SE465678B - Material av svampcellvaeggar, foerfarande foer dess framstaellning samt anvaendning daerav - Google Patents

Description

465 678 med 2%-ig ättiksyra, medan det ättiksyraolösliga materialet kastades (W.I. McGaren, etc., Process Biochemistry, lå, 88-90, 1984).

Enligt föreliggande uppfinning har det nu visat sig, att material av svampcellväggar, som är vattenolösligt både i sur och alkalisk miljö och som har en positiv Zeta-potential vid ett pH-värde av 7, beroende på närvaro av hexosaminer i cellväggarna, har utmärkta flockuleringsegenskaper. Zeta- potentialen bestämmes på cellväggmaterial med en partikel- storlek mindre än 20 Pm i en Malvern Zetasizer. I det fall att cellväggmaterialet enligt uppfinningen inte föreligger i form av små partiklar, måste materialet sönderdelas innan Zeta-potentialen kan bestämmas. Det har fortfarande svamp- liknande struktur och innehåller stora kvantiteter glykos- aminenheter. Cellväggmaterialets förmåga att flockulera t ex proteiner, såsom bovinserumalbumin, och nukleinsyror, såsom ribonukleinsyra, är mycket högre än flockuleringsförmågan hos chitosan. Cellväggmaterialet kan lätt regenereras genom att ättiksyra sättes till flockarna av cellväggmaterialet och proteinet. När den flockulerade vätskans pH-värde sänkes med ättiksyra, försvinner flockarna och proteinet upplöses.

Cellväggmaterialet kan återvinnas genom filtrering eller centrifugering.

Materialet enligt uppfinningen kan användas som en selektiv flockulant och/eller jonbytare i processer för återvinning eller avlägsnande av negativt laddade produkter, såsom kemiska föreningar och polymerer, t ex proteiner såsom enzymer och hormoner, samt nukleinsyror, från vattenbaserade vätskor. Dessutom kan avloppsvatten, såsom avloppsvatten från slakthus, jäst- och margarinfabriker, fiskinläggningsindustri och massa- och papperindustri, fördelaktigt rengöras genom att använda cellväggmaterialet som flockulant.

Materialet av svampcellväggar enligt uppfinningen framställes från en svamp, som innehåller chitin och chitosan genom en process, enligt vilken svampen underkastas extrak- tion för att avlägsna lipider, proteiner, nukleinsyror och chitosan. Normalt sönderdelas svampen även fysikaliskt för 'J 465 678 att underlätta extraktionen. Enligt ett lämpligt förfarande underkastas myceliet a) fysikalisk sönderdelning och/eller behandling med ett organiskt lösningsmedel för att avlägsna lipider b) behandling med alkali eller ett enzym för att avlägsna protein och nukleinsyra och, om så önskas, behandling med en syra för att avlägsna chitosan.

I förfarandet enligt uppfinningen kan varje svamp, vars cellväggar innehåller chitin eller chitosan, användas.

Exempel pà lämpliga svampar är phylum Zygomycota med släktena Absidia, Mucor och Rhizopus, liksom phylum Dikaryomycota med släktena Aspergillus, Fusarium och Penicilium.

Dessa svampar kan odlas i ett vätskemedium innehållande exempelvis en kvävekälla, en kolkälla och vitaminer. Exempel på kvävekällor är oorganiska produkter såsom (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4N03 eller organiska produkter, såsom urea, pepton, sojabönsprotein och majslakvätska. Jästextrakt kan tillsättas som vitaminförràd. Lämplig kolkälla är kolhydrater, såsom glykos, laktos, maltos, sukros, stärkelse och molass.

Odlingsbetingelserna är inte kritiska utan konventionella metoder kan tillämpas.

Den fysiskaliska sönderdelningen kan utföras genom någon konventionell metod, såsom behandling med ljud, malning i kvarn, sandvibrering och behandling vid höga skjuvhastig- heter, men företrädesvis utföres sönderdelningen genom frys- pressning. De sönderdelade cellväggarna har företrädesvis en partikelstorlek mindre än 20 Pm. Efter sönderdelningen kan det intracellära protoplasmamaterialet tvättas bort med vatten.

