CN107787363A

CN107787363A - 真正的胰腺祖细胞的分离

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Publication number: CN107787363A
Application number: CN201680037140.3A
Authority: CN
Inventors: J·阿米里; H·塞姆
Original assignee: Koebenhavns University
Current assignee: Koebenhavns University
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2018-03-09
Anticipated expiration: 2036-04-21
Also published as: PL3286300T3; WO2016170069A1; US10494608B2; EP3819372A3; HK1248277A1; EP3286300B1; PT3286300T; JP6954711B2; CY1123677T1; JP2018512886A; US11613736B2; US20200080062A1; CA2983764A1; EP3286300A1; US20180127724A1; EP3819372A2; CN107787363B; US20230227788A1; ES2840076T3; DK3286300T3

Abstract

本发明涉及用于分离真正的胰腺祖细胞和富集细胞群体的真正胰腺祖细胞的方法。

Description

真正的胰腺祖细胞的分离

发明领域

本发明涉及用于分离真正的胰腺祖细胞的方法。

发明背景

胰岛素依赖性糖尿病的细胞疗法治疗得利于不限数量的胰腺细胞的产生，所述胰腺细胞能够并且将能够发挥类似于人胰岛的作用。因此，需要生产衍生自人胚胎干(hES)细胞的这些胰腺细胞类型，以及纯化这些细胞的可靠方法。例如，使用衍生自人胚胎干细胞(hESC)的产生胰岛素的β细胞相比使用来自供体胰腺的细胞的当前细胞治疗方法将提供巨大的改善。目前，利用来自供体胰腺的细胞的糖尿病(例如1型或2型糖尿病)的细胞疗法治疗受限于移植所需的高质量胰岛细胞的稀缺。例如，针对单个1型糖尿病患者的细胞治疗需要移植大约8×10⁸个胰岛细胞(Shapiro et al,2000,N Engl J Med 343:230-238；Shapiro et al,2001a,Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 15:241-264；Shapiroet al,2001b,British Medical Journal 322:861)。因此，需要至少两个健康的供体器官来获得足够的胰岛细胞用于成功移植。

因此，胚胎干(ES)细胞代表了一个强大的模型***，用于调查早期胚胎内多潜能细胞生物学和分化的机制，并为哺乳动物的基因操作和由此产生的商业、医疗和农业应用提供机会。此外，ES细胞的适当增殖和分化能够潜在地用于产生适合于移植的细胞的无限源，用于治疗由细胞损伤或功能障碍导致的疾病。也可以使用其他多能细胞和细胞系，包括早期原始外胚层样细胞(EPL)，体内或体外衍生的ICM/上胚层，体内或体外衍生的原始外胚层，原始生殖细胞(EG细胞)，畸胎癌细胞(EC细胞)以及通过去分化或核移植衍生的多能细胞。

因此，需要用于分离真正的胰腺祖细胞的方法。

发明概述

本发明提供了用于分离表达PDX1和NKX6.1的真正的胰腺祖细胞的方法。本发明的方法基于使用对表达PDX1和/或NKX6.1的细胞特异性的标志物或使用特异于不表达PDX1的细胞的标志物。还提供了通过这样的方法能够获得的细胞群体，以及它们用于治疗代谢紊乱的用途。

附图说明

图1.eGFP靶向进入人PDX1基因座。A)将编码绿色荧光蛋白(eGFP)的基因***到hPS细胞系HUES-4中的PDX1基因的5'非翻译区(UTR)中。BD引物扩增WT等位基因，AC引物扩增所有转基因克隆，AD引物扩增所靶向的等位基因(3'HA)。B)针对4个个体克隆(泳道1和4：基因靶向阳性克隆；泳道2)，使用Neo/F和Ex3/R引物显示4个靶向事件的代表性PCR筛选(片段大小5.1kb)。使用整合到PDX1基因座中的包含报道子盒的PDX1eGFP BAC作为阳性对照(BAC)。C)显示在3种不同的hPS细胞系中获得的相对靶向效率的表格。D)显示在第13天所靶向的PDX1-eGFP hES细胞系的荧光和相应的相差图像。比例尺＝100μm。E)在第16天PDX1-GFP靶向细胞系的免疫荧光图像，其显示内源性PDX1表达(红色)与GFP(绿色)的共定位。比例尺＝50μm。F)第17天的PDX1-eGFP+细胞群体的免疫荧光分析。显著数目的GFP+/PDX1+细胞共表达NKX6-1和SOX9。大部分PDX1+细胞也表达ECAD和HES1(数据未显示)。比例尺＝50μm。

图2.体外分化的PDX1-eGFP hPSC的分析。

A)根据两种不同分化操作方案分化hPSC，以获得共表达PDX1和NKX6-1的胰腺祖细胞(操作方案A(PE))或表达PDX1但缺少NKX6-1的后部前肠细胞(操作方案B(PFG))。B)示意图描绘称为“操作方案A”的分化操作方案，产生胰腺内胚层(PE)。C)在根据操作方案A处理的hPSC中,在第17天FACS分离eGFP+和eGFP-部分。D)分选的eGFP+和eGFP-细胞的基因表达分析显示,用操作方案A获得的eGFP+细胞中胰腺内胚层标志物(重要的是PDX1和NKX6-1)显著富集。数据显示为平均表达±SEM(n＝5)。这些图表示与在第十七天在对照样品(eGFP-细胞)中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设定为数值1。E)示意图描绘称为“操作方案B”的分化操作方案，产生后部前肠细胞。F)根据操作方案B分化的eGFP+和eGFP-细胞(从第17天开始)的FACS分离。G)分选的eGFP+和eGFP-细胞的基因表达分析显示，虽然后部前肠标志物如PDX1、ECAD、HNF6和SOX9在eGFP+细胞中被富集，但在操作方案B获得的eGFP+细胞中NKX6-1和MNX1均未被显著上调。数据以平均表达±SEM表示(n＝2-4)。这些图表示与在第十七天在对照样品(eGFP-细胞)中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设定为数值1。

图3.进行微阵列分析以比较体外衍生的PDX1+/NKX6-1+胰腺祖细胞(PPC)与PDX1+/NKX6-1-细胞(PFG)的基因表达谱。A)在胰腺祖细胞(PDX1+/NKX6-1+)、后部前肠细胞(PDX1+/NKX6-1-)和GFP-细胞中差异表达的基因的分级聚类。B)Venn图显示在第17天PPC相比于GFP-，PPC相比于PFG，PFG相比于GFP-细胞中上调的基因的分布。C)在A中所描绘的3-比较分析中差异表达的基因的分级聚类(显示平均表达水平)。条形图表示相关基因的子簇；总共创建了九个不同的子簇。子簇3a显示GFP-细胞群体中富集的基因，包括新的细胞表面标志物CD49d(ITGA4)，而子簇5显示胰腺祖细胞(GFP+细胞部分)中富集的基因，还包括新的细胞表面标志物GP2。子簇6表示在PDX1+细胞中富集的基因而不论NKX6-1表达如何(F2GFP+和GFP+细胞)，如CDH1(ECAD)、EPCAM、F3(CD142)和新的细胞表面标志物FOLR1。D)基因本体论(GO)分析显示PDX1+/NKX6-1+胰腺祖细胞中基因的富集。显示代表性的GO类别，并将其针对-log(p值)进行作图。

图4.在hPSC衍生的PDX1+胰腺内胚层中表达的新的细胞表面标志物。A)热图显示GFP+和GFP-部分中定位于质膜中或细胞外区域中的基因的富集。箭头指示不同细胞群体中富集的选定细胞表面标志物。B)对在MEF(d17)上培养的分化的hPSC进行的选定细胞表面标志物GP2和CD49d(ITGA4)的流式细胞术分析证实，GP2在GFP+细胞中高表达，而CD49d在GFP-细胞中富集。更具体地，在第17天大部分GFP-细胞(70-72％)表达CD49d，而64-76％的GFP+细胞共表达GP2。重要的是，只有低比例的GFP-细胞(3-7％)表达GP2，基本上没有GFP+细胞(1-2％)表达CD49d。C)分选的细胞群体的基因表达分析显示，胰腺内胚层标志物和新的细胞表面标志物在GP2+/CD49d-分选的细胞群体中高度富集。D)通过流式细胞术分析在无饲养层***中培养的遗传上未加标签的细胞系HUES-4中GP2和CD49d的表达。E)分选出GP2+CD49d-、CD49d+GP2-和GP2-CD49d-细胞部分，分析基因表达模式。胰腺内胚层标志物如PDX1、SOX9、MNX1和NKX6-1以及新的细胞表面标志物GP2和FOLR1在GP2+CD49d-细胞部分中显著富集。GP2-CD49d-细胞部分中剩余的PDX1+细胞仅表达低水平的NKX6-1，这证实了PDX1+/NKX6-1+细胞中GP2特异性富集。F)在非造血细胞和非内皮细胞(CD45-CD31-)上门控的人胎儿胰腺(9.1WD)中GP2和CD49d表达的流式细胞术分析。G)在FACS分选的GP2+和CD49d+(门控CD45-CD31-)细胞群体中的PDX1和NKX6-1表达的qPCR分析显示，在GP2+细胞中相对于CD49d+细胞中PDX1和NKX6-的显著富集。结果以相对于对照基因Hprt或Gapdh表达的任意单位(AU)呈现。*P＝0.023和**P＝0.010。ND＝未检测到。H)在8.7WD在GP2+(CD45-/CD31-)和CD45+/CD31+细胞中PDX1和NKX6-1表达的流式细胞术分析。91％的GP2+(PDX1+)细胞共表达NKX6.1。使用CD45+CD31+细胞作为PDX1和NKX6-1表达的阴性对照。FACS图是3个独立实验的代表。这一结果证实了我们先前的发现，表明GP2特异性标记共表达PDX1和NKX6.1的胰腺祖细胞。

图5.分化的hPSC中FOLR1表达的表征。A)在MEF上培养的PDXeG细胞系中标志物FOLR1与CD49d的FACS分析。B)分选出FOLR1-/+CD49d+、CD49d-/FOLR1+和GFP+/FOLR1-细胞部分，并分析基因表达图。C)在无饲养层***中培养的遗传上未加标签的细胞系HUES4中的FOLR1和CD49d的FACS分析。D)对FOLR1-Cd49d+、FOLR1-Cd49d-和FOLR1+Cd49d-细胞也进行qPCR分析。胰腺内胚层标志物如PDX1、SOX9、MNX1和NKX6-1以及新的细胞表面标志物GP2和FOLR1在FOLR1+CD49d-细胞部分中显著富集。数据以平均值±SEM表示。这些图表示与在第十七天在对照样品(eGFP-细胞)中检测到的相比的倍数增加。由于FOLR1在PDX1+/NKX6-1+和PDX1/NKX6-1-细胞中表达，因此在标记PPC时不如GP2特异/有效，因此FOLR1-CD49d-细胞部分仍含有表达PDX1、NKX6-1的细胞。

图6.使用独立和以前发表的分化操作方案验证GP2。A)根据由Rezania等人2013年发表的分化操作方案的略微修改版本，诱导hPSC衍生的胰腺祖细胞的方案。B)使用PDXeG细胞系，基于GFP和GP2表达分选出分化的hPSC，并通过qPCR分析。C)分选群体的qPCR分析：GP2-GFP-，GP2-GFP+和GP2+GFP+细胞显示，与GP2-GFP+细胞部分相比，表达PDX1和NKX6-1的细胞在GP2+GFP+细胞部分中显著富集。该数据证实GP2能够用于从异质细胞培养物分离共表达PDX1和NKX6-1的人胰腺祖细胞。

图7.先前发表的用于纯化胰腺祖细胞的细胞表面标志物的表征。A)在MEF上培养的PDXeG报道细胞系中，对先前鉴定的细胞表面标志物CD142和CD200的流式细胞术分析。大部分GFP+和GFP-细胞被用CD142和CD200染色，表明这些标志物在异源细胞培养物中识别PDX1+/NKX6-1+细胞时不够特异。B)在无饲养层培养***中，根据Rezania等人2013发表的分化操作方案的略微修改版本，分化遗传上未加标签的细胞系(HUES4)，并用GP2与CD49d、CD142和CD200组合染色。C)不同分选群体(GP2-，GP2+，CD142+和CD200+)的qPCR分析确认了GP2+细胞中PDX1和NKX6-1的显著富集。这些结果说明与先前发表的标志物CD142和CD200相比，GP2在标记PDX1+/NKX6-1+胰腺祖细胞方面是优越的。

图8.纯化的GP2+/CD49d-PPC分化为葡萄糖应答性的表达胰岛素的细胞。A)示意图说明hPSC分化成胰腺祖细胞，胰腺祖细胞被解离并用细胞表面标志物CD49d和GP2染色。B)描述分化操作方案的表格，其应用于将重铺的FACS分选的GP2+/CD49d-胰腺祖细胞分化成表达胰岛素的细胞。For：Forskolin(10uM)，Alki：Alk5抑制剂(4.5uM)，Nic：烟酰胺(10mM)，Rocki：抑制剂(10-15uM)，DF12：DMEM/F-12，B27：B27补充物。C)FACS图显示在第18天分化的hPCS的GP2和CD49d染色。D)分化的GP2+(CD49d-)PPC和从遗传上未加标签的细胞系HUES4分离的GP2低(CD49d-)细胞显示在GP2+(CD49d-)细胞中C肽+细胞的显著富集。E)分化成表达胰岛素的细胞的经纯化并重新接种的GP2+(CD49d-)胰腺祖细胞(分离自遗传上未加标签的细胞系HUES4)的免疫荧光分析。F)在第18天，Gp2low细胞相对于GP2+细胞中表达CPEP细胞的百分比。G)通过静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定(GSIS)，在分化的GP2+(CD49d-)细胞中测量人C-肽的释放。结果显示，高浓度葡萄糖刺激导致C-肽的统计学上显著增加，这表明主要触发(K-ATP通道依赖性)途径在GP2+PPC衍生的β细胞中起作用。

