JP2020530282A - 組換えウリカーゼ酵素 - Google Patents

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Abstract

例えば、高尿酸血症、高尿酸尿症および痛風を含む、上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害を処置するためにとりわけ使用され得る、改善されたパンクレアチン安定性および／または活性を有する組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素、かかるウリカーゼ酵素を含有する組成物が開示される。上記ウリカーゼ酵素は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ）の変異を含む組換え変異体である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月７日出願の米国特許出願第６２／５２９，７２６号および２０１８年５月３１日出願の米国特許出願第６２／６７８，５１１号に基づく利益および優先権を主張し、その各々の内容は、全ての目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、一般に、上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害を処置するための方法および組成物に関し、より詳細には、本発明は、上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害を処置するための、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼおよびかかるウリカーゼを使用する方法、ならびにかかるウリカーゼを含有する組成物に関する。
背景
尿酸は、ヒトおよび高等霊長類におけるプリン代謝の最終酸化産物である。ウリカーゼ即ち尿酸オキシダーゼは、尿酸をアラントインおよび二酸化炭素へと分解する酵素である。変異性サイレンシングに起因して、ヒトおよび高等霊長類は、機能的ウリカーゼ遺伝子を欠如している。従って、ある特定の他の哺乳動物とは異なり、ヒトは、酵素の変異性サイレンシングに起因して、肝ウリカーゼによって尿酸を代謝する能力を喪失している。ヒトは、大量の尿酸を産生するが、尿酸の大部分は、尿中に***される。それにもかかわらず、尿酸の増加した産生および／または減少した***が、血液（高尿酸血症）および尿（高尿酸尿症）中の高レベルの尿酸を生じ得る。高尿酸血症および高尿酸尿症は、例えば、関節および皮膚組織における尿酸塩沈着に起因して、炎症性関節炎を生じ得る。
痛風は、推定８百万人のアメリカ人に罹患する状態であり、関節炎症（関節炎）の再発性の攻撃によって特徴付けられる。関節炎症は、滑液（関節液）および関節裏層（滑膜裏層）における尿酸結晶の沈着によって誘発される。強い関節炎症は、白血球が尿酸結晶を貪食して炎症性化学物質を放出する際に生じ、関節組織の疼痛、熱および発赤を引き起こす。慢性痛風はさらに、減少した腎臓機能および腎臓結石をもたらし得る。
痛風の既存の治療薬、例えば、経口キサンチンオキシダーゼインヒビター（例えば、アロプリノール）、尿酸***促進薬および静脈内ウリカーゼ剤の効力における制限および／または耐性は、痛風における尿酸塩低下療法（ＵＬＴ）に対する不応性に寄与する。例えば、アロプリノールによる遅延したまたは不十分な投薬は、不応性痛風に寄与する。Fels and Sundy (2008), CURR. OPIN. RHEUMATOL., 20(2): 198-202を参照のこと。腎***は、尿酸排出の主要な経路であるが、胃腸管（ＧＩＴ）は、特に、尿酸塩腎排出が損なわれている慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）において、尿酸塩ホメオスタシスにおけるますます認識された役割を果たす。
機能的ウリカーゼ酵素は、動物、植物、細菌および真菌を含む広範な生物において見出すことができ、そのため、外因性ウリカーゼは、上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害の処置において使用されてきた。臨床的に承認されたウリカーゼには、慢性不応性痛風の処置について承認されたＫｒｙｓｔｅｘｘａ（登録商標）（ペグロチカーゼ）、および腫瘍崩壊症候群について承認されたＥｌｉｔｅｋ（登録商標）（ラスブリカーゼ）が含まれる。
Fels and Sundy (2008), CURR. OPIN. RHEUMATOL., 20(2): 198-202
今日まで開発がなされてはきたが、上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害、例えば、高尿酸血症および痛風を処置および管理するための新たな有効な治療薬、ならびにかかる疾患または障害を処置および管理するための使用における改善されたウリカーゼ酵素が、なおも必要とされ続けている。
発明の要旨
本発明は、ヒトにおいて活性であり、天然に存在する酵素よりも高い安定性および／または活性を有する組換えウリカーゼ酵素の発見に、一部基づく。特に、本発明の組換え酵素は、天然に存在するバージョンの酵素と比較して、パンクレアチン（膵臓によって分泌される酵素の集積）によるタンパク分解性消化に対する改善された安定性を示す。さらに、本発明の組換え酵素は、野生型ウリカーゼ酵素よりも高い比活性を有し得る。さらに、本明細書に記載される組換え酵素は、それらの増強された安定性を考慮すると、経口投与に適切であり得、従って、市販の注射可能な形態のウリカーゼ（例えば、Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ（登録商標）およびＥｌｉｔｅｋ（登録商標））よりも潜在的に安全で耐容できることが企図されるが、それは、酵素が腸内で活性のままであり、腸壁を介して吸収されないことが企図されるからである。
一態様では、本発明は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素であって、少なくとも１つの変異が、（ａ）１８０位において、イソロイシンがバリンまたはアラニンによって置換されている（Ｉ１８０ＶまたはＩ１８０Ａ）、（ｂ）１６５位において、チロシンがフェニルアラニンによって置換されている（Ｙ１６５Ｆ）、（ｃ）１９０位において、バリンがグリシンまたはアラニンによって置換されている（Ｖ１９０ＧまたはＶ１９０Ａ）、（ｄ）５１位において、グルタミン酸がリシンによって置換されている（Ｅ５１Ｋ）、（ｅ）２４４位において、グルタミンがリシンによって置換されている（Ｑ２４４Ｋ）、（ｆ）１３２位において、イソロイシンがアルギニンまたはアスパラギンによって置換されている（Ｉ１３２ＲまたはＩ１３２Ｎ）、（ｇ）９７位において、バリンがイソロイシンによって置換されている（Ｖ９７Ｉ）、（ｈ）９２位において、グルタミン酸がアスパラギンによって置換されている（Ｅ９２Ｎ）、（ｉ）８７位において、アラニンがグリシンによって置換されている（Ａ８７Ｇ）、（ｊ）１４２位において、アスパラギン酸がグルタミン酸によって置換されている（Ｄ１４２Ｅ）、（ｋ）４４位において、グリシンがアラニンによって置換されている（Ｇ４４Ａ）、（ｌ）１２８位において、グリシンがプロリンによって置換されている（Ｇ１２８Ｐ）、（ｍ）２３６位において、アラニンがアスパラギンによって置換されている（Ａ２３６Ｎ）、（ｎ）２０８位において、リシンがアラニンによって置換されている（Ｋ２０８Ａ）、（ｏ）２１３位において、アスパラギンがアラニンによって置換されている（Ｎ２１３Ａ）、（ｐ）１４０位において、セリンがスレオニンによって置換されている（Ｓ１４０Ｔ）、（ｑ）２５３位において、チロシンがグルタミンによって置換されている（Ｙ２５３Ｑ）、（ｒ）８４位において、アラニンがセリンによって置換されている（Ａ８４Ｓ）、（ｓ）４７位において、スレオニンがグルタミン酸によって置換されている（Ｔ４７Ｅ）、（ｔ）９５位において、セリンがプロリンによって置換されている（Ｓ９５Ｐ）、（ｕ）１０３位において、リシンがスレオニンによって置換されている（Ｋ１０３Ｔ）、（ｖ）１３４位において、アスパラギン酸がグルタミン酸によって置換されている（Ｄ１３４Ｅ）、（ｗ）１３６位において、チロシンがアルギニンによって置換されている（Ｙ１３６Ｒ）、（ｘ）１９６位において、イソロイシンがロイシンによって置換されている（Ｉ１９６Ｌ）、（ｙ）２２４位において、スレオニンがアスパラギン酸によって置換されている（Ｔ２２４Ｄ）、（ｚ）２８５位において、プロリンがセリンによって置換されている（Ｐ２８５Ｓ）、および（ａａ）２９６位において、バリンがアラニンによって置換されている（Ｖ２９６Ａ）から選択される、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。
ある特定の実施形態では、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｖ１９０Ａ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４Ｋ、Ｉ１３２Ｒ、Ｖ９７Ｉ、Ｅ９２Ｎ、Ａ８７Ｇ、Ｄ１４２Ｅ、Ｇ４４Ａ、Ｇ１２８Ｐ、Ａ２３６Ｎ、Ｋ２０８Ａ、Ｎ２１３Ａ、Ｓ１４０Ｔ、Ｙ２５３ＱおよびＡ８４Ｓから選択される少なくとも１つの変異を含む。ある特定の他の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４Ｋ、Ｉ１３２Ｒ、Ｖ９７Ｉ、Ｅ９２Ｎ、Ａ８７Ｇ、Ｄ１４２ＥおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む。ある特定の他の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む。ある特定の他の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む。ある特定の他の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４ＫおよびＩ１３２Ｒから選択される少なくとも１つの変異を含む。
別の態様では、本発明は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５または６つ）の変異を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素であって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、１９０位、５１位、１３２位および４４位から選択された位置に存在する、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して保存的置換であり得るが、ある特定の他の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して非保存的置換であり得る。
別の態様では、本発明は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４または５つ）の変異を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素であって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、５１位、１３２位および４４位から選択された位置に存在する、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して保存的置換であり得るが、ある特定の他の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して非保存的置換であり得る。
別の態様では、本発明は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４または５つ）の変異を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、１９０位、５１位、２４４位および１３２位から選択される位置に存在する、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを提供する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して保存的置換であり得るが、ある特定の他の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して非保存的置換であり得る。
ある特定の実施形態では、上述の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素のいずれかにおいて、ウリカーゼは、２、３、４、５、６、７または８つの変異を含む。
ある特定の実施形態では、上述の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素のいずれかにおいて、ウリカーゼは、単独で、または他の置換と組み合わせてのいずれかで、以下の置換：（ｉ）Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａ、（ｉｉ）Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａ、（ｉｉｉ）Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａ、（ｉｖ）Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａ、（ｖ）Ｉ１８０ＶおよびＹ１６５Ｆ、または（ｖｉ）Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４ＫおよびＩ１３２Ｒを含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書の以下の表１の所与の列に列挙された３つの置換を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書の以下の表２の所与の列に列挙された５つの置換を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。
別の態様では、本発明は、パンクレアチンの存在下で少なくとも３５分の半減期、例えば、パンクレアチンの存在下で、例えば、実施例１に示される条件下で、３５〜２００分の半減期を有する、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを提供する。
上述の組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのいずれかは、例えば、野生型ウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下で５〜５０倍、１０〜４０倍、１０〜３０倍、２０〜４０倍または２０〜３０倍高い安定性を有し得ることが企図される。ウリカーゼは、例えば、鋳型（または参照）野生型ウリカーゼと比較して、約６．５未満のｐＨでより安定であり得る。
上述の組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのいずれかは、例えば、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされ得ることが企図される。
ある特定の実施形態では、上述の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素のいずれかにおいて、ウリカーゼは単離されている。
別の態様では、本発明は、上述のウリカーゼ酵素のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、宿主細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞における発現のためにコドン最適化される。本発明は、上述のヌクレオチド配列のいずれか１つを含む発現ベクターもまた提供する。同様に、本発明は、上述の発現ベクターの１つまたは複数を含む宿主細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、上述の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素のいずれか１つならびに少なくとも１つの薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。酵素は、可溶性形態または結晶形態であり得る。さらに、組成物は、ｐＨ増加剤を含み得る。医薬組成物は、例えば、経口剤形または非経口剤形として製剤化され得ることが企図される。ある特定の実施形態では、組成物は、散剤、顆粒剤（granulate）、ペレット剤、マイクロペレット剤（micropellet）またはミニ錠剤（minitablet）として製剤化される。ある特定の実施形態では、組成物は、カプセル、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセル、軟ゼラチンカプセルもしくは硬ゼラチンカプセル中にカプセル封入されるか、または組成物は、錠剤剤形として製剤化される。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、対象の血漿または尿中の上昇した量の尿酸と関連する。方法は、有効量の本明細書に記載されるウリカーゼ酵素または組成物のいずれかを対象に投与して、対象における疾患または障害を処置するステップを含む。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における高尿酸血症および／または高尿酸尿症を処置する方法を提供する。方法は、有効量の本明細書に記載されるウリカーゼ酵素または組成物のいずれかを対象に投与して、対象における高尿酸血症および／または高尿酸尿症を処置するステップを含む。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における痛風を処置する方法を提供する。方法は、有効量の本明細書に記載されるウリカーゼ酵素または組成物のいずれかを対象に投与して、対象における痛風を処置するステップを含む。
