JP3083554B2 - 凝集剤特性を有する菌の細胞壁物質、その生成のための方法 - Google Patents
凝集剤特性を有する菌の細胞壁物質、その生成のための方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、pH7で正のゼータ電位を有する菌類の細
胞壁物質、その使用と同様に菌の細胞壁物質の生成のた
めの方法に関するものである。
胞壁物質、その使用と同様に菌の細胞壁物質の生成のた
めの方法に関するものである。
キトサンは、それがアミノ基を含むとき、特に廃水処
理における凝集剤として使用される。大抵の生物分子お
よび細胞は負に帯電されるので、タンパク質、核酸、バ
クテリア、脂肪酸、セルロース繊維のような有機物質を
含む廃水物質はその廃水を浄化すために正に帯電された
キトサンと凝集させられてきた。
理における凝集剤として使用される。大抵の生物分子お
よび細胞は負に帯電されるので、タンパク質、核酸、バ
クテリア、脂肪酸、セルロース繊維のような有機物質を
含む廃水物質はその廃水を浄化すために正に帯電された
キトサンと凝集させられてきた。
一般に、キトサンは海の老廃残留物、たとえば、カ
ニ、小エビ、クルマエビおよびオキアミの殻から生成さ
れてきた。最初に、キチン（ポリアセチルグルコサミ
ン）は酸によって殻から抽出され、それから、アルカリ
不溶性でありかつ酸可溶性ポリマであるキトサンを生成
するために高い温度で濃縮アルカリ性溶液によって加水
分解されてきた。キトサンは通常酸性溶液において抽出
されかつ可溶化されてきた。濾過の後、その液体は、キ
トサンが沈殿させられ、回収されるようにアルカリによ
って中和された。
ニ、小エビ、クルマエビおよびオキアミの殻から生成さ
れてきた。最初に、キチン（ポリアセチルグルコサミ
ン）は酸によって殻から抽出され、それから、アルカリ
不溶性でありかつ酸可溶性ポリマであるキトサンを生成
するために高い温度で濃縮アルカリ性溶液によって加水
分解されてきた。キトサンは通常酸性溶液において抽出
されかつ可溶化されてきた。濾過の後、その液体は、キ
トサンが沈殿させられ、回収されるようにアルカリによ
って中和された。
接合菌類およびある子嚢菌類の菌糸体もまたキチンま
たはキトサンを含む。キトンサン−グルカン−複合体
は、４時間の間128℃で40％水酸化ナトリウムによって
ケカビ属ルウキシ（Mucor rouxii）およびアスペルギ
ルス属ニガー（Aspergillus niger）の菌糸体から抽出
されてきた。キトサン−グルカン−複合体は、IRスペク
トラムによって検出されるアミノ基を有し、かつコロイ
ド滴定（マザレリ（Muzzarelli、リカード（Ricard
o）、ドイツ オフェンルガングスシュリフト（Offenle
gungsschrift）２ 923 802、1979）によって示される
正の電荷を有する酢酸可溶性の白い粉であった。さら
に、菌のキトサンはアブシディア属コルレア（Absidia
coerulea）から生成されたと報告されている。アブシ
ディア属コルレアの菌糸体は１時間２％水酸化ナトリウ
ム煮沸によって除タンパクされた。それから、そのキト
サンは２％酢酸によって除タンパクされた菌糸体から抽
出され、可溶化されたが、その酢酸不溶性物質は捨てら
れた（W.I.マクガーレン他、プロセス生化学、（Proces
s Biochemistry）19、88−90、1984）。
たはキトサンを含む。キトンサン−グルカン−複合体
は、４時間の間128℃で40％水酸化ナトリウムによって
ケカビ属ルウキシ（Mucor rouxii）およびアスペルギ
ルス属ニガー（Aspergillus niger）の菌糸体から抽出
されてきた。キトサン−グルカン−複合体は、IRスペク
トラムによって検出されるアミノ基を有し、かつコロイ
ド滴定（マザレリ（Muzzarelli、リカード（Ricard
o）、ドイツ オフェンルガングスシュリフト（Offenle
gungsschrift）２ 923 802、1979）によって示される
正の電荷を有する酢酸可溶性の白い粉であった。さら
に、菌のキトサンはアブシディア属コルレア（Absidia
coerulea）から生成されたと報告されている。アブシ
ディア属コルレアの菌糸体は１時間２％水酸化ナトリウ
ム煮沸によって除タンパクされた。それから、そのキト
サンは２％酢酸によって除タンパクされた菌糸体から抽
出され、可溶化されたが、その酢酸不溶性物質は捨てら
れた（W.I.マクガーレン他、プロセス生化学、（Proces
s Biochemistry）19、88−90、1984）。
この発明にしたがうと、細胞壁物質の中のヘキソサミ
ンの存在次第で、酸性およびアルカリ性の環境の双方に
おいて水不溶性であり、かつ７のpH値で正のゼータ電位
を有する菌の細胞物質は、優れた凝集剤および固定化特
性を有するということがわかった。ゼータ電位は、マル
バーン・ゼータサイザ（Malvern Zetasizer）における
20μｍ未満の粒径を有する細胞壁物質上で求められた。
この発明の細胞壁物質が小さな粒子の状態でない場合
は、その物質はゼータ電位が決定され得る前に分解され
なければならない。それはなお海綿状の菌の構造を有
し、かつ大量のグルコサミン単位を含む。
ンの存在次第で、酸性およびアルカリ性の環境の双方に
おいて水不溶性であり、かつ７のpH値で正のゼータ電位
を有する菌の細胞物質は、優れた凝集剤および固定化特
性を有するということがわかった。ゼータ電位は、マル
バーン・ゼータサイザ（Malvern Zetasizer）における
20μｍ未満の粒径を有する細胞壁物質上で求められた。
この発明の細胞壁物質が小さな粒子の状態でない場合
は、その物質はゼータ電位が決定され得る前に分解され
なければならない。それはなお海綿状の菌の構造を有
し、かつ大量のグルコサミン単位を含む。
たとえば、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質の
ための、かつリボ核酸のような核酸のための細胞壁物質
の凝集能力はキトサンの凝集能力よりもはるかに高い。
その細胞壁物質は、細胞壁とタンパク質の凝集物に酢酸
を加えることによって簡単に再生されることができる。
凝集された液体のpHが酢酸によって減少させられると
き、凝集物は消え、タンパク質が水の中で溶解する。こ
の細胞壁物質は濾過または遠心分離によって回収される
ことができる。
ための、かつリボ核酸のような核酸のための細胞壁物質
の凝集能力はキトサンの凝集能力よりもはるかに高い。
その細胞壁物質は、細胞壁とタンパク質の凝集物に酢酸
を加えることによって簡単に再生されることができる。
凝集された液体のpHが酢酸によって減少させられると
き、凝集物は消え、タンパク質が水の中で溶解する。こ
の細胞壁物質は濾過または遠心分離によって回収される
ことができる。
この発明にしたがった菌の細胞壁物質は、化学化合
物、ポリマ、たとえば酵素およびホルモンのようなタン
パク質の負に帯電された生成物を核酸と同様に水系の液
体から回収または除去する工程において、選択凝集剤、
キャリアおよび／またはイオン交換体として使用される
ことができる。さらに、屠殺場、イーストおよびマーガ
リン工場、魚の缶詰の製造業、ならびにパルプおよび紙
産業からの廃水のような廃水が、その細胞壁物質を凝集
剤として使用することによって有利に清浄されることが
できる。
物、ポリマ、たとえば酵素およびホルモンのようなタン
パク質の負に帯電された生成物を核酸と同様に水系の液
体から回収または除去する工程において、選択凝集剤、
キャリアおよび／またはイオン交換体として使用される
ことができる。さらに、屠殺場、イーストおよびマーガ
リン工場、魚の缶詰の製造業、ならびにパルプおよび紙
産業からの廃水のような廃水が、その細胞壁物質を凝集
剤として使用することによって有利に清浄されることが
できる。
菌の細胞壁物質はまた微生物細胞および酵素の固定化
のための優れた生物キャリアである。しばしば、その結
合力はあまりにもしっかりとしているので、固定化され
た細胞および酵素は、激しい攪拌にさらされた水溶液中
でと同様に高いイオン強度、酸性の、かつアルカリ性の
水溶液において安定している。細胞は、バクテリア、イ
ースト、菌の菌糸体、植物細胞および動物細胞からなる
グループから選ばれてよく、かつ酵素は、アミラーゼ、