图9.CDKN1a敲低导致增殖的GP2+PPC显著增加。A)示意图显示细胞周期的各个阶段。B)用对照和CDKN1 siRNA转染第11天的分化的hPSC。转染后72小时取样并通过蛋白质印迹进行分析。在由不成熟的GP2+胰腺祖细胞组成的hPSC中敲低CDKN1a导致到第14天G2/M期细胞数量显著增加(C-E)。这种增加与G0/G1细胞数目减少相关，这表明降低p21水平促进细胞从G0/G1转变为增殖状态(G2/M)。然而，如果p21在更晚的时间点(第17天)被敲低，当更多成熟的GP2+胰腺祖细胞存在于hPSC培养物中时，增殖作用被消除(F-H)。I)从第14天siRNA处理的hPSC的免疫荧光分析显示，在CDKN1a敲低72小时后Ki67+细胞的显著上调。这些数据提供了证据证明，在早期胰腺祖细胞中敲低CDKN1a可以用于在体外培养期间扩增GP2+hPPC库。

图10.示意图显示hESC向产生胰岛素的细胞分化的间期。新的细胞表面标志物GP2、FOLR1和CD49d能够用于在PE阶段分离胰腺祖细胞。这些胰腺祖细胞具有分化为腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞(包含胰腺)的能力。

发明详述

本发明如权利要求书所定义。

本发明人已经鉴定了可用于分离真正的胰腺祖细胞的新的标志物。

最近在产生与正常β细胞共有功能特性的hPSC衍生的葡萄糖应答性的产生胰岛素的细胞方面取得的成功(Pagliuca et al.,2014,Rezania et al.,2014)，已经使用于治疗I型糖尿病的基于细胞的疗法变成明显的现实。这种方法在治疗方面的成功将取决于hPSC衍生物的提高的生产能力。估计将器官修复和疾病恢复所需的功能细胞的数量为每个患者10⁹个的数量级(Pagliuca et al.,2014,Kempf et al.,2016)。因此，分化策略将需要适应工业规模的大规模生产。目前，葡萄糖应答性产生胰岛素的细胞的产生需要繁琐和复杂的多步骤操作方案，其中未分化的具有致瘤倾向的hPSC被用作起始细胞群体。通过建立使用更成熟的细胞产生β细胞的策略，可以防止用于细胞治疗的最终细胞制备物中潜在的致肿瘤细胞污染，并且可以实现更安全和更可重复的制造程序。然而，缺乏可用于在胰腺分化期间纯化晚期细胞群体的阶段特异性表面标志物。

在正常的胚胎发育期间，通过其共同表达转录因子胰腺十二指肠同源异形框1(PDX1)和NK6同源异形框1(NKX6-1)识别的高度增殖的人和小鼠胰腺祖细胞负责胰腺上皮的正常生长，并产生所有的胰腺细胞类型，包括外分泌细胞、导管细胞和内分泌细胞。因此，胰腺祖细胞可以作为理想起始群体用于生成产生激素的内分泌细胞如β细胞。此外，先前的出版物支持这样的观点，即富集胰腺祖细胞将降低移植后畸胎瘤形成的风险。使用组织特异性细胞表面分子可以获得hPPC的分离，并且事实上已经报道了hPSC衍生的胰腺细胞群体的标志物(胰腺祖细胞的CD142和内分泌细胞的CD200/CD318)(Kelly 2011)。然而，如作者所指出，胰腺祖细胞标志物CD142的特异性是有问题的，因为用该分子富集的群体不是由胰腺祖细胞专门组成。因此，对用于富集祖细胞群体的新的和更特异性的标志物的需求，仍然有待实现。

产生组织特异性报道细胞系可以帮助识别胰腺特异性细胞表面标志物的过程。因此，我们通过基因靶向建立了PDX1-eGFP报道细胞系(PDXeG)，以便能够从hPSC分离纯PDX1+胰腺祖细胞。通过使用PDXeG报道细胞系作为遗传工具，我们能够分离不同的PDX1+细胞亚群，并进行全基因组表达分析，使我们能够确定新的细胞表面标志物用于分离hPPC。具体而言，我们鉴定出了三种新的使我们能够从后部前肠内胚层细胞分离出真正的胰腺祖细胞的细胞表面标志物：糖蛋白2(酶原颗粒膜)(GP2)作为分离PDX1+/NKX6-1+hPPC的标志物，整合素α-4(ITGA4或CD49d)作为标记PDX1-细胞部分的阴性选择标志物，最后是第三个标志物，即识别PDX1+/NKX6-1-细胞的叶酸受体1(成人)(FOLR1)。

这些标志物的特异性通过使用人胎儿胰腺组织得到证实。此外，使用简化和明确的分化策略，我们证明GP2+/CD49d-胰腺祖细胞保留了熟化成内分泌细胞并分化成葡萄糖应答性产生胰岛素的细胞的能力。最后，我们进行了靶向由微阵列鉴定的候选基因的siRNA筛选，并发现参与hPPC扩增的新基因。总而言之，本发明人提供了I)用于分离hPPC的新的细胞表面标志物，II)简化和明确的分化策略，以从分离的hPPC获得葡萄糖应答性产生胰岛素的细胞，III)以及hPPC如何在体外扩增的新观点，这不仅可以进一步深入表征hPPC，而且还促进开发扩增这些祖细胞以用于未来糖尿病细胞替代疗法的新策略。

因此，在第一个方面，本发明涉及用于分离富集了真正的胰腺祖细胞的群体的方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1；和

ii)将所述细胞群体暴露于：

a)第一配体，其与PDX1-细胞特异性的第一标志物结合，并从所述细胞群体选择不结合所述第一配体的细胞，由此使细胞群体富集PDX1+细胞；

和/或

b)第二配体，其与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使细胞群体富集PDX1+细胞；

和/或

c)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞；

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

在另一方面，本发明涉及用于产生富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体的方法，所述富集的细胞群体包含至少70％的真正的胰腺祖细胞。

在又一方面，本发明涉及包含至少70％的真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

在又一方面，本发明涉及包含通过本文公开的方法能够获得的真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

在又一方面，本发明涉及包含通过本文公开的方法能够获得的真正的胰腺祖细胞的细胞群体，用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱。

在又一方面，本发明涉及如本文所公开的富集真正的胰腺祖细胞的细胞群体，用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱。

在又一方面，本发明涉及治疗有此需要的个体的代谢紊乱的方法，其中所述方法包括提供如本文所述的细胞群体的步骤。

定义

抗体术语“抗体”描述血清的功能成分，通常指分子(抗体或免疫球蛋白)的集合或者一个分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能够与特定的抗原决定簇(抗原或抗原表位)结合或反应，这进而可以导致诱导免疫效应机制。通常认为个体抗体分子是单特异性的，并且抗体分子的组成可以是单克隆的(即由相同的抗体分子组成)或多克隆的(即由与同一抗原上或不相似的不同抗原上的相同或不同表位反应的不同抗体分子组成)。每个抗体分子具有独特的结构，使其能够与其相应的抗原特异性结合，并且所有天然抗体分子具有两条相同轻链和两条相同重链的相同的整体基本结构。抗体也被统称为免疫球蛋白。本文使用的术语抗体以最广泛的含义使用，并涵盖完整抗体，嵌合抗体，人源化抗体，完全人抗体和单链抗体，以及抗体的结合片段，如Fab，F(ab')₂，Fv片段或scFv片段，以及多聚体形式如二聚体IgA分子或五价IgM。

抗原抗原是包含至少一个表位的分子。抗原可以是例如多肽，多糖，蛋白质，脂蛋白或糖蛋白。

真正的胰腺祖细胞术语“真正的(bona fide)胰腺祖细胞”或“真正的(true)胰腺祖细胞”在本文中是指能够分化成所有胰腺细胞系(包括腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞)的细胞，例如产生胰岛素的细胞。

定形内胚层如本文所用，“定形内胚层”或“DE”是指能够分化成肠管的细胞或衍生自肠管的器官的细胞的多能细胞。根据某些实施方案，定形内胚层细胞和由其衍生的细胞是哺乳动物细胞，并且在优选的实施方案中，定形内胚层细胞是人细胞。在一些实施方案中，定形内胚层细胞表达或不能显著表达某些标志物。在一些实施方案中，选自SOX17,CXCR4,MIXLl,GAT A4,FOXA2,GSC,FGF 17,VWF,CALCR,FOXQl,CMKORl,CER和CRIPl的一种或多种标志物在定形内胚层细胞中表达。在其他实施方案中，选自OCT4，HNF4A，甲胎蛋白(AFP)，凝血调节蛋白(TM)，SPARC和SOX7的一种或多种标志物在定形内胚层细胞中不显著表达。定形内胚层细胞不表达PDX-1。

能够分化的细胞或分化的细胞如本文所用，短语“能够分化的细胞”或“分化的细胞”或“hES衍生的细胞”可以指如下文详细定义的多能(pluripotent)，专能(multipotent)，寡能(oligopotent)或甚至单能细胞。在某些实施方案中，能够分化的细胞是多能的能够分化的细胞。在更具体的实施方案中，多能的能够分化的细胞选自胚胎干细胞，ICM/上胚层(epiblast)细胞，原始外胚层细胞，原始生殖细胞和畸胎癌细胞。在一个具体的实施方案中，能够分化的细胞是哺乳动物胚胎干细胞。在更具体的实施方案中，能够分化的细胞是人胚胎干细胞。某些实施方案也考虑来自动物内任何来源的能够分化的细胞，只要细胞是如本文所定义的能够分化的。例如，能够分化的细胞可收获自胚胎或其中的任何原始胚层，收获自胎盘或绒毛膜组织，或收获自更成熟的组织，例如成体干细胞，包括但不限于脂肪，骨髓，神经组织，***组织，肝组织，胰腺，上皮，呼吸道，性腺和肌肉组织。在具体的实施方案中，能够分化的细胞是胚胎干细胞。在其他具体的实施方案中，能够分化的细胞是成体干细胞。在其他具体的实施方案中，干细胞是衍生自胎盘或绒毛膜的干细胞。

分化如本文所用，术语“分化”是指产生比其所衍生自的细胞类型更分化的细胞类型。因此该术语涵盖部分和终末分化的细胞类型。类似地，“由hESC产生”，“衍生自hESC”，“分化自hESC”，“hES衍生的细胞”及等同表达是指在体外和体内从hESC产生分化的细胞类型。

胚胎的如本文所用，“胚胎的”是指以单个合子开始并以多细胞结构结束的生物的一系列发育阶段，所述多细胞结构不再包含除了发育的配子细胞之外的多能或全能细胞。除了通过配子融合衍生的胚胎之外，术语“胚胎的”是指通过体细胞核转移衍生的胚胎。

表达水平如本文所用，术语“表达水平”可分别指特定基因或蛋白质的转录物水平(mRNA)或蛋白质水平。因此，可以通过本领域已知的方法通过测定转录水平或蛋白质水平来测定表达水平。转录水平可以通过用例如但不限于Northern印迹、RT-PCR或基于微阵列的方法定量转录物的量来测量。蛋白质水平可以通过如但不限于蛋白质印迹和免疫染色的方法来测量。

人胚胎干细胞人胚胎干细胞衍生自人胚胎的未分化内细胞团。这些细胞是多能的，能够分化成三个主要胚层的所有衍生物，即：外胚层、内胚层和中胚层(Thomson etal.,1998)。如本文所用，术语“人多能干细胞”(hPS)是指可以衍生自任何来源并且能够在适当条件下产生人不同细胞类型的后代的细胞，所述细胞类型是所有3个胚种层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物。hPS细胞可具有在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成所有三个胚层的能够鉴定的细胞的能力。包括在人多能干细胞的定义中的有各种类型的胚胎细胞，包括在文献中通常称为人胚胎干(hES)细胞的人胚泡衍生干(hBS)细胞(参见例如Thomson et al.(1998),Heins et.al.(2004))，以及诱导的多能干细胞(参见例如Yu et al.(2007)Science 318:5858；Takahashi et al.(2007)Cell 131(5):861)。本文所述的各种方法以及其它实施方案可需要或利用来自各种来源的hPS细胞(hPSC)。例如，适合使用的hPS细胞可从正在发育的胚胎获得。另外或可选地，可通过不需要破坏胚胎的方法从已建立的细胞系和/或人诱导的多能干(hiPS)细胞获得合适的hPS细胞(Chung et al.2008)。

如本文所用，“hiPS细胞”是指人诱导的多能干细胞。

如本文所用，术语“胚泡来源干细胞”表示为BS细胞，其人形式被称为“hBS细胞”。在文献中，这些细胞通常被称为胚胎干细胞，更具体地被称为人胚胎干细胞(hESC)。因此，用于本发明的多能干细胞可以是由胚泡制备的胚胎干细胞，如WO 03/055992和WO 2007/042225中所述，或者是可商购的hBS细胞或细胞系。然而，进一步地可以在本发明中使用任何人多能干细胞，包括通过例如重编程成多能细胞的分化成体细胞，如Yu,et al.,2007,Takahashi et al.2007和Yu et al 2009中所公开，用某些转录因子如OCT4、SOX2、NANOG和LIN28处理成体细胞。

