＥ
（ハンクスの平衡塩類溶液と混合したイーグルの基礎培
地）中に６×１０⁵細胞の濃度のＭＲＣ−５細胞を、１
００ｍｇ／リットルのガラクトース、５０μｇ／ｍｌの
ネオマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンと共に播種し、
５％ＣＯ₂雰囲気中で３５℃でインキュベートした。２
４〜４８時間のインキュベーション後、細胞が５０〜８
０％集密化した。増殖培地を吸引によって除去し、ＳＰ
ＧＡバッファまたは液体維持培地（ＬＭＭ）のような適
当なウイルス希釈剤に希釈した１００μｌのＶＺＶ溶液
で細胞を感染させた。ＳＰＧＡバッファは７.５％（ｗ
／ｖ）ショ糖と１１ｍＭのリン酸カリウムと０.１％
（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムと１％のヒト血清
アルブミンとを含有する。ウイルスを５％ＣＯ₂雰囲気
中で３５℃で１時間以上付着させる。次に、ＶＺＶ感染
細胞培養物に５ｍｌのアガロースオーバーレイ培地（Ａ
ＯＭ）または液体維持培地（ＬＭＭ）をオーバーレイす
る。アガロースオーバーレイ培地は２つの溶液、即ち液
体オーバーレイ培地（ＬＯＭ）とアガロース溶液との混
合物である。ＬＯＭはアールの塩（ＭＥＭ）、２％熱失
活ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍｌ硫酸ネオマイシン及び
２ｍＭのＬ−グルタミンと共に最少必須培地を含む。
４.５ｇの低ゲル化温度のアガロースを１００ｍｌのＭ
ＥＭ中で１２１℃で１５分間加熱し、溶液を４５℃に冷
却することによってアガロース溶液を調製する。１容の
アガロース溶液を４容の１.２５×ＬＯＭ濃縮物と共に
４５℃で混合することによってＡＯＭを調製する。プレ
ートを２３〜２５℃に冷却してＡＯＭを凝固させる。培
養物をインキュベートしてプラークを増殖させる。６〜
７日後に、ＬＯＭを与えたプレートに５ｍｌのリン酸塩
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をオーバーレイし、アガロー
スをばらばらにして除去するためにガラスパスツールピ
ペットで刻みをつける。ＬＭＭを与えたプレートから培
地を吸引し、エタノール−１％酢酸中の０.２％（ｗ／
ｖ）クーマシーブルーＲ−２５０の溶液で細胞を染色す
ることによってプレートを可視化する。４〜５個の重複
プレートの平均から得られたプレートカウント数を、ｍ
ｌあたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍｌ）として示
す。

【００６６】アッセイにばらつきが生じる可能性がある
ため、最適でない条件下の同様のアッセイと比較してＶ
ＺＶ収量の増加を調べる。

【００６７】実施例２ 感染時の細胞集密化の関数として示されるＶＺＶ収量 ＭＲＣ−５細胞を４×１０⁶細胞／１５０ｃｍ²の濃度に
ならし（均平化し）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の
存在下のアール塩を補充したイーグルの基礎培地（ＥＢ
ＭＥ）中で３日間増殖させた。約１２×１０⁶細胞／１
５０ｃｍ²の亜集密的細胞密度に達すると、２％ＦＣＳ
または１０％ＦＣＳを補充した新しいＥＢＭＥを細胞に
リフィードした。このときに、ＶＺＶ感染（ＭＯＩ＝
１：１２５）を伴う場合と伴わない場合で亜集密的細胞
を更に増殖させ、４８時間後の細胞密度及びウイルス収
量の増加をモニターした。２％ＦＣＳ中の非感染細胞は
３３％の密度増加しか示さなかったが、１０％ＦＣＳ中
では９２％の増加を示した。感染培養物中の細胞の数は
増加していなかった。表１に示すように、亜集密的細胞
からのウイルス収量は、ＦＣＳ補充量が最小（２％ＦＣ
Ｓ）であるかまたは最大（１０％ＦＣＳ）であるかにか
かわりなく培養物中の細胞複製能力（ｃａｐａｃｉｔｙ
ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）によっ
て影響を受けていなかった。

【００６８】別の細胞培養物を１０％ＦＣＳ中で更に２
日間、１５０ｃｍ²のフラスコあたり約２０×１０⁶細胞
（集密化）まで増殖させ、次いで、２％ＦＣＳまたは１
０％ＦＣＳを補充した新しいＥＢＭＥをリフィードし、
ＶＺＶを感染させるか（ＭＯＩ１：１２５）または非感
染で維持した。４８時間後に細胞密度の増加とウイルス
収量とをモニターした。２％ＦＣＳ中の非感染細胞は密
度増加を示さなかったが１０％ＦＣＳ中の細胞は約１５
％増加することが知見された。従って、どちらの条件で
も細胞複製を大して増加させることはできなかった。２
％ＦＣＳまたは１０％ＦＣＳ中のウイルス収量は同様で
あり、双方は亜集密的感染細胞からの収量の約３倍に増
加していた（表１）。従って、無細胞ＶＺＶの最適収量
を得るためには、能動的に複製する亜集密的細胞単層を
使用するよりも新しい集密的細胞単層を使用するのが好
ましい。

【００６９】

【表１】

【００７０】実施例３ 新しい集密的細胞培養物と古い集密的細胞培養物とにお
けるＶＺＶ収量の比較 約２６,５００細胞／ｃｍ²の濃度のＭＲＣ−５細胞を回
転培養瓶（８５０ｃｍ²）に播種した。全部の細胞を１
０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ₁₀）を含むＥＢ
ＭＥ培地中で５％ＣＯ₂雰囲気下に３５℃で増殖させ
た。ＶＺＶ感染時間に基づいて培養瓶を２グループに分
割し、グループＩの細胞は５日間増殖させると集密的細
胞単層に達した。ここで培地を除去し、１：１２５のＭ
ＯＩで細胞会合ＶＺＶを細胞に感染させ、ＥＭＥＭ＋２
％ＦＣＳに浮遊させた。追加の培地を添加し、細胞を更
に４８時間インキュベートした。グループＩＩの細胞は
更に４８時間維持した後でＭＯＩ＝１：１２５で感染さ
せた。

