CN115029331B - 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 - Google Patents
用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系，由固定化酶、构成乳液的油相和水相组成，其中，所述固定化酶是将磷脂酶D固定于纤维素纳米纤维所形成的固定化酶；固定化酶同时作为催化剂和乳化剂；所述油相由溶剂和磷脂酰胆碱组成；所述水相由缓冲溶液和丝氨酸组成。本发明还公开了一种制备磷脂酰丝氨酸的方法。本发明以纤维素纳米纤维作为载体负载磷脂酶D，能够吸附在油水界面起到稳定剂的作用，既能充分发挥皮克林乳液增大界面催化面积的作用，又具有易于回收、可重复使用、热稳定性和机械强度都提升的优点，制备磷脂酰丝氨酸的效率高，为功能性磷脂的工业化生产开拓了研究前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系，属于生物催化合成技术领域。
背景技术
磷脂酰丝氨酸（PS）能够抑制细胞凋亡和改善抑郁症，具有重要的生理功能，已被广泛应用于功能性食品和制药领域。磷脂酰丝氨酸可以通过磷脂酶D（PLD）介导的磷脂酰胆碱和L-丝氨酸的转磷脂酰化法合成。酶法合成的反应条件温和，产物纯度高，能够获得非天然的稀有磷脂。磷脂酰丝氨酸的酶促合成反应通常发生在有机-水双相反应体系中，底物L-丝氨酸和磷脂酰胆碱分别溶于水和有机溶剂。传统的有机溶剂包括***、氯仿等，它们往往具有特定的毒性，不适宜人类食用，并且由于界面面积限制会导致反应效率低和耗时久的问题。因此，建立用于合成磷脂酰丝氨酸的新型反应体系对于提高反应效率和实现高转化率至关重要。
皮克林乳液反应体系是指利用超细固体颗粒作为乳化剂和催化剂稳定的乳液反应体系，不仅可以降低反应活化能，加速反应进程，还有利于催化剂和产物的分离回收。目前，大量研究的皮克林乳液反应体系是以游离酶为水相，利用不同类型的材料制备皮克林乳液，其成本高且产物分离纯化困难，使用的材料集中于无机或合成颗粒上，生物相容性较差，酶促修饰过程复杂。在食品工业中，人们对植物基有机颗粒越来越感兴趣，颗粒基乳化剂具有形成和稳定食品级皮克林乳剂的潜力。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系。本发明以纤维素纳米纤维固定化酶同时作为乳化剂和催化剂，增大了反应接触面积，缩短了反应时间且转化率高，不涉及有毒化学品，产物易于分离纯化，产物磷脂酰丝氨酸稳定性高，更加绿色经济。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系，由固定化酶、构成乳液的油相和水相组成，其中，所述固定化酶是将磷脂酶D固定于纤维素纳米纤维（CNF）所形成的固定化酶；固定化酶同时作为催化剂和乳化剂；所述油相由溶剂和磷脂酰胆碱组成；所述水相由缓冲溶液和丝氨酸组成，反应底物磷脂酰胆碱和丝氨酸分别溶于油相和水相中。
进一步地，所述固定化酶是通过以下方法制备得到的：将纤维素纳米纤维加入到含有磷脂酶D的溶液中，在15～25℃下孵育2～24小时，离心，沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗，离心分离，冷冻干燥，即得固定化酶。
进一步地，所述纤维素纳米纤维的直径为10～50 nm，纤维长度为100～400 nm，可通过球磨法从微晶纤维素中提取。所述磷脂酶D与纤维素纳米纤维的配比关系为：100～400mg的纤维素纳米纤维上负载2～10 U的磷脂酶D，优选120 mg的纤维素纳米纤维上负载4.6U的磷脂酶D。
进一步地，所述溶剂选自庚烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁酸乙酯中的任意一种或两种以上；所述油相中磷脂酰胆碱的浓度为5～20 mg/mL，优选10 mg/mL。
进一步地，所述缓冲溶液的pH为4.0～6.0，浓度为0.01～0.1 mol/L，选自Tris-HCl缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；所述水相中丝氨酸的浓度为0.5～1.5 mol/L，优选1.0 mol/L。
进一步地，所述油相和水相的体积比为1:0.2～1.2，优选1:1；所述磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:50～80，优选1:80；所述固定化酶的加酶量为：每1 mL油相添加2～20mg的固定化酶，优选16 mg。
进一步地，所述乳液的粒径为5～40μm。
