CN115029331B - 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 - Google Patents
用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115029331B CN115029331B CN202210903048.8A CN202210903048A CN115029331B CN 115029331 B CN115029331 B CN 115029331B CN 202210903048 A CN202210903048 A CN 202210903048A CN 115029331 B CN115029331 B CN 115029331B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immobilized enzyme
- reaction system
- phosphatidylserine
- pickering emulsion
- cellulose nanofiber
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 97
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 title claims abstract description 42
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 53
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 53
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 45
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 claims abstract description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 50
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 claims description 18
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 claims description 18
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 claims description 18
- OBNCKNCVKJNDBV-UHFFFAOYSA-N ethyl butyrate Chemical group CCCC(=O)OCC OBNCKNCVKJNDBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000001132 ultrasonic dispersion Methods 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- IAZSXUOKBPGUMV-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-3-methyl-1,2-dihydroimidazol-1-ium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCC[NH+]1CN(C)C=C1 IAZSXUOKBPGUMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 abstract description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 abstract description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 22
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 14
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 14
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 13
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- FHDQNOXQSTVAIC-UHFFFAOYSA-M 1-butyl-3-methylimidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCN1C=C[N+](C)=C1 FHDQNOXQSTVAIC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000000498 ball milling Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011146 organic particle Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
- C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6481—Phosphoglycerides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