【００７１】グループＩ及びＩＩの細胞によるＶＺＶの
産生を以下のごとく定量した。培地を回転培養瓶から除
去し、細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、等容の
安定剤中でガラスビーズで掻取り、４℃に冷却した。低
温の細胞浮遊液を音波処理によって破壊した。細胞破片
を低速遠心（３２５×ｇで１０分間）によってウイルス
から除去し、ウイルス上清を保存した。ＶＺＶ産生をプ
ラークアッセイによって測定した。表２に示すように、
新しい集密的細胞単層にＶＺＶを感染させたとき、収量
が約２倍に増加した。

【００７２】

【表２】

【００７３】実施例４ ＶＺＶ ＰＦＵ／ｍｌ収量に対する培養量の効果 ８５０ｃｍ²の回転培養瓶に入れた１２５ｍｌのＥＢＭ
Ｅ、１０％のＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのネオマイシン及
び２ｍＭのＬ−グルタミンに、ＭＲＣ−５細胞（１０×
１０⁶細胞）を播種し、３５℃で３日間インキュベート
した。３００ｍｌの新しい培地を添加し、培養物を３５
℃で更に４日間インキュベートした。次に培地を除去
し、２％の熱失活ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのネオマイシ
ン及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１２５ｍｌまたは
４２５ｍｌのＥＭＥＭに交換した。ＶＺＶ感染ＭＲＣ−
５細胞を添加し（ＭＯＩ約１：１２５）、培養物に５％
ＣＯ₂ガスを与えながら３５℃で４６時間インキュベー
トした。培地を除去し、細胞を１００ｍｌのＰＢＳで４
回洗浄し、ガラスビーズを用いて掻取り、４３ｍｌの安
定剤に導入した。細胞を−７０℃で凍結した。無細胞ウ
イルスを音波処理によって調製した。（遠心分離によっ
て）清澄化した音波処理物中の感染性ウイルスの量をＶ
ＺＶプラークアッセイによって測定した。

【００７４】 結論：培地の使用量を増加するとＭＲＣ−５細胞培養物
からの感染性ＶＺＶの収量が約２倍になる。

【００７５】実施例５ ＶＺＶ ＰＦＵ／ｍｌ収量に対するＶＺＶ ＭＯＩの効
果 回転培養瓶にＭＲＣ−５細胞を播種し集密まで増殖させ
た。増殖培地を除去し細胞に種々のＭＯＩでＶＺＶを感
染させた。感染細胞培養物によるＶＺＶの産生を、定期
的な採取及び実施例１と同様のプラークアッセイによっ
て定量した。表３及び図５に示すように、使用したＭＯ
Ｉの値が高いほど感染性の無細胞ＶＺＶの回収率が増加
し、インキュベーション期間が短縮された。また、ＭＯ
Ｉの値が高いほどピーク抗原レベルも早期に得られた。
ＭＯＩが１：６２５のような極めて低い値のとき、抗原
産生は遅くなり、最適レベルには到達しなかった。

【００７６】

【表３】

【００７７】実施例６ −２０℃の安定剤中のＶＺＶの安定性強化 感染細胞培養物をＳＰＧＡ中で音波処理し、リン酸塩緩
衝生理食塩水で洗浄した。次に細胞定着ウイルスを音波
処理によって解放し、細胞破片を遠心分離によって除去
した。無細胞ウイルスの濃度を既知のＰＦＵ／ｍｌ濃度
に調整し、安定剤中のウイルスのアリコートを凍結乾燥
し、４℃または−２０℃で保存した。１箇月毎の間隔で
合計１４箇月までサンプルを復元し、残留ＰＦＵ／ｍｌ
力価を定量した。この実験の結果を図３に示す。

【００７８】−２０℃で保存したときには４℃で保存し
たときよりもＶＺＶの安定性がかなり改善されることが
明らかである。

【００７９】実施例７ 細胞増殖の前感染期のショ糖の添加量及び添加時期が最
終ＶＺＶ収量に与える効果 １.細胞移植期：１０％のＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのネ
オマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＥＢＭＥ培
地中で６０ｍｍのプレートにＭＲＣ−５細胞（５ｍｌ）
を１２０,０００細胞／ｍｌの濃度（合計６００,０００
細胞）で移植し、５％のＣＯ₂下に３５℃でインキュベ
ートした。

【００８０】２.細胞増殖／前感染期：移植３日後に細
胞が集密化した。４８のプレートから移植培地を吸引
し、１０％のＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのネオマイシン、
２ｍＭのＬ−グルタミン及び０.２ｍｇ／ｍｌの大豆脂
質、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充したＳＲＦＥ−２また
はＥＢＭＥから成り、５０ｍＭのショ糖添加または非添
加の８ｍｌの増殖培地に交換した。新しい増殖培地の添
加後、細胞を５％のＣＯ₂下に３５℃で更に３日間イン
キュベートした。

【００８１】３.ＶＺＶ感染：次に各プレートから培地
を除去し、ＥＢＭＥに代えてＥＭＥＭ、大豆脂質を添加
したＳＲＦＥ−２に代えてＳＲＦＥ−２を夫々８ｍｌ添
加した。増殖期に比べて全部のプレートでＦＣＳを２％
に減らしたが、その他の補充成分、即ちネオマイシン、
グルタミン及びショ糖は同量にした。次に各プレートに
ＥＭＥＭ、２％のＦＣＳ、ネオマイシン、グルタミン中
で１：１６に希釈した３３３μｌのＶＺＶ感染細胞（４
７,０００ＰＦＵ／ｍｌ）を導入した。

【００８２】ＶＺＶを５％ＣＯ₂下に３５℃で２日間複
製させ、次いで異なる各条件毎に２つのプレートから培
地を取り出した。細胞をＰＢＳで４回洗浄した。細胞を
プレートあたり１.２ｍｌの氷冷安定剤に掻取った。重
複プレートからの採取物を５０ｍｌの円錐状遠心管にプ
ールし、−７０℃で凍結させた。

【００８３】ＶＺＶ感染後の３日、４日及び５日目に各
条件毎に２つのプレートを取り出して上記と同様の手順
で処理し、各組２プレートの採取物をプールし、−７０
℃で保存した。