カタラーゼ、セルラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、グルコース
オキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、リパーゼ、リ
ゾチーム、パパイン、ペニシリンアシラーゼ、ペプシ
ン、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、ウ
レアーゼならびに動物、植物および微生物の源からの任
意の酵素からなるグループから選択されてもよい。
のための優れた生物キャリアである。しばしば、その結
合力はあまりにもしっかりとしているので、固定化され
た細胞および酵素は、激しい攪拌にさらされた水溶液中
でと同様に高いイオン強度、酸性の、かつアルカリ性の
水溶液において安定している。細胞は、バクテリア、イ
ースト、菌の菌糸体、植物細胞および動物細胞からなる
グループから選ばれてよく、かつ酵素は、アミラーゼ、
カタラーゼ、セルラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、グルコース
オキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、リパーゼ、リ
ゾチーム、パパイン、ペニシリンアシラーゼ、ペプシ
ン、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、ウ
レアーゼならびに動物、植物および微生物の源からの任
意の酵素からなるグループから選択されてもよい。
酸性pH値で等電点を有する細胞および酵素は、pH値お
よび７および７未満で細胞壁物質上に固定化され得る。
ある場合には、形成された凝集物はあまりにも安定して
いるので、架橋剤を使用する必要はない。ある場合、た
とえば、細胞および酵素が中性またはアルカリ性のpH値
で等電点を有するとき、凝集物は形成されないかもしれ
ないか、または、形成された凝集物は高いイオン強度溶
液において、または激しい攪拌の間安定は不十分である
かもしれない。これらの場合において、ジアルデヒドお
よびジイソシアナートのような二価性試薬が従来の態様
で架橋のために使用されてもよい。固定化が架橋剤で、
または架橋剤なしで達成されるかどうかにかかわりな
く、この発明にしたがって固定化された酵素は並はずれ
た酵素活性および保持を示した。
よび７および７未満で細胞壁物質上に固定化され得る。
ある場合には、形成された凝集物はあまりにも安定して
いるので、架橋剤を使用する必要はない。ある場合、た
とえば、細胞および酵素が中性またはアルカリ性のpH値
で等電点を有するとき、凝集物は形成されないかもしれ
ないか、または、形成された凝集物は高いイオン強度溶
液において、または激しい攪拌の間安定は不十分である
かもしれない。これらの場合において、ジアルデヒドお
よびジイソシアナートのような二価性試薬が従来の態様
で架橋のために使用されてもよい。固定化が架橋剤で、
または架橋剤なしで達成されるかどうかにかかわりな
く、この発明にしたがって固定化された酵素は並はずれ
た酵素活性および保持を示した。
この発明にしたがった菌の細胞壁物質は、菌が脂質、
タンパク質、核酸およびキトサンを除去するために抽出
にさらされる工程によってキチンまたはキトサンを含む
菌から調製される。通常、菌は、また抽出を容易にする
ために物理的に分解される。適当な工程にしたがって、
菌糸体は、 ａ） 有機溶剤での処理によって物理的に分解および／
または脱脂され、 ｂ） アルカリまたは酵素での処理によって除タンパク
され、核酸除去され、かつもし望まれるならば、キトサ
ンを除去するために酸で処理される。
タンパク質、核酸およびキトサンを除去するために抽出
にさらされる工程によってキチンまたはキトサンを含む
菌から調製される。通常、菌は、また抽出を容易にする
ために物理的に分解される。適当な工程にしたがって、
菌糸体は、 ａ） 有機溶剤での処理によって物理的に分解および／
または脱脂され、 ｂ） アルカリまたは酵素での処理によって除タンパク
され、核酸除去され、かつもし望まれるならば、キトサ
ンを除去するために酸で処理される。
この発明の工程において、その細胞壁がキチンまたは
キトサンを含む任意の菌が使用されることができる。適
当な菌の例は、アスペルギルス属、フザリウム属および
ペニシリウム属を有する二核菌門（Phylum Dikaryomyc
ota）と同様に、アブシディア属、ケカビ属およびクモ
ノスカビ属を有する接合菌門（Phylum Zygomycota）で
ある。これらの菌は、たとえば、窒素源、炭素源および
ビタミンを含む液体培地において培養されてもよい。他
の窒素源の例は、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH2NO3のような
無機源または尿素、ペプトン、大豆タンパクおよびコー
ンスティープリカーのような有機源である。イースト抽
出はビタミン供給として添加されてもよい。適当な炭素
源はグルコース、ラクトース、マルトース、スクロー
ス、スターチおよび糖みつのような炭水化物である。培
養条件は重要でないが従来の方法が適用され得るであろ
う。
キトサンを含む任意の菌が使用されることができる。適
当な菌の例は、アスペルギルス属、フザリウム属および
ペニシリウム属を有する二核菌門（Phylum Dikaryomyc
ota）と同様に、アブシディア属、ケカビ属およびクモ
ノスカビ属を有する接合菌門（Phylum Zygomycota）で
ある。これらの菌は、たとえば、窒素源、炭素源および
ビタミンを含む液体培地において培養されてもよい。他
の窒素源の例は、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH2NO3のような
無機源または尿素、ペプトン、大豆タンパクおよびコー
ンスティープリカーのような有機源である。イースト抽
出はビタミン供給として添加されてもよい。適当な炭素
源はグルコース、ラクトース、マルトース、スクロー
ス、スターチおよび糖みつのような炭水化物である。培
養条件は重要でないが従来の方法が適用され得るであろ
う。
物理的分解ステップは、音波処理、ミル摩砕、砂振動
および高速せん断のような任意の従来の方法によって行
なわれることができるが、好しくは分解は凍結−加圧に
よって行なわれる。分解された細胞壁は、好ましくは20
μｍ未満の粒径を有する。分解の後、細胞内原形質物質
は水で洗い落とされることができる。
および高速せん断のような任意の従来の方法によって行
なわれることができるが、好しくは分解は凍結−加圧に
よって行なわれる。分解された細胞壁は、好ましくは20
μｍ未満の粒径を有する。分解の後、細胞内原形質物質
は水で洗い落とされることができる。
分解された細胞壁は好ましくは脂質を除去するために
メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム、ア
セトンおよびベンゼンのような有機溶剤での抽出にさら
される。溶剤の中でエタノールが好ましいものである。
メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム、ア
セトンおよびベンゼンのような有機溶剤での抽出にさら
される。溶剤の中でエタノールが好ましいものである。
脱脂された細胞壁はそれからタンパク質および核酸を
除去するためにアルカリまたは酵素で処理される。適当
なアルカリ溶液はKOH、NaOH、Co（OH）２、およびNH4OH
の水溶液である。酵素プロティナーゼはタンパク質を除
去するために使用されることができ、かつ酵素ヌクレア
ーゼは核酸を除去するために使用され得るであろう。ア
ルカリの濃度は使用される菌の門に依存する。好ましく
は、よれは接合菌に対してはNaOHの0.2N−2.0Nであっ
て、子嚢菌類に対しておおよそ8Nである。細胞壁が物理
的分解にさらされないとき、または20μｍより大きな平
均粒径に帰する穏やかな分解にさらされるだけならば、
アルカリでの処理は接合菌に対しては、NaOHの1.0Nまた
はそれより高いような比較的強いアルカリ溶液を使用す
ることによって行なわれるべきである。
除去するためにアルカリまたは酵素で処理される。適当
なアルカリ溶液はKOH、NaOH、Co（OH）２、およびNH4OH
の水溶液である。酵素プロティナーゼはタンパク質を除
去するために使用されることができ、かつ酵素ヌクレア
