ES2886958T3 - Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado - Google Patents

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Abstract

Un roedor cuyo genoma comprende un gen Tmprss humanizado, en donde el gen Tmprss humanizado - comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, - se encuentra en un locus Tmprss de roedor endógeno, y es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica del gen Tmprss de roedor endógeno con dicha secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín y está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor endógeno, y - codifica una proteína Tmprss humanizada que comprende: (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado
Antecedentes
Las serina proteasas transmembrana de tipo II son una familia de proteasas caracterizadas por un dominio transmembrana aminoterminal (Bugge et al., J. Biol. Chem. 284 (35): 23177-23181,2009; Hooper et al., J. Biol. Chem.
272(2): 857-860, 2001). Todos los miembros de esta familia se expresan como zimógenos monocatenarios y se activan proteolíticamente por escisión dentro de un motivo R/(IV)VGG altamente conservado. Un miembro de la familia, la proteasa transmembrana, serina de tipo 4 (TMPRSS4), se ha demostrado que activa el canal de sodio epitelial (ENaC, por sus siglas en inglés) que regula el flujo de sodio y agua a través de los epitelios (Guipponi et al. 2002 Hum. Mol. Genet. 11:2829; Vuagniaux et al. 2002 J. Gen. Physiol. 120:191). Se desconocen los activadores proteolíticos de TMPRSS4; sin embargo, los datos disponibles hasta la fecha sugieren que la proteína se activa a sí misma. Cuando se activa, el dominio catalítico de TMPRSS4 permanece unido al extremo N de la proteína a través de un enlace disulfuro. Se ha demostrado que TMPRSS4, TMPRSS2 y TMPRSS11D (o proteasa similar a tripsina de las vías respiratorias humana; "HAT, por sus siglas en inglés") escinden la hemaglutinina de la gripe A (HA) in vitro, que es la primera etapa esencial en el ciclo de vida vírico. Esta escisión es esencial para la actividad de HA, ya que la proteína se sintetiza como una proteína precursora (HA0) y necesita la escisión en HA1 y HA2 para su actividad. El ARNi con atenuación génica de TMPRSS4 en células Caco-2 dio como resultado una reducción de la propagación del virus. Así mismo, se demostró que TMPRSS4 está fuertemente regulada positivamente en los pulmones de ratones infectados con gripe (Bottcher et al. 2006 J. Virol. 80:9896; Bottcher et al. 2009 Vaccine 27: 6324; Bottcher-Friebershausser et al.
2010 J. Virol. 84: 5604; Bertam et al. 2010 J. Virol. 84:10016; Bertam et al. 2010 J. Virol. 84:10016; Bottcher-Friebershausser et al. 2011 J. Virol. 85: 1554; Bahgat et al. 2011 Virol. J. 8:27).
Se necesita la creación de un sistema in vivo, por ejemplo, un modelo de infección en roedores, para identificar y probar compuestos que incluyen anticuerpos que se dirigen específicamente a las serina proteasas transmembrana de tipo II humanas para el tratamiento y la prevención de infecciones víricas y otras enfermedades.
También se hace referencia a los siguientes documentos:
• Kuhn et al (2015) consultado de internet: URL: http: //elib.tihohanover.de/dissertations/kuehnn s15.pdf que se refiere a estudios sobre la respuesta del hospedador a las infecciones por el virus de la gripe A en mutantes nuligénicos de ratón;
• WO 2013/158516 A1 que se refiere a métodos para tratar o prevenir la infección por el virus de la gripe administrando un inhibidor de serina proteasas;
• Sol et al (2009) consultado de internet: URL: http: //www.dtic.mil/get-tr-doc/pdf? AD = ADA525092 que se refiere a la caracterización de la proteasa TMPRSS2 como moduladora de la metástasis de cáncer de próstata;
• Bottcher-Friebertshauser et al (2010) Journal of Virology 84 (11): 5605-5614, que se refiere a la escisión de la hemaglutinina del virus de la gripe por las proteasas de las vías respiratorias TMPRSS2 y HAT, que difiere en la localización subcelular y la susceptibilidad a los inhibidores de proteasas;
• Devoy et al (2012) Nature Reviews Genetics, 13: 14-20 que se refiere a ratones humanizados genómicamente: tecnologías y promesas.
• Murphy et al (2014) PNAS USA 111(14): 5153-5158, que se refiere a ratones con humanización de megabases de sus genes de inmunoglobulinas que generan anticuerpos tan eficazmente como ratones normales; y
• Maconald et al (2014) PNAS USA 111(14): 5147-5152 que se refiere a la humanización genética precisa e in situ de 6 Mb de genes de inmunoglobulina de ratón.
Sumario
La presente invención abarca el reconocimiento de que es deseable modificar por ingeniería animales roedores para proporcionar sistemas de identificación in vivo y creación de nuevas terapias. Por ejemplo, la presente invención abarca el reconocimiento de que los roedores que tienen un gen Tmprss humanizado son deseables para su uso en la identificación y creación de agentes terapéuticos para el tratamiento y la prevención de infecciones víricas.
En un aspecto, la invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un gen Tmprss humanizado, en donde el gen Tmprss humanizado:
- comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín,
- se encuentra en un locus Tmprss de roedor endógeno, y es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica del gen Tmprss de roedor endógeno con dicha secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín y está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor endógeno, y
- codifica una proteína Tmprss humanizada que comprende: (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína T mprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
El gen Tmprss humanizado en roedores divulgado en el presente documento codifica una proteína Tmprss humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia al ectodominio de una proteína TMPRSS humana. La proteína Tmprss humanizada contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % (p. ej., al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica en secuencia a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena.
Un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín codifica un polipéptido al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia al ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín. Un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, en donde la secuencia de nucleótidos del gen Tmprss de roedor endógeno codifica un polipéptido al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss humanizado localizado en un locus Tmprss de roedor endógeno que es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss de roedor endógeno con una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano afín. En realizaciones específicas, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano afín que se está insertando incluye secuencias de exones que codifican un ectodominio sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSs codificada por el gen TMPRSS humano. En algunas realizaciones, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano afín también incluye la 3' UTR del gen TMPRSS humano afín.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento es heterocigoto para un gen Tmprss humanizado en un locus Tmprss de roedor endógeno. En otras realizaciones, un roedor es homocigoto para un gen Tmprss humanizado en un locus Tmprss de roedor endógeno.
En realizaciones adicionales, un roedor contiene dos o más genes Tmprss humanizados en diferentes locus Tmprss de roedor endógenos estando cada locus Tmprss de roedor endógeno humanizado con un gen TMPRSS humano afín; por ejemplo, dos o más de los genes Tmprss2 humanizado, Tmprss4, humanizado y Tm prsslld humanizado.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss2 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano, en donde el gen Tmprss2 humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss2 de roedor endógeno.
En algunas realizaciones, el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por el gen TMPRSS2 humano utilizado en la humanización. La proteína TMPRSS2 humana contiene, en algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % idéntica (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta por los restos W106 a G492 o los 387 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS2 humana como se expone en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que además contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor codificada por el gen Tmprss2 de roedor endógeno que se está humanizando. Una proteína Tmprss2 de roedor endógena ilustrativa se expone en la SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, un roedor contiene un gen Tmprss2 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS2 humano codifica un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por el gen TMPRSS2. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano es una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que contiene el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones particulares, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano contiene además la 3' UTR del gen TMPRSS2 humano. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno incluido en un gen Tmprss2 humanizado codifica una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena codificada por el gen Tmprss2 de roedor endógeno.
En realizaciones particulares, un gen Tmprss2 humanizado contiene los exones 1-2 codificantes de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante de un gen TMPRSS2 humano, en donde el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor codificada por el gen Tmprss2 de roedor endógeno y un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por el gen TMPRSS2 humano. El gen Tmprss2 humanizado contiene un exón 3 que en algunas realizaciones codifica el exón 3 de un gen TMPRSS2 humano y en otras realizaciones codifica el exón 3 de un gen Tmprss2 de roedor endógeno. En algunas realizaciones, el gen Tmprss2 humanizado contiene un exón 3 que incluye una porción 5' del exón 3 codificante de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una porción 3' del exón 3 codificante de un gen TMPRSS2 humano.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss4 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano, en donde el gen Tmprss4 humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss4 de roedor endógeno.
En algunas realizaciones, el gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana codificada por el gen TMPRSS4 humano utilizado en la humanización. La proteína TMPRSS4 humana contiene, en algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % idéntica (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica) a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta por los restos K54 a L437 o los 384 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS4 humana como se expone en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que además contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % (al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor codificada por el gen Tmprss4 de roedor endógeno que se está humanizando. Una proteína Tmprss4 de roedor endógena ilustrativa se expone en la SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones, un roedor contiene un gen Tmprss4 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano, en donde la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano codifica un ectodominio al menos un 85 % idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana codificada por el gen TMPRSS4 humano. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano es una secuencia genómica contigua que contiene el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno incluido en un gen Tmprss4 humanizado codifica una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor codificada por el gen Tmprss4 de roedor endógeno.
En realizaciones particulares, un gen Tmprss4 humanizado contiene el exón 1 codificante hasta el exón 3 codificante de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tm prsslld humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tm prsslld de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano, en donde el gen Tm prsslld humanizado está bajo el control del promotor del gen Tm prsslld de roedor endógeno.
En algunas realizaciones, el gen Tm prsslld humanizado codifica una proteína Tmprss11 d humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 %, (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana codificada por el gen TMPRSS11D humano utilizado en la humanización. La proteína TMPRSS11D humana contiene, en algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % idéntica (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica) a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada contiene un ectodominio al menos un 85 % (al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta por los restos A42-I418 o los 377 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS11D humana como se expone en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, el gen Tm prsslld humanizado codifica una proteína Tmprss11d humanizada que además contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 %, (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss11d de roedor endógena codificada por el gen Tm prsslld de roedor endógeno que se está humanizando. Una proteína Tmprss11d de roedor endógena ilustrativa se expone en la SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, un roedor contiene un gen Tm prsslld humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tm prsslld de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS11D humano codifica un ectodominio sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana codificada por el gen TMPRSS11D humano. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11d humano es una secuencia genómica contigua que contiene el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante de un gen TMPRS11D humano. En realizaciones particulares, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano contiene además la 3' UTR del gen TMPRSS11D humano. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss11d de roedor endógeno incluido en un gen Tmprss11d humanizado codifica una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss11d de roedor codificada por el gen Tmprss11d de roedor endógeno.
En realizaciones particulares, un gen Tmprss11d humanizado contiene los exones 1-2 codificantes de un gen Tmprss11d de roedor endógeno y el exón 3 codificante hasta el exón 13 codificante de un gen TMPRSS11D humano.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula o tejido de roedor aislado cuyo genoma contiene un gen Tmprss humanizado como se describe en el presente documento. En realizaciones específicas, el gen Tmprss humanizado se selecciona del grupo que consiste en un gen Tmprss2 humanizado, un gen Tmprss4 humanizado y un gen Tmprss11d humanizado.