【００８４】上記のごとく調製した各細胞採取物を後で
解凍し、カップ−ホーンソニケータ（ｃｕｐ−ｈｏｒｎ
ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて氷上でチューブあたり
３０秒間音波処理し、１０００×ｇで４℃で１０分間遠
心することによって清澄化した。プラークアッセイのた
めに上清のアリコートを採取した。実施例１と同様に行
なったプラークアッセイの結果を図１に示す。

【００８５】図１に示したデータからいくつかの結論が
確認される： （１）５０ｍＭのショ糖による細胞の前感染インキュベ
ーションはＶＺＶの最終収量に対して極めて有利に作用
する。感染前に細胞をショ糖で処理するとＥＭＥＭまた
はＳＲＦＥ−２のような各培地中でＶＺＶ収量が増加し
た。ショ糖に接触させたＳＲＦＥ−２増殖培地中で感染
７２時間後にＰＦＵとして測定したＶＺＶ収量はショ糖
非添加の最少培地中のＶＺＶ収量の約１６倍に増加して
いた。

【００８６】（２）富化培地（細胞増殖中に大豆脂質を
添加したＳＲＦＥ−２を用い、ウイルス増殖中にＳＲＦ
Ｅ−２を用いる）の使用もＶＺＶ収量に極めて有利に作
用し、ショ糖効果と併用するとＶＺＶの産生量が１桁増
加する。従って、富化培地はショ糖と相乗的に作用する
と考えられる。

【００８７】（３）ＶＺＶの採取時期が極めて重要であ
る。最適の培養条件、ＳＲＦＥ−２、ショ糖などを使用
した場合でも、ＶＺＶのピーク収量は感染後４８時間で
は得られない。この時点の収量は最少培地の４倍になる
だけである。しかしながら感染７２時間後にはＶＺＶ収
量が約１６倍に増加する。

【００８８】別の実験では、感染と同時に５０ｍＭのシ
ョ糖を添加したときのＶＺＶ収量は、感染７２時間前に
添加したときほどには増加しなかった。これは、ショ糖
の細胞内蓄積には長い前感染期が重要であることを示
す。また、２５ｍＭまたは１００ｍＭのショ糖の添加は
５０ｍＭのショ糖の添加ほど有効でないことも知見され
た。ラクトース、セロビオース及びマルトースに関して
も適当な濃度はほぼ同じである。

【００８９】実施例８ ＶＺＶ収量に対して複数の強化プロセスパラメータが与
える効果 種々のプロセスパラメータ（培地の種類、ショ糖の補
充、安定剤に対するＮＨ₄Ｃｌの添加、細胞からのウイ
ルス遊離のためのダウンス処理または音波処理）の変更
が無細胞ＶＺＶ ＰＦＵ収量に与える効果を定量するた
めに回転培養瓶試験を実施した。回転培養瓶あたり８０
×１０³細胞／ｍｌの培養物を含む１２５ｍｌのＥＢＭ
Ｅ、１０％のＦＣＳを移植した。これらをＥＢＭＥで４
２５ｍｌに調節するかまたはＳＲＦＥ＋大豆脂質培地を
リフィードし、１２５ｍｌ（低容量）または４２５ｍｌ
（高容量）のＥＭＥＭまたはＳＲＦＥ培地（大豆脂質非
添加）中の作用シードＶＺＶを感染させた。実施例７に
記載した時期にこれらの培地の交換／感染を実施した。
感染前の種々の時期（感染９６時間前または２４時間前
または感染と同時）にショ糖（ｓｕｃ）を５０ｍＭまで
添加した。感染前にショ糖を添加した培養物にはウイル
ス感染培地にもショ糖を添加した。全部の培養物をＭＯ
Ｉ約１：１５で感染させ、４６時間後にＥＭＥＭ培養物
中のＶＺＶ感染細胞を２０ｍＭのＮＨ₄Ｃｌ（Ｎ）を含
有するかまたは補充物非含有の感染後安定剤に採取し
た。全部のサンプルを−７０℃で凍結させ、次に、音波
処理またはダウンスホモジナイゼーションによって細胞
からウイルスを遊離した。全部のサンプルを１０００ｇ
で１０分間遠心して清澄化した。

【００９０】音波処理サンプルで得られたＰＦＵ結果か
ら以下の結論が得られた。

【００９１】（１）「高容量」のＥＭＥＭ培地を使用す
るとＶＺＶ ＰＦＵは２倍に増加した。ＳＲＦＥを使用
するときはこの実験でも別の実験でも「低容量」に近い
培地によって最適ＰＦＵ収量が得られると考えられる。
いくつかの場合には「高容量」培地で収量が低下する。

【００９２】（２）高いＰＦＵ回収率を得るためにＮＨ
₄Ｃｌは必須ではない。

【００９３】（３）ショ糖はＥＢＭＥ／ＥＭＥＭ培養物
のＰＦＵ収量を２倍に増加させ、ＳＲＦＥ培養物のＰＦ
Ｕ収量を５倍に増加させた。ショ糖の添加時期がＰＦＵ
に影響を与えると考えられる。ショ糖非添加、並びに、
感染と同時、感染２４時間前及び感染９６時間前にショ
糖を夫々添加したＳＲＦＥ＋大豆／ＳＲＦＥ培養物のＰ
ＦＵ収量は夫々、９４×１０³、２９６×１０³、４２７
×１０³及び６７１×１０³であった。

【００９４】（４）ショ糖処理した培養物はショ糖非含
有の対応物に比べて細胞変性作用も有意に減少してい
た。別の実験では、ショ糖処理した培養物は感染１週後
に退化性細胞変性作用を示さなかったが、ショ糖非含有
の対照は完全に溶菌していた。従って、ショ糖処理した
細胞はインキュベーション期間の延長に伴って（回転培
養瓶実験から４６時間以上後の採取物の）ＶＺＶ（抗原
特にＰＦＵ）蓄積量を増加させることも推定できる。

【００９５】（５）この実験ではＳＲＦＥ培地中で細胞
増殖させるので感染時期に細胞濃度をより高い濃度に調
節しなかった。従って、このパラメータを最適にすると
ＰＦＵ収量が更に増加することも予想できる。