ーゼは核酸を除去するために使用され得るであろう。ア
ルカリの濃度は使用される菌の門に依存する。好ましく
は、よれは接合菌に対してはNaOHの0.2N−2.0Nであっ
て、子嚢菌類に対しておおよそ8Nである。細胞壁が物理
的分解にさらされないとき、または20μｍより大きな平
均粒径に帰する穏やかな分解にさらされるだけならば、
アルカリでの処理は接合菌に対しては、NaOHの1.0Nまた
はそれより高いような比較的強いアルカリ溶液を使用す
ることによって行なわれるべきである。
脱脂され、脱タンパクされ、かつ核酸除去された細胞
壁からのキトサンの除去は選択的なことであるが、細胞
壁物質の製造の工程においては好ましいステップであ
る。酸の処理によって、遊離キトサンは溶解されかつ細
胞壁から除去される。酢酸は好ましい酸であるが、希塩
酸およびギ酸のような他の酸もまた使用されてもよい。
除去されたキトサンはpHは9.0に調整することによって
沈殿させられることができる。
壁からのキトサンの除去は選択的なことであるが、細胞
壁物質の製造の工程においては好ましいステップであ
る。酸の処理によって、遊離キトサンは溶解されかつ細
胞壁から除去される。酢酸は好ましい酸であるが、希塩
酸およびギ酸のような他の酸もまた使用されてもよい。
除去されたキトサンはpHは9.0に調整することによって
沈殿させられることができる。
この発明の工程によって生成された細胞壁物質はヘキ
ソサミンを含み、かつ酸および中性pH値で正のゼータ電
位を呈し、かつ好ましくはそのゼータ電位はpH6で20mV
を越える。
ソサミンを含み、かつ酸および中性pH値で正のゼータ電
位を呈し、かつ好ましくはそのゼータ電位はpH6で20mV
を越える。
pH7では、脱脂された細胞壁と同様に物理的に分解さ
れた細胞壁は水中で負に帯電される。しかしながら、次
の酢酸抽出の後と同様にアルカリ抽出の後で、分解され
た細胞壁物質は正のゼータ電位（正電荷）を示す。通
常、この発明の分解された細胞壁は20μｍ未満の平均粒
径を有する。
れた細胞壁は水中で負に帯電される。しかしながら、次
の酢酸抽出の後と同様にアルカリ抽出の後で、分解され
た細胞壁物質は正のゼータ電位（正電荷）を示す。通
常、この発明の分解された細胞壁は20μｍ未満の平均粒
径を有する。
この発明の細胞壁物質はpH4とpH7との間でウシ血清ア
ルブミン（BSA）、およびpH3.5とpH6.2との間でイース
トRNAを凝集させる優れた能力を有した。屠殺場ならび
にイースト、マーガリンおよび魚の缶詰製造工場からの
廃水はpH6で細胞壁物質によって容易に清浄されること
ができる。
ルブミン（BSA）、およびpH3.5とpH6.2との間でイース
トRNAを凝集させる優れた能力を有した。屠殺場ならび
にイースト、マーガリンおよび魚の缶詰製造工場からの
廃水はpH6で細胞壁物質によって容易に清浄されること
ができる。
この発明はさらに以下の実施例によって説明される。
実施例１ 以下の表１にしたがった５つの異なった接合菌株と２
つの異なった子嚢菌類株はグルコース、イースト抽出お
よび鉱質塩類を含む培地において培養された。成長の
後、菌糸体はナイロンのネット上で濾過されかつＸ−プ
レスにおいて分解された。分解された菌糸体は水で洗わ
れ、それから熱いエタノールで、接合菌に対しては熱い
1N NaOH、かつ子嚢菌類に対しては8N NaOHで２回、熱
水で２回、かつ最後に0.2N酢酸で抽出され、各々の抽出
ステップには濾過が続いた。変更されたエルソン−モー
ガン（Elson−Morgan）法（ジョージC.チェン他、応用
環境微生物学（Appl.Envir.Microbiol.）、46、13−1
6、1983）によって検出されたようなヘキソサミン含量
と得られた細胞壁物質のゼータ電位（マルバーン・ゼー
タサイザII、マルバーン インストルメンツ リミテッ
ド（Malvern Instruments Ltd.）、英国ウォーセスタ
ーシャ（Worcestershire）WR14 1AQ、マルバーン）と
は、細胞壁物質およびキトサンの収率と同様に以下の表
２に示される。たいていの細胞壁物質は５ないし10μｍ
の粒径を有した。表 １ Ａ アブシディア属コルレア（absidia coerulea）IMI
38500 Ｂ ケカビ属sp.（Mucor sp.）（チャイニーズ分離株
（Chinese isolate）） Ｃ ケカビ属ルウキシ（Mucor rouxii）ATCC 24905 Ｄ クモノスカビ属オリゴスポラス（Rhizopusoligospo
rus）MUCL 18813 Ｅ クモノスカビ属オリザエ（Rhizopus oryzae）CBS
112.07 Ｆ アスベルギルス属ニガー（Aspergillus niger）CC
UG sp. Ｇ フザリウム属ポアエ（Fusarium poae）CCUG 2242
5 ATCC＝アメリカンタイプカルチャーコレクション、米
国20852メリーランド州、ロックビル、パークローンド
ライブ12301（American Type Culture Collection,1230
1 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USA.） CBS＝セントラールビュロ ボル シクシマルキュル
チュア ジュリアナラーン67a、2628 BC デルフト
オランド（Centraalbureau voor Schimmelcultures,Jul
ianalaan 67a,2628 BC Delft,Natherlands.） CCUG＝カルチャーコレクション、ユニバーシティオブ
ゲーテボルグ、グルデーズガタン10、Ｓ−413 46 ゲ
ーテボルグ、スウェーデン（Culture Collection,Unive
rsity of Gteborg,Guldhedsgatan 10,S−413 46 Gt
eborg,Sweden） IMI＝コモンウェルス マイコロジカル インスティ
テュート 英国、サリー キュー（commonwealth Mycol
ogical Institute,Kew,Surrey,England.） MUCL＝ミコテーク ド リュニバルシテ カトリク
ド ルバン、プラス クロア デュ シュド ３ Bte
8、1348ルラン−ラ−ノーブ、ベルギー（Mycotheque de
1′Universit Catholique de Louvain,Place Croix
du Sub 3 Bte8,1348 Lourain−la−Neuve,Belgium.） 比較として、未精製の細胞壁物質は分解および分解さ
れた細胞壁を水中で完全に洗うことによって株Ｂおよび
株Ｅから調製された。分解された細胞壁物質の一部は脱
脂のために熱いアタノールで抽出された。脱脂された細
胞壁物質と未精製の細胞壁物質との双方のゼータ電位が
測定された。以下の結果が得られた。
つの異なった子嚢菌類株はグルコース、イースト抽出お
よび鉱質塩類を含む培地において培養された。成長の
後、菌糸体はナイロンのネット上で濾過されかつＸ−プ
レスにおいて分解された。分解された菌糸体は水で洗わ
れ、それから熱いエタノールで、接合菌に対しては熱い
1N NaOH、かつ子嚢菌類に対しては8N NaOHで２回、熱
水で２回、かつ最後に0.2N酢酸で抽出され、各々の抽出
ステップには濾過が続いた。変更されたエルソン−モー
ガン（Elson−Morgan）法（ジョージC.チェン他、応用
環境微生物学（Appl.Envir.Microbiol.）、46、13−1
6、1983）によって検出されたようなヘキソサミン含量
と得られた細胞壁物質のゼータ電位（マルバーン・ゼー
タサイザII、マルバーン インストルメンツ リミテッ
ド（Malvern Instruments Ltd.）、英国ウォーセスタ
ーシャ（Worcestershire）WR14 1AQ、マルバーン）と
は、細胞壁物質およびキトサンの収率と同様に以下の表
２に示される。たいていの細胞壁物質は５ないし10μｍ
の粒径を有した。表 １ Ａ アブシディア属コルレア（absidia coerulea）IMI
38500 Ｂ ケカビ属sp.（Mucor sp.）（チャイニーズ分離株
（Chinese isolate）） Ｃ ケカビ属ルウキシ（Mucor rouxii）ATCC 24905 Ｄ クモノスカビ属オリゴスポラス（Rhizopusoligospo
rus）MUCL 18813 Ｅ クモノスカビ属オリザエ（Rhizopus oryzae）CBS