De sönderdelade cellväggarna underkastas företrädesvis extraktion med ett organiskt lösningsmedel, såsom metanol, etanol, hexan, kloroform, aceton och bensen för att avlägsna lipider. Bland lösningsmedlen föredrages etanol.

Cellväggarna, från vilka lipider avlägsnats, behandlas därefter med alkali eller enzymer för att avlägsna protein och nukleinsyra. Lämpliga alkalilösningar är vattenlösningar av KOH, NaOH, Ca(OH)2 och NH4OH. Enzymet proteinas kan 465 678; användas för att avlägsna protein och enzymet nukleas för att avlägsna nukleinsyra. Koncentrationen av alkali beror på den svampart som användes. Företrädesvis är koncentrationen 0,2 N-2,0 N NaOH för zygomyceter och ca 8 N för ascomyceter.

När cellväggarna inte underkastas fysikalisk sönderdelning eller endast en mild sönderdelning, som resulterar i en partikelstorlek större än 20 pm, bör behandlingen med alkali utföras med en relativt stark alkalilösning, såsom 1,0 N NaOH eller högre för zygomyceter.

Borttagandet av chitosan från cellväggar, från vilka lipider, proteiner och nukleinsyra avlägsnats, är valfritt men är ett föredraget steg i processen för framställning av materialet enligt uppfinningen. Genom syrabehandling upplöses fri chitosan och avlägsnas från cellväggen. Ättiksyra är den föredragna syran men andra syror, såsom utspädd saltsyra och myrsyra, kan även användas. Avlägsnat chitosan kan utfällas genom justering av pH-värdet till 9,0.

Det cellväggmaterial, som framställes med förfarandet enligt uppfinningen, innehåller hexosaminer och uppvisar en positiv Zeta-potential vid surt och neutralt pH-värde och företrädesvis är Zeta-potentialen över 20 mV vid pH 6.

Vid pH 7 är de fysikaliskt sönderdelade cellväggarna liksom de cellväggar, från vilket lipider avlägsnats, nega- tivt laddade i vatten. Efter alkaliextraktionen liksom efter den efterföljande extraktionen. med ättiksyra uppvisar det sönderdelade cellväggmaterialet positiv Zeta-potential (positiv laddning). Vanligtvis har den sönderdelade cell- väggen enligt uppfinningen en genomsnittlig partikelstorlek av mindre än 20 pm.

Cellväggmaterialet enligt uppfinningen har en utmärkt förmåga att flockulera bovinserumalbumin (BSA) vid ett pH-värde från 4-7 och jäst RNA vid ett pH-värde från 3,5-6,2.

Avloppsvatten från slakthus och jäst-, margarin- och fisk- inläggningsfabriker kan lätt renas med hjälp av cellvägg- material vid pH 6.

Föreliggande uppfinning illustreras ytterligare avd följande exempel. 465 678 Exempel 1 Fem olika zygomycetesstammar och tvâ olika ascomycetes- stammar enligt Tabell l nedan odlades i ett medium inne- hållande glykos, jästextrakt och mineralsalter. Efter till- växt filtrerades myceliet av pà ett nylonnät och sönderdelades i en X-press. Det sönderdelade myceliet tvätta- des med vatten och extraherades därefter med varm etanol, två gånger med varm lN NaOH för zygomyceter och 8 Na0H för ascomyceter, tvá gånger med varmt vatten och slutligen med 0,2 N ättiksyra, varvid varje extraktionssteg följdes av filtering. Det erhållna cellväggmaterialet undersöktes med avseende pà hexosaminhalt enligt en modifierad Elson-Morgan- metod (George C. Chen etc. Appl. Envir. Microbiol., gg, 13-16, 1983). Dessutom bestämdes dess Zeta-potential (Malvern Zetasizer II, Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire WR14 IAQ, England). De erhållna värdena liksom utbytet av cellväggmaterial och chitosan visas i Tabell 2 nedan. Större delen av cellväggmaterialet hade en partikel- storlek av 5-10 pm.