【００９６】実施例９ 機械的剪断、音波処理及びそれらの併用によって到達で
きる無細胞ＶＺＶの収量 多くの異なるＶＺＶ産生条件を使用し実施例８に記載の
実験と同様にして大規模実験を実施した。この実験では
細胞破壊手順を新しいパラメータとして分析した。ダウ
ンスホモジナイゼーション単独、音波処理単独及びダウ
ンス処理と音波処理との併用によって得られた無細胞Ｖ
ＺＶの収量を比較した結果を以下に示す。表中のＶＺＶ
培養条件は、細胞を最少培地（ＥＢＭＥ／ＥＭＥＭ）ま
たは高栄養培地（ＳＲＦＥ−２＋大豆脂質／ＳＲＦＥ−
２＋５０ｍＭのショ糖（前感染期））で増殖させた。実
施例８に記載のごとく細胞を増殖させて採取し、実施例
１に記載のアッセイによってＶＺＶ ＰＦＵ／ｍｌを定
量した。

【００９７】

【表４】

【００９８】このデータより、細胞の機械的剪断と音波
破壊とを併用するとＶＺＶ収量が実質的に増加すること
が明らかである。

【００９９】実施例１０ ＭＲＣ−５細胞からの水痘生ワクチンの回収率を増加す
るためのＳＲＦＥ−２培地及び大豆脂質補充物の使用 ＭＲＣ−５細胞をＥＢＭＥ中の２５ｃｍ²のＴ型培養瓶
に接種し、３５℃で３日間インキュベートした。培地を
除去し、大豆脂質非添加または１：２００に希釈した大
豆脂質を添加した１２.５ｍｌの新しいＥＭＥＭ培地ま
たはＳＲＦＥ−２培地＋１０％のＦＣＳ、ネオマイシ
ン、グルタミンに交換した。培養物を３５℃で更に３日
間インキュベートした。次に培地を除去し、細胞に、Ｖ
ＺＶ感染ＭＲＣ−５細胞と１２.５ｍｌの２％ウシ胎仔
血清、ネオマイシン、グルタミンを含むＥＭＥＭまたは
ＳＲＦＥ−２とを与えた。培養条件の「ＳＲＦＥ−２」
は、細胞培養中及びウイルス培養中にＳＲＦＥ−２を与
えたことを示す。条件の「ＳＲＦＥ＋大豆」は、サンプ
ルに対して細胞培養中にＳＲＦＥ−２培地と１：２００
に希釈した大豆脂質とを与え、ウイルス培養中にＳＲＦ
Ｅ−２培地だけを与えたことを示す。培養４８時間後に
培地を除去し、細胞を５ｍｌのＰＢＳで４回洗浄し、
１.２ｍｌの安定剤中に掻取った。重複フラスコのサン
プルをプールし−７０℃で凍結させた。後に解凍後、細
胞を音波処理によって破壊し、遠心（１０００ｇで１０
分間）によって清澄化し、以後のウイルス感染力価アッ
セイに備えて上清を−７０℃で凍結させた。結果を図４
に示す。

【０１００】結論：ＥＭＥＭの代わりにＳＲＦＥ−２培
地を使用すると、生きた水痘ウイルスの回収率が２.５
倍に増加する。細胞培養中に大豆補充ＳＲＦＥ−２を使
用するとウイルス回収率が更に２.７倍増加し、これは
ＥＭＥＭウイルス増殖プロセスで得られた値の正味７倍
である。

【０１０１】実施例１１ ＶＺＶ抗原定量のためのコンペティティブＥＬＩＳＡ ＶＺＶプラークアッセイは時間がかかるので、インプロ
セスコントロールは特に難しい。高速ＶＺＶ抗原ＥＬＩ
ＳＡによれば、水痘生ワクチンの製造中のウイルス増殖
をモニターするためのＶＺＶ抗原量の測定が可能であ
る。更に、この試験は、清澄化し音波処理したワクチン
バルク中のＶＺＶ抗原量を算定するために使用でき、ま
た凍結乾燥ワクチン充填バイアル中の抗原を測定するこ
とも可能であろう。簡単に説明すると、このアッセイで
は、試験サンプルからのＶＺＶ抗原を抗ＶＺＶ血清と共
に溶液中でインキュベートする。残留する遊離抗体はＥ
ＬＩＳＡマイクロタイタープレートに固定されたＶＺＶ
抗原に結合する。プレートに結合し得る抗体の量は試験
サンプル中の抗原の量に反比例する。プレートに結合す
る抗体を酵素リンクした抗ヒト抗体及び分光光度法で定
量できる発色物質を生じる適当な基質との反応によって
定量する。

【０１０２】ＶＺＶ抗原ＥＬＩＳＡとＶＺＶプラークア
ッセイとは概して相関するデータを与えるであろうが、
ＶＺＶ抗原アッセイが非生存ＶＺＶ及び生存ＶＺＶの双
方を検出することに留意する必要がある。死ＶＺＶによ
って生じた免疫応答は、弱毒した生存ウイルスに対する
応答ほど有効であるとされておらず、ＶＺＶワクチンの
ウイルス接種量を決定するためにはプラークアッセイが
必須である。しかしながら、抗原アッセイはＶＺＶワク
チンレシピエントに投与される総抗原負荷の測定値を与
えるという点でやはり有効なアッセイである。

【０１０３】試験手順： （１）ＶＺＶ感染または非感染のＭＲＣ−５細胞に由来
の糖タンパク質（ｇｐｓ）をＥＬＩＳＡプレートにコー
トし、プレートに対する抗体の非特異的吸着を減少させ
るために１％のウシ血清アルブミン（分画Ｖ、＃Ａ−９
６４７、Ｓｉｇｍａ、０.１％ＮａＮ₃）をオーバーコー
トする。１列おきにＶＺＶまたは対照抗原をコートする
（即ち列Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧにＶＺＶ ｇｐをコートし、
列Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨに非感染ＭＲＣ−５ ｇｐ抗原をコ
ートする）。

【０１０４】（２）清澄化した（３２５０ｇ−分）試験
抗原を１２×７５ｍｍのチューブまたはマイクロチュー
ブに入れた安定剤に希釈する。標準ウイルス抗原調製物
（ドットブロットアッセイによる２６単位／ｍｌのＶＺ
Ｖ抗原）を１：１０に希釈し、次いで１：１.２５倍に
系列希釈して抗原濃度２.６、２.１、１.７、１.３、
１.１、０.９単位／ｍｌを与える。更に希釈して０.７
及び０.５単位／ｍｌの抗原濃度を与えてもよい。この
希釈系列を使用して、試験サンプル中の抗原量を測定す
るための標準曲線を作成する。