所述用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系的制备方法为：将磷脂酰胆碱溶于溶剂中得油相；将丝氨酸溶液缓冲溶液中得水相；将油相和水相混合，加入固定化酶，超声分散，即得粒径在5～40μm的固定化酶皮克林乳液反应体系。
进一步地，所述超声分散的具体参数为：时间100～200 s，优选180 s；功率40～140 W，优选100 W；超声间歇时间3 s/3 s～ 9 s/3 s，优选3 s/3 s。
一种制备磷脂酰丝氨酸的方法：上述固定化酶皮克林乳液反应体系，于37～42℃水浴反应1～12小时；反应结束后离心取上清，产物磷脂酰丝氨酸即溶于上层有机相中，氮吹，得到磷脂酰丝氨酸。
本发明的固定化酶皮克林乳液反应体系，以纤维素纳米纤维作为载体负载磷脂酶D，能够吸附在油水界面起到稳定剂的作用，既能充分发挥皮克林乳液增大界面催化面积的作用，又具有易于回收、可重复使用、热稳定性和机械强度都提升的优点。本发明通过一步固定化方法使酶与纤维素纳米纤维通过疏水相互作用结合。
本发明的固定化酶皮克林乳液反应体系，解决了磷脂酰丝氨酸合成的反应效率低下和转化率不高的问题，取得了以下有益成果：
（1）本发明首次使用新型皮克林乳液反应体系替代传统双相体系实现磷脂酰丝氨酸的高效合成，以磷脂酰胆碱和丝氨酸等反应原料作为底物，使用食品级的正丁酸乙酯作为油相，避免了传统双相反应体系有毒和反应效率低的问题，具有制备方法步骤简单，适用于磷脂酰丝氨酸的高效合成等特点，无溶剂污染，催化活性和转化率高，反应效率优异，产物易于分离纯化，易于重复使用等优点。
（2）本发明首次提出植物生物基来源的纤维素纳米纤维来制备皮克林乳液反应体系，与生物相容性较差和酶促修饰过程复杂的无机材料相比，纤维素纳米纤维不仅易与酶结合，还大大增加了酶与底物的接触面积，缩短反应时间和减少酶的用量，有利于加快底物传质和反应进程。
（3）本发明探索了用于合成磷脂酰丝氨酸的皮克林乳液反应体系的制备条件，酶和载体通过亲和吸附固定，能够与底物分子充分接触，皮克林乳液反应体系制备磷脂酰丝氨酸与游离酶或固定化酶相比有显著的提高，大大降低生产成本，为功能性磷脂的工业化生产开拓了研究前景。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：微晶纤维素和纤维素纳米纤维的扫描电镜图像，其中，A：微晶纤维素；B：纤维素纳米纤维。
图2：微晶纤维素、纤维素纳米纤维、固定化酶CNF-CBD1的红外光谱图。
图3：皮克林乳液的荧光显微镜图像。
图4：不同反应体系的磷脂酰丝氨酸的转化率比较示意图，其中，1、游离酶双相反应体系；2、微晶纤维素固定化酶双相反应体系；3、纤维素纳米纤维固定化酶双相反应体系；4、纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
本发明所用的磷脂酶D，是通过以下方式得到的：将来源于Trichoderma reesei的CBHI（GenBank: AF283514.1）和来源于Bacillus circulans的WL-12（GenBank: M57601.1）碳水化合物功能域，分别与PLDRecom34（GenBank: MN604233）的C末端进行融合，构建得到pET28a-PLD-CBD1和pET28a-PLD-CBDchiA1质粒，转入感受态大肠杆菌中，筛选阳性转化子，分别得到表达磷脂酶PLD-CBD1、磷脂酶PLD-chiA1的重组菌株；培养重组菌株，得到其表达的磷脂酶PLD-CBD1、磷脂酶PLD-chiA1（磷脂酶PLD-CBD1、磷脂酶PLD-chiA1的氨基酸序列通过重组质粒的构建过程即可合理推测出，重组质粒的构建过程中所涉及的结构基因的核苷酸序列、结构基因所表达的蛋白的氨基酸序列，均为现有技术中已知的序列，本发明不再赘述），其中，磷脂酶PLD-CBD1能与纤维素纳米纤维、微晶纤维素发生亲和吸附实现一步固定化，磷脂酶PLD-chiA1能与甲壳素发生一步固定化。
所述培养菌株、获得重组酶的具体操作如下：
成功转入pET28a-PLD-CBD1的菌株、pET28a-PLD-CBDchiA1的菌株，分别接种至1.5L的含0.5‰卡那霉素的ZYP-5052培养基中，在20℃、200 r/min条件下摇床振荡培养发酵48小时，获得足够量的重组酶；发酵结束后，高压破碎培养液（6 MPa压力下破碎10 min），离心（12000 r/min，15 min），获得澄清上清液，即粗酶液，冷冻干燥，得磷脂酶PLD-CBD1、磷脂酶PLD-chiA1。