Tabell 1 Absidia coerulea IMI 38500 Mucor sp. (kinesiskt isolat) Mucor rouxii ATCC 24905 Rhizopus oligosporus MUCL 18813 Rhizopus oryzae CBS 112.07 Aspergillus niger CCUG sp.

Fusarium poae CCUG 22425 GJUZIIIIZIUOUJ ATCC = American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.

CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Julianalaan 67a, 2628 BC Delft, Netherlands.

CCUG = Culture Collection, University of Göteborg, Guldhedsgatan 10, S-413 46 Göteborg, Sweden.

IMI = Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England. 465 678 MUCL = Mycotheque de l'Universitê Catholique de Louvain, Place Croix du Sud 3, Bte 8, 1348 Lourain-la-Neuve, Belgium.

Tabell 2 Stam A B C D E F G (se Tabell 1) Utbyte cellvägg- material, viktprocent 10.8 9.59 8.11 8.82 7.08 9.03 15.9 Utbyte chitosan, viktprocent 10.2 5.61 2.97 7.77 11.04 1.97 0.32 Hexosamin i cell- väggmaterial, viktprocent 60.0 66.5 52.6 50.5 59.4 13.8 38.1 Zeta-potential, mV pH 7.0 18.4 9.2 14.5 6.8 7.6 13.6 18.7 pH 6.0 31.3 30.0 24.9 25.8 28.0 25.1 40.0 pH 4.0 78.0 42.8 64.4 31.2 45.0 49.0 59.2 Isoelektrisk punkt 7.8 7.3 7.5 7.6 7.4 8.0 8.5 Som jämförelse framställdes ett primärt cellväggmaterial från stammen B och E genom sönderdelning och grundlig tvätt- ning av de sönderdelade cellväggarna i vatten. En del av det sönderdelade cellväggmaterialet extraherades med varm etanol både det avlipiderade cellväggmaterialet och det primära cellvägg- för att avlägsna lipider.

Zeta-potentialen hos materialet mättes. Följande resultat erhölls.

Tabell 3 Zeta-potential, mV Stam B Stam E Primär cellvägg pH 4 - 11.7 - 12.7 Avlipiderad cellvägg " - 16.1 - 14.7 Primär cellvägg pH 6 - 60.2 - 35.0 Avlipiderad cellvägg “ - 37.7 - 27.3 465 678 Av resultaten är det uppenbart att det primära cell- väggmaterialet vid ett pH-värde över 4 uppvisar negativa Zeta-potentialer, medan cellväggmaterial framställda enligt föreliggande uppfinning är positivt laddade.

Ytterligare en jämförande test genomfördes, där mycelium behandlade i enlighet med W I McGaren, Biochemistry, 12, 88-90, 1984. Efter blandare av märket Waring mättes Zeta-potentialen och befanns etc., Process sönderdelning i en vara negativ vid pH 7,0.

Exempel 2 Cellväggmaterial i en mängd av 3,6 mg räknat på torr- (6 mg/ml) tillsattes med pipett i ett 10 ml teströr. Vatten tillsattes i en sådan vikten och 1 ml bovinserumalbumin BSA mängd, att suspensionens volym efter pH-justering till ett pH-värde av 6 blev 6 ml. Den slutliga BSA-koncentrationen var 1 mg/ml och cellväggmaterialets halt var 600 ppm. När det positivt laddade cellväggmaterialet från testerna i Exempel l blandades med BSA, uppträdde omedelbart flockulering och aggregatbildning. Ingen flockulering eller aggregatbildning ägde rum, när negativt laddat primärt cellväggmaterial och avlipiderat cellmaterial från jämförelsetesterna i Exempel 1 användes i stället för det positivt laddade cellväggmate- rialet. Jämförelsetester med chitosan utfördes också. Flock- ningsförmågan bestämdes med hjälp av UV-absorbtion vid 278 nm och beräknades på följande sätt: Flockulerings- ljusadsorption (supernatant) (BSA-kontroll) förmåga (%) = 100 - x 100 ljusadsorption Följande resultat erhölls.