En otro aspecto más, la invención proporciona una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss humanizado como se describe en el presente documento. En realizaciones específicas, el gen Tmprss humanizado se selecciona del grupo que consiste en un gen Tmprss2 humanizado, un gen Tmprss4 humanizado y un gen Tmprss11d humanizado.
En otro aspecto, también se proporciona un embrión de roedor generado a partir de la célula madre embrionaria de roedor divulgada en el presente documento.
También se divulga un vector de ácido nucleico adecuado para su uso en la humanización de un gen Tmprss endógeno en un roedor. En algunos casos, el vector de ácido nucleico incluye una secuencia del ácido nucleico de Tmprss humano (por ejemplo, un ADN genómico humano que codifica el ectodominio de una proteína TMPRSS humana), flanqueado por un brazo de homología 5' y un brazo de homología 3'. Los brazos de homología 5' y 3' son secuencias de un ácido nucleico que se colocan en 5' y 3', respectivamente, de la secuencia del ácido nucleico de Tmprss humano y son homólogas a las secuencias de ADN genómico en un locus Tmprss endógeno en un roedor que flanquea un ADN genómico de roedor que codifica el ectodominio de una proteína Tmprss de roedor afín. Por tanto, los brazos de homología 5' y 3' son capaces de mediar la recombinación homóloga y la sustitución del ADN genómico de roedor que codifica el ectodominio de la proteína Tmprss de roedor afín con la secuencia del ácido nucleico de Tmprss humano para formar un gen Tmprss humanizado como se describe en el presente documento.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para proporcionar un roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss humanizado. El método incluye modificar el genoma de un roedor para reemplazar una secuencia genómica de un gen Tmprss de roedor endógeno con una secuencia genómica de un gen TMPRSS humano afín para formar un gen Tmprss humanizado.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para hacer que un roedor (tal como un ratón o una rata) tenga un gen Tmprss humanizado, que comprende:
(a) insertar un fragmento genómico en un locus Tmprss de roedor endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, comprendiendo dicho fragmento genómico una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, formando, de este modo, un gen Tmprss humanizado,
en donde el gen Tmprss humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor en el locus Tmprss de roedor endógeno y codifica una proteína T mprss humanizada, y
en donde la proteína Tmprss humanizada comprende (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor codificada por el gen Tmprss de roedor en dicho locus Tmprss de roedor endógeno;
(b) obtener una célula madre embrionaria de roedor que comprende el gen Tmprss humanizado de (a); y,
(c) crear un roedor utilizando la célula madre embrionaria de roedor de (b).
En algunas realizaciones, el gen Tmprss humanizado se selecciona del grupo que consiste en un gen Tmprss2 humanizado, un gen Tmprss4, humanizado y un gen Tm prsslld humanizado. En diversas realizaciones, el gen Tmprss humanizado codifica una proteína Tmprss humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 % idéntico (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia) al ectodominio de la proteína Tm p Rs S humana codificada por el gen TMPRSS humano utilizado para la humanización. En realizaciones específicas, la proteína Tmprss humanizada contiene el ectodominio de una proteína TMPRSS humana seleccionada del grupo que consiste en una proteína TMPRSS2 humana, una proteína TMPRSS4 humana y una proteína TMPRSS 11D humana. En realizaciones específicas, la proteína Tmprss humanizada contiene además una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno que se está humanizando.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para utilizar un roedor divulgado en el presente documento para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto (por ejemplo, inhibidores candidatos que se dirigen específicamente a una proteína TMPRSS humana) en el tratamiento de la infección por el virus de la gripe. En particular, la presente invención proporciona un método para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto en el tratamiento de una infección por el virus de la gripe A, que comprende:
proporcionar un roedor de la presente invención;
administrar un virus de la gripe A y un compuesto candidato al roedor, en donde opcionalmente el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana; y
monitorizar la presencia y la gravedad de la infección por el virus de la gripe A en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del compuesto candidato.
En algunas realizaciones, el virus de la gripe se administra al roedor antes que el compuesto. En otras realizaciones, el virus de la gripe se administra al roedor después del compuesto.
En algunas realizaciones, el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana. En realizaciones específicas, el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana seleccionada del grupo que consiste en una proteína TMPRSS2 humana, una proteína TMPRSS4 humana y una proteína TMPRSS11D humana.
Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada a continuación. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica realizaciones de la presente invención, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación. Serán evidentes diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención para los expertos en la materia a partir de la presente descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos incluidos en el presente documento, que están compuestos por las siguientes figuras, son solamente para fines de ilustración y no de limitación.
Figuras 1A-1D. Estrategia ilustrativa para la humanización de Tmprss2 de ratón.
La figura 1A muestra un diagrama, no a escala, de la organización genómica de los genes Tmprss2 de ratón y TMPRSS2 humano. Los exones están representados por barras delgadas colocadas a lo largo de las secuencias genómicas, indicando el primer exón codificante para ambos genes mediante el codón de inicio "ATG" por encima del exón e indicando el último exón codificante mediante el codón de "parada" por encima del exón. Se indican un fragmento genómico de ratón de aproximadamente 25.291 pb a eliminar y un fragmento genómico humano de aproximadamente 25.091 pb a insertar. Se indican las ubicaciones de las sondas utilizadas en un ensayo descrito en el ejemplo 1. DT: dominio transmembrana; SRCR: dominio de tipo rico en cisteína del receptor eliminador; LDLRa: receptor de lipoproteínas de baja densidad de clase A.
La figura 1B ilustra, no a escala, un vector BAC modificado ilustrativo para la humanización de un gen Tmprss2 de ratón endógeno, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 22, 23 y 24).
La figura 1C ilustra, no a escala, un alelo Tmprss2 humanizado después de que se haya eliminado el casete de neomicina, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 22 y 25).
La figura 1D establece una alineación de secuencias de una proteína TMPRSS2 humana (SEQ ID NO: 4), una proteína Tmprss2 de ratón (SEQ ID NO: 2) y una proteína Tmprss2 humanizada ("pro 7010 mutante") (SEQ ID NO: 7).
Figuras 2A-2D. Estrategia ilustrativa para la humanización de Tmprss4 de ratón.
La figura 2A muestra un diagrama, no a escala, de la organización genómica de los genes Tmprss4 de ratón y TMPRSS4 humano. Los exones están representados por barras delgadas colocadas a lo largo de las secuencias genómicas, indicando el primer exón (también el primer exón codificante) para ambos genes mediante el codón de inicio "ATG" por encima del exón e indicando el último exón codificante mediante el codón de "parada" por encima del exón. Se indican el fragmento genómico de ratón de aproximadamente 11.074 pb a eliminar y el fragmento genómico humano de aproximadamente 14.963 pb a insertar. Se indican las ubicaciones de las sondas utilizadas en un ensayo descrito en el ejemplo 2. DT: dominio transmembrana; SRCR: dominio de tipo rico en cisteína del receptor eliminador; LDLRa: receptor de lipoproteínas de baja densidad de clase A.
La figura 2B ilustra, no a escala, un vector BAC modificado ilustrativo para la humanización de un gen Tmprss4 de ratón endógeno, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 38, 39 y 40).
La figura 2C ilustra, no a escala, un alelo Tmprss4 humanizado después de que se haya eliminado el casete de neomicina, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 41 y 40).
La figura 2D establece una alineación de secuencias de una proteína TMPRSS4 humana (SEQ ID NO: 11), una proteína T mprss4 de ratón (SEQ ID NO: 9) y una proteína T mprss4 humanizada ("pro 7224 mutante") (SEQ ID NO: 14).
Figuras 3A-3D. Estrategia ilustrativa para la humanización de Tm prsslld de ratón.
La figura 3A muestra un diagrama, no a escala, de la organización genómica de los genes Tm prsslld de ratón y TMPRSS11D humano. Los exones están representados por barras delgadas colocadas a lo largo de las secuencias genómicas, indicando el primer exón (también el primer exón codificante) para ambos genes mediante el codón de inicio "ATG" por encima del exón e indicando el último exón codificante mediante el codón de "parada" por encima del exón. Se indican un fragmento genómico de ratón de aproximadamente 35.667 pb a eliminar y un fragmento genómico humano de aproximadamente 33.927 pb a insertar. Se indican las ubicaciones de las sondas utilizadas en un ensayo descrito en el ejemplo 3. DT: dominio transmembrana; SEA: dominio que se encuentra en la proteína, enterocinasa y agrina de esperma de erizo de mar.
La figura 3B ilustra, no a escala, un vector BAC modificado ilustrativo para la humanización de un gen Tm prsslld de ratón endógeno, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 57, 58 y 59).
La figura 3C ilustra, no a escala, un alelo Tm prssll humanizado después de que se haya eliminado el casete de neomicina, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 57 y 60).
La figura 3D establece una alineación de secuencias de una proteína TMPRSS11D humana (SEQ ID NO: 18), una proteína Tmprss11d de ratón (SEQ ID NO: 16) y una proteína Tmprss11d humanizada ("pro 7226 mutante") (SEQ ID NO: 21).
La figura 4 muestra los resultados de un experimento que muestra que los ratones MAID7225 HumlnTMPRSS4 no difieren en su susceptibilidad a la exposición con dosis altas de gripe A H1N1 grave o H3N2 adaptada a ratón grave. Los ratones MAID7225 Humln TMRPSS4 expuestos con A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) (círculos de color gris claro, línea discontinua) mostraron tasas de supervivencia similares en comparación con los ratones de tipo silvestre (cuadrados de color gris claro, línea discontinua). De forma análoga, los ratones MAID7225 Humln TMRPSS4 expuestos con A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2) (triángulos de color gris oscuro, línea discontinua) mostraron tasas de supervivencia similares en comparación con los ratones de tipo silvestre (triángulos invertidos de color gris claro, línea discontinua). Los ratones se infectaron IN el día 0 con 1150 UFP de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) o 10.000 UFP de A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2). El grupo de control incluía ratones MAID7225 Humln TMPRSS4 no infectado como control negativo y ratones de tipo silvestre (rombos negros, línea continua).
Descripción detallada de determinadas realizaciones
La presente invención se refiere a roedores genéticamente modificados (por ejemplo, ratones y ratas) que tienen un gen humanizado que codifica una serina proteasa transmembrana de tipo II (o "Tmprss", para proteasa/serina transmembrana). Los roedores genéticamente modificados son adecuados para su uso en la exploración de compuestos candidatos que se dirigen específicamente a una molécula de TMPRSS humana para el tratamiento y la prevención de enfermedades tales como la infección por el virus de la gripe. Por consiguiente, la presente invención proporciona roedores genéticamente modificados que tienen un gen Tmprss humanizado, células y tejidos aislados de roedores genéticamente modificados, métodos y composiciones para producir roedores genéticamente modificados y el uso de roedores genéticamente modificados para explorar y probar compuestos terapéuticos. Las diversas realizaciones de la presente invención se describen con más detalle a continuación.