ある特定の実施形態では、上述の方法のいずれかにおいて、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、キサンチンオキシダーゼインヒビター（例えば、アロプリノールまたはフェブキソスタット）、尿酸***促進薬（例えば、プロベネシド、ベンズブロマロン、ロサルタンまたはレシヌラド）、またはそれらの組合せと組み合わせて投与される。
本発明のこれらおよび他の態様および特色は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲に記載される。
本発明は、以下の図面を参照して、より完全に理解することができる。
図１Ａは、パンクレアチン、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ（Ｈｉｓ−ＵＯ）、およびパンクレアチンとの９０分のインキュベーション後の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図１Ｂは、示された時点についての野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのパンクレアチンとのインキュベーション後の基質尿酸濃度の喪失によって測定される野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ活性を示す折れ線グラフである。尿酸濃度は、２９８ｎｍにおける吸光度によって測定される。
図２Ａは、パンクレアチンの存在下での示された変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの活性を示す折れ線グラフである。２つの独立した調製物からのデータが、各ウリカーゼについて示される。活性値は、時間ゼロにおけるパンクレアチンの存在下での活性に対して標準化される。図２Ｂは、図２Ａ中に示されるデータについて各調製物にわたる再現性を実証する折れ線グラフである。
図３は、示された時点についてのパンクレアチンとのインキュベーション後のＲ２＿Ｖ７９、Ｒ２＿１５、Ｒ２＿Ｖ１６およびＲ２＿親変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの活性を示す折れ線グラフである。活性値は、時間ゼロにおけるパンクレアチンの存在下での活性に対して標準化される。
図４は、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼおよび示された変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素についての、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって決定されるタンパク質アンフォールディングを示す。
図５は、示された時点についてのパンクレアチンとのインキュベーション後のＲ２＿Ｖ１７、Ｒ２＿Ｖ４およびＲ２＿Ｖ７９変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
図６は、示された時点についてのパンクレアチンとのインキュベーション後の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼおよびＲ２＿Ｖ１７変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
図７は、野生型と比較した示された変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのパンクレアチン安定性を示す棒グラフである。５つの置換を各々が含有する、実施例１に記載されるＲ２変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ（右）、および単一の置換を各々が含有する、実施例２に記載される変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ（左および中央）が示される。
図８は、野生型と比較して単一の置換を各々が含有する、実施例２に記載される変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのパンクレアチン安定性を示す滝グラフである。酵素は、安定性に対するそれらの効果に関して順序付けられる。
図９Ａは、重症高尿酸血症を有するウリカーゼノックアウト（ＵｒＯｘＫＯ）マウスにおける血漿中尿酸塩レベル（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフである。処置前（血漿中尿酸塩レベルを、維持用量のアロプリノールの除去の７日後に収集した試料において測定した）、処置（血漿中尿酸塩レベルを、それぞれ５０ｍｇ／Ｌのアロプリノール、１５０ｍｇ／Ｌのアロプリノールまたは１５０ｍｇ／日の変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの投与の７日後に収集した試料において測定した）および処置後（血漿中尿酸塩レベルを、処置が終結した７日後に収集した試料において測定した）の血漿中尿酸塩レベルの平均（ＳＥＭ）が示される。
図９Ｂは、重症高尿酸尿症を有するＵｒＯｘＫＯマウスにおける尿中尿酸レベル（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフである。尿酸レベルを、示されるように、処置前および処置期間の最後の３日間の間に収集した２４時間の尿試料において測定した。
詳細な説明
本発明は、ヒトにおいて活性であり、天然に存在する酵素よりも高い安定性および／または活性を有する組換えウリカーゼ酵素の発見に、一部基づく。特に、本発明の組換え酵素は、天然に存在するバージョンの酵素と比較して、パンクレアチン（膵臓によって分泌される酵素の集積）によるタンパク分解性消化に対する改善された安定性を示す。さらに、本発明の組換え酵素は、野生型ウリカーゼ酵素よりも高い比活性を有し得る。さらに、本明細書に記載される組換え酵素は、それらの増強された安定性を考慮すると、経口投与に適切であり得、従って、市販の注射可能な形態のウリカーゼ（例えば、Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ（登録商標）およびＥｌｉｔｅｋ（登録商標））よりも潜在的に安全で耐容できることが企図されるが、それは、酵素が腸内で活性のままであり、腸壁を介して吸収されないことが企図されるからであり、それは、組換え酵素のサイズが、受動的吸収を排除し、腸からの酵素の能動輸送のための受容体が同定されていないからである。
本発明の種々の特色および態様は、以下でより詳細に議論される。
Ｉ．尿酸およびウリカーゼ
尿酸（尿酸塩としても公知）は、ヒトおよび高等霊長類におけるプリン代謝の最終産物である。ウリカーゼ（尿酸オキシダーゼまたはＵｒＯｘとしても公知）は、以下の反応を触媒することによって、尿酸をアラントインへと分解する：
尿酸＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→５−ヒドロキシイソ尿酸塩＋Ｈ２Ｏ２→アラントイン＋ＣＯ２。
変異性サイレンシングに起因して、ヒトおよび高等霊長類は、機能的ウリカーゼ遺伝子を欠如している。しかし、機能的ウリカーゼ酵素は、動物、植物、細菌および真菌を含む広範な生物において見出すことができる。１つのかかる生物は、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｌｉｌｕｓ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ ｊａｄｉｎｉｉまたはＴｏｒｕｌａ酵母としても公知）である。Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、触媒作用のために金属原子も有機補因子も必要としないホモテトラマー酵素である。野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのアミノ酸配列は、以下の通りである：
野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下の通りである：
ＩＩ．組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素
とりわけ、本発明は、例えば、対象における上昇したレベルの尿酸と関連する障害、例えば、対象の血漿中の上昇したレベルの尿酸と関連する障害を処置するのに有用な、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素のファミリーを提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素は、野生型Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較してより高い安定性、例えば、野生型Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下でのより高い安定性を有し、従って、野生型Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼよりも、経口送達および腸における活性に適している。特記しない限り、本明細書で使用する場合、野生型Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、または５−ヒドロキシイソ尿酸塩への尿酸の酸化を触媒できるその機能的断片を指す。本明細書で使用する場合、用語「機能的断片」は、５−ヒドロキシイソ尿酸塩および／またはアラントインへの尿酸の変換を触媒する、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％を有する、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのタンパク質断片であると理解される。
一態様では、本発明は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素であって、少なくとも１つの変異が、（ａ）１８０位において、イソロイシンがバリンまたはアラニンによって置換されている（Ｉ１８０ＶまたはＩ１８０Ａ）、（ｂ）１６５位において、チロシンがフェニルアラニンによって置換されている（Ｙ１６５Ｆ）、（ｃ）１９０位において、バリンがグリシンまたはアラニンによって置換されている（Ｖ１９０ＧまたはＶ１９０Ａ）、（ｄ）５１位において、グルタミン酸がリシンによって置換されている（Ｅ５１Ｋ）、（ｅ）２４４位において、グルタミンがリシンによって置換されている（Ｑ２４４Ｋ）、（ｆ）１３２位において、イソロイシンがアルギニンまたはアスパラギンによって置換されている（Ｉ１３２ＲまたはＩ１３２Ｎ）、（ｇ）９７位において、バリンがイソロイシンによって置換されている（Ｖ９７Ｉ）、（ｈ）９２位において、グルタミン酸がアスパラギンによって置換されている（Ｅ９２Ｎ）、（ｉ）８７位において、アラニンがグリシンによって置換されている（Ａ８７Ｇ）、（ｊ）１４２位において、アスパラギン酸がグルタミン酸によって置換されている（Ｄ１４２Ｅ）、（ｋ）４４位において、グリシンがアラニンによって置換されている（Ｇ４４Ａ）、（ｌ）１２８位において、グリシンがプロリンによって置換されている（Ｇ１２８Ｐ）、（ｍ）２３６位において、アラニンがアスパラギンによって置換されている（Ａ２３６Ｎ）、（ｎ）２０８位において、リシンがアラニンによって置換されている（Ｋ２０８Ａ）、（ｏ）２１３位において、アスパラギンがアラニンによって置換されている（Ｎ２１３Ａ）、（ｐ）１４０位において、セリンがスレオニンによって置換されている（Ｓ１４０Ｔ）、（ｑ）２５３位において、チロシンがグルタミンによって置換されている（Ｙ２５３Ｑ）、（ｒ）８４位において、アラニンがセリンによって置換されている（Ａ８４Ｓ）、（ｓ）４７位において、スレオニンがグルタミン酸によって置換されている（Ｔ４７Ｅ）、（ｔ）９５位において、セリンがプロリンによって置換されている（Ｓ９５Ｐ）、（ｕ）１０３位において、リシンがスレオニンによって置換されている（Ｋ１０３Ｔ）、（ｖ）１３４位において、アスパラギン酸がグルタミン酸によって置換されている（Ｄ１３４Ｅ）、（ｗ）１３６位において、チロシンがアルギニンによって置換されている（Ｙ１３６Ｒ）、（ｘ）１９６位において、イソロイシンがロイシンによって置換されている（Ｉ１９６Ｌ）、（ｙ）２２４位において、スレオニンがアスパラギン酸によって置換されている（Ｔ２２４Ｄ）、（ｚ）２８５位において、プロリンがセリンによって置換されている（Ｐ２８５Ｓ）、および（ａａ）２９６位において、バリンがアラニンによって置換されている（Ｖ２９６Ａ）から選択される、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。
ある特定の実施形態では、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｖ１９０Ａ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４Ｋ、Ｉ１３２Ｒ、Ｖ９７Ｉ、Ｅ９２Ｎ、Ａ８７Ｇ、Ｄ１４２Ｅ、Ｇ４４Ａ、Ｇ１２８Ｐ、Ａ２３６Ｎ、Ｋ２０８Ａ、Ｎ２１３Ａ、Ｓ１４０Ｔ、Ｙ２５３ＱおよびＡ８４Ｓから選択される少なくとも１つの変異を含む。ある特定の他の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４Ｋ、Ｉ１３２Ｒ、Ｖ９７Ｉ、Ｅ９２Ｎ、Ａ８７Ｇ、Ｄ１４２ＥおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む。ある特定の他の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む。ある特定の他の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む。ある特定の他の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４ＫおよびＩ１３２Ｒから選択される少なくとも１つの変異を含む。
別の態様では、本発明は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５または６つ）の変異を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素であって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、１９０位、５１位、１３２位および４４位から選択された位置に存在する、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して保存的置換であり得るが、ある特定の他の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して非保存的置換であり得る。