失活术语“失活”在本文中在与细胞中给定蛋白质的功能失活有关时使用，并且是指为获得功能丧失而对细胞进行的操作。可以如本领域已知的那样实现失活，例如，通过使用能够抑制蛋白质功能的抑制剂。失活也可以通过编码蛋白质的基因的突变或缺失来实现。如本领域技术人员已知的，例如通过使用siRNA的沉默也可以用于实现失活。失活可以是短暂的或永久的。失活也可以是可逆的或不可逆的。例如，只要抑制剂有效或存在，用抑制剂孵育细胞群体通常会导致瞬时失活。从环境中除去抑制剂通常会导致失活减轻。同样，只要siRNA表达或存在，siRNA通常只具有沉默效应。另一方面，基因的缺失或突变通常会导致永久失活，尽管本领域技术人员将知道如何通过例如基因编辑方法来逆转缺失或突变的影响。

诱导的多能干细胞诱导的多能干细胞(或iPSC)可以通过重编程直接从成体细胞中获得(Takashashi et al.,2006)。iPSC可以被蛋白质诱导，然后被称为蛋白质诱导的多能干细胞(piPSC)。

配体如本文所用，“配体”是指与细胞上标志物或靶或受体或膜蛋白质或与样品或溶液中的可溶性分析物特异性结合或交叉反应的部分或结合伴侣。细胞上的靶包括但不限于标志物。这样的配体的例子包括但不限于结合细胞抗原的抗体，结合可溶性抗原的抗体，结合已经结合细胞或可溶性抗原的抗体的抗原，与可溶性碳水化合物结合的凝集素或结合到作为糖蛋白或糖脂一部分的碳水化合物部分的凝集素；或能够结合的此类抗体和抗原的功能性片段；与细胞靶或可溶性分析物的靶核酸序列充分互补以结合靶或分析物序列的核酸序列，与已经结合细胞标志物或靶或可溶性分析物或化学化合物或蛋白质化合物如生物素或抗生物素蛋白的配体核酸序列充分互补的核酸序列。配体可以是可溶的或可以固定在捕获介质上(即，通过合成共价连接到珠)，如测定形式例如抗体亲和层析所示。如本文所定义，配体包括但不限于检测一种或多种特定细胞标志物或靶或可溶性分析物并与之反应的各种试剂。

标志物如本文所用，“标志物”，“表位”，“靶”，“受体”或其等同物可以指可以观察或检测到的任何分子。例如，标志物可以包括但不限于核酸，如特定基因的转录物，基因的多肽产物，如膜蛋白，非基因产物多肽，糖蛋白，碳水化合物，糖脂，脂质，脂蛋白或小分子(例如分子量小于10,000amu的分子)。“细胞表面标志物”是存在于细胞表面的标志物。

专能细胞如本文所用，“专能”或“专能细胞”是指可以产生有限数量的其他特定细胞类型的细胞类型。专能细胞定型于一种或多种胚胎细胞命运，因此与多能细胞相反，不能产生三种胚层谱系中的每一种以及胚外细胞中。

初始( )干细胞和致敏(primed)干细胞。与致敏干细胞不同，初始干细胞具有发展成任何种类的细胞的潜力，初始干细胞能够分化成几种类型但已经在一定程度上预先确定的细胞。已知初始干细胞存在于小鼠体内，但是人初始干细胞最近才有描述(Takashima et al.,2014)。初始干细胞能够连续自我更新而不需ERK信号传导，其表型稳定，并且核型完整。它们在体外分化并在体内形成畸胎瘤。在ESC中，代谢与线粒体呼吸激活一起被重新编程。如Takashima et al.,2014中所述，人细胞的多能状态可以通过短期表达两种组分NANOG和KLF2来重置。初始PSC与胚泡的内细胞团共有许多性质，而致敏PSC类似于更晚期的、原肠形成前期阶段(pregastrulating stage)胚胎的外胚层细胞。在小鼠中，胚胎干细胞(mESC)代表初始状态，并且外胚层干细胞(EpiSC)代表致敏状态。在人中，胚泡来源的ESC直到最近才被认为是mESC的人的等同物。然而，不受理论的约束，基于平坦形态(flat morphology)、生长因子依赖性或X染色体失活等多种特征，与mESC相比，hESC(和人诱导的多能干细胞(hiPSC))更接近小鼠EpiSC，因此，更可能对应于多潜能性的致敏状态而不是初始状态(Tesar et al.2007；Stadtfeld and Hochedlinger 2010)。

天然存在的抗体术语“天然存在的抗体”是指能够识别和结合抗原并包含通过二硫键相互连接的两条相同重链(H)和两条相同轻链(L)的异四聚体糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区(本文缩写为C_H)。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为V_L)和轻链恒定区(本文缩写为C_L)。V_H和V_L区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。抗体可以包含几个相同的异四聚体。

胰腺祖细胞或多能胰腺祖细胞祖细胞是实施分化成某种类型的细胞的细胞。因此，胰腺祖细胞是专能的并且能够分化并产生胰腺的所有细胞类型。

部分成熟的细胞如本文所用，“部分成熟的细胞”是指表现出来自相同器官或组织的成熟细胞的至少一种表型特征(例如形态学或蛋白质表达)的细胞。一些实施方案涉及使用来自能够产生能分化细胞的任何动物的能分化细胞，例如胰腺类型细胞如β细胞。收获能够分化的细胞的动物可以是脊椎动物或无脊椎动物，哺乳动物或非哺乳动物，人或非人。动物来源的实例包括但不限于灵长类动物，啮齿动物，犬科动物，猫科动物，马科动物，牛科动物和猪科动物。

多能细胞“多能”是指细胞可以产生三种胚层谱系中的每一种。然而，多能细胞可能不能够产生整个生物体。在某些实施方案中，用作起始材料的多能细胞是干细胞，包括人胚胎干细胞。多能细胞可以通过在不同发育阶段从胚胎中移出细胞来获得。PSC(多能干细胞)可以分为两种不同的状态，初始和致敏状态，这取决于它们在胚胎发育期间的阶段。

干细胞干细胞是未分化的细胞，其能够分化成特化的细胞，并能够***产生更多的干细胞。术语干细胞包括胚胎干细胞，成体干细胞，初始干细胞以及诱导的多能干细胞。干细胞通过其在单细胞水平上的自我更新和分化以产生后代细胞的能力来定义，所述后代细胞包括自我更新祖细胞，非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于它们能够在体外分化成多胚层(内胚层，中胚层和外胚层)的各种细胞谱系的功能细胞，以及在移植后产生多胚层的组织，且在注射到囊胚后促成大部分(如果不是全部的话)组织的能力。干细胞按其发育潜能分为：(1)全能干细胞，表示能够产生所有胚胎细胞类型和胚外细胞类型；(2)多能干细胞，表示能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能干细胞，表示能够产生细胞谱系的子集，但是该子集全部均在特定组织、器官或生理***内(例如，造血干细胞(HSC)能产生包括HSC(自我更新)、限制为血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和元件(例如血小板)的后代)；(4)寡能干细胞，表示能够产生比专能干细胞更有限的细胞谱系子集；和(5)单能干细胞，表示能够产生单一细胞谱系(例如生精干细胞)。

全能干细胞该术语是指具有产生任何和所有类型的人细胞的能力的细胞，例如所有三种胚层谱系和胚外谱系。它能够产生完整的功能生物。

在本公开中，任一基因或蛋白质名称可以指任何物种中的该基因或蛋白质。例如，PDX1或Pdx1可互换使用，可指鼠Pdx1或人PDX1或另一物种中的Pdx1。

在本公开中，基因或蛋白质名称后面的“-”符号表示基因或蛋白质不表达，而基因或蛋白质名称后面的“+”符号表示基因或蛋白质表达。因此，PDX1-或PDX1-细胞是不表达PDX1的细胞，而PDX1+或PDX1+细胞是表达PDX1的细胞。

用于分离真正的胰腺祖细胞的方法

本公开内容的一个目的是提供用于分离富集胰腺祖细胞的群体的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

a)第一配体，其与PDX1-细胞特异性的第一标志物结合，并从所述细胞群体选择不结合所述第一配体的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；

和/或

b)第二配体，其与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；

和/或

c)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞；

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

真正的胰腺祖细胞

在胰腺中可以发现几种不同类型的胰腺细胞。胰腺细胞包括例如专能胰腺祖细胞，导管/腺泡祖细胞，完全分化的腺泡/外分泌细胞，导管/内分泌祖细胞，内分泌祖细胞，早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞。在图10中显示了hPSC向内分泌细胞的不同阶段。表达PDX1和NKX6-1的胰腺内胚层祖细胞具有分化成腺泡细胞、导管细胞或内分泌细胞的能力。术语“真正的(bona fide)胰腺祖细胞”或“真正的(true)胰腺祖细胞”在本文中是指能够分化成所有胰腺细胞谱系(包括腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞)的细胞，例如产生胰岛素的细胞。

胰腺早期内分泌细胞是已经启动胰腺内分泌激素(胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽)之一的表达的细胞，但不具有在成年胰腺的朗格汉斯胰岛中发现的完全成熟的胰腺内分泌细胞的所有特征。这些细胞可以是已经关闭了Ngn3的内分泌细胞，但不具有在成年胰腺的朗格汉斯胰岛中发现的完全分化的胰腺内分泌细胞的所有特征，例如对葡萄糖的反应，和对于胰腺内分泌激素(胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和食欲刺激素)之一为阳性。

胰腺内分泌细胞或产生胰腺激素的细胞是能够表达至少一种以下激素的细胞：胰岛素，胰高血糖素，生长抑素，胰多肽和食欲刺激素(ghrelin)。

“胰腺的完全分化的内分泌细胞”(也称为“完全分化的内分泌细胞”，“胰腺成熟内分泌细胞”，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺成年内分泌细胞”)是具有在成年胰腺的朗格汉斯胰岛中发现的完全分化的胰腺内分泌细胞的所有特征的细胞。

本文公开的方法可用于在胰腺内胚层阶段分离胰腺祖细胞。这些细胞可能具有进一步分化成例如产生胰腺激素的细胞如β细胞和/或产生胰岛素的细胞的潜力。产生胰岛素的细胞可对葡萄糖有反应。然而，通过本方法获得的细胞可以分化成任何类型的胰腺细胞。

标志物和配体

PDX1(胰腺和十二指肠同源异形框1)也称为胰岛素启动子因子1，是胰腺发育和β细胞成熟所必需的转录因子。在胚胎发育中，PDX1由定形内胚层后部前肠区域中的细胞群体表达，并且PDX1+上皮细胞产生发育中的胰芽，并最终产生整个胰腺-其外分泌，内分泌和导管细胞群体(图11)。Pdx1也是β细胞成熟所必需的：发育中的β细胞共表达PDX1，NKX6-1和胰岛素，这是导致MafB沉默和MafA表达的过程，这是β细胞成熟过程中必需的转换。PDX1+胰腺祖细胞还共表达H1xb9，Hnf6，Ptf1a和Nkx6-1(同源异形框蛋白Nkx-6.1)，并且这些祖细胞形成最初的胰芽，其可进一步增殖。胰腺内分泌细胞表达PDX1和NKX6-1(PDX1+NKX6-1+细胞)。

本发明的方法基于对不表达PDX1(PDX1-细胞)的细胞特异性的表面标志物的鉴定，而其他标志物被鉴定为对表达PDX1(PDX1+)的细胞是特异性的，再有其他标志物对表达PDX1和NKX6-1的细胞是特异性的。能够结合此类标志物的分子在本文中将被称为“配体”并且可以用于分离真正的胰腺祖细胞。

因此，本发明的用于分离富集了真正的胰腺祖细胞的群体的方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

和/或

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

应该理解的是，细胞群体可以在同时的步骤中或者在连续的步骤中暴露于第一和/或第二和/或第三配体中的任何一个，并且这些步骤可以以任何顺序进行。在一些实施方案中，细胞群体仅暴露于第一、第二或第三配体中的仅一个。在其他实施方案中，细胞群体暴露于第一、第二或第三配体中的两个或三个。在一些实施方案中，细胞群体同时暴露于第一、第二和第三配体。在一些实施方案中，细胞群体以分开的步骤暴露于第一配体和第二配体。在其他实施方案中，细胞群体以分开的步骤暴露于第一配体和第三配体。在其他实施方案中，细胞群体同时暴露于第一配体和第二或第三配体。在其他实施方案中，细胞群体暴露于第一配体并且在分开的步骤中同时暴露于第二和第三配体。在其他实施方案中，细胞群体同时暴露于第一和第二或第三配体。在其他实施方案中，细胞群体同时暴露于第一和第二配体，并且在分开的步骤中暴露于第三配体。在其他实施方案中，细胞群体同时暴露于第一和第三配体，并在分开的步骤中暴露于第二配体。

起始细胞群体

在第一步中，提供包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其中真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1。

在一些实施方案中，起始细胞群体包含至少5％的真正的胰腺祖细胞，如至少10％的真正的胰腺祖细胞，如至少15％的真正的胰腺祖细胞，如至少20％的真正的胰腺祖细胞，如至少25％的真正的胰腺祖细胞，如至少30％的真正的胰腺祖细胞，如至少35％的真正的胰腺祖细胞，如至少40％的真正的胰腺细胞祖细胞，如至少45％的真正的胰腺祖细胞，如至少50％的真正的胰腺祖细胞，如至少55％的真正的胰腺祖细胞，如至少60％的真正的胰腺祖细胞，如至少65个真正的胰腺祖细胞，如至少70％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞或细胞。

