RU2557318C9 - Очищенный препарат уратоксидазы, очищенная рекомбинантная уратоксидаза, конъюгат (варианты) и фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, очищенные фрагменты уратоксидазы и способ очистки уратоксидазы. - Google Patents

Очищенный препарат уратоксидазы, очищенная рекомбинантная уратоксидаза, конъюгат (варианты) и фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, очищенные фрагменты уратоксидазы и способ очистки уратоксидазы. Download PDF

Info

Publication number
RU2557318C9
RU2557318C9 RU2009104003/10A RU2009104003A RU2557318C9 RU 2557318 C9 RU2557318 C9 RU 2557318C9 RU 2009104003/10 A RU2009104003/10 A RU 2009104003/10A RU 2009104003 A RU2009104003 A RU 2009104003A RU 2557318 C9 RU2557318 C9 RU 2557318C9
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
uricase
uratoxidase
octamers
residue
conjugate
Prior art date
Application number
RU2009104003/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2557318C2 (ru
RU2009104003A (ru
Inventor
Л. Дэвид ВИЛЛИАМЗ
Сьюзэн Дж. КЕЛЛИ
Марк Дж. П. САЙФЕР
Майкл С. ХЕРШФИЛД
Мери Р. ШЕРМЕН
Original Assignee
Мунтэн Вью Фармасьютикэлз, Инк.
Дюк Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мунтэн Вью Фармасьютикэлз, Инк., Дюк Юниверсити filed Critical Мунтэн Вью Фармасьютикэлз, Инк.
Publication of RU2009104003A publication Critical patent/RU2009104003A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2557318C2 publication Critical patent/RU2557318C2/ru
Publication of RU2557318C9 publication Critical patent/RU2557318C9/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой очищенную рекомбинантную уратоксидазу (уриказу), характеризующуюся содержанием тетрамеров и октамеров 95% и более от общего количества её молекул. Изобретение также раскрывает очищенный препарат указанной уратоксидазы, обладающий сниженной иммуногенностью, конъюгат указанной уратоксидазы с полиэтиленгликолем или полиэтиленоксидом, используемый для снижения уровней мочевой кислоты в ткани или жидкости организма млекопитающего, очищенные фрагменты указанной уратоксидазы, фармацевтическую композицию, содержащую указанную уратоксидазу, и способ очистки указанной уратоксидазы с сохранением её уриколитической активности, включающий выделение и удаление агрегатов уриказы крупнее октамеров. Настоящее изобретение позволяет получить препараты уратоксидазы со сниженной иммуногенностью. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к очистке и химической модификации белков для увеличения периода их циркуляции и снижения их иммуногенности. Конкретнее, изобретение относится к удалению агрегатов крупнее октамеров из уратоксидаз (уриказ) до конъюгирования их с поли(этиленгликолями) или поли(этиленоксидами). Это практически нивелирует иммуногенность уриказы, не ухудшая ее уриколитическое действие.
Уровень техники
Утверждения, содержащиеся в разделе описания существующего уровня техники, не представляют собой обзор аналогов, но вместо этого отражают собственное субъективное мнение и интерпретации изобретателей относительно уровня техники на момент осуществления изобретения. Эти интерпретации могут включать в себя личные, до сих пор не раскрытые догадки изобретателей, которые сами по себе не являлись частью аналогов.
Уратоксидазы (уриказы; Е.С.1.7.3.3) являются ферментами, которые катализируют окисление мочевой кислоты до лучше растворимого продукта, алантоина, - пуринового метаболита, - который проще выводится. Люди не вырабатывают ферментативно-активную уриказу из-за нескольких мутаций в генеуриказы, произошедших в ходе эволюции высших приматов. Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34:78-84. Вследствие этого у подверженных индивидов избыточные концентрации мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) и в моче (гиперурикозурия) могут приводить к болезненному артриту (подагре), отложениям солей мочевой кислоты (подагрическим узлам) и почечной недостаточности. У некоторых пораженных индивидов доступные медикаменты, такие как аллопуринол (ингибитор синтеза мочевой кислоты) вызывают ограничивающие лечение побочные эффекты или не облегчают эти состояния адекватным образом. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192. Инъекции уриказы могут ослабить гиперурикемию и гиперурикозурию, по крайней мере, временно. Однако, поскольку уриказа является чуждым для людей ферментом, даже первая инъекция интактного белка, взятого от Aspergillus flavus, вызывает анафилактические реакции у нескольких процентов подвергавшихся лечению пациентов (Pui, С-Н, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816), а иммунореактивность ограничивает ее полезность для постоянного или прерывающегося лечения. Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554.
Патентная заявка США №09/370084 и международная заявка № PCT/US1999/017514 раскрывают поли(этиленгликоль)-уратоксидазу (ПЭГ-уриказу), которая сохраняет, по меньшей мере, приблизительно 75% уриколитической активности неконъюгированной уриказы и обладает значительно ослабленной иммуногенностью. В одной из таких очищенных уриказ каждая субъединица ковалентно связана со в среднем от 2 до 10 нитей ПЭГ, причем каждая молекула ПЭГ может иметь молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 100 кДа.
Известно, что агрегация белков увеличивает их иммуногенность. Понимание этого внесло свой вклад в разработку способов целенаправленной агрегации белков с помощью такой обработки, как термическое денатурирование и перекрестное связывание посредством выдерживания в глутаральдегиде перед приготовлением вакцин или для иммунизации животных с целью вырабатывания антисывороток.
Обнаружено также, что нежелательная агрегация белков вносит вклад в иммунизацию или сенсибилизацию при клиническом использовании терапевтических белков, например, для гамма-глобулина человека (Henney et al. (1968) N. Engl. J. Med. 278:2244-2246) и для человеческого гормона роста (Moore et al. (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51:691-697). Вклад агрегатов в иммуногенность человеческого интерферона альфа был продемонстрирован на мышах BALB/c (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1472-1478), а для его измерения был разработан твердофазный иммуно-ферментный тест (ELISA) (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1394-1400).
Несмотря на известность влияния агрегации на иммуногенность белков, данные о влиянии агрегации на иммуногенность белков, конъюгированных с поли(алкиленгликолями), такими как ПЭГ, отсутствуют. Все еще существует потребность в поли(алкиленгликоль)-уриказных конъюгатах, которые практически устраняют иммуногенность уриказы, не ухудшая ее уриколитическую активность.
Задачей, положенной в основу данного изобретения, является удовлетворение упомянутой существующей общественной потребности.
Раскрытие изобретения
Конъюгирование белков с поли(алкиленгликолями), в особенности с ПЭГ, дает конъюгаты со сниженной иммуногенностью и увеличенным периодом полураспада в кровотоке. При попытках получить практически неиммуногенные конъюгаты уриказы, сохраняющие практически всю уриколитическую активность интактного препарата уриказы, было обнаружено, что следы крупных агрегатов уриказы в исходном материале вызывали неожиданно сильное антителообразование и ускоренное элиминирование из кровотока, что в обоих случаях является ухудшающими факторами для повтора инъекций ПЭГ-конъюгатов, приготовленных из уриказы, содержащей такие агрегаты. Неожиданно изобретатели обнаружили, что присутствие хорошо определенны агрегатов субъединиц уриказы умеренного размера, крупнее оригинального тетрамера, то есть агрегатов, содержащих восемь субъединиц (октамеров), - не вызывает повышение иммуногенности и ускоренное выведение. Октамерная форма уриказы представлена в достаточно высоких концентрациях в большинстве препаратов уриказы, чтобы обнаруживаться по поглощению ею ультрафиолетового излучения, например, с длиной волны 214 нм или 276 нм, или за счет вклада в коэффициент отражения или с помощью других измерений концентрации белка. Тем не менее, было обнаружено, что вклад самих октамеров в иммуногенность и ускоренное выведение ПЭГ-уриказных конъюгатов минимален, в отличие от вклада гораздо меньшего количества еще более крупных агрегатов, которые не обнаруживаются путем ультрафиолетового поглощения в исследуемых условиях, но обнаруживаются путем статического (Рэлеевского) или динамического рассеивания света. Таким образом, было обнаружено, что удаление таких следов очень крупных агрегатов перед конъюгированием с ПЭГ неожиданно сильно снижает иммуногенность и ускоренное выведение получающихся ПЭГ-уриказных конъюгатов.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является очищенная уратоксидаза (уриказа), практически свободная от агрегатов крупнее октамеров. Предпочтительно уриказой является уриказа млекопитающего. Более предпочтительно уриказой является уриказа свиной печени, бычьей печени или овечьей печени.
В одном из аспектов данного предпочтительного варианта осуществления уриказа является рекомбинантной. В еще одном аспекте данного предпочтительного варианта осуществления уриказа в значительной степени имеет последовательность уриказы свиной, бычьей, овечьей печени. Предпочтительно уриказа является химерной. Предпочтительно уриказа является PKS-уриказой.