本发明所用的纤维素纳米纤维，是在[BMIM]Cl（1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐）离子液体存在下通过球磨法从微晶纤维素中提取得到的，具体操作为：将2 g微晶纤维素、2 g[BMIM]Cl与30 mL蒸馏水混合，加入直径为5 mm，3 mm，1.8 mm的三种氧化锆球，其重量分别为4 g，4 g，3 g。在球磨机罐中以300 r/ min的研磨速度加工1.5小时。收集到的产品用蒸馏水洗涤，通过真空过滤除去残留的[BMIM]Cl，冷冻干燥，得到纤维素纳米纤维。微晶纤维素、纤维素纳米纤维的扫描电镜图像如图1所示。
实验1 不同固定化酶合成磷脂酰丝氨酸效果的比较
以不同载体负载磷脂酶D，并制备相应的固定化酶双相反应体系，考察合成磷酯酰丝氨酸的效率，具体如下：
固定化酶反应体系，由12 mg的固定化酶（有三种，具体见下述）、1 mL的油相和1mL的水相组成，其中，油相由溶剂正丁酸乙酯和磷脂酰胆碱组成，磷脂酰胆碱的浓度为10mg/mL；水相由柠檬酸钠缓冲溶液（20 mmol/L，pH 6.0）和丝氨酸组成，丝氨酸的浓度为1mol/L。制备方法为：将磷脂酰胆碱溶于正丁酸乙酯中得油相；将丝氨酸溶液柠檬酸钠缓冲溶液中得水相；将油相和水相混合，加入固定化酶，得三种固定化酶双相反应体系。
所述固定化酶分别是：纤维素纳米纤维固定化酶、纤维素固定化酶、甲壳素固定化酶，制备方法具体如下：
纤维素纳米纤维固定化酶：将120 mg纤维素纳米纤维加入到10 mL的含有0.46 U/mL磷脂酶PLD-CBD1的粗酶液中，在20℃、200 r/min下孵育11小时，10000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗3次，离心分离，冷冻干燥，即得纤维素纳米纤维固定化酶。酶活恢复力（即固定化酶的总酶活与总初始酶活之比）为56.3%，表明固定化过程的成功。微晶纤维素、纤维素纳米纤维、纤维素纳米纤维固定化酶的红外光谱如图2所示，修饰后的纤维素纳米纤维与原始微晶纤维素的光谱相同，证实了化学结构的相似性，纤维素纳米纤维固定化酶的红外光谱有蛋白N-H伸缩振动峰，酰胺C=O特征峰，证实了PLD-CBD1的成功固定化。
纤维素固定化酶：将120 mg纤维素纳米纤维加入到10 mL的含有0.46 U/mL磷脂酶PLD-CBD1的粗酶液中，在20℃、200 r/min下孵育11小时，离心，沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗3次，离心分离，冷冻干燥，即得纤维素固定化酶。
甲壳素固定化酶：将120 mg甲壳素（购自麦克林）加入到10 mL的含有0.46 U/mL磷脂酶PLD-chiA1的粗酶液中，在20℃、200 r/min下孵育11小时，离心，沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗3次，离心分离，冷冻干燥，即得甲壳素固定化酶。
上述三种固定化酶反应体系，置于40℃恒温水浴中搅拌反应4小时，搅拌转速为220 r/min；反应完毕后在8000 r/min离心3 min，取上层有机相，吹干得到产物磷脂酰丝氨酸。计算磷脂酰丝氨酸的转化率，每组做三次重复实验，取其平均值，结果：含纤维素纳米纤维固定化酶的双相反应体系的转化率为88.6%，含纤维素固定化酶的双相反应体系的转化率为43.3%，含甲壳素固定化酶的双相反应体系的转化率为32.8%，可见，以纤维素纳米纤维作为载体制备的固定化酶双相体系，其转化率最高，显著优于微晶纤维素、甲壳素，差异显著。
实验2 纤维素纳米纤维固定化酶添加量对转化率的影响
以不同载体负载磷脂酶D，并制备相应的固定化酶皮克林乳液反应体系，考察合成磷酯酰丝氨酸的效率，具体如下：
固定化酶皮克林乳液反应体系，由纤维素纳米纤维固定化酶、1 mL的油相和1 mL的水相组成，其中，油相由溶剂正丁酸乙酯和磷脂酰胆碱组成，磷脂酰胆碱的浓度为10 mg/mL；水相由柠檬酸钠缓冲溶液（20 mmol/L，pH 6.0）和丝氨酸组成，丝氨酸的浓度为1 mol/L。制备方法为：将磷脂酰胆碱溶于正丁酸乙酯中得油相；将丝氨酸溶液柠檬酸钠缓冲溶液中得水相；将油相和水相混合，加入固定化酶，超声分散（时间180 s；功率100 W；超声间歇时间3 s/3 s），得纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系，其中，纤维素纳米纤维固定化酶的添加量分别为2 mg、4 mg、8 mg、12 mg、16 mg、20 mg。