- C12Y301/04004—Phospholipase D (3.1.4.4)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/584—Recycling of catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系,由固定化酶、构成乳液的油相和水相组成,其中,所述固定化酶是将磷脂酶D固定于纤维素纳米纤维所形成的固定化酶;固定化酶同时作为催化剂和乳化剂;所述油相由溶剂和磷脂酰胆碱组成;所述水相由缓冲溶液和丝氨酸组成。本发明还公开了一种制备磷脂酰丝氨酸的方法。本发明以纤维素纳米纤维作为载体负载磷脂酶D,能够吸附在油水界面起到稳定剂的作用,既能充分发挥皮克林乳液增大界面催化面积的作用,又具有易于回收、可重复使用、热稳定性和机械强度都提升的优点,制备磷脂酰丝氨酸的效率高,为功能性磷脂的工业化生产开拓了研究前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系,属于生物催化合成技术领域。
背景技术
磷脂酰丝氨酸(PS)能够抑制细胞凋亡和改善抑郁症,具有重要的生理功能,已被广泛应用于功能性食品和制药领域。磷脂酰丝氨酸可以通过磷脂酶D(PLD)介导的磷脂酰胆碱和L-丝氨酸的转磷脂酰化法合成。酶法合成的反应条件温和,产物纯度高,能够获得非天然的稀有磷脂。磷脂酰丝氨酸的酶促合成反应通常发生在有机-水双相反应体系中,底物L-丝氨酸和磷脂酰胆碱分别溶于水和有机溶剂。传统的有机溶剂包括***、氯仿等,它们往往具有特定的毒性,不适宜人类食用,并且由于界面面积限制会导致反应效率低和耗时久的问题。因此,建立用于合成磷脂酰丝氨酸的新型反应体系对于提高反应效率和实现高转化率至关重要。
皮克林乳液反应体系是指利用超细固体颗粒作为乳化剂和催化剂稳定的乳液反应体系,不仅可以降低反应活化能,加速反应进程,还有利于催化剂和产物的分离回收。目前,大量研究的皮克林乳液反应体系是以游离酶为水相,利用不同类型的材料制备皮克林乳液,其成本高且产物分离纯化困难,使用的材料集中于无机或合成颗粒上,生物相容性较差,酶促修饰过程复杂。在食品工业中,人们对植物基有机颗粒越来越感兴趣,颗粒基乳化剂具有形成和稳定食品级皮克林乳剂的潜力。
发明内容
针对上述现有技术,本发明提供了一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系。本发明以纤维素纳米纤维固定化酶同时作为乳化剂和催化剂,增大了反应接触面积,缩短了反应时间且转化率高,不涉及有毒化学品,产物易于分离纯化,产物磷脂酰丝氨酸稳定性高,更加绿色经济。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系,由固定化酶、构成乳液的油相和水相组成,其中,所述固定化酶是将磷脂酶D固定于纤维素纳米纤维(CNF)所形成的固定化酶;固定化酶同时作为催化剂和乳化剂;所述油相由溶剂和磷脂酰胆碱组成;所述水相由缓冲溶液和丝氨酸组成,反应底物磷脂酰胆碱和丝氨酸分别溶于油相和水相中。
进一步地,所述固定化酶是通过以下方法制备得到的:将纤维素纳米纤维加入到含有磷脂酶D的溶液中,在15~25℃下孵育2~24小时,离心,沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗,离心分离,冷冻干燥,即得固定化酶。
进一步地,所述纤维素纳米纤维的直径为10~50 nm,纤维长度为100~400 nm,可通过球磨法从微晶纤维素中提取。所述磷脂酶D与纤维素纳米纤维的配比关系为:100~400mg的纤维素纳米纤维上负载2~10 U的磷脂酶D,优选120 mg的纤维素纳米纤维上负载4.6U的磷脂酶D。
进一步地,所述溶剂选自庚烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁酸乙酯中的任意一种或两种以上;所述油相中磷脂酰胆碱的浓度为5~20 mg/mL,优选10 mg/mL。
进一步地,所述缓冲溶液的pH为4.0~6.0,浓度为0.01~0.1 mol/L,选自Tris-HCl缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液;所述水相中丝氨酸的浓度为0.5~1.5 mol/L,优选1.0 mol/L。
进一步地,所述油相和水相的体积比为1:0.2~1.2,优选1:1;所述磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:50~80,优选1:80;所述固定化酶的加酶量为:每1 mL油相添加2~20mg的固定化酶,优选16 mg。
进一步地,所述乳液的粒径为5~40μm。
所述用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系的制备方法为:将磷脂酰胆碱溶于溶剂中得油相;将丝氨酸溶液缓冲溶液中得水相;将油相和水相混合,加入固定化酶,超声分散,即得粒径在5~40μm的固定化酶皮克林乳液反应体系。
进一步地,所述超声分散的具体参数为:时间100~200 s,优选180 s;功率40~140 W,优选100 W;超声间歇时间3 s/3 s~ 9 s/3 s,优选3 s/3 s。
一种制备磷脂酰丝氨酸的方法:上述固定化酶皮克林乳液反应体系,于37~42℃水浴反应1~12小时;反应结束后离心取上清,产物磷脂酰丝氨酸即溶于上层有机相中,氮吹,得到磷脂酰丝氨酸。
本发明的固定化酶皮克林乳液反应体系,以纤维素纳米纤维作为载体负载磷脂酶D,能够吸附在油水界面起到稳定剂的作用,既能充分发挥皮克林乳液增大界面催化面积的作用,又具有易于回收、可重复使用、热稳定性和机械强度都提升的优点。本发明通过一步固定化方法使酶与纤维素纳米纤维通过疏水相互作用结合。
本发明的固定化酶皮克林乳液反应体系,解决了磷脂酰丝氨酸合成的反应效率低下和转化率不高的问题,取得了以下有益成果:
(1)本发明首次使用新型皮克林乳液反应体系替代传统双相体系实现磷脂酰丝氨酸的高效合成,以磷脂酰胆碱和丝氨酸等反应原料作为底物,使用食品级的正丁酸乙酯作为油相,避免了传统双相反应体系有毒和反应效率低的问题,具有制备方法步骤简单,适用于磷脂酰丝氨酸的高效合成等特点,无溶剂污染,催化活性和转化率高,反应效率优异,产物易于分离纯化,易于重复使用等优点。
(2)本发明首次提出植物生物基来源的纤维素纳米纤维来制备皮克林乳液反应体系,与生物相容性较差和酶促修饰过程复杂的无机材料相比,纤维素纳米纤维不仅易与酶结合,还大大增加了酶与底物的接触面积,缩短反应时间和减少酶的用量,有利于加快底物传质和反应进程。
(3)本发明探索了用于合成磷脂酰丝氨酸的皮克林乳液反应体系的制备条件,酶和载体通过亲和吸附固定,能够与底物分子充分接触,皮克林乳液反应体系制备磷脂酰丝氨酸与游离酶或固定化酶相比有显著的提高,大大降低生产成本,为功能性磷脂的工业化生产开拓了研究前景。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1:微晶纤维素和纤维素纳米纤维的扫描电镜图像,其中,A:微晶纤维素;B:纤维素纳米纤维。
图2:微晶纤维素、纤维素纳米纤维、固定化酶CNF-CBD1的红外光谱图。
图3:皮克林乳液的荧光显微镜图像。
图4:不同反应体系的磷脂酰丝氨酸的转化率比较示意图,其中,1、游离酶双相反应体系;2、微晶纤维素固定化酶双相反应体系;3、纤维素纳米纤维固定化酶双相反应体系;4、纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而,本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料,可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
本发明所用的磷脂酶D,是通过以下方式得到的:将来源于Trichoderma reesei的CBHI(GenBank: AF283514.1)和来源于Bacillus circulans的WL-12(GenBank: M57601.1)碳水化合物功能域,分别与PLDRecom34(GenBank: MN604233)的C末端进行融合,构建得到pET28a-PLD-CBD1和pET28a-PLD-CBDchiA1质粒,转入感受态大肠杆菌中,筛选阳性转化子,分别得到表达磷脂酶PLD-CBD1、磷脂酶PLD-chiA1的重组菌株;培养重组菌株,得到其表达的磷脂酶PLD-CBD1、磷脂酶PLD-chiA1(磷脂酶PLD-CBD1、磷脂酶PLD-chiA1的氨基酸序列通过重组质粒的构建过程即可合理推测出,重组质粒的构建过程中所涉及的结构基因的核苷酸序列、结构基因所表达的蛋白的氨基酸序列,均为现有技术中已知的序列,本发明不再赘述),其中,磷脂酶PLD-CBD1能与纤维素纳米纤维、微晶纤维素发生亲和吸附实现一步固定化,磷脂酶PLD-chiA1能与甲壳素发生一步固定化。
所述培养菌株、获得重组酶的具体操作如下:
成功转入pET28a-PLD-CBD1的菌株、pET28a-PLD-CBDchiA1的菌株,分别接种至1.5L的含0.5‰卡那霉素的ZYP-5052培养基中,在20℃、200 r/min条件下摇床振荡培养发酵48小时,获得足够量的重组酶;发酵结束后,高压破碎培养液(6 MPa压力下破碎10 min),离心(12000 r/min,15 min),获得澄清上清液,即粗酶液,冷冻干燥,得磷脂酶PLD-CBD1、磷脂酶PLD-chiA1。
本发明所用的纤维素纳米纤维,是在[BMIM]Cl(1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐)离子液体存在下通过球磨法从微晶纤维素中提取得到的,具体操作为:将2 g微晶纤维素、2 g[BMIM]Cl与30 mL蒸馏水混合,加入直径为5 mm,3 mm,1.8 mm的三种氧化锆球,其重量分别为4 g,4 g,3 g。在球磨机罐中以300 r/ min的研磨速度加工1.5小时。收集到的产品用蒸馏水洗涤,通过真空过滤除去残留的[BMIM]Cl,冷冻干燥,得到纤维素纳米纤维。微晶纤维素、纤维素纳米纤维的扫描电镜图像如图1所示。
实验1 不同固定化酶合成磷脂酰丝氨酸效果的比较
以不同载体负载磷脂酶D,并制备相应的固定化酶双相反应体系,考察合成磷酯酰丝氨酸的效率,具体如下:
固定化酶反应体系,由12 mg的固定化酶(有三种,具体见下述)、1 mL的油相和1mL的水相组成,其中,油相由溶剂正丁酸乙酯和磷脂酰胆碱组成,磷脂酰胆碱的浓度为10mg/mL;水相由柠檬酸钠缓冲溶液(20 mmol/L,pH 6.0)和丝氨酸组成,丝氨酸的浓度为1mol/L。制备方法为:将磷脂酰胆碱溶于正丁酸乙酯中得油相;将丝氨酸溶液柠檬酸钠缓冲溶液中得水相;将油相和水相混合,加入固定化酶,得三种固定化酶双相反应体系。
所述固定化酶分别是:纤维素纳米纤维固定化酶、纤维素固定化酶、甲壳素固定化酶,制备方法具体如下:
纤维素纳米纤维固定化酶:将120 mg纤维素纳米纤维加入到10 mL的含有0.46 U/mL磷脂酶PLD-CBD1的粗酶液中,在20℃、200 r/min下孵育11小时,10000 r/min离心5 min,弃去上清液,沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗3次,离心分离,冷冻干燥,即得纤维素纳米纤维固定化酶。酶活恢复力(即固定化酶的总酶活与总初始酶活之比)为56.3%,表明固定化过程的成功。微晶纤维素、纤维素纳米纤维、纤维素纳米纤维固定化酶的红外光谱如图2所示,修饰后的纤维素纳米纤维与原始微晶纤维素的光谱相同,证实了化学结构的相似性,纤维素纳米纤维固定化酶的红外光谱有蛋白N-H伸缩振动峰,酰胺C=O特征峰,证实了PLD-CBD1的成功固定化。
纤维素固定化酶:将120 mg纤维素纳米纤维加入到10 mL的含有0.46 U/mL磷脂酶PLD-CBD1的粗酶液中,在20℃、200 r/min下孵育11小时,离心,沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗3次,离心分离,冷冻干燥,即得纤维素固定化酶。