Предпочтительно уриказа содержит амино-конец и карбоксильный конец, и уриказа усечена на одном конце или на обоих концах. В одном из аспектов данного предпочтительного варианта осуществления описанная выше уриказа конъюгируется с поли(этиленгликолем) или поли(этиленоксидом) при таких условиях, чтобы уриказа в конъюгате была практически свободна от агрегатов крупнее октамеров. Предпочтительно уриказа конъюгируется с поли(этиленгликолем или поли(этиленоксидом) через уретановую (карбаматную), вторичную аминную или амидную связь. В одном из аспектов данного предпочтительного варианта осуществления поли(этиленгликоль) является монометокси поли(этиленгликолем). В еще одном аспекте данного предпочтительного варианта осуществления поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 30 кДа. Предпочтительно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют молекулярный вес приблизительно между 10 кДа и 20 кДа. Преимущественно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 2 и 12 нитями на субъединицу уриказы. Более предпочтительно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 6 и 10 на субъединицу уриказы. Наиболее предпочтительно среднее количество нитей упомянутого поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет приблизительно между 7 и 9 на субъединицу уриказы. Предпочтительно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) является линейным. Альтернативно поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) является разветвленным.
Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию для снижения уровня мочевой кислоты в жидкости или ткани организма, содержащую описанный выше конъюгат уриказы и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно композиция стабилизируется путем лиофилизации и растворяется после восстановления для обеспечения растворов, пригодных для парентерального введения.
Еще одним объектом изобретения является способ очистки уриказы, имеющей пониженную иммуногенность, включающий в себя стадию отделения агрегатов уриказы крупнее октамеров, во фракциях уриказы, и исключения таких агрегатов из очищенной уриказы. Предпочтительно, стадия отделения включает в себя операцию обнаружения агрегатов крупнее октамеров, по меньшей мере в части фракций уриказы, и исключения фракций, содержащих эти агрегаты. Преимущественно операция обнаружения содержит измерение рассеивания света.
Настоящее изобретение также обеспечивает выделенную уриказу, приготовленную в соответствии с вышеописанным способом.
Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является выделенная уратоксидаза (уриказа), в которой, по меньшей мере, 95% от общего количества ее молекул входит в состав тетрамеров и октамеров.
В частном варианте осуществления уратоксидаза выделена из организма млекопитающего.
В предпочтительном варианте осуществления уратоксидаза является выделенной из печени свиньи или печени овцы.
В еще одном частном варианте осуществления уратоксидаза является рекомбинантной.
В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная уриказа имеет аминокислотную последовательность уриказы печени свиньи, уриказы печени быка, уриказы печени овцы или уриказы печени бабуина.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная уриказа является химерной.
В более предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная химерная уратоксидаза включает в себя часть от уриказы, выделенной из печени свиньи, и часть от уриказы, выделенной из печени бабуина.
В еще более предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная химерная уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность свиной уратоксидазы SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 (R291K) и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301 (T301S) (CKS-уриказа).
В другом предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 с остатком гистидина вместо тирозина в положении 97 (Y97H).
В другом частном варианте осуществления источник, из которого выделена уратоксидаза, представляет собой организм гриба или микроба.
В предпочтительном варианте осуществления уратоксидаза является выделенной или рекомбинантной и притом имеет аминокислотную последовательностью организма гриба или микроба, выбранного из группы, состоящей из Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. и Candida utilis.
В частном варианте осуществления источник, из которого выделена уратоксидаза, представляет собой организм беспозвоночного животного.
В предпочтительном варианте осуществления уратоксидаза является выделенной или рекомбинантной и притом имеет аминокислотную последовательность организма беспозвоночного животного, выбранного из группы, состоящей из Drosophila melanogaster и Drosophila pseudoobscura.
В еще одном частном варианте осуществления источник, из которого выделена уратоксидаза, представляет собой растительный организм.
В предпочтительном варианте осуществления уратоксидаза является выделенной или рекомбинантной и притом имеет аминокислотную последовательность растительного организма Glycine max.
В другом частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
Вторым объектом настоящего изобретения является очищенная химерная уратоксидаза (уриказа), по меньшей мере, 95% от общего количества молекул которой входит в состав тетрамеров и октамеров, при этом она имеет аминокислотную последовательность свиной уратоксидазы SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 (R291K) и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301 (T301S) (CKS-уриказа).
Третьим объектом настоящего изобретения являются конъюгаты, включающие очищенную уратоксидазу (уриказу) и поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид), в которых, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
В еще одном частном варианте осуществления, в качестве указанного поли(этиленгликоля) конъюгаты включают в себя монометокси поли(этиленгликоль).
В другом частном варианте осуществления конъюгаты имеют ковалентный линкер между указанными поли(этиленгликолем) или поли(этиленоксидом) и уратоксидазой, выбранный из группы, состоящей из уретанового (карбаматного) линкера, вторичного аминового линкера и амидного линкера.
В частном варианте осуществления конъюгатов, указанные поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют средний молекулярный вес примерно от десяти до шестидесяти тысяч дальтон.
В предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, указанные поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют средний молекулярный вес примерно от десяти до тридцати тысяч дальтон.
В еще одном частном варианте осуществления конъюгатов, среднее количество нитей указанных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до двенадцати.
В предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, среднее количество нитей указанных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от шести до десяти.
В более предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, среднее количество нитей указанных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от семи до девяти.
В другом частном варианте осуществления конъюгатов, в качестве указанного поли(этиленгликоля) они включают в себя линейный поли(этиленгликоль), а в качестве поли(этиленоксида) они включают в себя линейный поли(этиленоксид).
В частном варианте осуществления конъюгатов, в качестве указанного поли(этиленгликоля) они включают в себя разветвленный поли(этиленгликоль), а в качестве указанного поли(этиленоксида) они включают в себя разветвленный поли(этиленоксид).
Четвертым объектом настоящего изобретения являются очищенные фрагменты уратоксидазы (уриказы), представляющие собой укороченную с амино-конца и/или с карбоксильного конца рекомбинантную уриказу.
В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества фрагментов входит в состав тетрамеров и октамеров.
Пятым объектом настоящего изобретения являются конъюгаты, включающие в себя очищенную уратоксидазу (уриказу) и поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид), в которых, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров, притом что среднее количество нитей указанных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до десяти.
В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
В предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, указанные поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют средний молекулярный вес примерно от десяти до шестидесяти тысяч дальтон.
В более предпочтительном варианте осуществления конъюгатов, указанные поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) имеют средний молекулярный вес примерно от десяти до тридцати тысяч дальтон.
Шестым объектом настоящего изобретения является конъюгаты, включающие в себя очищенную уратоксидазу (уриказу) и поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид), в которых, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров, притом что среднее количество нитей указанного поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида), ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до десяти, а средний молекулярный вес названных поли(этиленгликоля) или поли(этиленоксида) составляет примерно от десяти до шестидесяти тысяч дальтон.
В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
Седьмым объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, включающая в себя конъюгат очищенной уриказы с поли(этиленгликолем) или поли(этиленоксидом) и фармацевтически приемлемый носитель, в которой, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
В частном варианте осуществления, композиция имеет стабилизированную лиофилизированную форму, быстро восстанавливаемую растворением с получением раствора, пригодного для парентерального введения.
Восьмым объектом настоящего изобретения является способ очистки уратоксидазы (уриказы) с сохранением ее уриколитической активности, в котором из фракций уратоксидазы выделяют агрегаты уриказы крупнее октамеров и отбрасывают их с получением очищенной уриказы, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул которой входит в состав тетрамеров и октамеров.
В частном варианте осуществления способа, выделение осуществляют посредством ионнообменной хроматографии, размерно-эксклюзионной хроматографии или ультрафильтрации.
В еще одном частном варианте осуществления способа при выделении детектируют и отбрасывают фракции уриказы, содержащие агрегаты крупнее октамеров.
В другом частном варианте осуществления способа детекцию осуществляют посредством измерения светорассеяния.
Девятым объектом настоящего изобретения является выделенная уратоксидаза (уриказа), полученная способом, в котором от тетрамеров уриказы отделяют агрегаты уриказы крупнее октамеров и отбрасывают их с получением очищенной уриказы, по меньшей мере, 95% от общего количества молекул которой входит в состав тетрамеров и октамеров.
В частном варианте осуществления, по меньшей мере, 97% от общего количества молекул уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 иллюстрирует активность уриказы, общие концентрации белков и солей во фракциях, полученных из анионообменной колонки от Pharmacia Biotech Mono Q (1×10 см). Активность уриказы измерялась при комнатной температуре путем отслеживания уменьшения поглощения длины волны 292 нм 100 мкмоль мочевой кислоты в 200 ммоль бората натрия, рН 9,2. Общее количество белка определяют по площади под кривой пика поглощения уриказы при анализах ВЭЖХ с исключением по размеру.
Фиг.2 иллюстрирует анализ с помощью ВЭЖХ с исключением по размеру в колонке Pharmacia Superdex 200 (1×30 см) загрузки и избранных фракций, полученных при Mono Q хроматографии свиной уриказы, содержащей мутации R291K и T301S (PKS уриказа), показывающий данные, полученные детектором светорассеивания при 90°C (верхние кривые) и по поглощению при 276 нм (нижние кривые). Очевидны различные силы сигнала тетрамерных, октамерных и более высокоагрегированных форм уриказы в не разделенном на фракции образце (загрузке) и в различных фракциях. Загрузка была разбавлена в соотношении 1/5 с помощью буфера колонки Mono Q, фракция 5 была разбавлена в соотношении 1/3, а фракция 6 была разбавлена в соотношении 1/9. Фракции 5 и 6 комбинировались, формируя "слабосолевой пул".