112.07 Ｆ アスベルギルス属ニガー（Aspergillus niger）CC
UG sp. Ｇ フザリウム属ポアエ（Fusarium poae）CCUG 2242
5 ATCC＝アメリカンタイプカルチャーコレクション、米
国20852メリーランド州、ロックビル、パークローンド
ライブ12301（American Type Culture Collection,1230
1 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USA.） CBS＝セントラールビュロ ボル シクシマルキュル
チュア ジュリアナラーン67a、2628 BC デルフト
オランド（Centraalbureau voor Schimmelcultures,Jul
ianalaan 67a,2628 BC Delft,Natherlands.） CCUG＝カルチャーコレクション、ユニバーシティオブ
ゲーテボルグ、グルデーズガタン10、Ｓ−413 46 ゲ
ーテボルグ、スウェーデン（Culture Collection,Unive
rsity of Gteborg,Guldhedsgatan 10,S−413 46 Gt
eborg,Sweden） IMI＝コモンウェルス マイコロジカル インスティ
テュート 英国、サリー キュー（commonwealth Mycol
ogical Institute,Kew,Surrey,England.） MUCL＝ミコテーク ド リュニバルシテ カトリク
ド ルバン、プラス クロア デュ シュド ３ Bte
8、1348ルラン−ラ−ノーブ、ベルギー（Mycotheque de
1′Universit Catholique de Louvain,Place Croix
du Sub 3 Bte8,1348 Lourain−la−Neuve,Belgium.） 比較として、未精製の細胞壁物質は分解および分解さ
れた細胞壁を水中で完全に洗うことによって株Ｂおよび
株Ｅから調製された。分解された細胞壁物質の一部は脱
脂のために熱いアタノールで抽出された。脱脂された細
胞壁物質と未精製の細胞壁物質との双方のゼータ電位が
測定された。以下の結果が得られた。
上記から、４を超えるpH値での未精製の細胞壁物質は
負のゼータ電位を呈する一方で、この発明にしたがって
生成された細胞壁物質は正に帯電されることが明らかで
ある。
負のゼータ電位を呈する一方で、この発明にしたがって
生成された細胞壁物質は正に帯電されることが明らかで
ある。
菌糸体がW.I.マクガーレン他、プロセス生化学、19、
88−90、1984にしたがって処理される別の比較テストも
また行なわれた。ウォーリングブレンダ（Waring blen
dor）における分解の後、ゼータ電位は測定されpH7.0で
負であるとわかった。
88−90、1984にしたがって処理される別の比較テストも
また行なわれた。ウォーリングブレンダ（Waring blen
dor）における分解の後、ゼータ電位は測定されpH7.0で
負であるとわかった。
実施例２ 実施例１からの3.6mg乾燥重量の細胞壁物質および1ml
ウシ血清アルブミンBSA（6mg/ml）は10ml試験管にピペ
ットで分注された。6.0のpH値へのpH調整の後懸濁液体
積が6mlになるような量で水が添加された。最終のBSA濃
度は1mg/mlで、細胞壁物質は600ppmであった。実施例１
のテストからの正に帯電された細胞壁物質がBSAと混合
されたとき、凝集および集成が直ちに現われた。正に帯
電された細胞壁物質の代わりに、実施例１における比較
からの負に帯電された未精製の細胞壁物質および脱脂さ
れた細胞物質が使用されたとき、凝集または集成は起こ
らなかった。キトサンでの比較テストもまた行なわれ
た。凝集能力は278nmでのUV吸光度で求められ、以下の
ように計算された。
ウシ血清アルブミンBSA（6mg/ml）は10ml試験管にピペ
ットで分注された。6.0のpH値へのpH調整の後懸濁液体
積が6mlになるような量で水が添加された。最終のBSA濃
度は1mg/mlで、細胞壁物質は600ppmであった。実施例１
のテストからの正に帯電された細胞壁物質がBSAと混合
されたとき、凝集および集成が直ちに現われた。正に帯
電された細胞壁物質の代わりに、実施例１における比較
からの負に帯電された未精製の細胞壁物質および脱脂さ
れた細胞物質が使用されたとき、凝集または集成は起こ
らなかった。キトサンでの比較テストもまた行なわれ
た。凝集能力は278nmでのUV吸光度で求められ、以下の
ように計算された。
以下の結果が得られた。表４ 菌 BSA凝集能力 ％ Ａ1/ 97 Ｂ 95 Ｃ 99 Ｄ 96 Ｅ 95 Ｆ 91 Ｇ 90 Ｈ2/ 77 キトサン3/ 58 キトサン4/ 18 1/ 文字Ａ−Ｇは表１にあてはまる。
2/ ペリシリウム属フレキュエンタンス（Penicillium
frequentans）CCUG sp. 3/ 50ないし100ppmの濃度での最大能力 4/ およそ300ppmの濃度での最大能力 テストから、この発明の細胞壁物質は優れたBSA凝集
能力を有し、この点に関してキトサンに勝っているとい
うことが明らかである。
frequentans）CCUG sp. 3/ 50ないし100ppmの濃度での最大能力 4/ およそ300ppmの濃度での最大能力 テストから、この発明の細胞壁物質は優れたBSA凝集
能力を有し、この点に関してキトサンに勝っているとい
うことが明らかである。
実施例３ クモノスガビ属オリザエ（Rhizopus oryzae）CBS 1
12.07は実施例１と同じ態様で培養されかつ集菌され
た。菌糸体は３時間の間直接熱いエタノールで洗われか
つ抽出された。乾燥の後、脱脂された菌糸体が得られ、
かつその15gは主に実施例１と似た態様でNaOHおよび酢
酸で処理されたが、NaOHの濃度は0.2Nであった。水での
洗浄の後、アルカリ処理された菌糸体は0.2N酢酸中の懸
濁され、高いせん断力（ウルトラタラックス（Ultra t
urrax、西ドイツ、ストーフェン（Staufen）、ジャンク
＆カンケル（Janke ＆ Kunkel））のもとで１分間分
解され、それは300mlの4.12mg/mlの生体凝集剤をもたら
した。遠心分離および9.0への水の液相のpH調整の後、
7.65重量％の収率でキトサンが得られた。この発明にし
たがった細胞壁物質の収率は6.77重量％であった。BSA
の凝集は、クモノスガビ属オリザエCBS112.07から異な
った濃度の細胞壁生体凝集剤で実施例２でのように行な
われた。得られた結果は表５に示される。表５ 細胞壁物質 ppm 100 200 400 600 800 BSA凝集 38 65 95 95 94 実施例４ 1mlの量でのイーストから誘導されたリボ核酸（RNA）
溶液（純度78％、0.05％NH4OHおよび10％NaCl中の0.5mg
/ml）は、実施例１でのようにクモノスカビ属オリザエC
BS112.07から調製された2.75ml細胞壁物質（1.6mg/ml）
および0.1ml2N酢酸とともに試験管へ加えられた。混合
物のpH値は0.1N NaOHを添加することによって調整され
た。凝集能力が求められた。RNAは70℃での0.5N過塩素
酸での加水分解の後260nmでのUV吸光度によって検出さ
れた（S.オーラ（Ohla）他、応用微生物学22、p415−42
1、1971）。以下の結果が得られた。表８ pH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.2 RNA凝集％ 89 94 95 97 97 97 結果から、この細胞壁物質はRNA上で優れた凝集能力
を有したということが明らかである。比較として、キト
サンは上記pH値での広範囲の濃度においてRNAを凝集し
なかった。
12.07は実施例１と同じ態様で培養されかつ集菌され
た。菌糸体は３時間の間直接熱いエタノールで洗われか
つ抽出された。乾燥の後、脱脂された菌糸体が得られ、
かつその15gは主に実施例１と似た態様でNaOHおよび酢
酸で処理されたが、NaOHの濃度は0.2Nであった。水での
洗浄の後、アルカリ処理された菌糸体は0.2N酢酸中の懸
濁され、高いせん断力（ウルトラタラックス（Ultra t
urrax、西ドイツ、ストーフェン（Staufen）、ジャンク
＆カンケル（Janke ＆ Kunkel））のもとで１分間分
解され、それは300mlの4.12mg/mlの生体凝集剤をもたら
した。遠心分離および9.0への水の液相のpH調整の後、
7.65重量％の収率でキトサンが得られた。この発明にし
たがった細胞壁物質の収率は6.77重量％であった。BSA
の凝集は、クモノスガビ属オリザエCBS112.07から異な
った濃度の細胞壁生体凝集剤で実施例２でのように行な
われた。得られた結果は表５に示される。表５ 細胞壁物質 ppm 100 200 400 600 800 BSA凝集 38 65 95 95 94 実施例４ 1mlの量でのイーストから誘導されたリボ核酸（RNA）
溶液（純度78％、0.05％NH4OHおよび10％NaCl中の0.5mg
/ml）は、実施例１でのようにクモノスカビ属オリザエC
BS112.07から調製された2.75ml細胞壁物質（1.6mg/ml）
および0.1ml2N酢酸とともに試験管へ加えられた。混合
物のpH値は0.1N NaOHを添加することによって調整され
た。凝集能力が求められた。RNAは70℃での0.5N過塩素
酸での加水分解の後260nmでのUV吸光度によって検出さ
れた（S.オーラ（Ohla）他、応用微生物学22、p415−42
1、1971）。以下の結果が得られた。表８ pH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.2 RNA凝集％ 89 94 95 97 97 97 結果から、この細胞壁物質はRNA上で優れた凝集能力
を有したということが明らかである。比較として、キト
サンは上記pH値での広範囲の濃度においてRNAを凝集し
なかった。
実施例５ 細胞壁生体凝集剤でのBSAの凝集はpH6.0で実施例２で
のように行なわれた。ケカビ属sp.（Mucorsp.）（チャ
イニーズ分離株）およびクモノスカビ属オリザエCBS11
2.07の細胞壁生体凝集剤は以下のように３回再生され
た。BSA−生体凝集剤凝集物は遠心分離され、5ml 0.2N
NAc中で再懸濁され、20分間激しく攪拌され、10分間4
000rpmで遠心分離され、5ml 0.2N HAc中で再懸濁さ
れ、かつ再び１分間攪拌された。遠心分離の後、沈降物
は10ml水で２回洗われ、最後に15分間4000rpmで遠心分
離された。再生された細胞壁生体凝集剤はBSAを凝集さ
せるために再使用された。
のように行なわれた。ケカビ属sp.（Mucorsp.）（チャ
イニーズ分離株）およびクモノスカビ属オリザエCBS11
2.07の細胞壁生体凝集剤は以下のように３回再生され
た。BSA−生体凝集剤凝集物は遠心分離され、5ml 0.2N
NAc中で再懸濁され、20分間激しく攪拌され、10分間4
000rpmで遠心分離され、5ml 0.2N HAc中で再懸濁さ
れ、かつ再び１分間攪拌された。遠心分離の後、沈降物
は10ml水で２回洗われ、最後に15分間4000rpmで遠心分
離された。再生された細胞壁生体凝集剤はBSAを凝集さ
せるために再使用された。
結果から、凝集能力は再生によって不利に影響を受け
なかったということが明らかである。
なかったということが明らかである。
実施例６ イースト工場、マーガリン工場、屠殺場および魚の缶
詰工場からの廃水は細胞壁生体凝集剤によって清浄され
た。クモノスカビ属オリザエCBS112.07またはケカビ属s
p.（チャイニーズ分離株）の細胞壁生体凝集剤懸濁液は
実施例１でのように準備された。凝集剤懸濁液は、高い
攪拌速度で20秒間の間、50ml水サンプルに、最終体積の
60ml（魚缶詰工場からの水で100ml）まで添加された。p
HはNaOHまたはHClで6.0−6.2に調整され、かつサンプル
は２分間ゆっくりと攪拌された。サンプルは75分間の間
（魚の缶詰工場水で180分間）沈降のためにおかれ、そ
の後上澄み液25mlは濁度測定のためにピペットで吸われ
た。残留濁度として示される廃水清浄の結果は以下の表
に示される。
詰工場からの廃水は細胞壁生体凝集剤によって清浄され
た。クモノスカビ属オリザエCBS112.07またはケカビ属s
p.（チャイニーズ分離株）の細胞壁生体凝集剤懸濁液は
実施例１でのように準備された。凝集剤懸濁液は、高い
攪拌速度で20秒間の間、50ml水サンプルに、最終体積の
60ml（魚缶詰工場からの水で100ml）まで添加された。p
HはNaOHまたはHClで6.0−6.2に調整され、かつサンプル
は２分間ゆっくりと攪拌された。サンプルは75分間の間
（魚の缶詰工場水で180分間）沈降のためにおかれ、そ
の後上澄み液25mlは濁度測定のためにピペットで吸われ
た。残留濁度として示される廃水清浄の結果は以下の表
に示される。
実施例７ 0.25mlペニシリンＶアシラーゼ（78 U/ml、5.0U/mg
タンパク質）、5.0mg/mlでの1.55ml細胞壁物質（実施例
１にしたがって生成されたクモノスカビ属オリザエ、CB
S 112.07）、および1mlの50mMリン酸カリウム緩衝液、
pH7.5（KPB）が10ml試験管へ分注されるとすぐ、異なっ
た量の2.5％グルタルアルデヒドおよび最終蒸留水が総
体積5.0mlになるように加えられた。最終グルタルアル
デヒド濃度は0.04％から0.16％に変化した。すべての混
合物は４℃で一晩中振とうされた。固定化されたペニシ
リンＶアシラーゼは遠心分離によって回収された。沈降
物は、10ml蒸留水で２回、2ml 3M NaClで１回、かつ1
0ml蒸留水で２回連続して洗われ、最後に5.0mlへと蒸留
水中で懸濁され、徹底的に混合され、そして固定化され
たペニシリンＶアシラーゼの活性は以下のように求めら
れた。
タンパク質）、5.0mg/mlでの1.55ml細胞壁物質（実施例
１にしたがって生成されたクモノスカビ属オリザエ、CB
S 112.07）、および1mlの50mMリン酸カリウム緩衝液、
pH7.5（KPB）が10ml試験管へ分注されるとすぐ、異なっ
た量の2.5％グルタルアルデヒドおよび最終蒸留水が総
体積5.0mlになるように加えられた。最終グルタルアル
デヒド濃度は0.04％から0.16％に変化した。すべての混
合物は４℃で一晩中振とうされた。固定化されたペニシ
リンＶアシラーゼは遠心分離によって回収された。沈降
物は、10ml蒸留水で２回、2ml 3M NaClで１回、かつ1
0ml蒸留水で２回連続して洗われ、最後に5.0mlへと蒸留
水中で懸濁され、徹底的に混合され、そして固定化され
たペニシリンＶアシラーゼの活性は以下のように求めら
れた。
酵素、ca ５ Ｕの1ml固定化された酵素懸濁液、蒸
留水20mlおよび2.0ml50mM KPB、pH7.5は混ぜられ、か
つ28℃で激しく攪拌され、それから20ml ４％カリウム
ペニシリンＶ（蒸留水溶液）が添加された。pHは10分間
の後10mM NahOの滴定で7.5に再調整された。１単位の
ペニシリンＶアシラーゼは１分間での１μM6−アミノペ
ニシラン酸の生成として規定される。固定化されたペニ
シリンＶアシラーゼの活性に対するグルタルアルデヒド
の濃度の影響は表11に示され、酵素と細胞壁との間の比
は表12に示される。
留水20mlおよび2.0ml50mM KPB、pH7.5は混ぜられ、か
つ28℃で激しく攪拌され、それから20ml ４％カリウム
ペニシリンＶ（蒸留水溶液）が添加された。pHは10分間
の後10mM NahOの滴定で7.5に再調整された。１単位の
ペニシリンＶアシラーゼは１分間での１μM6−アミノペ
ニシラン酸の生成として規定される。固定化されたペニ
シリンＶアシラーゼの活性に対するグルタルアルデヒド
の濃度の影響は表11に示され、酵素と細胞壁との間の比
は表12に示される。
実施例８ 25％乾燥重量での1.0gの圧搾されたパンイースト、サ
ッカロミセス属セレビジアエ（Saccharomyces cerevis
iae）は100ml 0.01 Ｍ リン酸緩衝液pH6.0中で懸濁
された。2mlのイースト懸濁液および（実施例１にした
がって生成された、クモノスカビ属オリザエCBS 112.0
7 5.0mg/ml）細胞壁物質は、表13で述べられた比が得
られるような量で10ml試験管へピペットで分注された。
細胞壁物質に対する乾燥圧搾イーストの比（w/w）は0.5
ないし3.0に維持された。リン酸緩衝液0.01M、pH 6.0
は5.0mlに添加され、懸濁液は徹底的に混ぜられた。凝
集は直ちに現われた。微視的に、凝集物は、細胞壁物質
と混ぜ合わされたイースト細胞からなった。すべての5.