考察上述不同固定化酶添加量的皮克林乳液反应体系的转化率：置于40℃恒温水浴中搅拌反应2小时，搅拌转速为200 r/min，其他步骤同实验1，结果：纤维素纳米纤维固定化酶的添加量分别为2 mg、4 mg、8 mg、12 mg、16 mg、20 mg时，所对应的转化率分别为1.4%、12.0%、18.4%、71.8%、91.8%、92.0%，可见，添加量为16 mg时，转化率已经达到很高的水平（为91.8%），酶的添加量继续增加，转化率大致保持不变。综合考虑经济因素和催化效果，固定化CNF-CBD1添加量的16 mg适合于该反应体系。
实施例3 皮克林乳液反应体系与双相反应体系的比较
考察纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系、游离酶双相反应体系、微晶纤维素固定化酶双相反应体系、纤维素纳米纤维固定化酶双相反应体系的磷脂酰丝氨酸转化率：置于40℃恒温水浴中搅拌反应2小时，搅拌转速为200 r/min；反应完毕后以8000 r/min离心8 min，取上层有机相，吹干得到产物磷脂酰丝氨酸。计算磷脂酰丝氨酸的转化率，每组做三次重复实验，取其平均值，结果：如图4所示，游离酶双相反应体系、微晶纤维素固定化酶双相反应体系、纤维素纳米纤维固定化酶双相反应体系的转化率分别为4.5%、13.2%、69.5%，纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系的转化率最高，为95.4%，为微晶纤维素固定化酶双相反应体系的7倍，游离酶双相反应体系的21倍。
纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系的制备方法同实验2（纤维素纳米纤维固定化酶的添加量为16 mg），纤维素纳米纤维固定化酶皮克林乳液反应体系的荧光显微镜图像如图3所示，证明该乳液为水包油型，液滴均匀分散，大小分布在5～15μm之间。
游离酶双相反应体系的制备方法为：将磷脂酰胆碱溶于正丁酸乙酯中得油相；将丝氨酸溶液柠檬酸钠缓冲溶液中得水相；将油相和水相混合，加入0.61 U酶活力的酶粉（磷脂酶PLD-CBD1），即得。
微晶纤维素固定化酶双相反应体系、纤维素纳米纤维固定化酶双相反应体系的制备方法同上述游离酶双相反应体系的制备方法，区别在于将加入的游离酶替换为微晶纤维素固定化酶（16 mg）、纤维素纳米纤维固定化酶（16 mg）。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (3)
1.一种用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系的制备方法，其特征在于：将磷脂酰胆碱溶于溶剂中得油相；将丝氨酸溶于缓冲溶液中得水相；将油相和水相混合，加入固定化酶，超声分散，即得；
所述溶剂为正丁酸乙酯，油相中磷脂酰胆碱的浓度为10 mg/mL；
所述缓冲溶液为pH 6.0、20 mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，水相中丝氨酸的浓度为1.0 mol/L；
所述油相和水相的体积比为1:1；所述固定化酶的加酶量为：每1 mL油相添加16 mg的固定化酶；
所述固定化酶是通过以下方法制备得到的：将120 mg纤维素纳米纤维加入到0.46 U/mL的磷脂酶D溶液中，在20℃、200 r/min下孵育11小时，离心，沉淀用Tris-HCl缓冲液冲洗，离心分离，冷冻干燥，即得固定化酶；
所述纤维素纳米纤维是通过以下方法制备得到的：将2 g微晶纤维素、2 g 1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐与30 mL蒸馏水混合，加入直径为5 mm、3 mm、1.8 mm的三种氧化锆球，其重量分别为4 g、4 g、3 g，在球磨机罐中以300 r/min的研磨速度加工1.5小时；收集到的产品用蒸馏水洗涤，通过真空过滤除去残留的1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐，冷冻干燥，得到纤维素纳米纤维；
所述超声分散的具体参数为：时间100～200 s；功率40～140 W；超声间歇时间3 s/3 s～9 s/3 s；
所述乳液的粒径为5～15μm。
2.利用权利要求1所述的用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系的制备方法制备得到的固定化酶皮克林乳液反应体系。
3.一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：采用权利要求2所述的固定化酶皮克林乳液反应体系，于37～42℃反应1～12小时；反应结束后离心取上清，产物磷脂酰丝氨酸即溶于上层有机相中，氮吹，得到磷脂酰丝氨酸。
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