甲壳素固定化酶:将120 mg甲壳素(购自麦克林)加入到10 mL的含有0.46 U/mL磷脂酶PLD-chiA1的粗酶液中,在20℃、200 r/min下孵育11小时,离心,沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗3次,离心分离,冷冻干燥,即得甲壳素固定化酶。
上述三种固定化酶反应体系,置于40℃恒温水浴中搅拌反应4小时,搅拌转速为220 r/min;反应完毕后在8000 r/min离心3 min,取上层有机相,吹干得到产物磷脂酰丝氨酸。计算磷脂酰丝氨酸的转化率,每组做三次重复实验,取其平均值,结果:含纤维素纳米纤维固定化酶的双相反应体系的转化率为88.6%,含纤维素固定化酶的双相反应体系的转化率为43.3%,含甲壳素固定化酶的双相反应体系的转化率为32.8%,可见,以纤维素纳米纤维作为载体制备的固定化酶双相体系,其转化率最高,显著优于微晶纤维素、甲壳素,差异显著。
实验2 纤维素纳米纤维固定化酶添加量对转化率的影响
以不同载体负载磷脂酶D,并制备相应的固定化酶皮克林乳液反应体系,考察合成磷酯酰丝氨酸的效率,具体如下:
固定化酶皮克林乳液反应体系,由纤维素纳米纤维固定化酶、1 mL的油相和1 mL的水相组成,其中,油相由溶剂正丁酸乙酯和磷脂酰胆碱组成,磷脂酰胆碱的浓度为10 mg/mL;水相由柠檬酸钠缓冲溶液(20 mmol/L,pH 6.0)和丝氨酸组成,丝氨酸的浓度为1 mol/L。制备方法为:将磷脂酰胆碱溶于正丁酸乙酯中得油相;将丝氨酸溶液柠檬酸钠缓冲溶液中得水相;将油相和水相混合,加入固定化酶,超声分散(时间180 s;功率100 W;超声间歇时间3 s/3 s),得纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系,其中,纤维素纳米纤维固定化酶的添加量分别为2 mg、4 mg、8 mg、12 mg、16 mg、20 mg。
考察上述不同固定化酶添加量的皮克林乳液反应体系的转化率:置于40℃恒温水浴中搅拌反应2小时,搅拌转速为200 r/min,其他步骤同实验1,结果:纤维素纳米纤维固定化酶的添加量分别为2 mg、4 mg、8 mg、12 mg、16 mg、20 mg时,所对应的转化率分别为1.4%、12.0%、18.4%、71.8%、91.8%、92.0%,可见,添加量为16 mg时,转化率已经达到很高的水平(为91.8%),酶的添加量继续增加,转化率大致保持不变。综合考虑经济因素和催化效果,固定化CNF-CBD1添加量的16 mg适合于该反应体系。
实施例3 皮克林乳液反应体系与双相反应体系的比较
考察纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系、游离酶双相反应体系、微晶纤维素固定化酶双相反应体系、纤维素纳米纤维固定化酶双相反应体系的磷脂酰丝氨酸转化率:置于40℃恒温水浴中搅拌反应2小时,搅拌转速为200 r/min;反应完毕后以8000 r/min离心8 min,取上层有机相,吹干得到产物磷脂酰丝氨酸。计算磷脂酰丝氨酸的转化率,每组做三次重复实验,取其平均值,结果:如图4所示,游离酶双相反应体系、微晶纤维素固定化酶双相反应体系、纤维素纳米纤维固定化酶双相反应体系的转化率分别为4.5%、13.2%、69.5%,纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系的转化率最高,为95.4%,为微晶纤维素固定化酶双相反应体系的7倍,游离酶双相反应体系的21倍。
纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系的制备方法同实验2(纤维素纳米纤维固定化酶的添加量为16 mg),纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系的荧光显微镜图像如图3所示,证明该乳液为水包油型,液滴均匀分散,大小分布在5~15μm之间。
游离酶双相反应体系的制备方法为:将磷脂酰胆碱溶于正丁酸乙酯中得油相;将丝氨酸溶液柠檬酸钠缓冲溶液中得水相;将油相和水相混合,加入0.61 U酶活力的酶粉(磷脂酶PLD-CBD1),即得。
微晶纤维素固定化酶双相反应体系、纤维素纳米纤维固定化酶双相反应体系的制备方法同上述游离酶双相反应体系的制备方法,区别在于将加入的游离酶替换为微晶纤维素固定化酶(16 mg)、纤维素纳米纤维固定化酶(16 mg)。
给本领域技术人员提供上述实施例,以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案,而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (3)
1.一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系的制备方法,其特征在于:将磷脂酰胆碱溶于溶剂中得油相;将丝氨酸溶于缓冲溶液中得水相;将油相和水相混合,加入固定化酶,超声分散,即得;
所述溶剂为正丁酸乙酯,油相中磷脂酰胆碱的浓度为10 mg/mL;
所述缓冲溶液为pH 6.0、20 mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,水相中丝氨酸的浓度为1.0 mol/L;
所述油相和水相的体积比为1:1;所述固定化酶的加酶量为:每1 mL油相添加16 mg的固定化酶;
所述固定化酶是通过以下方法制备得到的:将120 mg纤维素纳米纤维加入到0.46 U/mL的磷脂酶D溶液中,在20℃、200 r/min下孵育11小时,离心,沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗,离心分离,冷冻干燥,即得固定化酶;