为了确定富集群体中包含的真正的祖细胞部分，可以使用本领域已知的方法，例如但不限于免疫染色或流式细胞术方法。

不受理论的约束，起始细胞群体中真正的胰腺祖细胞的百分比可以通过GP2的表达来估计。因此，在一些实施方案中，起始细胞群体包含至少5％表达GP2的细胞，如至少10％表达GP2的细胞，如至少15％表达GP2的细胞，如至少20％表达GP2的细胞，如至少25％的表达GP2的细胞，如至少30％的表达GP2的细胞，如至少35％的表达GP2的细胞，如至少40％的表达GP2的细胞，如至少45％的表达GP2的细胞，如至少50％的表达GP2的细胞，如至少55％的表达GP2的细胞，如至少60％的表达GP2的细胞，如至少65％的表达GP2的细胞，如至少70％的表达GP2的细胞，如至少75％表达GP2的细胞，如至少80％表达GP2的细胞，如至少85％表达GP2的细胞。GP2表达可以通过本领域已知的方法测定，例如免疫染色方法，流式细胞术方法或转录水平的定量测量。

同样，不受理论的约束，起始细胞群体中PDX1+NKX6-1+细胞的百分比可以通过GP2的表达来估计。因此，在一些实施方案中，起始细胞群体包含至少5％表达GP2的细胞，如至少10％表达GP2的细胞，如至少15％表达GP2的细胞，如至少20％表达GP2的细胞，如至少25％的表达GP2的细胞，如至少30％的表达GP2的细胞，如至少35％的表达GP2的细胞，如至少40％的表达GP2的细胞，如至少45％的表达GP2的细胞，如至少50％的表达GP2的细胞，如至少55％的表达GP2的细胞，如至少60％的表达GP2的细胞，如至少65％的表达GP2的细胞，如至少70％的表达GP2的细胞，如至少75％表达GP2的细胞，如至少80％表达GP2的细胞，如至少85％表达GP2的细胞。GP2表达可以通过本领域已知的方法测定，例如免疫染色方法，流式细胞术方法或转录水平的定量测量。

在一些实施方案中，细胞群体可以衍生自或分离自个体，例如但不限于哺乳动物，例如人。

在一些实施方案中，细胞衍生自能够分化的细胞，如多能干细胞，例如人多能干细胞(hPSC)。hPSC包括人的诱导的多能干细胞(hiPSC)，人胚胎干细胞(hESC)和初始人干细胞(NhSC)。

在一个实施方案中，包含胰腺细胞的细胞群体是从包括胎儿胰脏的胰腺获得的。在本发明的一些方面，包含至少一个表达PDX1和NKX6-1的真正的胰腺祖细胞的细胞群体是从包括胎儿胰脏或成人胰腺的胰腺获得的。在一方面，胰腺来自哺乳动物，例如人。

在另一个实施方案中，包含胰腺细胞的细胞群体是体细胞群体。在一些实施方案中，从体细胞群体获得包含至少一个表达PDX1和NKX6-1的真正的胰腺祖细胞的细胞群体。在本发明的另一方面，已经诱导体细胞群体以去分化为胚胎样干细胞(ESC，例如多能细胞，或对于人ESC则为hESC)。这样的去分化细胞也被称为诱导的多能干细胞(IPSC，或对于人IPSC则为hIPSC)。

在又一个实施方案中，包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体是ESC或hESC。在一个实施方案中，从ESC或hESC获得包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体。在一些实施方案中，包含至少一种真正的胰腺祖细胞的细胞群体是多能细胞群体如ESC样细胞群体。

在一些实施方案中，通过本领域已知的方法诱导包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体的分化。例如，可以在胚状体和/或单层细胞培养物或其组合中诱导分化。

在本发明的一个方面，包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体是哺乳动物来源的。在本发明的一个方面，包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体是人来源的。在本发明的一些方面，细胞群体已经分化成胰腺内分泌谱系。

在本发明的一个方面，包含胰腺细胞的细胞群体从一个或多个供体胰腺获得。本文所述的方法不依赖于捐赠的胰腺的年龄。因此，可以使用从胚胎到成年的供体分离的胰脏材料。

一旦从供体收获胰腺，通常使用各种方法加工胰腺产生单个细胞或小群细胞进行培养。一种这样的方法要求将收获的胰腺组织清洗并准备用于酶消化。酶处理用于消化***，使得收获的组织的实质(parenchyma)分解成更小的胰腺细胞物质单位。用一种或多种酶处理收获的胰腺组织，从所收获器官的整个结构分离胰腺细胞物质、亚结构和单个胰腺细胞。本申请也包括胶原酶、DNA酶、脂肪酶制剂和其它酶与本文公开的方法一起使用。

在进行本发明的方法之前，可以进一步处理分离的源材料以富集一种或多种所需的细胞群体。在一些方面，未经分级的胰腺组织一旦解离培养就也可直接用于本发明的培养方法中而无需进一步分离。然而，未经分级的胰腺组织一旦解离培养也可直接用于本发明的培养方法而无需进一步分离，并将产生中间细胞群体。在一个实施方案中，通过密度梯度离心(例如Nycodenz，Ficoll或Percoll)纯化分离的胰腺细胞物质。从供体来源收获的细胞混合物通常是不均匀的，因此含有α细胞、β细胞、δ细胞、导管细胞、腺泡细胞、兼性祖细胞和其他胰腺细胞类型。

典型的纯化过程导致分离的细胞物质分开成多个层或界面。通常形成两个界面。上界面富含胰岛细胞，典型地包含悬浮液中的10至100％的胰岛细胞。

第二界面通常是含有胰岛细胞、腺泡细胞和导管细胞的混合细胞群体。底层是沉淀物(pellet)，它形成在梯度的底部。该层通常主要含有腺泡细胞，一些包埋的胰岛细胞和一些导管细胞。可以分开收集导管树组分以进一步处理。

选择用于进一步操作的部分的细胞组成(constituency)将根据选择哪个梯度部分以及每个分离的最终结果而变化。当胰岛细胞是所需的细胞类型时，分离的部分内的适当富集的胰岛细胞群体将含有至少10％至100％的胰岛细胞。也可以在富集后收集其他胰腺细胞类型和浓度。例如，根据所使用的纯化梯度，本文所述的培养方法可以与从第二界面、从沉淀物或从其他部分分离的细胞一起使用。

在一个实施方案中，中等胰腺细胞培养物由富含胰岛的(上)部分产生。此外，然而，通常含有胰岛细胞、腺泡细胞和导管细胞或导管树组分、腺泡细胞和一些包埋的胰岛细胞的混合细胞群体的更不均匀的第二界面和底层部分也可以分别用于培养。尽管两层均含有能够产生本文所述的富集真正的胰腺祖细胞群体的细胞，但是每一层可以具有用于所公开方法的特定优势。

在一个实施方案中，细胞群体是干细胞群体。在另一个实施方案中，细胞群体是分化成胰腺内分泌谱系的干细胞群体。在一个实施方案中，细胞群体是在没有破坏胚胎的情况下获得的干细胞群体。获得干细胞而不破坏胚胎的方法是本领域已知的(Chung et al.,2008)。

用于从干细胞获得胰腺细胞的操作方案例示于如但不限于在D'Amour,K.A.etal.(2006)；Jiang,J.et al.(2007)；and Kroon,E.et al.(2008),Rezania et al(2012,2014),Felicia W.Pagliuca et al(2014)中描述的操作方案。

用于从体细胞或诱导去分化成多能细胞(如ES样细胞)的体细胞获得胰腺细胞的操作方案示例于例如但不限于在Aoi,T.et al.(2008),Jiang,J.et al.(2007),Takahashi,K.et al.(2007),Takahashi and Yamanaka(2006),and Wernig,M.et al.(2007).Other protocols have been described by D'Amour,K.A.et al.(2006)或Kroon,E.et al.(2008)中描述的操作方案。

分化是非特化的(“非定型的”)或特化较少的细胞获得特化细胞(例如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化或分化诱导的细胞是在细胞谱系中具有更特化的(“定型”)位置的细胞。当应用于分化过程时，术语“定型”是指细胞已经进行至分化途径中的这样一个点，在该点在正常情况下其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型子集，并且在正常情况下不能分化成不同的细胞类型或恢复到分化程度较低的细胞类型。去分化是指细胞由此回复到细胞谱系内特化(或定型)较少的位置的过程。如本文所用，细胞谱系定义细胞的遗传性，即它来自哪些细胞以及它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞置于发育和分化的遗传方案之中。谱系特异性标志物是指与感兴趣谱系的细胞表型特异性相关的特征，并且能够用于评估未注定的细胞向感兴趣谱系的分化。

在一些方面，如本文所用的“分化”(“differentiate”或“differentiation”)是指细胞从未成熟状态进展到较不成熟状态的过程。在另一方面，本文所用的“分化”是指细胞从未分化状态进展到分化状态或从未成熟状态进展到成熟状态的过程。例如，未分化的胰腺细胞可以能够增殖并表达特征标志物，如PDX1。早期未分化的胚胎胰腺细胞可以能够增殖并表达特征标志物，如PDX1。在一个实施方案中，成熟或分化的胰腺细胞不增殖并分泌高水平的胰腺内分泌激素。在一些实施方案中，成熟或分化的胰腺细胞不增殖并分泌高水平的胰腺内分泌激素或消化酶。在一个实施方案中，例如，成熟β细胞以高水平分泌胰岛素。在一些实施方案中，例如，成熟β细胞应答于葡萄糖以高水平分泌胰岛素。当细胞失去未分化细胞的标志物或增加分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和成熟的变化。在一个实施方案中，单个标志物的损失或获得能够指示细胞已经“成熟或分化”。在一些实施方案中，单个标志物的损失或获得能够指示细胞已经“成熟或完全分化”。术语“分化因子”是指添加到胰腺细胞中以增强它们分化成还含有产生胰岛素的β细胞的成熟内分泌细胞的化合物。示例性的分化因子包括肝细胞生长因子，角质形成细胞生长因子，激动肽-4(exendin-4)，碱性成纤维细胞生长因子，***-1，神经生长因子，表皮生长因子血小板衍生的生长因子和胰高血糖素样肽1。在一个实施方案中，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。

在一些实施方案中，分析包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体，以鉴定起始群体中细胞的至少一个细胞是否表达胰腺内分泌谱系特征性标志物，其选自NGN3，NEUROD，ISL1，PDX1，NKX6.1，NKX2.2，MAFA，MAFB，ARX，BRN4，PAX4和PAX6，GLUT2，INS，GCG，SST，胰多肽(PP)。在一些实施方案中，胰腺内分泌谱系特征性标志物选自PDX1和NKX6-1。在一个实施方案中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素，胰高血糖素，生长抑素(somatostatin)和PP。在一些实施方案中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素，胰高血糖素，生长抑素，PP和食欲刺激素。适用于本发明的细胞是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞是胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是表达胰腺激素的细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以是分泌胰腺激素的细胞。

在一个实施方案中，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达PDX1，并可进一步表达以下转录因子中的至少一种：NGN3，NKX2-2，NKX6-1，NEUROD，ISL1，FOXA2，MAFA，PAX4和PAX6。在一个实施方案中，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。在一个实施方案中，胰腺内分泌细胞是表达标志物NKX6-1的细胞。在本发明的另一方面，胰腺内分泌细胞是表达标志物PDX1的细胞。在本发明的另一方面，胰腺内分泌细胞是表达标志物NKX6-1和PDX1的细胞。

PDX1是与胰腺发育有关的同源异形结构域转录因子。Pax-4是β细胞特异性因子，Pax-6是胰腺胰岛细胞(特异性)转录因子；两者都与胰岛发育有关。Hnf-3β(也称为FoxA2)属于转录因子的肝核因子家族，其特征在于高度保守的DNA结合结构域和两个短的羧基末端结构域。NeuroD是与神经发生相关的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。Ngn3是碱性环-螺旋-环转录因子的神经原素(neurogenin)家族的成员。如本文所用的NKX2-2和NKX6-1是Nkx转录因子家族的成员。Islet-1或ISL-1是LIM/同源异形结构域家族转录因子的成员，并在发育中的胰腺中表达。MAFA是在胰腺中表达的转录因子，并且控制参与胰岛素生物合成和分泌的基因的表达。NKX6-1和PDX1在早期胰腺专能细胞中与PTF1a共表达，所述早期胰腺专能细胞可以发育成成年胰腺中发现的所有细胞类型(例如腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞)。在这个细胞群体内发现了也瞬时表达NGN3的细胞。一旦细胞表达或已经表达NGN3，它将成为内分泌谱系的一部分，产生内分泌细胞(作为产生胰岛素的β细胞的一种类型)，其后来将形成朗格汉斯胰岛。在没有NGN3的情况下，在胰腺发育期间不形成内分泌细胞。随着发育进展，NKX6-1和PDX1在更为中心的胰腺区域共表达，其现在变得缺乏PTF1a表达，并且NKX6-1和PDX1阳性细胞不能再产生腺泡细胞。在这个NKX6-1和PDX1阳性细胞群体中，相当数量的细胞瞬时共表达NGN3，从而将它们标记为如同在发育早期的内分泌谱系。

在一个实施方案中，真正的胰腺祖细胞衍生自能够分化的细胞。在具体的实施方案中，能够分化的细胞是人多能干细胞。在一些实施方案中，能够分化的细胞选自由以下组成的组：人iPS细胞(hIPSC)，人ES细胞(hESC)和初始人干细胞(NhSC)。

能够分化的细胞可以衍生自从个体分离的细胞。

CDKN1a(也称为P21)和CDKN2a(也称为P16)是细胞周期特异性基因。CDKN1a(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1或CDK相互作用蛋白1)是抑制CDK2和CDK1复合物的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。因此CDKN1在G1期和S期起着细胞周期进展的调节剂的作用。CDKN2a(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A，多肿瘤抑制因子1)是肿瘤抑制蛋白。它通过减慢细胞从G1期向S期的进展而在细胞周期调控中起重要作用，因此作为参与癌症预防的肿瘤抑制剂起作用。