Serina proteasas transmembrana de tipo II ("Tmprss")
Las serina proteasas transmembrana de tipo II, también denominadas en el presente documento "Tmprss" para moléculas no humanas o "TMPRSS" para moléculas humanas ("proteasa/serina transmembrana"), son una familia de proteínas caracterizadas por un dominio transmembrana aminoterminal y un dominio serina proteasa extracelular carboxiterminal. Se han identificado al menos 18 miembros en la familia, que se agrupan en cuatro subfamilias (Bugge et al. (2009), supra). Todos los miembros comparten varias características estructurales comunes que definen a la familia, incluyendo (i) un dominio citoplasmático aminoterminal corto, (ii) un dominio transmembrana y (iii) un ectodominio que contiene un dominio proteasa y una región tallo que une el dominio transmembrana con el dominio proteasa. La región tallo contiene una combinación de dominios estructurales modulares de seis tipos diferentes: un dominio SEA (proteína/enteropeptidasa/agrina de esperma de erizo de mar), un dominio receptor eliminador del grupo A, un dominio LDLA (receptor de lipoproteínas de baja densidad de clase A), un dominio CUB (factor de crecimiento embrionario de erizo Cls/Clr, proteína morfogenética ósea 1), un dominio MAM (meprina/antígeno A5/proteína receptora fosfatasa mu) y un dominio frizzled. Véase la revisión de Bugge et al. (2009), supra. Por ejemplo, TMPRSS2 y TMPRSS4, pertenecen ambas a la subfamilia hepsina/TMPRSS, tienen un dominio receptor eliminador del grupo A, precedido por un solo dominio LDLA en la región tallo. TMPRSS11D, también conocida como "HAT" para la proteasa similar a tripsina de las vías respiratorias humanas que pertenece a la subfamilia HAT/DESC, tiene un único dominio SEA. Véase la figura 1 de Bugge et al. (2009), supra.
Las serina proteasas transmembrana de tipo II se producen inicialmente como proenzimas inactivas que requieren activación por escisión después de un resto de aminoácido básico en un motivo de activación consenso que precede al dominio proteasa. Algunas de las proteasas activadas permanecen unidas a la membrana como resultado de un enlace disulfuro entre el prodominio y el dominio proteasa. Los dominios extracelulares se consideran cruciales para la localización celular, activación, inhibición y/o especificidad de sustrato de estas proteasas (Bugge et al. (2009), supra; Szabo et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 40: 1297-1316 (2008)).
Se ha documentado diversa información bioquímica y fisiopatológica para miembros de las serina proteasas transmembrana de tipo II. Se han mostrado que TMPRSS2, TMPRSS4 y TMPRSS11D escinden la hemaglutinina de la gripe A (HA) in vitro, que es la primera etapa esencial en el ciclo de vida vírico. Animales roedores genéticamente modificados que tienen un gen Tmprss humanizado divulgado en el presente documento proporcionan sistemas in vivo que permiten una comprensión profunda de las funciones biológicas de las moléculas TMPRSS, así como la exploración de compuestos terapéuticos que se dirigen específicamente a moléculas de TMPRSS humanas.
En la presente solicitud se proporcionan secuencias T mprss ilustrativas, incluyendo secuencias de los ácidos nucleicos y proteínas de Tmprss de ratón, humanas y humanizadas y se resumen en la siguiente tabla. También se incluyen en la tabla secuencias de cebadores y sondas utilizados en los ensayos descritos en la sección de ejemplos, y secuencias de unión de inserción de alelos Tmprss humanizados ilustrativos.
Descripción resumida de secuencias
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continuación
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continuación
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Animales Roedores con Tmprss humanizado
En un aspecto, la presente invención proporciona animales roedores que contienen en la línea germinal un gen Tmprss humanizado que codifica una proteína Tmprss humanizada. En particular, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un gen Tmprss humanizado, en donde el gen Tmprss humanizado
comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín,
se encuentra en un locus Tmprss de roedor endógeno, y es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica del gen Tmprss de roedor endógeno con dicha secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín y está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor endógeno, y
- codifica una proteína Tmprss humanizada que comprende: (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína T mprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
El término "humanizado/a", cuando se utiliza en el contexto de ácidos nucleicos o proteínas, se refiere a ácidos nucleicos o proteínas cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleótidos o aminoácidos) incluyen porciones que corresponden sustancial o idénticamente a las estructuras de un gen o proteína particular que se encuentra en la naturaleza en un animal roedor, y también incluyen porciones que difieren de las encontradas en el gen o proteína de roedor relevante y en cambio corresponden de manera más cercana o idéntica a estructuras encontradas en un gen o proteína humanos correspondiente. Un roedor que contiene un gen humanizado o que expresa una proteína humanizada es un roedor "humanizado".
En algunas realizaciones, un roedor de la presente invención se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster. En algunas realizaciones, un roedor de la presente invención se selecciona de la superfamilia Muroidea. En algunas realizaciones, un roedor genéticamente modificado de la presente invención es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratones), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del nuevo mundo, campañoles), Muridae (ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirón espinoso), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas del bambú, y zokores). En algunas realizaciones determinadas, un roedor genéticamente modificado de la presente invención se selecciona de un auténtico ratón o rata (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso y una rata con cresta. En algunas realizaciones determinadas, un ratón genéticamente modificado de la presente invención es de un miembro de la familia Muridae.
En algunas realizaciones, el roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss humanizado en el genoma que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano, en donde la secuencia de nucleótidos del gen Tmprss de roedor endógeno y la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano están operativamente unidos entre sí de modo que el gen Tmprss humanizado codifica una proteína Tmprss y está bajo el control de un o unos elementos 5' reguladores, tal como el o los promotores y/o potenciadores, del gen Tmprss de roedor endógeno.
La presente invención se refiere particularmente a la humanización similar; en otras palabras, una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín para formar un gen humanizado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano para formar un gen Tmprss2 humanizado. En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano para formar un gen Tmprss4 humanizado. En otras realizaciones más, una secuencia de nucleótidos de un gen Tm prsslld de roedor endógeno se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano para formar un gen Tm prsslld humanizado.
En algunas realizaciones, un roedor genéticamente modificado de la presente invención contiene un gen Tmprss humanizado en su genoma, en donde el gen Tmprss humanizado codifica una proteína Tmprss humanizada que contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS humana. El término "ectodominio" se refiere a la porción de una proteína transmembrana que se extiende fuera de la membrana celular, es decir, la porción extracelular de una proteína transmembrana. El ectodominio de una molécula de TMPRSS incluye un dominio proteasa y una región de tallo que une el dominio transmembrana con el dominio proteasa. Por un ectodominio o polipéptido que es "sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS humana", se entiende en algunas realizaciones, un polipéptido que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia al ectodominio de una proteína TMPRSS humana; en algunas realizaciones, un polipéptido que difiere del ectodominio de una proteína TMPRSS humana en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; en algunas realizaciones, un polipéptido que difiere del ectodominio de una proteína TMPRSS humana solamente en el extremo N o C del ectodominio, por ejemplo, al carecer de aminoácidos o al tener aminoácidos adicionales en el extremo N o C del ectodominio; y en algunas realizaciones, un polipéptido que es sustancialmente el ectodominio de una proteína TMPRSS humana. Por "sustancialmente el ectodominio" de una proteína TMPRSS humana, se entiende un polipéptido que es idéntico al ectodominio, o difiere del ectodominio al carecer de 1-5 (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5) aminoácidos o al tener 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo N o C.
En algunas realizaciones, el gen Tmprss humanizado codifica una proteína Tmprss humanizada que además contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena. Por una porción o polipéptido citoplasmáticos y transmembrana que es "sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína T mprss de roedor endógena", se entiende en algunas realizaciones, un polipéptido que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena; en algunas realizaciones, un polipéptido que difiere de la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; en algunas realizaciones, un polipéptido que difiere de la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena solamente en el extremo C, por ejemplo, al carecer de aminoácidos o al tener aminoácidos adicionales en el extremo C del dominio transmembrana; y en algunas realizaciones, un polipéptido compuesto por el dominio citoplasmático y sustancialmente el dominio transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena. Por "sustancialmente el dominio transmembrana" de una proteína Tmprss de roedor endógena, se entiende un polipéptido que es idéntico al dominio transmembrana, o se diferencia del dominio transmembrana al carecer de 1-5 aminoácidos o al tener 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo C.
El gen Tmprss humanizado en el genoma de un roedor genéticamente modificado incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín codifica un polipéptido sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín en un gen Tmprss humanizado codifica el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano.
En algunas realizaciones, el gen Tmprss humanizado en el genoma de un roedor genéticamente modificado incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, en donde la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno codifica un polipéptido sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno presente en un gen Tmprss humanizado codifica los dominios citoplasmático y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
Un gen Tmprss humanizado en la invención da como resultado una sustitución de una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno en un locus Tmprss de roedor endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss de roedor en un locus Tmprss de roedor endógeno se ha sustituido por una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano afín para formar un gen Tmprss humanizado.
En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano insertado en un gen Tmprss de roedor endógeno incluye exones, en su totalidad o en parte, de un gen TMPRSS humano, que codifican un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano.
En determinadas realizaciones, la secuencia genómica de un gen Tmprss de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss de roedor endógeno después de la sustitución de humanización y está operativamente unido a la secuencia genómica de TMPRSS humano contigua codifica una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
En circunstancias en las que una proteína Tmprss endógena y una proteína TMPRSS humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión entre el dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario insertar una secuencia genómica de TMPRSS humano que codifique precisamente el ectodominio de la proteína TMPRSS humana. Es posible insertar una secuencia genómica ligeramente más larga o más corta de un gen TMPRSS humano, que codifica sustancialmente el ectodominio de la proteína TMPRSS humana, en unión operativa a una secuencia genómica de un gen Tmprss de roedor endógeno que codifica el dominio citoplasmático y sustancialmente el dominio transmembrana de la proteína T mprss de roedor endógena, de manera que la proteína T mprss humanizada codificada por el gen Tmprss humanizado resultante incluye un ectodominio que es idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS humana y un dominio transmembrana que es idéntico al dominio transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano incluido en un gen Tmprss humanizado también incluye la región 3' no traducida ("UTR") del gen TMPRSS humano. En determinadas realizaciones, además de la 3' UTR de un gen TMPRSS humano, un gen Tmprss humanizado también incluye una secuencia genómica humana adicional del locus del gen TMPRSS humano, después de la 3' UTR de TMPRSS. La secuencia genómica humana adicional puede consistir en al menos 10-200 pb, por ejemplo, 50 pb, 75 pb, 100 pb, 125 pb, 150 pb, 175 pb, 200 pb o más, encontradas en locus del gen TMPRSS humano inmediatamente cadena abajo de la 3' UTR del gen TMPRSS humano. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano presente en un gen Tmprss humanizado no incluye una 3' UTR humana; en cambio, se incluye la 3' UTR de un gen Tmprss de roedor endógeno y sigue inmediatamente al codón de parada del gen Tmprss humanizado. Por ejemplo, un gen Tmprss humanizado puede incluir una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno que contiene secuencias de exones que codifican los dominios citoplasmático y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena, seguida de una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano que contiene secuencias de exones que codifican el ectodominio a través del codón de parada de la proteína TMPRSS humana, siguiendo la 3' UTR del gen Tmprss de roedor endógeno inmediatamente después del codón de parada.