【０１０５】（３）ヒト抗ＶＺＶ血清を所望の最終希釈
度の２倍まで安定剤に希釈する。

【０１０６】（４）３００μｌの希釈抗原をマイクロチ
ューブに分注し、３００μｌの希釈抗ＶＺＶ血清と混合
し、３５℃で１５〜２２分間インキュベートする。対照
はヒト抗ＶＺＶ及び希釈剤（抗原非含有）を含む。

【０１０７】（５）各血清抗原混合物からの１００μｌ
のアリコートを、ＶＺＶ糖タンパク質（ＶＺＶ ｇｐ）
をコートした２つの重複ウェル及びＭＲＣ−５ ｇｐを
コートした２つのウェル（サンプルあたり４ウェル）に
添加する。（例えば、コラム１、列Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに
サンプル１を添加し、コラム２の列Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに
サンプル２を添加する、など）。

【０１０８】（６）（溶液中で抗原と複合体を形成しな
い）遊離抗体がプレートに固定されたウイルス抗原に結
合するようにプレートを３５℃で１５±１分間インキュ
ベートする。

【０１０９】（７）未結合抗体を洗浄によって除去し、
結合したヒト抗体を検出するためにアルカリホスファタ
ーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧをウェルに
導入する。

【０１１０】（８）３５℃で１５±１分間のインキュベ
ーション後、未結合コンジュゲートを洗浄によって除去
する。ジエタノールアミンバッファに溶解したｐ−ニト
ロフェニルリン酸塩基質と共に３５℃で１５分間インキ
ュベーションすることによって結合コンジュゲートを検
出する。

【０１１１】（９）３ＭのＮａＯＨを５０μｌ／ウェル
の量で添加して基質反応を終了させた後、マイクロプレ
ート分光光度計によって発色（４０５ｎｍのＯＤ）を定
量する。

【０１１２】試験値計算及び解釈： （１）ＶＺＶ及びＭＲＣ−５をコートした重複ウェルの
重複ＯＤ値を夫々平均する。実験は、種々のサンプル及
び希釈度でＭＲＣ−５のＯＤが一致していることを示し
た。従って、全プレートのＭＲＣ−５値を平均し、これ
を使用して非感染細胞抽出物に対する第１抗体またはコ
ンジュゲートの非特異的結合を補正する。ＭＲＣ−５
ＯＤの平均をＶＺＶ ＯＤの平均から夫々減算するとＶ
ＺＶ特異的ＯＤ（ΔＯＤ）値が得られる。

【０１１３】（２）抗原量を測定するための標準曲線の
作成：既知の抗原濃度（ＶＺＶ単位／ｍｌ）に対する標
準曲線ΔＯＤ値をプロットする。

【０１１４】データを適当な図形プログラムに入力し
（例えばＣｒｉｃｋｅｔグラフバージョン１.３、Ｃｒ
ｉｃｋｅｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐ
Ａ）、グラフの直線部分を識別し（少なくとも４つの点
を含まなければならない）、「直線近似式」（ｙ＝ａ＋
ｂｘ）を得る。

【０１１５】（３）試験サンプルの抗原量を計算する。
ａ及びｂの値を直線近似式によって与え、ｙ（ΔＯＤ）
は既知数である。残りの未知数、即ち抗原量を単位／ｍ
ｌで示すｘの値を計算し、サンプル希釈度によって補正
して非希釈サンプルの抗原濃度を得る。次にサンプル全
体の計算を行なう。

【０１１６】 サンプル 希釈度 ΔＯＤ 直線近似式による抗原量 希釈度補正後の抗原量 （単位／ｍｌ） （単位／ｍｌ） Ａ １：２ Ｙ Ｘ＝(ｙ−ａ)／ｂ (ｘ)＊(希釈率) 得られる抗原濃度は、標準曲線の直線状部分の内部のΔ
ＯＤ値を与える最小希釈サンプルで得られた濃度であ
る。

【０１１７】実施例１２ ＶＺＶ抗原ＥＬＩＳＡ及びＶＺＶ ＰＦＵ収量との比較 図１にＰＦＵ／ｍｌで示す収量を与えた実施例７の無細
胞ＶＺＶのサンプルを、実施例１１に記載したＶＺＶ抗
原ＥＬＩＳＡに従って検定した。このアッセイの結果を
図２に示す。

【０１１８】図１のデータによればＰＦＵ／ｍｌが減少
する９６時間後にもＶＺＶ抗原が増加を続けることが観
察される。また、ＳＲＦＥ−２と大豆とショ糖とを加え
た培地中のＶＺＶ抗原のレベルがＥＭＥＭ培地中の該抗
原のレベルのほぼ１６倍になることはないが（図２）、
無細胞の生存ＶＺＶのＰＦＵ／ｍｌは１６倍になる（図
１）。この比較から、感染７２時間後に生存ＶＺＶを維
持するためにはショ糖効果が極めて重要であると考えら
れる。

【０１１９】実施例１３ ＳＲＦＥ−２培地及び大豆脂質補充物を用いるＭＲＣ−
５細胞増殖の増進 ２５ｃｍ²のＴ型培養瓶に、１２.５ｍｌのＥＢＭＥ、１
０％のＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのネオマイシン、及び２
ｍＭのＬ−グルタミン中のＭＲＣ−５細胞を５３,００
０細胞／ｍｌの濃度で接種し、３５℃でインキュベート
した。２〜３日後、培地を除去し、１０％のＦＣＳ、５
０μｇ／ｍｌのネオマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン
及び種々の量の大豆脂質を含有する１２.５ｍｌの新し
いＳＲＦＥ−２培地に交換した（シフト２）。非希釈の
大豆脂質は２０ｍｇ／ｍｌの脂質と１００ｍｇ／ｍｌの
ウシ血清アルブミンとを含有していた。

【０１２０】初期細胞移植の６日後に培地を除去し、種
々の量の大豆脂質を補充した２％ＦＣＳ、５０μ／ｍｌ
のネオマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１２．
５ｍｌのＥＭＥＭまたはＳＲＦＥ−２培地中に交換し
た。トリプシン処理によって選択培養瓶から細胞を解離
させ、血球計によって細胞をカウントした。３５℃で更
に２日間培養した後で残留培養物の細胞カウント数を定
量した。結果を表５にまとめる。