本发明人已经出乎意料地发现，起始细胞群体中CDKN1a或CDKN2a的失活促进细胞群体进入对应于G2/M期的复制状态，特别是当起始细胞群体是表达PDX1的胰腺祖细胞时。起始细胞群体中CDKN1a或CDKN2a的失活也可促进细胞群体进入S期。因此，CDKN1a或CDKN2a的失活可用于从扩增的胰腺祖细胞获得成熟的β细胞。

在一些实施方案中，起始细胞群体中CDKN1a和/或CDKN2a的表达失活。在一些实施方案中，起始细胞群体是表达PDX1的胰腺祖细胞群体。起始细胞群体也可以是上述任一群体。本领域技术人员知道如何失活CDKN1a和/或CDKN2a的表达。这可以通过例如通过已知的基因编辑方法突变或缺失相应的基因来完成。或者，可以使用沉默手段如siRNA以阻止CDKN1a和/或CDKN2a的表达。或者，可以使用阻止CDKN1a和/或CDKN2a的正确功能的抑制剂。

配体

在已经提供包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体后，将所述群暴露于与PDX1-细胞特异性的第一标志物结合的第一配体，并选择不结合所述第一配体的细胞。这种负分离产生了富集PDX1+细胞的细胞群体。将细胞群体暴露于与PDX1+细胞特异性的标志物结合的第二配体和/或与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体，选择与第二和/或第三配体结合的细胞。应该理解的是，暴露于第一和第二和/或第三配体中的每一个可以同时或分开进行。

因此，在一个实施方案中，细胞群体暴露于第一配体，其与PDX1-细胞特异性的第一标志物结合。在选择不与第一配体结合的细胞后，将现富含PDX1+细胞的细胞群体暴露于与PDX1+细胞特异性的标志物结合的第二配体和/或与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体，选择与第二和/或第三配体结合的细胞。

在另一个实施方案中，细胞群体同时暴露于第一配体、第二配体和/或第三配体，选择不结合第一配体但结合第二和/或第三配体的细胞。

本文公开的每种配体是与标志物特异性结合或交叉反应的部分，即PDX1+细胞、PDX1-细胞或PDX1+NKX6-1+细胞特异性的标志物。术语“配体”将被用作通用术语来指第一、第二或第三配体中的任何一个。

配体可以是抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能够识别并结合特定类型的细胞的标志物。抗体可以是单克隆或多克隆的。因此，在一些实施方案中，第一、第二和第三配体中的至少一个是单克隆或多克隆抗体或其片段。在其他实施方案中，第一、第二和第三配体中的至少两个是单克隆或多克隆抗体或其片段。在其他实施方案中，第一、第二和第三配体是单克隆或多克隆抗体或其片段。

在一些实施方案中，配体与之结合的标志物是细胞表面标志物。

本文描述的实施方案中使用的配体和/或抗体在一些实施方案中可以与可检测标记相连。因此，如本文所用，术语“标记(标记物)”或“可检测标记物”是指例如本领域中标准使用的放射性、荧光、发光、化学发光、生物或酶的标签或标记物。可用于在本文所述的某些实施方案中的附着于组分的可检测标记物可容易地从诊断测定领域技术人员已知且容易获得的多种组合物选择。在一些实施方案中，标记物可以是能够单独作用或与其他分子或蛋白一起作用提供可直接或间接检测的信号的小化学分子。在优选的实施方案中，标志物或靶与测定中使用的各种配体或竞争分析物相连。本文描述的试剂、配体、竞争分析物或捕获介质不受所采用的特定可检测标记或标记***的限制。在一些情况下，可检测标记物可以包括细胞表面或珠的折射率。可检测标记物可以与核酸、多肽如抗体或小分子缀合或结合。例如，本文所述的寡核苷酸可以在合成之后通过掺入生物素化的dNTP或rNTP或一些相似的手段(例如将生物素的蛋白质衍生物光交联到RNA)并随后添加标记的链霉亲和素(例如，藻红蛋白缀合的链霉亲和素)或等价物进行标记。或者，当使用荧光标记的寡核苷酸探针时，荧光素、丽丝胺(lissamine)、藻红蛋白、罗丹明、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX等可以与核酸附接。可与多肽如抗体缀合的可检测标记的非限制性例子包括但不限于放射性标记，如³H,¹¹C,¹⁴C,¹⁸F,³²P,³⁵S,⁶⁴Cu,⁷⁶Br,⁸⁶Y,⁹⁹Tc,¹¹¹In,¹²³I,¹²⁵I或¹⁷⁷Lu，酶如辣根过氧化物酶，荧光团，发色团，化学发光剂，螯合络合物，染料，胶体金或胶乳颗粒。

在一个实施方案中，特定标记使得能够在激光激发后通过发射特定波长的可检测信号来进行检测。藻胆蛋白、串联染料、某些荧光蛋白、小化学分子和某些能够通过其他手段检测到的分子都可以被认为是用于流式细胞分析的标记。参见，例如，Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals,6th Ed.,R.P.Haugland,MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oreg.(1996)中所列的标记。配体，例如通过与藻胆蛋白缀合直接标记的抗体分子，可以具有多达34个相连的发色团，每个发色团的吸光度和量子产率大致与荧光素的相当。用于本文所述的某些实施方案的藻胆蛋白的实例是藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白(APC)、别藻蓝蛋白B、藻红蛋白，优选R-藻红蛋白。藻红蛋白(PE)是目前可用的最亮的荧光染料之一。

还有其它可以与本文所述的某些方法的组分直接缀合的或者与藻胆蛋白或串联染料一起使用以将额外数量的标记的配体添加至该方法的其他标记包括在激发后发射小于550nm的波长的小分子。因此，如本文所用，“小分子”标记或其等同物是指不与藻胆蛋白的发射重叠的分子。这种标志物的一个例子是异硫氰酸荧光素(FITC)。在这种方法中可以用来提供额外颜色的其他标记是被称为绿色荧光蛋白(GFP)和蓝色荧光蛋白(BFP)的蛋白质；而且，在某些实施方案中，通过紫外光激发而发射的标记是有用的。

可检测标记也可以是与底物相互作用以产生可检测信号的酶；或能够通过抗体结合或通过与适当标记的配体结合而检测的蛋白质。各种酶***用于在测定中显示比色信号，例如葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶(FIRP)或碱性磷酸酶(AP)，和己糖激酶连同葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，其与ATP、葡萄糖和NAD+反应产生NADH，NADH在340nm波长处检测到增加的吸光度。还有诸如彩色胶乳微粒(由此包埋染料并与抑制剂序列或配体形成缀合物，并提供指示所得复合物存在的视觉信号)的另外的标记可用于某些实施方案中描述的一些测定。其他可以使用的标记***包括纳米粒子或量子点。因此，任何数量的附加和常规使用的标记***可以适用于本文所述的方法。本领域技术人员理解，标记***的选择和/或实施仅涉及常规实验。以上讨论的标记和标志可以从已知来源商购获得。

如本文所用，“固体基质”或“固相捕获介质”是指允许其与细胞群体样品分离的任何基质或介质，例如生理相容性珠。这种基质或介质的特征包括折射率、大小、光散射强度或携带荧光检测染料以提供独特的荧光特征。这样的珠在本领域中通常是可用的。例如，固相捕获介质的一个子集包括稳定的胶体粒子，例如直径在约0.2至约5.0μm范围内(即胶体尺寸的)的聚苯乙烯珠。这样的聚苯乙烯基质或珠可以含有醛和/或硫酸盐官能团，例如可商购的珠。

第一配体

本发明用于分离富集了真正的胰腺祖细胞的群体的方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

和/或

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

因此，在提供包含至少一个真正的胰腺祖细胞(其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1)的细胞群体之后，将细胞群体暴露于第一配体，所述第一配体与PDX1-细胞特异性的第一标志物结合，并且选择不结合所述第一配体的细胞，由此富集表达PDX1的(PDX1+)细胞。

第一配体可以是如上所述的配体。在一些实施方案中，第一配体是能够识别和结合细胞表面标志物的配体。在一些实施方案中，细胞表面标志物是CD49d。在一些实施方案中，第一配体是针对CD49d的单克隆或多克隆抗体或其片段。如上所述，第一配体可以与标记缀合，例如以便于选择不与第一配体结合的细胞。

不结合第一配体的细胞的选择可以通过本领域已知的方法进行，例如流式细胞术。因此，在一些实施方案中，可以通过流式细胞术检测第一标志物的表达。

第二配体

该方法进一步包括将起始群体(或如上所述在用第一配体选择后不表达PDX1的细胞)暴露于与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合的第二配体并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此获得富集了PDX1+细胞的细胞群体。结果，获得富集了真正的胰腺祖细胞的群体。富集的群体尤其可以富集后部前肠PDX1+细胞。

第二配体可以是如上所述的配体。在一些实施方案中，第二配体是能够识别和结合细胞表面标志物的配体。在一些实施方案中，第二配体可识别并结合选自由FOLR1、CDH1/ECAD、F3/CD142、PDX1、FOXA2、EPCAM、HES1和GATA4组成的组的第二靶。在一些实施方案中，第二配体是针对选自由FOLR1、CDH1/ECAD、F3/CD142、PDX1、FOXA2、EPCAM、HES1和GATA4组成的组的第二靶的单克隆或多克隆抗体或其片段。如上所述，第二配体可以与标记物缀合，例如以便于选择与第二配体结合的细胞。在优选的实施方案中，第二配体能够识别并结合FOLR1。

结合第二配体的细胞的选择可以通过本领域已知的方法如流式细胞术进行。因此，在一些实施方案中，可以通过流式细胞术检测第二标志物的表达。

将细胞群体暴露于第二配体可以在暴露于第一配体和任选暴露于第三配体的同时发生，或者可以在单独的步骤中发生。

第三配体

该方法可以包括将细胞群体暴露于与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体的步骤，并且选择与所述第三配体结合的细胞，以获得富集了表达PDX1和NKX6-1两者的真正的胰腺祖细胞的细胞群体。可以进行暴露于第三配体而不是暴露于第二配体。在一些实施方案中，细胞群体暴露于第一和第三配体，其中配体的暴露可以同时或分开进行。在其他实施方案中，细胞群体暴露于第一、第二和第三配体，其中配体的暴露可以同时或分开进行。结果，获得了富集真正的胰腺祖细胞的群体。

第三配体可以是如上所述的配体。在一些实施方案中，第三配体是能够识别和结合细胞表面标志物的配体。在一些实施方案中，第三配体可以识别并结合第三靶，其中第三靶选自由GP2、SCN9A、MPZ、NAALADL2、KCNIP1、CALB1、SOX9、NKX6-2和NKX6-1组成的组。在优选实施方案中，第三靶是GP2。在一些实施方案中，第三配体是针对选自由GP2、SCN9A、MPZ、NAALADL2、KCNIP1、CALB1、SOX9、NKX6.2和NKX6-1组成的组的第三靶的单克隆或多克隆抗体或其片段。在优选的实施方案中，第三配体是针对GP2的单克隆或多克隆抗体或其片段。如上所述，第三配体可以与物缀合，例如以便于选择与第三配体结合的细胞。

结合第三配体的细胞的选择可以通过本领域已知的方法如流式细胞术进行。因此，在一些实施方案中，可以通过流式细胞术检测第三标志物的表达。

因此，在一些实施方案中，本发明用于分离富集了真正的胰腺祖细胞的群体的方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

和/或

其中，

-第一配体识别并结合CD49d，

-第二配体识别并结合选自由FOLR1、CDH1/ECAD、F3/CD142、PDX1、FOXA2、EPCAM、HES1和GATA4组成的组的第二标志物，和

-第三配体识别并结合选自由GP2、SCN9A、MPZ、NAALADL2、KCNIP1、CALB1、SOX9、NKX6.2和NKX6-1组成的组的第三标志物，

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

在一些实施方案中，本发明用于分离富集了真正的胰腺祖细胞的群体的方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

和

b)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞；

其中，

-第一配体识别并结合CD49d，并且

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

ii)将所述细胞群体暴露于：

和

其中，

-第一配体识别并结合CD49d，并且

-第二配体识别并结合选自由FOLR1、CDH1/ECAD、F3/CD142、PDX1、FOXA2、EPCAM、HES1和GATA4组成的组的第二标志物，

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

ii)将所述细胞群体暴露于：

和

其中，

-第一配体识别并结合CD49d，

-第二配体识别并结合FOLR1，且

-第三配体识别并结合GP2，

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

ii)将所述细胞群体暴露于：

和

其中，

-第一配体识别并结合CD49d，

-第二配体识别并结合FOLR1，

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

ii)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞；

其中，

-第三配体识别并结合GP2，

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

ii)将所述细胞群体暴露于与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞；

其中第三配体识别并结合GP2，

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

ii)将所述细胞群体暴露于：

a)第二配体，其与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；

和

其中，

-第二配体识别并结合FOLR1，

-第三配体识别并结合GP2，

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

应该理解，用于生成产生激素的β细胞(例如产生胰岛素的β细胞)的方法包括分选通过流式细胞术或其它类似方法分离并用毛喉素(Forskolin)、Alk5抑制剂、头蛋白(Noggin)、烟酰胺处理的GP2阳性细胞。分选后可以加入Rock抑制剂持续24-48小时。