En algunas realizaciones, un gen Tmprss humanizado da como resultado una expresión de la proteína Tmprss humanizada codificada en un roedor. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss humanizada se expresa en un patrón comparable con, o sustancialmente el mismo que, una proteína Tmprss de roedor homóloga en un roedor de control (por ejemplo, un roedor sin el gen Tmprss humanizado). En algunas realizaciones, una proteína Tmprss humanizada se expresa a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss de roedor homóloga en un roedor de control (por ejemplo, un roedor sin el gen Tmprss humanizado). En determinadas realizaciones, se expresa y detecta una proteína Tmprss humanizada en la superficie celular. En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss humanizada o una forma soluble (por ejemplo, una forma secretada de ectodominio) se expresa y detecta en el suero de un roedor, por ejemplo, a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss de roedor homóloga o una forma soluble de la misma en un roedor de control. En el contexto de comparar un gen o proteína humanizados en un roedor humanizado con un gen o proteína de roedor endógeno en un roedor de control, el término "comparable" significa que las moléculas o niveles que se comparan pueden no ser idénticos entre sí, pero son suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos, de modo que se puedan extraer conclusiones razonablemente en función de las diferencias o similitudes observadas; y la expresión "sustancialmente el mismo" al referirse a los niveles de expresión significa que los niveles que se comparan no son diferentes entre sí en más de un 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 %.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona además una célula o tejido aislados de un animal roedor como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula se selecciona de una célula dendrítica, linfocito (p. ej., un linfocito B o T), macrófago y monocito. En algunas realizaciones, un tejido se selecciona de adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, óvulo y una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss humanizado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón. En otras realizaciones, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de rata. Una célula madre embrionaria de roedor que contiene un gen Tmprss humanizado en su genoma se puede utilizar para producir un animal roedor humanizado, como se describe adicionalmente en el presente documento a continuación.
En algunas realizaciones, un roedor proporcionado en el presente documento es heterocigoto para un gen Tmprss humanizado en su genoma. En otras realizaciones, un roedor proporcionado en el presente documento es homocigoto para un gen Tmprss humanizado en su genoma.
En determinadas realizaciones, un roedor incluye múltiples, es decir, dos o más, genes Tmprss humanizados en su genoma. En otras palabras, se han humanizado dos o más locus Tmprss endógenos diferentes en un roedor utilizando secuencias de nucleótidos de genes TMPRSS humanos afines. Por ejemplo, se ha humanizado un roedor en dos o más de los loci de genes seleccionados de: Tmprss2, Tmprss4, y Tmprsslld.
Se describen con más detalle a continuación roedores (tal como ratones) con Tmprss2 humanizado, roedores (tal como ratones) con Tmprss4 humanizado y roedores (tal como ratones) con Tm prsslld humanizado ilustrativos.
Roedores con Tmprss2 humanizado
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss2 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano, y que está bajo el control de un o unos elementos 5' reguladores, tal como el o los promotores y/o potenciadores, del gen Tmprss2 de roedor endógeno. Ejemplos de roedores incluyen ratones y ratas.
En algunas realizaciones, un gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS2 humana.
En realizaciones específicas, la proteína TMPRSS2 humana tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada contiene los 387 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS2 humana, por ejemplo, los aminoácidos 106 a 492 de una proteína TMPRSS2 humana. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta de W106 a G492 de la SEQ ID NO: 4. En realizaciones específicas, una proteína Tmprss2 humanizada contiene un ectodominio que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos compuesta de W106 a G492 de la SEQ ID NO: 4; un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de W106 a G492 de la SEQ ID NO: 4 en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; o un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de W106 a G492 de la SEQ ID NO: 4 solamente en el extremo N o C del ectodominio, por ejemplo, que carece de 1-5 aminoácidos o que tiene 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo N o C.
Una proteína Tmprss2 humanizada contiene además una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss2 de roedor endógena. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada incluye además el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína Tmprss2 de roedor endógena.
Una proteína Tmprss2 humanizada contiene el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína T mprss2 de roedor endógena y el ectodominio de una proteína TMPRSS2 humana. En realizaciones particulares, un gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.
Un gen Tmprss2 humanizado es el resultado de una sustitución de una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno en un locus Tmprss2 de roedor endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss2 de roedor endógeno en un locus Tmprss2 de roedor endógeno se ha sustituido por una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano para formar un gen Tmprss2 humanizado.
En realizaciones específicas, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano insertado en un gen Tmprss2 de roedor endógeno incluye secuencias de exones, es decir, exones en su totalidad o en parte, de un gen TMPRSS2 humano, que codifican un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por el gen TMPRSS2 humano. En circunstancias en las que una proteína Tmprss2 endógena y una proteína TMPRSS2 humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario insertar una secuencia genómica de TMPRSS2 humano que codifique precisamente el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana, y es posible utilizar una secuencia genómica de TMPRSS2 humano ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el ectodominio de una proteína TMPRSS2 humana para producir una proteína Tmprss2 humanizada que tiene un ectodominio que es idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana.
En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que se está insertando en un gen Tmprss2 de roedor endógeno contiene al menos el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano.
En determinadas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que se está insertando en un gen Tmprss2 de roedor endógeno contiene el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones particulares, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que se está insertando en un gen Tmprss 2 de roedor endógeno contiene una porción 3' del exón 3 codificante, el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones específicas, la porción 3' del exón 3 codificante de un gen TMPRSS2 humano incluido en la humanización tiene una longitud de aproximadamente 5-10 pares de bases, es decir, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pares de bases del extremo 3' del exón 3 codificante.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que se está insertando en un gen Tmprss2 de roedor endógeno también contiene la 3' UTR del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones específicas, todo el exón 13 codificante de un gen TMPRSS2 humano está incluido en la secuencia genómica de TMPRSS2 contigua para la humanización, que incluye la 3' UTR del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones particulares, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano incluye una secuencia genómica humana adicional cadena abajo de la 3' UTR del gen TMPRSS2 humano. La secuencia genómica humana adicional puede ser una secuencia de al menos 10-200 pb, o al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 pb, que se encuentra inmediatamente cadena abajo del 3' UTR del gen TMPRSS2 humano en un locus TMPRSS2 humano.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss2 humanizado codifica un polipéptido que es sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena. En circunstancias en las que una proteína Tmprss2 endógena y una proteína TMPRSS2 humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario mantener la secuencia genómica de Tmprss2 de roedor endógeno que codifique precisamente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena, y es posible mantener una secuencia genómica de Tmprss2 de roedor ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena en la sustitución de humanización para codificar una proteína Tmprss2 humanizada que tiene un dominio transmembrana que es idéntico al dominio transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss2 humanizado incluye los exones 1-2 y una porción 5' del exón 3 codificante de un gen Tmprss2 de roedor endógeno, en donde la porción 5' del exón 3 codificante es una porción sustancial del exón 3 codificante, por ejemplo, todo el exón 3 codificante excepto 5­ 10 pares de bases en el extremo 3' del exón 3 codificante.
En realizaciones específicas, un gen Tmprss2 humanizado contiene los exones 1-2 codificantes y una porción 5' del exón 3 codificante de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una porción 3' del exón 3 codificante y del exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante de un gen TMPRSS2 humano, en donde el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína T mprss2 humanizada que contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor, y un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana. En determinadas realizaciones, el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que contiene el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana de la proteína T mprss2 de roedor codificada por un gen Tmprss2 de roedor endógeno y el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por un gen TMPRSS2 humano. En realizaciones particulares, un gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, los exones e intrones de un gen TMPRSS2 humano y un gen Tmprss2 de roedor utilizados en la humanización son los que se encuentran en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5-6.
En algunas realizaciones, un gen Tmprss2 humanizado da como resultado una expresión de la proteína Tmprss2 humanizada codificada en un roedor. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada se expresa en un patrón comparable con, o sustancialmente el mismo que, una proteína Tmprss2 de roedor homóloga en un roedor de control (por ejemplo, un roedor sin el gen Tmprss2 humanizado). En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada se expresa a un nivel comparable con, o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss2 de roedor homóloga en un roedor de control (por ejemplo, un roedor sin el gen Tmprss2 humanizado). En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada se expresa y detecta en la superficie celular. En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada o una forma soluble (por ejemplo, una forma secretada de ectodominio) se expresa y detecta en el suero de un roedor, por ejemplo, a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss2 de roedor homóloga o una forma soluble de la misma en un roedor de control.
Roedores con Tmprss4 humanizado
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss4 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano, y que está bajo el control de un o unos elementos 5' reguladores, tal como el o los promotores y/o un o unos potenciadores, del gen Tmprss4 de roedor endógeno. Ejemplos de roedores incluyen ratones y ratas.
Un gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS4 humana. En realizaciones específicas, la proteína TMPRSS4 humana tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada contiene los 384 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS4 humana, por ejemplo, los aminoácidos 54 a 437 de una proteína TMPRSS4 humana. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta de K54 a L437 de la SEQ ID NO: 11. En realizaciones específicas, una proteína Tmprss4 humanizada contiene un ectodominio que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos compuesta de K54 a L437 de la SEQ ID NO: 11; un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de K54 a L437 de la SEQ ID NO: 11 en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; o un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de K54 a L437 de la SEQ ID NO: 11 solamente en el extremo N o C del ectodominio, por ejemplo, que carece de 1-5 aminoácidos o que tiene 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo N o C.
Una proteína Tmprss4 humanizada contiene además una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss4 de roedor endógena. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada incluye además el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína Tmprss4 de roedor endógena.
Una proteína Tmprss4 humanizada contiene el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína Tmprss4 de roedor endógena y el ectodominio de una proteína TMPRSS4 humana. En realizaciones particulares, un gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14.
Un gen Tmprss4 humanizado es el resultado de una sustitución de una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno en un locus Tmprss4 de roedor endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss4 de roedor endógeno en un locus Tmprss4 de roedor endógeno se ha sustituido por una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano para formar un gen Tmprss4 humanizado.
En realizaciones específicas, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano insertado en un gen Tmprss4 de roedor endógeno incluye secuencias de exones, es decir, exones en su totalidad o en parte, de un gen TMPRSS4 humano que codifica un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana codificada por el gen TMPRSS4 humano. En circunstancias en las que una proteína Tmprss4 endógena y una proteína TMPRSS4 humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario insertar una secuencia genómica de TMPRSS4 humano que codifique precisamente el ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana, y es posible utilizar una secuencia genómica de TMPRSS4 humano ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el ectodominio de una proteína TMPRSS4 humana para producir una proteína Tmprss4 humanizada que tiene un ectodominio que es idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana.
En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano que se está insertando en un gen Tmprss4 de roedor endógeno contiene al menos el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS4 humano.