Фиг.3 иллюстрирует анализы с исключением по размеру фракций, полученных из колонки Mono Q по фиг.1, показывающие данные, полученные детектором светорассеивания при 90°C и по поглощению при 276 нм, как на фиг.2. Фракции, показанные на данном чертеже, использовались для формирования "сильносолевого пула", из которого ПЭГ-конъюгаты были приготовлены и инъецированы мышам BALB/c. Результирующие активности сыворотки и иммунологические реакции мышей BALB/c показаны на фиг.5 и 6.
Фиг.4 иллюстрирует содержание октамеров, определенное путем поглощения длины волны 276 нм и с помощью рассеивания света при 90 градусах, рассчитанное по данным фиг.2 и 3, в не разделенной на фракции PKS уриказе и в избранных фракциях, полученных с помощью хроматографии PKS уриказы в колонне Mono Q (фиг.1).
Фиг.5 иллюстрирует УФ-исследования, как и на фиг.1, активности уриказы после 4 часов инкубирования при 37°C, в сыворотках, изъятых спустя 24 часа после каждой из шести еженедельных инъекций 6×10 кДа ПЭГ-конъюгатов PKS уриказы или пулов фракций из колонны Mono Q.
Фиг.6 иллюстрирует твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) формирования антитела IgG к ПЭГ-конъюгатам PKS уриказы и к ПЭГ-конъюгатам пулов фракций из колонки Mono Q, показанной на фиг.1, в сыворотках, изъятых спустя 24 часа после каждой из шести еженедельных инъекций 0,2 мг уриказного белка на каждые 20 граммов веса тела самок мышей BALB/c. Для каждой мыши данные по крови через 24 часа после первой-шестой инъекции показаны слева направо. Условия исследования описаны в примере 6. Данные для восьми мышей в каждой группе организованы в порядке возрастания иммунной реакции, слева направо.
Осуществление изобретения
Предыдущие исследования показали, что когда значительное снижение иммуногенности и/или антигенности уриказы достигается посредством ее конъюгирования с ПЭГ (ПЭГ-илирования), оно неизменно связано со значительной потерей уриколитической активности. Настоящее изобретение в частности эксплуатирует тот факт, что следы агрегатов уратоксидаз крупнее октамеров, вносят значительный вклад в иммуногенность и ускоренное выведение ПЭГ-уриказных конъюгатов. Это открытие с наибольшей вероятностью применимо к отличным от уриказ белкам, в том числе к интерферонам и факторам роста.
На безопасность, удобство и финансовую выгоду биомедикаментов отрицательно влияет снижение их силы и вытекающая из этого необходимость увеличения дозы введения. Таким образом, существует необходимость в безопасном и эффективном альтернативном средстве для снижения повышенных уровней мочевой кислоты в жидкостях организма, в том числе в крови и в моче. Настоящее изобретение обеспечивает способ для производства уриказы, свободной от уриказных агрегатов крупнее октамеров, для использования при синтезе ПЭГ-уриказы. Данная ПЭГ-уриказа сохраняет всю или почти всю уриколитическую активность интактного фермента. Также настоящее изобретение обеспечивает очищенную уриказу, практически свободную от агрегатов крупнее октамеров. Термин "практически свободная" указывает на то, что очищенная уриказа содержит не более приблизительно 2%, а предпочтительно не более приблизительно 1% агрегатов крупнее октамеров.
Настоящее изобретение обеспечивает такой способ очистки уриказы, что агрегаты крупнее октамеров, исключаются из очищенного препарата. Поскольку эти крупные агрегаты являются сильно иммуногенными, их наличие в очищенном уриказном препарате нежелательно. Способ включает в себя отслеживание колоночных фракций с помощью светорассеивания вместо или в дополнение к поглощению ультрафиолетового излучения с длиной волны 280 нм, поскольку эти агрегаты могут быть слишком разбавлены, чтобы обнаруживаться с помощью поглощения ультрафиолетового излучения. Очищенная уриказа затем конъюгируется с водорастворимыми полимерами, предпочтительно с поли(этиленгликолями) или поли(этиленоксидами), как описано в параллельно рассматриваемой патентной заявке США №09/370084.
Устранение агрегированной уриказы из препарата, состоящего преимущественно из тетрамерной уриказы, может выполняться любым из способов, известных специалистам, в том числе хроматографией с исключением по размеру, ионообменной хроматографией, ультрафильтрацией сквозь микропористую мембрану и центрифугированием, в том числе ультрацентрифугированием. Способ отделения может содержать разделение и анализ фракций и устранение или исключение тех фракций, которые содержат избыточные количества крупных агрегатов. Получаемый уриказный препарат в большей степени пригоден для синтеза практически неиммуногенных конъюгатов уриказы, чем неразделенная на фракции уриказа. Для постоянного введения важно, чтобы ПЭГ-конъюгаты белков, например ПЭГ-уриказа, имели низкую иммуногенность и не вызывали прогрессирующе быстрое выведение из потока крови после повторяющихся дозировок.
Изобретение также обеспечивает фармацевтические составы полимер-уриказных конъюгатов. Эти конъюгаты являются практически неиммуногенными и сохраняют по меньшей мере 75%, предпочтительно 85%, а более предпочтительно 95% или более уриколитической активности интактного фермента. Уриказы, пригодные для конъюгирования с водорастворимыми полимерами, включают в себя уратоксидазы естественного происхождения, выделенные из животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, а также рекомбинантные формы уриказы, в том числе мутантные, гибридные и/или усеченные ферментативно-активные варианты уриказы. Водорастворимые полимеры, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают в себя линейные и разветвленные поли(этиленгликоли) или поли(этиленоксиды), совместно известные как ПЭГ. Примеры разветвленных ПЭГ являются предметом патента США №5643575. Одним из предпочтительных примеров ПЭГ является монометоксиПЭГ с общей структурой CH3O-(CH2CH2O)nH, где n варьирует от приблизительно 100 до приблизительно 2300.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является конъюгат уратоксидазы (уриказы), который сохраняет по меньшей мере приблизительно 75% уриколитической активности неконъюгированной уриказы и обладает значительно сниженной иммуногенностью. Уриказа по данному аспекту изобретения может быть рекомбинантной. Является она рекомбинантной или нет, это может быть уриказа, происходящая от млекопитающего. В одном из аспектов данного варианта осуществления уриказа может быть уриказой свиной, бычьей или овечьей печени. В еще одном аспекте данного варианта осуществления уриказа может быть химерной. Химерная уриказа может содержать части уриказы свиной печени и/или уриказы печени бабуина. Например, химерная уриказа может быть свиной уриказой, содержащей мутации R291K и T301S (PKS уриказа). Альтернативно, уриказа может быть уриказой печени бабуина, в которой тирозин 97 заменен на гистидин, причем специфическая активность уриказы может быть увеличена по меньшей мере, на 60%. Уриказа по изобретению, какого бы происхождения она ни была, может также быть в укороченной форме, либо со стороны амино-конца, либо со стороны карбоксильного конца, либо с обоих концов. Подобным же образом уриказа может быть грибной или микробной уриказой. В одном из аспектов данного варианта осуществления грибная или микробная уриказа может являться естественной или рекомбинантной формой уриказы из Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis. Bacillus sp. или Candida utilis. Альтернативно уриказа может быть уриказой беспозвоночного, такой как, к примеру, естественная или рекомбинантная форма уриказы из Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura. Уриказа по изобретению может быть также растительной уриказой, например естественной или рекомбинантной формой уриказы из клубеньков соевого корня (Glycine max). ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно между 5 кДа и 100 кДа; предпочтительно ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно между 8 кДа и 60 кДа; более предпочтительно ПЭГ может иметь средний молекулярный вес между приблизительно 10 кДа и приблизительно 40 кДа, например от 10 до 20 кДа. Среднее количество ковалентно связанных нитей ПЭГ может составлять от 2 до 12 нитей на субъединицу уриказы; предпочтительно, среднее количество ковалентно связанных нитей составляет от 6 до 10 на субъединицу; более предпочтительно, среднее количество нитей ПЭГ составляет от 7 до 9 на субъединицу. В одном из аспектов данного варианта осуществления уриказа может быть тетрамерной. Нити ПЭГ могут быть ковалентно связаны с уриказой через уретановые (карбаматные) связи, вторичные аминные связи и/или амидные связи. Если уриказа является рекомбинантной формой любой подразумеваемой здесь уриказы, то эта рекомбинантная форма может в значительной степени иметь последовательность естественной формы.
Одной из предпочтительных уриказ млекопитающего является рекомбинантная химерная уриказа свиньи-бабуина, составленная из частей последовательностей уриказы свиной печени и печени бабуина, обе из которых были впервые определены Wu, et al., (1989). Один из примеров такой химерной уриказы содержит первые 288 аминокислот свиной последовательности (SEQ ID NO:1), а последние 16 аминокислот бабуиновой последовательности (SEQ ID NO:2). Hershfield, et al. International Publication WO 00/08196, Urate Oxidase, опубликовано 17 февраля 2000. Поскольку последняя последовательность отличается от свиной последовательности только в двух позициях, содержа лизин (K) вместо аргинина в остатке 291 и серии (S) вместо треонина в остатке 301, этот мутант обозначается как свиная-K-S, или PKS уриказа (SEQ ID NO:3). PKS уриказа имеет на один лизиновый остаток больше и, следовательно, на один потенциальный сайт ПЭГилирования больше, чем свиная или бабуиновая последовательности.