真正的胰腺祖细胞群体

本发明的方法提供了富集真正的胰腺祖细胞的群体。

在一个实施方案中，富集胰腺祖细胞的细胞群体中的至少一个细胞具有进一步分化的能力。富集胰腺祖细胞的细胞群体的至少一个细胞可能具有进一步分化为产生胰腺激素的细胞的能力。在一些实施方案中，至少一种产生胰腺激素的细胞是产生胰岛素的细胞。在一些实施方案中，至少一种产生胰腺激素的细胞对葡萄糖有应答。在一些实施方案中，至少一种产生胰腺激素的细胞是产生胰岛素的细胞，其也对葡萄糖有应答。在一些实施方案中，富集胰腺祖细胞的细胞群体的至少一个细胞可以产生产生胰岛素的胰岛细胞。

在一些实施方案中，与已经在没有Yap1抑制剂的情况下孵育的细胞群体相比，所述至少一种产生胰腺激素的细胞中胰岛素、C-肽、Insm-1、Isl-1、MafA和MafB中的至少一种的表达增加。在一个实施方案中，产生胰腺激素的细胞是成熟的β细胞。

获得产生激素的β细胞(如产胰岛素的β细胞)的另一种方法包括用Yap1抑制剂(如维替泊芬(verteporfin))处理通过本发明方法分离的细胞的步骤。这些方法在同一天提交的标题为“生产产胰岛素细胞的方法”(发明人Anant Mamidi和Henrik Semb，申请人：哥本哈根大学)的共同未决专利申请中进行了描述。

YAP1(Yes-associated protein 1)是Hippo信号传导途径的下游核效应物，其参与发育、生长、修复和内环境稳态。维替泊芬是能够抑制Yap1的活性的小分子。

在如上所述已经提供了包含至少一个能够分化的细胞的胰腺祖细胞群体后，可以在Yap1抑制剂的存在下孵育所述细胞群体。在一些实施方案中，Yap1抑制剂是维替泊芬。

在一些实施方案中，细胞群体在浓度为0.1-10μg/mL，如0.2-9μg/mL，如0.3-8μg/mL，如0.4-7μg/mL，如0.5-6μg/mL，如0.6-5μg/mL，如0.7-4μg/mL，如0.8-3μg/mL，如0.9-2μg/mL，如1μg/mL的维替泊芬存在下孵育。在一个实施方案中，细胞群体在1μg/mL维替泊芬存在下孵育。

在一些实施方案中，细胞群体在维替泊芬存在下孵育持续至少3天，如至少4天，如至少5天，如至少6天，如至少7天，如至少8天，如至少9天，如至少10天。在一些实施方案中，在维替泊芬存在下孵育持续5天。

在一些实施方案中，CDKN1a和/或CDKN2a在起始细胞群体中失活。在一个实施方案中，CDKN1a失活。在另一个实施方案中，CDKN2a失活。在另一个实施方案中，CDKN1a和CDKN2a都失活。在另一个实施方案中，依次使CDKN1a和CDKN2失活，即CDKN1a和CDKN2a中的一个在第一步中失活，并且CDKN1a和CDKN2a中的另一个在第二步中失活；第一步和第二步可在时间上重叠或者是独立的。

产生富集了胰腺祖细胞的细胞群体的方法

本文还公开了产生富集了胰腺祖细胞的细胞群体的方法，所述富集的细胞群体包含至少70％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。在一个实施方案中，该方法如上所述。

因此，在一些实施方案中，该方法用于生产富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体，所述细胞群体包含至少70％的真正的胰腺祖细胞，如至少71％的真正的胰腺祖细胞，如至少72％的真正的胰腺祖细胞，如至少73％的真正的胰腺祖细胞，如至少74％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少76％的真正的胰腺细胞祖细胞，如至少77％的真正的胰腺祖细胞，如至少78％的真正的胰腺祖细胞，如至少79％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少81％的真正的胰腺祖细胞，如至少82％的真正的胰腺祖细胞，如至少83％的真正的胰腺祖细胞，如至少84％的真正的胰腺细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少86％的真正的胰腺祖细胞，如至少87％的真正的胰腺祖细胞，如至少88％的真正的胰腺祖细胞细胞，如至少89％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

为了测定富集的群体中包含的真正祖细胞的部分，可以使用本领域已知的方法，例如但不限于免疫染色和/或流式细胞术方法。

富集真正的胰腺祖细胞的细胞群体

本文还公开了包含至少70％真正的胰腺祖细胞，如至少75％真正的胰腺祖细胞，如至少80％真正的胰腺祖细胞，如至少85％真正细胞胰腺祖细胞，如至少90％的真胰腺祖细胞的细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞群体能够通过上述任何方法获得。

因此，在一些实施方案中，富集胰腺祖细胞的细胞群体包含至少70％的真正的胰腺祖细胞，如至少71％的真正的胰腺祖细胞，如至少72％的真正的胰腺祖细胞，如至少73％的真正的胰腺祖细胞，如至少74％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少76％的真正的胰腺祖细胞，如至少77％的真正的胰腺祖细胞，如至少78％的真正的胰腺祖细胞，如至少79％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少81％的真正的胰腺祖细胞，如至少82％的真正的胰腺祖细胞，如至少83％的真正的胰腺祖细胞，如至少84％的真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少86％的真正的胰腺祖细胞，如至少87％的真正的胰腺祖细胞，如至少88％的真正的胰腺祖细胞，如至少89％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

治疗代谢紊乱

本文还公开了通过本文公开的任何方法能够获得的包含真正的胰腺祖细胞的细胞群体，用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱。

本文所述的细胞群体能够用于治疗代谢紊乱。这样的包含真正的胰腺祖细胞的细胞群体可以如所描述的那样富集真正的祖细胞，使得可以分离富集例如β细胞祖细胞的细胞群体。这可以如上所述完成，例如通过使用如上详述的与标志物结合的配体并通过流式细胞术分离实现。这些分离的细胞可以储存直至使用，也可以立即使用。细胞可以进一步分化。一旦获得具有所需特征的细胞群体，将细胞移植到有此需要的个体中。例如，这样的基于细胞的疗法可用于将产胰岛素的β细胞移植到患有糖尿病的个体中，由此可以恢复体内胰岛素产生。如果起始细胞群体来源于患者自身，则可能降低移植细胞排斥等不利免疫反应的风险。作为将产胰岛素的β细胞移植入患者的替代方式，也可以移植真正的胰腺祖细胞，例如通过本文所述的方法能够获得的细胞。

如本文所用，术语“代谢紊乱”应解释为指内分泌、营养和代谢疾病。优选地，该紊乱与胰腺紊乱有关。代谢紊乱的例子是：糖尿病，包括1型和2型糖尿病。

糖尿病(diabetes mellitus，通常被称为diabetes)，是其中长时间高血糖水平的一组代谢性疾病。存在几种类型的糖尿病，包括1型糖尿病，2型糖尿病和妊娠糖尿病。1型糖尿病的特征是胰腺中胰岛的产胰岛素β细胞缺乏，导致胰岛素不足。2型糖尿病的特征是胰岛素抵抗，这可能结合有相对减少的胰岛素分泌。人体组织对胰岛素的反应性缺陷被认为涉及胰岛素受体。妊娠糖尿病类似于2型糖尿病，约占全部妊娠的2-10％。糖尿病的类型也可以分为胰岛素依赖性糖尿病，非胰岛素依赖性糖尿病，营养不良相关的糖尿病或未指定的糖尿病。

本文公开的方法可以用于获得富集了胰腺祖细胞的细胞群体。因此，在一些实施方案中，提供了用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱的细胞群体。在一些实施方案中，代谢紊乱选自糖尿病，例如胰岛素依赖性糖尿病，非胰岛素依赖性糖尿病，营养不良相关的糖尿病或未指定的糖尿病。

在一些实施方案中，用于治疗代谢紊乱的细胞群体通过上述方法获得，即：

·将包含至少一个真正的胰腺祖细胞(其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1)的细胞群体暴露于与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体，并从不与所述第三配体结合的细胞选择结合所述第三配体的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞；其中所述第三配体识别并结合GP2；或者

·将包含至少一个真正的胰腺祖细胞(其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1)的细胞群体暴露于与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合的第二配体，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞，并暴露于与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞，其中第二配体识别并结合FOLR1，并且第三配体识别并结合GP2；或者

·将包含至少一个真正的胰腺祖细胞(其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1)的细胞群体暴露于与PDX1-细胞特异性的第一标志物结合的第一配体，并从所述细胞群体选择不结合所述第一配体的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；并暴露于与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合的第二配体，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；并暴露于与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞，其中第一配体识别并结合CD49d，第二配体识别并结合FOLR1，第三配体识别并结合GP2；

·或本文其他地方描述的任何方法。

在一个方面，提供了治疗有此需要的个体中代谢紊乱的方法，其中所述方法包括提供可通过本文所述的方法获得的富集胰腺祖细胞的细胞群体的步骤。

在一些实施方案中，本发明方法包括将至少部分所述富集的细胞群体移植到患有代谢紊乱的个体中的步骤。

在一些实施方案中，富集的细胞群体可以在移植之前进一步分化。因此，真正的胰腺祖细胞可以在移植之前进一步分化成产胰岛素的细胞或成熟的产胰岛素的β细胞，例如在同一天提交的标题为“生产产胰岛素细胞的方法”(发明人Anant Mamidi和Henrik Semb，申请人：哥本哈根大学)的共同未决的专利申请中进行了描述。在其他实施方案中，富集的细胞群体进一步分化成胰岛中发现的内分泌细胞。在一些实施方案中，富集的细胞群体进一步分化成具有增加的MafA表达的产生胰岛素的β细胞。优选地，产胰岛素的β细胞是成熟的和/或胰岛素应答的。

本领域技术人员可获得用于进一步分化富集细胞群体的方法(Rezania et al.，2014)。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：提供包含至少一个能够分化的细胞的胰腺祖细胞群体；并在Yap1抑制剂存在下孵育所述细胞群体；

由此获得富含产胰岛素的β细胞的细胞群体。在一个实施方案中，Yap1抑制剂是维替泊芬。

在如上所述提供了包含至少一种能够分化的细胞的胰腺祖细胞群体后，可以在Yap1抑制剂的存在下孵育所述细胞群体。在一些实施方案中，Yap1抑制剂是维替泊芬。

在一些实施方案中，可以分离已经因此进一步分化的细胞。在一些实施方案中，将分离的细胞或包含已经进一步分化的细胞的细胞群体移植到患有代谢紊乱的个体中。

实施例

实施例1

介绍

治愈糖尿病需要预防β细胞的自身免疫破坏以及已经被破坏的β细胞群体的恢复。治疗可以是再生或移植产胰岛素的细胞。由于其内在的多能性和理论上的无限供应，人胚胎干细胞(hESC)已经成为β细胞替代治疗的有吸引力的来源。这种策略依靠克服移植后畸胎瘤形成的风险。纯化的hESC衍生物的植入可以使致瘤性的风险最小化。在这项研究中，通过开发靶向PDX1-eGFP报道细胞系，我们对hESC衍生的PDX1+胰腺祖细胞进行了深入分析。我们鉴定了用于分离hESC衍生的PDX1+β细胞祖细胞的新的细胞表面标志物。具体来说，我们显示在GFP+部分中对应于胰腺祖细胞的GP2和FOLR1以及GFP-部分中的CD49d的富集。通过组合这些新的细胞表面标志物或单独使用它们，可以从体外分化过程中衍生的异质细胞群体中分离出真正的β细胞祖细胞。这些新的抗体不仅能够促进从纯化的胰腺祖细胞生成产胰岛素的细胞以及用于糖尿病细胞替代治疗的纯的胰腺祖细胞群体的进一步培养和移植，而且使得能够进一步研究人胰腺发育。尽管功能性葡萄糖反应性分泌胰岛素的细胞迄今为止还没有通过体外分化策略获得，但通过胰腺祖细胞和体外衍生的表达胰岛素的细胞在糖尿病小鼠模型中的移植获得了原理证据，其中前体细胞/未成熟胰岛素+细胞分化并成熟为具有逆转小鼠糖尿病能力的葡萄糖反应性产胰岛素的细胞(Kroon et al.2008,Rezania et al.2014)。这个概念已经成为治疗患有糖尿病的患者的有吸引力的模型，因为它提供了干细胞衍生的β细胞的无限源。但是，在实现这一愿景之前，必须消除两个主要关心的事/障碍，(1)异种细胞群体移植引起的畸胎瘤形成；(2)植入的细胞必须得到保护以避免随后的免疫排斥反应。已经证实/确定，在移植之前纯化胰腺祖细胞可以降低畸胎瘤形成的风险。这种富集可以通过使用组织特异性报道细胞系或细胞表面标志物来获得。缺乏可用于分离胰腺祖细胞的人报道细胞系阻碍了胰腺特异性细胞表面标志物的鉴定。有关鉴定人细胞表面标志物的少数出版物已经利用原始人胰腺或胰岛部分作为材料的来源。2011年，Kelly等报道了三种细胞表面标志物，通过对商业抗体进行基于流式细胞术的筛选来鉴定胰腺祖细胞和内分泌细胞。CD142被鉴定为PDX1+/NKX6-1+细胞的表面标志物，CD200或CD318被鉴定为内分泌细胞的表面标志物。另一组(Jiang et al 2011)报道了另外的标志物CD24是PDX1+祖细胞的新标志物。然而，后来显示CD24不是PDX1+祖细胞的合适标志物，因为在未分化的hESC中以及在从早期内胚层到胰腺内胚层的分化过程中检测到其表达(Naujok and Lenzen,2012)。在Kelly等人进行的抗体筛选中也观察到CD24的广泛表达模式。实际上，在我们的筛选中我们检查了这些公布的细胞表面标志物的表达模式，并且可以观察到标志物CD24、CD200的表达在GFP+和GFP-细胞部分之间没有显著变化。另外，CD318在GFP-细胞中显著富集。虽然CD142/F3在GFP+细胞(相对于GFP-细胞)在转录水平上相对富集，但用CD142抗体的染色在GFP+和GFP-细胞群体中均显示CD142表达。这些观察突出/说明了在不使用组织特异性报道细胞系的情况下鉴定特定细胞表面标志物的困难。