En determinadas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano que se está insertando en un gen Tmprss4 de roedor endógeno incluye una porción 3' del intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano. En realizaciones específicas, la porción 3' del intrón 3 de un gen TMPRSS4 humano incluido en la humanización tiene una longitud de aproximadamente 140­ 160 pares de bases, es decir, aproximadamente 140, 145, 150, 155, 160 pares de bases del extremo 3' del intrón 3.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano que se está insertando en un gen Tmprss4 de roedor endógeno contiene la 3' UTR del gen TMPRSS4 humano. En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano que se está insertando en un gen Tmprss4 de roedor endógeno no contiene la 3' UTR del gen TMPRSS4 humano, y la 3' UTR del gen Tmprss4 de roedor endógeno sigue inmediatamente después del codón de parada en el gen Tmprss4 humanizado.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss4 humanizado codifica un polipéptido que es sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor endógena. En circunstancias en las que una proteína Tmprss4 endógena y una proteína TMPRSS4 humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario mantener la secuencia genómica de Tmprss4 de roedor endógeno que codifique precisamente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor endógena, y es posible mantener una secuencia genómica de Tmprss4 de roedor ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor endógena en la sustitución de humanización para codificar una proteína Tmprss4 humanizada que tiene un dominio transmembrana que es idéntico al dominio transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor endógena.
En realizaciones específicas, un gen Tmprss4 humanizado contiene los exones 1-3 codificantes de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el codón de parada del exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano. En realizaciones particulares, un gen Tmprss4 humanizado contiene los exones 1-3 codificantes y una porción 5' del intrón 3 de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y una porción 3' del intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada del exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano. En determinadas realizaciones, el gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que contiene el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor codificada por un gen Tmprss4 de roedor endógeno y el ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana codificada por un gen TMPRSS4 humano. En realizaciones particulares, un gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, los exones e intrones de un gen TMPRSS4 humano y un gen Tmprss4 de roedor utilizados en la humanización son los que se encuentran en las SEQ ID NO: 8, 10 y 12-13.
En algunas realizaciones, un gen Tmprss4 humanizado da como resultado una expresión de la proteína Tmprss4 humanizada codificada en un roedor. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada se expresa en un patrón comparable con, o sustancialmente el mismo que, una proteína Tmprss4 de roedor homóloga en un roedor de control (p. ej., un roedor sin el gen Tmprss4 humanizado que codifica la proteína Tmprss4 humanizada). En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada se expresa a un nivel comparable con, o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss4 de roedor homóloga en un roedor de control (p. ej., un roedor sin el gen Tmprss4 humanizado que codifica la proteína Tmprss4 humanizada). En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada se expresa y detecta en la superficie celular. En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada o una forma soluble (por ejemplo, una forma secretada de ectodominio) se expresa y detecta en el suero de un roedor, por ejemplo, a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss4 de roedor homóloga o una forma soluble de la misma en un roedor de control.
Roedores con Tmprsslldhumanizado
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma contiene un gen Tm prsslld humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tm prsslld de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano, y que está bajo el control de un o unos elementos 5' reguladores, tal como el promotor y/o el o los potenciadores del gen Tmprss11d de roedor endógeno. Ejemplos de roedores incluyen ratones y ratas.
Un gen Tmprss11d humanizado codifica una proteína Tmprss11d humanizada que contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS11D humana.
En realizaciones específicas, la proteína TMPRSS11D humana tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada contiene los 377 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS11D humana, por ejemplo, los aminoácidos 42 a 418 de una proteína TMPRSS11D humana. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta de A42 a I418 de la SEQ ID NO: 18. En realizaciones específicas, una proteína Tmprss11d humanizada contiene un ectodominio que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos compuesta de A42 a I418 de la SEQ ID NO: 18; un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de A42 a I418 de la SEQ ID NO: 18 en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; o un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de A42 a I418 de la SEQ ID NO: 18 solamente en el extremo N o C, por ejemplo, al carecer de 1-5 aminoácidos o al tener 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo N o C.
Una proteína Tmprss11d humanizada contiene además una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss11d de roedor endógena. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada incluye el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína T mprss11d de roedor endógena.
En realizaciones específicas, una proteína Tmprss11d humanizada contiene el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína Tmprss11d de roedor endógena y el ectodominio de una proteína TMPRSS11D humana. En realizaciones particulares, un gen Tmprss11d humanizado codifica una proteína Tmprss11 d humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21.
Un gen Tmprss11d humanizado es el resultado de una sustitución de una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss11d de roedor endógeno en un locus Tmprss11d de roedor endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss11d de roedor endógeno en un locus Tmprss11d de roedor endógeno se ha sustituido por una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano para formar un gen Tmprss11d humanizado. En realizaciones específicas, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano insertado en un gen Tmprss11d de roedor endógeno incluye secuencias de exones, es decir, exones en su totalidad o en parte, de un gen TMPRSS11D humano que codifica un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana codificada por el gen TMPRSS11D humano. En circunstancias en las que una proteína Tmprss11d endógena y una proteína TMPRSS11D humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario insertar una secuencia genómica de TMPRSS11D humano que codifique precisamente el ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana, y es posible utilizar una secuencia genómica de TMPRSS11D humano ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el ectodominio de una proteína TMPRSS11D humana para producir una proteína Tmprss11d humanizada que tiene un ectodominio que es idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana.
En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano que se está insertando en un gen Tmprss11d de roedor endógeno contiene al menos el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante de un gen TMPRSS11D humano.
En determinadas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano que se está insertando en un gen Tmprss11d de roedor endógeno contiene, al menos, una porción 3' del intrón 2 y el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante del gen TMPRSS11D humano. En realizaciones específicas, la porción 3' del intrón 2 de un gen TMPRSS2 humano incluido en la humanización tiene una longitud de aproximadamente 444 pares de bases.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano que se está insertando en un gen Tmprss11d de roedor endógeno contiene la 3' UTR del gen TMPRSS11D humano. En realizaciones específicas, todo el exón 10 codificante de un gen TMPRSS11D humano está incluido en la secuencia genómica de TMPRSS11D contigua para la humanización, que incluye la 3' UTR de un gen TMPRSS11D humano. En realizaciones particulares, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano incluye una secuencia genómica humana adicional cadena abajo de la 3' UTR del gen TMPRSS11D humano. La secuencia genómica humana adicional puede ser una secuencia de 10-200 pb, 50-200 pb, o aproximadamente 150, 160, 170, 180 pb, que se encuentra inmediatamente cadena abajo del 3' UTR del gen TMPRSS11D humano en un locus TMPRSS11D humano.
La secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss11d de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss11d humanizado codifica un polipéptido que es sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss11 d de roedor endógena codificada por el gen Tmprss11d de roedor endógeno. En circunstancias en las que una proteína Tmprss11d endógena y una proteína TMPRSS11D humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario mantener la secuencia genómica de Tmprss11d de roedor endógeno que codifique precisamente el dominio transmembrana de la proteína T mprss11d de roedor endógena, y es posible mantener una secuencia genómica de Tmprss11d de roedor ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss11d de roedor endógena en la sustitución de humanización para codificar una proteína T mprss11 d humanizada que tiene un dominio transmembrana que es idéntico al dominio transmembrana de la proteína T mprss11d de roedor endógena.
En realizaciones específicas, un gen Tmprss11d humanizado contiene los exones 1-2 codificantes de un gen Tmprss11d de roedor endógeno y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante de un gen TMPRSS11D humano. En determinadas realizaciones, el gen Tmprss11d humanizado codifica una proteína Tmprss11d humanizada que contiene el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana de la proteína Tmprss11d de roedor codificada por un gen Tmprss11d de roedor endógeno y el ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana codificada por un gen TMPRSS11D humano. En realizaciones particulares, un gen Tmprss11d humanizado codifica una proteína Tmprss11d humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21.
En algunas realizaciones, los exones e intrones de un gen TMPRSS11D humano y un gen Tmprss11d de roedor utilizados en la humanización son los que se encuentran en las SEQ ID NO: 15, 17 y 19-20.
En algunas realizaciones, un gen Tmprs11D humanizado da como resultado una expresión de la proteína Tmprs11d humanizada codificada en un roedor. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada se expresa en un patrón comparable con, o sustancialmente el mismo que, una proteína Tmprss11d de roedor homóloga en un roedor de control (p. ej., un roedor sin el gen Tmprss11d humanizado que codifica la proteína Tmprss11d humanizada). En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada se expresa a un nivel comparable con, o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss11d de roedor homóloga en un roedor de control (p. ej., un roedor sin el gen Tmprss11d humanizado que codifica la proteína Tmprss11 d humanizada). En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada se expresa y detecta en la superficie celular. En determinadas realizaciones, una proteína T mprss11d humanizada o una forma soluble (por ejemplo, una forma secretada de ectodominio) se expresa y detecta en el suero de un roedor, por ejemplo, a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína T mprss11d de roedor homóloga o una forma soluble de la misma en un roedor de control.
Métodos para producir animales roedores con Tmprss humanizados
Otros aspectos de esta divulgación se refieren a métodos para producir un roedor con Tmprss humanizado descrito anteriormente, así como vectores de ácido nucleico y células madre embrionarias no humanas adecuadas para su uso en la producción de un roedor con Tmprss humanizado. En particular, la presente invención también proporciona un método para producir un roedor que tenga un gen Tmprss humanizado, que comprende:
(a) insertar un fragmento genómico en un locus Tmprss de roedor endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, comprendiendo dicho fragmento genómico una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, formando, de este modo, un gen Tmprss humanizado,
en donde el gen Tmprss humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor en el locus Tmprss de roedor endógeno y codifica una proteína T mprss humanizada, y
en donde la proteína Tmprss humanizada comprende (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor codificada por el gen Tmprss de roedor en dicho locus Tmprss de roedor endógeno;
(b) obtener una célula madre embrionaria de roedor que comprende el gen Tmprss humanizado de (a); y, (c) crear un roedor utilizando la célula madre embrionaria de roedor de (b).
Los roedores proporcionados en el presente documento se pueden producir utilizando métodos conocidos en la técnica. En realizaciones ilustrativas, un clon de un cromosoma artificial bacteriano (BAC, por sus siglas en inglés) que lleva un gen Tmprss de roedor puede modificarse utilizando recombinación bacteriana homóloga y tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, el documento US 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659). Como resultado, se ha eliminado una secuencia de nucleótidos de Tmprss de roedor del clon BAC original y se ha insertado una secuencia de nucleótidos de Tmprss humano, dando como resultado un clon BAC modificado que lleva un gen Tmprss humanizado, flanqueado por brazos de homología 5' y 3' de roedor. El clon BAC modificado, una vez linealizado, se puede introducir en células madre embrionarias de roedor (ES, por sus siglas en inglés) mediante, por ejemplo, electroporación. En la técnica se han descrito tanto células ES de ratón como células ES de rata. Véanse, por, ejemplo, los documentos US 7.576.259, US 7.659.442, US 7.294.754 y US 2008-0078000 A1 describen células ES de ratón y el método VELOCIMOUSE® para producir un ratón genéticamente modificado; los documentos US 2014/0235933 A1, US 2014/0310828 A1, Tong et al. (2010) Nature 467:211-215 y Tong et al. (2011) Nat Protoc. 6(6): doi: 10.1038/nprot.2011.338 describen células ES de rata y métodos para producir una rata genéticamente modificada.