кДНК для различных уриказ млекопитающих, в том числе PKS уриказы, были субклонированы, и были определены оптимальные условия для экспрессии в E.coli с помощью стандартных способов. См. Erlich, НА, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. New York: Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Рекомбинантные уриказы экстрагировали, очищали, а их стабильность и активность исследовали с помощью модификаций стандартных тестов. См. Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240:2491-2494; Nishimura, et al., (1979), и примеры 1 и 5.
В одном из вариантов осуществления изобретения уриказа может конъюгироваться с помощью биологически стабильной, нетоксичной, ковалентной связи с относительно небольшим количеством нитей ПЭГ. Такие связи могут быть уретановыми (карбаматными) связями, вторичными аминными связями и амидными связями. Различные активированные ПЭГ, пригодные для такого конъюгирования, доступны коммерчески у фирмы Shearwater Polymers, Huntsville, AL.
Например, уретановые связи с уриказой могут формироваться путем инкубирования уриказы в присутствии сукцинимидилкарбонатного (СК) или р-нитрофенилкарбонатного (НФК) производного ПЭГ. СК-ПЭГ может быть синтезирован с помощью процедуры, описанной в патенте США №5612460. НФК-ПЭГ может быть синтезирован путем реагирования ПЭГ с п-нитрофенилхлорформатом в соответствии со способами, описанными в Veronese, FM, et al., (1985) Appi Biochen Biotechnol 11:141-152, и в патенте США №5286637. Способы, описанные в патенте '637, адаптированы для ПЭГ с большим молекулярным весом путем регулирования концентраций реагентов для поддержания подобной стехиометрии. Альтернативный способ синтеза НФК-ПЭГ описан в Buttner, W, et al., описание патента ГДР №279486 А1.
Амидные связи с уриказой могут быть получены с помощью N-гидроксисукцинимидного сложноэфирного карбоксилово-кислотного производного ПЭГ (Shearwater Polymers). Вторичные аминные связи могут быть сформированы с помощью 2,2,2-трифторэтансульфонилового ПЭГ (тресил ПЭГ; Shearwater Polymers) или путем восстанавливающего алкилирования с помощью ПЭГ-альдегида (Shearwater Polymers) и цианборгидрата натрия.
В конъюгатах, содержащих ПЭГ с молекулярным весом 10 кДа, максимальное количество нитей ПЭГ, которые связывались с одной субъединицей при сохранении по меньшей мере 75% уриколитической активности интактного фермента, составляло приблизительно 12 нитей для уриказ млекопитающих (например, PKS уриказы, мутеина свиной уриказы; см. условия теста в Примере 5). Последний объем ПЭГ-илирования соответствовал приблизительно 40% всех аминогрупп. В одном из вариантов выполнения изобретения среднее количество нитей ПЭГ, связанных с субъединицей уриказы, составляло приблизительно между 2 и 12. В предпочтительном варианте осуществления среднее количество нитей ПЭГ, связанных с субъединицей уриказы, составляло приблизительно между 6 и 10. В более предпочтительном варианте осуществления среднее количество ковалентно связанных с субъединицей уриказы нитей ПЭГ составляло приблизительно между 7 и 9. В еще одном варианте осуществления молекулярный вес ПЭГ, использованных в реакции связывания, составлял приблизительно между 5 кДа и 30 кДа, предпочтительно приблизительно между 10 кДа и 20 кДа.
Существует несколько факторов, которые могут влиять на выбор оптимального молекулярного веса и количества нитей ПЭГ для связывания с определенной формой уриказы. В целом уменьшение или устранение иммуногенности без значительной потери уриколитической активности может потребовать связывания сравнительно большего количества нитей ПЭГ более низкого молекулярного веса по сравнению с относительно меньшим количеством нитей ПЭГ более высокого молекулярного веса. Подобным же образом, каждая отличная форма уриказы может иметь различный оптимум по отношению и к размеру, и к количеству нитей. Оптимальное количество нитей ПЭГ и молекулярный вес ПЭГ могут быть определены с помощью описываемых здесь способов.
Если ПЭГ-конъюгаты уриказы млекопитающего были приготовлены из очищенных тетрамерных и октамерных форм фермента (содержащих четыре или восемь субъединиц весом приблизительно 35 кДа), они проявляли коренным образом ослабленную иммуногенность у мышей, в противоположность умеренной иммуногенности ПЭГ-конъюгатов препаратов уриказы, содержавших крупные агрегаты (см. фиг.6), и очень высокой иммуногенности интактного фермента.
Очищенные препараты естественных и рекомбинантных уриказ обычно содержат смесь очень крупных агрегатов фермента вдобавок к тетрамерной (140 кДа) и октамерной (280 кДа) формам. Процент уриказы, находящейся либо в тетрамерной, либо в октамерной форме в каждом уриказном препарате, обычно варьируется приблизительно от 20% до 95% (см. фиг.2-4). Несмотря на очевидность того, что не-ПЭГ-илированные агрегаты нескольких других белков являются высокоиммуногенными (например, см. Moore, WV, et al., (1980) JCIin Endocrinol Metab 51:691-697), предшествующие исследования ПЭГ-уриказы не описывали никаких попыток ограничить содержание агрегатов, что говорит о том, что потенциальная иммуногенность ПЭГ-модифицированных агрегатов не рассматривалась. На основе наблюдений изобретателей представляется вероятным, что такие агрегаты присутствовали в ферментных препаратах, использовавшихся ранее для синтеза ПЭГ-уриказы. Их присутствие могло усложнять задачу приготовления неиммуногенных конъюгатов. Представляется также, что большие потери уриколитической активности, наблюдавшиеся при предыдущих попытках ПЭГ-илирования уриказы, были связаны с большим количеством нитей ПЭГ низкого молекулярного веса, которые связывались. С другой стороны, способы очистки и ПЭГ-илирования уриказы, описанные здесь, обеспечивают ковалентное присоединение 12 нитей ПЭГ на субъединицу, сохраняя при этом более 75% уриколитической активности, по меньшей мере для некоторых уриказ, например, PKS уриказы (мутеина свиных уриказ) и фермента из термофильной Bacillus sp.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления практически все крупные агрегаты фермента могут быть удалены ионообменной хроматографией (фиг.1, 2 и 3) или хроматографией с исключением по размеру при рН приблизительно между 9 и 10,5, предпочтительно 10,2 перед конъюгированием полученного практически свободного от агрегатов препарата уриказы с ПЭГ. Молекулярный вес уриказы в каждой фракции, полученной из препаративной колонки, может быть отслежен посредством любой зависящей от размера аналитической технологии, в том числе, например, ВЭЖХ, общепринятой хроматографии с исключением по размеру, центрифугирования, светорассеивания, капиллярного электрофореза или гель-электрофореза в неденатурирующем буфере. Для свободной от агрегатов уриказы, выделенной с помощью хроматографии с исключением по размеру, только фракции, содержащие формы фермента с весом 140 кДа и 280 кДа, могут объединяться и использоваться для конъюгирования с ПЭГ. Для тетрамерной и октамерной уриказы, выделенной с помощью ионообменной хроматографии, фракции, полученные из ионообменной колонны, могут анализироваться в отношении размера для определения того, какие фракции содержат значительные количества тетрамерных и октамерных форм без крупных агрегатов, с помощью светорассеивания. В очищенном продукте нежелательные крупные агрегаты могут, таким образом, составлять не более приблизительно 1% или менее от всей уриказы.
Результаты, представленные здесь, показывают, что, даже в случае сильного ПЭГ-илирования, формы PKS уриказы крупнее октамеров, провоцируют ускоренное выведение (фиг.5) и являются в некоторой степени иммуногенными для мышей (фиг.6). Напротив, конъюгаты, приготовленные из уриказы, которая была практически свободна от крупных агрегатов (обнаруживаемых с помощью светорассеивания), могут повторно инъецироваться по меньшей мере шесть раз с интервалом в одну неделю с гораздо менее заметным увеличением скоростей выведения (фиг.5) и без обнаруживаемого формирования антител, как было показано с помощью чувствительного твердофазного иммуноферментного теста (фиг.6). Использование высокоочищенной тетрамерной или октамерной уриказы дополнительно отличает улучшенные конъюгаты по настоящему изобретению от препаратов ПЭГ-уриказы, описанных ранее. Напротив, наличие значительного количества крупных агрегатов в препаратах уриказы, использовавшихся некоторыми прежними исследователями, могло приводить к попыткам связывания большого количества нитей ПЭГ для подавления иммуногенности. Вследствие этого ферментативная активность получавшихся конъюгатов сильно ослаблялась.