为了使得能够从hESC分离纯PDX1+胰腺祖细胞，我们通过基因靶向建立了PDX1报道细胞系。尽管这已经在小鼠ES细胞中完成(Holland et al.,2006)，但在hESC中至今尚没有发表。此外，这种报道细胞系不仅允许hESC衍生的胰腺祖细胞的分离和进一步表征，而且还代表了研究人胰腺祖细胞发育的新工具。

在本研究中，我们将GP2鉴定为用于分离PDX1+/NKX6-1+胰腺祖细胞的新的细胞表面标志物，并将CD49d鉴定为PDX1-细胞部分的细胞表面标志物，从而允许阴性选择。还鉴定了另外的细胞表面标志物FOLR1。与GP2相比，该标志物具有更广泛的染色模式，也标记PDX1+/NKX6-1-祖细胞。

与之前公布的标志物相比，这些标志物允许从异质细胞培养物富集胰腺祖细胞并且对于糖尿病疗法的开发是非常有价值的，因为它们能够从其他遗传上未加标签的人ES细胞系分离PDX1+β细胞祖细胞。

实施例2-将eGFP靶向到人PDX1基因座中。

为了监测hESCs中的胰腺内胚层形成，通过使用细菌人工染色体(BAC)重组，靶向胰腺发育和β细胞功能所必需的转录因子胰腺十二指肠同源异形框1(PDX1)(图1A)。使用http://genome.ucsc.edu上的基因组浏览器鉴定含有人PDX1基因的BAC。将eGFP-loxp-Sv40-Neo-loxp报道基因盒直接***PDX1起始密码子的上游。将靶向载体回恢复到细菌质粒中，通过CRE重组酶切割新霉素盒，产生含有12.5kb和3.5kb同源臂的最终靶向载体。值得注意的是，Neo盒的切除对于获得eGFP表达是至关重要的。HUES-4细胞系用线性化靶向载体电穿孔并用G418处理2周，直到出现耐药性集落。筛选353个克隆得到4个正确靶向的克隆(图1B和1C)。为了证实靶向克隆中的PDX1-eGFP表达，我们使用了我们以前公布的分化操作方案的修改版本(Ameri et al.，2010)(图1C)。将hESC暴露于Activin A和Wnt3a(用于在MEF上培养的hESC上使用)或Chir(用于在““DEF-CSTM”培养基，Cellectis干细胞，Cellartis AB”中培养的hESC上使用)以诱导定形内胚层诱导(阶段1)。此阶段之后是三天的维甲酸(RA)添加(阶段2)，然后是剩余的几天的FGF2(偶尔用头蛋白)添加，以诱导后部前肠和胰腺祖细胞(阶段3)。图1D显示了在第13天所靶向的PDX1-eGFP hES细胞系的荧光和相应的相差图像。在第17天，50-70％的细胞常规表达PDX1-eGFP。克隆PDXeG1的免疫染色显示，eGFP与PDX1高度共定位(图1E)。这些结果证实，报道细胞系PDX1-eGFP可用于监测hESC分化过程中的PDX1表达。阶段3细胞的免疫染色(第17天)证实，在蛋白质水平上胰腺祖细胞中NKX6-1、ECAD、HES1和SOX9的表达(图2F)，

实施例3-分析体外分化的PDX1-eGFP hESC。

通过改造我们先前公布的分化操作方案(Ameri et al.，2010)并将其与实施例2中所述的PDX1-eGFP报道细胞系相组合，我们能够FACS分选不同的亚群，或者共表达PDX1和NKX6-1(操作方案A(PE))或仅表达PDX1而缺少NKX6-1(操作方案B(PFG))(图2A，2B和2D)。为了评估FACS分选的eGFP+和eGFP-细胞群体的基因表达谱，通过qPCR定量各种胰腺相关基因的mRNA水平(图2C和2F)。利用操作方案A(PE)获得的eGFP+细胞相对于eGFP-细胞PDX1、NKX6-1、ECAD、MNX1、HNF6和SOX9的表达均显著上调(图2D)。然而，在用操作方案B(PFG)获得的eGFP+细胞中，MNX1和更重要的NKX6-1都没有显著上调(图2G)。这些结果表明，操作方案A(PE)获得的eGFP+细胞是胰腺祖细胞，而操作方案B(PFG)获得的eGFP+细胞是后前肠(内胚层)细胞。阶段3细胞的免疫染色(第17天)证实蛋白质水平的胰腺祖细胞中NKX6-1、ECAD、HES1和SOX9的表达(图2F)。

实施例4-进行微阵列分析以比较体外衍生的PDX1+/NKX6-1+胰腺祖细胞相对于 PDX1+/NKX6-1-细胞的基因表达谱。

为了鉴定将用于富集胰腺祖细胞的特定细胞表面标志物，我们进行了微阵列分析，比较了对应于PDX1+前肠内胚层(PFG)和PDX1+/NKX6-1+胰腺内胚层的两种不同的PDX1+亚群的基因表达模式。具体而言，将PDX1⁺/NKX6-1细胞(称为PFG+)与PDX1⁺/NKX6-1⁺细胞(称为PPC)和相应的GFP-细胞进行比较(图3A)。我们还比较了PDX1+/NKX6-1-细胞(F2GFP+)、PDX1+/NKX6-1+细胞(RFN GFP+)和相应的PDX1-/GFP-细胞(RFN GFP-)的基因表达模式。为了简化分析，仅选择p值低于0.005且倍数变化高于1.4的基因用于进一步分析。这些截断值是基于PDX1和NKX6-1的表达值确定的。这些基因的分级聚类揭示了每个组中不同基因的富集。具体而言，PPC细胞相对于PFG细胞中有382个基因上调/富集，而PPC+相对于GFP-细胞中有698个基因上调。更有意思的是，115个基因在PPC(以PDX1和NKX6-1的表达为特征的胰腺祖细胞)细胞中特异性上调，但在PFG和GFP-细胞中下调(图3B)。通过对每组中的所有重复的平均表达应用分级聚类，创建了九个不同的子聚类(图3C)。

实施例5-在hESC衍生的PDX1+胰腺内胚层中表达的新细胞表面标志物。

在子聚类3a、5和6中列出的基因中，我们鉴定了新细胞表面标志物：在GFP-细胞富集的整联蛋白α4(ITGA4或CD49d)(子聚类3a)，识别PDX1+细胞而与NKX6-1表达无关的叶酸受体1(FOLR1)(子聚类6)，以及在PDX1+/NKX6-1+胰腺祖细胞中特异性富集的糖蛋白2(酶原颗粒膜)(GP2)(子聚类5)。GP2、FOLR1和CD49d通过流式细胞术验证用于衍生自PDXeG细胞的PPC的纯化(图4A)。通过流式细胞术验证候选基因，以鉴定用于纯化hESC衍生的胰腺祖细胞的细胞表面标志物。基于商业抗体的可用性，选择糖蛋白2(酶原颗粒膜)(GP2)、叶酸受体1(成人)(FOLR1)和CD49d(ITGA4)并通过流式细胞术分析。图4A显示GFP+和GFP-部分中位于质膜或细胞外区域的基因的富集。图4B和图5A显示了对在MEF上培养的分化的hESC上(第17天)进行的所选细胞表面标志GP2、CD49d(ITGA4)和FOLR1的流式细胞术分析，证实了GP2和FOLR1在GFP+细胞中高度表达，而CD49d在GFP-细胞中富集。更具体地说，第17天大多数GFP-细胞(70-72％，约71％)表达CD49d，而64-76％(约76％)的GFP+细胞共表达GP2。重要的是，只有低比例的GFP-细胞(3-7％，约3％)表达GP2，基本上没有(1-2％，约1％)的GFP+细胞表达CD49d。用FOLR1和CD49d的共同染色显示CD49d的相同染色模式，在第17天有70-73％(约70％)的GFP-细胞表达CD49d，而41-62％(约62％)的GFP+细胞表达FOLR1(图5A)。

分选的细胞群体的基因表达分析显示，胰腺内胚层标志物和新的细胞表面标志物在GP2+/CD49d-和FOLR1+/CD49d-分选的细胞群体中高度富集(图4C和D)。

表1中显示了依赖于GP2表达的细胞群体中基因表达的相对值(图4C)。

表1

表2中显示了依赖于FOLR1表达的细胞群体中基因表达的相对值(图4D)。

表2

总之，这些数据表明CD49d仅在GFP-细胞中表达，并且GP2标记了大部分GFP+细胞。然而，与GP2相比，FOLR1标记了GFP+细胞的一小部分，使得GP2成为识别PDX1+胰腺祖细胞的更特异性标志物。

实施例6-在无饲养细胞***中培养的遗传上未加标签细胞系中新细胞表面标志物的表征。

为了研究我们鉴定的细胞表面标志物是否也可用于未经遗传修饰的细胞系中并验证我们新鉴定的标志物，我们使用在无饲养层条件下培养的未经遗传修饰的细胞系HUES4细胞，以通过流式细胞术表征CD49d、GP2和FOLR1的表达。HUES-4细胞系也用于产生PDX1-eGFP细胞系(图4C和5C)。一般来说，与MEF培养相比，我们的分化操作方案在确定的无饲养细胞培养***中效率更高，因此观察到的CD49d+细胞极少。

从第17天开始，通过qPCR在分化的hESC中对以下亚群进行分选和表征；CD49d+/GP2，GP2-/CD49d-和GP2+/CD49d-(图4D)。与CD49d+/GP2-和GP2-/CD49d-细胞相比，胰腺标志物PDX1、NKX6-1、SOX9、HNF6、FOXA2、MNX1均显著富集在GP2+/CD49d-细胞中。重要的是，尽管在GP2-CD49d-细胞中仍然检测到PDX1，但是这些细胞具有NKX6-1和GP2的低表达，表明这些细胞是PDX1+后部前肠细胞。此外，缺乏GP2表达以及FOLR1在GP2-/CD49d-细胞中仍然表达的观察结果表明，GP2特异性标记胰腺祖细胞，而FOLR1更广泛地表达。亚群CD49d+/FOLR1-、FOLR1-/CD49d-和FOLR1+CD49d-的基因表达分析(图5D)显示，虽然所有的胰腺标志物确实富集在FOLR1+/CD49d-细胞中，但FOLR1-CD49d-细胞仍然含有PDX1、NKX6-1表达细胞，表明FOLR1在识别/标记胰腺祖细胞方面比GP2具有稍低的特异性。

因此，这些数据显示GP2和FOLR1特异性标记hESC衍生的PDX1+/NKX6-1+细胞，而不管它们是在确定的无饲养层培养***中还是在MEF上衍生的。总之，我们的数据表明，GP2特别标记hPSC衍生的PDX1+/NKX6-1+PPC，而FOLR1识别hPPCs和缺乏NKX6-1表达的hPFC。

表3中显示了依赖于FOLR1表达的细胞群体中基因表达的相对值(图5D)。

表3

表4中显示了依赖于GP2表达的细胞群体中基因表达的相对值(图5C)。

表4

实施例7-验证人胎儿胰脏中的新细胞表面标志物GP2和CD49d。

为了验证GP2和CD49d标志物，并为了验证GP2是否也在体内起作用，我们使用来自9.1WD的人胎儿胰脏来检查GP2和CD49d的表达。我们进行了人胎儿胰腺的流式细胞术分析。与hPSC媲美的是，在人胚胎胰腺中GP2和CD49d表达之间没有重叠(图4E)。在FACS分选的GP2+和CD49d+细胞群体中分析PDX1和NKX6-1的表达。PDX1和NKX6-1在GP2+细胞中显著富集，在用作对照的CD45+/CD31+造血内皮细胞上没有检测到表达(图4G)。

总之，这些结果表明，hESCs和人胎胰腺中的GP2+细胞均标记以PDX1和NKX6-1表达为特征的胰腺祖细胞，并且GP2可用于从体外从两种hPSC和体内从人胎胰分离PPC。

实施例8-使用独立的先前公布的分化操作方案验证GP2。

为了证实我们的发现，根据由Rezania et al.2013发表的先前分化操作方案的稍微修改的版本，对PDXeG细胞系进行分化(图6A)，并且基于GP2和GFP表达分选不同的亚群(图6B)。与我们在我们的操作方案中观察到的相比，Rezania的操作方案产生了由GFP+/GP2-和GFP+/GP2+细胞组成的异质细胞群体(图6B)。基因表达分析显示GP2+GFP+细胞显著富集PPC相关基因PDX1、NKX6-1、SOX9、GP2和PTF1a，而GP2-GFP-细胞表达高水平的CD49d(图6C)。在GP2-GFP+细胞中观察到最高水平的FOLR1，然而FOLR1也在GP2+/GFP+和GP2-/GFP-细胞中表达(图6C)。总之，这些发现与上面显示的数据一起表明，GP2可独立于培养***或分化操作方案而用于从异源分化培养物分离PDX1+/NKX6-1+hPPC。