Se pueden seleccionar células ES que tienen un gen Tmprss humanizado integrado en el genoma. En algunas realizaciones, las células ES que tienen un Tmprss humanizado integrado en un locus Tmprss de roedor endógeno se pueden seleccionar basándose en ensayos de pérdida de alelos de roedor y/o ganancia de alelos humanos. Las células ES seleccionadas se utilizan después como células ES donantes para inyección en un embrión en etapa previa a la mórula (p. ej., embrión en etapa de 8 células) mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, los documentos US 7.576.259, US 7.659.442, US 7.294.754 y US 2008-0078000 A1), o los métodos descritos en los documentos US 2014/0235933 A1 y US 2014/0310828 A1. El embrión que comprende las células ES donantes se incuba hasta la etapa de blastocisto y luego se implanta en una madre sustituta para producir un roedor F0 totalmente derivado de las células Es donantes. Las crías de roedores que llevan el gen Tmprss humanizado pueden identificarse mediante genotipificación del ADN aislado de cortes de la cola utilizando ensayos de pérdida de alelos de roedor y/o ganancia de alelos humanos.
Se pueden cruzar roedores heterocigotos para un gen Tmprss humanizado con roedores homocigotos generados. Se pueden cruzar roedores que contienen un gen Tmprss humanizado con roedores que contienen otro gen Tmprss humanizado para hacer producir roedores que contienen múltiples genes Tmprss humanizados. Por ejemplo, se pueden cruzar roedores que contienen un gen Tmprss2 humanizado con roedores que contienen un gen Tmprss4 humanizado para producir roedores que contienen un gen Tmprss2 humanizado y un gen Tmprss4 humanizado.
Métodos que emplean roedores que tienen genes Tmprss humanizados
Los roedores divulgados en el presente documento proporcionan un sistema in vivo útil y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que expresan proteínas Tmprss humanizadas para identificar y probar compuestos que se dirigen específicamente a proteínas TMPRSS humanas.
En un aspecto, un roedor divulgado en el presente documento se usa para determinar la capacidad de un compuesto candidato, tal como un inhibidor de una proteína TMPRSS humana, para tratar y/o prevenir la infección por el virus de la gripe. En particular, la presente invención proporciona un método para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto en el tratamiento de una infección por el virus de la gripe A, que comprende:
proporcionar un roedor de la presente invención;
administrar un virus de la gripe A y un compuesto candidato al roedor, en donde opcionalmente el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana; y
monitorizar la presencia y la gravedad de la infección por el virus de la gripe A en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del compuesto candidato.
En algunas realizaciones, un roedor que contiene un gen Tmprss humanizado y que expresa una proteína Tmprss humanizada divulgada en el presente documento se administra con un compuesto candidato antes de la infección experimental con el virus de la gripe. La eficacia profiláctica del compuesto se puede evaluar determinando si el roedor presenta menos síntomas y/o síntomas menos graves de infección por el virus de la gripe y/o una viabilidad mejorada, en comparación con el o los roedores de control.
En otras realizaciones, un roedor que contiene un gen Tmprss humanizado y que expresa una proteína Tmprss humanizada que comprende el ectodominio de una proteína TMPRSS humana se administra con un inhibidor candidato de esa proteína TMPRSS humana después de la infección experimental con el virus de la gripe. La eficacia profiláctica del inhibidor candidato se puede evaluar determinando si el roedor presenta menos síntomas y/o síntomas menos graves de infección por el virus de la gripe y/o una viabilidad mejorada, en comparación con el o los roedores de control.
Los roedores de control adecuados incluyen, por ejemplo, roedores que contienen un gen Tmprss humanizado sin estar sometidos a la infección experimental; y roedores que contienen un gen Tmprss humanizado sometidos a la infección experimental sin ningún compuesto; y roedores que contienen un gen Tmprss humanizado sometidos a la infección experimental y un compuesto que se sabe que es terapéuticamente eficaz.
Los compuestos que pueden evaluarse en los métodos de la presente invención incluyen inhibidores de TMPRSS candidatos, por ejemplo, un inhibidor de proteasas de molécula pequeña, un inhibidor basado en ácidos nucleicos (p. ej., ARNip, ribozima, construcción antisentido, etc.), proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo), o un péptido de bloqueo/inhibidor de péptido. Un inhibidor de TMPRSS puede funcionar inhibiendo o reduciendo la capacidad de una proteína TMPRSS de escindir proteolíticamente la proteína precursora de hemaglutinina (HA0) en las subunidades HA1 y HA2.
En algunas realizaciones, un inhibidor candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales son adecuados para los fines de la presente invención. En realizaciones específicas, el anticuerpo se une específicamente a una proteína TMPRSS e inhibe la actividad proteasa de esa proteína TMPRSS y no inhibe sustancialmente la actividad proteasa de otra proteína TMPRSS. Por ejemplo, un inhibidor de anticuerpos anti-TMPRSS2 se une específicamente a una proteína TMPRSS2 e inhibe la actividad proteasa de la proteína TMPRSS2, y no tiene ningún efecto sobre la actividad proteolítica de TMPRSS4 o TMPRSS1 ID, o reduce la actividad proteolítica de TMPRSS4 o TMPRSS1 ID en no más de un 25 % (p. ej., 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, o menos) con respecto a una molécula de control no inhibidora probada en condiciones experimentales idénticas o sustancialmente idénticas.
En algunas realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo anti-TMPRSS2 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo anti-TMPRSS4 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En otras realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo anti-TMPRSS11D o fragmento de unión a antígeno del mismo.
La infección con el virus de la gripe experimental se puede inducir y controlar siguiendo protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, el documento US 2013/0273070 A1. Por ejemplo, los animales roedores se pueden administrar por vía intranasal con el virus de la gripe. Los animales infectados pueden evaluarse para determinar los síntomas y la gravedad de la infección. Por ejemplo, los animales pueden analizarse para determinar(1) cambio de peso y supervivencia, (2) cambios celulares a través de citometría de flujo, (3) inmunoquímica, tinción de PAS y H&E de pulmones completos y (4) niveles de citocinas en suero. Los animales de control que se sabe que son susceptibles al virus presentan un aumento significativo en la frecuencia de células dendríticas, los niveles de macrófagos alveolares positivos para gripe, neutrófilos o células epiteliales en los pulmones y los niveles de IFNy, en comparación con los animales no infectados.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de describir para los expertos en la materia como preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores de la presente invención consideran como su invención. A menos que se indique lo contrario, la temperatura se indica en grados Celsius y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.
Ejemplo 1. Humanización de un gen Tmprss2 endógeno.
Este ejemplo ilustra métodos ilustrativos de humanización de un gen endógeno que codifica Tmprss2 en un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo se pueden emplear para humanizar un gen Tmprss2 endógeno de un roedor utilizando cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias (o fragmentos de secuencias) humanas según se desee.
Un vector de direccionamiento para la humanización de un gen Tmprss2 endógeno se construyó utilizando clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y tecnología VELOCIGENe® (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with highresolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659).
Brevemente, se utilizó el clon bMQ-264A15 de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón que contiene un gen Tmprss2 de ratón y se modificó de la siguiente manera. Se generó un fragmento de ADN para incluir una secuencia de nucleótidos de homología de ratón 5', un ADN genómico de TMPRSS2 humano de aproximadamente 25.091 pb (que contiene los últimos 7 pb del exón 3 codificante, el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el exón 13 (incluida la 3' UTR que forma parte del exón 13 codificante), de un gen TMPRSS2 humano), un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 2.691 pb y una secuencia de homología 3' de ratón. Este fragmento de ADN se utilizó para modificar el clon BAC bMQ-264A15 mediante recombinación homóloga en células bacterianas. Como resultado, un ratón con un fragmento genómico de Tmprss2 de ratón que codifica un ectodominio (de aproximadamente 25.291 pb) en el clon BAC se sustituyó con el fragmento genómico de TMPRSS2 humano de aproximadamente 25.091 pb, seguido de un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 2691 pb. Específicamente, el fragmento genómico de Tmprss2 de ratón que se sustituyó incluía los últimos 7 pb del exón 3 codificante, el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen Tmprss2 de ratón (figuras 1A-1B). El fragmento genómico de TMPRSS2 humano que se insertó incluía los últimos 7 pb del exón 3 codificante, el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante de un gen TMPRSS2 humano (incluida la 3' UTR de TMPRSS2 humano) y una secuencia genómica 3' humana de 131 pb cadena abajo de la 3' UTR de TMPRSS2 humano (figuras 1A-1B). El clon BAC modificado resultante incluía, de 5' a 3', (i) un brazo de homología 5' de ratón que contiene aproximadamente 12 kb de ADN genómico de ratón que incluye la 5' UTR de Tmprss2 de ratón, el exón 1 (no codificante) de Tmprss2 de ratón, los exones 1-3 codificantes (excepto los últimos 7 pb del exón 3 codificante); (ii) un fragmento genómico de TMPRSS2 humano de aproximadamente 25.091 pb que incluye los últimos 7 pb del exón 3 codificante humano, el intrón 3, los exones 4 a 13 codificantes humanos (incluida la 3' UTR de TMPRSS2 humano),y una secuencia genómica 3' humana; (iii) un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 2691 pb, seguido de (iv) un brazo de homología 3' de ratón de 45 kb que contiene la 3' UTR de Tmprss2 de ratón y el ADN genómico de ratón restante en el clon BAC original. Véase las figuras 1A-1B. Las secuencias de unión también se exponen en la parte inferior de la figura 1B. La parte del clon BAC modificado que contiene el fragmento genómico de TMPRSS2 humano y el casete de neomicina, así como las uniones de inserción cadena arriba y cadena abajo, se expone en la SEQ ID NO:5. La secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Tmprss2 humanizado se expone en la SEQ ID NO: 7. Se proporciona una alineación de esta proteína Tmprss2 humanizada ("proteína 7010 mutante"), una proteína Tmprss2 de ratón (SEQ ID NO: 2) y una proteína TMp Rs S2 humana (SEQ iD NO: 4) en la figura 1D.