0ml懸濁液はフィルタ紙を通し濾過され、濾液の濁度は5
00nmで求められた。イースト細胞の固定化は以下のよう
に計算された。
ッカロミセス属セレビジアエ（Saccharomyces cerevis
iae）は100ml 0.01 Ｍ リン酸緩衝液pH6.0中で懸濁
された。2mlのイースト懸濁液および（実施例１にした
がって生成された、クモノスカビ属オリザエCBS 112.0
7 5.0mg/ml）細胞壁物質は、表13で述べられた比が得
られるような量で10ml試験管へピペットで分注された。
細胞壁物質に対する乾燥圧搾イーストの比（w/w）は0.5
ないし3.0に維持された。リン酸緩衝液0.01M、pH 6.0
は5.0mlに添加され、懸濁液は徹底的に混ぜられた。凝
集は直ちに現われた。微視的に、凝集物は、細胞壁物質
と混ぜ合わされたイースト細胞からなった。すべての5.
0ml懸濁液はフィルタ紙を通し濾過され、濾液の濁度は5
00nmで求められた。イースト細胞の固定化は以下のよう
に計算された。
固定化（％）＝100（１−OD濾液/OD対照） 以下の結果が得られた。
細胞壁物質で固定化されたイースト細胞は、激しい攪
拌の間、高イオン強度および酸性またはアルカリ性水溶
液、たとえば、室温で、蒸留水、２％NaCl、0.1 Ｍ
リン酸緩衝液pH8.0、１％NH4OH、0.1N HAc、0.1M H3P
O4、0.1M HCl中、500rpmでの激しい攪拌の開安定であ
った。固定化されたイースト細胞は圧搾濾過、真空濾過
または遠心分離で処理されることができた。比較する
と、キトサンでのイースト細胞の凝集は２％NaCl溶液中
でも蒸留水中でも安定ではなかった。
拌の間、高イオン強度および酸性またはアルカリ性水溶
液、たとえば、室温で、蒸留水、２％NaCl、0.1 Ｍ
リン酸緩衝液pH8.0、１％NH4OH、0.1N HAc、0.1M H3P
O4、0.1M HCl中、500rpmでの激しい攪拌の開安定であ
った。固定化されたイースト細胞は圧搾濾過、真空濾過
または遠心分離で処理されることができた。比較する
と、キトサンでのイースト細胞の凝集は２％NaCl溶液中
でも蒸留水中でも安定ではなかった。
実施例９ CCUGからのシュードモナス属プチダ（Pseudomonas p
utida）EP 12690は肉エキス培地中で培養され、遠心分
離によって集菌され、水で２回洗われ、10.8mg/mlの乾
燥重量で水中で懸濁された。0.5mlの細菌懸濁液および
（実施例１にしたがって生成された、クモノスカビ属オ
リザエCBS 112.07）細胞壁物質は、表14で示された重
量比が得られるような量で10ml試験管にピペットで分注
され、水が5.0mlに加えられ、かつ固定化手順および固
定化の測定が実施例１の固定化されたイースト細胞に対
してのように行なわれた。
utida）EP 12690は肉エキス培地中で培養され、遠心分
離によって集菌され、水で２回洗われ、10.8mg/mlの乾
燥重量で水中で懸濁された。0.5mlの細菌懸濁液および
（実施例１にしたがって生成された、クモノスカビ属オ
リザエCBS 112.07）細胞壁物質は、表14で示された重
量比が得られるような量で10ml試験管にピペットで分注
され、水が5.0mlに加えられ、かつ固定化手順および固
定化の測定が実施例１の固定化されたイースト細胞に対
してのように行なわれた。
以下の結果が得られた。
細胞壁調製試料およびシュードモナス属プチダは双方
とも乾燥重量として与えられる。シュードモナス属プチ
ダおよび細胞壁の凝集物は、蒸留水、２％NaCl、0.1Mリ
ン酸緩衝液pH8.0、１％NH4OH、0.1N HAc、0.1M H3PO4
および0.1N HClにおける500rpmでの高速攪拌、濾過お
よび遠心分離手順の間、パンイーストのそれらと同様に
安定していた。
とも乾燥重量として与えられる。シュードモナス属プチ
ダおよび細胞壁の凝集物は、蒸留水、２％NaCl、0.1Mリ
ン酸緩衝液pH8.0、１％NH4OH、0.1N HAc、0.1M H3PO4
および0.1N HClにおける500rpmでの高速攪拌、濾過お
よび遠心分離手順の間、パンイーストのそれらと同様に
安定していた。
微生物細胞を細胞壁物質へ固定化する保持能力は高
く、1g細胞壁物質（乾燥重量）につき1.0−2.0gイース
ト細胞または0.9−1.35g細菌細胞であった。この発明の
細胞壁物質は、強い酸性およびアルカリ性水溶液中でさ
え高い保持および安定性があるために、微生物細胞固定
化のための良好なマトリックスであるということが明ら
かである。
く、1g細胞壁物質（乾燥重量）につき1.0−2.0gイース
ト細胞または0.9−1.35g細菌細胞であった。この発明の
細胞壁物質は、強い酸性およびアルカリ性水溶液中でさ
え高い保持および安定性があるために、微生物細胞固定
化のための良好なマトリックスであるということが明ら
かである。
実施例10 タチナタマメ（Jack bean）ウレアーゼ75U/mg（シグ
マケミカルコーポレーション（Sigma Chemical C
o））は1mg/mlで0.02Mリン酸緩衝液pH7.0中で溶解され
た。4mlのウレアーゼ溶液および（実施例１にしたがっ
て生成された、アブシディア属コルレア（Absidia coe
rulea）IMI 38500）4mg/ml細胞壁物質は、表15で示さ
れた重量比が得られるような量で10ml試験管へピペット
で分注され、５分間ゆっくりと攪拌され、それから４℃
で夜通しおかれた。結合されたウレアーゼを有する細胞
壁は遠心分離によって回収された。上澄み液のウレアー
ゼ活性が求められ、固定化されないウレアーゼと見なさ
れた。沈殿物は、5ml蒸留水、5ml3 Ｎ NaCl、5.0ml蒸
留水×２および5ml 0.02Mリン酸緩衝液pH7.0で連続的
に洗われ、最後に4.0ml 0.02M リン酸緩衝液pH7.0中
で懸濁され、徹底的に混ぜられ、固定化されたウレアー
ゼ調製試料として使用された。遊離（固定化されない）
ウレアーゼとしての上澄み液および固定化されたウレア
ーゼの活性は、ウォーシントン エンザイム マニュア
ル、p144、米国ニュージャージー州フリーホールド、ウ
ォーシントンバイオケミカルコーポレーション、1972
（Worthington Enzyme Manual,p144,Worthington Bioch
emical Co.,Freehold,New Jersey,USA,1972）に述べら
れるように検出された。ウレアーゼ活性の１単位はpH7.
0および25℃で１分につき１分子のアンモニアを遊離す
ることと規定された。上澄み液中の遊離ウレアーゼは0.
9−3.4％に達した。以下の結果が得られた。
マケミカルコーポレーション（Sigma Chemical C
o））は1mg/mlで0.02Mリン酸緩衝液pH7.0中で溶解され
た。4mlのウレアーゼ溶液および（実施例１にしたがっ
て生成された、アブシディア属コルレア（Absidia coe
rulea）IMI 38500）4mg/ml細胞壁物質は、表15で示さ
れた重量比が得られるような量で10ml試験管へピペット
で分注され、５分間ゆっくりと攪拌され、それから４℃
で夜通しおかれた。結合されたウレアーゼを有する細胞
壁は遠心分離によって回収された。上澄み液のウレアー
ゼ活性が求められ、固定化されないウレアーゼと見なさ
れた。沈殿物は、5ml蒸留水、5ml3 Ｎ NaCl、5.0ml蒸
留水×２および5ml 0.02Mリン酸緩衝液pH7.0で連続的
に洗われ、最後に4.0ml 0.02M リン酸緩衝液pH7.0中
で懸濁され、徹底的に混ぜられ、固定化されたウレアー
ゼ調製試料として使用された。遊離（固定化されない）
ウレアーゼとしての上澄み液および固定化されたウレア
ーゼの活性は、ウォーシントン エンザイム マニュア
ル、p144、米国ニュージャージー州フリーホールド、ウ
ォーシントンバイオケミカルコーポレーション、1972
（Worthington Enzyme Manual,p144,Worthington Bioch
emical Co.,Freehold,New Jersey,USA,1972）に述べら
れるように検出された。ウレアーゼ活性の１単位はpH7.
0および25℃で１分につき１分子のアンモニアを遊離す
ることと規定された。上澄み液中の遊離ウレアーゼは0.
9−3.4％に達した。以下の結果が得られた。
固定化ウレアーゼは固定化前の初期のウレアーゼ活性
の％として与えられる。
の％として与えられる。
４℃および室温での細胞壁固定化ウレアーゼの安定性
は表16に示される。表16 日 0 11 27 42 活性 ％ ４℃ 100 89 78 72 室温 100 89 71 34 固定化ウレアーゼの酵素活性は激しい攪拌条件の下で
安定していた。ウレアーゼ保持37800U/g（乾燥細胞壁）
は、親水性合成多孔ポリマビーズ416U/g（乾燥保持体）
（モーツ（Mauz）、オットー（Otto）他、Ger.Offen.DE
３ 714 276、1988）のそれと、合成陽イオン交換樹
脂340U/g（乾燥樹脂）（H.J.モイニハン（Moynihan）
他、ハイオテクノロジーおよび生物工学（Biotechnolog
y and Bioengineering） 34:951−963、1989）のそ
れとよりもはるかに高かった。細胞壁へ固定化されたウ
レアーゼの酵素活性の半減期は４℃と室温との双方で27
日を越えた。
は表16に示される。表16 日 0 11 27 42 活性 ％ ４℃ 100 89 78 72 室温 100 89 71 34 固定化ウレアーゼの酵素活性は激しい攪拌条件の下で
安定していた。ウレアーゼ保持37800U/g（乾燥細胞壁）
は、親水性合成多孔ポリマビーズ416U/g（乾燥保持体）
（モーツ（Mauz）、オットー（Otto）他、Ger.Offen.DE
３ 714 276、1988）のそれと、合成陽イオン交換樹
脂340U/g（乾燥樹脂）（H.J.モイニハン（Moynihan）
他、ハイオテクノロジーおよび生物工学（Biotechnolog
y and Bioengineering） 34:951−963、1989）のそ
れとよりもはるかに高かった。細胞壁へ固定化されたウ
レアーゼの酵素活性の半減期は４℃と室温との双方で27
日を越えた。
実施例11 グルコースオキシダーゼ59.4U/mgは2mg/mlで蒸留水中
で溶解された。4mlのグルコースオキシダーゼ溶液、1.6
ml細胞壁物質（実施例１にしたがった5.0mg/mlクモノス
カビ属オリザエCBS112.07）、2.4ml蒸留水および0.32ml
の５％グルタリアルデヒドは10ml試験管にピペットで分
注され、混ぜられ、それから４℃で夜通し置かれた。グ
ルコースオキシダーゼは、二官能化合物グルタルアルデ
ヒドを架橋剤として使用して細胞壁物質に固定された。
細胞壁固定化グルコースオキシダーゼは遠心分離によっ
て回収された。沈殿物は10ml蒸留水×２、10ml 0.25M
KCl、10ml蒸留水×２で連続的に洗われ、最後に200ml
蒸留水中で懸濁された。この200ml懸濁液は１分間の
間、高いせん断力のもとでホモジナイズされ、固定化グ
ルコースオキシダーゼが測定された（ウォーシントン
エンザイム マニュアル、p19、米国ニュージャージー
州フリーホールド、ウォーシントンバイオケミカルコー
ポレーション、1972）。１単位のグルコースオキシダー
ゼ活性は25℃で１分につき１分子のH2O2のを遊離させる
量として規定された。
で溶解された。4mlのグルコースオキシダーゼ溶液、1.6
ml細胞壁物質（実施例１にしたがった5.0mg/mlクモノス
カビ属オリザエCBS112.07）、2.4ml蒸留水および0.32ml
の５％グルタリアルデヒドは10ml試験管にピペットで分
注され、混ぜられ、それから４℃で夜通し置かれた。グ
ルコースオキシダーゼは、二官能化合物グルタルアルデ
ヒドを架橋剤として使用して細胞壁物質に固定された。
細胞壁固定化グルコースオキシダーゼは遠心分離によっ
て回収された。沈殿物は10ml蒸留水×２、10ml 0.25M
KCl、10ml蒸留水×２で連続的に洗われ、最後に200ml
蒸留水中で懸濁された。この200ml懸濁液は１分間の
間、高いせん断力のもとでホモジナイズされ、固定化グ
ルコースオキシダーゼが測定された（ウォーシントン
エンザイム マニュアル、p19、米国ニュージャージー
州フリーホールド、ウォーシントンバイオケミカルコー
ポレーション、1972）。１単位のグルコースオキシダー
ゼ活性は25℃で１分につき１分子のH2O2のを遊離させる
量として規定された。
固定化グルコースオキシダーゼの保持は、合成ポリア
クリルアミンビーズ100U/g（乾燥保持体）（B.スザジャ
ニ（Szajni）他、応用生化学およびバイオテクノロジ
ー（Applied Biochemistry and Biotechnology）14:3
7−47、1987）のそれよりもはるかに優れた26800U/g
（乾燥細胞壁）であった。固定化グルコースオキシダー
ゼは、固定化前のグルコースオキシダーゼの初期の溶液
と比較して45.1％の活性を示した。
クリルアミンビーズ100U/g（乾燥保持体）（B.スザジャ
ニ（Szajni）他、応用生化学およびバイオテクノロジ
ー（Applied Biochemistry and Biotechnology）14:3
7−47、1987）のそれよりもはるかに優れた26800U/g
（乾燥細胞壁）であった。固定化グルコースオキシダー
ゼは、固定化前のグルコースオキシダーゼの初期の溶液
と比較して45.1％の活性を示した。
実施例12 100ml細胞壁物質（実施例１にしたがった6.0mg/mlア
ブシディア属コルレアIMI 38500）、20mlリン酸緩衝液
0.1M、pH7.6および5.0mlグルタルアルデヒド25％が200m
lビーカー中で混ぜられ、５分間ゆっくりと攪拌され、
それから室温で２時間置かれた。
ブシディア属コルレアIMI 38500）、20mlリン酸緩衝液
0.1M、pH7.6および5.0mlグルタルアルデヒド25％が200m
lビーカー中で混ぜられ、５分間ゆっくりと攪拌され、
それから室温で２時間置かれた。
グルタルアルデヒド活性化された細胞壁物質は焼結ガ
ラス漏斗中での真空濾過によって回収され、100ml蒸留
水で５回、50ml 0.1Mリン酸緩衝液、pH7.6で洗われ、
最後に60ml 0.1Mリン酸緩衝液、pH7.6中で懸濁され
た。1.5U/mgでの未精製のパパイン300mlは、システイン
0.05M、EDTA5×10-3Mおよびメルカプトエタノール１×1
0-6Mを含む27ml蒸留水溶液中で溶解させた。パパイン溶
液および活性化された細胞壁物質は混ぜられ、それから
４℃で夜通し置かれた。細胞壁固定化パパインは遠心分
離によって回収され、50ml蒸留水×２、50ml １ Ｎ
NaCl×２および50ml蒸留水×２で連続的に洗われ、蒸留
水中で懸濁され、全体で20gの最終重量になった。
ラス漏斗中での真空濾過によって回収され、100ml蒸留
水で５回、50ml 0.1Mリン酸緩衝液、pH7.6で洗われ、
最後に60ml 0.1Mリン酸緩衝液、pH7.6中で懸濁され
た。1.5U/mgでの未精製のパパイン300mlは、システイン
0.05M、EDTA5×10-3Mおよびメルカプトエタノール１×1
0-6Mを含む27ml蒸留水溶液中で溶解させた。パパイン溶
液および活性化された細胞壁物質は混ぜられ、それから
４℃で夜通し置かれた。細胞壁固定化パパインは遠心分
離によって回収され、50ml蒸留水×２、50ml １ Ｎ
NaCl×２および50ml蒸留水×２で連続的に洗われ、蒸留
水中で懸濁され、全体で20gの最終重量になった。
固定化パパインの活性が求められた（ウォーシントン
エンザイム マニュアル、p134、米国ニュージャージ
ー州フリーホールド、ウォーシントンバイオケミカルコ
ーポレーション、1972）。１単位のパパイン活性は25℃
で１分につき１分子のベンゾイルアルギニンエチルエス
テルを加水分割するものとして規定された。
エンザイム マニュアル、p134、米国ニュージャージ
ー州フリーホールド、ウォーシントンバイオケミカルコ
ーポレーション、1972）。１単位のパパイン活性は25℃
で１分につき１分子のベンゾイルアルギニンエチルエス
テルを加水分割するものとして規定された。
固定化パパインの保持は370U/g（乾燥細胞壁）、また
は固定化前の初期の未精製のパパインと比較して49％の
活性であって、それは、A.テレフォンス（Telefoncu）
他、バイオテクノロジーおよび生物工学（Biotechnolog
y and Bioengineering）23:1689−1674、1981によっ
て報告されたＰ−ベンゾキノン活性化されたセルロー
ス、72.4U/g（乾燥保持体）のそれよりも高い。
は固定化前の初期の未精製のパパインと比較して49％の
活性であって、それは、A.テレフォンス（Telefoncu）
他、バイオテクノロジーおよび生物工学（Biotechnolog
y and Bioengineering）23:1689−1674、1981によっ
て報告されたＰ−ベンゾキノン活性化されたセルロー
ス、72.4U/g（乾燥保持体）のそれよりも高い。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リ，シャンペン スウェーデン、エス―421 44 バ・フ ロルンダ、ネーベルルースガータン、26 ―393 (56)参考文献 Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，40 （３），619−624（1976) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，66（９），3376，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．35614ｔ（1967) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/14 B01D 21/01 C12P 1/02 C12P 13/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (17)
- 【請求項１】酸およびアルカリ環境下で、水不溶性の菌
類の細胞壁物質であって、ヘキソサミンを含み、20μｍ
未満の粒径に分解されたときpH値７で正のゼータ電位を
示し、 キチンまたはキトサンを含む菌類から、ａ）物理的に分
解されかつ／または有機溶剤で脱脂され、ｂ）アルカリ
処理および／または酵素での処理によって脱タンパクさ
れ、かつ核酸除去される、方法で得られる ことを特徴とする菌類の細胞壁物質。 - 【請求項２】ヘキソサミンの含量は少なくとも５重量％
である、請求項１に記載の菌類の細胞壁物質。 - 【請求項３】細胞壁物質は接合菌門（Zygomycota）また
は二核菌門（Dikaryomycota）から選択された菌から誘
導される、請求項１または請求項２に記載の菌類の細胞
壁物質。 - 【請求項４】物質が菌糸体から誘導される、請求項３に
記載の菌類の細胞壁物質。 - 【請求項５】物質が20μｍ未満の粒径に分解されたとき
pH値６で少なくとも20mVのゼータ電位を有する、請求項
１ないし請求項４のいずれかに記載の菌類の細胞壁物
質。 - 【請求項６】物質が20μｍ未満の平均粒径を有する、請
求項１ないし請求項５のいずれかに記載の菌類の細胞壁
物質。 - 【請求項７】ヘキソサミンを含み、20μｍ未満の粒径に
分解されたときpH値７で正のデータ電位を示し、酸およ
びアルカリ環境下で、水不溶性の菌類の細胞壁物質の製
造方法であって、 キチンまたはキトサンを含む菌類は、ａ）物理的に分解
されかつ／または有機溶剤で脱脂され、ｂ）アルカリ処
理および／または酵素での処理によって脱タンパクさ
れ、かつ核酸除去される ことを特徴とする菌類の細胞壁物質の製造方法。 - 【請求項８】ステップａ）における菌類は20μｍ未満の
粒径に物理的に分解される、請求項７に記載の製造方
法。 - 【請求項９】脱タンパクされた細胞壁物質はキトサンを
除去するために酸で抽出される、請求項７または請求項
８に記載の製造方法。 - 【請求項１０】菌は接合菌門（zygomycota）または二核
菌門（Dikaryomycota）から選択される、請求項７ない
し請求項９のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項１１】細胞壁物質は菌糸体から得られる、請求
項７ないし請求項10のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項１２】水系培地から負に帯電さた生成物を回収
または除去する方法において請求項１ないし請求項６の
いずれかに従った細胞壁物質の使用方法。 - 【請求項１３】細胞または生物学的に活性な化合物が細
胞壁物質上で固定化される、請求項12に記載の使用方
法。 - 【請求項１４】細胞は、バクテリア、イースト、菌類の
菌糸体ないし植物および動物細胞からなるグループに属
する、請求項13に記載の使用方法。 - 【請求項１５】化合物は、アミラーゼ、カタラーゼ、セ
ルラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、β−グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、
グルコースイソメラーゼ、リパーゼ、リゾチーム、パパ
イン、ペニシリンアシラーゼ、ペプシン、プロテアー
ゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、ウレアーゼならび
に動物、植物および微生物の源からの任意の酵素からな
るグループに属する酵素である、請求項13に記載の使用
方法。 - 【請求項１６】固定化は任意の架橋剤の存在なしで行な
われる、請求項13ないし請求項15に記載の使用方法。 - 【請求項１７】固定化は架橋剤の存在において行なわれ
る、請求項13ないし請求項15に記載の使用方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8903368-2 | 1989-10-13 | ||
| SE8903368A SE465678B (sv) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | Material av svampcellvaeggar, foerfarande foer dess framstaellning samt anvaendning daerav |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05500901A JPH05500901A (ja) | 1993-02-25 |
| JP3083554B2 true JP3083554B2 (ja) | 2000-09-04 |
Family
ID=20377128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02514473A Expired - Fee Related JP3083554B2 (ja) | 1989-10-13 | 1990-10-08 | 凝集剤特性を有する菌の細胞壁物質、その生成のための方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0494950B1 (ja) |
| JP (1) | JP3083554B2 (ja) |
| AT (1) | ATE137800T1 (ja) |
| DE (1) | DE69026953T2 (ja) |
| DK (1) | DK0494950T3 (ja) |
| ES (1) | ES2089034T3 (ja) |
| SE (1) | SE465678B (ja) |
| WO (1) | WO1991005869A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE515085C2 (sv) * | 1998-04-20 | 2001-06-05 | Lizyx Ab | Porös struktur innefattande svampcellväggar |
| SE521726C2 (sv) * | 1999-04-16 | 2003-12-02 | Lars Edebo | Förfarande för odling av chitin- och chitosanrika trädbildande svampar på sulfitlut jämte förfarande för anrikning av lignosulfonater ur odlingsmediet |
| WO2021136882A1 (en) * | 2019-12-30 | 2021-07-08 | Kemira Oyj | Animal free chitosan and methods and uses related thereto |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1104351B (it) * | 1978-06-14 | 1985-10-21 | Muzzarelli Riccardo | Il complesso glucano chitosano il metodo della sua produzione a partire da muffe funghi e lieviti e i suoi usi |
-
1989
- 1989-10-13 SE SE8903368A patent/SE465678B/sv not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-08 ES ES90915541T patent/ES2089034T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-08 DE DE69026953T patent/DE69026953T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-10-08 DK DK90915541.8T patent/DK0494950T3/da active
- 1990-10-08 AT AT90915541T patent/ATE137800T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-08 JP JP02514473A patent/JP3083554B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-10-08 WO PCT/SE1990/000646 patent/WO1991005869A1/en active IP Right Grant
- 1990-10-08 EP EP90915541A patent/EP0494950B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０（３），６１９−６２４（１９７６） |
| Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，６６（９），３３７６，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．３５６１４ｔ（１９６７） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0494950T3 (da) | 1996-09-23 |
| WO1991005869A1 (en) | 1991-05-02 |
| JPH05500901A (ja) | 1993-02-25 |
| ATE137800T1 (de) | 1996-05-15 |
| DE69026953T2 (de) | 1996-10-31 |
| EP0494950B1 (en) | 1996-05-08 |
| SE8903368L (sv) | 1991-04-14 |
| EP0494950A1 (en) | 1992-07-22 |
| ES2089034T3 (es) | 1996-10-01 |
| SE8903368D0 (sv) | 1989-10-13 |
| SE465678B (sv) | 1991-10-14 |
| DE69026953D1 (de) | 1996-06-13 |
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|---|---|---|---|
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