实施例9-用于纯化胰腺祖细胞的目前可用的细胞表面标志物的表征。

最后，我们使用在MEF上培养并根据“操作方案PE”(图7A)分化的PDXeG报道细胞系，检查了之前报道的细胞表面标志物CD142、CD200(Kelly et al.,2011)的表达模式。大部分GFP+和GFP-细胞被用CD142和CD200染色，表明这些表面标志物并不如实标记胰腺祖细胞群体。通过应用由Rezania et al.,2013发表的独立的无饲养层分化操作方案并与未经遗传修饰的细胞系HUES4组合，我们与先前公布的CD142和CD200平行评估了我们的新型细胞表面标志物的特异性。这些结果清楚地表明GP2在标记PDX1+/NKX6-1+PPC方面是优异的(图7B，C)。

在MEF上培养的PDXeG报道细胞系中先前鉴定的细胞表面标志物CD142和CD200的流式细胞术分析(图7A)显示，大部分GFP+和GFP-细胞被用CD142和CD200染色。因此，这些标志物在识别异源干细胞培养物中的PDX1+/NKX6-1+细胞方面不够特异。

总的来说，这些发现显示新的细胞表面标志物GP2、Cd49d和FOLR1能够用于分离hESC衍生的胰腺祖细胞，并且之前公布的CD200和CD142在识别胰腺祖细胞方面不如GP2或FOLR1具有特异性。

实施例10-纯化的GP2+/CD49d-PPC向表达胰岛素的细胞的分化/纯化的GP2+hPPC 向β细胞谱系分化的谱系潜力。

为了显示分离的GP2+/CD49d-胰腺祖细胞具有分化成表达胰岛素的细胞的能力，在FACS分选后将这些细胞重新铺板(图8A)。使用遗传上未加标签的细胞系HUES4进行这个重新铺板实验(图8)。将纯化的PPC重铺于纤连蛋白包被的板上，并在毛喉素、ALKi、头蛋白和烟酰胺的存在下进一步分化。在最初的24-48小时内，还加入了Rock抑制剂以增加分选后的活力(图8B)。由于在这些培养物中出现极少量的CD49d+细胞，所以GP2+和数量有限/数量少的GP2低表达细胞得到分选(图8C)。

与GP2^低(CD49d-)细胞相比，分化的GP2+(Cd49d-)细胞显示出CPEP+细胞的显著富集(图8D)，这也通过定量CPEP+细胞/DAPI面积得到证实(图8F)。

分化的GP2+/CD49d-细胞的免疫荧光分析显示在图8E中。最后，衍生自GP2+PPC的细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌分析证实，这些细胞也是葡萄糖反应性的(图5G)。因此，通过使用我们的修改的操作方案，GP2+PPC可以被分化为葡萄糖反应性单激素C-肽(CPEP)+细胞。

实施例11-CDKN1a沉默促进GP2+人胰腺祖细胞的扩增

在基于我们的微阵列分析在PDX1+/NKX6-1+PPC中富集的基因中，我们发现了几个细胞周期特异性基因，特别是CDKN1a和CDKN2a。为了研究这些基因是否是(参与)调节胰腺祖细胞扩增的细胞周期机制中的重要靶，我们在不同时间点在胰腺祖细胞中对选择的靶进行siRNA介导的敲低。事实上，在早期胰腺祖细胞中CDKN1a的敲低(图9B)显著升高(观察到增加>60％，数据未显示)了在G2/M期的增殖的胰腺祖细胞数目(图9C-E)。若在成熟的GP2+胰腺祖细胞中进行CDKN1a敲低，则不存在这种增殖作用(图9F-H)。如所预期的，用Ki67进行免疫荧光染色证实CDKN1a敲低的早期胰腺祖细胞中Ki67+细胞显著增加(图9I)。

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项

1.用于分离富集了真正的胰腺祖细胞的群体的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

和/或

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

2.根据项1所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个是抗体或其片段。

3.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆或多克隆抗体。

4.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个与所述真正的胰腺祖细胞的细胞表面标志物结合。

5.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个与标记物缀合。

6.根据前述项中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术检测所述第一、第二和第三标志物中的至少一个的表达。

7.根据前述项中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术去除或选择所述细胞。

8.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段。

9.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第二配体是针对选自由FOLR1，CDH1/ECAD，F3/CD142，PDX1，FOXA2，EPCAM，HES1和GATA4组成的组的靶的抗体或其片段。

10.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第二配体是针对FOLR1的抗体或其片段。

11.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第三配体是针对选自由GP2，SCN9A，MPZ，NAALADL2，KCNIP1，CALB1，SOX9，NKX6-2和NKX6-1组成的组的靶的抗体或其片段。

12.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第三配体是针对GP2的抗体或其片段。

13.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段，并且所述第三配体是针对GP2的抗体。

14.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段，所述第二配体是针对FOLR1的抗体或其片段，并且所述第三配体是针对GP2的抗体或其片段。

15.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述真正的胰腺祖细胞衍生自能够分化的细胞，如人多能干细胞。

16.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述能够分化的细胞选自由人iPS细胞(hIPSC)，人ES细胞(hESC)和初始人干细胞(NhSC)组成的组。

17.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述能够分化的细胞衍生自从个体分离的细胞。

18.根据前述项中任一项的方法，其中富集胰腺祖细胞的细胞群体的至少一个细胞具有进一步分化的能力。

19.根据前述项中任一项的方法，其中富集胰腺祖细胞的细胞群体的至少一个细胞具有进一步分化为产生胰腺激素的细胞的能力。

20.根据前述项中任一项的方法，其中至少一个产生胰腺激素的细胞是产生胰岛素的细胞和/或对葡萄糖有反应。

21.根据前述项中任一项的方法，其中富集胰腺祖细胞的细胞群体的至少一个细胞能够产生产生胰岛素的胰岛细胞。

22.用于产生富集胰腺祖细胞的细胞群体的方法，所述富集的细胞群体包含至少70％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

23.项22的方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供包含真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1；和

ii)将所述细胞群暴露于：

a)第一配体，其与PDX1-细胞特异性的第一标志物结合，并从所述细胞群选择不结合所述第一配体的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；

和/或

c)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，从而使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞。

24.项22或23的方法，其中第一配体是针对CD49d的抗体或其片段，第二配体是针对FOLR1的抗体或其片段，第三配体是针对GP2的抗体或其片段。

25.细胞群体，其包含至少50％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

26.包含真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其通过项1至21中任一项所述的方法能够获得。

27.根据项26的细胞群体，其中所述细胞群包含至少50％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

28.包含真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其通过项1至21中任一项的方法能够获得，用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱。

29.根据项28所述的细胞群体用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱，其中所述细胞群体包含至少50％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

30.根据项25至29中任一项所述的富集胰腺祖细胞的细胞群体，用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱。

31.项30的细胞群体，其中所述代谢紊乱为糖尿病，如胰岛素依赖性糖尿病，非胰岛素依赖性糖尿病，营养不良相关的糖尿病，1型糖尿病，2型糖尿病或未明确的糖尿病。

32.治疗有此需要的个体的代谢紊乱的方法，其中所述方法包括提供根据项25至29中任一项所述的细胞群体的步骤。

33.根据项32所述的方法，所述方法还包括将所述细胞群的至少一部分移植入所述个体的步骤。

34.根据项32至33中任一项的方法，所述方法进一步包括诱导至少部分细胞群分化为产生胰岛素的细胞的步骤，以及任选地分离所述产生胰岛素的细胞的步骤。

35.根据项32至34中任一项所述的方法，其中诱导至少部分细胞群分化为产生胰岛素的β细胞的步骤包括在存在Yap1抑制剂的情况下孵育至少部分所述细胞群的步骤，由此获得富含产生胰岛素的β细胞的细胞群。

36.根据项35所述的方法，其中所述Yap1抑制剂是维替泊芬。

37.根据项32至36中任一项所述的方法，其中与在不存在Yap1抑制剂的情况下孵育的细胞相比，产生胰岛素的β细胞具有增加的Insm-1，Isl-1，MafA和MafB之一的表达。

38.根据项32至37中任一项所述的方法，其中与在不存在Yap1抑制剂的情况下孵育细胞群时获得的细胞中的胰岛素面积相比，产生胰岛素的β细胞具有增加的胰岛素面积。

39.根据项32至36中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述产生胰岛素的细胞移植入所述个体的步骤。

Claims

ii)将所述细胞群体暴露于：

和/或

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个是抗体或其片段。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆或多克隆抗体。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个与所述真正的胰腺祖细胞的细胞表面标志物结合。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个与标记物缀合。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术检测所述第一、第二和第三标志物中的至少一个的表达。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术去除或选择所述细胞。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二配体是针对选自由FOLR1、CDH1/ECAD、F3/CD142、PDX1、FOXA2、EPCAM、HES1和GATA4组成的组的靶的抗体或其片段。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二配体是针对FOLR1的抗体或其片段。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三配体是针对选自由GP2、SCN9A、MPZ、NAALADL2、KCNIP1、CALB1、SOX9、NKX6-2和NKX6-1组成的组的靶的抗体或其片段。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三配体是针对GP2的抗体或其片段。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段，并且所述第三配体是针对GP2的抗体。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段，所述第二配体是针对FOLR1的抗体或其片段，并且所述第三配体是针对GP2的抗体或其片段。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞，其中所述第三个标志物是GP2；

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

a)第二配体，其与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞，其中所述第二标志物是FOLR1；

和

b)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞，其中所述第三标志物是GP2；

由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述真正的胰腺祖细胞衍生自能够分化的细胞，如人多能干细胞。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述能够分化的细胞选自由人iPS细胞(hIPSC)、人ES细胞(hESC)和初始人干细胞(NhSC)组成的组。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述能够分化的细胞衍生自从个体分离的细胞。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中富集胰腺祖细胞的细胞群体中的至少一个细胞具有进一步分化的能力。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述富集胰腺祖细胞的细胞群体中的至少一个细胞具有进一步分化为产生胰腺激素的细胞的能力。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产生胰腺激素的细胞中的至少一个细胞是产生胰岛素的细胞和/或对葡萄糖有反应。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述富集胰腺祖细胞的细胞群体的至少一个细胞能够产生产生胰岛素的胰岛细胞。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤i)中提供的细胞群体中，CDKN1a和/或CDKN2a是失活的。

25.根据权利要求24所述的方法，其中CDKN1a和/或CDKN2a是通过敲低、缺失，沉默或阻遏而失活的。

26.根据权利要求24至25中任一项所述的方法，其中起始细胞群体是表达PDX1的胰腺祖细胞群体。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中与当CDKN1a和/或CDKN2a不是失活的时候进入复制阶段的细胞的比例相比，CDKN1a和/或CDKN2a的失活导致进入复制阶段的细胞的比例增加。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述增加至少1.5倍，如至少2.0倍，如至少2.5倍，如至少3.0倍，如至少3.5倍。

29.用于生产富集真正的胰腺祖细胞的细胞群体的方法，所述富集细胞群体包含至少70％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

30.权利要求29所述的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

和/或

c)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞。

31.权利要求29至30中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于与PDX1+NKX6-1+细胞特异性第三标志物结合的第三配体，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，其中所述第三标志物是GP2，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)将所述细胞群体暴露于：

和

b)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不结合所述第三配体的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，其中所述第三标志物是GP2，

由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞。

33.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段，所述第二配体是针对FOLR1的抗体或其片段，并且所述第三配体是针对GP2的抗体或其片段。

34.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中在步骤i)中提供的细胞群体中，CDKN1a和/或CDKN2a是失活的。

35.细胞群体，其包含至少50％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

36.细胞群体，其包含通过权利要求1至23中任一项所述的方法能够获得的真正的胰腺祖细胞。

37.根据权利要求36所述的细胞群体，其中所述细胞群体包含至少50％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

38.通过权利要求1至23中任一项的方法能够获得的包含真正的胰腺祖细胞的细胞群体，用于治疗方法。

39.通过权利要求1至23中任一项的方法能够获得的包含真正的胰腺祖细胞的细胞群体，用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱。

40.根据权利要求38或39中任一项细胞群体用于所述用途，其中所述细胞群体包含至少50％的真正的胰腺祖细胞，如至少75％的真正的胰腺祖细胞，如至少80％的真正的胰腺祖细胞，如至少85％的真正的胰腺祖细胞，如至少90％的真正的胰腺祖细胞。

41.根据权利要求35至40中任一项所述的富集真正的胰腺祖细胞的细胞群体，用于治疗有此需要的个体的代谢紊乱。

42.权利要求41所述的用途的细胞群体，其中所述代谢紊乱是糖尿病，如胰岛素依赖性糖尿病，非胰岛素依赖性糖尿病，营养不良相关的糖尿病，1型糖尿病，2型糖尿病或未明确的糖尿病。

43.治疗有此需要的个体的代谢紊乱的方法，其中所述方法包括提供根据权利要求35至40中任一项所述的细胞群体的步骤。

44.根据权利要求43所述的方法，所述方法还包括将所述细胞群体的至少一部分移植入所述个体的步骤。

45.根据权利要求43至44中任一项所述的方法，所述方法还包括诱导至少部分细胞群体分化为产生胰岛素的细胞的步骤，以及任选地分离所述产生胰岛素的细胞的步骤。

46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中诱导至少部分细胞群分化为产生胰岛素的β细胞的步骤包括在存在Yap1抑制剂的情况下孵育至少部分所述细胞群的步骤，由此获得富集产生胰岛素的β细胞的细胞群。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述Yap1抑制剂是维替泊芬。

48.根据权利要求43至47中任一项所述的方法，其中与在不存在Yap1抑制剂的情况下孵育的细胞相比，产生胰岛素的β细胞具有增加的Insm-1、Isl-1、MafA和MafB中之一的表达。

49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，其中与在不存在Yap1抑制剂的情况下孵育细胞群时获得的细胞中的胰岛素面积相比，产生胰岛素的β细胞具有增加的胰岛素面积。

50.根据权利要求43至47中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述产生胰岛素的细胞移植入所述个体的步骤。