El clon BAC modificado que contiene el gen Tmprss2 humanizado, como se describe anteriormente, se utilizó para someter a electroporación a células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen Tmprss2 humanizado. Las células ES dirigidas positivamente que contienen un gen Tmprss2 humanizado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia de secuencias de TMPRSS2 humano (p. ej., los exones 4-13 codificantes de TMPRSS2 humano) y confirmó la pérdida y/o conservación de secuencias de Tmprss2 de ratón (p. ej., pérdida de los exones 4-13 codificantes de Tmprss2 de ratón). La tabla 1 muestra los cebadores y las sondas que se utilizaron para confirmar la humanización de un gen Tmprss2 endógeno como se describe anteriormente (figuras 1A-1B). Una vez que se ha seleccionado un clon de células ES correctamente dirigido, el casete de selección de neomicina se puede escindir introduciendo una recombinasa Cre, por ejemplo, a través de electroporación. Como alternativa, el casete de selección de neomicina puede eliminarse cruzando la descendencia generada a partir del clon ES con una cepa de roedor eliminador que expresa una recombinasa Cre. El locus Tmprss2 humanizado después de la eliminación del casete se muestra en la figura 1C, con las secuencias de unión que se muestran en la parte inferior de la figura 1C.
Se utilizaron clones de células ES seleccionados (con o sin el casete) para implantar en ratones hembra utilizando el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.° 7.294.754 y Poueymirou et al., F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de crías que contenía un alelo Tmprss2 humanizado en el genoma. Se pueden confirmar e identificar nuevamente ratones que llevan un alelo Tmprss2 humanizado mediante la genotipificación del ADN aislado de los cortes de la cola utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra) que detecta la presencia de las secuencias del gen TMPRSS2 humano. Las crías se genotipifican y se seleccionan las cohortes de animales heterocigotos para el locus Tmprss2 humanizado para la caracterización. Se producen animales homocigotos para el locus Tmprss2 humanizado cruzando animales heterocigotos.
TABLA 1
Nombre Cebador Secuencia (5'-3') SEQ ID NO
7010U Directo GCCGTGACT GTGACCTTCTC (SEQ ID NO: 26)
Sonda (BHQ) TGGAGGAGCCACCTGATGCCTC (SEQ ID NO: 27)
Inverso GCCTTGCCCTCAATGGAAAC (SEQ ID NO 28)
7010D Directo GGTTGCACAGCAAGGAAGAAG (SEQ ID NO: 29)
Sonda (BHQ) CCAGGAGTTCCTGTGAGCCTACCC (SEQ ID NO: 30)
Inverso TGGAATGGAAGGAGCTGGAG (SEQ ID NO 31)
7010hU Directo GTCCCACCTCCTGCAACTG (SEQ ID NO: 32)
Sonda (BHQ) TGAGCCTTCCCATCAGCCTGGG (SEQ ID NO: 33)
Inverso CCACAATGGCACATGGGTCTG (SEQ ID NO: 34) 7010hTD Directo GGTGCTTGCTCCCCAAGA (SEQ ID NO: 35)
Sonda (BHQ) CCTAAAAGGTGTTGTAATGG (SEQ ID NO: 36)
Inverso GGCAATAAAGAAGGAAGACGTTTT (SEQ ID NO: 37)
Ejemplo 2. Humanización de un gen Tmprss4 endógeno.
Este ejemplo ilustra métodos ilustrativos de humanización de un gen endógeno que codifica Tmprss4 en un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo se pueden emplear para humanizar un gen Tmprss4 endógeno de un roedor utilizando cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias (o fragmentos de secuencias) humanas según se desee.
Un vector de direccionamiento para la humanización de un gen Tmprss4 endógeno se construyó utilizando clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003), supra).
Brevemente, se utilizó el clon RP23-71M15 de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón que contiene un gen Tmprss4 de ratón y se modificó de la siguiente manera. Se generó un fragmento de ADN para incluir una secuencia de nucleótidos de homología de ratón 5', un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4996 pb, un ADN genómico humano de aproximadamente 14.963 pb (que contiene el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano), y una secuencia de homología 3' de ratón. Este fragmento de ADN se utilizó para modificar el clon BAC RP23-71M15 mediante recombinación homóloga en células bacterianas. Como resultado, un fragmento genómico de ratón que codifica un ectodominio (de aproximadamente 11.074 pb) en el clon BAC se sustituyó con un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4.996 pb, seguido del ADN genómico humano de aproximadamente 14.963 pb. Específicamente, el fragmento genómico de ratón que se eliminó y sustituyó incluía las 130 pb 3' del intrón 3 de ratón, el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen Tmprss4 de ratón (figuras 2A-2B). El fragmento genómico humano que se insertó incluía una porción 3' del intrón 3 de TMPRSS4 humano de aproximadamente 150 pb, y el exón 4 codificante de TMPRSS4 humano hasta el codón de parada en el exón 13 codificante (figuras 2A-2B). El clon BAC modificado resultante incluía, de 5' a 3', un brazo de homología 5' de ratón que contiene aproximadamente 44,8 kb de ADN genómico de ratón (incluida una 5' UTR de Tmprss4 de ratón, los exones 1 a 3 codificantes de Tmprss4 de ratón, el intrón 3 de Tmprss4 de ratón en parte (sin los 130 pb 3'), un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4996 pb, una porción 3' del intrón 3 de TMPRSS4 de aproximadamente 150 pb, el exón 4 codificante de TMPRSS4 hasta el codón de parada en el exón 13 codificante, seguido directamente por la 3' UTR de Tmprss4 de ratón y el ADN genómico de ratón restante en el clon BAC original (un brazo de homología 3' de ratón de aproximadamente 118 kb en total). Véase las figuras 2A-2B. Las secuencias de unión también se exponen en la parte inferior de la figura 2B. La parte del clon BAC modificado que contiene el casete de neomicina y el fragmento genómico de TMPRSS4 humano, así como las uniones de inserción cadena arriba y cadena abajo, se expone en la SEQ ID NO:12. La secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Tmprss4 humanizado se expone en la SEQ ID NO: 14. Se proporciona una alineación de esta proteína Tmprss4 humanizada ("pro 7224 mutante"), una proteína Tmprss4 de ratón (SEQ ID NO: 9) y una proteína TMPRSS4 humana (SEQ ID n O: 11) en la figura 2 D.
El clon BAC modificado que contiene el gen Tmprss4 humanizado, como se describe anteriormente, se utilizó para someter a electroporación a células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen Tmprss4 humanizado. Las células ES dirigidas positivamente que contienen un gen Tmprss4 humanizado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia de secuencias de TMPRSS4 humano (p. ej., los exones 4-13 codificantes de TMPRSS4 humano) y confirmó la pérdida y/o conservación de secuencias de Tmprss4 de ratón (p. ej., pérdida de los exones 4-13 codificantes de Tmprss4 de ratón). La tabla 2 muestra los cebadores y las sondas que se utilizaron para confirmar la humanización de un gen Tmprss4 endógeno como se describe anteriormente (figuras 2A-2B). Una vez que se ha seleccionado un clon de células ES correctamente dirigido, el casete de selección de neomicina se puede escindir introduciendo una recombinasa Cre, por ejemplo, a través de electroporación. Como alternativa, el casete de selección de neomicina puede eliminarse cruzando la descendencia generada a partir del clon ES con una cepa de roedor eliminador que expresa una recombinasa Cre. El locus Tmprss4 humanizado después de la eliminación del casete se muestra en la figura 2C, con las secuencias de unión que se muestran en la parte inferior de la figura 2C.
Se utilizaron clones de células ES seleccionados (con o sin el casete) para implantar en ratones hembra utilizando el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007), supra) para generar una camada de cachorros que contenía un alelo Tmprss4 humanizado en el genoma. Se pudieron confirmar e identificar nuevamente ratones que llevaban un alelo Tmprss4 humanizado mediante la genotipificación del ADN aislado de los cortes de la cola utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra) que detectaba la presencia de las secuencias del gen TMPRSS4 humano. Las crías se genotipificaron y se seleccionaron las cohortes de animales heterocigotos para el locus Tmprss4 humanizado para la caracterización. Se produjeron animales homocigotos para el locus Tmprss4 humanizado cruzando animales heterocigotos.
TABLA 2
Nombre Cebador Secuencia (5'-3') SEQ ID NO 7224mTU Directo GAGCAGGGCCAT GACACAT (SEQ ID NO 42)
Sonda (BHQ) ACCATT AGAT CCCAGCACT GG AC A (SEQ ID NO 43) Inverso AAACCCTT CCCGAGAGAGAA (SEQ ID NO 44) Directo GAGG AACACT GT GT CAAGGACTT (SEQ ID NO: 45) 7224mTU2 Sonda (BHQ) CCT GAAAAGCCCGGAGTGGCAG (SEQ ID NO 46)
Inverso GGGCAGAGACCACAT CTGA (SEQ ID NO: 47) ______________ (continuación)
Nombre Cebador Secuencia (5'-3') SEQ ID NO 7224mTD Directo GG AAGCCCT CT CT CGAT ACTT G (SEQ ID NO: 48)
Sonda (BHQ) TT CT ACCCT GAGGGCATGC AGC (SEQ ID NO: 49) Inverso T GGGAT GT AGAAGGTT GT CAGA (SEQ ID NO: 50) 7224hTU Directo CT GAGCCT GGAACTCACACAT G (SEQ ID NO: 51)
Sonda (BHQ) T CT GAG AGCCCAGCACT AT CGCC (SEQ ID NO: 52) Inverso GCT GAGGGT CAGGCTT GAG (SEQ ID NO: 53) 7224hTD Directo T CT GCAGGGT AGGGAGAGAAG (SEQ ID NO: 54)
Sonda (BHQ) TGTTTCAGAAAAGGAAGACTCACGTTA (SEQ ID NO: 55)
CA
Inverso GAGACCGAT GAAGAGAAAGT CAGA (SEQ ID NO: 56)
Ejemplo 3. Humanización de un gen T m p rs s lld endógeno.
Este ejemplo ilustra métodos ilustrativos de humanización de un gen endógeno que codifica Tmprss11d en un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo se pueden emplear para humanizar un gen Tm prsslld endógeno de un roedor utilizando cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias (o fragmentos de secuencias) humanas según se desee.
Un vector de direccionamiento para la humanización de un gen Tm prsslld endógeno se construyó utilizando clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003), supra).
Brevemente, se utilizó el clon RP23-95N22 de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón que contiene un gen Tm prsslld de ratón y se modificó de la siguiente manera. Se generó un fragmento de ADN para incluir una secuencia de nucleótidos de homología de ratón 5', un ADN genómico de TMPRSS11D humano de aproximadamente 33.927 pb (que contiene 444 pb en el extremo 3' del intrón 2, y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante (incluida la 3' UTR que es parte del exón 10 codificante), de un gen TMPRSS11D humano), un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4.996 pb y una secuencia de homología de ratón 3'. Este fragmento de ADN se utilizó para modificar el clon BAC RP23-95N22 mediante recombinación homóloga en células bacterianas. Como resultado, un ratón con un fragmento genómico de Tmprss11d de ratón que codifica un ectodominio (de aproximadamente 35.667 pb) en el clon BAC se sustituyó con el fragmento genómico de TMPRSS11D humano de aproximadamente 33.927 pb, seguido de un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4996 pb. Específicamente, el fragmento genómico de Tmprss11d de ratón que se sustituyó incluía una porción 3' del intrón 2 y el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante del gen Tmprss11d de ratón (figuras 3A-3B). El fragmento genómico de TMPRSS11D humano que se insertó incluía 444 pb en el extremo 3' del intrón 2 y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante de un gen TMPRSS11D humano (incluida la 3' UTR de TMPRSS11D humano) y una secuencia genómica 3' humana de aproximadamente 172 pb cadena abajo de la 3' UTR de TMPRSS11D humano (figuras 3A-3B). El clon BAC modificado resultante incluía, de 5' a 3', (i) un brazo de homología 5' de ratón que contiene aproximadamente 143 kb de ADN genómico de ratón que incluye la 5' UTR de Tmprss11d de ratón, los exones 1-2 codificantes de Tmprss11d de ratón y una porción 5' del intrón 2; (ii) un fragmento genómico de TMPRSS11D humano que incluía una porción 3' del intrón 2 y los exones 3 a 10 codificantes (incluida la 3' UTR) de TMPRSS11D humano y una secuencia genómica 3' humana; (iii) un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4996 pb, seguido de (iv) un brazo de homología 3' de ratón de 10 kb que contiene la 3' UTR de Tmprss11d de ratón y el ADN genómico de ratón restante en el clon BAC original. Véase las figuras 3A-3B. Las secuencias de unión también se exponen en la parte inferior de la figura 3B. La parte del clon BAC modificado que contiene el fragmento genómico de TMPRSS11D humano y el casete de neomicina, así como las uniones de inserción cadena arriba y cadena abajo, se expone en la SEQ ID n O:19. La secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Tmprss11d humanizado se expone en la SEQ ID NO: 21. Se proporciona una alineación de esta proteína Tmprss11d humanizada ("pro 7226 mutante"), una proteína Tmprss11d de ratón (SEQ ID NO: 16) y una proteína TMPRSS11D humana (SEQ ID NO: 18) en la figura 3D.
El clon BAC modificado que contiene el gen Tmprss11d humanizado, como se describe anteriormente, se utiliza para someter a electroporación a células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen Tmprss11d humanizado. Las células ES dirigidas positivamente que contienen un gen Tmprss11d humanizado se identifican mediante un ensayo (Valenzuela et al., supra) que detecta la presencia de las secuencias de TMPRSS11D humano (p. ej., los exones 3-10 codificantes de TMPRSS11D humano) y confirma la pérdida y/o conservación de secuencias de Tmprss11d de ratón (p. ej., pérdida de los exones 3-10 codificantes de Tmprss11d de ratón). La tabla 3 muestra los cebadores y las sondas que se utilizaron para confirmar la humanización de un gen Tmprss11d endógeno como se describe anteriormente (figuras 3A-3B). Una vez que se ha seleccionado un clon de células ES correctamente dirigido, el casete de selección de neomicina se puede escindir introduciendo una recombinasa Cre, por ejemplo, a través de electroporación. Como alternativa, el casete de selección de neomicina puede eliminarse cruzando la descendencia generada a partir del clon ES con una cepa de roedor eliminador que expresa una recombinasa Cre. El locus Tm prsslld humanizado después de la eliminación del casete se muestra en la figura 3C, con las secuencias de unión que se muestran en la parte inferior de la figura 3C.
Se utilizan clones de células ES seleccionados (con o sin el casete) para implantar en ratones hembra utilizando el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007), supra) para generar una camada de cachorros que contenía un alelo Tm prsslld humanizado en el genoma. Se pueden confirmar e identificar nuevamente ratones que llevaba un alelo Tm prsslld humanizado mediante la genotipificación del ADN aislado de los cortes de la cola utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra) que detecta la presencia de las secuencias del gen TMPRSS11D humano. Las crías se genotipifican y se seleccionan las cohortes de animales heterocigotos para el locus Tm prsslld humanizado para la caracterización. Se producen animales homocigotos para el locus Tm prsslld humanizado cruzando animales heterocigotos.
__________________________________________ TABLA 3__________________________________________
Nombre Cebador Secuencia (5'-3') SEQ ID NO 7226mTU Directo TCCTCT CCAGACAAGAAAGCT (SEQ ID NO: 61)
Sonda (BHQ) TCATAGCAGCTTTCAAATCCTAAACGT (SEQ ID NO: 62) TGA
Inverso TCGTGTGT AGCT GGT GAGTT (SEQ ID NO: 63) 7226mTD Directo CAT GCGAT CACAGGAGGAGAT C (SEQ ID NO: 64) Sonda (BHQ) AATT GGGCCCGAAGCCAGAT GC (SEQ ID NO: 65) Inverso CGGAAGGCTT CT GT GACTT C (SEQ ID NO: 66) 7226hTU Directo GT CTCCCACTT CT GACAT AAT GAAC (SEQ ID NO: 67) Sonda (BHQ) CCCAGT GTT AACCCT ACAT CTGGTTCC (SEQ ID NO: 68) Inverso T GGG AAGAGACT CTT GGAC A (SEQ ID NO: 69) 7226hTD Directo AT GAGCTCCT AGT ACAGCTAAAGTT (SEQ ID NO: 70) Sonda (MGB) ATGCATGATCATCTATGCGTCAGAGC (SEQ ID NO: 71) Inverso TGCCCAGAT GCAGGGAGTT AG (SEQ ID NO: 72)
Ejemplo 4. Evaluación de los virus de la gripe A del grupo 1 y del grupo 2 en ratones MAID7225 Humln frente a ratones Tmprss4 de tipo silvestre
Para validar el uso de roedores con Tmprss humanizados como modelo animal de infección, se realizaron experimentos para evaluar la supervivencia de ratones MAID7225 Humln TMPRSS4 frente a compañeros de camada de tipo silvestre (TS) en un modelo de infección grave por gripe A del grupo 1 y del grupo 2.
Los ratones MAID7225 Humln TMPRSS4 son homocigotos para un gen Tmprss4 humanizado en su genoma y se generaron como se describe en el ejemplo 2. Las cepas víricas utilizadas en estos estudios incluyeron el aislado histórico del virus de la gripe A del grupo 1 A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) y un aislado del virus de la gripe A del grupo 2 propio adaptado a ratón A/Aichi/02/1968 (HA, NA) X-31 (H3N2). Todos los experimentos se realizaron en ratones machos y hembras MAID7225 Humln TMPRSS4 de 6-8 semanas de edad o compañeros de camada de TS. Los ratones se expusieron con 1150 unidades formadoras de placa (UFP) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) o 10.000 UFP de A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2). En estos modelos de supervivencia, los ratones se expusieron por vía intranasal (IN) el día 0 después de la infección (p.i.). Los ratones se pesaron y observaron diariamente hasta el día 14 p.i. y se sacrificaron cuando perdieron el 20 % de su peso inicial. Los resultados se indican como porcentaje de supervivencia (tabla 4).
Tabla 4
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un roedor cuyo genoma comprende un gen Tmprss humanizado, en donde el gen Tmprss humanizado
- comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín,
- se encuentra en un locus Tmprss de roedor endógeno, y es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica del gen Tmprss de roedor endógeno con dicha secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín y está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor endógeno, y
- codifica una proteína Tmprss humanizada que comprende: (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína T mprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
2. El roedor de la reivindicación 1, en donde el gen Tmprss humanizado es un gen Tmprss2 humanizado, el gen Tmprss de roedor endógeno es un gen Tmprss2 de roedor endógeno y el gen TMPRSS humano afín es un gen TMPRSS2 humano.
3. El roedor de la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS2 humano comprende el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano.
4. El roedor de la reivindicación 2, en donde el gen Tmprss2 humanizado comprende
(i) los exones 1-2 codificantes del gen Tmprss2 de roedor endógeno,
(ii) un exón 3 que comprende una porción 5' del exón 3 codificante del gen Tmprss2 de roedor endógeno y una porción 3' del exón 3 codificante del gen TMPRSS2 humano, y
(iii) el exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano, y
en donde el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que comprende una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor codificada por dicho gen Tmprss2 de roedor endógeno y un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por dicho gen TMPRSS2 humano.
5. El roedor de la reivindicación 1, en donde el gen Tmprss humanizado es un gen Tmprss4 humanizado, el gen Tmprss de roedor endógeno es un gen Tmprss4 de roedor endógeno y el gen TMPRSS humano afín es un gen TMPRSS4 humano.
6. El roedor de la reivindicación 5, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS4 humano comprende el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS4 humano.
7. El roedor de la reivindicación 5, en donde el gen Tmprss4 humanizado comprende el exón 1 codificante hasta el exón 3 codificante del gen Tmprss4 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS4 humano.
8. El roedor de la reivindicación 1, en donde el gen Tmprss humanizado es un gen Tm prsslld humanizado, el gen Tmprss de roedor endógeno es un gen Tm prsslld de roedor endógeno y el gen TMPRSS humano afín es un gen TMPRSS11D humano.
9. El roedor de la reivindicación 8, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS11D humano comprende el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante del gen TMPRSS11D humano.
10. El roedor de la reivindicación 8, en donde el gen Tmprss11d humanizado que comprende los exones 1-2 codificantes del gen Tmprss11d de roedor endógeno y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante del gen TMPRSS11D humano.
11. El roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor es homocigoto para el gen Tmprss humanizado.
12. Un método para producir un roedor que tiene un gen Tmprss humanizado, que comprende:
(a) insertar un fragmento genómico en un locus Tmprss de roedor endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, comprendiendo dicho fragmento genómico una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, formando, de este modo, un gen Tmprss humanizado,
en donde el gen Tmprss humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor en el locus Tmprss de roedor endógeno y codifica una proteína T mprss humanizada, y
en donde la proteína Tmprss humanizada comprende (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor codificada por el gen Tmprss de roedor en dicho locus Tmprss de roedor endógeno;
(b) obtener una célula madre embrionaria de roedor que comprende el gen Tmprss humanizado de (a); y, (c) crear un roedor utilizando la célula madre embrionaria de roedor de (b).
13. El método de la reivindicación 11 o 12, en donde el gen Tmprss humanizado se selecciona del grupo que consiste en un gen Tmprss2 humanizado, un gen Tmprss4 humanizado y un gen Tm prsslld humanizado.
14. El método de la reivindicación 13,
en donde el gen Tmprss2 humanizado comprende (i) los exones 1-2 codificantes del gen Tmprss2 de roedor endógeno, (ii) un exón 3 que comprende una porción 5' del exón 3 codificante del gen Tmprss2 de roedor endógeno y una porción 3' del exón 3 codificante del gen TMPRSS2 humano y (iii) el exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano; y/o
en donde el gen Tmprss4 humanizado comprende el exón 1 codificante hasta el exón 3 codificante del gen Tmprss4 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS4 humano; y/o en donde el gen Tm prsslld humanizado comprende los exones 1-2 codificantes del gen Tm prsslld de roedor endógeno y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante del gen TMPRSS11D humano.
15. El roedor acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde el roedor es un ratón o una rata.
16. Un método para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto en el tratamiento de una infección por el virus de la gripe A, que comprende:
proporcionar un roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o 15;
administrar un virus de la gripe A y un compuesto candidato al roedor, en donde opcionalmente el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana; y
monitorizar la presencia y la gravedad de la infección por el virus de la gripe A en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del compuesto candidato.
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