【０１２１】

【表５】

【０１２２】培地シフト１＝細胞移植の２〜３日後に１
０％ＦＣＳを補充した指示培地に交換した。

【０１２３】培地シフト２＝細胞移植の６日後に２％Ｆ
ＣＳを補充した指示培地に交換した。

【０１２４】ＮＤ＝測定せず 結論：脂質補充物非添加のＳＲＦＥ−２培地を使用した
ときの細胞数はＥＭＥＭ単独使用のときに比べて約２倍
に増加した。培地に大豆脂質を補充することによって細
胞収量は量依存的に更に増加した。ＳＲＦＥ−２培地と
約２００〜４００μｇ／ｍｌの脂質の併用によって最大
の細胞収量が得られた。

【０１２５】実施例１４ 本発明方法によるＷＩ−３８細胞の増殖 ２５ｃｍ²のＴ型培養瓶に、１２.５ｍｌの容量のＥＢＭ
Ｅ、１０％のＦＣＳ、５０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン、
２ｍＭのＬ−グルタミン中に５３,０００細胞／ｍｌの
濃度でＷＩ−３８細胞を接種し、３５℃でインキュベー
トした。２日後、培地を除去し、５０ｍｇ／ｍｌのネオ
マイシンと２ｍＭのＬ−グルタミンと１：２００に希釈
した大豆脂質とを補充した１２.５ｍｌのＳＲＦＥ−２
培地に交換した。対照には脂質補充物を含まない培地を
導入した。３５℃で５日間培養した後、培地を除去し、
トリプシン処理によって細胞を培養瓶から解離させ、血
球計でカウントした。残りの培養瓶を更に３日間維持し
た後で細胞をカウントした。結果を以下にまとめる：

【０１２６】

【表６】

【０１２７】結論：富化培地に大豆脂質を補充するとＷ
Ｉ−３８細胞の収量は約２倍に増加した。従ってＶＺＶ
の産生にこの細胞系を使用するとＭＲＣ−５細胞を使用
した場合と同様の結果が得られると予想される。

【０１２８】実施例１５ ＭＲＣ−５細胞の増殖の増進を評価する手順 ２５ｃｍ²のＴ型培養瓶に、１２.５ｍｌのアール塩補充
イーグルの基礎培地（ＥＢＭＥ）、１０％のＦＣＳ、５
０μｇ／ｍｌの硫酸ネオマイシン（ｎｅｏ）及び２ｍＭ
のグルタミン（Ｇｌｎ）中に約５３,０００細胞／ｍｌ
の濃度でＭＲＣ−５細胞を移植する。培養物を３５℃で
３日間インキュベートする。このときまでに、細胞単層
は典型的に約５０〜７５％集密である。培地を除去し、
１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのｎｅｏ及び２ｍＭのＧ
ｌｎ±大豆またはその他の脂質を含む１０〜１２.５ｍ
ｌのＳＲＦＥ−２培地に交換し、培養物を３５℃でイン
キュベートする。細胞をトリプシン処理（２.５ｍｌの
０.２５％クエン酸トリプシン溶液）し、血球計でカウ
ントすることによって種々の時点の細胞カウント数を定
量する。０.２％トリパンブルーの細胞排除によって細
胞の生存率をモニターする。細胞カウント数を使用し
て、細胞濃度を推定し、次いで細胞浮遊液の総量に対し
て補正し、培養瓶あたりの細胞収量を得る。いくつかの
実験では、培養物を培地交換の３〜４日後に２％ＦＣＳ
培地にシフトし、更に２日間のインキュベーション後に
細胞カウント数を定量する。

【０１２９】実施例１６ 脂質補充物に対する培養細胞の長期接触の効果 ＭＲＣ−５細胞をＴ２５型培養瓶に移植し、３日後にフ
ィードし（第１リフィード）、更に３日間の増殖後に細
胞カウント数を定量した。脂質を加えるかまたは加えず
してリフィードすることによって（第２リフィード）Ｔ
２５培養瓶の増殖を更に継続し、更に２日間増殖させ
た。細胞をトリプシンで回収した。ＥＢＭＥに移植しＥ
ＭＥＭで増殖させた細胞の収量は２.６×１０⁶であった
が、ＳＲＦＥ−２と１：１００に希釈した大豆脂質とを
混用した培地で増殖させた細胞の収量は６.６×１０⁶及
び７.７×１０⁶に達した。更に２日間増殖させた細胞
は、ＥＢＭＥ／ＥＭＥＭ増殖細胞の場合は収量２.７６
×１０⁶であったが、大豆脂質補充物非添加のＥＢＭＥ
／ＳＲＦＥ−２の場合はＴ２５培養瓶あたりの収量が
９．２×１０^６及び７.８８×１０⁶であった。ＥＢＭＥ
／ＳＲＦＥ−２＋１：１００大豆脂質で増殖した細胞の
収量はわずかに２.４８及び２.２８×１０⁶であった。
このデータは、高脂質濃度に長期接触させると（第２リ
フィード後約５日間）、以後の細胞収量が減少するこ
と、その理由は細胞死に起因すると推定されることを示
す。従って一般には、脂質補給物非添加の富化培地を細
胞にリフィードする。脂質はウイルス増殖またはウイル
ス急襲の存在下の細胞生存の継続に対して有毒になるか
もしれないので、このような脂質非添加富化培地に切換
える手順は、ウイルス増殖期を開始させるときに特に重
要である。

【０１３０】実施例１７ 細胞増殖に対する富化培地及び最少培地の種々の脂質濃
度の効果 ＭＲＣ−５細胞の培養に関する実施例１６の記載と本質
的に同じ手順及びリフィード／細胞定量スケジュールに
従って、以下の細胞収量が得られた（注：培地記述後の
＋及び−符号は第２のリフィード培地中の指定量の大豆
脂質（ｓｌ.）ｍｇ／ｍｌの補給の有無を示す）：

【０１３１】

【表７】

【０１３２】上記にまとめたデータは、高脂質濃度に対
する細胞の長期接触が極めて有利ではないという実施例
１６で得られた観察とほぼ符合するが、このデータでは
実施例１６で観察された顕著な毒作用が減少している。
より低濃度の脂質に対する細胞のより長期間の接触は、
より低毒性であり、増殖表面１ｃｍ²あたりの細胞収量
が増加するという利点が得られる。