"Mmmm 465 678 Tabell 4 ëvamp Flockningsförmåga % BSA A1/ 97 B 95 C 99 D 96 E 95 F 91 G 90 H2/ 77 Chitosan3/ 58 Chitosan4/ 18 1/ Bokstäverna A-G hänför sig till Tabell 1. 2/ Penicillium frequentans CCUG sp. 3/ Maximal förmåga vid en koncentration av 50-100 ppm. 4/ Maximal förmåga vid en koncentration av ca 300 ppm.

Av testerna är det uppenbart, att cellväggmaterialen enligt uppfinningen har en utmärkt BSA-flockulerande förmåga och att de är överlägsna chitosan i detta avseende.

Exempel 3 Rhizopus oryzae_ CBS 112.07 odlades och skördades på samma sätt som i. Exempel 1. Myceliet tvättades och extra- herades direkt med varm etanol i tre timmar. Efter torkning erhölls ett nwcelium, från vilket lipider avlägsnats, och 15 g av detta behandlades med NaOH och ättiksyra i allt väsentligt på samma sätt som i Exempel 1, men koncentrationen av NaOH var 0,2 N. Efter tvättning med vatten, suspenderades det alkalibehandlade myceliet i 0,2 N ättiksyra och sönder- delades under höga skjuvhastigheter (Ultra Turrax; Janke & Kunkel, Staufen, Västtyskland) under en minut, vilket gav 300 ml av 4,12 mg/ml bioflockulant. Efter centrifugering och pH-justering till 9,0 av den vattenhaltiga flytande fasen erhölls chitosan i en mängd av 7,65 viktprocent av utgångs- 465 678 produkten. Utbytet av cellväggmaterial enligt uppfinningen var 6,77 i viktprocent. Flockulering av BSA utfördes som i Exempel 2 vid olika koncentrationer av cellväggbioflocku- från Rhizopus CBS 112.07. De erhållna lanten oryzae resultaten visas i Tabell 5.

Tabell 5 Cellväggmaterial, ppm 100 200 400 600 800 Flockulering, % BSA 38 65 95 95 94 Exempel 4 Ribonukleinsyralösning (RNA) (renhet 78%, 0,05% NH4OH och 10% NACl) framställt från jäst tillsattes i en mängd av 1 ml tillsammans med 2,75 ml cellväggmaterial (1,6 mg/ml) framställd från Rhizopus oryzae CBS 112.07 enligt Exempel 1 och 0,1 ml 2 N ättiksyra i testtuber. pH-värdena av 0,1 N NaOH.

Flockuleringsförmågan (RNA) detekterades genom UV-absorbans vid 260 nm efter hydrolys med 0,5 N perklorsyra vid 70OC (S. Ohla et al, biology 22, p 415-421, 1971). Följande resultat erhölls. 0,5 mg/ml i blandningarna justerades genom tillsats av bestämdes. Ribonukleinsyran Applied Micro- Tabell 8 pH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.2 Flockulering, % RNA 89 94 95 97 97 97 Av resultaten är det uppenbart att cellväggmaterialet hade en utmärkt flockuleringsförmåga avseende RNA. Inom vida koncentrationsomráden flockuleras RNA inte av' chitosan vid ovan angivna pH-värden.

Exempel 5 Flockulering av BSA med en cellväggbioflockulant ut- fördes på samma sätt som i Exempel 2 vid pH 6,0. Cellvägg- flockulanterna, Mucor sp. (kinesiskt isolat) och Rhizopus 465 678 1° oryzae CBS 112.07 regenererades tre gånger som följer.

Flockarna av BSA och bioflockulant centrifugerades och återsuspenderades i 5 ml 0,2 N HAc, omskakades häftigt under 20 minuter, centrifugerades vid 4000 varv per minut under 10 minuter och àtersuspenderades i. 5 ml 0,2 N HAc, och omska- kades åter under en minut. Efter centifugering tvättades sedimentet två gånger med 10 ml vatten och centrifugerades slutligen vid 4000 varv per minut i 15 minuter. Den regene- rade cellväggbioflockulanten återanvändas för att flockulera BSA.

Tabell 9 Regenererad cellväggbioflockulant.

Flockuleringsbetingelser: BSA 1 mg/ml, cellväggbioflockulant 1,2 mg/ml, pH 6,0.

Cellvägg- Antal användningar Flockulering, bioflockulant % BSA Mucor sp. (kinesiskt isolat) 1 95.1 2 98.6 3 99.1 4 99.7 Rhizopus oryzae CBS 112.07 95.2 97.2 98.5 98.6 vb-UJND-J Av resultaten är det uppenbart att flockuleringsförmàgan inte påverkades negativt av regeneringen.

Exempel 6 Avloppsvatten från en jästfabrik, en margarinfabrik, ett slakthus och en fiskinläggningsfabrik renades med cellvägg- bioflockulanter. Cellväggbioflockulantsuspensionen av Rhizopus oryzae CBS 112.07 eller Mucor sp. (kinesiskt isolat) 11 465 678 framställdes på samma sätt som i Exempel 1. Flockulant- suspensionerna tillsattes till 50 ml vattenprover under 20 sekunder med hög omrörningshastighet till en slutvolym av 60 ml (100 ml med vatten från fiskinläggningsfabriken). pH-värdet justerades till 6,0-6,2 med NaOH eller HC1 och proverna omrördes långsamt under två minuter. Proverna lämnades i 75 minuter för sedimentering vattenprovet från fiskinläggningsfabriken), varefter 25 ml av den översta delen sögs av' med en pipett för grumlighets- (180 minuter för mätningar. Resultaten av reningen av avloppsvattnen, angivna som kvarvarande grumlighet, anges i nedanstående tabell.

Tabell 10 Flockulant Grumlighet Kvarvarande grumlighet (FTU) Avlopps- (FTU) Mucor sp. Rhizopus oryzae vatten Kontroll mg/l mg/l från 50 100 400 50 100 400 Jästfabrik 23 21 18 7 20 16 8 Margarinfabrik 51 27 18 10 18 6 10 Slakthus 42 17 12 9 11 10 11 Fiskinläggnings- fabrik -* 90 27 17 29 22 23 * ej uppmätt

Claims (12)

12 465 678 PATENTKRAV

1. Material av svampcellväggar, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att det innehåller hexosamin och uppvisar en positiv Zeta-potential vid ett pH-värde av 7, när materialet är sönderdelat till en partikelstorlek mindre än 20 um, och kan erhållas genom att en svamp innehållande chitin eller chitosan underkastas a) fysikalisk sönderdelning och/eller behandling med ett organisk lösningsmedel för att avlägsna lipider och b) behandling med alkali och/eller ett enzym för att avlägsna protein och nukleinsyra.

2. Material av svampcellväggar enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att halten hexosamin är minst 5 viktprocent.

3. Material av svampcellväggar enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att cellväggmaterialet är härlett från en svamp vald från phylum Zygomycota eller phylum Dikaryomycota.

4. Material av svampcellväggar enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att materialet är härlett från ett mycelium.

5. Material av svampcellväggar enligt något av kraven 1-4, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att materialet vid pH 6 har en Zeta-potential av åtminstone 20 mV, när det är sönderdelat till en partikelstorlek mindre än 20 um.

6. Material av svampcellväggar enligt något av kraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att materialet har en genomsnittlig partikelstorlek av mindre än 20 um.

7. Förfarande för framställning av ett material av svampcellväggar enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att en svamp innehållande chitin eller chitosan underkastas a) fysiskalisk sönderdelning och/eller behandling med ett organisk lösningsmedel för att avlägsna lipider och b) behandling med alkali och/eller ett enzym för att avlägsna protein och nukleinsyra. N 465 678

8. Ett förfarande enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att svampen i steg a) fysiskaliskt sönderdelas till en partikelstorlek mindre än 20 um.

9. Ett förfarande enligt krav 7 eller 8, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v , att det avproteiniserade cell- väggmaterialet extraheras med syra för att avlägsna chitosan.

10. Ett förfarande enligt något av kraven 7-9, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att svampen är vald från phylum Zygomycota eller phylum Dikaryomycota.

11. Ett förfarande enligt något av kraven 7-9, kännetecknat därav, att cellväggmaterialet är ett mycelium.

12. Användning av cellväggmaterialet enligt något av kraven 1-6 i en process för att återvinna eller avlägsna negativt laddade produkter från vattenbaserade media.