所述纤维素纳米纤维是通过以下方法制备得到的:将2 g微晶纤维素、2 g 1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐与30 mL蒸馏水混合,加入直径为5 mm、3 mm、1.8 mm的三种氧化锆球,其重量分别为4 g、4 g、3 g,在球磨机罐中以300 r/min的研磨速度加工1.5小时;收集到的产品用蒸馏水洗涤,通过真空过滤除去残留的1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐,冷冻干燥,得到纤维素纳米纤维;
所述超声分散的具体参数为:时间100~200 s;功率40~140 W;超声间歇时间3 s/3 s~9 s/3 s;
所述乳液的粒径为5~15μm。
2.利用权利要求1所述的用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系的制备方法制备得到的固定化酶皮克林乳液反应体系。
3.一种制备磷脂酰丝氨酸的方法,其特征在于:采用权利要求2所述的固定化酶皮克林乳液反应体系,于37~42℃反应1~12小时;反应结束后离心取上清,产物磷脂酰丝氨酸即溶于上层有机相中,氮吹,得到磷脂酰丝氨酸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210903048.8A CN115029331B (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210903048.8A CN115029331B (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115029331A CN115029331A (zh) | 2022-09-09 |
CN115029331B true CN115029331B (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=83130461
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210903048.8A Active CN115029331B (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115029331B (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103966277A (zh) * | 2014-05-22 | 2014-08-06 | 南京工业大学 | 一种固定化磷脂酶d催化制备磷脂酰丝氨酸的方法 |
WO2019069809A1 (ja) * | 2017-10-06 | 2019-04-11 | 第一工業製薬株式会社 | タンパク質固定用担体、複合体、及びそれらの製造方法 |
CN109706141A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-05-03 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种固定化酶皮克林乳液反应体系及其应用 |
CN110923225A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-27 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 用于磷脂催化的纤维素凝胶微球固定化磷脂酶及其制备方法 |
CN111778295A (zh) * | 2019-04-04 | 2020-10-16 | 南通厚元生物科技有限公司 | 一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法 |
CN112458076A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-03-09 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110591117B (zh) * | 2019-10-31 | 2020-10-09 | 江南大学 | 一种利用白果壳纤维素稳定的Pickering乳液及其制备方法 |
-
2022
- 2022-07-29 CN CN202210903048.8A patent/CN115029331B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103966277A (zh) * | 2014-05-22 | 2014-08-06 | 南京工业大学 | 一种固定化磷脂酶d催化制备磷脂酰丝氨酸的方法 |
WO2019069809A1 (ja) * | 2017-10-06 | 2019-04-11 | 第一工業製薬株式会社 | タンパク質固定用担体、複合体、及びそれらの製造方法 |
CN109706141A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-05-03 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种固定化酶皮克林乳液反应体系及其应用 |
CN111778295A (zh) * | 2019-04-04 | 2020-10-16 | 南通厚元生物科技有限公司 | 一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法 |
CN110923225A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-27 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 用于磷脂催化的纤维素凝胶微球固定化磷脂酶及其制备方法 |