【０１３３】実施例１８ 細胞収量に対するウシ胎仔血清濃度の効果 この実験では、脂質補充物の存在下の２％または１０％
のウシ胎仔血清の添加を試験した。ＭＲＣ−５細胞をＥ
ＢＭＥに移植し、３日後に種々の量の大豆脂質を補充し
たＳＲＦＥ−２をリフィードし、２日後に第１リフィー
ドで与えた濃度と同じ濃度の脂質を含むＳＲＦＥ−２を
リフィードした。１０％ＦＣＳ中の細胞収量は、０.
１、０.２及び０.４ｍｇ／ｍｌの脂質を夫々補充した培
養物について夫々９.５、１１.３、１２.２×１０⁶であ
った。２％ＦＣＳを与えたとき、細胞収量は夫々、６.
５、８.８及び３.２×１０⁶であった。この実験は、Ｆ
ＣＳ補充は脂質補充と同様に細胞増殖に有利な効果を与
えることを示す。高脂質濃度が細胞に与える有毒作用は
十分なＦＣＳの補充によって常に弱化される。

【０１３４】実施例１９ ＭＲＣ−５細胞の増殖に対する種々の脂質補充物の効果 ＥＢＭＥ中のＭＲＣ−５細胞をＴ２５培養瓶に移植し
た。３日目に、１０％ＦＣＳを含有し種々の脂質を補充
したＳＲＦＥ−２培地を細胞にリフィードした。Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ大豆脂質、成ウシ血
清に由来のＳｉｇｍａコレステロール富化脂質またはＭ
ｉｌｅｓ／Ｐｅｎｔｅｘ ＥＸ−ＣＹＴＥＩまたはＶｅ
ｒｙ Ｌｏｗ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎウシリポプロテイン
を指定濃度で使用した。リフィードのときの細胞カウン
ト数は１.１９×１０⁶であった。５日後、細胞をカウン
トした。ＥＭＥＭ中の細胞カウント数は２.９７×１０⁶
であった。ＳＲＦＥ−２またはＳＲＦＥ−２＋０.４ｍ
ｇ／ｍｌ、０.２ｍｇ／ｍｌ及び０.１ｍｇ／ｍｌの大豆
脂質中の細胞カウント数は夫々、４.８３、１０.４４、
８.６７及び８.０４×１０⁶であった。１：５０、１：
１００、１：２００のＥＸ−ＣＹＴＥ Ｉは夫々、５.
３７、４.８０及び４.７４×１０⁶の細胞を生じた。
１：２５、１：５０、１：１００のＥＸ−ＣＹＴＥ Ｖ
ＬＥは夫々、５.４９、７.２３及び７.９２×１０⁶の細
胞を生じた。１：２５、１：５０、１：１００のＳｉｇ
ｍａ高コレステロール脂質は夫々、６.８７、７.５６及
び７.６５×１０⁶の細胞を生じた。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ大豆脂質は最大の細胞収量増進を
示したが、ＥＸ−ＣＹＴＥ ＶＬＥ及びＳｉｇｍａ脂質
もほぼ同様に有効であった。従って増進効果は大豆脂質
に固有ではない。

【０１３５】実施例２０ 高濃度大豆脂質を用いたＭＲＣ−５細胞増殖の増進 実施例１３と同様にＭＲＣ−５細胞を２５ｃｍ²の培養
瓶に播種し、３日目及び６日目にリフィードした。６日
目のフラスコあたりの細胞収量は、ＥＢＭＥ／ＥＭＥ
Ｍ、ＳＲＦＥ−２＋１／１００大豆脂質またはＳＲＦＥ
−２＋１／５０大豆脂質培養物で夫々、４.３×１０⁶、
９.７×１０⁶及び１１.７×１０⁶であった。細胞生存率
は（トリパンブルー排除から判断すると）、すべての培
養物で＞９９％であった。細胞に培地±大豆脂質をリフ
ィードし、更に２日間インキュベートし、細胞収量を定
量した。これらの培養物についてフラスコあたりの細胞
回収量は重複ＥＢＭＥ／ＥＭＥＭ培養物では２.９及び
３.５×１０⁶、同じ培地にＳＲＦＥ−２＋１／５０大豆
脂質をリフィードした場合には１１.６５×１０⁶、ＳＲ
ＦＥ−２＋１／５０大豆脂質培養物に大豆脂質非添加の
ＳＲＦＥ−２培地をリフィードした場合（重複）には１
３.６９及び１１.０９×１０⁶、ＳＲＦＥ−２＋１／１
００大豆脂質に同じ培地をリフィードした場合には９.
６６×１０⁶、脂質非添加のＳＲＦＥ−２をリフィード
した場合には重複培養物で８.５１及び６.２７×１０⁶
が得られた。

【０１３６】この実験より、ＭＲＣ−５細胞の収量が大
豆脂質の増量に伴って増加することは明らかである。最
大細胞収量は希釈度１／５０の大豆脂質（試験最大濃
度）で得られた。第２のリフィード培地に脂質を添加す
ると細胞収量はある程度増加した。しかしながら、デー
タは、第１リフィード培地に１／５０の脂質を使用した
ときに最大細胞収量が得られることを示す。従って脂質
補充物を第２リフィード培地から除去し得る。高濃度脂
質はウイルス産生に不利なのでウイルス増殖中には脂質
を除去するのが望ましい。

【図面の簡単な説明】

【図１】ショ糖補充培地におけるＶＺＶ ＰＦＵの収量
を示すグラフである。

【図２】無細胞ＶＺＶ抗原の収量を示すグラフである。

【図３】−２０℃または４℃におけるＳＰＧＡ安定剤中
のＶＺＶの安定性を示すグラフである。

【図４】種々の培地を用いて得られたＶＺＶ ＰＦＵの
収量を示す。

【図５】導入される細胞関連ＭＯＩが無細胞ＶＺＶ収量
にあたえた効果を示すグラフである。

フロントページの続き (72)発明者 デイビツド・エル・クラー アメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 19446、ランズデイル、ブランズウイツ ク・コート・213 (72)発明者 ポール・エイ・フリードマン アメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 19010、ローズモント、グレイト・スプ リング・ロード・403

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水痘帯状庖疹ウイルス（ＶＺＶ）の生ワ
   クチンの製造方法であって、 （ａ） ヒト二倍体細胞から選択されたＶＺＶ感染感受
   性細胞を、高度の細胞複製を達成するに十分な高栄養の
   条件下で、集密的単層培養物となるまで培養し、非代謝
   性二糖を供給するステップと、 （ｂ） ステップ（ａ）で培養した細胞の集密時点にで
   きるだけ近い時期にＶＺＶ感染細胞を実用上可能な限り
   高い感染多重度で感染させるステップと、 （ｃ） ＶＺＶ感染培養物を高栄養状態に２２ないし９
   ６時間維持して感染性ＶＺＶ産生物が最大となったもの
   を採取するステップと、 （ｄ） ＶＺＶ感染細胞を採取する前に、塩化アンモニ
   ウムまたはクロロキンのようなリソソーム向性物質を任
   意に含有する生理的溶液でＶＺＶ感染培養物を洗浄する
   ステップと、 （ｅ） ＶＺＶ感染細胞を最小量の安定化溶液に採取
   し、直ちに細胞を破壊するかまたは後で破壊するために
   細胞を凍結するステップと、 （ｆ） ＶＺＶ感染細胞を細胞会合ＶＺＶが最適に解放
   されるまで破壊し、細胞性破片を除去して無細胞ＶＺＶ
   調製物を提供するステップとから成る方法。
2. 【請求項２】 （ａ） １．細胞移植期と、 ２．実用的な限り多量の最少培地またはより少量の高栄
   養培地を用いる細胞増殖期と、 ３．細胞を無毒性非代謝性二糖に接触させる前感染期と
   から成る培養ステップとから成るＶＺＶ感染感受性細胞
   を集密状態まで培養する培養ステップと、 （ｂ） ステップ（ａ）で培養した細胞の集密時点にで
   きるだけ近い時期に弱毒ＶＺＶ感染細胞を実用的な限り
   高い感染多重度で感染させるステップと、 （ｃ） ＶＺＶ感染培養物を多量の最少培地またはより
   少量の富化培地にＶＺＶ産生ピーク点まで２２ないし９
   ６時間維持するステップと、 （ｄ） 採取に先立ってＶＺＶ感染培養物を、リソソー
   ム向性物質を任意に含有する生理的溶液で洗浄するステ
   ップと、 （ｅ） １．液体を除去し、 ２．最小量の安定剤溶液を添加し、 ３．ＶＺＶ感染細胞を掻取るかまたは化学的に解放し、 ４．任意に、解放したＶＺＶ感染細胞を−６５℃以下で
   凍結することによってＶＺＶ感染細胞を採取するステッ
   プと、 （ｆ） 細胞定着ＶＺＶを最適に放出させるために解放
   されたＶＺＶ感染細胞を破壊し、細胞性破片を除去し、
   任意に無細胞ＶＺＶを凍結乾燥するかまたは液体凍結形
   態で保存するステップとを含むことを特徴とする水痘帯
   状庖疹ウイルスの弱毒無細胞生ワクチンの製造方法。
3. 【請求項３】 ＶＺＶ感染感受性細胞がＭＲＣ−５細胞
   であり、弱毒ＶＺＶが水痘帯状庖疹ウイルスのＯｋａ株
   であり、培養温度が３０ないし３７℃であり、二糖が２
   ０ないし６０ｍＭで供給されるショ糖であり、培養温度
   が３４．５ないし３５．５℃であり、ＭＯＩが１：２５
   ないし１：６２５であり、リソソーム向性物質が、２０
   ないし５０ｍＭで与えられる塩化アンモニウムまたはお
   およそ２３０μＭで与えられるクロロキンであることを
   特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 高栄養培地が０．０２ないし０．４ｍｇ
   ／ｍｌの大豆脂質を任意に補充したＳＲＦＥ−２であ
   り、ウイルスが音波処理またはダウンスホモジナイゼー
   ションまたはその双方によって細胞から遊離されること
   を特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 （ａ） １．ＥＢＭＥ中の細胞移植期
   と、 ２．細胞移植の約３日後に開始される０．１５ないし
   ０．２５ｍｇ／ｍｌの大豆脂質を補充したＳＲＦＥ−２
   中の細胞増殖期と、 ３．ＭＲＣ−５細胞を２０〜５０ｍＭのショ糖に２４な
   いし９６時間接触させる前感染期とから成るＭＲＣ−５
   細胞を集密状態まで培養するステップと、 （ｂ） ステップ（ａ）で培養した細胞に、集密時点に
   できるだけ近い時期に弱毒ＶＺＶ感染ＭＲＣ−５細胞を
   実用的な限り高い感染多重度で感染させるステップと、 （ｃ） ＶＺＶ感染培養物を３７ないし９６時間維持
   し、ＶＺＶ産生物が最大となったものを採取するステッ
   プと、 （ｄ） １ないし１００ｍＭのＮＨ_４Ｃｌまたはクロロ
   キンを任意に補充したリン酸塩緩衝生理食塩水で培養物
   を洗浄するステップと、 （ｅ） １．液体を除去し、 ２．１ないし１００ｍＭのＮＨ_４Ｃｌまたはおおよそ２
   ３０μＭのクロロキンを任意に含有する最小量の安定化
   剤を添加し、 ３．細胞を掻取るかまたは細胞を化学的に解放し、 ４．解放したＶＺＶ感染細胞を−６５℃以下で任意に凍
   結することによってＶＺＶ感染ＭＲＣ−５細胞を採取
   し、 （ｆ） １．ダウンスホモジナイゼーション、２．破片
   のペレット化及び上清の保存、３．ペレットの音波処理
   及び再ペレット化、４．ステップ（ｆ）−２及び（ｆ）
   −３で得られた上清の混合によって解放されたＶＺＶ感
   染細胞を破壊するステップと、 （ｇ） ステップ（ｆ）の産生物を安定剤に希釈し、後
   で使用するときに用量あたり１０００ＰＦＵ以上が得ら
   れるような凍結乾燥及び４℃以下保存用の単位用量で産
   生物を充填するステップから成る無細胞水痘帯状庖疹ウ
   イルスの弱毒生ワクチンの製造方法。