別の態様では、本発明は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４または５つ）の変異を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素であって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、５１位、１３２位および４４位から選択された位置に存在する、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して保存的置換であり得るが、ある特定の他の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して非保存的置換であり得る。本明細書で使用する場合、用語「保存的置換」は、構造的に類似のアミノ酸による置換を指す。例えば、保存的置換は、以下の群内での置換を含み得る：ＳｅｒおよびＣｙｓ；Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；ＬｙｓおよびＡｒｇ；Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ；ならびにＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐおよびＨｉｓ。保存的置換は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルゴリズム、ＢＬＯＳＵＭ置換マトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックス）またはＰＡＭ置換：ｐマトリックス（例えば、ＰＡＭ ２５０マトリックス）によっても定義され得る。非保存的置換は、保存的置換でないアミノ酸置換である。
別の態様では、本発明は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５または６つ）の変異を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、１９０位、５１位、２４４位および１３２位から選択される位置に存在する、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを提供する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して保存的置換であり得るが、ある特定の他の実施形態では、１つまたは複数の変異は、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して非保存的置換であり得る。
ある特定の実施形態では、上述の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素のいずれかにおいて、ウリカーゼは、２、３、４、５、６、７または８つの変異を含む。
ある特定の実施形態では、上述の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素のいずれかにおいて、ウリカーゼは、単独で、または他の置換と組み合わせてのいずれかで、以下の置換：（ｉ）Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａ、（ｉｉ）Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａ、（ｉｉｉ）Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａ、（ｉｖ）Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａ、（ｖ）Ｉ１８０ＶおよびＹ１６５Ｆ、または（ｖｉ）Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４ＫおよびＩ１３２Ｒを含む。
一態様では、本発明は、表１の所与の列に列挙された３つの置換を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を提供する。
別の態様では、本発明は、表２の所与の列に列挙された５つの置換を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを提供する。
本明細書で開示される組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、例えば、配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼよりも高い比活性を有し得る。例えば、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼよりも５〜５０倍高い比活性を有し得る。ある特定の実施形態では、ウリカーゼは、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼよりも、約５〜約５０、約５〜約４０、約５〜約３０、約５〜約２０、約５〜約１０、約１０〜約５０、約１０〜約４０、約１０〜約３０、約１０〜約２０、約２０〜約５０、約２０〜約４０、約２０〜約３０、約３０〜約５０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５、約１０、約２０、約３０、約４０または約５０倍高い比活性を有する。
あるいは、またはさらに、本明細書で開示される組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、例えば、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、より高い安定性、例えば、パンクレアチンの存在下でのより高い安定性を有し得る。例えば、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下で５〜５０倍高い安定性を有し得る。ある特定の実施形態では、ウリカーゼは、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下で、約５〜約５０、約５〜約４０、約５〜約３０、約５〜約２０、約５〜約１０、約１０〜約５０、約１０〜約４０、約１０〜約３０、約１０〜約２０、約２０〜約５０、約２０〜約４０、約２０〜約３０、約３０〜約５０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５、約１０、約２０、約３０、約４０または約５０倍高い安定性を有する。
あるいは、またはさらに、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、例えば、パンクレアチンの存在下で少なくとも３５分の半減期を有し得る。ある特定の実施形態では、ウリカーゼは、パンクレアチンの存在下で、少なくとも約３５〜約２００分、約３５〜約１７５分、約３５〜約１５０分、約３５〜約１２５分、約３５〜約１００分、約３５〜約７５分、約３５〜約５０分、約５０〜約２００分、約５０〜約１７５分、約５０〜約１５０分、約５０〜約１２５分、約５０〜約１００分、約５０〜約７５分、約７５〜約２００分、約７５〜約１７５分、約７５〜約１５０分、約７５〜約１２５分、約７５〜約１００分、約１００〜約２００分、約１００〜約１７５分、約１００〜約１５０分、約１００〜約１２５分、約１２５〜約２００分、約１２５〜約１７５分、約１２５〜約１５０分、約１５０〜約２００分、約１５０〜約１７５分、約１７５〜約２００分、約３５分、約５０分、約７５分、約１００分、約１２５分、約１５０分、約１７５分または約２００分の半減期を有する。ウリカーゼの安定性または半減期は、実施例１に記載されるような吸収ベースのアッセイまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。パンクレアチンの存在下でのウリカーゼ半減期は、例えば、パンクレアチンの濃度を含む、半減期が測定される実験条件に依存する。ある特定の実施形態では、パンクレアチンの存在下での、開示される組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの半減期は、２０ｎｇ／μＬまたは８０ｎｇ／μＬのパンクレアチン、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なパンクレアチン（カタログ番号Ｐ７５４５）の存在下で測定される。
あるいは、またはさらに、本明細書で開示される組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素は、例えば、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、約６．５未満のｐＨでより高い安定性を有し得ることが企図される。例えば、組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下で５〜５０倍高い安定性を有し得る。ある特定の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、約６．５未満のｐＨで、約５〜約５０、約５〜約４０、約５〜約３０、約５〜約２０、約５〜約１０、約１０〜約５０、約１０〜約４０、約１０〜約３０、約１０〜約２０、約２０〜約５０、約２０〜約４０、約２０〜約３０、約３０〜約５０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５、約１０、約２０、約３０、約４０または約５０倍高い安定性を有する。ウリカーゼの安定性または半減期は、実施例１に記載されるような吸収ベースのアッセイまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。
本発明は、以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｇ４４Ａ、Ｅ５１ＫおよびＩ１３２Ｒを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、以下のアミノ酸配列を含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ１７と呼ばれる組換え変異体ウリカーゼをさらに提供する：
本発明は、以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｅ５１Ｋ、Ｖ９７ＩおよびＡ２３６Ｎを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、以下のアミノ酸配列を含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ４と呼ばれる組換え変異体ウリカーゼをさらに提供する：
本発明は、以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１３２Ｒ、Ｑ２１７ＬおよびＰ２８５Ｓを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、以下のアミノ酸配列を含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ７９と呼ばれる組換え変異体ウリカーゼをさらに提供する：
本発明は、以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｅ５１Ｋ、Ｖ９７ＩおよびＩ１９６Ｌを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、以下のアミノ酸配列を含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ４７と呼ばれる組換え変異体ウリカーゼをさらに提供する：
本発明は、以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｅ５１Ｋ、Ｄ１４２ＥおよびＱ２１７Ｌを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、以下のアミノ酸配列を含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ３９と呼ばれる組換え変異体ウリカーゼをさらに提供する：
本発明は、本明細書で開示されるＣ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、野生型Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して少なくとも６０％の比活性および／または５倍高い安定性を有する組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをさらに提供する。配列同一性は、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内の種々の方法で決定され得る。プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって用いられるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析（参照によって組み込まれるKarlin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268；Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300；Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）は、配列類似性検索のために調整される。配列データベースを検索する際の基本的な問題の議論については、参照によって完全に組み込まれるAltschul et al., (1994) Nature Genetics 6:119-129を参照のこと。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定できる。ヒストグラム、記述、アラインメント、期待（即ち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルターについての検索パラメーターは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（参照によって完全に組み込まれるHenikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919）。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは、以下のように調節され得る：Ｑ＝１０（ギャップ創出ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸張ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ったあらゆるｗｉｎｋ．ｓｕｐ番目の位置においてワードヒットを生成する）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップ付きアラインメントが生成されるウインドウ幅を設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメーター設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であり得る。検索は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｐｔｉｏｎパラメーター（例えば、−Ｇ、ギャップをオープンさせるためのコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドについて５／タンパク質について１１；−Ｅ、ギャップを伸長させるためのコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドについて２／タンパク質について１；−ｑ、ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティ［整数］：デフォルト＝−３；−ｒ、ヌクレオチドマッチの報酬［整数］：デフォルト＝１；−ｅ、期待値［実数］：デフォルト＝１０；−Ｗ、ワードサイズ［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドについて１１／ｍｅｇａｂｌａｓｔについて２８／タンパク質について３；−ｙ、ｂｌａｓｔ伸張についてのドロップオフ（Ｘ）（ビット）：デフォルト＝ｂｌａｓｔｎについて２０／他について７；−Ｘ、ギャップ付きアラインメントについてのＸドロップオフ値（ビット）：デフォルト＝全てのプログラムについて１５であるが、ｂｌａｓｔｎには適用不能；および−Ｚ、ギャップ付きアラインメントについての最終Ｘドロップオフ値（ビット）：ｂｌａｓｔｎについて５０、他について２５）を使用しても実施され得る。ペアワイズタンパク質アラインメントのためのＣｌｕｓｔａｌＷもまた使用され得る（デフォルトパラメーターは、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスならびにギャップオープニングペナルティ＝１０およびギャップ伸張ペナルティ＝０．１を含み得る）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において入手可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ創出ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸張ペナルティ）を使用し、タンパク質比較における等価な設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
開示される組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、改変、操作、または化学的にコンジュゲートされ得ることが企図される。例えば、開示される組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏコンジュゲーション化学を使用して、エフェクター薬剤にコンジュゲートされ得ることが企図される。エフェクター薬剤がポリペプチドである場合、ウリカーゼ酵素は、エフェクターに化学的にコンジュゲートされるか、または融合タンパク質としてエフェクターに連結され得る。融合タンパク質の構築は、当業者の技術範囲内である。
ある特定の実施形態では、特定の投与様式または活性の部位に依存して、開示される組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、循環中で、例えば、血液、血清または他の組織中でのその安定化および／または保持を改善する部分を用いて改変され得る。例えば、開示される組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素は、ポリマー、例えば、実質的に非抗原性のポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドにコンジュゲートされ得る。ある特定の実施形態では、開示される組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素は、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンにコンジュゲートされる。かかるポリマーの例には、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーが含まれる。さらなる有用なポリマーには、ポリオキシアルキレン、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ならびにポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックコポリマー、ポリメタクリレート、カルボマー、ならびに分岐または非分岐多糖が含まれる。
ＩＩＩ．ウリカーゼ産生
本発明のウリカーゼ酵素を産生するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ウリカーゼ酵素をコードするＤＮＡ分子は、本明細書で提供される配列情報を使用して化学的に合成され得る。合成ＤＮＡ分子は、所望のウリカーゼ酵素をコードする従来の遺伝子発現構築物を産生するために、例えば発現制御配列を含む、他の適切なヌクレオチド配列にライゲーションされ得る。
所望のウリカーゼ酵素をコードする核酸は、従来のトランスフェクションまたは形質転換技術を介して宿主細胞中に導入され得る発現ベクター中に取り込まれ（ライゲーションされ）得る。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞がウリカーゼ酵素をコードする遺伝子を発現するのを許容する条件下で、増殖され得る。
本発明の組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする核酸は、当該分野で公知の方法を使用して、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードするヌクレオチド配列、例えば、本明細書で開示される配列番号７を変異させることによって生成され得る。さらに、ある特定の実施形態では、本発明の組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする核酸は、当該分野で公知の方法を使用して、異種細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞における発現のためにコドン最適化され得る。
一実施形態では、以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｇ４４Ａ、Ｅ５１ＫおよびＩ１３２Ｒを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ１７と呼ばれる組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下の通りである：
以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｅ５１Ｋ、Ｖ９７ＩおよびＡ２３６Ｎを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ４と呼ばれる組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下の通りである：
以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１３２Ｒ、Ｑ２１７ＬおよびＰ２８５Ｓを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ７９と呼ばれる組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下の通りである：
以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｅ５１Ｋ、Ｖ９７ＩおよびＩ１９６Ｌを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ４７と呼ばれる組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下の通りである：
以下の置換：Ｙ１６５Ｆ、Ｉ１８０Ｖ、Ｅ５１Ｋ、Ｄ１４２ＥおよびＱ２１７Ｌを含む組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ、例えば、本明細書でＲ２＿Ｖ３９と呼ばれる組換え変異体Ｃ．Ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下の通りである：
具体的な発現および精製条件は、用いられる発現系に依存して変動する。例えば、遺伝子がＥ．ｃｏｌｉにおいて発現される場合、これは、操作された遺伝子を、適切な細菌プロモーター、例えば、ＴｒｐまたはＴａｃ、および原核生物シグナル配列の下流に配置することによって、発現ベクター中にクローニングされ得る。発現された分泌タンパク質は、屈折体（refractile body）または封入体中に蓄積し、フレンチプレスまたは超音波処理による細胞の破壊後に回収され得る。次いで、屈折体は可溶化され、タンパク質は、当該分野で公知の方法によってリフォールディングおよび切断される。
ウリカーゼ酵素は、ウリカーゼ酵素の発現を許容する条件下で、かかるウリカーゼ酵素をコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を増殖させる（培養する）ことによって産生され得る。発現後、ウリカーゼ酵素は、当該分野で公知の技術、例えば、アフィニティータグ、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒスチジンタグを使用して、回収され、精製または単離され得る。ウリカーゼ酵素のための例示的な発現および精製プロトコールは、Liu et al. (2011) Appl. Microbiol. Biotechnol. 92(3):529-37に記載されている。
ＩＶ．医薬組成物
治療的使用のために、本明細書に記載される組換えウリカーゼ酵素は、好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わされる。用語「薬学的に許容される」は、本明細書で使用する場合、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答もなく、他の問題も合併症もなしに人間および動物の組織と接触して使用するのに適切な、健全な医学的判断の範囲内の化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用する場合、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答もなく、他の問題も合併症もなしに人間および動物の組織と接触して使用するのに適切な、緩衝液、担体および賦形剤を指す。薬学的に許容される担体には、標準的な医薬担体のいずれか、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョンなど）、および種々の型の湿潤剤が含まれる。組成物は、安定剤および防腐剤もまた含み得る。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]を参照のこと。薬学的に許容される担体には、医薬品投与と適合性の、緩衝液、溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で公知である。
ある特定の実施形態では、ウリカーゼ酵素は、例えば、酸性環境中、例えば、胃腸管中でのウリカーゼ酵素の安定性を増強するために、ｐＨ増加剤、例えば、タンパク質ポンプインヒビター（ＰＰＩ）と共に製剤化されるか、または例えば経腸経路（例えば、経口）によって、それと（同時または逐次的のいずれかで）共投与され得る。
プロトンポンプインヒビターは、その主要な作用が胃酸産生の顕著な持続性の低減である、一群の薬物である。プロトンポンプインヒビターは、胃壁細胞の水素／カリウムアデノシントリホスファターゼ酵素系（Ｈ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ、またはより一般には、単に胃プロトンポンプ）を遮断することによって作用する。プロトンポンプは、胃酸分泌における最終段階であり、Ｈ＋イオンを胃管腔中に分泌することを直接担い、酸分泌を阻害するための理想的な標的になっている。プロトンポンプインヒビターの例には、オメプラゾール（商品名：ＬＯＳＥＣ（登録商標）、ＰＲＩＬＯＳＥＣ（登録商標）、ＺＥＧＥＲＩＤ（登録商標））；ランソプラゾール（商品名：ＰＲＥＶＡＣＩＤ（登録商標）、ＺＯＴＯＮ（登録商標）、ＩＮＨＩＢＩＴＯＬ（登録商標））；エソメプラゾール（商品名：ＮＥＸＩＵＭ（登録商標））；およびパントプラゾール（商品名：ＰＲＯＴＯＮＩＸ（登録商標）、ＳＯＭＡＣ（登録商標）、ＰＡＮＴＯＬＯＣ（登録商標））が含まれる。
本明細書で開示される組換えウリカーゼ酵素を含有する医薬組成物は、投薬単位形態で提示され得、任意の適切な方法によって調製され得る。医薬組成物は、その意図した投与経路と適合性であるように製剤化すべきである。医薬組成物は、種々の形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体および固体剤形、例えば、液体溶液剤、分散液剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤が含まれる。好ましい形態は、意図した投与様式および治療適用に依存する。
組成物は、好ましくは、経腸（例えば、経口）投与のために製剤化されるが、かかる組成物は、非経口様式（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射）によって投与され得る。語句「非経口投与」および「非経口投与される」は、本明細書で使用する場合、通常は注射による、経腸および外用投与以外の投与様式を意味し、これには、限定されずに、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨下の注射および注入が含まれる。
組成物は、溶液剤、マイクロエマルジョン、分散液剤、リポソーム、または高濃度での安定な貯蔵に適切な他の秩序立った構造として、製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液剤は、上に列挙した成分の１つまたはそれらの組合せと共に、適切な溶媒中に必要な量の本明細書に記載される薬剤を取り込み、その後必要に応じて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液剤は、本明細書に記載される薬剤を、基本的分散媒、および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液剤の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、以前に無菌濾過されたその溶液から、本明細書に記載される薬剤＋任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライである。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、もたらされ得る。
非経口投与によるなどの投与様式に依存して、無菌である医薬製剤を産生することが望ましい場合がある。滅菌は、任意の適切な方法、例えば、無菌濾過メンブレンを介した濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、フィルター滅菌は、凍結乾燥および再構成の前またはその後に、実施され得る。
ある特定の実施形態では、開示される組成物は、例えば、ウリカーゼをコーティングし得るポリイオン性（polyionic）試薬を含む（例えば、組成物は、ポリイオン性コーティングを含む）。例示的なポリイオン性試薬には、ＰＳＳ（ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）、ＰＡＡ（ポリアクリル酸ナトリウム塩）、ＰＭＧ（ポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩）、ＤＳ（デキストラン硫酸）、ＰＭＡ（ポリ（メチルアクリレート））またはＰＶＳ（ポリビニルシロキサン）が含まれる。
Ｖ．治療的使用
本明細書で開示される組換えウリカーゼ酵素は、対象における上昇した量の尿酸と関連する種々の疾患または障害を処置するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「対象における上昇した量の尿酸」は、疾患または障害を有さない対象と比較して、ある対象における体液（例えば、血液、血漿、血清または尿）、組織および／または細胞中の上昇した量の尿酸を指し得る。ヒト血液中では、女性について２．４〜６ｍｇ／ｄＬおよび男性について３．４〜７．２ｍｇ／ｄＬの間の尿酸濃度が、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｙｏ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって正常とみなされる。
本発明は、対象における上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、対象の血漿中の上昇した量の尿酸と関連する。方法は、単独で、または別の治療剤と組み合わせてのいずれかで、有効量の開示される組換えウリカーゼを対象に投与して、対象における疾患または障害を処置するステップを含む。用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な、活性薬剤（例えば、本発明の組換えウリカーゼ）の量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与、適用または投薬量で投与され得、特定の製剤または投与経路への限定を意図しない。
ある特定の実施形態では、方法は、単独で、または別の治療剤と組み合わせてのいずれかで、有効量の開示される組換えウリカーゼを対象に経口投与して、対象における疾患または障害を処置するステップを含む。ある特定の実施形態では、経口投与された組換えウリカーゼは、そのサイズに起因して腸における受動的吸収を回避し得、代謝されると、食物と共に経口投与された本発明の新規組換えウリカーゼは、任意の他の摂取されたタンパク質と類似の様式で代謝されることが企図される。
本明細書で使用する場合、「処置する（treat）」、「処置する（treating）」および「処置」は、対象における、例えばヒトにおける疾患の処置を意味する。これには、（ａ）疾患を阻害すること、即ち、その発達を停止させること；および（ｂ）疾患を軽減させること、即ち、疾患状態の退縮を引き起こすことが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「対象」および「患者」は、本明細書に記載される方法および組成物によって処置される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれるがこれらに限定されず、より好ましくは、ヒトが含まれる。
上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害の例には、代謝障害、例えば、メタボリックシンドローム、高尿酸血症、痛風（例えば、痛風性関節炎）、レッシュ−ナイハン症候群、心血管疾患、糖尿病、高血圧、腎疾患、メタボリックシンドローム、尿酸腎結石症（または腎臓結石（Wiederkehr et al. (2011), Clin. Rev. Bone. Miner. Metab., 9(3-4):207-217（「尿酸腎結石症は、特徴的には、全身性代謝障害の顕在化である。これは、全ての結石形成者の約１０％の有病率を有し、先進国において３番目に多い型の一般的な腎臓結石である。」）を参照のこと））、腫瘍崩壊症候群、および高尿酸尿症が含まれる。
本明細書に記載される方法および組成物は、単独で、または他の治療剤および／もしくはモダリティと組み合わせて使用され得る。「組み合わせて」投与されるという用語は、本明細書で使用する場合、患者に対する処置の効果がある時点で重複するように、２つ（またはそれよりも多くの）異なる処置が、障害による対象の苦痛の過程の間、対象に送達されることを意味すると理解される。ある特定の実施形態では、投与に関して重複が存在するように、１つの処置の送達は、第２の送達が開始する時に、依然として存在している。これは、本明細書で「同時」または「同時発生的送達」と呼ばれる場合がある。他の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達が開始する前に終了する。いずれの場合のある特定の実施形態でも、処置は、組み合わされた投与により、より有効である。例えば、第２の処置は、第２の処置を第１の処置の非存在下で投与した場合に見られるよりも有効である、例えば、等価な効果が、より少ない第２の処置で見られるか、または第２の処置が、第２の処置を第１の処置の非存在下で投与した場合に見られるよりも高い程度に症状を低減させる、あるいは同様の状況が第１の処置で見られる。ある特定の実施形態では、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメーターにおける低減が、他方の処置の非存在下で送達された一方の処置で観察されるものよりも大きいような送達である。２つの処置の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的、または相加的よりも大きい場合がある。送達は、送達された第１の処置の効果が、第２が送達される時に依然として検出可能であるような送達であり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法または組成物は、キサンチン−オキシダーゼインヒビター（例えば、アロプリノール、ＴＥＩ−６７２０（２−（３−シアノ−４−イソブトキシフェニル）−４−メチル−５−チアゾールカルボン酸）、フェブキソスタット（２−［３−シアノ−４−イソブトキシフェニル］−４−メチルチアゾール−５−カルボン酸）、オキシプリノールまたはプテリジルアルデヒド（pteridylaldehyde））、尿酸***促進薬（例えば、プロベネシド、レシヌラド、スルフィンピラゾン、スルフィンピラゾンまたはフェノフィブレート）、エチレンジアミン四酢酸、アセタゾラミド、カリウム補給剤、およびそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与される。
本明細書を通じて、組成物が、特定の構成成分を有する、含む（including）もしくは含む（comprising）と記載される場合、またはプロセスおよび方法が、特定のステップを有する、含む（including）もしくは含む（comprising）と記載される場合、列挙された構成成分から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物が存在し、列挙された処理ステップから本質的になるまたはそれからなる本発明に従うプロセスおよび方法が存在することが、さらに企図される。
エレメントまたは構成成分が、列挙されたエレメントまたは構成成分のリスト中に含まれるおよび／またはそこから選択されると言われる適用では、エレメントもしくは構成成分が、列挙されたエレメントもしくは構成成分のいずれか１つであり得ること、またはエレメントもしくは構成成分が、列挙されたエレメントもしくは構成成分の２つもしくはそれよりも多くからなる群から選択され得ることを、理解すべきである。
さらに、本明細書に記載される組成物または方法のエレメントおよび／または特色は、本明細書において明示的であれ黙示的であれ、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに種々の方法で組み合わされ得ることを、理解すべきである。例えば、特定の化合物に対して言及がなされる場合、その化合物は、文脈から他のように理解されない限り、本発明の組成物の種々の実施形態においておよび／または本発明の方法において使用され得る。言い換えれば、本出願中では、実施形態は、明確で簡潔な適用が書かれ描かれることを可能にする方法で記載され示されているが、実施形態は、本教示および発明から逸脱することなく種々に組み合わされるかまたは分離され得ることが意図され、理解される。例えば、本明細書に記載され示される全ての特色は、本明細書に記載され示される発明の全ての態様に適用可能であり得ることが理解される。
表現「〜の少なくとも１つ」は、文脈および使用から他のように理解されない限り、表現の後に列挙された対象物の各々を個々に、および列挙された対象物の２つまたはそれよりも多くの種々の組合せを含むと理解すべきである。３つまたはそれよりも多くの列挙された対象物に関連した、表現「および／または」は、文脈から他のように理解されない限り、同じ意味を有すると理解すべきである。
それらの文法的等価物を含む、用語「含む（include）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（have）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contain）」、「含有する（contains）」または「含有する（containing）」の使用は、他のように具体的に述べられるか、または文脈から理解されない限り、一般には、オープンエンドで非限定的である、例えば、列挙されていないさらなるエレメントまたはステップを排除しないと理解すべきである。
用語「約」の使用が、定量的な値の前にある場合、本発明は、他のように具体的に述べられない限り、その具体的な定量的な値自体もまた含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、他のように示されるかまたは推測されない限り、名目上の値からの±１０％の変動を指す。
ステップの順序またはある特定の作用を実施する順序は、本発明が動作可能なままである限り、重要ではないことを理解すべきである。さらに、２つまたはそれよりも多くのステップまたは作用は、同時に実施され得る。
本明細書のあらゆる全ての例、または例示的な言葉、例えば、「例えば（such as）」または「含む（including）」の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しているにすぎず、特許請求されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言葉は、特許請求されていない任意のエレメントを本発明の実施にとって必須であると示すと解釈すべきではない。
以下の実施例は、単なる例示にすぎず、本発明の範囲または内容を制限する意図では決してない。
（実施例１）
組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの設計および試験
この実施例は、改善されたパンクレアチン安定性を有する組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの設計および試験を記載する。
野生型配列と比較して３つのアミノ酸置換を各々が有する９５個の変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを設計した。変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、Ｒ１＿Ｖ１〜Ｒ１＿Ｖ９５と示す。
簡潔に述べると、９５個の変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードするＤＮＡ断片を、Ｎ末端Ｈｉｓタグをコードするｒｈａｍａｎｏｓｅ ｐＤ８６１−ＮＨ発現ベクター（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）中にクローニングした。全ての構築物を、配列決定によって確認した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞における発現後、各組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに結合させ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾールおよび５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する緩衝液中で溶出させた。
精製された組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを、パンクレアチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｐ７５４５；これは、その重量の少なくとも２５倍のジャガイモデンプンを、水中で４０℃で５分で、可溶性炭水化物へと変換し、その重量の少なくとも２５倍のカゼインを、ｐＨ７．５で４０℃で６０分で消化し、オリーブ油から、ｐＨ９．０で３７℃で、パンクレアチン１ｍｇ当たり１分間に少なくとも２マイクロ等量の酸を放出する）の存在下での酵素活性について試験して、パンクレアチン安定性を決定した。簡潔に述べると、２５ｎｇ／μＬのウリカーゼを、最大２００分間３７℃で、２０ｎｇ／μＬのパンクレアチンと共にインキュベートした。アッセイを、９６ウェルプレート中で、人工腸液（simulated intestinal fluid）（ＳＩＦ）緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．８）中で実施した。示された時点についてのパンクレアチンとのインキュベーション後、酵素活性を、吸収ベースのアッセイを使用してモニタリングした。尿酸は、２９３ｎｍにおいて強い吸光度を有し、ウリカーゼによる尿酸から５−ヒドロキシイソ尿酸塩への酵素的酸化は、経時的な２９３ｎｍ吸光度における対応する低下を生じる。
最も改善されたパンクレアチン安定性を有するＣ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ変異体についての結果を、複数のタンパク質調製物について確認した。野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼについての代表的なデータは、図１に示し、変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのサブセットについての代表的なデータは、図２に示す。
表３は、９５個の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼについてのアミノ酸置換、ならびに各酵素についての比活性（１．２ｎｇ／μｌのウリカーゼ当たりのμＭ／分）、パンクレアチン安定性（半減期、分）および発現収量（μｇ／ｍｌ）を示す。「ｎｄ」は、活性および安定性の測定値が、不十分な発現収量に起因して決定されなかったことを示している。
タンパク質モデリングツールを使用した、９５個の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの分析により、改善されたパンクレアチン安定性に貢献する重要な置換として、Ｙ１６５ＦおよびＩ１８０Ｖが同定された。結果として、これら２つの置換を含有する変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を、第２のラウンドのＣ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの設計において、親として使用した。
特記しない限り、第２のラウンドの変異設計、発現、精製およびパンクレアチン安定性アッセイは、全て上記のように実施した。プロセスは、野生型配列と比較して５つのアミノ酸置換を各々が有する９５個の変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを生じ、これらののうち２つは、各場合において、Ｙ１６５ＦおよびＩ１８０Ｖ置換であった。変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、表４においてＲ２＿Ｖ１〜Ｒ２＿Ｖ９５と示す。
表４は、９５個の変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼについてのアミノ酸置換、ならびに各酵素についての比活性（１．２ｎｇ／μｌのウリカーゼ当たりのμＭ／分）、パンクレアチン安定性（半減期、分）および発現収量（μｇ／ｍｌ）を示す。パンクレアチン安定性を、８０ｎｇ／μＬの可溶性パンクレアチンにおいてアッセイした。「ｎｄ」は、活性および安定性の測定値が、不十分な発現収量に起因して決定されなかったことを示している。
変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのサブセットについての代表的なパンクレアチン安定性データは、図３に示す。変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのサブセットを、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって、熱安定性についてさらに試験した。ＤＳＦは、タンパク質アンフォールディング後のタンパク質の露出された疎水性内部への結合の際にその蛍光を増加させる蛍光色素の存在下でタンパク質を加熱することによって熱安定性を評価する方法である。タンパク質アンフォールディング曲線は、図４に示す。見てわかるように、Ｒ２＿Ｖ１７は、試験したものの中で最も高い融解温度を有し、野生型ウリカーゼと比較して５℃の増加である。
変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素のサブセットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、パンクレアチン安定性についてさらに試験した。図５は、示された時点についての３７℃でのＳＩＦ緩衝液中での、１４４ｎｇ／μＬのウリカーゼの８０ｎｇ／μＬのパンクレアチンとのインキュベーション後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、Ｒ２＿Ｖ１７、Ｒ２＿Ｖ４およびＲ２＿Ｖ７９ Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素の分析を示す。図６は、示された時点についての３７℃でのＳＩＦ緩衝液中での、１００ｎｇ／μＬのウリカーゼの３２０ｎｇ／μＬのパンクレアチンとのインキュベーション後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、野生型およびＲ２＿Ｖ１７ Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素の分析を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からの結果は、活性アッセイデータと一致している。特に、Ｒ２＿Ｖ１７、Ｒ２＿Ｖ４およびＲ２＿Ｖ７９変異体は、野生型と比較して、パンクレアチンの存在下で増加した安定性を示す。
まとめると、これらの結果は、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、パンクレアチンに対する増加した安定性を有し、大幅に減少した比活性を有さない変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ酵素を同定している。
（実施例２）
Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ安定性を改善する個々の置換の同定
この実施例は、実施例１に記載される組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ中に含まれる個々の置換の試験を記載する。
実施例１に記載される変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ中に含まれる種々の置換の中で、個々の置換のセットを、タンパク質モデリングツールによる試験のために選択した。ある特定の例では、実施例１で同定された元の置換と共に、保存的置換を試験した。野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を各々が有する、合計で５１個の変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを、設計および試験した。１つのアミノ酸置換を含有する５１個の変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、表５中で個々の置換によって示す。変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを、実施例１に記載される変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのサブセットと共に、パンクレアチン安定性アッセイにおいて試験した。試験した実施例１に記載される５つの置換を含有する変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼのサブセットは、表３に示す通りである。結果を、表５、図７および図８にまとめる。
表５は、変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼについてのアミノ酸置換、ならびに各酵素についての比活性（１．２μＭのウリカーゼ当たりのμＭ／分）、パンクレアチン安定性（半減期、分。±ＳＥＭ）および発現収量（μｇ／ｍｌ）を示す。パンクレアチン安定性を、４０ｎｇ／μＬの可溶性パンクレアチンにおいてアッセイした。「ｎｄ」は、活性および安定性の測定値が、不十分な発現収量に起因して決定されなかったことを示している。
まとめると、これらの結果は、野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼと比較して、パンクレアチンに対する増加した安定性を有し、大幅に減少した比活性を有さない変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを同定し、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ安定性を増加させるのに十分な単一の置換を同定している。
（実施例３）
組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼは、腎障害ＵｒＯｘノックアウト（ＵｒＯｘＫＯ）マウスにおいて重症高尿酸血症を低減させ、高尿酸尿症を正常化する
この実施例では、高尿酸血症（血液中の過剰な量の尿酸塩）および高尿酸尿症（尿中の過剰な量の尿酸）に対する、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼの経口投与による尿酸塩（尿酸）の標的化された腸管排出の効果を調査した。ＥＳ細胞における遺伝子標的化による尿酸オキシダーゼ遺伝子座における標的化された変異によって生成されたＵｒＯｘＫＯマウス（Wu et al., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA (1994), 91:742-746に記載される方法に従う）は、重症高尿酸血症、高尿酸尿症および尿酸結晶性閉塞性腎症を発症し、従って、ヒト状態を模倣する高尿酸血症および関連障害を調査するための適切なモデルである。
変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする、配列番号１３のコドン最適化された核酸配列を含む発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、発現された組換え変異体ウリカーゼを単離および精製した。
研究は、３つの研究期間における３つの平行したアームのＵｒＯｘＫＯマウスを使用した−処置前アーム、処置アームおよび追跡アーム、各々７日間持続。全てのマウスが、研究開始前に１５０ｍｇ／Ｌのアロプリノール（ＡＬＬＯ）を受けた；この相は、維持用量のＡＬＬＯである。「処置前」期間の間、マウスには、維持用量のＡＬＬＯも、重症高尿酸血症、高尿酸尿症および尿酸結晶性閉塞性腎症を処置するための任意の他の治療剤も投与しなかった。
８匹のマウスを、組換え変異体ウリカーゼによる処置のための処置アームにおいて選択し、陽性対照として、１７匹のマウスを、アロプリノール（ＡＬＬＯ）による処置のために選択した（ＡＬＬＯ １５０ｍｇ／Ｌについてｎ＝９、ＡＬＬＯ ５０ｍｇ／Ｌについてｎ＝８）；血漿中尿酸塩レベルの測定を、処置の開始前（ＡＬＬＯ維持用量の除去の７日目、または処置前期間の７日目）、処置の間（処置の７日目（３．５ｇの食物と混合した、２５％ウリカーゼおよび７５％トレハロースの噴霧乾燥粉末を、７日間毎日投与し、処置の７日目に測定を行った））、追跡アームでは処置の終結の７日後に、同じ群のマウス（即ち、閉鎖コホート）から行った。組換え変異体ウリカーゼおよびＡＬＬＯコホートの両方において、マウスは、それぞれの処置前観察期間の開始前に、維持用量の１５０ｍｇ／ＬのＡＬＬＯを受けた。
処置前期間の開始時に、維持用量の１５０ｍｇ／ＬのＡＬＬＯを除去した。血漿中尿酸塩レベルを、維持用量のＡＬＬＯの除去の７日後に取集した血漿試料において測定し、尿中尿酸レベルを、処置前期間の最後の３日間の間に収集した２４時間尿試料において測定した。血漿中尿酸塩レベルおよび尿中尿酸レベルを、Ｃｏｒｍａｙ、Ｐｏｌａｎｄ（Ｌｉｑｕｉｃｋ Ｃｏｒ−ＵＡ ３０ ｐｌｕｓ、キットサイズ５×３０ｍｌ、カタログ番号２−２６０）によるＬｉｑｕｉｃｋ Ｃｏｒ−ＵＡ ３０ ｐｌｕｓプロトコールに従って測定した。
組換え変異体ウリカーゼで処置したマウス（ｎ＝８）は、食物と混合したおよそ６２ｍｇ／日（または１，５００Ｕ／日）の組換え変異体ウリカーゼ（３．５ｇの食物と混合した、２５％ウリカーゼおよび７５％トレハロースの噴霧乾燥粉末）を、経口で受けた。対照群では、マウス（ｎ＝１７）に、水中に補充した１５０ｍｇ／ＬのＡＬＬＯ（ｎ＝９）および５０ｍｇ／ＬのＡＬＬＯ（ｎ＝８）を投与した。血漿中尿酸塩レベルを、それぞれ組換え変異体ウリカーゼ、ＡＬＬＯ １５０ｍｇ／ＬおよびＡＬＬＯ ５０ｍｇ／Ｌによる処置の７日目にマウスから収集した血液試料において測定し、尿中尿酸レベルを、処置期間の最後の３日間の間に収集した２４時間尿試料において測定した。
追跡期間において、血漿中尿酸塩レベルを、それぞれ組換え変異体ウリカーゼ、ＡＬＬＯ １５０ｍｇ／ＬおよびＡＬＬＯ ５０ｍｇ／Ｌによる処置の終結の７日後にマウスから収集した血液試料において測定した。
尿中尿酸についてのアッセイを、製造業者の指示（Ｃｏｒｍａｙ、Ｐｏｌａｎｄ（Ｌｉｑｕｉｃｋ Ｃｏｒ−ＵＡ ３０ ｐｌｕｓ、キットサイズ５×３０ｍｌ、カタログ番号２−２６０）によるＬｉｑｕｉｃｋ Ｃｏｒ−ＵＡ ３０ ｐｌｕｓプロトコール）に従って実施した。例えば、尿試料を、動物の群および収集の時間に依存して、１：４、１：９または１：１４希釈した。尿酸の塩の沈殿を防止するために、１滴のＮａＯＨ（５００ｇ／Ｌ）を、２４時間検体の収集前に、収集チューブに添加した。
血漿中尿酸塩レベルもまた、製造業者の指示（Ｌｉｑｕｉｃｋ Ｃｏｒ−ＵＡ ３０ ｐｌｕｓプロトコール）に従って測定した。血液試料中の尿酸塩レベルを、希釈なしで、または二重蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）で１：１希釈して測定した。
測定された血漿中尿酸塩レベルおよび尿中尿酸レベルにより、組換え変異体ウリカーゼの経口投与の７日後に、高尿酸血症（即ち、血液中の過剰な尿酸）が大幅に（ｐ＜０．００１）低減され、高尿酸尿症（即ち、尿中の過剰な量の尿酸の存在）が正常化したことが実証された（図９Ａおよび９Ｂ）。組換え変異体ウリカーゼで処置したマウスは、処置前から４４％減少した血漿中尿酸塩を有し（平均の標準（ＳＥＭ）１４．５±０．９から８．１±０．５ｍｇ／ｄＬ）、これは、５０ｍｇ／Ｌ ＡＬＬＯのマウスにおいて観察された５１％の減少と類似であった（平均（ＳＥＭ）１３．２±２．６から６．５±１．１ｍｇ／ｄＬ）；ｐ＝ＮＳ。結果は、血漿中尿酸塩レベルに対するＡＬＬＯ ５０ｍｇ／Ｌの効果と組換え変異体ウリカーゼの効果との間に有意差が存在しなかったことを実証した。６９％の最も高い減少が、ＡＬＬＯ １５０ｍｇ／Ｌで処置したマウスにおいて観察された（平均（ＳＥＭ）１３．８±１．７から４．３±０．６ｍｇ／ｄＬ）。
組換え変異体ウリカーゼまたはＡＬＬＯの除去は、およそ処置前レベルに戻る高尿酸血症を生じた。これは、以下のように研究した。
尿中尿酸***は、８６％の低減（平均（ＳＥＭ）４．７±０．６から０．７±０．１ｍｇ／２４ｈ）で、組換え変異体ウリカーゼで正常化した（＜２ｍｇ／２４時間）；一方、ＡＬＬＯ ５０ｍｇ／Ｌおよび１５０ｍｇ／Ｌで処置したマウスでは、低減はそれぞれ、３４％（平均（ＳＥＭ）４．９±０．４から３．２±０．３ｍｇ／２４ｈ）および６６％（平均（ＳＥＭ）６．４±０．７から２．２±０．３ｍｇ／２４ｈ）であった。胃腸管（ＧＩＴ）の異なる部分からの消化管内容物（食物が胃液分泌によって変換され、胃から小腸へと通過する、半流体の塊）の分析は、尿酸が腸管全体に沿って存在することを示し、循環からの尿酸塩の分泌が確認された。
この実施例に示される結果は、経口投与された組換え変異体ウリカーゼによる腸内尿酸（循環から腸への尿酸分泌）の標的化が、血清中尿酸レベルを首尾よく低下させ、腎障害ＵｒＯｘＫＯマウスにおいて尿中尿酸を正常化したことを実証した。
番号付き実施形態
本開示は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲によって示される本開示の範囲の限定ではなく例示を意図すると理解すべきである。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
本明細書で開示される実施形態は、本開示の番号付き実施形態に提供されるように、実施形態Ｐ１〜Ｐ５３を含む。
実施形態Ｐ１：配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、少なくとも１つの変異が、（ａ）１８０位において、イソロイシンがバリンまたはアラニンによって置換されている（Ｉ１８０ＶまたはＩ１８０Ａ）、（ｂ）１６５位において、チロシンがフェニルアラニンによって置換されている（Ｙ１６５Ｆ）、（ｃ）１９０位において、バリンがグリシンまたはアラニンによって置換されている（Ｖ１９０ＧまたはＶ１９０Ａ）、（ｄ）５１位において、グルタミン酸がリシンによって置換されている（Ｅ５１Ｋ）、（ｅ）２４４位において、グルタミンがリシンによって置換されている（Ｑ２４４Ｋ）、（ｆ）１３２位において、イソロイシンがアルギニンまたはアスパラギンによって置換されている（Ｉ１３２ＲまたはＩ１３２Ｎ）、（ｇ）９７位において、バリンがイソロイシンによって置換されている（Ｖ９７Ｉ）、（ｈ）９２位において、グルタミン酸がアスパラギンによって置換されている（Ｅ９２Ｎ）、（ｉ）８７位において、アラニンがグリシンによって置換されている（Ａ８７Ｇ）、（ｊ）１４２位において、アスパラギン酸がグルタミン酸によって置換されている（Ｄ１４２Ｅ）、（ｋ）４４位において、グリシンがアラニンによって置換されている（Ｇ４４Ａ）、（ｌ）１２８位において、グリシンがプロリンによって置換されている（Ｇ１２８Ｐ）、（ｍ）２３６位において、アラニンがアスパラギンによって置換されている（Ａ２３６Ｎ）、（ｎ）２０８位において、リシンがアラニンによって置換されている（Ｋ２０８Ａ）、（ｏ）２１３位において、アスパラギンがアラニンによって置換されている（Ｎ２１３Ａ）、（ｐ）１４０位において、セリンがスレオニンによって置換されている（Ｓ１４０Ｔ）、（ｑ）２５３位において、チロシンがグルタミンによって置換されている（Ｙ２５３Ｑ）、（ｒ）８４位において、アラニンがセリンによって置換されている（Ａ８４Ｓ）、（ｓ）４７位において、スレオニンがグルタミン酸によって置換されている（Ｔ４７Ｅ）、（ｔ）９５位において、セリンがプロリンによって置換されている（Ｓ９５Ｐ）、（ｕ）１０３位において、リシンがスレオニンによって置換されている（Ｋ１０３Ｔ）、（ｖ）１３４位において、アスパラギン酸がグルタミン酸によって置換されている（Ｄ１３４Ｅ）、（ｗ）１３６位において、チロシンがアルギニンによって置換されている（Ｙ１３６Ｒ）、（ｘ）１９６位において、イソロイシンがロイシンによって置換されている（Ｉ１９６Ｌ）、（ｙ）２２４位において、スレオニンがアスパラギン酸によって置換されている（Ｔ２２４Ｄ）、（ｚ）２８５位において、プロリンがセリンによって置換されている（Ｐ２８５Ｓ）、および（ａａ）２９６位において、バリンがアラニンによって置換されている（Ｖ２９６Ａ）から選択される、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ２：Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｖ１９０Ａ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４Ｋ、Ｉ１３２Ｒ、Ｖ９７Ｉ、Ｅ９２Ｎ、Ａ８７Ｇ、Ｄ１４２Ｅ、Ｇ４４Ａ、Ｇ１２８Ｐ、Ａ２３６Ｎ、Ｋ２０８Ａ、Ｎ２１３Ａ、Ｓ１４０Ｔ、Ｙ２５３ＱおよびＡ８４Ｓから選択される少なくとも１つの変異を含む、実施形態Ｐ１の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ３：Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４Ｋ、Ｉ１３２Ｒ、Ｖ９７Ｉ、Ｅ９２Ｎ、Ａ８７Ｇ、Ｄ１４２ＥおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む、実施形態Ｐ１またはＰ２の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ４：Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む、実施形態Ｐ１からＰ３のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ５：Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む、実施形態Ｐ１からＰ４のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ６：Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４ＫおよびＩ１３２Ｒから選択される少なくとも１つの変異を含む、実施形態Ｐ１からＰ５のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ７：配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５または６つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、１９０位、５１位、１３２位および４４位から選択される位置に存在する、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ８：配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４または５つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、５１位、１３２位および４４位から選択される位置に存在する、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ９：配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５または６つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、１９０位、５１位、２４４位および１３２位から選択される位置に存在する、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１０：２、３、４、５、６、７または８つの変異を含む、実施形態Ｐ１からＰ９のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１１：以下の置換：Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａを含む、実施形態Ｐ１からＰ１０のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１２：以下の置換：Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａを含む、実施形態Ｐ１からＰ１０のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１３：以下の置換：Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａを含む、実施形態Ｐ１からＰ１０のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１４：以下の置換：Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａを含む、実施形態Ｐ１からＰ１０のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１５：以下の置換：Ｉ１８０ＶおよびＹ１６５Ｆを含む、実施形態Ｐ１からＰ１０のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１６：以下の置換：Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４ＫおよびＩ１３２Ｒを含む、実施形態Ｐ１からＰ１０のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１７：表１または表２に列挙された置換を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１８：パンクレアチンの存在下で少なくとも３５分の半減期を有する組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ１９：半減期が、パンクレアチンの存在下で３５〜２００分である、実施形態Ｐ１７の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ２０：野生型ウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下で５〜５０倍高い安定性を有する、実施形態Ｐ１からＰ１９のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ２１：野生型ウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下で２０〜３０倍高い安定性を有する、実施形態Ｐ２０の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ２２：単離されている、実施形態Ｐ１からＰ２１のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ２３：水溶性ポリマーにコンジュゲートされている、実施形態Ｐ１からＰ２２のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ２４：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている、実施形態Ｐ２３の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
実施形態Ｐ２５：実施形態Ｐ１からＰ２４のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする核酸配列を含む発現ベクター。
実施形態Ｐ２６：組換え変異体ウリカーゼをコードする核酸配列が、異種細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態Ｐ２５の発現ベクター。
実施形態Ｐ２７：異種細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、実施形態Ｐ２６の発現ベクター。
実施形態Ｐ２８：実施形態Ｐ２５からＰ２７のいずれか１つの発現ベクターを含む細胞。
実施形態Ｐ２９：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、実施形態Ｐ２８の細胞。
実施形態Ｐ３０：実施形態Ｐ１からＰ２４のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを含む医薬組成物。
実施形態Ｐ３１：薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む、実施形態Ｐ３０の医薬組成物。
実施形態Ｐ３２：経口剤形または非経口剤形として製剤化される、実施形態Ｐ３０またはＰ３１の医薬組成物。
実施形態Ｐ３３：経口剤形として製剤化される、実施形態Ｐ３２の医薬組成物。
実施形態Ｐ３４：散剤、顆粒剤、ペレット剤、マイクロペレット剤またはミニ錠剤として製剤化される、実施形態Ｐ３０からＰ３３のいずれか１つの医薬組成物。
実施形態Ｐ３５：カプセル中にカプセル封入されるか、または錠剤剤形として製剤化される、実施形態Ｐ３０からＰ３４のいずれか１つの医薬組成物。
実施形態Ｐ３６：カプセルが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセル、軟ゼラチンカプセルまたは硬ゼラチンカプセルである、実施形態Ｐ３５の医薬組成物。
実施形態Ｐ３７：非経口剤形として製剤化される、実施形態Ｐ３２の医薬組成物。
実施形態Ｐ３８：静脈内剤形として製剤化される、実施形態Ｐ３７の医薬組成物。
実施形態Ｐ３９：それを必要とする対象における上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害を処置する方法であって、有効量の実施形態Ｐ１からＰ２４のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを対象に投与し、それによって、対象における疾患または障害を処置するステップを含む、方法。
実施形態Ｐ４０：疾患または障害が、対象の血漿中の上昇した量の尿酸と関連する、実施形態Ｐ３９の方法。
実施形態Ｐ４１：それを必要とする対象における高尿酸血症を処置する方法であって、有効量の実施形態Ｐ１からＰ２４のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを対象に投与し、それによって、対象における高尿酸血症を処置するステップを含む、方法。
実施形態Ｐ４２：それを必要とする対象における痛風を処置する方法であって、有効量の実施形態Ｐ１からＰ２４のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを対象に投与し、それによって、対象における痛風を処置するステップを含む、方法。
実施形態Ｐ４３：それを必要とする対象における高尿酸血症を処置する方法であって、有効量の実施形態Ｐ３０からＰ３８のいずれか１つの医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象における高尿酸血症を処置するステップを含む、方法。
実施形態Ｐ４４：それを必要とする対象における痛風を処置する方法であって、有効量の実施形態Ｐ３０からＰ３８のいずれか１つの医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象における痛風を処置するステップを含む、方法。
実施形態Ｐ４５：組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼが、キサンチンオキシダーゼインヒビター、尿酸***促進薬、またはそれらの組合せと組み合わせて投与される、実施形態Ｐ３９からＰ４４のいずれか１つの方法。
実施形態Ｐ４６：キサンチンオキシダーゼインヒビターが、アロプリノールおよびフェブキソスタットから選択される、実施形態Ｐ４５の方法。
実施形態Ｐ４７：尿酸***促進薬が、プロベネシド、ベンズブロマロン、ロサルタンおよびレシヌラドから選択される、実施形態Ｐ４５の方法。
実施形態Ｐ４８：それを必要とする対象における高尿酸尿症を処置する方法であって、有効量の実施形態Ｐ１からＰ２４のいずれか１つの組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを対象に投与し、それによって、対象における高尿酸尿症を処置するステップを含む、方法。
実施形態Ｐ４９：それを必要とする対象における高尿酸尿症を処置する方法であって、有効量の実施形態Ｐ３０からＰ３８のいずれか１つの医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象における高尿酸尿症を処置するステップを含む、方法。
実施形態Ｐ５０：組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼが、キサンチンオキシダーゼインヒビター、尿酸***促進薬、またはそれらの組合せと組み合わせて投与される、実施形態Ｐ４８またはＰ４９の方法。
実施形態Ｐ５１：組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼが、キサンチンオキシダーゼインヒビター、尿酸***促進薬、またはそれらの組合せの投与に引き続いて投与される、実施形態Ｐ４８またはＰ４９の方法。
実施形態Ｐ５２：キサンチンオキシダーゼインヒビターが、アロプリノールおよびフェブキソスタットから選択される、実施形態Ｐ５０またはＰ５１の方法。
実施形態Ｐ５３：尿酸***促進薬が、プロベネシド、ベンズブロマロン、ロサルタンおよびレシヌラドから選択される、実施形態Ｐ５０またはＰ５１の方法。
参照による組み込み
本明細書で言及される特許および科学文書の各々の開示全体は、全ての目的のために参照によって組み込まれる。
等価物
本発明は、その精神からも本質的な特徴からも逸脱することなく、他の具体的な形態で具体化され得る。従って、上述の実施形態は、本明細書に記載される発明を限定するのではなく、あらゆる点で例示的とみなすべきである。従って、本発明の範囲は、上述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の同等性の意味および範囲の内に入る全ての変化は、その中に包含されることが意図される。

Claims (53)

  1. 配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、前記少なくとも１つの変異が、（ａ）１８０位において、イソロイシンがバリンまたはアラニンによって置換されている（Ｉ１８０ＶまたはＩ１８０Ａ）、（ｂ）１６５位において、チロシンがフェニルアラニンによって置換されている（Ｙ１６５Ｆ）、（ｃ）１９０位において、バリンがグリシンまたはアラニンによって置換されている（Ｖ１９０ＧまたはＶ１９０Ａ）、（ｄ）５１位において、グルタミン酸がリシンによって置換されている（Ｅ５１Ｋ）、（ｅ）２４４位において、グルタミンがリシンによって置換されている（Ｑ２４４Ｋ）、（ｆ）１３２位において、イソロイシンがアルギニンまたはアスパラギンによって置換されている（Ｉ１３２ＲまたはＩ１３２Ｎ）、（ｇ）９７位において、バリンがイソロイシンによって置換されている（Ｖ９７Ｉ）、（ｈ）９２位において、グルタミン酸がアスパラギンによって置換されている（Ｅ９２Ｎ）、（ｉ）８７位において、アラニンがグリシンによって置換されている（Ａ８７Ｇ）、（ｊ）１４２位において、アスパラギン酸がグルタミン酸によって置換されている（Ｄ１４２Ｅ）、（ｋ）４４位において、グリシンがアラニンによって置換されている（Ｇ４４Ａ）、（ｌ）１２８位において、グリシンがプロリンによって置換されている（Ｇ１２８Ｐ）、（ｍ）２３６位において、アラニンがアスパラギンによって置換されている（Ａ２３６Ｎ）、（ｎ）２０８位において、リシンがアラニンによって置換されている（Ｋ２０８Ａ）、（ｏ）２１３位において、アスパラギンがアラニンによって置換されている（Ｎ２１３Ａ）、（ｐ）１４０位において、セリンがスレオニンによって置換されている（Ｓ１４０Ｔ）、（ｑ）２５３位において、チロシンがグルタミンによって置換されている（Ｙ２５３Ｑ）、（ｒ）８４位において、アラニンがセリンによって置換されている（Ａ８４Ｓ）、（ｓ）４７位において、スレオニンがグルタミン酸によって置換されている（Ｔ４７Ｅ）、（ｔ）９５位において、セリンがプロリンによって置換されている（Ｓ９５Ｐ）、（ｕ）１０３位において、リシンがスレオニンによって置換されている（Ｋ１０３Ｔ）、（ｖ）１３４位において、アスパラギン酸がグルタミン酸によって置換されている（Ｄ１３４Ｅ）、（ｗ）１３６位において、チロシンがアルギニンによって置換されている（Ｙ１３６Ｒ）、（ｘ）１９６位において、イソロイシンがロイシンによって置換されている（Ｉ１９６Ｌ）、（ｙ）２２４位において、スレオニンがアスパラギン酸によって置換されている（Ｔ２２４Ｄ）、（ｚ）２８５位において、プロリンがセリンによって置換されている（Ｐ２８５Ｓ）、および（ａａ）２９６位において、バリンがアラニンによって置換されている（Ｖ２９６Ａ）から選択される、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  2. Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｖ１９０Ａ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４Ｋ、Ｉ１３２Ｒ、Ｖ９７Ｉ、Ｅ９２Ｎ、Ａ８７Ｇ、Ｄ１４２Ｅ、Ｇ４４Ａ、Ｇ１２８Ｐ、Ａ２３６Ｎ、Ｋ２０８Ａ、Ｎ２１３Ａ、Ｓ１４０Ｔ、Ｙ２５３ＱおよびＡ８４Ｓから選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  3. Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４Ｋ、Ｉ１３２Ｒ、Ｖ９７Ｉ、Ｅ９２Ｎ、Ａ８７Ｇ、Ｄ１４２ＥおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１または２に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  4. Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  5. Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  6. Ｉ１８０Ｖ、Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４ＫおよびＩ１３２Ｒから選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  7. 配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５または６つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、前記少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、１９０位、５１位、１３２位および４４位から選択される位置に存在する、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  8. 配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４または５つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、前記少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、５１位、１３２位および４４位から選択される位置に存在する、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  9. 配列番号１の野生型Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼに対応する位置において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５または６つ）の変異を含む組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼであって、前記少なくとも１つの変異が、１８０位、１６５位、１９０位、５１位、２４４位および１３２位から選択される位置に存在する、組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  10. ２、３、４、５、６、７または８つの変異を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  11. 以下の置換：Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  12. 以下の置換：Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  13. 以下の置換：Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  14. 以下の置換：Ｉ１８０Ａ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｉ１３２ＲおよびＧ４４Ａを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  15. 以下の置換：Ｉ１８０ＶおよびＹ１６５Ｆを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  16. 以下の置換：Ｉ１８０Ｖ、Ｙ１６５Ｆ、Ｖ１９０Ｇ、Ｅ５１Ｋ、Ｑ２４４ＫおよびＩ１３２Ｒを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  17. 表１または表２に列挙された置換を含む組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  18. パンクレアチンの存在下で少なくとも３５分の半減期を有する組換え変異体Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  19. 前記半減期が、パンクレアチンの存在下で３５〜２００分である、請求項１７に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  20. 前記野生型ウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下で５〜５０倍高い安定性を有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  21. 前記野生型ウリカーゼと比較して、パンクレアチンの存在下で２０〜３０倍高い安定性を有する、請求項２０に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  22. 単離されている、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  23. 水溶性ポリマーにコンジュゲートされている、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  24. ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている、請求項２３に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼ。
  25. 請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼをコードする核酸配列を含む発現ベクター。
  26. 前記組換え変異体ウリカーゼをコードする前記核酸配列が、異種細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２５に記載の発現ベクター。
  27. 前記異種細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項２６に記載の発現ベクター。
  28. 請求項２５から２７のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む細胞。
  29. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項２８に記載の細胞。
  30. 請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを含む医薬組成物。
  31. 薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 経口剤形または非経口剤形として製剤化される、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
  33. 経口剤形として製剤化される、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 散剤、顆粒剤、ペレット剤、マイクロペレット剤またはミニ錠剤として製剤化される、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  35. カプセル中にカプセル封入されるか、または錠剤剤形として製剤化される、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  36. 前記カプセルが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセル、軟ゼラチンカプセルまたは硬ゼラチンカプセルである、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 非経口剤形として製剤化される、請求項３２に記載の医薬組成物。
  38. 静脈内剤形として製剤化される、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. それを必要とする対象における上昇した量の尿酸と関連する疾患または障害を処置する方法であって、有効量の請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを前記対象に投与し、それによって、前記対象における前記疾患または障害を処置するステップを含む、方法。
  40. 前記疾患または障害が、前記対象の血漿中の上昇した量の尿酸と関連する、請求項３９に記載の方法。
  41. それを必要とする対象における高尿酸血症を処置する方法であって、有効量の請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを前記対象に投与し、それによって、前記対象における高尿酸血症を処置するステップを含む、方法。
  42. それを必要とする対象における痛風を処置する方法であって、有効量の請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを前記対象に投与し、それによって、前記対象における痛風を処置するステップを含む、方法。
  43. それを必要とする対象における高尿酸血症を処置する方法であって、有効量の請求項３０から３８のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象における高尿酸血症を処置するステップを含む、方法。
  44. それを必要とする対象における痛風を処置する方法であって、有効量の請求項３０から３８のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象における痛風を処置するステップを含む、方法。
  45. 前記組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼが、キサンチンオキシダーゼインヒビター、尿酸***促進薬、またはそれらの組合せと組み合わせて投与される、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記キサンチンオキシダーゼインヒビターが、アロプリノールおよびフェブキソスタットから選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記尿酸***促進薬が、プロベネシド、ベンズブロマロン、ロサルタンおよびレシヌラドから選択される、請求項４５に記載の方法。
  48. それを必要とする対象における高尿酸尿症を処置する方法であって、有効量の請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼを前記対象に投与し、それによって、前記対象における高尿酸尿症を処置するステップを含む、方法。
  49. それを必要とする対象における高尿酸尿症を処置する方法であって、有効量の請求項３０から３８のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象における高尿酸尿症を処置するステップを含む、方法。
  50. 前記組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼが、キサンチンオキシダーゼインヒビター、尿酸***促進薬、またはそれらの組合せと組み合わせて投与される、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 前記組換え変異体Ｃ．ｕｔｉｌｉｓウリカーゼが、キサンチンオキシダーゼインヒビター、尿酸***促進薬、またはそれらの組合せの投与に引き続いて投与される、請求項４８または４９に記載の方法。
  52. 前記キサンチンオキシダーゼインヒビターが、アロプリノールおよびフェブキソスタットから選択される、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. 前記尿酸***促進薬が、プロベネシド、ベンズブロマロン、ロサルタンおよびレシヌラドから選択される、請求項５０または５１に記載の方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112646790A (zh) * 2019-10-11 2021-04-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法
US20230105474A1 (en) * 2020-02-25 2023-04-06 Synlogic Operating Company, Inc. Recombinant bacteria engineered to treat diseases associated with uric acid and methods of use thereof
WO2022097141A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Protalix Ltd. Modified uricase and uses thereof
CN114480320B (zh) * 2022-02-28 2024-01-16 复旦大学 重组夜猴尿酸酶及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0956383A (ja) * 1995-08-24 1997-03-04 Kikkoman Corp 変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
PT1588716E (pt) 1998-08-06 2011-05-25 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados de peg-urato oxidase e sua utiliza??o
US6913915B2 (en) 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US20050049166A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-03 Huang Tsao-Chin Clare Enzyme-based cleaning composition and method of use
GB0326676D0 (en) * 2003-11-15 2003-12-17 Astrazeneca Ab Protein
CN1980687B (zh) * 2004-02-09 2015-05-13 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
EP1778261A4 (en) 2004-07-21 2010-08-11 Univ Florida COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT AND DIAGNOSIS OF INSULIN RESISTANCE
HU230758B1 (hu) 2006-04-12 2018-03-28 Crealta Pharmaceuticals LLC 100% Fehérjék tisztítása kationos felületaktív anyaggal
US20110171268A1 (en) * 2008-03-24 2011-07-14 Althea Technologies, Inc. Uricase compositions and methods of use
CN101390969A (zh) * 2008-11-03 2009-03-25 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 降低血液中尿酸浓度的药物
CN101875922B (zh) * 2009-04-30 2012-02-22 重庆医科大学 一种重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶及其聚乙二醇修饰与应用
RU2535038C2 (ru) 2009-06-25 2014-12-10 Криэлта Фармасьютикалз ЭлЭлСи Способы и наборы для прогнозирования риска инфузионных реакций и опосредованной антителами потери ответа при терапии пэгилированной уриказой с помощью мониторинга содержания мочевой кислоты в сыворотке крови
WO2011097590A2 (en) * 2010-02-05 2011-08-11 New England Biolabs, Inc. High fidelity restriction endonucleases
CN102586315A (zh) * 2012-02-21 2012-07-18 章泽人 一种低尿酸分泌量益生菌及其制备方法
EP2986720B1 (en) * 2013-04-17 2017-09-06 Council of Scientific & Industrial Research Uricase mutants
CN104342415A (zh) * 2014-07-08 2015-02-11 吉林省金梓源生物科技有限公司 一种重组尿酸酶的制备方法
WO2016024232A1 (en) * 2014-08-11 2016-02-18 Acerta Pharma B.V. Therapeutic combinations of a btk inhibitor, a pi3k inhibitor, a jak-2 inhibitor and/or a cdk 4/6 inhibitor
CN106554948B (zh) 2015-09-29 2019-06-25 上海生物制品研究所有限责任公司 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用
MX2018011012A (es) 2016-03-11 2019-03-28 Selecta Biosciences Inc Formulaciones y dosis de uricasa pegilada.
US20230085022A1 (en) 2016-11-11 2023-03-16 Horizon Therapeutics Usa, Inc. Combination therapies of prednisone and uricase molecules and uses thereof
BR112019018748A2 (pt) 2017-03-11 2020-04-07 Selecta Biosciences Inc métodos e composições relacionados ao tratamento combinado com anti-inflamatórios e nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor
CN107308452A (zh) * 2017-05-29 2017-11-03 钟术光 一种稳定生物活性材料的组合物的制备方法
GB201713732D0 (en) * 2017-08-25 2017-10-11 Alta Innovations Ltd Tat expression system
CN109223707B (zh) 2018-09-13 2020-12-08 中国药科大学 一种尿酸酶外用凝胶制剂、其制备方法及用途
CN109846909B (zh) * 2019-01-31 2022-03-22 武汉康复得生物科技股份有限公司 可在肠道中催化尿酸降解的组合物及其制备方法和应用
EP3967754A4 (en) * 2019-05-10 2023-07-26 Peg-Bio Biopharm Co., Ltd. (Chongqing) URATE OXIDASE MODIFIED BY POLYETHYLENE GLYCOL

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0956383A (ja) * 1995-08-24 1997-03-04 Kikkoman Corp 変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法

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