CN113993540A - 用于治疗癌症的一种或多种包含靶向掩蔽i型干扰素(ifna和ifnb)和针对肿瘤抗原的抗体的融合蛋白组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了包含掩蔽IFN的融合蛋白组合物，和制作掩蔽IFN的方法。因此，掩蔽IFN可被融合至单克隆抗体或其结合片段并作为治疗方法给予患者，并提供治疗癌症、免疫失调和其他疾病的方法。

Description

用于治疗癌症的一种或多种包含靶向掩蔽I型干扰素(IFNA和 IFNB)和针对肿瘤抗原的抗体的融合蛋白组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月15日提交的第62/920,140号美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
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下述以ASCII文本文件提交的内容通过引用其全部内容纳入本文：计算机可读形式(CRF)序列表(文件名：165802000140.txt，记录日期：2020年4月14日，大小：24.7KB)。
联邦资助的研究下作出发明的权利声明
无。
发明领域
本文描述的发明涉及癌症治疗和其他免疫失调或疾病的治疗领域。具体地，本发明涉及掩蔽I型干扰素(IFN)组合物，它可被融合至肿瘤抗原结合蛋白，并用作人类靶向癌症治疗的载体。该发明进一步涉及治疗失调或疾病，例如癌症和其他免疫失调和疾病。
发明背景
癌症是仅次于冠心病的全球第二大死亡原因。每年有数百万人死于癌症，仅在美国，每年就有超过50万人死于癌症，2017年新确诊1,688,780例癌症病例(美国癌症协会)。虽然心脏病导致的死亡显著下降，但癌症导致的死亡普遍上升。在本世纪初期，除非医学发展改变当前趋势，否则癌症预计将成为主要死因。
几种癌症具有突出的高死亡率。血液***恶性肿瘤，包括骨髓瘤，仅在美国每年就导致50,000人死亡(美国癌症协会，2018年)。此外，肺癌(占所有癌症死亡人数的18.4％)、乳腺癌(占所有癌症死亡人数的6.6％)、结直肠癌(占所有癌症死亡人数的9.2％)、肝癌(占所有癌症死亡人数的8.2％)和胃癌(占所有癌症死亡人数的8.2％)代表了全球所有年龄段两性癌症死亡的主要原因(GLOBOCAN 2018)。这些和几乎所有其他癌都有一个共同的致死特征，在于它们转移到原发肿瘤的远端，除了极少数例外，转移性疾病是致命的。此外，即使对于那些最初从原发性癌症中幸存下来的癌症患者，共同的经验表明，他们的生活发生了巨大的变化。许多癌症患者由于意识到复发或治疗失败的可能性而经历强烈焦虑。许多癌症患者还会在治疗后出现身体虚弱。此外，许多癌症患者的疾病会复发。
尽管癌症治疗在过去几十年中有所改进并且存活率有所提高，但癌症的异质性仍然需要利用多种治疗方法的新治疗策略。在治疗解剖学关键部位的实体瘤(例如，胶质母细胞瘤、头颈部鳞状癌和肺腺癌)时尤其如此，这些部位有时仅限于标准放疗和/或化疗。尽管如此，这些疗法的不利影响是化疗和放疗抗性，这会促进局部复发、远端转移和第二原发肿瘤，以及降低患者生活质量的严重副作用。
此外，正在实现单克隆抗体(mAb)(G.Kohler和C.Milstein，Nature 256：495-497(1975))的治疗效用。单克隆抗体现已被批准用于移植、癌症、传染病、心血管疾病和炎症的治疗。不同的同种型具有不同的效应物功能。这种功能差异反映在不同的免疫球蛋白同种型的不同3维结构中(P.M.Alzari等，Annual Rev.Immunol.，6：555-580(1988))。
此外，干扰素(包括IFNα和IFNβ(I型)和IFNγ(II型))是抗癌免疫的重要介导物，对许多癌症具有直接的抗增殖作用以及多种抗肿瘤免疫治疗作用。然而，尽管IFNα已显示出抗多种人类癌症的功效，但迄今为止，其临床效用受限于无法在肿瘤部位达到IFN有效浓度而不引起全身毒性。
由于全身毒性，几个团队已经通过使用单克隆抗体的肿瘤靶向能力将IFN直接运载到肿瘤部位来解决这个问题。参见，Huang，等J.Immunol.179(10)，第6881-6888页(2007)和Vasuthasawat，等，J.Immunol.36(5)，第305-318页(2013)。应注意，最初的工作是使用抗-CD20-IFNα2蛋白将IFNα靶向到淋巴瘤上表达的CD20，和使用抗-CD138-IFNα2融合蛋白靶向多发性骨髓瘤上表达的CD138。参见，Vasuthasawat，等，MAbs 8(7)，第1386-1397页(2016)。虽然这些方法已显示出巨大的治疗前景，目前正在人体临床试验中进行测试并进行商业开发，但仍存在一些缺陷。
虽然注意到与单独注射IFN时的效果相比，使用特异性结合以靶向肿瘤相关抗原的抗体递送了更高百分比(％)的IFN到肿瘤部位，但附接的干扰素仍被与肿瘤无关的全身表达的干扰素受体识别并结合。因此，由于全身暴露和与全身IFN受体的相互作用，Mab融合的IFN仍可能诱导毒性和/或增加清除率。
综上所述，本领域技术人员不难了解，在治疗癌症和免疫疾病时需要一种新的治疗范例。
鉴于目前与将IFN递送至癌细胞相关的缺陷，本发明的一个目的是提供利用在到达肿瘤之前抑制IFN活性的掩蔽IFN治疗一种或多种癌症、免疫失调和其他疾病的新的和改进的方法。提供了满足这些需求的组合物、试剂盒和使用方法。
发明概述
本发明提供结合至全范围肿瘤相关抗原(TAA)的抗体、抗原结合片段和融合蛋白组合物。在另一个实施方式中，融合蛋白组合物包含I型干扰素。在另一个实施方式中，干扰素被掩蔽，因此其活性被降低或无效，直到它到达肿瘤细胞。在另一个实施方式中，TAA列于表I中。在优选的实施方式中，TAA与实体瘤相关。在一个实施方式中，TAA包含CD138。在另一个实施方式中，TAA是CD20。在另一个实施方式中，TAA是间皮素。在另一个实施方式中，TAA是5T4。在又一个实施方式中，表II中列出了IFN或功能性活化突变体。在优选的实施方式中，IFN包括IFNA2。
在另一个实施方式中，本发明包含靶向掩蔽IFN。在优选的实施方式中，靶向掩蔽IFN包括IFNA1。
在另一个实施方式中，本发明包含靶向掩蔽IFN。在优选的实施方式中，靶向掩蔽IFN包括IFNA14。
在另一个实施方式中，本发明包含靶向掩蔽IFN。在优选的实施方式中，靶向掩蔽IFN包括IFNB1。
在另一个实施方式中，本公开教导了生产靶向掩蔽IFN的方法。
在另一个实施方式中，本公开教导了治疗人的一种或多种癌症、免疫失调和其他疾病的方法。
在优选的实施方式中，本公开教导了用融合至结合TAA的单克隆抗体的掩蔽IFN治疗癌症的方法。
在任意一些实施方式中，治疗癌症的方法包括给予对象(例如人对象)治疗有效量的任何组合物或任何融合蛋白，例如任何本文所述的靶向掩蔽IFN。
还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的任何组合物或任何融合蛋白，例如本文所述的任何靶向掩蔽IFN。在任意一些实施方式中，药物组合物用于治疗，包括治疗癌症。在任意一些实施方式中，癌症包括在实体瘤中发现的癌症；或癌症起源于造血***。在任意一些实施方式中，药物组合物进一步包含一种或多种抗肿瘤剂。
还提供了试剂盒，例如包含任何组合物或任何融合蛋白的试剂盒，例如本文所述的任何靶向掩蔽IFN。
附图简要说明
图1.间质蛋白酶(Matriptase)ST 14从抗-CD138融合抗体(Ab)的重链上裂解IFN掩蔽。
图2.间质蛋白酶(Matriptase)ST 14从抗-CD138(N297Q)非糖基化融合抗体的重链上裂解IFN掩蔽。
图3.间质蛋白酶(Matriptase)ST 14从抗-5T4融合抗体和抗-间皮素融合抗体的重链上裂解IFN掩蔽。
图4.相对于未掩蔽的融合蛋白，掩蔽的抗-5T4融合抗体和掩蔽的抗-间皮素融合抗体结合IFNα2受体的亲和力降低。
图5.相对于未掩蔽的融合蛋白，掩蔽的抗-CD20融合抗体和掩蔽的抗-CD138融合抗体结合IFNα2受体的亲和力降低。
图6.掩蔽降低了IFN受体的IFNα融合蛋白激活，而MST14恢复了活性。
图7(A-B).减少和恢复掩蔽IFNα活性的方法。图7(A)显示了抗-5T4融合抗体。图7(B)显示了抗-间皮素抗体。
图8.人外周血单核细胞(“PMBC”)中IP-10的诱导。
图9.QXL138AM构建体设计。
图10.QXL138AM表达/纯化表征。
图11.通过质谱仪对QXL138AM的重链轻链分析。
图12.通过SDS-Page表征QXL138AM。
图13(A-B).通过SDS-Page表征掩蔽融合抗体。
图14(A-B).通过ELISA将融合抗体与掩蔽结合。图14(A)显示了与掩蔽(肽1)的结合。图14(B)显示了与掩蔽(肽2)的结合。
图15(A-B).靶向融合抗体比非靶向融合抗体的表征。图15(A)显示了OVKATE细胞的增殖。图15(B)显示了OVCAR3细胞的增殖。
图16(A-B).靶向融合抗体比非靶向融合抗体的表征。图16(A)显示了U266 MTS细胞的增殖。图16(B)显示了U266 MTS细胞的增殖。
图17.去除IFN掩蔽恢复对细胞增殖的抑制。
图18(A-B).抗体靶向和掩蔽有助于减少脱靶的IFNα-诱导的细胞毒性。.图18(A)显示了具有CD138掩蔽的IFNα的Daudi MTS细胞的增殖。图18(B)显示了具有CD20掩蔽的IFNα和CD138掩蔽的IFNa的Daudi MTS细胞的增殖。
图19(A-B).掩蔽/未掩蔽和靶向/非靶向融合抗体的肿瘤细胞系细胞毒性。图19(A)显示了U266 MTS细胞的增殖。图19(B)显示了OVCAR3 MTS细胞的增殖。
图20(A-B).掩蔽/未掩蔽和靶向/非靶向融合抗体的肿瘤细胞系细胞毒性。图20(A)显示了OCI-My5.5MTS细胞的增殖。图20(B)显示了H929 MTS细胞的增殖。
图21(A-B).掩蔽降低了PBMC的IFNR激活。图21(A)显示了剂量依赖性STAT1激活。图21(B)显示了剂量依赖性IP-10诱导。
图22.掩蔽降低了PBMC的IFNR激活。
图23(A-B).QXL138A和QXL138AM体外功能研究。图23(A)显示了QXL138A、QXL138AM和QXL138AM+蛋白酶。图23(B)显示了抗-CD20-IFNα、抗CD20-IFNα-掩蔽和抗-CD20-IFNα-掩蔽+蛋白酶。
图24.QXL138A和QXL138AM在人骨髓瘤异种移植物(H929)中的体内功效。
图25.QXL138A和QXL138AM在人骨髓瘤异种移植物(H929)中的体内功效。
图26.QXL138A在骨髓瘤中显示出与标准护理治疗(硼替佐米)的协同作用。
图27.QXL138A在骨髓瘤中显示出与标准护理治疗(硼替佐米)的协同作用。
图28.QXL138AM在骨髓瘤中显示出与标准护理治疗(泊马度胺)的协同作用。
图29.QXL138AM在骨髓瘤中显示出与标准护理治疗(泊马度胺)的协同作用。
图30.间质蛋白酶ST 14从抗-CD138融合体的重链上裂解第二IFN掩蔽。
图31.相对于未掩蔽的融合蛋白，掩蔽的抗-CD138(掩蔽1)融合抗体和掩蔽的抗-CD138(掩蔽2)融合抗体结合IFNα2受体的亲和力降低。
图32(A-B).减少和恢复掩蔽IFNα活性的方法。图32(A)显示了没有MST的抗-CD138融合抗体(掩蔽1和掩蔽2)。图32(B)显示了有MST的抗-CD138融合体(掩蔽1和掩蔽2)。
具体实施方式
本文提供了包含干扰素(IFN)的融合蛋白和组合物。在一些方面，所提供的融合蛋白和组合物包含IFN和抗体或其抗原结合片段，例如对肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，干扰素是I型IFN。在一些方面，所提供的融合蛋白和组合物包含IFN和掩蔽，例如阻断IFN与其受体(例如IFN-α受体(IFNAR))之间相互作用的多肽序列。在一些方面，所提供的融合蛋白或组合物包含IFN、抗体或其抗原结合片段和掩蔽。在所提供的任意一些实施方式中，融合蛋白或组合物还包含柔性肽接头。在一些实施方式中，融合蛋白或组合物还包含蛋白酶裂解位点，例如肿瘤相关蛋白酶裂解位点。在一些方面，蛋白酶裂解位点的裂解，例如在肿瘤部位处或附近或在肿瘤微环境(TME)中，可导致IFN的“暴露”并允许IFN与其受体结合.在一些方面，例如对TAA特异的抗体或其抗原结合片段可以将融合蛋白或组合物靶向到肿瘤或癌症的特定部位或位置。因此，在一些方面，所提供的融合蛋白和组合物可用于治疗疾病或病症，例如癌症或肿瘤。还提供了制备这种融合蛋白或组合物的方法、涉及使用这种融合蛋白或组合物的方法(例如在治疗方法中)，和包含这种融合蛋白或组合物的药物组合物或试剂盒。
如本文进一步所述，所提供的实施方式(包括靶向掩蔽IFN)具有优于可用方法的独特优势，一些原因包括掩蔽IFN的活性在到达肿瘤部位之前显著降低和/或消除，因此非特异性活性被最小化，融合蛋白不会被不在肿瘤部位的干扰素受体捕获。在肿瘤部位，掩蔽可以被除去，IFN的结合和活性被重新激活，这可以最大化在肿瘤中的功效，并在不增加毒性的情况下增加融合蛋白的有效浓度。此外，借助于附接至IFN的抗体，融合蛋白可以被靶向至特定肿瘤(例如，表达被抗体特异性结合的TAA的肿瘤)。特异性靶向允许IFN有更大的机会被引导至感兴趣的癌而避开非癌性或非肿瘤组织。
各部分的概要
I.)定义
II.)抗体
III.)一种或多种干扰素
IV.)掩蔽IFN的方法
a.可用方法的讨论
b.掩蔽本公开的IFN的方法
V.)表达肿瘤相关抗原(TAA)的一种或多种癌症的治疗
VI.)靶向掩蔽IFN融合蛋白混合物
VII.)组合疗法
VIII.)试剂盒/生产制品
本发明中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据集，均以各个体出版物好似独立地通过引用纳入的相同程度通过引用其全文纳入本文用于所有目的。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其他出版物中所示的定义不同或其他情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。
本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述内容。
I.)定义：
除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它科学专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。本文所述或所引用的许多技术和方法已由本领域技术人员充分了解并通常通过常规方法采用，例如，Sambrook等在Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)第2版(1989)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)(纽约州冷泉港)中描述的广泛应用的分子克隆方法。在适当的情况下，除非另有说明，涉及使用市售试剂盒和试剂的程序一般都是按照制造商规定的方案和/或参数进行的。
本文中使用商品名时，提及的商品名也指该商品名产品的产品制剂、仿制药和一种或多种活性药物成分，除非上下文另有指示。
术语“晚期癌症”、“局部晚期癌症”、“晚期疾病”和“局部晚期疾病”是指已经延伸穿过相关组织囊的癌症，意指包括美国泌尿外科协会(AUA)***下的C期疾病，Whitmore-Jewett***下的C1-C2期疾病，以及TNM(肿瘤、结节、转移)***下的T3-T4期和N+疾病。通常，不建议对局部晚期疾病患者进行手术治疗，与临床局部(器官局限性)癌症患者相比，这些患者的预后要差得多。
“改变天然糖基化模式”在本文中旨在表示删除在天然抗体序列中发现的一个或多个碳水化合物部分(或通过去除潜在的糖基化位点或通过化学和/或酶促方式删除糖基化)，和/或添加一个或多个不存在于天然抗体序列中的糖基化位点，其中“天然糖基化模式”是指由所使用的抗体序列、细胞类型和生长条件的特定组合产生的天然翻译后糖基化模式。此外，该短语包括天然蛋白质糖基化的质变，包括存在的各种碳水化合物部分的性质和比例的变化。
术语“类似物”是指与另一分子(例如TAA相关蛋白)结构相似或共享相似或对应属性的分子。例如，TAA蛋白的类似物可以被特异性结合TAA的抗体或T细胞特异性结合。
除非另有明确说明，否则术语“抗体”以最广泛的含义使用。因此，“抗体”可以是天然存在的或人造的，例如通过常规杂交瘤或转基因小鼠技术产生的单克隆抗体。抗体包括单克隆和多克隆抗体以及含有抗原结合结构域和/或这些抗体的一个或多个互补决定区的片段。如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合至TAA和/或表现出所需生物学活性的任何形式的抗体或其片段，并且具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、)和抗体片段，只要它们特异性结合TAA和/或表现出所需的生物学活性。任何特异性抗体均可用于本文提供的方法和组合物中。因此，在一个实施方式中，术语“抗体”涵盖了包含至少一个来自轻链免疫球蛋白分子的可变区和至少一个来自重链分子的可变区的分子，它们组合形成靶抗原的特异性结合位点。在一个实施方式中，抗体是IgG抗体。例如，抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体或任何已知的抗体同种型。可用于本方法和组合物的抗体可以在细胞培养物、噬菌体或各种动物中产生，包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴子、黑猩猩和猿。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体是哺乳动物抗体。噬菌体技术可用于分离初始抗体或产生具有改变的特异性或亲合力特征的变体。这种技术是常规且是本领域公知的。在一个实施方式中，抗体通过本领域已知的重组方式产生。例如，可以通过用包含编码抗体的DNA序列的载体转染宿主细胞来产生重组抗体。一种或多种载体可用于转染在宿主细胞中表达至少一种VL和至少一种VH区的DNA序列。抗体产生和生产的重组方式的示例性描述包括Delves，《抗体生产：关键技术》(ANTIBODY PRODUCTION：ESSENTIAL TECHNIQUES)(Wiley，1997)；Shephard，等，《单克隆抗体》(MONOCLONAL ANTIBODIES)(牛津大学出版社，2000)；Goding，《单克隆抗体：原理和实践》(MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE)(学术出版社，1993)；和《新编免疫学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)(John Wiley和Sons，最新版本)。本发明的抗体可以通过重组方式修饰以增加抗体在介导所需功能中的功效。因此，可以使用重组方式通过取代修饰的抗体也在本发明的范围内。通常，取代将是保守取代。例如，抗体恒定区中的至少一个氨基酸可以被不同的残基取代。参见例如，美国专利号5,624,821、美国专利号6,194,551、申请号WO 9958572；和Angal，等，Mol.Immunol.30：105-08(1993)。氨基酸的修饰包括氨基酸的缺失、添加和取代。在某些情况下，进行此类改变以减少不需要的活性，例如补体依赖性细胞毒性。经常地，通过共价或非共价接合提供可检测信号的物质来标记抗体。多种标记和偶联技术是已知的，在科学和专利文献中都有广泛的报道。这些抗体可以被筛选出结合至正常或缺陷型TAA的。参见例如，《抗体工程：实用方法》(ANTIBODYENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH)(牛津大学出版社，1996)。具有所需生物活性的合适抗体可以使用以下体外试验来鉴定，包括但不限于：增殖、迁移、黏着、软琼脂生长、血管生成、细胞间通讯、凋亡、运输、信号转导，以及以下体内试验，例如抑制肿瘤生长。本文提供的抗体还可用于诊断应用。如捕获或非中和抗体，它们可以被筛选为具有结合至特定抗原的能力，而不抑制抗原的受体结合或生物学活性。如中和抗体，该抗体可用于竞争性结合试验。它们还可用于量化TAA或其受体。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”(或简称为“抗体部分”)是指保留了特异性结合至TAA抗原(例如，CD138、CD20、间皮素、5T4及其变体；另见表I)的能力的TAA抗体的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合片段”所包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，二价片段，包括在铰链区通过二硫桥联接的两个Fab片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等.，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH分别由不同基因编码，但可通过重组方法利用合成接头使其连接成为一条蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子，称为单链Fv(scFv)。参见例如Bird等，(1988)Science 242：423-426；和Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。这种单链抗体也意为包含在术语抗体的“抗原结合片段”内。这些抗体片段可使用本领域普通技术人员所知的常规技术获得，并且筛选与完整抗体具有相同应用的片段。
如本文所用，术语“Fc”是指包含铰链区、CH2和/或CH3结构域的区域。
如本文所用，任何形式的“抗原”可用于产生对TAA特异的抗体。因此，引发抗原可以是单个表位、多个表位或整个蛋白质，单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合。引发抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白质(例如，用转染了至少部分抗原的细胞进行免疫)或可溶性蛋白质(例如，仅用蛋白质的细胞外结构域部分进行免疫))。抗原可以在遗传修饰的细胞中产生。编码抗原的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)并且编码至少部分胞外结构域或胞内结构域。如本文所用，术语“部分”在抗原的情况下是指构成感兴趣的抗原的免疫原性表位的最小数目的氨基酸或核酸，视情况而定。适合用于转化感兴趣细胞的任何遗传载体都可以使用，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非病毒载体，例如阳离子脂质。在一个实施方式中，本文方法和组合物的抗体特异性结合至少部分感兴趣的TAA的胞外结构域。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可构成“生物活性剂”或是其一部分。如本文所用，术语“生物活性剂”是指结合抗原和/或增强或介导所需的生物学效应以增强细胞杀伤毒素的任何合成或天然存在的化合物。在一个实施方式中，用于本发明的结合片段是生物学活性片段。如本文所用，术语“生物学活性”是指能够结合所需抗原表位并直接或间接发挥生物效应的抗体或抗体片段。直接效应包括但不限于：生长信号的调节、刺激和/或抑制，抗凋亡信号的调节、刺激和/或抑制，凋亡或坏死信号的调节、刺激和/或抑制，ADCC级联的调节、刺激和/或抑制和CDC级联的调节、刺激和/或抑制。
如本文所用，术语“保守取代”是指本领域技术人员已知的通常可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下进行的氨基酸和/或氨基酸序列的取代。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如，Watson，等，《基因的分子生物学》(MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE)，本杰明·卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Pub.Co.)，第224页(1987年第4版))。这种示例性取代优选根据表III中列出的那些氨基酸进行。例如，这种变化包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任何一个取代任何其他这些疏水性氨基酸；天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；和丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。其他取代也可以被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境及其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也可以互换。甲硫氨酸(M)是相对疏水的，经常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常可以互换位置，其中氨基酸残基的重要特征是其电荷，这两个氨基酸残基的pK值不同并不重要。在特定环境中还可以认为其他变化是“保守的”(参见例如，本文的表III；第13-15页“生物化学”(“Biochemistry”)第2版.Lubert Stryer编(斯坦福大学)；Henikoff等，PNAS 1992第89卷第10915-10919页；Lei等，J Biol Chem 1995年5月19日；270(20)：11882-6)。其他取代也是允许的，并且可以根据经验或根据已知的保守取代来确定。
本文所用的术语“融合蛋白”是指本发明的蛋白，其使用本领域已知的接头和方法融合至本发明的IFN的C-末端。参见，例如，美国专利9,803,021，其通过引用纳入本文。可用于将IFN融合至本发明的蛋白质的示例性接头包括但不限于：(i)GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：1)；(ii)GGGGS(SEQ ID NO：2)；(iii)SGGGGS(SEQ ID NO：3)；AGAAAKGAAAKAG(SEQ IDNO：4)；SGGAGGS(SEQ ID NO：5)；Landar；双Landar；1qo0E_1；IgG3铰链；IgG3铰链Δcys；和/或IgG1铰链Δcys。
本文所用术语“抑制”或“对......的抑制”是指降低可测量，或完全阻止。
如本文所用，术语“干扰素”是指宿主细胞响应几种病毒的存在而产生和释放的一组信号蛋白。在典型的情况下，被病毒感染的细胞会释放干扰素，导致附近的细胞增强其抗病毒防御能力。干扰素属于被称为细胞因子的一大类蛋白质，这些分子用于细胞之间的通讯，以触发免疫***的保护性防御，帮助消灭病原体。
如本文所用，术语“1型干扰素”或“I型干扰素”是指帮助调节免疫***活性的干扰素蛋白的一大亚组。所有I型IFN都与称为IFN-α受体(IFNAR)的特定细胞表面受体复合物结合，该复合物由IFNAR1和IFNAR2链组成。本公开的I型干扰素的示例性列表在表II中列出。
术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何生物体，包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马和人。在本发明的一个实施方式中，哺乳动物是小鼠。在本发明的另一个实施方式中，哺乳动物是人。
术语“掩蔽”指的是掩蔽IFN(也表示为“掩蔽的”IFN)就本发明而言是指阻断IFNAR激活和/或细胞因子相互作用的任何肽或蛋白质。可以使用重组方式通过取代修饰的“掩蔽”也在本发明的范围内。氨基酸的修饰包括氨基酸的缺失、添加和取代。
如本文所用，术语“靶向掩蔽的IFN”是指I型干扰素，其中多肽被附接至IFN的羧基末端从而降低结合IFNAR的能力。掩蔽IFN还包括附接至靶向结合蛋白(即抗体)的羧基末端。可以使用重组方式通过取代修饰的“一种或多种靶向掩蔽IFN”也在本发明的范围内。氨基酸的修饰包括氨基酸的缺失、添加和取代。
术语“转移癌”和“转移性疾病”是指已经扩散到区域***或远端部位的癌症，包括AUA***下的D期疾病和TNM***下的T×N×M+期。
“分子识别”是指一种化学事件，其中主体分子能够与第二个分子(即客体)形成复合物。该过程通过非共价化学键发生，包括但不限于氢键合、疏水相互作用、离子相互作用。
本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，即除了存在少数可能天然发生的突变外，群体包含的单独抗体均是相同的。单克隆抗体具有针对单个抗原性表位的高度特异性。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂通常包括多种针对(或特异于)不同表位的抗体。在一个实施方式中，在含有多个抗原表位的单一抗原内，多克隆抗体包含多种具有不同表位特异性、亲和性(affinity)、亲合力(avidity)的单克隆抗体。修饰语“单克隆”指示该抗体获自基本均质的抗体群这一特点，而不应被解释为需要通过任何特定的方法来产生抗体。例如，根据本发明所用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等，Nature 256：495(1975)所述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。也可通过例如Clackson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。这些单克隆抗体通常将以至少约1μM，更通常至少约300nM，通常至少约30nM，优选至少约10nM，更优选至少约3nM或更好的Kd结合，通常通过ELISA测定。
“药学上可接受的”是指与人类或其他哺乳动物在生理上相容的无毒、惰性和/或组合物。
如本文所用，术语“单链Fv”或“scFv”或“单链”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，使得sFv能够形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述参见Pluckthun，《单克隆抗体的药理学》(THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES)，第113卷，Rosenburg和Moore编著，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约，第269-315页(1994)。
如本文所用，术语“特异性”、“特异性结合”和“结合特异性”是指抗体与靶抗原表位的选择性结合。在给定的一组条件下，可以通过比较与适当抗原的结合和与无关抗原或抗原混合物的结合来测试抗体的结合特异性。如果抗体结合至适当抗原至少2、5、7优选10倍于无关抗原或抗原混合物，则认为它是特异的。在一个实施方式中，特异性抗体是仅结合TAA抗原但不结合至无关抗原的抗体。在另一个实施方式中，特异性抗体是结合人TAA抗原但不结合与TAA抗原氨基酸同源性为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的非人TAA抗原的抗体。在另一个实施方式中，特异性抗体是结合人TAA抗原但不结合与TAA抗原的氨基酸序列具有百分比相同性为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的非人TAA抗原的抗体。在另一个实施方式中，特异性抗体是结合人TAA抗原和结合鼠TAA抗原，但具有更高程度结合人抗原的抗体。在另一个实施方式中，特异性抗体是结合人TAA抗原和结合灵长类TAA抗原，但具有更高程度结合人抗原的抗体。在另一个实施方式中，特异性抗体是结合至人TAA抗原和任何非人TAA抗原，但具有更高程度结合人抗原或其任意组合的抗体。
如本文所用，“治疗”或“治疗性”和语法相关术语是指对疾病的任何后果的任何改善，例如延长生存期、降低发病率和/或减轻副作用，这些副作用是替代疗法的副产品；如本领域中容易理解的，完全根除疾病是优选的，但不是治疗行为的要求。
II.)抗体
在一些方面，所提供的融合蛋白(例如靶向掩蔽干扰素(IFN))和组合物，包含抗体或其抗原结合片段。在所提供的任意一些实施方式中，抗体结合(例如特异性结合、识别、靶向)抗原，所述抗原是与疾病或病症(例如癌症或免疫失调或疾病)相关的抗原，例如肿瘤相关抗原(TAA)。在一些方面，借助于与抗原(例如，TAA)的结合，所提供的融合蛋白(例如靶向掩蔽的IFN)可以靶向治疗的相关物理位置(例如癌症或肿瘤区域)。在一些方面，所述的抗体或其抗原结合片段可用作本文提供的任何融合蛋白的组分，例如，本文提供的任何靶向IFN、抗体-IFN融合蛋白或靶向掩蔽IFN中。
本发明的一个方面提供结合至与癌症或肿瘤相关的抗原，例如肿瘤相关抗原(TAA)和TAA-相关蛋白(参见表I)的抗体。在一个实施方式中，结合至TAA-相关蛋白的抗体是特异性结合至包含表1中列出的蛋白的氨基酸的TAA蛋白的抗体。例如，结合包含表I中列出的蛋白之一的氨基酸序列的TAA蛋白的抗体可以结合TAA-相关蛋白，例如TAA变体及其同源物或类似物。
在一些方面，结合至TAA或TAA-相关蛋白的抗体，例如所提供的实施方式的抗-TAA抗体特别适用于癌症，用于预后试验、成像、诊断和治疗方法。在一些方面，所提供的实施方式的抗体是治疗性抗体，例如特异性结合TAA(例如表I中列出的TAA)的治疗性抗体。类似的，这种抗体是有用的(例如，当与治疗剂组合时，在一种融合蛋白中，在癌症的治疗和/预后中，例如卵巢癌、头颈癌、多发性骨髓瘤和其他癌症，在这些其他癌症中达到TAA也表达或过度表达的程度。此外，所提供的实施方式的抗体，其包括细胞内表达的抗体(例如，单链抗体、)，可用于治疗涉及TAA表达的癌症，例如实体瘤中的晚期或转移性癌症或其他晚期或转移性癌症。在一个实施方式中，本文公开的TAA结合试验用于检测癌症，例如用于免疫测定。
在一些实施方式中，所提供的融合蛋白或组合物包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗体，例如选自表I中所列出的示例性TAA的TAA。在一些实施方式中，TAA是在肿瘤表面，例如肿瘤细胞或癌细胞表面上表达的抗原。在一些实施方式中，TAA包括与本文所述的任何疾病或病症(例如本文所述的任何癌症)相关的任何抗原。在一些实施方式中，TAA是在与肿瘤相关的细胞(例如存在于肿瘤微环境(TME)中的细胞)的表面上表达的抗原。在一些实施方式中，TAA是存在于TME中的抗原。
在一些实施方式中，所提供的融合蛋白或组合物包含结合与造血***中发生的肿瘤(例如血液恶性肿瘤)相关的肿瘤相关抗原的抗体。在一些实施方式中，所提供的融合蛋白或组合物包含结合至CD138抗原的抗体。在一些实施方式中，抗体结合至(例如特异性结合至)表I中列出的TAA之一。
在一些实施方式中，抗体包含或包含于融合蛋白。在一些实施方式中，抗体包含于本文提供的任何融合蛋白或组合物中。在一些实施方式中，抗体包含含有1型IFN的融合蛋白，例如表II中列出的I型IFN。在一些实施方式中，抗体包含融合蛋白，其进一步包含靶向IFN-α。在一些实施方式中，抗体包含融合蛋白，其进一步包含靶向掩蔽IFN-α。
在一些方面，抗体包含抗体片段，例如抗原结合抗体片段。抗体片段的示例包括但不限于：Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、单链抗体分子(例如单链Fv蛋白(“scFv”)、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、Fv、Fab’-SH、双抗体、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
用于制备抗体(例如单克隆抗体)的各种方法是本领域公知的。例如，可以通过使用分离或免疫偶联形式的TAA相关蛋白、肽或片段免疫合适的哺乳动物宿主来制备抗体(《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，CSH出版社，编著，Harlow，和Lane(1988)；Harlow，抗体(Antibodies)，冷泉港出版社，纽约(1989))。此外，还可以使用TAA的融合蛋白，例如TAA GST-融合蛋白。在一个具体实施方式中，制备包含图1的全部或大部分氨基酸序列的GST融合蛋白，然后用作免疫原以产生适当的抗体。在另一个实施方式中，TAA-相关蛋白被合成并用作免疫原。
此外，使用本领域已知的裸DNA免疫技术(有或没有纯化的TAA-相关蛋白或TAA表达细胞)以产生对编码免疫原的免疫反应(综述参见Donnelly等，1997，Ann.Rev.Immunol.15：617-648)。
表I中列出的TAA蛋白的氨基酸序列可以被分析以选择TAA蛋白的特定区域，例如作为免疫原或表位，用于产生抗体。例如，TAA氨基酸序列的疏水性和亲水性分析用于鉴定TAA结构中的亲水性区域。显示免疫原性结构的TAA蛋白区域以及其他区域和结构域，可以使用本领域已知的各种其他方法容易地鉴定，例如Chou-Fasman、Gamier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析。亲水性图(Hydrophilicityprofile)可以使用Hopp，T.P.和Woods K.R.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828的方法生成。亲水性分布图(Hydropathicity profile)可以使用Kyte，J.和Doolittle，R.F.，1982，J.Mol.Biol.157：105-132的方法生成。百分比(％)可及残基分布图可以使用Janin J.，1979，Nature 277：491-492的方法生成。平均柔性分布图可以使用Bhaskaran R.，Ponnuswamy P.K.，1988，Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255的方法生成。β-转角分布图可以使用Deleage，G.，Roux B.，1987，Protein Engineering 1：289-294的方法生成。因此，由任何这些程序或方法鉴定的每个区域都在本发明的范围内。通过本文提供的实施例进一步说明了产生TAA抗体的优选方法。制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法是本领域公知的。本领域还众所周知的是制备带有运载体的蛋白质的免疫原性偶联物的方法，例如BSA、KLH或其他运载体蛋白质。在某些情况下，使用例如使用碳二亚胺试剂直接偶联；在其他情况下，例如由皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)，(伊利诺伊州罗克服德)提供的连接剂，是有效的。如本领域所理解的，TAA免疫原的给予通常通过在合适的时间段内注射并使用合适的佐剂来进行。在免疫计划期间，可以测定抗体的效价以确定抗体形成的充分性。
TAA单克隆抗体可以通过本领域熟知的各种方式产生。例如，使用Kohler和Milstein的标准杂交瘤技术或使产生抗体的B细胞永生化的改良方法，制备分泌所需单克隆抗体的永生化细胞系，这是众所周知的。通过免疫测定筛选分泌所需抗体的永生化细胞系，其中抗原是TAA-相关蛋白。当鉴定了合适的永生化细胞培养物时，可以扩增细胞，并从体外培养物或腹水中产生抗体。
本发明的抗体或片段也可以通过重组方式产生。也可以在多物种来源的嵌合或互补决定区(CDR)移植抗体的背景下生产与TAA蛋白的所需区域特异性结合的区域。也可以生产人源化或人TAA抗体，并优选用于治疗情况中。通过将一个或多个非人抗体CDR取代为相对应的人抗体序列，人源化鼠和其他非人抗体的方法是众所周知的(参见例如，Jones等，1986，Nature 321：522-525；Riechmann等，1988，Nature 332：323-327；Verhoeyen等，1988，Science 239：1534-1536)。还参见，Carter等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285和Sims等，1993，J.Immunol.151：2296。
在一个实施方式中，可以使用VelocImmune小鼠制备本发明的人单克隆抗体，其中在免疫球蛋白重链(VH、DH和JH区段)和/或κ轻链(VK和JK)基因座处带有内源性小鼠可变区段的基因组序列已全部或部分被人类基因组序列替换，其中人类免疫球蛋白重链(VH、DH和JH)和/或κ轻链(VK和JK)基因座(Regeneron，Tarrytown，N.Y.)带有未重排的种系可变区段。参见，例如，美国专利号6,586,251、6,596,541、7,105,348、6,528,313、6,638,768和6,528,314。
此外，本发明的人抗体可以使用HuMAb小鼠(Medarex，Inc.)产生，该小鼠包含人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，其编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及灭活内源μ和κ链基因座的靶向突变(参见例如，Lonberg，等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。
在另一个实施方式中，本发明的全人抗体可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠产生，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠。这种小鼠在本文中称为“KM小鼠”，这种小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727和Tomizuka，等人的PCT公开号WO 02/43478中有所描述。
本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法是本领域中已经建立的。参见例如：美国专利号5,223,409；5,403,484；和Ladner等人的美国专利号5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
本发明的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠来制备，其中的人免疫细胞已经被重构为使得在免疫时可以产生人抗体反应。这种小鼠描述于，例如，Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767。
此外，本发明的人抗体可以使用转基因小鼠的技术制备，灭活用于抗体生产，用人重链和轻链基因座工程化改造的被称为转基因鼠(Xenomouse)(安进公司(Amgen Fremont，Inc.)，原称Abgenix公司)。制备产生人抗体的转基因小鼠的示例性描述可以在美国专利号6,657,103中找到。还参见美国专利号5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；和5,545,806；和Mendez，等Nature Genetics，15：146-156(1998)；Kellerman，S.A.和Green，L..L.，Curr.Opin.Biotechnol 13，593-597(2002)。
上述任何生产方法产生的抗体具有一定的结合TAA，或同源物、或片段、或具有与TAA的85、90、91、92、93、94、95、96、9、98或99％序列相同性的多肽序列的能力。抗体、其结合片段以及包含其的抗体药物偶联物对TAA的结合亲和力(KD)可以是1mM或更少、100nM或更少、10nM或更少、2nM或更少或1nM或更少。或者，KD可以是5和10nM之间；或1和2nM之间。KD可以是1微摩尔和500微摩尔之间或500微摩尔和1nM之间。
抗原结合蛋白的结合亲和力通过缔合常数(Ka)和解离常数(Kd)确定(KD＝Kd/Ka)。结合亲和力可以通过BIACORE测量，例如，通过测试抗体捕获到包被蛋白A的传感器表面上并使TAA流过该表面。或者，结合亲和力可以通过FORTEBIO测量，例如，测试抗体受体被捕获到包被蛋白A的针上并使TAA流过该表面。本领域技术人员可以鉴定本领域已知的其他适合测量结合亲和力的试验。
术语“特异性结合”，如本文所用与TAA抗原结合相关，蛋白质是指结合至TAA以及TAA内的离散结构域或离散氨基酸序列的抗原结合蛋白，与其他(例如，不相关的)蛋白质没有或无显著结合。然而，该术语不排除抗体或其结合片段也可能与密切相关的分子交叉反应的事实。抗体及其片段以及包含本文所述的这些的融合蛋白可以特异性结合至TAA，其亲和力比它们与密切相关的分子结合的亲和力大至少2、5、10、50、100或1000倍。
一方面，本发明包括结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。
另一方面，本发明包括结合与实体癌肿瘤相关的肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。
另一方面，本发明包括结合与在造血***中产生的肿瘤相关的肿瘤相关抗原的抗体。
另一方面，本发明包括结合至CD138抗原的抗体。
另一方面，本发明包括结合至CD20抗原的抗体。
另一方面，本发明包括结合至间皮素抗原的抗体。
另一方面，本发明包括结合至5T4抗原的抗体。
另一方面，本发明包括结合至PSCA抗原的抗体。
另一方面，抗体包括融合蛋白。
另一方面，抗体包括含有表II中列出的1型IFN的融合蛋白。
另一方面，抗体包括融合蛋白，进一步包含靶向IFN-α。
另一方面，抗体包括融合蛋白，进一步包含靶向掩蔽IFN-α。
另一方面，本发明包括结合CD138的抗体，其进一步包含具有以下序列的重链：
Figure BDA0003412867230000201
另一方面，本发明包括结合CD138的抗体，其进一步包含具有以下序列的重链：
Figure BDA0003412867230000202
Figure BDA0003412867230000211
III.)一种或多种干扰素
在一些实施方式中，所提供的融合蛋白(例如靶向干扰素(IFN)，例如靶向掩蔽IFN)和组合物，包含干扰素(IFN)或其变体组分。在一些实施方式中，还提供了靶向掩蔽IFN，例如与抗体或其片段或链融合的I型IFN，和“干扰素掩蔽”。
在一些实施方式中，提供了融合蛋白，其包含干扰素(IFN)或其变体，以及特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗体或其抗原结合片段，例如抗体-IFN融合蛋白或靶向干扰素。在一些方面，IFN是本文所述的任何类型的IFN。在特定方面，所提供实施方式中的示例性IFN包括I型IFN，I型IFN包括任何已知的I型IFN和本文所述的任何I型IFN，例如表II中列出的那些。融合蛋白中的示例性抗体包括任何本文所述的，例如部分II或表I中描述的。在任意一些实施方式中，提供附接到或连接至“掩蔽”的干扰素(IFN)或其变体，例如阻断细胞因子相互作用和/或干扰素α受体(IFNAR)激活的肽或蛋白质；在某些情况下也称为干扰素掩蔽。在一些方面，提供了掩蔽IFN。在一些方面，所提供掩蔽IFN中的示例性IFN包括I型IFN，I型IFN包括任何已知的I型IFN和本文所述的任何I型IFN，例如表II中列出的那些。用于掩蔽干扰素的示例性掩蔽和方法包括任何本文中所述的，例如，在部分IV中。在一些实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含含有选自表II中IFN的IFN组分的“掩蔽的”IFN。
在一些方面，IFN是用于疾病或病症的治疗或疗法的蛋白质。在一些方面，所提供的融合蛋白和组合物包含能有效治疗疾病或病症(例如癌症或肿瘤)的IFN组分，和/或能用于增加治疗剂有效性的，例如抗癌或抗肿瘤剂。
IFN是一组信号转导蛋白，由对象或宿主的细胞(例如宿主细胞)响应于体内外来实体(例如病原体，包括几种病毒)的存在而产生和释放。在典型的情况下，被病毒感染的细胞会释放干扰素，导致附近的细胞增强其抗病毒防御能力。
干扰素属于被称为细胞因子的一大类蛋白质，这些分子用于细胞之间的通讯，以触发免疫***的保护性防御，帮助消灭病原体。干扰素因其通过保护细胞免受病毒感染而“干扰”病毒复制的能力而得名。在某些方面，IFN还具有多种其他功能：(i)它们激活免疫细胞，例如自然杀伤细胞和巨噬细胞；以及(ii)它们通过增加主要组织相容性复合体(MHC)抗原的表达来上调抗原呈递，从而增加宿主防御。
已经在包括人类在内的动物中鉴定了超过二十(20)种不同的IFN基因和蛋白质。它们通常被分为三类：I型IFN、II型IFN和III型IFN。属于所有三类的IFN对于对抗病毒感染和调节免疫***都很重要。
I型干扰素：所有I型IFN都与称为IFN-α/β受体(IFNAR)的特定细胞表面受体复合物结合，该复合物由IFNAR1和IFNAR2链组成。人类中存在十三种(13)I型干扰素，包括但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω。通常，当身体识别出入侵它的病毒时，产生I型干扰素。它们由成纤维细胞和单核细胞产生。然而，I型IFN-α的产生被另一种称为白细胞介素-10的细胞因子所阻止。一旦释放，I型干扰素结合至靶细胞上的特定受体，从而导致蛋白质表达，从而阻止病毒产生和复制其RNA和DNA。
II型干扰素(人类中的IFN-γ)：这也称为免疫干扰素，由白细胞介素-12激活。此外，II型干扰素由细胞毒性T细胞和T辅助细胞(特别是I型)释放。然而，它们会阻止二型T辅助细胞的增殖。前者导致Th2免疫反应的抑制和Th1免疫反应的进一步诱导，从而导致衰弱性疾病的发展，例如多发性硬化症。II型IFN结合至由IFNGR1和IFNGR2链组成的IFNGR。
III型干扰素：通过由IL10R2(也称为CRF2-4)和IFNLR1(也称为CRF2-12)组成的受体复合物信号转导。最近的信息证明了III型IFN在一些类型的病毒或真菌感染中的重要性。
一般来说，I型和II型干扰素负责调控和激活免疫反应。通过细胞质和内体受体识别病毒组分(尤其是核酸)可以在几乎所有细胞类型中诱导I型和III型干扰素的表达，而II型干扰素由细胞因子(如IL-12)诱导，其表达受限于免疫细胞，如T细胞和NK细胞。
在一些方面，IFN和含有或源自IFN的蛋白质可用作治疗剂。在所提供的任意一些实施方式中，融合蛋白的IFN组分，例如靶向掩蔽的IFN，用作治疗疾病或病症(例如癌症)的治疗剂。
在某些方面，干扰素疗法(与化学疗法和放射疗法结合)用作某些癌症的治疗方法。这种治疗可用于血液***恶性肿瘤；白血病和淋巴瘤，包括毛细胞白血病、慢性髓性白血病、结节性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。在某些情况下，复发性黑色素瘤患者接受重组IFN-α2b。
在癌症治疗中使用可用的IFN的主要限制是无法在肿瘤部位达到IFN有效浓度而不引起全身毒性。为了克服这一限制，已经进行了一些尝试以解决这个问题，通过使用单克隆抗体的肿瘤靶向能力将IFN直接运载到肿瘤部位。参见，Huang，等，J.Immunol.179(10)，第6881-6888页(2007)和Vasuthasawat，等，J.Immunol.36(5)，第305-318页(2013)。应注意，最初的工作是使用抗-CD20-IFNα2蛋白将IFNα靶向到淋巴瘤上表达的CD20，和使用抗-CD138-IFNα2融合蛋白靶向多发性骨髓瘤上表达的CD138。参见，Vasuthasawat，等MAbs 8(7)，第1386-1397页(2016)。虽然这些方法已显示出巨大的治疗前景，目前正在人体临床试验中进行测试并进行商业开发，但这些可用的方法仍存在一些缺陷。
虽然与单独注射IFN时的效果相比，使用特异性结合以靶向肿瘤相关抗原的抗体递送了更高百分比的IFN到肿瘤部位，但附接的干扰素仍被全身细胞(例如与肿瘤细胞无关的或正常细胞)表达的干扰素受体识别并结合。这种结合会导致更少的干扰素到达肿瘤，和不期望的脱靶毒性。提供了克服这种限制和缺陷的实施方式。
因此，本发明的一个目的是通过提供在IFN到达疾病或病症(例如肿瘤)的治疗相关位置或区域之前“掩蔽”IFN的功能或活性的机制来克服这些限制。那时，IFN被“去掩蔽”且活性和功能有效地重新开启。因此，在一些实施方式中，提供了融合蛋白，例如靶向掩蔽的IFN，其仅在治疗效果的目标位置(例如肿瘤处)“去掩蔽”或“被激活”。在一些方面，通常在身体的其他部分(例如全身循环中)对IFN的功能或活性的掩蔽可以降低或防止IFN的非特异性活性，并且还可以降低或防止治疗剂(例如IFN)被体内的非癌细胞或非肿瘤细胞捕获或吸收。在一些方面，借助于提供的实施方式中存在的抗体，掩蔽IFN的功能或活性并靶向IFN到目标位置(例如到肿瘤)，可以有效地增加治疗剂(例如IFN)的浓度，例如通过防止IFN结合至和/或被捕获于抗体特异性靶向药剂。
因此，在一些实施方式中，本发明包括抗体-IFN融合蛋白，其中IFN到达肿瘤后将会选择性结合IFN受体。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含被作为蛋白水解裂解位点的肽接头分隔的IFN。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含“掩蔽的”IFN。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含被作为蛋白水解裂解位点的肽接头分隔的“掩蔽的”IFN。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含“掩蔽的”IFNA1。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含被作为蛋白水解裂解位点的肽接头分隔的“掩蔽的”IFNA1。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含“掩蔽的”IFNA2。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含被作为蛋白水解裂解位点的肽接头分隔的“掩蔽的”IFNA2。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含“掩蔽的”IFNB1。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含被作为蛋白水解裂解位点的肽接头分隔的“掩蔽的”IFNB1。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含选自表II中列出的IFN的“掩蔽的”IFN。
在另一个实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含被作为蛋白水解裂解位点的肽接头分隔，且选自表II列出的IFN的“掩蔽的”IFN。
另一方面，抗体-IFN融合蛋白包含含有以下的IFNα2：
Figure BDA0003412867230000241
IV.)掩蔽IFN的方法
如前所述，本发明的一个目的是提供靶向掩蔽IFN组合物，由此抑制本发明的IFN(参见表II)的活性，直到它到达肿瘤并被蛋白酶(例如肿瘤相关蛋白酶)去掩蔽。在一些方面，所提供的掩蔽IFN(例如靶向掩蔽IFN)在待治疗的疾病或病症的位置处或附近(例如在肿瘤处或附近，例如肿瘤微环境处)“去掩蔽”，并且变得能够结合和/或激活干扰素受体(例如，IFNAR)。在一些方面，所提供的融合蛋白的去掩蔽或活化是通过肿瘤环境中的蛋白质(例如肿瘤相关蛋白酶)对组分(例如肽接头)的裂解而发生的。
(a)可用方法的讨论。
与此努力相关的可用方法是有限的。本公开提供了对可用方法的解释，以进一步证明和展示本发明的技术优势。改善治疗剂的肿瘤特异性递送的先前方法是创建被肿瘤相关蛋白酶激活的治疗剂。这种方法的一个例子是采用识别肿瘤相关抗原但其功效有限的抗体，因为它们也识别存在于正常细胞上的抗原，并修饰它们使得它们仅在定位于靶肿瘤时才与抗原结合。参见，美国8,563,269(CytomX治疗公司(CytomX Therapeutics)，加利福尼亚州旧金山)。所谓的“前抗体(Probody)”具有阻断抗体结合位点的相关肽，该结合位点由可被肿瘤微环境中存在的蛋白酶切割的接头接合。在一种情况中，生产了表皮生长因子受体(EGFR)的特异性抗体CETUXIMAB，它只有在定位到肿瘤时才会被激活以结合。参见，Desnoyers，等，Sci.Transl.Med.，16：5(207)第207页ra144(2013)。在该″前抗体″中，结合CETUXIMAB可变区的掩蔽序列后接GS-接头，然后将序列LSGRSDNHGSSGT(SEQ ID NO：8)附接至抗体重链的氨基末端。在这种情况下，下划线的序列是UPA和间质蛋白酶的底物，已知蛋白酶在多种人癌症中上调，在正常组织中活性最低。据证该前抗体在非人灵长类动物中表现出改进的安全性和增加的半衰期。
除了在肿瘤微环境中产生抗体结合激活的前抗体之外，还可能产生蛋白酶激活的干扰素α前蛋白。参见，美国8,399,219(CytomX治疗公司(CytomX Therapeutics)，加利福尼亚州旧金山)。在该情况下，用于IFN-αTDVDYYREWSWTQVS(SEQ ID NO：9)的肽掩蔽被置于单链重组IFNα的氨基末端，通过可裂解序列与IFNα分隔开。所得构建体：GQSGQ
IDVDYYREWSETQVS GSSGGS VHMPLGFLGP GGS(SEQID NO：10)IFNα含有在肿瘤微环境中选择性激活的IFNα。据教导，VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：11)是MMP-9的底物。
(b)掩蔽本公开的IFN的方法
所提供的包括掩蔽IFN和靶向掩蔽IFN的融合蛋白能够在疾病或病症的位置处或附近被去掩蔽。综上所述，掩蔽本公开的IFN的方法是明显可区分的，并且提供了优于任何可用方法的优势。
例如，如上所述，所提供的实施方式包括在IFN到达与疾病或病症(例如肿瘤)的治疗相关位置或区域之前“掩蔽”IFN的功能或活性的机制，以及借助于融合至IFN的TAA-特异性抗体将融合蛋白特异性物理靶向肿瘤位置。因此，本文所述的融合蛋白提供了多种优势，包括但不限于，IFN仅在治疗效果的目标位置(例如肿瘤)处“去掩蔽”或“激活”；IFN的非特异性活性降低；防止IFN被体内的非癌细胞或非肿瘤细胞捕获或吸收；和/或有效地增加治疗剂(例如，IFN)的浓度而不增加毒性。
在任意一些实施方式中，所提供的融合蛋白，例如靶向掩蔽IFN，仅在疾病或病症(例如肿瘤)的位点处或附近被去掩蔽。因此，在一些实施方式中，本发明包括抗体-IFN融合蛋白，其中IFN到达肿瘤的位置或区域后将会选择性结合IFN受体。
在一些实施方式中，抗体-IFN融合蛋白包含被作为蛋白水解裂解位点的肽接头分隔的IFN。在一些方面，肽接头的蛋白水解裂解可以“去掩蔽”或激活(例如在肿瘤处或肿瘤附近的)IFN。
如本公开中所述，所提供的实施方式包括抗体-IFN，其中诸如本文第III部分或表II中所述的那些IFN被融合至本文(例如第II部分或表I中)所述的抗体。然后IFN被“掩蔽”，使得它将在肿瘤处变得活跃并结合其受体。在未裂解状态下，理想的肽掩蔽抑制蛋白质(例如IFN)结合至其结合伴侣(例如，干扰素受体，如IFNAR)，而在裂解之后，肽掩蔽不抑制蛋白质结合至其结合伴侣。在本文提供的实施方式中，例如在肿瘤部位处或附近的“掩蔽”的裂解允许I型IFN结合至其受体(例如IFNAR)，并发挥其治疗作用。
下面描述了示例性实施方式：
首先，使用IFNα2，并在融合至CH3的3’末端处放置了蛋白酶裂解位点和抑制IFN结合的“掩蔽”。本公开内容预期，在肿瘤部位，肿瘤微环境内的蛋白酶将裂解蛋白酶裂解位点，释放掩蔽并释放IFN以使其能够结合至其受体。
获得了用于构建具有蛋白酶裂解位点和IFN抑制掩蔽的重组重链的核酸(ATUM，加利福尼亚州纽华克)，并用于修饰抗-CD138-IFNα2的重链(H链)，方法如下：在3’端融合：
Figure BDA0003412867230000271
单下划线表示IFNα2的羧基末端，双下划线表示蛋白酶裂解位点的序列，虚线下划线表示IFNα2掩蔽。接头序列显示为小写。
在另一个实施方式中，构建体包含：
Figure BDA0003412867230000272
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000273
Figure BDA0003412867230000274
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000275
Figure BDA0003412867230000276
且进一步包括IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000277
Figure BDA0003412867230000278
且进一步包括IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000279
Figure BDA00034128672300002717
且进一步包括IFNα4。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002710
Figure BDA00034128672300002718
且进一步包括IFNα5。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002711
Figure BDA00034128672300002712
且进一步包括融合至结合CD138的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002713
Figure BDA00034128672300002714
且进一步包括融合至结合CD20的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002715
Figure BDA00034128672300002716
且进一步包括融合至结合Her2的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000281
Figure BDA0003412867230000282
且进一步包括融合至结合CSPG4的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000283
且进一步包括融合至结合PSCA的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000284
Figure BDA0003412867230000285
且进一步包括融合至结合CEA的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000286
Figure BDA0003412867230000287
且进一步包括融合至结合RCC的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000288
Figure BDA0003412867230000289
且进一步包括融合至结合5T4的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002810
Figure BDA00034128672300002811
且进一步包括融合至结合间皮素的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002812
Figure BDA00034128672300002813
且进一步包括融合至结合CD138的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002814
Figure BDA00034128672300002815
且进一步包括融合至结合CD20的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002816
Figure BDA00034128672300002817
且进一步包括融合至结合Her2的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002818
Figure BDA00034128672300002819
且进一步包括融合至结合CSPG4的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002820
Figure BDA00034128672300002821
且进一步包括融合至结合PSCA的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002822
Figure BDA00034128672300002823
且进一步包括融合至结合CEA的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002824
Figure BDA00034128672300002825
且进一步包括融合至结合RCC的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002826
Figure BDA00034128672300002827
且进一步包括融合至结合5T4的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000291
Figure BDA0003412867230000292
且进一步包括融合至结合间皮素的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000293
Figure BDA0003412867230000294
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000295
Figure BDA0003412867230000296
且进一步包括IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000297
Figure BDA0003412867230000298
且进一步包括IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000299
Figure BDA00034128672300002910
且进一步包括IFNα4。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002911
Figure BDA00034128672300002912
且进一步包括IFNα5。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002913
Figure BDA00034128672300002914
且进一步包括融合至结合CD138的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002915
Figure BDA00034128672300002916
且进一步包括融合至结合CD20的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002917
Figure BDA00034128672300002918
且进一步包括融合至结合Her2的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002919
Figure BDA00034128672300002920
且进一步包括融合至结合CSPG4的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002921
Figure BDA00034128672300002922
且进一步包括融合至结合PSCA的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002923
Figure BDA00034128672300002924
且进一步包括融合至结合CEA的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002929
Figure BDA00034128672300002925
且进一步包括融合至结合RCC的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002926
Figure BDA00034128672300002927
且进一步包括融合至结合5T4的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300002928
Figure BDA00034128672300003016
且进一步包括融合至结合间皮素的抗体的IFNα1。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000301
Figure BDA00034128672300003017
且进一步包括融合至结合CD138的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000302
Figure BDA00034128672300003018
且进一步包括融合至结合CD20的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000303
Figure BDA0003412867230000304
且进一步包括融合至结合Her2的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000305
Figure BDA0003412867230000306
且进一步包括融合至结合CSPG4的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000307
Figure BDA0003412867230000308
且进一步包括融合至结合PSCA的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA0003412867230000309
Figure BDA00034128672300003010
且进一步包括融合至结合CEA的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300003011
Figure BDA00034128672300003012
且进一步包括融合至结合RCC的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300003013
Figure BDA00034128672300003019
且进一步包括融合至结合5T4的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括：
Figure BDA00034128672300003014
Figure BDA00034128672300003015
且进一步包括融合至结合间皮素的抗体的IFNα2。
在一个实施方式中，“掩蔽的”IFN包括中和scFv，其也充当掩蔽物(如本公开内容的上下文中所定义)以提供掩蔽IFNAR的协同能力。
出于多种原因，所得到的实施方式，例如靶向掩蔽IFN，提供了优于现有技术的独特优势。首先，IFN被掩蔽，使其活性显著降低和/或消除，直到它到达肿瘤。此时，掩蔽被去除，活性被重新激活，从而最大化在肿瘤中的功效。其次，通过将C-末端连接的掩蔽IFN附接到抗体的C-末端，掩蔽IFN可以被靶向特定的TAA。特异性靶向允许IFN有更大的机会被引导至感兴趣的癌而避开正常组织。
本公开涵盖所得靶向掩蔽IFN的一般实施方式，包括但不限于以下：
首先，如本文所示的组合物：
(i)抗体-接头-细胞因子(例如IFN)-接头-蛋白酶裂解(PC)位点-接头-掩蔽；和
第二，如本文所示的组合物：
(ii)抗体-接头-PC裂解位点-接头-细胞因子(例如IFN)
应理解，本领域技术人员将理解并明白(ii)中列出的组合物具有抗体的附加特性，其通过组合物中存在的细胞因子的空间位阻发挥作为部分掩蔽的作用。
在一些实施方式中，蛋白酶裂解位点是肿瘤相关蛋白酶裂解位点。本文提供的“肿瘤相关蛋白酶裂解位点”是被蛋白酶识别的氨基酸序列，其表达对肿瘤细胞或其肿瘤细胞环境具有特异性。在一些实施方式中，示例性蛋白酶裂解位点包括肿瘤相关蛋白酶裂解位点，例如基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点、含有解整合素和金属蛋白酶结构域(ADAM)的金属蛋白酶裂解位点、***特异性抗原(PSA)蛋白酶裂解位点、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白酶裂解位点、膜型丝氨酸蛋白酶1(MT-SP1)蛋白酶裂解位点、间质蛋白酶蛋白酶裂解位点(ST14)或豆荚蛋白蛋白酶裂解位点。在一些方面，蛋白酶裂解位点可由特定氨基酸序列指定。
V.)表达肿瘤相关拉原(TAA)的一种或多种癌症的治疗
本文还提供了融合蛋白，例如靶向掩蔽IFN或组合物，其可用于多种治疗、诊断和预防方法和用途。例如，融合蛋白和组合物可用于治疗对象的多种疾病和病症，例如癌症或肿瘤。这种方法和用途包括治疗方法和用途，例如，涉及将融合蛋白或组合物给予患有疾病或病症(例如肿瘤或癌症)的对象。在一些实施方式中，以有效量给予融合蛋白或组合物以实现疾病或病症的治疗。用途包括融合蛋白或组合物在这种方法和治疗中的用途，以及用于制备药物以实施这种治疗方法的用途。在一些实施方式中，融合蛋白或组合物用于治疗对象的多种疾病和病症，例如，根据治疗方法。在一些实施方式中，所述方法通过将融合蛋白或组合物给予患有或怀疑患有疾病或病症(如肿瘤或癌症)对象来实施。在一些实施方式中，该方法由此治疗对象的疾病或病症。
在一些方面，所提供的融合蛋白(例如靶向掩蔽IFN)用于治疗疾病或病症(例如肿瘤或癌症，包括表达肿瘤相关抗原(TAA)的那些)的方法或用途。本公开的TAA的鉴定为通常在一组受限的组织或细胞中表达但也在癌症(例如实体肿瘤癌)中表达的蛋白质，开启了利用本文公开的掩蔽融合蛋白治疗此类癌症的多种治疗方法。
值得注意的是，即使当靶向蛋白质在正常组织或细胞，甚至重要的正常器官组织上表达，靶向抗肿瘤疗法也是有用的。重要器官是维持生命所必需的器官，例如心脏或结肠。非必要器官是可以被去除，然后个体仍能存活的器官。非必要器官的例子为卵巢、***和***。
靶蛋白在正常组织(甚至是重要正常组织)中的表达不会破坏该蛋白的靶向药剂作为某些也过度表达该蛋白的肿瘤的治疗剂的效用。例如，在重要器官中的表达本身并不是有害的。此外，被视为非必要的器官(例如***和卵巢)可以在不影响死亡率的情况下被去除。最后，一些重要器官由于免疫豁免而不受正常器官表达影响。免疫豁免器官是指由血-器官屏障保护而免受血液影响的器官，因此是免疫治疗不可及的。免疫豁免器官的例子是大脑和睾丸。
因此，抑制包含本发明的靶向掩蔽IFN融合蛋白的TAA蛋白的活性的治疗方法，用于患有表达TAA的癌的患者(例如，在肺、肾、***、卵巢、乳腺和本领域已知其他类型的癌症中有实体瘤癌)。治疗方法涉及IFNA诱导杀伤(例如，当在目的肿瘤中“掩蔽”被去除且IFN被重新激活时)、ADCC、CDC和/或免疫调节。此外，结合TAA的抗体还可以协同调节癌细胞的功能。此外，进一步地，借助于IFN结合至干扰素受体(例如IFNAR)，“去掩蔽”的或激活的IFN可以调节参与抗肿瘤或抗癌免疫的免疫细胞的活性。结合TAA的抗体的调节通常分为两类。第一类调节TAA功能，因为它与肿瘤细胞生长有关，导致抑制或阻滞肿瘤细胞生长或诱导其杀伤。第二类包括用于抑制TAA蛋白质与其结合伴侣或其他蛋白质的结合或缔合的各种方法。
因此，可以评估癌症患者的TAA表达的存在和水平，优选使用肿瘤组织的免疫组织化学评估、定量TAA成像或其他可靠地指示TAA表达的存在和程度的技术。如果适用，肿瘤活检或手术标本的免疫组织化学分析对此是优选的。肿瘤组织的免疫组织化学分析方法是本领域熟知的。
VI..)靶向掩蔽IFN融合蛋白混合物
本发明的治疗方法涵盖了给予单一靶向掩蔽IFN融合蛋白以及与不同单克隆抗体的组合或混合物(cocktail)(即与掩蔽IFN融合蛋白结合相同TAA的裸单克隆抗体或结合另一种蛋白的单克隆抗体或完全结合另一种TAA的另一种靶向掩蔽IFN融合蛋白)。这种单克隆抗体混合物具有某些优势，因为它们包含靶向不同表位、利用不同效应物机制的单克隆抗体或将细胞毒性单克隆抗体与依赖于免疫效应物功能的单克隆抗体直接组合。这种组合的单克隆抗体以表现出协同治疗效果。此外，靶向掩蔽IFN融合蛋白可以与其他治疗方式同时给予，包括但不限于：各种化疗剂和生物制剂、雄激素阻断剂、免疫调节剂(例如IL-2、GM-CSF)、手术或放射。在优选的实施方式中，靶向掩蔽IFN以融合蛋白的形式给予。
靶向掩蔽IFN融合蛋白制剂可通过任何能够将抗体递送至肿瘤细胞的途径给予。给予途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮内等。治疗通常涉及靶向掩蔽IFN融合蛋白制剂的重复给药，通过可接受的给药途径，例如静脉内注射(IV)，通常的剂量范围包括但不限于：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg/kg体重。通常，每周10-1000mg范围剂量的靶向掩蔽IFN融合蛋白是有效且耐受良好的。
基于
Figure BDA0003412867230000331
(曲妥珠单抗)在治疗转移性乳腺癌的临床经验，初始负荷剂量为约4mg/kg患者体重IV，之后每周剂量约2mg/kg IV的单克隆抗体制剂，代表可接受的给药方案。优选地，初始负荷剂量以90分钟或更长时间的输注给予。初始剂量耐受良好的前提下，周期性的维持剂量以30分钟或更长时间的输注给予。正如本领域技术人员所理解的，各种因素会影响特定情况下的理想剂量方案。这些因素包括，例如，所使用的TAA单克隆抗体的结合亲和力和半衰期，患者中TAA表达的程度，循环中脱落的TAA抗原的背景，所需的稳态抗体浓度水平，治疗频率，以及与本发明的治疗方法(即靶向掩蔽IFN)组合使用的化疗或其他药物的影响，以及特定患者的健康状况。
可选地，患者应当被评估给定样品的TAA水平(例如循环TAA和/或TAA表达细胞的水平)以协助确定最有效的给药方案，等等。在整个治疗过程中，这种评估也用于监测目的，并结合其他参数的评估(例如，膀胱癌治疗中的尿细胞学和/或免疫细胞(ImmunoCyt)水平，或类似的，***癌治疗中的血清PSA水平)，可用于评估治疗的成功。
本发明的目的是提供靶向掩蔽IFN融合蛋白，其抑制或阻滞表达融合蛋白结合的特定TAA的肿瘤细胞的生长。本发明的另一个目的是提供抑制血管生成和其他生物学功能从而减少哺乳动物(优选人)的肿瘤生长的方法，使用这种包含结合TAA的融合蛋白的靶向掩蔽IFN，特别是使用这种包含发现特定TAA与其他药物或免疫活性治疗组合的融合蛋白的靶向掩蔽IFN。
VII.)组合疗法
在一些实施方式中，还提供了涉及组合疗法的方法和用途，例如，涉及任何所提供的融合蛋白或组合物，以及其他治疗剂，例如化疗药或放射的用途。在一些实施方式中，所提供的融合蛋白或组合物可以与其他治疗剂的组合使用，用于治疗疾病或病症，例如抗癌或抗肿瘤剂。
在一些实施方式中，当肿瘤(包括人肿瘤)用结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白联同其他治疗剂(例如化疗药、放疗、免疫调节疗法或其任意组合)治疗时，存在协同作用。换言之，当与化疗药或放射或其组合组合使用时，结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白对肿瘤生长的抑制被超出预期地增强了。协同作用可以通过，例如，通过用组合疗法对肿瘤生长的抑制比仅用结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白治疗，或用结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白和化疗药或放射治疗的累加效应所预期的更强所显示。优选地，协同作用通过癌症的缓解来证明，这种缓解既不能期望从治疗获得，也不能从结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白或使用结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白和化学治疗剂或辐射的累加组合获得。
使用结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白和化疗、放疗或免疫调节疗法的组合，或其中任意一种、两种或三种的组合来抑制肿瘤细胞生长的方法，包括在开始化疗或放疗之前、期间或之后给予结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白，以及其任何组合(即开始化疗和/或放疗之前和期间、之前和之后、期间和之后，或之前、期间和之后)。例如，结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白通常在开始放射疗法和/或化学疗法之前1至60天、优选3至40天、更优选5至12天给予。然而，取决于治疗方案和特定患者的需求，该方法以提供最有效治疗并最终延长患者生命的方式进行。
化疗剂的给予可以多种方式完成，包括通过肠胃外和肠内途径全身给药。在一个实施方式中，结合特定TAA的靶向掩蔽的IFN融合蛋白和化疗药作为分开的分子给予。化疗剂或化疗的具体示例包括硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲菌素、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、柔红霉素、丝裂霉素、阿糖孢苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、卡培他滨(紫杉醇)、多西他赛(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链脲佐菌素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替哌、尿嘧啶芥、长春瑞滨、吉西他滨、苯丁酸氮芥、紫杉醇和其组合。
与结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白组合使用的辐射源可以在正在治疗的患者的外部或内部。当该源在患者外部时，这种疗法称为外照射放射疗法(EBRT)。当该辐射源在患者内部时，这种治疗称为近距离放射治疗(BT)。
上述治疗方案可以进一步与另外的癌症治疗剂和/或方案组合，例如，硼替佐米、泊马度胺和/或其它化疗，癌症疫苗，信号转导抑制剂，能够用于治疗异常细胞生长或癌症的试剂，抗体(例如抗-CTLA-4抗体，如WO/2005/092380(辉瑞公司(Pfizer))中所述)或通过接合IGF-1R和细胞因子来抑制肿瘤生长的其他配体。
用于癌症治疗的免疫调节疗法的实例包括但不限于抗-(CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIGIT、LAG3、T1B7-H3、B7-H4)和本领域已知的其他疗法。
当哺乳动物接受其它化疗时，可以使用上述化疗剂。此外，可以使用生长因子抑制剂，生物学反应调节剂，抗激素疗法，选择性***受体调节剂(SERM)，血管生成抑制剂和抗雄激素。例如，可以使用抗激素，例如抗***，如诺瓦得士(Nolvadex)(他莫昔芬)或抗雄激素如康士得(Casodex)(4′-氰基-3-(4-氟苯基磺酰基)-2-羟基-2-甲基-3-′-(三氟甲基)丙酰苯胺)。
上述治疗方法可以与多种手术、化学疗法或放射疗法方案中的任一种组合。本发明的治疗方法能够使用减少剂量的化学疗法(或其他疗法)和/或较低频率的给药，这对所有患者，特别是对不能很好耐受化学治疗剂毒性的患者是有利的。
VIII.)试剂盒/生产制品
为了在实验室中使用，本文所述的预后、预防、诊断和治疗应用，试剂盒、生产制品、***和设备均在本发明的范围内。这类试剂盒包含运载体、包装或容器，其经分隔可容纳一个或多个容器例如小瓶、管等，一个或多个容器中的每个包含一种用于本文所述方法的单独元件，以及包含使用(例如本文所述的使用)说明的标签或插页。例如，一个或多个容器可包含结合本公开的特定TAA或几个TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白。试剂盒可包含含有靶向掩蔽IFN的容器。试剂盒可包含全部或部分的结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白，和/或用于检测癌症和/或其他免疫失调的诊断分析。
本发明的试剂盒通常包含上述容器和一个或多个与其相关的其他容器，这些容器包含从商业和用户角度来看所需的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器；运载体、包装、容器、小瓶和/或列出内容物和/或使用说明的管标签，以及带有使用说明的包装插页。
标签可以存在于容器上或与容器一起存在以表明该组合物用于特定治疗或非治疗性应用，例如预后、预防、诊断或实验室应用，并且还可以指示用于体内或体外的使用说明，例如本文所述的那些用途。说明和或其他信息也可以包含在试剂盒内或试剂盒上的一个或多个插页或一个或多个标签上。标签可以在容器上或与容器相关联。当形成标签的字母、数字或其他字符被模制或蚀刻到容器本身时，标签可以位于容器上；当它存在于也容纳有容器的受器(receptacle)或运载体内时，标签可以是与容器相关联的，例如作为包装插页。标签可以表明该组合物用于诊断、治疗、预防或预后病情，例如癌症或其他免疫失调。
术语“试剂盒”和“生产制品”可用作同义词。
在本发明的另一个实施方式中，一种或多种生产制品包含组合物，例如本公开的结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白。生产制品通常包含至少一个容器和至少一个标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。该容器可以由多种材料形成，例如玻璃、金属或塑料。容器可以容纳一种或几种结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白和/或一种或多种治疗剂量的靶向掩蔽IFN。
或者容器可以容纳对治疗、诊断、预后或预防病情有效的组合物并且可以具有无菌接孔(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶))。组合物中的活性剂可以是本公开的结合特定TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白。
生产制品进一步包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和/或葡萄糖溶液。从商业和用户角度出发，其进一步包含期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、搅拌器、针、注射器和/或带有适应症和/或使用说明书的包装插页。
示例性实施方式
提供的实施方式包括：
1)一种组合物，其包含多肽序列TDVDYYREWSWTQV(SEQ ID NO：14)，其中所述多肽序列掩蔽I型干扰素(IFN)的活性，且其中所述组合物进一步包含融合至结合肿瘤相关抗原的抗体的融合蛋白。
2)如实施方式1所述的组合物，其进一步包含柔性肽接头。
3)如实施方式1或2所述的组合物，其进一步包含肿瘤相关蛋白酶裂解位点。
4)如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包含IFNα1。
5)如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包含IFNα2。
6)如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包含IFNα4。
7)如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包含IFNα5。
8)如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包含IFNα6。
9)如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包含IFNα14。
10)如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包含IFNβ1。
11)如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素或其功能性突变体选自表II中所示I型干扰素。
12)如实施方式1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原包括CD138。
13)如实施方式1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原包括CD20。
14)如实施方式1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原包括间皮素。
15)如实施方式1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原包括5T4。
16)如实施方式1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原选自表I中所示肿瘤相关抗原。
17)一种靶向掩蔽IFN，其包含：
a.包含重链和/或轻链的抗体，其特异性结合至肿瘤相关抗原；
b.I型干扰素，其中所述I型干扰素的N-末端被融合至所述抗体重链和/或轻链的C-末端；和
c.干扰素掩蔽，其包含(SEQ ID NO：14)，由此所述干扰素掩蔽被附接在所述I型干扰素的C-末端。
18)如实施方式17所述的靶向掩蔽IFN，其中所述I型干扰素的N-末端被融合至所述抗体重链和/或轻链的C-末端，其进一步包含柔性肽接头。
19)如实施方式17或18的靶向掩蔽IFN，其中所述干扰素掩蔽(SEQ ID NO：14)被附接至所述I型干扰素的C-末端，其进一步包含柔性肽接头。
20)如实施方式19所述的靶向掩蔽IFN，其进一步包含***所述抗体和所述柔性肽接头之间的肿瘤相关蛋白酶裂解位点。
21)如实施方式17-19中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其进一步包含***所述I型干扰素和所述干扰素掩蔽之间的肿瘤相关蛋白酶裂解位点。
22)如实施方式17-21中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述I-型IFN或其功能性突变体列于表II。
23)如实施方式17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合表I中所列出的肿瘤相关抗原。
24)如实施方式17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合CD138。
25)如实施方式17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合CD20。
26)如实施方式17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合间皮素。
27)如实施方式17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合5T4。
28)一种制备如实施方式1-16中任一项所述的组合物或实施方式17-27中任一项所述靶向掩蔽IFN的方法。
29)一种药物组合物，其包括如实施方式1-16中任一项所述的组合物或实施方式17-27中任一项所述的靶向掩蔽IFN，(i)其中，可选地，所述药物组合物是用于治疗(包括癌症的治疗)，其中，可选地，(a)癌症包含在实体瘤中发现的癌症；或(b)从造血***中发生的癌症，和(ii)其中，可选地，药物组合物进一步包含一种或多种抗-肿瘤剂；
30)一种试剂盒，其包含如实施方式1-16中任一项所述的组合物或实施方式17-27中任一项所述靶向掩蔽IFN。
31)一种治疗对象癌症的方法，其包括给予所述对象治疗有效量的如实施方式1-16中任一项所述的组合物或如实施方式17-27中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中，可选地，所述对象是人类对象。
实施例：
通过以下几个实施例进一步描述和说明本发明的各个方面，其中没有一个旨在限制本发明的范围。
实施例1：融合至抗-CD138的靶向掩蔽IFNα2(抗-CD138-IFNα2)的表征
在该实施例中，证明了可以使用间质蛋白酶ST 14将IFN掩蔽从H链裂解下来。简言之，使用同上列出的程序产生抗-CD138-IFNα2和抗-CD138-IFNα2-掩蔽。参见，本公开的掩 蔽IFN的方法。然后，修饰的重链在具有适当L链的293T细胞中瞬时表达，获得抗-CD138-IFNα2-掩蔽。通过SDS-PAGE分析的确认表明融合蛋白被正确组装在H2L2分子中，具有适当大小的H和L链。然后FACS分析显示修饰的融合蛋白结合至表达CD138的细胞。
通过蛋白质印迹得到的分析表明，间质蛋白酶ST 14可以从H链上裂解IFN掩蔽。没有掩蔽的抗-CD138-IFNα2用作对照。(参见，图1)。
实施例2：融合至非糖基化的抗-CD138(N297Q)的靶向掩蔽IFNα2(抗-CD138-IFNα2 N297Q)的表征。
在该实施例中，证明了可以使用间质蛋白酶ST 14将IFN掩蔽从H链裂解下来。简言之，对于用MST14(R&D***公司(R&D Systems))处理的样品，50ug抗体与0.5ug MST14孵育1小时。在37摄氏度。然后，一(1)ug每种纯化的抗体加热至95摄氏度变性，用约2％的β-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司(Thermofisher))还原，并在4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(英杰公司(Invitrogen))上跑样。四(4)ug的每种未还原的抗体通过加热至95摄氏度变性并在5％PO4 SDS-PAGE凝胶上跑样。结果分析表明，间质蛋白酶ST 14可高效地裂解非糖基化融合抗体上的IFN掩蔽。没有掩蔽的抗-CD138-IFNα2用作对照。(参见，图2)。
实施例3：融合至抗-5T4和抗-间皮素融合抗体的靶向掩蔽IFNα2的表征
在该实施例中，证明了可以使用间质蛋白酶ST 14将针对多个靶标的融合抗体上的IFN掩蔽从H链裂解下来。简言之，对于用MST14(R&D***公司(R&D Systems))处理的样品，50ug抗体与0.5ug MST14孵育1小时。在37摄氏度。然后，一(1)ug每种纯化的抗体加热至95摄氏度变性，用约2％的β-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司(Thermofisher))还原，并在4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(英杰公司(Invitrogen))上跑样。四(4)ug的每种未还原的抗体通过加热至95摄氏度变性并在5％PO4 SDS-PAGE凝胶上跑样。结果分析表明，间质蛋白酶ST 14可高效地裂解5T4和间皮素融合抗体上的IFN掩蔽。没有掩蔽的抗-CD138-IFNα2用作对照。(参见，图3)。
实施例4：掩蔽融合抗体结合至IFNα2受体。
在该实施例中，证明了本公开的多个掩蔽融合抗体可以结合至IFNα2受体。简言之，Immulon 2HB板(赛默飞世尔科技公司)在4摄氏度下用10ug/mL IFNαR2(R&D***公司)包被过夜，并用2％BSA(Fisher)在室温下封闭至少2小时。然后，孔用PBS+0.05％Tween(西格玛公司(Sigma))洗涤3次。指示的抗体浓度在4摄氏度下覆盖过夜。然后孔用PBS+0.05％Tween洗涤3次。用在PBS+1％BSA中1∶3000稀释的抗-人κ-AP(南方生物技术公司(SouthernBiotech))检测结合的抗体。使用Biotek EPOCH ELISA读板仪在410nm处测定添加AP底物(西格玛公司)后的吸光度变化。结果显示，与未掩蔽的5T4、间皮素、CD20和CD138融合抗体相比，掩蔽的5T4、间皮素、CD20和CD138抗体以较低的亲和力结合IFNαR2。(参见图4和图5)。
实施例5：减少和恢复掩蔽IFNα活性的方法
在该实施例中，证明了掩蔽IFN融合蛋白(抗-CD138-IFNα2)不会激活I型IFN信号转导通路。然后，在间质蛋白酶ST 14处理后可以恢复激活。简言之，使用HEK-BlueTM IFN-α/β细胞(英杰公司，加利福尼亚州圣地亚哥)，使用表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的报告基因检测I型IFN信号转导通路的激活，并通过处理细胞的上清中的定量碱性磷酸酶活性监测基因激活。HEK-BlueTM IFN-α/β细胞与hIFNα2、抗-CD138掩蔽IFNα2 w/o MST14、抗-CD138掩蔽IFNα2 w MST14；以及抗-CD138-IFNα2一起孵育持续二十四(24)小时。结果表明，发现掩蔽抗-CD138-IFNα2中的IFNα活性降低到未掩蔽蛋白质中所见活性的10％以下；在间质蛋白酶/ST14处理后，IFNα2活性恢复到接近100％(见图6)。
实施例6：减少和恢复掩蔽IFNα活性的方法。
在该实施例中，证明了本公开的多个掩蔽融合抗体可以减少和恢复IFNα活性。简言之，HEK Blue IFNa/b细胞(英杰公司)以1x10e4个细胞/孔(50uL/孔)的密度接种到96孔组织培养板(Fisher)中。重组IFNa(Novus生物公司(Novus Biologicals))或指示的抗体(5T4或间皮素)以50uL/孔与指示浓度的细胞在37摄氏度孵育过夜。用MST14(R&D***公司)裂解的抗体是通过50ug抗体与0.5ug MST14孵育1小时来制备的。在37摄氏度。然后，将10uL上清加入含有90uL/孔Quanti-Blue底物(英杰公司)的板。使用Biotek EPOCH ELISA读板仪在630nm处读取吸光度变化。结果显示，与掩蔽被裂解时相比，掩蔽的抗-5T4-IFNα和掩蔽的抗-间皮素-IFNα中的IFNα活性降低了大约1到2个对数。(参见图7(A)和图7(B))。
实施例7：在PBMC中减少IP-10诱导的方法
在该实施例中，证明了本公开的多个掩蔽融合抗体可以减少IP-10诱导。简言之，用冰冷的RPMI+10％FBS(英杰公司)将新鲜解冻的人PBMC(人类细胞生物科学(Human CellsBiosciences))洗涤一次，并以约1x10e6个细胞/孔(1mL/孔)的密度接种到12孔板(赛默飞世尔科技公司)中。在进行所述实验之前，通过向细胞添加300nM未融合的抗-CD138 IgG1一(1)小时，阻断/降低任何Fc受体和/或CD138抗原表达。然后，将重组人IFNa(Novus生物公司)或指示的抗体(5T4或间皮素)添加到细胞中，并允许在37摄氏度下孵育额外的七(7)小时。由MST14(R&D***公司)裂解的抗体是通过50ug抗体与0.5ug MST14孵育1小时制备的。在37摄氏度。孵育七(7)小时后，细胞在500xg旋降3分钟，以及每个样品的20uL上清，根据制造商的方案通过ELISA测定IP-10(艾博抗(Abcam))。结果表明，掩蔽降低了抗-5T4和抗-间皮素融合抗体中的IP-10诱导(参见，图8)。
实施例8：制备掩蔽融合蛋白的方法。
在该实施例中，显示了QXL138AM的构建体设计和表征。简言之，抗-CD138 IgG1使用本领域标准方法制备。重链同种型是人γ1，轻链同种型是人κ。掩蔽是如本说明书中所述生成的，参见，本公开的掩蔽IFN的方法。所得构建体表示为QXL 138AM(抗-CD 138-IFNα2-可裂解接头-掩蔽)包含IgG重链(以黄色显示)(SEQ ID NO：6)、融合蛋白接头(SGGGGS)(SEQID NO：3)、IFNα2(以绿色显示)(SEQ ID NO：7)、可裂解接头GSSGLSGRSDNHGSSGGSGGSGGSG(以蓝色显示)(SEQ ID NO：16)和本公开的掩蔽(以紫色显示)(SEQ ID NO：15)(参见，图9；SEQ ID NO：17中列出完整序列，SEQ ID NO：18中列出无信号肽的完整序列)。
图9中显示的构建体在TunaCHO中瞬时表达十四(14)天。效价达到179mg/L且由蛋白A色谱法纯化，使用标准方法(湖泽制药公司(Lake Pharma)，加利福尼亚州贝尔蒙特)(图10)。重链和轻链的进一步分析通过质谱仪评估，使用标准方法(湖泽制药公司(LakePharma)，加利福尼亚州贝尔蒙特)(图11)。
实施例9：抗体-细胞因子-掩蔽结构完整性的测定。
在该实施例中，测定了QXL138AM的抗体-细胞因子-掩蔽构建体的结构完整性。简言之，通过还原SDS-PAGE评估了两批QXL138AM。对于用MST14(R&D***公司)处理的样品，8ug抗体与约125ng MST14在37摄氏度孵育15分钟。然后，2ug的每种纯化的抗体加热至95摄氏度变性，用约2％的β-巯基乙醇(西格玛公司)还原，并在4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(英杰公司)上跑样。批次2用间质蛋白酶(MST14)评估/-预处理。结果表明抗体-细胞因子-掩蔽结构在纯化时似乎是完整的。进一步地，在不破坏抗体-细胞因子蛋白的情况下，掩蔽被MST14释放。(参见，图12)。
实施例10：融合蛋白结构完整性和裂解特异性的测定。
在该实施例中，多种融合抗体的结构完整性以及MST14裂解掩蔽的能力被测定。简言之，对于用MST14(R&D***公司(R&D Systems))处理的样品，50ug抗体与0.5ug MST14孵育1小时。在37摄氏度。一(1)ug每种纯化的抗体加热至95摄氏度变性，用约2％的β-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司(Thermofisher))还原，并在4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(英杰公司(Invitrogen))上跑样。4ug的每种非还原性抗体通过加热至95摄氏度变性并在5％PO4 SDS-PAGE凝胶上跑样。10ug指示的掩蔽抗体与1x10e6个RPMI 8226S细胞在100uL无血清RPMI(英杰公司)中孵育4小时。4小时后。细胞在500xg旋降三(3)分钟，10uL上清加热至95摄氏度变性，用约2％β-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司)还原。然后剩余的细胞被重悬并允许在37摄氏度孵育过夜。然后，约24小时后，细胞被轻柔旋降并按上述方法处理。结果显示掩蔽融合抗体看起来大小正确，并且被MST14特异性裂解。(参见图13(A))。
在平行设置中，10ug指示的掩蔽抗体与1x10e6个RPMI 8226S细胞在1uL无血清RPMI(英杰公司)中在37摄氏度下孵育24小时。约24小时后，如上段所述，细胞被旋降并用蛋白A琼脂糖(西格玛公司)免疫沉淀上清。如上所示，样品被变性并还原，在4-12％Bis-TrisSDS-PAGE凝胶上跑样。结果显示，将掩蔽抗-CD138融合抗体靶向到8226S细胞不影响掩蔽在体外的裂解。(参见，图13(B))。
实施例11：将融合抗体结合至掩蔽肽的方法。
在该实施例中，证明了多种融合抗体特异性结合至本公开的几种肽掩蔽。为了参考，测试了两种(2)肽掩蔽：
肽1(掩蔽1)：GSGTDVDYYREWSWTQVS(SEQ ID NO：19)；
肽2(掩蔽2)：GSGTDVDYYREWSWTQV(SEQ ID NO：20)；
简言之，在室温下，链霉亲和素包被板(皮尔斯(Pierce))用50uM每种指示的肽(赛默飞世尔科技公司)覆盖至少两(2)小时。然后孔用PBS+0.05％Tween洗涤3次。然后指示浓度的抗体在4度离心下结合过夜。孔用PBS+0.05％Tween洗涤3次。用在PBS+1％BSA中1∶3000稀释的抗-人κ-AP(南方生物技术公司(Southem Biotech))检测结合的抗体。使用BiotekEPOCH ELISA读板仪在410nm处测定添加AP底物(西格玛公司)后的吸光度变化。结果显示肽1结合所有测试的IFN融合抗体。(参见，图14(A))。此外，相对于肽1，肽2以不同程度结合至所有测试的IFN融合抗体。(参见，图14(B))。
实施例12：靶向融合抗体比非靶向融合抗体的表征。
在几种细胞系中测试本公开的融合抗体，以比较靶向融合抗体比非靶向融合抗体的有效性。简言之，每个细胞系以1x1oe4个细胞/孔(50uL/孔)被接种到96孔组织培养板(BD公司(Becton Dickinson))中。次日指示浓度的每种指示抗体以50uL/孔处理细胞。六(6)天后，MTS试剂(普罗梅加公司(Promega))以20uL/孔添加到板中。用Biotek EPOCH读板仪在490nm处读取吸光度变化。结果表明靶向融合抗体比非靶向融合抗体更有效。(参见，图15(A)和图15(B))。
在另一个实验中，1.5x10e4个U266细胞/孔(50uL/孔)或1x10e4个CAPAN-2细胞/孔(50uL/孔)被接种到96孔组织培养板(碧迪公司)中。U266细胞在同一天处理，而次日CAPAN-2细胞用指示浓度的每种指示抗体以50uL/孔进行处理。处理后六(6)天，MTS试剂(普罗梅加公司(Promega))以20uL/孔添加到板中。用Biotek EPOCH读板仪在490nm处读取吸光度变化。结果表明靶向融合抗体比非靶向融合抗体更有效。此外，掩蔽融合抗体不如裂解版本有效。(参见，图16(A)和图16(B))。
实施例13：使用抗-CD138-IFNα2抑制细胞增殖的方法。
在该实施例中，证明了IFN融合蛋白(抗-CD138-IFNα2)抑制癌细胞(即Daudi细胞)的细胞增殖。当IFN掩蔽就位时，对癌细胞增殖的抑制显著降低。去除IFN掩蔽后，细胞增殖的抑制作用得以恢复。简而言之，Daudi细胞与hIFNα2、抗-CD138掩蔽的IFNα2 w/o MST14、抗-CD138掩蔽的IFNα2 w MST1；和抗-CD138-IFNα2一起孵育持续三(3)天，并使用MTS试验测量增殖。应注意，增殖表示为相对于未处理细胞的百分比(％)。结果表明，去除IFN掩蔽恢复对细胞增殖的抑制。(参见，图17)。
实施例14：减少脱靶IFNα-诱导的细胞毒性的方法。
在该实验中，证明了掩蔽能够减少脱靶IFNα-诱导的细胞毒性。简言之，每个细胞系以1x10e4个细胞/孔(50uL/孔)接种到96孔组织培养板(BD公司(Becton Dickinson))中。指示浓度的每种指示的抗体以50uL/孔添加到板中。三(3)天后，MTS试剂(普罗梅加公司(Promega))以20uL/孔添加到板中。用Biotek EPOCH读板仪在490nm处读取吸光度变化。对于用MST14(R&D***公司)处理的样品，50ug抗体与0.5ug MST14在37摄氏度孵育1小时。结果表明，CD138融合蛋白和裂解的CD138融合蛋白对CD138细胞的效力比游离IFNα低约50倍，而掩蔽的CD138融合蛋白对CD138细胞的效力比IFNα低约1000倍(参见，图18(A))。此外，在细胞培养中，掩蔽将靶向或脱靶活性降低约10倍。靶向细胞表面的抗体使活性增强约100倍。靶向未掩蔽融合蛋白的效力约为非靶向掩蔽融合蛋白的10,000倍。(参见，图18(B))。
实施例15：掩蔽比未掩蔽和靶向比非靶向融合蛋白的肿瘤细胞系细胞毒性。
使用以下方案进行比较使用本公开的掩蔽比未掩蔽和靶向与非靶向融合蛋白的各种细胞系的细胞毒性的研究。简言之，U266、H929或OCI-My5.5细胞以1.5x10e4个细胞/孔(50uL/孔)接种到96孔组织培养板(BD公司)中。此外，1x10e4个OVCAR3或BCMW1细胞/孔(50uL/孔)接种到96孔组织培养板(BD公司)中。U266、H929或OCI-My5.5细胞在同一天处理，而次日OVCAR3或BCMW1细胞用指示浓度的每种指示抗体以50uL/孔进行处理。U266、H929或OCI-My5.5在处理后四(4)天通过将MTS试剂(普罗梅加公司)以20uL/孔添加到板中并使用Biotek EPOCH读板仪测量490nm处的吸光度变化进行测定。OVCAR3或BCMW1细胞在处理六(6)天后进行了类似的测定。结果显示抗原靶向增加了掩蔽和未掩蔽融合抗体相对于它们的非靶向对应物的抗增殖作用。此外，相对于所测定的细胞系中未掩蔽的对应物，掩蔽干扰素部分会降低融合抗体的抗增殖作用。(参见，图19和20)。
实施例16：减少PBMC的IFNR激活的方法。
在该实验中，用冰冷的RPMI+10％FBS(英杰公司)将新鲜解冻的人PBMC(人类细胞生物科学(Human Cells Biosciences))洗涤一次，并以约1x10e6个细胞/孔(1mL/孔)的密度接种到12孔板(赛默飞世尔科技公司)中。在进行所述实验之前，通过向细胞添加167nM人Fc阻断剂(碧迪公司)一(1)小时，阻断/降低任何Fc受体表达。将重组人IFNa(Novus生物公司)或指示的抗体添加到细胞中，并允许在37摄氏度下孵育额外的七(7)小时。由MST14(R&D***公司)裂解的抗体是通过50ug抗体与0.5ug MST14在37摄氏度孵育1小时制备的。孵育7小时后，细胞在500xg旋降3分钟，以及每个样品的20uL上清根据制造商的方案通过ELISA测定IP-10(艾博抗(Abcam))。
此外，对来自同一实验的细胞沉淀进行了蛋白质印迹。用100uL NDET(1％NonidetP-40、0.4％脱氧胆酸盐、66mM EDTA和10mM Tris，pH7.4)裂解细胞。10ug/样品加热至95摄氏度变性，用约2％的β-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司)还原，并在4-12％的Bis-TrisSDS-PAGE凝胶(英杰公司)上跑样。蛋白质被转移到0.45um PVDF膜(GE医疗公司(GEHealthcare))上并在4摄氏度下用PBS+3％BSA(赛默飞世尔科技公司)封闭过夜。然后在4摄氏度下用PBS+3％BSA中1∶3000的兔抗-pSTAT1(细胞信号技术公司(Cell Signaling)将膜印迹过夜。在用PBS+0.1％Tween(西格玛公司)洗涤3次每次10分钟后，印迹与在PBS+3％BSA中1∶10000稀释的抗-兔IgG-HRP在室温下孵育1小时。在用PBS+0.1％Tween再洗涤三(3)次、每次十(10)分钟后，印迹与超级信号蛋白质微小HRP底物(SuperSignal West Pico HRPsubstrate)(皮尔斯公司)孵育。使用Azure 280(Azure生物***(Azure Biosystems))捕获印迹图像。印迹图像捕获后，印迹立即用PBS+0.1％Tween洗涤3次，并与PBS+3％BSA中1∶20000稀释的兔抗GAPDH在4摄氏度下孵育过夜。
如前所述完成检测。最后，印迹通过在10mM Tris pH 6.8+2％SDS+0.7％β-巯基乙醇中加热至65摄氏度15分钟来剥离。用PBS+0.1％Tween洗涤四(4)次，每次十(10)分钟后，用PBS+3％BSA重新封闭印迹，并用PBS+3％BSA中1∶1000稀释的兔抗-STAT1进行印迹，在4摄氏度过夜。如前所述检测。
结果显示存在剂量依赖性STAT1激活，其中与等摩尔浓度的未掩蔽融合蛋白相比，掩蔽融合蛋白激活STAT1的效果较差。(参见，图21(A))。此外，图21(B)显示了存在IP-10的剂量依赖性诱导，其中与等摩尔浓度的未掩蔽融合蛋白相比，掩蔽融合蛋白诱导IP-10的效果较差。
在另一个实验中，用冰冷的RPMI+10％FBS(英杰公司)将新鲜解冻的人PBMC(人类细胞生物科学(Human Cells Biosciences))洗涤一次，并以约1x10e6个细胞/孔(1mL/孔)的密度接种到12孔板(赛默飞世尔科技公司)中。在进行所述实验之前，通过向细胞添加167nM人Fc阻断剂(碧迪公司)1小时，阻断/降低任何Fc受体表达。将重组人IFNa(Novus生物公司)或指示的抗体添加到细胞中，并允许在37摄氏度下孵育额外的七(7)小时。由MST14(R&D***公司)裂解的抗体是通过50ug抗体与0.5ug MST14在37摄氏度孵育1小时制备的。孵育七(7)小时后，细胞在500xg旋降3分钟，以及每个样品的20uL上清根据制造商的方案通过ELISA测定IP-10(艾博抗(Abcam))。结果显示，掩蔽IFNα显著降低(＞10倍)IP-10诱导的效力。(参见，图22)。
实施例17：QXL138AM体外功能研究。
使用以下方案对QXL138AM进行功能特性研究。简言之，HEK Blue IFNa/b细胞(英杰公司)以5x10e4个细胞/孔(50uL/孔)的密度接种到96孔组织培养板(Fisher)中。然后重组IFNa(Novus生物公司)或指示的抗体以五十(50)uL/孔与指示浓度的细胞在37摄氏度孵育过夜。由MST14(R&D***公司)裂解的抗体是通过50ug抗体与0.5ug MST14在37摄氏度孵育1小时制备的。然后，将十(10)uL上清加入含有90uL/孔Quanti-Blue底物(英杰公司)的板。使用Biotek EPOCH ELISA读板仪在630nm处读取吸光度变化。结果显示(i)融合抗体靶向IFNα与野生型IFNα一样有效力，(ii)非靶向抗体-IFNα的效力比野生型IFNα低约100倍，(iii)掩蔽可有效阻断非靶向IFNα，和(iv)即使在靶向表达CD138的转化的(非致瘤性)HEK细胞时，掩蔽降低IFNα活性。(参见，图23(A)和图23(B))。
实施例18：QXL138AM体内功效研究。
使用以下方案进行QXL138AM的功效研究。简言之，在NSG小鼠背上用基质胶(BD)皮下注射1x10^6个H929细胞。在感染后第14、16和18天用100ug(5mg/kg左图)和300ug(15mg/kg右图)静脉注射治疗小鼠。每周测量肿瘤大小区域三(3)次，直到它们长到1.4cm以上，此时将小鼠处死。比较靶向融合蛋白与非靶向融合蛋白。还比较了每种掩蔽的版本。结果表明，(i)QXL138AM与QXL138A一样有效力，(ii)单药QXL138A和QXL138AM能够实现持久的CR，在治疗后持续数月。(参见，图24和25)。
在另一个实验中，显示了在骨髓瘤中与标准治疗(硼替佐米)的协同作用。简言之，在NSG小鼠背上用基质胶(BD)皮下注射5x10^6个MM1-144细胞。在注射后的第14、16和18天，用100ug(5mg/kg)的融合蛋白单独静脉注射治疗，靶向掩蔽和未掩蔽的融合蛋白与.38mg/kg硼替佐米静脉注射组合治疗，或单独用.38mg/kg硼替佐米静脉注射治疗小鼠。每周测量肿瘤大小区域三(3)次，直到它们长到1.4cm以上，此时将小鼠处死。结果显示，当与硼替佐米一起使用时，掩蔽和未掩蔽的IFNα都具有协同作用，并显示出类似的功效。(参见，图26)。
在另一个实验中，在NSG小鼠背上用基质胶(BD)皮下注射1x10^6个H929细胞。在注射后第14、16和18天用100ug(5mg/kg)融合蛋白单独静脉注射，.38mg/kg硼替佐米单独静脉注射，或.15mg/kg硼替佐米单独静脉注射治疗小鼠。靶向融合蛋白(QXL138A)与.38mg/kg硼替佐米组合静脉注射或与.15mg/kg硼替佐米组合静脉注射治疗。每周测量肿瘤大小区域三(3)次，直到它们长到1.4cm以上，此时将小鼠处死。结果显示QXL138A和硼替佐米在H929细胞中有体内协同作用。(参见，图27)。
在另一个实验中，显示了在骨髓瘤中与标准治疗(泊马度胺)的协同作用。简言之，在NSG小鼠背上用基质胶(BD)皮下注射1x10^6个H929细胞。在注射后第14、16和18天用100ug(5mg/kg)融合蛋白单独静脉注射，或500ug(25m/kg)泊马度胺单独静脉注射治疗小鼠。未掩蔽的融合蛋白(QXL183A)与25mg/kg泊马度胺组合静脉治疗，并每周测量肿瘤大小区域三(3)次，直到它们长到1.4cm以上，此时将小鼠处死。结果显示QXL138AM和泊马度胺有协同作用)。(参见，图28)。
在另一个实验中，在NSG小鼠背上用基质胶(matrigel)(BD)皮下注射5x10^6个MM1-144细胞。在注射后第14、16和18天用100ug(5mg/kg)融合蛋白(QXL138A)单独静脉注射，或非靶向融合蛋白单独静脉注射，或25mg/kg泊马度胺单独腹膜内注射治疗小鼠。25mg/kg泊马度胺腹膜内注射与5mg/kg靶向融合蛋白(QXL138A)静脉注射组合或5mg/kg非靶向融合蛋白静脉注射组合治疗。每周测量肿瘤大小区域三(3)次，直到它们长到1.4cm以上，此时将小鼠处死。结果显示QXL138A和泊马度胺有协同作用。(参见，图29)。
实施例19：使用第二掩蔽融合至抗-CD138的靶向掩蔽IFNα2(抗-CD138-IFNα2-掩 蔽2)的表征。
在该实施例中，证明了可以使用间质蛋白酶ST 14将IFN掩蔽(掩蔽2)从重链裂解下来。简言之，对于用MST14(R&D***公司)处理的样品，50ug抗体与0.5ug MST14在37摄氏度孵育1小时。然后，一(1)ug的每种纯化的抗体加热至95摄氏度变性，用约2％的β-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司)还原，并在4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(英杰公司)上跑样。结果分析表明，间质蛋白酶ST 14可高效地裂解抗-CD138融合抗体上的IFN掩蔽(掩蔽2)。(参见，图30)。
实施例20：掩蔽融合抗体(利用掩蔽2)结合至IFNα2受体。
在该实施例中，显示了可以结合至IFNα2受体的本公开的掩蔽融合抗体(利用掩蔽2)。简言之，Immulon2HB板(赛默飞世尔科技公司)在4摄氏度下用10ug/mL IFNαR2(R&D***公司)包被过夜，并用2％BSA(Fisher)在室温下封闭至少2小时。然后，孔用PBS+0.05％Tween(西格玛公司(Sigma))洗涤3次。指示的抗体浓度在4摄氏度下覆盖过夜。然后孔用PBS+0.05％Tween洗涤3次。用在PBS+1％BSA中1∶3000稀释的抗-人κ-AP(南方生物技术公司(Southem Biotech))检测结合的抗体。使用Biotek EPOCH ELISA读板仪在410nm处测定添加AP底物(西格玛公司)后的吸光度变化。结果显示掩蔽1和掩蔽2都能抑制融合抗体结合至IFNαR2。(参见，图31).
实施例21：减少和恢复掩蔽IFNα活性的方法。
在该实施例中，显示了可以减少和恢复IFNα活性的本公开的掩蔽1和掩蔽2。简言之，将HEK Blue IFNa/b细胞(英杰公司)以1x10e4个细胞/孔(50uL/孔)的密度接种到96孔组织培养板(Fisher)中。然后重组IFNa(Novus生物公司)或指示的抗体(5T4或间皮素)以50uL/孔与指示浓度的细胞在37摄氏度孵育过夜。由MST14(R&D***公司)裂解的抗体是通过50ug抗体与0.5ug MST14在37摄氏度孵育1小时制备的。然后，将10uL上清加入含有90uL/孔Quanti-Blue底物(英杰公司)的板。使用Biotek EPOCH ELISA读板仪在630nm处读取吸光度变化。结果显示，与掩蔽被裂解时相比，掩蔽的抗-CD138-IFNα(掩蔽1)和掩蔽的抗-CD138-IFNα(掩蔽2)中的IFNα活性减少。(参见，图32(A)和图32(B))。
实施例22：融合至抗-PSCA的靶向掩蔽IFNα1(抗-PSCA-IFNα1)的表征。
在该实施例中，证明了可以使用间质蛋白酶ST 14将IFN掩蔽从H链裂解下来。简言之，使用同上列出的程序产生抗-PSCA-IFNα1和抗-PSCA-IFNα1+掩蔽。参见，本公开的掩蔽 IFN的方法。然后，修饰的重链在具有适当L链的293T细胞中瞬时表达，在293T细胞中获得抗-PSCA-IFNα1+掩蔽。通过SDS-PAGE分析的确认表明融合蛋白被正确组装成H2L2分子，具有适当大小的H和L链。FACS分析显示修饰的融合蛋白结合至表达PSCA的细胞。
结果分析表明，间质蛋白酶ST 14可以从H链上裂解IFN掩蔽。没有掩蔽的抗-PSCA-IFNα1用作对照。
实施例23：融合至抗-PSCA的靶向掩蔽IFNα2(抗-PSCA-IFNα2)的表征。
在该实施例中，证明了可以使用间质蛋白酶ST 14将IFN掩蔽从H链裂解下来。简言之，使用同上列出的程序产生抗-PSCA-IFNα2和抗-PSCA-IFNα2+掩蔽。参见，本公开的掩蔽 IFN的方法。然后，修饰的重链在具有适当L链的293T细胞中瞬时表达，在293T细胞中获得抗-PSCA-IFNα2+掩蔽。通过SDS-PAGE分析的确认表明融合蛋白被正确组装成H2L2分子，具有适当大小的H和L链。FACS分析显示修饰的融合蛋白结合至表达PSCA的细胞。
结果分析表明，间质蛋白酶ST 14可以从H链上裂解IFN掩蔽。没有掩蔽的抗-PSCA-IFNα2用作对照。
实施例24.利用体内靶向掩蔽的IFN融合蛋白抑制肿瘤生长的方法。
TAA在肿瘤细胞中的显著表达，加上在正常细胞中的限制性表达，使得本公开的TAA，优选是在实体肿瘤癌症中表达的TAA成为靶向掩蔽IFN融合蛋白治疗的良好靶标。因此，在人类癌症异种移植小鼠模型中评估了结合表达TAA的靶向掩蔽IFN融合蛋白的疗效。
掩蔽IFN融合蛋白对肿瘤生长和转移形成的功效是在小鼠癌症异种移植模型(如皮下和原位)中研究的。
皮下(s.c.)肿瘤是通过将5×104-106个癌细胞与基质胶(合作研究(Collaborative Research))以1∶1的稀释度混合注射在SCID小鼠右胁腹产生的。为了测试掩蔽IFN融合蛋白对肿瘤形成的功效，掩蔽IFN融合蛋白的注射是在肿瘤细胞注射的同一天开始的。作为对照，小鼠被注射纯化的人IgG或PBS；或识别不在人类细胞中表达的不相关抗原的纯化的单克隆抗体。在初步研究中，没有发现对照组IgG或PBS对肿瘤生长有什么不同。肿瘤大小由卡尺测量确定，肿瘤体积计算为宽度2×长度/2，其中宽度是最小的尺寸，长度是最大的尺寸。皮下肿瘤直径大于1.4cm的小鼠将被处死。
异种移植癌症模型的一个优点是能够研究新生血管和血管生成。肿瘤的生长部分依赖于新血管的发展。虽然毛细血管***和发育中的血液网络是起始于宿主的，但新生血管的萌生和结构是由异种移植肿瘤调节的(Davidoff等，Clin Cancer Res.(2001)7：2870；Solesvik等，Eur J Cancer Clin Oncol.(1984)20：1295)。抗体和小分子对新生血管的作用是根据本领域已知的程序研究的，例如通过对肿瘤组织及其周围微环境的IHC分析。
证明了与人癌症中表达的TAA结合的掩蔽IFN融合蛋白抑制体内肿瘤生长。
实施例25：通过使用结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白治疗人癌症的人体临床试 验。
与特定TAA结合的掩蔽IFN融合蛋白根据本发明合成，在肿瘤细胞中特异性积累，用于治疗某些肿瘤和其他免疫失调和/或其他疾病。关于这些适应症中的每一项，成功地实行了两种临床方法。
I.)辅助治疗：在辅助治疗中，患者用结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白与化疗或药物或生物制药剂或其组合组合治疗。方案设计解决了由以下实例评估的有效性，包括但不限于：减少原发或转移性病灶的肿瘤质量、增加无进展生存期、总生存期、改善患者健康、疾病稳定，以及能够减少标准化疗和其他生物制剂的常用剂量。通过减少化疗或生物制剂的剂量相关毒性，这些剂量的减少允许附加和/或延长治疗。
II.)单药治疗：关于使用结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白对肿瘤进行单药治疗，结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白被给予患者，而不使用化疗或药物或生物制剂。在一个实施方式中，在临床上对患有广泛转移性疾病的晚期癌症患者进行单药治疗。方案设计解决了由以下实例评估的有效性，包括但不限于：减少原发或转移性病灶的肿瘤质量、增加无进展生存期、总生存期、改善患者健康、疾病稳定，以及能够减少标准化疗和其他生物制剂的常用剂量。
剂量
可调节剂量方案以提供最佳的所需缓解。例如，可以单独给予结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白注射，按时间分次给药或根据治疗情况的紧急程度成比例地降低或增加剂量。本文中所用“单位剂型”指作为单个剂量用于待治疗哺乳动物对象的物理上离散的单位；每个单位包含预定量的活性化合物与所需药物运载体，该预定量经测算能够产生所需治疗效果。本发明的单位剂型的规格取决于或直接依赖于(a)结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白的独特特性，和待实现的特定治疗或预防效果，以及(b)此化合物配制相关领域关于应对个体治疗敏感性的固有限制。
临床开发计划(CDP)
CDP遵循并开发使用本公开的结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白的一种或多种癌症和/或免疫失调的治疗方法，与辅助治疗或单药治疗相关。试验最初证明了安全性，此后确认了重复给药的功效。试验是开放式的，比较了标准化疗与标准疗法+结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白。如将理解的，关于招募病人时可以利用的一个非限制性标准是通过本领域已知的标准检测方法确定的肿瘤中结合特定TAA的掩蔽IFN融合蛋白的浓度。
本发明不局限于本文所述实施方式的范围，这些实施方式仅旨在说明本发明的单独方面，任何功能等同形式也在本发明范围内。除了本文所述的之外，由前述的描述和教导对本发明的模型、方法和生命周期方法论的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且同样旨在落入本发明的范围内。可以在不偏离本发明的真实范围和精神的情况下实施这种修改或其它实施方式。
表I.选择一种或多种肿瘤相关抗原。
CD138 HPV E6 E7 CEA
MUC1 EGFRvIII STEAP
LMP2 HER-2/neu MART1
CD20 TMPRSS2 PSMA
gp100 NA17 PLAC1
EGFR B7-H4 GM3
PR1 ALK BORIS
FAP NECTIN-4 Tn
酪氨酸酶 周期蛋白B1 G1oboH
叶酸受体α CSPG4 ETV6-AML
PSA RCC NY-BR-1
SLC34A2 TRP-2 RGS5
EphA2 GD3 SART3
PAP 岩藻糖基GM1 STn
B7-H3 间皮素 PAX5
AFP PSCA OY-TES1
EpCAM MAGE A1 SLITRK6
AKAP-4 XAGE 1 TAA
5T4 CD38 GPR94
SSX2 AXL CD-37
表II.一种或多种干扰素和功能性突变体列表。
经批准的符号 经批准的名称
IFNA1 干扰素α1
IFNA2 干扰素α2
IFNA4 干扰素α4
IFNA5 干扰素α5
IFNA6 干扰素α6
IFNA7 干扰素α7
IFNA8 干扰素α8
IFNA10 干扰素α10
IFNA11P 干扰素α11
IFNA12P 干扰素α12
IFNA13 干扰素α13
IFNA14 干扰素α14
IFNA16 干扰素α16
IFNA17 干扰素α17
IFNA20P 干扰素α20，假基因
IFNA21 干扰素α21
IFNA22P 干扰素α22，假基因
IFNB1 干扰素β1
YNS
IFNA
表III.氨基酸缩写。
单字母 三字母 全称
F Phe 苯丙氨酸
L Leu 亮氨酸
S Ser 丝氨酸
Y Tyr 酪氨酸
C Cys 半胱氨酸
W Trp 色氨酸
P Pro 脯氨酸
H His 组氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
R Arg 精氨酸
I Ile 异亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
T Thr 苏氨酸
N Asn 天冬酰胺
K Lys 赖氨酸
V Val 缬氨酸
A Ala 丙氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
G Gly 甘氨酸
序列表
<110> 奎克赛尔治疗学有限责任公司(Qwixel Therapeutics)
<120> 用于治疗癌症的一种或多种包含掩蔽I型干扰素
(IFNa和IFNb)的融合蛋白组合物及其方法
<130> 16580-20001.40
<140> 还未指定
<141> 同时附上
<150> 62/920,140
<151> 2019-04-15
<160> 21
<170> 适用于Windows 4.0版本的FastSEQ
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 3
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 4
Ala Gly Ala Ala Ala Lys Gly Ala Ala Ala Lys Ala Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 5
Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 6
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
20 25 30
Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala
35 40 45
Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg
50 55 60
Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly
65 70 75 80
Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala
85 90 95
Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
100 105 110
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn
115 120 125
Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
145 150 155 160
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
165 170 175
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
180 185 190
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
195 200 205
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
210 215 220
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
225 230 235 240
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
290 295 300
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
370 375 380
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
405 410 415
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
435 440 445
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 7
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 7
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 8
Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 9
Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 10
Gly Gln Ser Gly Gln Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Glu
1 5 10 15
Thr Gln Val Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly
20 25 30
Phe Leu Gly Pro Gly Gly Ser
35
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 11
Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 12
Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu
1 5 10 15
Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg
20 25 30
Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Ser
50 55 60
Gly Gly
65
<210> 13
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 13
Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu
1 5 10 15
Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg
20 25 30
Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Gly
50 55 60
Gly
65
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 14
Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val
1 5 10
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 15
Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 16
Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25
<210> 17
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 17
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
20 25 30
Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala
35 40 45
Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg
50 55 60
Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly
65 70 75 80
Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala
85 90 95
Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
100 105 110
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn
115 120 125
Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
130 135 140
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145 150 155 160
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
165 170 175
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
180 185 190
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
195 200 205
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210 215 220
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
225 230 235 240
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
290 295 300
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
370 375 380
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
405 410 415
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
435 440 445
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
485 490 495
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys
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Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe
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Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile
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Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
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Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
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Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 18
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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His
450 455 460
Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg
465 470 475 480
Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro
485 490 495
Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val
500 505 510
Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp
515 520 525
Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu
530 535 540
Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val
545 550 555 560
Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val
565 570 575
Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr
580 585 590
Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe
595 600 605
Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser
610 615 620
Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser
625 630 635 640
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp
645 650 655
Ser Trp Thr Gln Val Ser Gly Gly
660
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 19
Gly Ser Gly Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln
1 5 10 15
Val Ser
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 20
Gly Ser Gly Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln
1 5 10 15
Val
<210> 21
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
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290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450

Claims (31)

1.一种组合物，其包含多肽序列TDVDYYREWSWTQV(SEQ ID NO：14)，其中所述多肽序列掩蔽I型干扰素(IFN)的活性，且其中所述组合物进一步包含融合至结合肿瘤相关抗原的抗体的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含柔性肽接头。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含肿瘤相关蛋白酶裂解位点。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包括IFNα1。
5.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包括IFNα2。
6.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包括IFNα4。
7.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包括IFNα5。
8.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包括IFNα6。
9.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包括IFNα14。
10.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素包括IFNβ1。
11.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述I型干扰素或其功能性突变体选自表II中所示I型干扰素。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原包括CD138。
13.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原包括CD20。
14.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原包括间皮素。
15.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原包括5T4。
16.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原选自表I中所示肿瘤相关抗原。
17.一种靶向掩蔽IFN，其包含：
a.包含重链和/或轻链的抗体，其特异性结合至肿瘤相关抗原；
b.I型干扰素，其中所述I型干扰素的N-末端被融合至所述抗体重链和/或轻链的C-末端；和
c.干扰素掩蔽，其包含(SEQ ID NO：14)，由此所述干扰素掩蔽被附接在所述I型干扰素的C-末端。
18.如权利要求17所述的靶向掩蔽IFN，其中所述I型干扰素的N-末端被融合至所述抗体重链和/或轻链的C-末端，其进一步包含柔性肽接头。
19.如权利要求17或18所述的靶向掩蔽IFN，其中所述干扰素掩蔽(SEQ ID NO：14)被附接至所述I型干扰素的C-末端，其进一步包含柔性肽接头。
20.如权利要求19所述的靶向掩蔽IFN，其进一步包含***所述抗体和所述柔性肽接头之间的肿瘤相关蛋白酶裂解位点。
21.如权利要求17-19中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其进一步包含***所述I型干扰素和所述干扰素掩蔽之间的肿瘤相关蛋白酶裂解位点。
22.如权利要求17-21中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述I-型IFN或其功能性突变体列于表II。
23.如权利要求17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合表I中所列出的肿瘤相关抗原。
24.如权利要求17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合CD138。
25.如权利要求17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合CD20。
26.如权利要求17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合间皮素。
27.如权利要求17-22中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中所述抗体结合5T4。
28.一种制备如权利要求1-16中任一项所述的组合物或权利要求17-27中任一项所述靶向掩蔽IFN的方法。
29.一种药物组合物，其包括如权利要求1-16中任一项所述的组合物或权利要求17-27中任一项所述的靶向掩蔽IFN，(i)其中，可选地，所述药物组合物是用于治疗，包括癌症的治疗，其中，可选地，(a)癌症包含在实体瘤中发现的癌症；或(b)从造血***中发生的癌症，和(ii)其中，可选地，药物组合物进一步包含一种或多种抗肿瘤剂。
30.一种试剂盒，其包含如权利要求1-16中任一项所述的组合物或权利要求17-27中任一项所述靶向掩蔽IFN。
31.一种治疗对象癌症的方法，其包括给予所述对象治疗有效量的如权利要求1-16中任一项所述的组合物或如权利要求17-27中任一项所述的靶向掩蔽IFN，其中，可选地，所述对象是人类对象。
CN202080044080.4A 2019-04-15 2020-04-15 用于治疗癌症的一种或多种包含靶向掩蔽i型干扰素(ifna和ifnb)和针对肿瘤抗原的抗体的融合蛋白组合物 Pending CN113993540A (zh)

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