ПЭГ-уриказные конъюгаты по настоящему изобретению полезны для снижения уровней мочевой кислоты в жидкостях и тканях организма млекопитающих, предпочтительно людей, и, таким образом, может использоваться для лечения повышенных уровней мочевой кислоты, связанных с такими состояниями как подагра, подагрические узлы, почечная недостаточность, трансплантация и злокачественное заболевание органа. ПЭГ-уриказные конъюгаты могут инъецироваться млекопитающему, имеющему избыточные уровни мочевой кислоты, любым из нескольких маршрутов, в том числе внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно и внутрибрюшинно. Альтернативно, они могут распыляться и ингалироваться. См. Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19:3-36 и патент США №5458135. Эффективная дозировка ПЭГ-уриказы по настоящему изобретению будет зависеть от уровня мочевой кислоты и размера индивида. В одном из вариантов осуществления этого аспекта изобретения ПЭГ-уриказа вводится в фармацевтически приемлемом наполнителе или разбавителе в количестве от приблизительно 10 мкг до приблизительно 1 г. В предпочтительном варианте осуществления вводимое количество составляет приблизительно между 100 мкг и 500 мг. Более предпочтительно конъюгированная уриказа вводится в количестве между 1 мг и 100 мг, например 5 мг, 20 мг или 50 мг. Массы, заданные для дозировок по вариантам осуществления, относятся к количеству белка в конъюгате.
Фармацевтические композиции, содержащие ПЭГ-уриказу, могут быть приготовлены посредством общепринятых технологий, например, как описано в Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Easton, PA: Mack Publishing Co. Пригодные наполнители для приготовления инъекционных растворов включают в себя, например, фосфатно-буферный солевой раствор, лактатный раствор Рингера, воду, полиолы и глицерин. Фармацевтические композиции для парентеральной инъекции содержат фармацевтически приемлемые стерильные водные и неводные жидкости, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий прямо перед использованием. Эти композиции могут содержать такие дополнительные компоненты, как, к примеру, консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, увлажняющие агенты, эмульгаторы, буферы, антиоксиданты и разбавители.
ПЭГ-уриказа может также предоставляться в виде композиций с управляемым высвобождением для имплантации индивиду для продолжительного управления повышенными уровнями мочевой кислоты в жидкостях организма. Например, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, регенерированный коллаген, поли-L-лизин, алгинат натрия, геллановая резина, хитозан, агароза, многопластинчатые липосомы и многие общепринятые формулы пролонгированного действия содержат биоэродирующие и биоразрушаемые материалы, которые могут вводиться в формулу с биологически активными составами. Эти материалы, будучи имплантированными или введенными путем инъекции, постепенно разрушаются и высвобождают активный материал в окружающую ткань. Например, один из способов инкапсулирования ПЭГ-уриказы содержит способ, раскрытый в патенте США №5653974. Использование биоэродируемых, биоразрушаемых и прочих композиций пролонгированного действия явно включено в настоящее изобретение. Использование инфузионных насосов и систем матричных носителей для доставки ПЭГ-уриказы также входит в объем настоящего изобретения. ПЭГ-уриказа также может выгодным образом инкапсулирована в мицеллы или липосомы. Технология липосомной инкапсуляции хорошо известна из уровня техники. См., например, Lasic, D, et al., (Eds.) (1995) Stealth Liposomes. Boca Raton, FL: CRC Press.
Фармацевтические композиции с ПЭГ-уриказой по настоящему изобретению уменьшат потребность в гемодиализе для пациентов с высоким риском вызванной уратами почечной недостаточности, например для пациентов с трансплантированным органом (см. Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron 56:317-321) и пациентов с некоторыми злокачественными заболеваниями. У пациентов с большими отложениями кристаллических уратов (подагрическими узлами) такие фармацевтические композиции улучшат качество жизни быстрее, чем доступное в настоящее время лечение.
Последующие примеры, которые не следует рассматривать, как какое-либо ограничение изобретения, иллюстрируют различные раскрытые выше аспекты. Эти примеры описывают ПЭГ-уриказы, приготовленные путем связывания активированного ПЭГ (например, производного п-нитрофенилкарбоната) с мутеином свиной уриказы. Эти примеры дают специалисту руководство для производства практически неиммуногенных конъюгатов уриказы, которые сохраняют, по меньшей мере, приблизительно 75% уриколитической активности интактного фермента и хорошо пригодны для постоянного введения.
Пример 1
Препаративная ионообменная хроматография уриказы
Препаративная ионообменная хроматография выполнялась на аппарате быстрой белковой жидкостной хроматографии (ББЖХ) (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Колонку Mono Q (1×10 см, Amersham Pharmacia) элюируют градиентом от 50 ммоль карбоната натрия, рН 10,3, 0,1 моль NaCl (буфер А) до 50 ммоль карбоната натрия, рН 10,3, 0,6 моль NaCl (буфер Б) со скоростью потока 0,5 мл/мин, за исключением того, что образец загружают с более низкой скоростью потока. Эту технологию используют для разделения на фракции 25 мл раствора PKS уриказы (рН 10,3). PKS уриказа была получена у фирмы Bio-Tecnology General Limited (Rehovot, Israel). Уриказа являлась рекомбинантной свиной уриказой, в которой один лизиновый остаток (K) и один сериновый остаток (S) заменили один аргининовый остаток и один треониновый остаток, соответственно, в родительской свиной последовательности (Lee et al., (1988) Science 239:1288-1291; Wuet at., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:9412-9416). После загрузки образца колонна промывалась с помощью 100 мл буфера А. Пикуриказы начал элюироваться в конце 31-мл линейного буфера Б с градиентом от 0 до 26%. Большая часть уриказы изократически элюируется 7 мл буфера, содержащего 26% буфера Б. Остаток восстановленной уриказы элюируют 89-мл буфера Б с линейным градиентом от 26% до 100%. Фракции 4 мл или 6 мл собирают. Аликвотные количества фракций №4-11 тестируют на уриказу и общее содержание белка (фиг.1) и анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с исключением по размеру, как описано в примере 2 (фиг.2 и 3). Оставшиеся части фракций №5-10 связывают с ПЭГ, как описано в примере 3. На основании результатов анализов примера 2 ПЭГ-конъюгаты фракций №5 и 6 объединяют в качестве "слабосолевого пула", а ПЭГ-конъюгаты фракций №7-10 объединяют в качестве "сильносолевого пула", как показано на фиг.1.
Пример 2
Хроматография с исключением по размеру уриказы, отслеженной по светорассеиванию и ультрафиолетовому поглощению
ВЭЖХ с исключением по размеру проводят при комнатной температуре на колонне Superdex 200 (1×30 см, Amersham Pharmacia Biotech) над неразделенной на фракции PKS уриказой и над избранными фракциями из препаративной Mono Q-хроматографии PKS уриказы по примеру 1. Светорассеяние элюата из монитора поглощения (UV 2000) Thermo Separations HPLC (Sunnyvale, CA) анализируют на детекторе MiniDawn компании Wyatt Technologies (Santa Barbara, CA) при угле падения света 90 градусов.
Результаты, показанные на фиг.2-4, иллюстрируют различие между тетрамером, октамером и крупными агрегатами субъединиц уриказы и различные сигналы, зафиксированные от этих форм уриказы в различных образцах. В отличие от сигнала поглощения, который прямо пропорционален концентрации, сигнал светорассеивания пропорционален произведению концентрации и размера светорассеивающей единицы. Результирующая чувствительность детектора светорассеивания к очень малым количествам сильноагрегированной уриказы позволила обнаружить наличие самых крупных агрегатов, которые элюировали в мертвом объеме (приблизительно 7 мл).
Пример 3
Синтез ПЭГ-уриказных конъюгатов
Нефракционированную PKS уриказу (от Bio-Technology General Limited) и уриказу в виде фракций из колонки Mono Q по примеру 1 связывают с ПЭГ весом 10-40 кДа с помощью р-нитрофенилкарбонатного производства ПЭГ (НФК-ПЭГ), полученного от Shearwater Polymers (Huntsville, AL). Получение НФК-ПЭГ из ПЭГ с помощью фенилхлорформатов было описано в нескольких статьях (например, Veronese, FM, et at., (1985) Appi Biochem Biotechnol 11:141-152; Kito, M, et al., (1996)J Clin Biochem Nutr 21:101-111), a НФК-ПЭГ использовался для синтеза ПЭГ-белковых конъюгатов предыдущими исследователями, в том числе, данными изобретателями (например, Veronese, FM, выше; Sherman, MR, et at., в JM Harris, et al., (Eds.) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp.155-176) Washington, DC: American Chemical Society). Количество нитей ПЭГ весом 10-40 кДа, связанных с каждой субъединицей уриказы определялось равным шести в соответствии со способом, описанным у Kumtani, M, et al., (1991) J Chromatogr 588:125-137.
Пример 4
Устойчивость и иммуногенность уриказы и ПЭГ-уриказы в сыворотке in vivo
ПЭГ-конъюгаты рекомбинантных уриказ млекопитающих, приготовленные в соответствии со способом по примеру 3, доводят до 1 мг белка в фосфатно-буферном солевом растворе (ФБС), рН 7,4, для инъецирования. Образцы замораживают и хранят до анализа или инъецирования. Образцы нагревают до 37°C вплоть до 1 часа перед инъецированием группам из восьми самок мышей BALB/c. Группы мышей имели средний вес в диапазоне 18-22 г в начале исследования.
Вес всех мышей отслеживают, и записывают показания по всем побочным реакциям на инъекции или прочим болезненным состояниям. Через двадцать четыре часа после каждой из шести еженедельных инъекций животным делалась анестезия с помощью кетамина, и ретроорбитально получают 100-200 мкл крови, кроме случая умерщвления (обескровливания), когда собирался больший объем. Сыворотку готовят из крови, которая свертывается в течение от 4 до 32 часов при 2-8°C. Сыворотки хранят при -20°C. Сыворотки анализируют на уриколитическую активность, как описано в примере 5, и анализировались на антитела к уриказам, как описано в примере 6.
Пример 5
Тесты уриколитической активности ПЭГ-уриказы в сыворотках мышей, инъецированных ПЭГ-уриказой
Тест на активность, основанный на поглощении ультрафиолетового света (УФ-тест), выполняют с помощью 100 мкмоль мочевой кислоты в качестве субстрата в 200 ммоль бората натрия, рН 9,2, в микропластиночной модификации способа I. Fridovich (J Biol Chem. (1965) 240:2491-2494). Уменьшение поглощения длины волны 292 нм отслеживают в течение 15 минут при комнатной температуре в 96-ячеечном планшете с прозрачным для УФ-излучения дном (Costar, Coming, NY) с помощью микропластиночного считывателя SpectraMAX 250 компании Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Данные анализировались путем нахождения максимальной крутизны характеристики (в милли-единицах поглощения в минуту) измерений поглощения, выполненных в ходе интервала, в течение которого окислилось от 10 до 40% субстрата. Результаты, полученные с помощью данного теста, проиллюстрированы на фиг.1 и 5.
Средний период полураспада в сыворотках мышей, инъецированных впервые с помощью PKS уриказы, связанной с шестью нитями ПЭГ весом 10 кДа, на субъединицу (6×10-кДа ПЭГ PKS) составлял 29±4 часа на основании данных сывороток, полученных через 24 и 72 часа после инъекции.
В отдельных экспериментах было установлено, что обнаруживаемая уриколитическая активность в сыворотках мышей, инъецированных с помощью ПЭГ-уриказы, уменьшалась во время хранения при -20°C, и что максимальное восстановление данной активности достигалось путем 4-часового инкубирования при 37°C перед исследованием. Фиг.5 показывает, что восстановление уриколитической активности после повторных еженедельных инъекций 6×10-кДа ПЭГ PKS уриказы было наибольшим, когда фермент очищался посредством хроматографии в колонке Mono Q, как в примере 1, перед ПЭГилированием в соответствии со способом по примеру 3. Восстановление было наивысшим после инъецирования конъюгатов, приготовленных из пула сильносолевых элюатов по примеру 1 (см. фиг.1), который имеет наименьшее содержание очень крупных агрегатов (см. профили светорассеивания фракций 7-10 на фиг.3). Немедленное восстановление достигалось с помощью конъюгатов, приготовленных из пула слабосолевых элюатов из колонны Mono Q по примеру 1, а наихудшее восстановление достигалось с помощью конъюгатов, выполненных из неразделенной на фракции PKS уриказы, которая имела наименьшее содержание очень крупных агрегатов (см. фиг.2). Тот же порядок относительных активностей, восстановленных в сыворотке после повторных инъекций (сильносолевой пул > слабосолевой пул > неразделенная уриказа) наблюдался независимо оттого, использовался ли описанный выше УФ-тест или колорометрический тест, адаптированный из способа Р. Fossati et al., (J. Clin Chem (1980) 26:227-231), и независимо от того, инкубировались ли сыворотки при 37°C перед тестированием.
Пример 6
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) сывороток мышей, инъецированных с помощью ПЭГ-уриказы
Неконкурентные анализы ELISA производились на свиной уриказе, сорбированной на 96-ячеечных планшетах Immulon 2 (Dynex Technologies, VWR Scientific, San Francisco, CA). Первичные антисыворотки брались у мышей, инъецированных уриказой или 6×10-кДа ПЭГ-конъюгатами, приготовленными в соответствии со способом по примеру 3. Вторичное антитело являлось козлиным антимышиным IgG, связанным с пероксидазой хрена (Calbiochem-Novabiochem #401 253, La Jolla, CA), а субстратом являлся о-фенилендиаминдигидрохлорид (Sigma P-9187, St. Louis, МО), как описано в В. Porstmann et al., (J dm. Chem. din. Biochem. (1981) 19:435-440).
Фиг.6 иллюстрирует результаты неконкурентных тестов ELISA. Результаты демонстрируют, что 6×10-кДа ПЭГ-уриказа, синтезированная в соответствии со способом по примеру 3 из сильносолевого элюата из колонки Mono Q по примеру 1 (показанному на фиг.1), не вызывала обнаруживаемых иммунных реакций ни в одной из восьми мышей, получавших еженедельные инъекции в течение шести недель. Несколько мышей, инъецированных конъюгатами, приготовленными из не разделенной на фракции PKS уриказы в соответствии со способом по примеру 3, проявили слабые, но обнаруживаемые иммунные реакции. Наиболее частые случаи иммунных реакций наблюдались у мышей, инъецированных конъюгатами, приготовленными в соответствии со способом по примеру 3 из пула слабосолевых элюатов из колонки Mono Q по примеру 1.
Без преимуществ, обусловленных детектором светорассеивания в анализах ВЭЖХ с исключением по размеру, как описано в примере 2, не было бы очевидно, что присутствие самых крупных агрегатов неоктамерной формы уриказы связано с прогрессивно уменьшающимся восстановлением ПЭГ-уриказных конъюгатов после повторных инъекций, что наблюдалось в примере 5 (фиг.5), и с увеличением иммуногенности у мышей BALB/c, что наблюдалось в примере 6 (фиг.6). Эти результаты имеют важные следствия для спецификаций уриказы, используемой в качестве стартового материала для производства ПЭГ-уриказы для клинического использования.
Хотя изобретение было описано иллюстративно с некоторыми подробностями и в виде примеров в целях ясности понимания, специалисту будет понятно, в свете описания в данном изобретении, что в изобретение могут быть внесены определенные изменения и модификации без отхода от сущности и объема, который описан и составляет формулу изобретения.

Claims (23)

1. Очищенный препарат уратоксидазы, обладающий сниженной иммуногенностью, включающий уратоксидазу с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, в которой остаток аргинина заменен остатком лизина в положении 291, а остаток треонина заменен остатком серина в положении 301, причем по меньшей мере 95% от общего количества ее молекул входит в состав тетрамеров и октамеров.
2. Очищенная рекомбинантная уратоксидаза (уриказа), характеризующаяся содержанием тетрамеров и октамеров по меньшей мере 95% от общего количества ее молекул, при этом она имеет аминокислотную последовательность свиной уратоксидазы SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 (R291K) и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301 (T301S) (PKS-уриказа).
3. Конъюгат для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, включающий очищенную уратоксидазу (уриказу) и полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, при этом уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301, причем по меньшей мере 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
4. Конъюгат по п. 3, в котором полиэтиленгликоль представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль.
5. Конъюгат по п. 3, который содержит ковалентный линкер между
полиэтиленгликолем или полиэтиленоксидом и уратоксидазой, выбранный из группы, включающей уретановый (карбаматный) линкер, вторичный аминовый линкер и амидный линкер.
6. Конъюгат по п. 3, в котором полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид имеют средний молекулярный вес приблизительно 10000-60000 Да.
7. Конъюгат по п. 6, в котором полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид имеют средний молекулярный вес приблизительно 10000-30000 Да.
8. Конъюгат по п. 3, в котором среднее количество нитей полиэтиленгликоля или полиэтиленоксида, ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до двенадцати.
9. Конъюгат по п. 8, в котором среднее количество нитей полиэтиленгликоля или полиэтиленоксида, ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от шести до десяти.
10. Конъюгат по п. 9, в котором среднее количество нитей полиэтиленгликоля или полиэтиленоксида, ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от семи до девяти.
11. Конъюгат по п. 3, в котором полиэтиленгликоль представляет собой линейный полиэтиленгликоль, а полиэтиленоксид представляет собой линейный полиэтиленоксид.
12. Конъюгат по п. 3, в котором полиэтиленгликоль представляет собой разветвленный полиэтиленгликоль, а полиэтиленоксид представляет собой разветвленный полиэтиленоксид.
13. Очищенные фрагменты уратоксидазы (уриказы), включающие рекомбинантную уратоксидазу с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, в которой остаток аргинина заменен остатком лизина в положении 291, а остаток треонина заменен остатком серина в положении 301, укороченную с амино-конца по большей мере на 5 аминокислот и/или с карбоксильного конца по большей мере на 3 аминокислоты, причем по меньшей мере 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
14. Конъюгат для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, включающий в себя очищенную уратоксидазу (уриказу) и полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, при этом уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301, а по меньшей мере 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров, причем среднее количество нитей указанных полиэтиленгликоля или полиэтиленоксида, ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до десяти.
15. Конъюгат по п. 14, в котором полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид имеют средний молекулярный вес приблизительно 10000-60000 Да.
16. Конъюгат по п. 15, в котором полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид имеют средний молекулярный вес приблизительно 10000-30000 Да.
17. Конъюгат для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, включающий в себя очищенную уратоксидазу (уриказу) и полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, при этом уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301, а по меньшей мере 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров, причем среднее количество нитей указанного полиэтиленгликоля или полиэтиленоксида, ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоят указанные тетрамеры и октамеры, составляет от двух до десяти, а средний молекулярный вес названных полиэтиленгликоля или полиэтиленоксида составляет приблизительно 10000-60000 Да.
18. Фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, включающая в себя эффективное количество конъюгата очищенной уратоксидазы (уриказы) с полиэтиленгликолем или полиэтиленоксидом и фармацевтически приемлемый носитель, при этом уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301, причем по меньшей мере 95% от общего количества молекул указанной уратоксидазы входит в состав тетрамеров и октамеров.
19. Композиция по п. 18, которая имеет стабилизированную лиофилизированную форму, быстро восстанавливаемую растворением с получением раствора, пригодного для парентерального введения.
20. Способ очистки уратоксидазы (уриказы) с сохранением ее уриколитической активности, включающий выделение и отбрасывание агрегатов уриказы крупнее октамеров с получением очищенной уриказы, при этом уратоксидаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301, причем по меньшей мере 95% от общего количества молекул которой входит в состав тетрамеров и октамеров.
21. Способ по п. 20, в котором выделение осуществляют посредством ионнообменной хроматографии, размерно-эксклюзионной хроматографии или ультрафильтрации.
22. Способ по п. 20, в котором при выделении детектируют и отбрасывают фракции уриказы, содержащие агрегаты крупнее октамеров.
23. Способ по п. 22, в котором детектирование осуществляют посредством измерения светорассеяния.
RU2009104003/10A 2000-02-10 2009-02-06 Очищенный препарат уратоксидазы, очищенная рекомбинантная уратоксидаза, конъюгат (варианты) и фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, очищенные фрагменты уратоксидазы и способ очистки уратоксидазы. RU2557318C9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/501,730 2000-02-10
US09/501,730 US6783965B1 (en) 2000-02-10 2000-02-10 Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2006107110/13A Division RU2352354C2 (ru) 2000-02-10 2001-02-07 Свободная от агрегатов уратоксидаза для приготовления неиммуногенных полимерных конъюгатов

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2009104003A RU2009104003A (ru) 2010-08-20
RU2557318C2 RU2557318C2 (ru) 2015-07-20
RU2557318C9 true RU2557318C9 (ru) 2015-09-10

Family

ID=23994789

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2006107110/13A RU2352354C2 (ru) 2000-02-10 2001-02-07 Свободная от агрегатов уратоксидаза для приготовления неиммуногенных полимерных конъюгатов
RU2002120486/13A RU2281954C2 (ru) 2000-02-10 2001-02-07 Очищенный препарат уриказы млекопитающего, способ его получения, препарат активного уриказного конъюгата и фармацевтический состав
RU2009104003/10A RU2557318C9 (ru) 2000-02-10 2009-02-06 Очищенный препарат уратоксидазы, очищенная рекомбинантная уратоксидаза, конъюгат (варианты) и фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, очищенные фрагменты уратоксидазы и способ очистки уратоксидазы.

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2006107110/13A RU2352354C2 (ru) 2000-02-10 2001-02-07 Свободная от агрегатов уратоксидаза для приготовления неиммуногенных полимерных конъюгатов
RU2002120486/13A RU2281954C2 (ru) 2000-02-10 2001-02-07 Очищенный препарат уриказы млекопитающего, способ его получения, препарат активного уриказного конъюгата и фармацевтический состав

Country Status (28)

Country Link
US (3) US6783965B1 (ru)
EP (3) EP2196538B1 (ru)
JP (2) JP5165826B2 (ru)
KR (3) KR101054247B1 (ru)
CN (2) CN100491532C (ru)
AT (1) ATE463576T1 (ru)
AU (3) AU4997501A (ru)
BE (1) BE2013C045I2 (ru)
BR (1) BRPI0108386B8 (ru)
CA (1) CA2398679C (ru)
CY (3) CY1110142T1 (ru)
CZ (1) CZ304864B6 (ru)
DE (1) DE60141742D1 (ru)
DK (3) DK2196538T3 (ru)
ES (2) ES2343105T3 (ru)
FR (1) FR13C0036I2 (ru)
HK (4) HK1056742A1 (ru)
HU (1) HU227127B1 (ru)
IL (3) IL151065A0 (ru)
LU (1) LU92237I2 (ru)
MX (1) MXPA02007545A (ru)
NZ (1) NZ520434A (ru)
PL (1) PL208064B1 (ru)
PT (2) PT1254237E (ru)
RU (3) RU2352354C2 (ru)
TW (2) TW200914617A (ru)
WO (1) WO2001059078A2 (ru)
ZA (1) ZA200207206B (ru)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
JP5183836B2 (ja) * 1998-08-06 2013-04-17 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
US20060188971A1 (en) * 1998-08-06 2006-08-24 Duke University Urate oxidase
PT1100880E (pt) 1998-08-06 2011-01-13 Univ Duke Urato-oxidase
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
CA2338665C (en) 1998-08-06 2011-01-18 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
US7229810B2 (en) 2001-06-28 2007-06-12 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of proteinases
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
EP2298278B1 (en) 2002-06-07 2015-11-11 Dyax Corp. Prevention and reduction of blood loss and inflammatory response
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
RS20050502A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of interferon- beta with enhanced biological potency
WO2004101600A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof
ES2395413T3 (es) * 2003-05-12 2013-02-12 Affymax, Inc. Péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina
MXPA05012314A (es) * 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Radical separador para peptido modificado con polietilenglicol.
CA3050564A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
JP2008519858A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
CA2602654A1 (en) * 2005-04-05 2006-10-12 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Method for shielding functional sites or epitopes on proteins
US8148123B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
US20080159976A1 (en) * 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
ES2856881T3 (es) 2005-04-11 2021-09-28 Horizon Pharma Rheumatology Llc Formas variantes de urato oxidasa y su uso
EP1871877A2 (en) 2005-04-11 2008-01-02 Savient Pharmaceuticals, Inc. A variant form of urate oxidase and use thereof
EP1883425A1 (en) * 2005-05-23 2008-02-06 Universite De Geneve Injectable superparamagnetic nanoparticles for treatment by hyperthermia and use for forming an hyperthermic implant
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
ES2532804T3 (es) * 2006-04-12 2015-03-31 Crealta Pharmaceuticals Llc Purificación de proteínas con tensioactivo catiónico
CA2696208A1 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Genzyme Corporation Treatment with kallikrein inhibitors
AU2010203712A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
AU2010265964B2 (en) 2009-06-25 2014-09-18 Horizon Therapeutics Usa, Inc. Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during PEGylated uricase therapy
LT2521568T (lt) 2010-01-06 2018-12-10 Dyax Corp. Plazmos kalikreiną surišantys baltymai
US8940861B2 (en) 2010-04-08 2015-01-27 Georgia Tech Research Corporation Variants of ancestral uricases and uses thereof
BR112013017080A8 (pt) 2011-01-06 2023-05-09 Dyax Corp Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo que se liga a forma ativa de calicreína do plasma humano, composiçao farmacêutica e método de detecçao de calicreína do plasma em um paciente
CN102827073A (zh) 2011-06-17 2012-12-19 安吉奥斯医药品有限公司 治疗活性组合物和它们的使用方法
US9474779B2 (en) 2012-01-19 2016-10-25 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compositions and their methods of use
DK3003358T3 (da) 2013-06-07 2021-06-21 Allena Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og anordninger til dialyse
CA2917671A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. 2,4-or 4,6-diaminopyrimidine compounds as idh2 mutants inhibitors for the treatment of cancer
US9579324B2 (en) 2013-07-11 2017-02-28 Agios Pharmaceuticals, Inc Therapeutically active compounds and their methods of use
WO2015003360A2 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compounds and their methods of use
WO2015003355A2 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compounds and their methods of use
US20150031627A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Agios Pharmaceuticals, Inc Therapeutically active compounds and their methods of use
US9968595B2 (en) 2014-03-14 2018-05-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutically active compounds
US10428158B2 (en) 2014-03-27 2019-10-01 Dyax Corp. Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema
EP3294322A4 (en) 2015-05-15 2018-12-12 Medimmune, LLC Improved uricase sequences and methods of treatment
MX2018004587A (es) 2015-10-15 2018-08-14 Agios Pharmaceuticals Inc Terapia de combinacion para tratar tumores malignos.
KR20180067658A (ko) 2015-10-15 2018-06-20 아지오스 파마슈티컬스 아이엔씨. 악성 종양의 치료를 위한 조합물 요법
BR112018011622A2 (pt) 2015-12-11 2018-11-27 Dyax Corp método para tratar ataque de angioedema hereditário (hae) ou reduzir a taxa de ataque de hae
US20230085022A1 (en) 2016-11-11 2023-03-16 Horizon Therapeutics Usa, Inc. Combination therapies of prednisone and uricase molecules and uses thereof
JP2020530282A (ja) 2017-07-07 2020-10-22 アレナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 組換えウリカーゼ酵素
US20190309269A1 (en) 2018-03-20 2019-10-10 Rubius Therapeutics, Inc. Therapeutic cell systems and methods for treating hyperuricemia and gout
US10980788B2 (en) 2018-06-08 2021-04-20 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapy for treating malignancies
CN109055260B (zh) * 2018-08-08 2021-11-09 淮海工学院 弯曲芽孢杆菌alkaAU及产尿酸氧化酶方法、产品与应用
CN114181917B (zh) * 2022-02-14 2022-06-03 潍坊华卓生物科技有限公司 一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2105812C1 (ru) * 1989-07-13 1998-02-27 Санофи Полипептид, обладающий уратоксидазной активностью, фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), вектор экспрессии, содержащий фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), штамм, экспрессирующий полипептид, обладающий уратоксидазной активностью (варианты), способ получения полипептида, обладающего уратоксидазной активностью
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (ru)
US3616231A (en) 1968-11-14 1971-10-26 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the production of uricase
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5599189A (en) 1979-01-22 1980-07-28 Mihama Hisaharu Modified uricase free from antigenicity and its preparation
JPS55135590A (en) 1979-04-05 1980-10-22 Mihama Hisaharu Modified asparaginase and uricase and their preparation
CH657141A5 (de) 1980-07-01 1986-08-15 Hoffmann La Roche Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen.
JPS57192435A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Toyobo Co Ltd Modified polypeptide
DE3126759A1 (de) 1981-07-07 1983-01-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4847079A (en) * 1985-07-29 1989-07-11 Schering Corporation Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal
DD279486A1 (de) 1986-03-10 1990-06-06 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur aktivierung von hydroxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen
JPS6255079A (ja) * 1986-04-23 1987-03-10 Mihama Hisaharu 修飾ウリカ−ゼ
JPH085506B2 (ja) * 1986-08-25 1996-01-24 日東製器株式会社 缶容器
DD279489A1 (de) 1986-12-11 1990-06-06 Leuna Werke Veb Verfahren zur herstellung optisch transparenter epoxidharzformmassen
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5955336A (en) * 1988-08-17 1999-09-21 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha DNA sequence for uricase and manufacturing process of uricase
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5382518A (en) 1989-07-13 1995-01-17 Sanofi Urate oxidase activity protein, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH03148298A (ja) 1989-11-01 1991-06-25 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 修飾ペプチドおよびその製造方法
US5653974A (en) 1990-10-18 1997-08-05 Board Of Regents,The University Of Texas System Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor
WO1992016221A1 (en) * 1991-03-15 1992-10-01 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
DE69233690T2 (de) 1991-07-02 2008-01-24 Nektar Therapeutics, San Carlos Abgabevorrichtung für nebelförmige Medikamente
AU6240494A (en) 1993-02-16 1994-09-14 Enzon, Inc. Ribosome inactivating protein compositions having reduced antigenicity
AU6586394A (en) * 1993-04-22 1994-11-08 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of growth factor and bone resorption inhibitor
WO1995000162A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
IT1265101B1 (it) * 1993-07-23 1996-10-30 Erba Carlo Spa Derivati dell'acido 2-ammino-4-fenil-4-osso butirrico
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
DK0730470T3 (da) * 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996017929A1 (en) * 1994-12-07 1996-06-13 Novo Nordisk A/S Polypeptide with reduced allergenicity
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
JP2758154B2 (ja) * 1995-04-06 1998-05-28 エフ・ホフマン−ラ ロシユ アーゲー インターフェロンを含む液体製剤
FR2733914B1 (fr) * 1995-05-11 1997-08-01 Sanofi Sa Composition de liquide stable contenant de l'urate oxydase et composition lyophilisee pour sa preparation
US5853974A (en) 1995-06-07 1998-12-29 Chiron Corporation Enhancement of alkaline phosphatase with SDS in chemiluminescent substrates
JPH09154581A (ja) 1995-12-05 1997-06-17 Asahi Chem Ind Co Ltd ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物
EP1007082B1 (en) 1997-01-15 2006-10-18 Phoenix Pharmacologics, Inc. Modified tumor necrosis factor
EP1500661A1 (en) * 1998-06-01 2005-01-26 Genetech, Inc. Separation of protein monomers from aggregates by use of ion-exchange chromatography
PT1100880E (pt) 1998-08-06 2011-01-13 Univ Duke Urato-oxidase
CA2338665C (en) * 1998-08-06 2011-01-18 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
JP5183836B2 (ja) 1998-08-06 2013-04-17 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
US6783965B1 (en) * 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
US6425448B1 (en) 2001-01-30 2002-07-30 Cdx Gas, L.L.P. Method and system for accessing subterranean zones from a limited surface area
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
WO2014187953A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Zentrum Mikroelektronik Dresden Ag Non pwm digital dc-dc converter

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2105812C1 (ru) * 1989-07-13 1998-02-27 Санофи Полипептид, обладающий уратоксидазной активностью, фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), вектор экспрессии, содержащий фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), штамм, экспрессирующий полипептид, обладающий уратоксидазной активностью (варианты), способ получения полипептида, обладающего уратоксидазной активностью
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OSMAN AM et al., Liver uricase in Camelus dromedarius: purification and properties, Comp Biochem Physoil B, 1989, 94(3), pp.469-474. CONLEY T.G. et al., Thermodynamics and stoicheiometry of the binding of substrate analogues to uricase, Biochem.J., 1980, 187, pp.727-732. SURINA Tla et al., Urate oxidase from pig liver: biochemical and immunological properties, Prikl Boikhim Mikrobiol, Jul-Aug 1978, 14(4), pp. 533-542. LEE CC. et al., Generation of cDNA probes directed by amino acid sequence: cloning of urate oxidase, Science, 11.03.1988, pp.1288-1291. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101054247B1 (ko) 2011-08-08
PT2305819E (pt) 2015-06-01
JP2011188861A (ja) 2011-09-29
HK1056742A1 (en) 2004-02-27
CN1423699A (zh) 2003-06-11
HK1144701A1 (en) 2011-03-04
EP2305819A1 (en) 2011-04-06
JP5341945B2 (ja) 2013-11-13
JP2003521937A (ja) 2003-07-22
HUP0204544A2 (en) 2003-05-28
ES2343105T3 (es) 2010-07-23
HK1143989A1 (en) 2011-01-21
PL358539A1 (en) 2004-08-09
RU2281954C2 (ru) 2006-08-20
DK2305819T3 (en) 2015-01-05
US6783965B1 (en) 2004-08-31
BR0108386B1 (pt) 2017-10-31
EP2196538B1 (en) 2014-10-01
DK1254237T3 (da) 2010-07-19
ATE463576T1 (de) 2010-04-15
US20080057048A1 (en) 2008-03-06
BR0108386A (pt) 2002-10-29
AU2001249975B2 (en) 2006-06-08
CA2398679A1 (en) 2001-08-16
HUP0204544A3 (en) 2007-05-02
RU2352354C2 (ru) 2009-04-20
MXPA02007545A (es) 2002-12-13
JP5165826B2 (ja) 2013-03-21
LU92237I2 (fr) 2013-09-03
FR13C0036I1 (fr) 2013-08-09
EP2196538A1 (en) 2010-06-16
PT1254237E (pt) 2010-06-07
WO2001059078A3 (en) 2002-03-07
KR20020087934A (ko) 2002-11-23
RU2557318C2 (ru) 2015-07-20
US20110287466A1 (en) 2011-11-24
BE2013C045I2 (ru) 2020-06-24
CZ304864B6 (cs) 2014-12-17
IL193365A0 (en) 2009-02-11
DK2196538T3 (en) 2015-01-05
CN100491532C (zh) 2009-05-27
HU227127B1 (en) 2010-07-28
CA2398679C (en) 2015-11-17
KR20080098686A (ko) 2008-11-11
AU2009212900A1 (en) 2009-10-01
AU4997501A (en) 2001-08-20
ES2343105T8 (es) 2013-07-15
HK1155203A1 (en) 2012-05-11
AU2009212900B2 (en) 2011-12-08
ZA200207206B (en) 2003-05-06
ES2524153T3 (es) 2014-12-04
DE60141742D1 (de) 2010-05-20
CZ20022982A3 (cs) 2003-01-15
KR100884724B1 (ko) 2009-02-19
CN101735991A (zh) 2010-06-16
CY2013028I2 (el) 2015-11-04
BRPI0108386B8 (pt) 2021-05-25
RU2006107110A (ru) 2007-09-20
PL208064B1 (pl) 2011-03-31
CY1110142T1 (el) 2015-01-14
FR13C0036I2 (fr) 2014-05-16
TW200914617A (en) 2009-04-01
CN101735991B (zh) 2013-09-11
TWI322184B (en) 2010-03-21
US8921064B2 (en) 2014-12-30
US7927852B2 (en) 2011-04-19
KR20070092329A (ko) 2007-09-12
IL151065A (en) 2008-12-29
EP1254237B1 (en) 2010-04-07
IL151065A0 (en) 2003-04-10
EP2305819B1 (en) 2014-11-12
IL193365A (en) 2011-08-31
WO2001059078A2 (en) 2001-08-16
CY2013028I1 (el) 2015-11-04
BR0108386C1 (pt) 2011-12-20
CY1117264T1 (el) 2017-04-26
NZ520434A (en) 2004-05-28
EP1254237A2 (en) 2002-11-06
RU2009104003A (ru) 2010-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2557318C9 (ru) Очищенный препарат уратоксидазы, очищенная рекомбинантная уратоксидаза, конъюгат (варианты) и фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани организма млекопитающего, очищенные фрагменты уратоксидазы и способ очистки уратоксидазы.
US20180223263A1 (en) Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
AU2001249975A1 (en) Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
AU2006203252B2 (en) Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Reissue of patent specification