CN112458076A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-03-09 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Laccase immobilization on cellulose nanofiber: The catalytic efficiency and recyclic application for simulated dye effluent treatment;treatmentPalanivel Sathishkumar 等;《Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic》;第100卷(第2014期);第112页第1栏第2段、第115页第1栏第1-3段 * |
产磷脂酶D工程菌构建及发酵条件优化;刘琦 等;《食品研究与开发》;第43卷(第11期);第26-34页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115029331A (zh) | 2022-09-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Preparation of chitosan-based nanoparticles for enzyme immobilization | |
JP6728294B2 (ja) | たんぱく質精製の新規な方法 | |
Yin et al. | Cellulose nanofibril-stabilized Pickering emulsion as a high-performance interfacial biocatalysis system for the synthesis of phosphatidylserine | |
Xie et al. | Interfacial biocatalysis in bacteria-stabilized Pickering emulsions for microbial transformation of hydrophobic chemicals | |
JPH09132601A (ja) | 多孔性セルロース粒子の製造方法 | |
CN115029331B (zh) | 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 | |
KR19990035890A (ko) | 박테리아셀룰로오즈농축물및상기농축물의처리방법 | |
JP4034348B2 (ja) | 結晶セルラーゼおよびその製造方法 | |
JP2003277416A (ja) | 糖類を含むアクリルアミド水溶液 | |
Rai et al. | Development of recyclable magnetic cross-linked enzyme aggregates for the synthesis of high value rare sugar d-tagatose in aqueous phase catalysis | |
Selber et al. | Parameters influencing protein extraction for whole broths in detergent based aqueous two-phase systems | |
Núñez-Serrano et al. | Production and immobilization of pectinases from Penicillium crustosum in magnetic core-shell nanostructures for juice clarification | |
US20040248270A1 (en) | Process for producing concentrated/purified protein using clay mineral composition | |
CN106591274B (zh) | 一种固定化核酸酶p1及其制备方法与其应用 | |
JP2839493B2 (ja) | 培養におけるセルラーゼ製剤の使用及びセルロース生産微生物の使用 | |
EP3805365A1 (en) | Trichoderma filamentous fungus mutant strain and method for producing protein | |
JPH07171303A (ja) | 水性二相分離法 | |
JP2015519049A (ja) | 固定化脂環式ペプチドアシルトランスフェラーゼ及びその製造方法と用途 | |
Rezaeepour et al. | The Role of Cellulose Binding Heptapeptide in Immobilizing Glucose Oxidase to Cellulosic Surfaces | |
CN113355368B (zh) | 水溶化碳笼在黑曲霉发酵制备柠檬酸中的应用及应用方法 | |
FI119376B (fi) | Liukenemattoman indigon talteenotto | |
FR2961526A1 (fr) | Ulvane lyase, procede de fabrication et utilisations | |
JP5001016B2 (ja) | エルロースの製造方法 | |
JP5370983B2 (ja) | 生体触媒を用いたラクタム加水分解によるω−アミノカルボン酸の製造方法 | |
JP5132979B2 (ja) | ポリアクリルアミド及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |